SK64899A3 - Enzymatic process for the preparation of cephalosporanic 7beta-(4-carboxybutanamide) acid by means of the modified enzyme d-aminoacid oxidase of i(trigonopsis variabilis) produced in i(escherichia coli) - Google Patents

Enzymatic process for the preparation of cephalosporanic 7beta-(4-carboxybutanamide) acid by means of the modified enzyme d-aminoacid oxidase of i(trigonopsis variabilis) produced in i(escherichia coli) Download PDF

Info

Publication number
SK64899A3
SK64899A3 SK648-99A SK64899A SK64899A3 SK 64899 A3 SK64899 A3 SK 64899A3 SK 64899 A SK64899 A SK 64899A SK 64899 A3 SK64899 A3 SK 64899A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
enzyme
gene
leu
ser
gly
Prior art date
Application number
SK648-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Lopez Jose Luis Garcia
Rubio Estrella Cortes
Palacios Jorge Alonso
Duran Encarnacion Mellado
Garcia Bruno Diez
Seijas Jose Manuel Guisan
Maldonado Francisci Salto
Fuente Jose Luis Barredo
Original Assignee
Antibioticos Sau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Antibioticos Sau filed Critical Antibioticos Sau
Publication of SK64899A3 publication Critical patent/SK64899A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky < Tento vynález sa týka enzymatického spôsobu prípravy kyseliny 7β-(4-karboxybutánamid) cefalosporónovej. Predovšetv kým popisuje spôsob izolácie génu, ktorý kóduje enzým s aktivitou oxidázy D-aminokyseliny pomocou rekombinantnej DNA, spôsob klónovania uvedeného génu v mikroorganizme rodu Escherichia, modifikáciu uvedeného enzýmu metódami bielkovinového inžinierstva, spôsob kvasenia uvedeného mikroorganizmu produkujúceho nadmerné množstvo modifikovaného enzýmu a spôsob extrakcie modifikovaného enzýmu pre prípravu kyseliny 7B-(4karboxybutanamid) cefalosportLnovej. Táto kyselina je medziproduktom pri príprave kyseliny 7-amino cef alospor<Lnove j, ktorá je známym medziproduktom pri príprave veľkého množstva antibakteriálnych látok cefalosporínovej rodiny.
Súčasný stav techniky
Pre prípravu kyseliny 7β-(4-karboxybutánamid) cefalosporánovej, tiež nazývanej kyselina glutaryl-7-cefalospoiatnová t (tu ďalej označovaná ako GL-7ACA) z cefalosporínu C je známe použitie enzýmu oxidáza D-aminokyseliny (tu ďalej označovaný ako DAO) z rôznych mikroorganizmov ako Trigonopsis variabilis (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1993) 31: 709), Rhodotorula gracilis (J. Biol. Chem. (1994) 269: 17809) a Fusarium solani (J. Biochem. (1990) 108: 1063). Tvorba DAO týmito mikroorganizmami má mnohé nevýhody. Po prvé, množstvo vytvorenej aktívnej DAO je velmi nízke a po druhé, spolu s uvedeným enzýmom sú prítomné aj iné, neželateľné aktivity enzýmov ako sú esterázy a katalázy. Esterázy štiepia kyselinu GL-7ACA, čim sa znižuje výťažok, a tým sa zvyšujú náklady prečisťovacich postupov. Katalázy poškodzujú peroxid vodíka, ktorý je potrebný pri katalýze. Je preto potrebné pridanie tejto zlúčeniny, čo zvyšuje náklady pre prípravu a tiež súčasne spôsobuje stratu aktivity tohoto enzýmu, a znižuje možnosť jeho opätovného použitia. Aby sa vyhlo uvedenej enzymatickej kontaminácii je potrebné prečistiť DAO enzým, čo podstatne zvyšuje náklady a obťažnosť enzymatického spôsobu pre získanie GL-7ACA z cefalosporínu C.
Nedávno bol popísaný spôsob izolácie génu kódujúceho DAO v T. variabilis a jeho expresie v E. coli a v T. variabilis (Japonská patentová žiadosť, podaná, č. 71180/1988; Európska patentová prihláška č. 93202219.7, Publikácia č. 0583817A2). Okrem toho gén, ktorý kóduje DAO v F. solani bol tiež klónovaný a exprimovaný v E. coli a Achremonium chrysogenum (Japonská patentová žiadosť, podaná č. 2000181/1990; J. Biochem. (1990) 108: 1063; Bio/Technology (1991) 9: 188) a pred nedávnom bol klónovaný gén, ktorý kóduje DAO v R. gracilis a exprimovaný v E. coli (Španielsky patent P9600906).
Pre veľký záujem o priemyselnú dostupnosť čistého enzýmu DAO aktivity pre výrobu GL-7ACA, cieľ tohoto vynálezu bol zameraný na tvorbu enzýmu s aktivitou DAO, ktorý je možné ľahko prečistiť. V tomto zmysle je známe, že jedným z najúčinnejších spôsobov prečistenia proteínu je použitie afinitnej chromatografie (Sassenfeld, H. M. (1990) Trends Biotechnol. 8: 88). Pre tento ciel je potrebné nájsť chromatografický nosič, ktorý umožňuje selektívnu väzbu a/alebo elúciu príslušného proteínu. Uvedený chromatografický nosič musí obsahovať takú rozpoznávajúcu molekulu alebo ligand, pre daný proteín, aby interakcia medzi proteínom a ligandom bola špecifická a dostatočne pevná a aby umožnila selektívnu elúciu proteínu.
Vývoj nosiča pre afinitnú chromatografiu nie je jednoduchý a dodnes nebol popísaný žiadny spôsob, ktorý by umožnil afinitné prečistenie aktívneho enzýmu DAO v jednom kroku.
Je známe, že niektoré spôsoby genetického inžinierstva umožňujú modifikáciu proteínov so zlepšením ich niektorých vlastností, čo ulahčuje ich prečistenie. Pre modifikáciu štruktúry proteínu boli vyvinuté mnohé systémy tak, aby sa umožnilo jeho afinitné prečistenie (Sii, D. a Sadana, A. (1991) J. Biotechnol. 19: 83; Narayanan, S. R. a Crane, L. J. (1990) Trends Biotechnol. 8: 12; Scouten, W. H. (1991) Curr. Opinion Biotechnol. 2: 37; Sassenfeld H. M. (1990) Trends Biotechnol. 8: 88). Zmysel týchto modifikácii pozostáva v naviazaní polypeptidu na proteín. Polypeptid má špecifické reakčné vlastnosti pre daný chromatografický nosič, ktorý dáva komplexu s proteínom schopnosť byť prečistený pomocou afinitnej chromatografie. Jedna z takýchto modifikácií predstavuje naviazanie polyhistidínovej sekvencie na príslušný proteín, čím sa modifikovaný proteín stáva schopný byť prečistený afinitnou chromatografiou použitím nosiča s obsahom dvojmocných iónov kovu (Arnolds, F. H. (1991) Bio/Technology 9: 151; Hochuli a spol. (1988) Bio/Technology 6: 1321) .
Hoci získanie modifikovaných proteínov pre zlepšenie purifikačných vlastností je v zásade jednoduchou a účinnou metódou, jej hlavná nevýhoda je v tom, že modifikácia primárnej štruktúry proteínu môže spôsobiť zmeny, ktoré môžu mať významný účinok na jeho sekundárnu, terciálnu a kvartérnu štruktúru. Tieto zmeny v štruktúre môžu ovplyvniť proteín do takej miery, že úplne alebo čiastočne stratí svoju funkčnosť zmenou na proteín, ktorý je nepoužitelný pre pôvodný účinok. Získanie modifikovaného proteínu preto vždy vyvoláva veľkú neistotu, nakoľko konečný výsledok väčšinou nie je možné predpokladať, zvlášť pri prvom pokuse s modifikáciou, t.zn., keď nie sú známe výsledky predošlých modifikácií. Pre neistotu konečného výsledku spočíva novosť v spôsobe získania modifikovaného proteínu. V súčasnosti nie je možné s určitosťou predpovedať, čo sa stane v priebehu procesu modifikácie proteínu.
V odbornej literatúre neexistuje popis žiadneho spôsobu prípravy enzýmu DAO z T. variabilis geneticky modifikovaného tak, aby mohol byť prečistený jedným krokom a tvorený vo veľkom množstve a v aktívnom stave buď v E. coli alebo v inom mikroorganizme.
Podstata vynálezu
Východiskovým bodom pre popis vynálezu je kvasinka T. variabilis, ATCC 20931, ako donor deoxyribonukleovej kyseliny (tu ďalej označovaná ako DNA). Po získaní genómovej DNA kvasinky (ktorá obsahuje gén s genetickou informáciou pre tvorbu DAO, tu ďalej nazývaný dao gén), bola táto použitá na konštrukciu DNA knižnice v E. coli pomocou fágového vektora λGEM12. Analýza DNA knižnice bola uskutočnená štandardnými hybridizačnými postupmi použitím syntetických oligonukleotidových prób navrhnutých na základe podobných oblastí nájdených v rôznych enzýmoch DAO. Týmto spôsobom boli izolované série rekombinantných klónov E. coli, ktoré obsahovali DNA fragment z T. variabilis kódujúci dao gén. Takto získaný fragment DNA bol subklónovaný do plazmidového vektora získaného z kmeňa E. coli. Rekombinantný vektor bol použitý na získanie sekvencie DNA fragmentu, ktorý obsahoval dao gén z T. variabilis (SEQ ID NO: 1) . Analýza uvedenej sekvencie umožnila charakterizáciu dao génu, ktorý je tvorený dvomi exónmi a jedným intrónom.
Keďže získaný fragment DNA obsahuje genómovú sekvenciu dao génu z T. variabilis má jeden intrón, nemôže byť priamo použitý pre expresiu v E. coli. Boli potrebné kroky na zís5 kanie dao génu bez prítomnosti uvedeného intrónu. Pre tento účel bol dao gén amplifikovaný pomocou PCR použitím dvoch syntetických oligonukleotidov. Prvý z nich bol navrhnutý tak, aby obsahoval nasledovné znaky: väzobné miesto pre ribozóm, translačné iniciačné miesto, úplnú sekvenciu prvého exónu a prvé nukleotidy na 5' zakončení druhého exónu. Druhý oligonukleotid obsahoval komplementárnu sekvenciu 3' zakončenia zodpovedajúcu druhému exónu dao génu, spolu s translačným terminačným kodónom. Tieto syntetické oligonukleotidy obsahovali tiež rôzne reštrikčné miesta užitočné pre klónovanie DNÄ fragmentov. Takto sa získal nový DNA fragment, po jeho izolácii bol klónovaný do E. coli plazmidového vektora (Obr. 1). Za použitia vopred vytvorených cielových reštrikcií, DNA fragment s obsahom kompletného dao génu bez prítomnosti intrónu bol následne subklónovaný do rôznych plazmidových vektorov E. coli s obsahom promótorov, čo umožnilo nadmernú expresiu (overexpresiu) génov v tejto hostiteľskej baktérii. DAO aktivita z rôznych klónov bola stanovená kolorimetrickými metódami a HPLC chromatografiou. Týmto spôsobom boli získané rekombinantné klóny E. coli, ktoré produkovali veľké množstvo aktívneho DAO enzýmu.
Dao gén bol potom modifikovaný pridaním nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje polyhistidín. Pre tento účel bol plazmid obsahujúci dao gén natrávený reštrikčným enzýmom, ktorý rozstrihol translačný iniciačný kodón; DNA zakončenia ako výsledok natrávenia boli spojené s Klenow-ovým fragmentom DNA polymerázy I E. coli. Potom boli ligované v prítomnosti syntetického spojovníka (linkéru), ktorý obsahoval kodóny pre polyhistidín. Vytvorený plazmid ďalej obsahoval modifikovaný dao gén na 5' zakončení jeho kódujúcej oblasti (SEQ ID NO: 2). Takto pripravený rekombinantný plazmid bol prenesený do kmeňa
E. coli a izolovaný pomocou hybridizačných metód použitím, oligonukleotidov pre polyhistidínový linkér ako próby. Na overenie, či sa dosiahla požadovaná modifikácia, bol modifikovaný dao gén sekvenovaný.
Tvorba DAO modifikovaného polyhistidínom (tu ďalej označovaného hisDAO) bola sledovaná použitím rôznych kmeňov E. coli ako hostiteľov pre vopred pripravené plazmidy. Týmto spôsobom sa skontrolovalo, či enzým hisDAO bol aktívny.
Pre prípravu hisDAO, za použitia vopred vybraných rekombinantných klónov E. coli, sú tieto kultivované v médiu s obsahom zdroja uhlíka, zdroja dusíka a minerálnych solí. Inkubačná teplota je v rozsahu od 18 do 37 °C a pH hodnota musí byť udržiavaná v rozsahu 5 až 9. Pre kvasenie v malom objeme môžu byť použité fľašky s rôznymi objemami, od 50 ml do 1 000 ml, s médiom v množstve od 10 do 50 % objemu fľašky. Kvasenie môže trvať v rozsahu 12 až 90 hodín.
Tvorba DAO pomocou rekombinantného mikroorganizmu môže byť zlepšená úpravou kultivačných podmienok tak, aby boli tieto vhodné pre udržanie stability rekombinantných vektorov, čo sa dosiahne pridaním antibiotík do kultivačného média. Sú to antibiotiká, voči ktorým rekombinantný vektor obsahujúci dao gén, vykazuje rezistenciu (ampicilín, chloramfenikol, kanamycín, tetracyklín, atď.). Pridanie antibiotík stabilizuje prípravu, a okrem toho zabraňuje kontaminácii kultivačného média neželateľnými mikroorganizmami a tiež eliminuje kmene, ktoré, pretože stratili rekombinantný vektor prestali produkovať DAO.
Rekombinantné bunky produkujúce hisDAO boli oddelené od kultivačného média centrifugáciou a potom boli dezintegrované alebo permeabilizované chemickými, enzymatickými alebo mechanickými spôsobmi. Pre získanie enzymatického extraktu vyššej čistoty, hisDAO bol prečistený jedným krokom afinitnou chro matografiou na kolóne Co2+-IDA. Hrubý extrakt enzýmu bol nanesený na Co2+-IDA rezin kolónu a kontaminujúce proteíny boli eluované premytím s 20 mM fosfátovým pufrom, pH 7,0 s obsahom 0,2 M NaCl. HisDAO enzým bol potom eluovaný premytím kolóny s 10 mM imidazolom.
Keď sa použije ako chromatografický nosič Cu2+-IDA alebo Zn2+-IDA namiesto Co2+-IDA, hisDAO enzým zostáva pevne naviazaný v matrixe v aktívnej forme bez možnosti ho eluovať vysokými koncentráciami imidazolu. Týmto spôsobom nosič, vhodne premytý na vyplavenie kontaminujúcich proteínov, môže byť použitý ako imobilizovaný enzýmový systém.
Použitím hisDAO enzýmu purifikovaného z rekombinantných klónov E. coli, ktoré exprimujú chimérny gén, bola získaná GL-7ACA z cefalosporínu C.
Dialyzované a zahustené enzýmové extrakty získané chromatografiou na Co2+-IDA nosiči môžu byť tiež imobilizované reakciou s inými vhodnými inertnými nosičmi, s možnosťou opakovaného použitia imobilizovaného hisDAO.
Novosť tohoto vynálezu spočíva v tom, že je to po prvýkrát, čo enzým DAO z kvasinky T. variabilis, modifikovaný ako hisDAO, môže byť exprimovaný v aktívnej forme v prokaryotickom mikroorganizme ako je E. coli a purifikovaný jedným krokom afinitnou chromatografiou. Okrem toho sa dosiahlo zvýšenie tvorby DAO v porovnaní k množstvu získanému z T. variabilis, čo uľahčuje použitie tohoto enzýmu v priemyselnom meradle. Možnosť produkcie hisDAO v rôznych kmeňoch E. coli, bez neželateľných enzýmov ako sú katalázy a esterázy, a tiež možnosť zlepšenia stability a katalytických vlastností pomocou ďalších modifikácii metódami proteínového inžinierstva, sú iné aspekty ktoré zvyšujú novosť tohoto patentu.
Tento vynález bez obmedzenia bude ilustrovaný podrobnejšie príkladmi, ktoré sú popísané nižšie.
PRÍKLAD 1
1. Stanovenie aktivity DAO
Stanovenie aktivity DAO sa uskutočnilo podlá spôsobu publikovaného v J. Biol. Chem. ((1967) 242: 3957), použitím D-fenylglycínu (25 mM) ako substrátu. Inkubácia v 50 mM fosfátovom pufri, pH 8,0 trvala 15 až 30 minút, reakcia bola ukončená pridaním 1/10 objemu čistej kyseliny octovej. Rozdiely v hodnotách OD pri 252 nm určujú aktivitu enzýmu. 89,77 nmol kyseliny benzoylformovej, ktorá vzniká pri reakcii, vykazuje OD252 rovnajúce sa 1,0.
2. Príprava DNA vektorov a komplementárnych E. coli buniek pre transformáciu
Plazmidový vektor pBluescript I KS (+) (Apr) (Stratagene) a pKK233,2 (Apr) (Pharmacia) boli pripravené alkalickou lýzou (Sambrook a spol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Pre tento účel boli kmene E. coli s prítomnými vyššie uvedenými plazmidmi inkubované 16 hodín za pohybu v kruhovej trepačke rýchlosťou 250 rpm a pri teplote 37 °C v 500 ml LB s 100 pg/ml ampicilínu. Týmto spôsobom získaný plazmid DNA bol prečistený centrifugáciou cez CsCl gradient.
Príslušné bunky E. coli TG1 a E. coli DH5a boli získané pomocou PbCl postupu (Sambrook a spol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA).
3. Príprava donorovej DNA, ktorá obsahuje genetickú informáciu pre tvorbu DAO
Kmeň T. variabilis ATCC 20931 bol kultivovaný v YMPG médiu (0,3 % extrakt sladu, 0,3 % extrakt kvasníc, 0,5 % pep ton a 1 % glukóza). Inkubácia trvala 36 hodín (OD66o = 5,0) za pohybu v kruhovej trepačke pri rýchlosti 250 rpm a pri teplote 30 °C.
Bunky sa nechali potom sedimentovať, boli premyté a lýzované pôsobením zymolyázy, a DNA bola extrahovaná spôsobom podlá Shermana a spol. ((1986) Laboratory Course for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Pre dosiahnutie vyššej čistoty pôsobila na DNA RNáza, zmes bola extrahovaná viackrát fenolom a chloroform-izoamyl alkoholom 24/1 (CIA) a vyzrážaná izopropanolom. Vyzrážaná DNA bola premytá 100 % etanolom a potom bola rozpustená v 10 mM Tris-HCl pufri, pH 7,5, s obsahom 1 mM EDTA (TE pufer).
PRÍKLAD 2
1. Konštrukcia DNA knižnice T. variabilis
Celková DNA z kmeňa T. variabilis ATCC 20931 bola získaná tak, ako je uvedené v Časti 3 Príkladu 1. Všetkých 300 pg uvedenej celkovej DNA bolo čiastočne natrávených pôsobením 20 jednotiek Sau3AI v reakčnom objeme 600 pl pri teplote 37 °C, 3 podiely po 200 pl boli zozbierané v intervale 45 sekúnd, 1 minúty a 2 minút, natrávenie bolo zakončené pridaním studeného 20 mM EDTA. Po skontrolovaní produktov natrávenia na 0,7 % agarózovom géli, boli tieto spojené, zahriate na 68 °C počas 10 minút, ochladené na laboratórnu teplotu a nanesené na 38 ml (10-40 %) sacharózový gradient. Uvedený gradient bol centrifugovaný pri 26 000 rpm počas 24 hodín pri teplote 15 °C, potom boli zozbierané 0,5 ml podiely, 10 pl z nich bolo analyzovaných na 0,4 % agarózovom géli. Podiely, ktorých DNA mala veľkosť v rozsahu 18 a 22 kb boli spojené a zriedené destilovanou vodou na približne 10 % sacharózu. DNA bola potom vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v 50 pl TE pufru, a 3 pl z tohoto roztoku bolo analyzovaných na 0,4 % agarózovom géli. Tým sa skontrolovalo, že veľkosť fragmentov DNA je správna a že ich koncentrácia je približne 50 ng/μΐ.
Súčasne bola pripravená DNA bakteriofágu X-GEM12 (Promega) pomocou známych metód s malými modifikáciami (Sambrook a spol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Pre tento účel kmeň E. coli NM538 (Promega) bol kultivovaný 10 hodín v NZCYM-0,2 % maltóza a jeho OD bolo merané pri 600 nm. Objem kultúry s 3 x 109 bunkami bol centrifugovaný pri 4 000 rpm 10 minút pri teplote 4 °C v stolnej centrifúge a potom bol sediment resuspendovaný v 1,2 ml SM pufru. K týmto bunkám boli pridané 3 x 107 plakotvorných jednotiek fágu λGEM12 a zmes bola potom inkubovaná 30 minút pri teplote 37 °C bez miešania. Každá z fľašiek (500 ml, so 100 ml média NZCYM0,2 % maltóza) vopred zahriatá na 37 °C bola inokulovaná 200 μΐ infikovaných buniek. Uvedené fľašky boli inkubované pri 37 °C, dokiaľ sa neobjavila lýza kultúry (5-6 hodín). Lyzáty boli spracované pôsobením DNázy (1 pg/ml) a RNázy (2 pg/ml) počas 45 minút pri laboratórnej teplote. Potom bolo pridaných
5,8 g NaCl na 100 ml lyzátu a zmes sa nechala stáť 60 minút na ľade. Po tomto čase bol lyzát prefiltrovaný, čím sa odstránili bunkové zvyšky, a po pridaní 20 ml 50 % PEG-6 000 na 100 ml lyzátu zmes stála 60 minút na ľade a potom bola centrifugovaná pri 10 000 x g 20 minút pri teplote 4 °C. Sediment bol resuspendovaný v 1 ml TE pufru a potom bol extrahovaný dvakrát s CIA na odstránenie zvyškov PEG-6 000 bez toho, aby nastalo poškodenie fágu. Sediment bol potom dvakrát extrahovaný neutrálnym fenolom, jedenkrát s fenol-CIA a jedenkrát s CIA. Vodná fáza bola prenesená do 0,5 M NaCl (s 4 M NaCl) a DNA bola vyzrážaná s dvoma objemami etanolu pri -20 °C. Po centrifugácii 20 minút pri teplote 4 °C a rýchlosti 12 000 rpm v mikrocentrifúge bola sedimentovaná DNA premytá 70 % etanolom, vysušená a resuspendovaná v 50 μΐ TE pufru.
pg DNA izolovanej z bakteriofága bola natrávená endonukleázou BamHI a Xbal pri teplote 37 °C po dobu 2 hodín. Výsledný produkt bol extrahovaný s fenol-CIA a CIA, vyzrážaný etanolom a resuspendovaný v 50 μΐ TE pufru. Po odobraní 2 pl podielu, bol k zvyšku pridaný MgCl2 až do koncentrácie 10 mM a potom bol inkubovaný 1 hodinu pri 42 °C, čím sa podporila recirkularizácia ramien vektora jeho kohezívnymi zakončeniami. Opäť bola odobraná 2 μΐ frakcia, ktorá bola analyzovaná spolu s predchádzajúcimi na 0,5 % agarózovom géli. Správna recirkularizácia kohezívnych zakončení sa overila tak, že zmes bola nanesená na 38 ml sacharózový gradient (10-40 %) . V tomto prípade DNA nebola zahriata na teplotu 68 °C predtým, ako bola nanesená na gradient, nakoľko zahriatie by spôsobilo rozpojenie kohezívnych zakončení fágu. Gradient bol centrifugovaný pri 26 000 rpm 24 hodín pri teplote 15 °C, potom boli zozbierané 0,5 ml podiely. Po analýze 15 μΐ z každého podielu
I na 0,5 % agarózovom géli, tie ktorým chýbal centrálny fragment boli zmiešané a zriedené destilovanou vodou do koncentrácie 10 % sacharózy. DNA bola vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v 50 μΐ TE a 2 μΐ z tohoto roztoku bolo analyzovaných na agarózovom géli (0,5 %) a tým sa potvrdila neprítomnosť centrálneho fragmentu a stanovila sa jej približná koncentrácia 100 ng/μΐ.
Potom sa uskutočnilo niekoľko ligácií použitím 0,25 pg inzertu a rôznych množstiev vektora v rozsahu od 0,25 do 0,75 pg, aby sa dosiahol rôzny pomer inzert/vektor. Reakcie sa uskutočnili pri teplote 12-14 °C počas 16 hodín. Po potvrdení na 0,4 % agarózovom géli, že sú prítomné DNA fragmenty (vytvorené ligáciou) väčšej veľkosti ako je veľkosť vektora alebo veľkosť inzertu, boli zmiešané všetky vhodné fragmenty, vyzrážané etanolom a resuspendované v 4 μΐ ligačného pufra.
Zvinutie rekombinantnej fágovej DNA vytvorenej po ukončení ligácie bolo uskutočnené v extraktoch pomocou Packagene (Promega) „in vitro. Výsledok reakcie bol resuspendovaný v 500 μΐ SM a bol použitý na' infikovanie E. coli NM538, ďalej
I na stanovenie množstva prítomných fágov v E. coli NM539 (Promega). a na stanovenie percenta rekombinantných fágov. E. coli NM539 je lyzogénnym kmeňom fágu P2 a tvorí lyzátové plaky len vtedy, keď infikujúcemu fágu chýba centrálna oblasť. Vytvorená DNA knižnica obsahovala asi 200 000 pfu a asi 85 % fágov nesúcich exogénny DNA fragment.
Po týchto výpočtoch bola E. coli NM539 infikovaná a úplná genetická knižnica bola nanesená na Petriho misku s priemerom 150 mm.
2. Identifikácia klônov s obsahom dao génu
Úplná DNA knižnica bola prenesená na nitrocelulózové filtre a proces výberu pozitívnych fágov sa uskutočnil podľa spôsobu hybridizácie publikovaného Sambrookom a spol. ((1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Postup bol zahájený pre-hybridizáciou nitrocelulózových filtrov, ich inkubáciou pri 42 °C počas 3 hodín v hybridizačnom pufri. Hybridizácia sa uskutočnila tak, že bol odstránený pufer použitý pri pre-hybridizácii a bol pridaný nový hybridizačný pufer spolu s 10 pmol oligonukleotidiv OA (5'-TCTTGTCCTCGACACC-3') a OB (5'-GACGTGGATTGTCAACTG-3') označených na ich 5' zakončení s 32P pomocou polynukleotid kinázy fágu T4 a [γ-32Ρ]ΑΤΡ (ICN Biochemicals) štandardnými postupmi (Sambrook a spol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Filtre boli inkubované 16 hodín pri 42 °C a boli premyté dvakrát 20 minút pri laboratórnej teplote 2 x SSC-0,1 % SDS pufri, potom nasledovali dve premytia pri rovnakej teplote a čase trvania hybridizácie v 0,1 x SSC-0,1 % SDS pufri. Nakoniec boli nitrocelulózové filtre exponované na Hyperfilm-MP (Amersham) v kazete s násobičom pri -70 °C počas 48 hodín.
Po ukončení pre-hybridizácie, hybridizácie, premývania a autorádiografie, bolo vybraných 63 klónov, ktoré dávali pozitívne signály s próbami OA a OB. Pomocou Pasteurovej pipety sa jednotlivo odobralo len 9 pozitívnych lyzátových plakov a každý z nich bol resuspendovaný v 1 ml SM plus 50 μΐ chloroformu. Fágy prítomné v tomto roztoku boli potom titrované. Pre zaistenie, že v 20 μΐ fágu so zavedenou infekciou bude množstvo lyzátových plakov medzi 500 až 1 000 na Petriho miske, uvedený fág bolo potrebné zriediť 5 000 krát. Obsah každej Petriho misky bol prenesený na príslušný nitrocelulózový filter, a tento bol opäť hybridizovaný tými istými próbami OA a OB. Autorádiografia ukázala, že 20 až 50 % fágov z každej Petriho misky dávalo pozitívny signál. Bolo preto potrebné prečistiť každý z pozitívnych fágov pomocou tretieho hybridizačného cyklu. Pomocou Pasteurovej pipety boli zozbierané pozitívne lyzátové plaky, ktoré boli viac oddelené od iných plakov, alebo také, ktoré boli obklopené pozitívnymi lyzátovými plakmi a boli resuspendované v 1 ml SM plus 50 μΐ chloroformu. Po zriedení roztoku fágu 100 krát sa použilo 15 μΐ na infikovanie, ktoré dávalo asi 300 lyzátových plakov na Petriho misku. Pri spracovaní za rovnakých podmienok ako v dvoch predchádzajúcich cykloch sa dosiahol taký výsledok, že 100 % fágov z každej Petriho misky bolo pozitívnych. Týmto spôsobom bolo prečistených 9 nezávislých lyzátových plakov. Každý lyzátový plak bol resuspendovaný v 100 μΐ SM plus 10 μΐ chloroformu a 2 μΐ z tohoto roztoku lyzátových plakov sa odobralo na amplifikáciu uvedených pozitívnych fágov na pevnom médiu. Po zozbieraní vrchnej vrstvy agarózy a jej resuspendovaní v 5 ml SM sa získali roztoky s približnou koncentráciou 107 pfu/μΐ pre každý z pozitívnych fágov.
Metóda podlá Southerna (Sambrook a spol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) bola použitá pre vyššie uvedené oligonukleotidy OA a OB ako próby pre stanovenie fragmentov genómovej DNA, ktoré obsahovali dao gén z T. variabilis. Uskutočnila sa preto hybridizácia s DNA netrávenou reštrikčnými endonukleázami (Pharmacia) BamHI, EcoRI, HindlII, Knpl, PstT, PvuTT, XbaT a Xhol a frakcionácia v agarózovom géli v podmienkach popísaných nižšie. Fragmenty DNA rozdelené na agarózovom géli na základe ich molekulárnej veľkosti boli postupne inkubované pri izbovej teplote pri miernom pohybe počas 15 minút v 0,25 M HC1; 1 hodinu v denaturačnom roztoku a 1 hodinu v neutralizačnom roztoku. Gél bol potom umiestnený na väčšiu vrstvu Whatman 3 MM filtračného papiera namočeného v 10 x SSC. Na povrch gélu bol opatrne položený (tak, aby sa zabránilo tvorbe bublín) BA85 nitrocelulózový filter (0,45 pm) (Schleicher a Schuell) rovnakých rozmerov ako gél, a namočený v 2 x SSC. Dva hárky Whatman 3 MM papiera navlhčené v 2 x SSC boli umiestnené na nitrocelulózový filter, a 8-10 cm (výška), suchý filtračný papier rovnakých rozmerov bol umiestnený na povrch. Na povrch tohoto všetkého („sendvič) bola položená záťaž asi 500 g. Prenos sa trval 16 hodín. Po tom, ako bola DNA prenesená, nitrocelulózový filter bol opatrne ponorený do 6 x SSC na 5 minút, nechal sa vysušiť 1 hodinu pri izbovej teplote a bol inkubovaný medzi dvomi hárkami Whatman 3 MM papiera pri 80 °C vo vákuu počas ďalších 3 hodín, aby sa dosiahla fixácia DNA na filter. Potom nasledovala pre-hybridizácia a hybridizácia za rovnakých podmienok ako bolo už popísané pri skríningu DNA knižnice. Výsledok autorádiografie ukázal prítomnosť špecifických hybridizačných prúžkov pre každú vzorku. Presnejšie, veľkosť týchto prúžkov bola nasledovná: 10,2 kb pri použití
EcoRI, 3,7 kb pri pôsobení BamHI, 3,5 kb pri použití HindlII,
11,6 kb pri pôsobení KpnI, 11,3 kb pri použití PstI, 4,8 kb pri pôsobení PvuII, 2,8 kb pri použití Xbal a 4,7 kb pri pôsobení Xhol.
3. Klónovanie fragmentu DNA, ktorý kóduje dao gén
Po prečistení DNA fágov, ako je uvedené v Časti I Príkladu 2 pre bakteriofág X-GEM12, uskutočnilo sa natrávenie DNA pôsobením Sali a bol identifikovaný prúžok 9,2 kb. Táto frakcia bola subklónovaná do plazmidu pBluescript I KS(+) (Stratagene), natráveného Sali, použitím DNA ligázy fágu T4 (Amersham), ATP a pufru odporúčaného dodávateľom enzýmu. Výsledná zmes bola inkubovaná 5 hodín pri 12 °C a bola použitá na transformáciu príslušných E. coli TG1 buniek (Amersham) . Transformované bunky boli kultivované v pevnom LB médiu, do ktorého boli pridané ampicilín (100 pg/ml), X-gal (40 pg/ml) a 0,2 mM IPTG. Z klónov vo forme bieleho výberového fenotypu, bol izolovaný plazmid pALTl. Pomocou Southern metódy a použitím OB próby bol potom lokalizovaný dao gén v 3,7 kb BamHI fragmente plazmidu pALTl. Tento BamHI fragment bol subklónovaný do plazmidu pBluescript I KS(+) (Stratagene) natráveného BamHI. Potom boli izolované plazmidy pALT2 a pALT3, ktoré obsahovali 3,7 kb BamHI fragment v oboch smeroch.
4. Sekvenovanie fragmentu, ktorý obsahuje dao gén
Nukleotidová sekvencia fragmentu prítomného v plazmide pALT2 bola stanovená v tom istom plazmide metódou podlá Sangera a spol. ((1997) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 74: 5463-5464) použitím T7 DNA Polymerase Kit (Pharmacia) a [35S]dATP. Táto sekvencia je označená ako SEQ ID No: 1. Analýzy sekvencie a ich porovnanie s inými sekvenciami známymi v medzinárodných databázach (GeneBank/EMBL) ukázali, že klónovaný fragment kódoval dao gén T. variabilis.
PRÍKLAD 3
1. Odstránenie intrónu z dao génu pomocou PCR
0,15 pg vzorky DNA z plazmidu pALT2 bolo zmiešaných s 10 pg (25 pM) každého z nasledujúcich oligonukleotidov: DAO1 (5'-CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTTTAAC-3') ktorý kóduje úplnú sekvenciu prvého exónu a prvých nukleotidov na 5' zakončení druhého exónu a obsahoval Ncol reštrikčné miesto; a DAO2 (5'-CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG-3'), ktorý obsahoval HIndlII reštrikčné miesto a sekvenciu 3' zakončenia zodpovedajúcu druhému exónu dao génu, vrátane translačného terminačného kodónu. Do tejto zmesi boli pridané 2,5 jednotky Taq polymerázy (Perkin-Elmer) spolu s príslušným pufrom odporúčaným dodávateľom, a zmes bola vystavená amplifikácii v PCR zariadení (Gene-ATAQ, Pharmacia) použitím 30 cyklov, každý cyklus sa uskutočnil pri 95 °C (1 minúta), 50 °C (2 minúty) a 72 °C (2,5 minúty). Výsledok amplifikácie bol detekovaný farbením etidium bromidom po elektroforéze v 1 % agarózovom géli.
Fragment DNA získaný pomocou PCR vo veľkosti približne 0,9 kb bol prečistený extrakciou agarózového gélu za použitia β-agarázy (Biolabs), podľa odporúčaní výrobcu. 0,2 pg prečisteného fragmentu bolo ligovaných s 1 pg vektoru M13tgl30 (Amersham), natráveného enzýmom HincII (Pharmacia), pomocou DNA ligázy fágu T4 (Amersham) v prítomnosti ATP a pufru podľa odporúčania výrobcu. Týmto spôsobom bol pripravený fág M13DAO (Obr. 1), ktorý bol potom sekvenovaný aby sa overilo, že intrón bol dostatočne odstránený. Nukleotidová sekvencia fragmentu prítomného vo fágu M13DAO bola stanovená v tom istom rekombinantnom fágu metódou podľa Sangera a spol. ((1997) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 74: 5463-5464) za použitia T7 DNA Polymerase Kit (Pharmacia) a [35S]dATP. Nukleotidová sekvencia ukázala, že klónovaný fragment mal 0,9 kb a obsahoval sekvenciu dao génu T. variabilis bez intrónu.
η
2. Subklónovanie dao génu bez intrónu v pKK233.2.
Vzorka 0,1 pg DNA z plazmidu pKK233.2 bola natrávená reštrikčnými endonukleázami Ncol a HindlII (Pharmacia) pri 37 °C v pufri podlá odporúčania výrobcom počas 1 hodiny. Na zastavenie reakcie bola zmes zahrievaná 10 minút pri 65 °C. Natrávený plazmid bol zmiešaný s 0,2 pg fágu M13DA0 natráveného rovnakými endonukleázami ako je uvedené vyššie, a obe DNA boli ligované pomocou enzýmu DNA ligázy fágu T4 (Amersham) v prítomnosti ATP v pufri podlá odporúčania výrobcu.
Výsledná zmes po ligácii bola použitá na transformáciu príslušných E. coli TG1 buniek. Transformované bunky boli izolované z LB média s obsahom ampicilínu (100 pg/ml). Týmto spôsobom sa získal klón, ktorý obsahoval rekombinantný plazmid pKDAO3 (Obr. 1), ktorý obsahoval 0,9 kb fragment ako výsledok amplifikácie pomocou PCR, ktorý bol vložený medzi Ncol a HindlII plazmidu pKK233.2, t.zn., že jeho expresia bola pod kontrolou trc promótora.
PRÍKLAD 4
1. Chimérny DAO enzým obsahujúci 6 histidínov
Za účelom vložiť polyhistidínový prívesok na amino zakončení DAO enzýmu T. variabilis, bolo natrávených 0,1 pg plazmidu pKDAO3 reštrikčnou endonukleázou Ncol (Pharmacia) počas 1 hodiny pri 37 °C za podmienok odporúčaných dodávateľom. Na zastavenie reakcie bola zmes zahrievaná 10 minút pri teplote 65 °C. Takto natrávený plazmid bol spracovaný Klenow-ovým fragmentom DNA polymerázy I z E. coli (Pharmacia) , podľa návodov odporúčaných dodávateľom. Na zastavenie reakcie bola vzorka zahrievaná 10 minút pri 65 °C. Výsledný linearizovaný plazmid bol ligovaný s DNA fragmentom, ktorý obsahoval nukleotidovú sekvenciu kódujúcu 6 histidínových zvyškov, pomocou DNA ligázy T4 fágu (Amersham) v prítomnosti
ATP a pufru, podlá odporúčania dodávatela. Fragment kódujúci 6 histidínových zvyškov bol získaný zmiešaním 1,5 pg dvoch komplementárnych oligonukleotidov, HIS1 (5'CATCATCACCACCATCACTT-3') a HIS2 (5' -AAGTGATGGTGGTGATGATG-3'), ktoré boli zahrievané 5 minút pri 100 °C a potom ochladené na laboratórnu teplotu, pri ktorej sa uskutočnila hybridizácia, za vytvorenia fragmentu dvojvláknovej DNA.
Výsledná ligačná zmes bola použitá na transformáciu príslušných E. coli TG1 buniek. Transformované bunky boli izolované z LB média s obsahom ampicilínu (100 pg/ml). Týmto spôsobom sa získal klón s obsahom rekombinantného plazmidu pKDAOHIS, ktorý obsahoval dao gén spojený so sekvenciou 18 nukleotidov kódujúcich 6 histidínových zvyškov na 5' zakončení. Pre kontrolu, či plazmid pKDAOHIS (Obr. 1) obsahoval očakávaný chimérny konštrukt, bola stanovená sekvencia v tom istom rekombinantnom plazmide metódou podlá Sangera a spol. ((1997) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 74: 5463-5464) za použitia T7 DNA Polymerase Kit (Pharmacia) a [35S]dATP. Získaná sekvencia je uvedená ako SEQ ID NO: 2.
Kmeň E. coli TG1 transformovaný plazmidom pKDAOHIS bol kultivovaný v LB médiu 20 hodín pri 25 °C a za pohybu (250 rpm). Bunky boli potom 10 minút centrifugované pri 5 000 x g a dezintegrované sonikáciou a ich DAO aktivita bola stanovená tak, ako je uvedené v Časti 1 Príkladu 1. DAO aktivita získaná týmto postupom bola 350 U/mg proteínu. Takto bolo potvrdené, že získaný chimérny DAO enzým s histidinovým reťazcom (hisDAO) bol aktívny. Použitím SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforézy bolo potvrdené, tak ako sa očakávalo, že hisDAO enzým mal mierne väčšiu velkosť ako natívny DAO enzým. Kmeň E. coli TG1 transformovaný plazmidom pKDAOHIS bol uložený v Španielskej zbierke typov kultúr (CECT), ktorá sa nachádza v Mikrobiologickom oddelení Fakulty biologických vied Univerzity vo Valencii, 64100 Burjasot (Valencia) dňa 10. 6. 1997, pod číslom CECT4888.
PRÍKLAD 5
1. Príprava agarózového-kov chelátového nosiča
Zmes 5,7 ml epichlorhydrínu a 11,4 ml etylén glykol dimetyl esteru bola pomaly pridaná k suspenzii 7 g agarózy CL6B v 57 ml roztoku 0,1 N NaOH s obsahom 340 mg NaBH4, a suspenzia bola jemne miešaná 4 hodiny pri 25 °C. Takto získaný agaróza-epoxid bol premytý veľkým množstvom destilovanej vody a pridaný do roztoku pripraveného z 2,5 ml 2 M iminodiacetátu sodného a 19 ml pufru 0,1 M bikarbonátu sodného, pH 11. Táto suspenzia bola jemne miešaná 12 hodín pri 25 °C. Nakoniec bol nosič premytý destilovanou vodou a resuspendovaný do vodného roztoku, ktorý obsahoval požadovanú soľ kovu (5 mg/ml). Takto pripravený agarózový-kov chelátový nosič bol premytý veľkým množstvom vody a pripravený pre použitie. Keď sa pridal ako soľ kovu C0CI2, získal sa agarózový-kobalt chelátový nosič.
2. Prečistenie chimérneho hisDAO enzýmu na agarózovomkobalt chelátovom nosiči
Kolóna naplnená agarózovým-kobalt chelátovým nosičom bola ekvilibrovaná 20 mM pufrom fosfátu sodného (pH 7.0) a 0,2 M NaCl. Extrakt solubilizovaných buniek získaný tak, ako je popísané vyššie z E. coli TG1 buniek transformovaných plazmidom pKDAOHIS, bol nanesený na túto kolónu. Po nanesení extraktu buniek bola kolóna premytá veľkými množstvami toho istého ekvilibračného pufru, čím sa odstránili všetky proteíny z extraktu s výnimkou hisDAO, ktorý zostal zadržaný v kolóne.
1 Enzým hisDAO bol potom eluovaný pomocou 20 mM pufru fosfátu sodného, pH 7,0 s obsahom 10 mM imidazolu. Frakcie, ktoré obsahovali enzým hisDAO boli odobrané a dialyzované oproti 20 mM pufru fosfátu sodného, pH 7,0. Takto pripravený enzým (9 000 U/mg) vykazoval stupeň čistoty väčší ako 90 % a je možné ho priamo použiť pre premenu cefalosporínu C na GL7ACA.
Podrobný popis obrázkov
Obr. 1. - Spôsob konštrukcie plazmidu pKDAOHIS.
Dao gén bez intrónu a s ATcoI miestom v ATG, ktorý kóduje prvý metionín proteínu, bol získaný pomocou PCR z plazmidu pALT2.
Fragment amplifikovaný pomocou PCR bol potom subklónovaný na mieste HincII vo vektore M13tgl30, za vzniku M13DAO. Fragment <· Ncol-HindlII získaný z M13DAO bol subklónovaný na NcolHindlll miestach plazmidu pKK233.2, za vzniku pKDAO3. Tento plazmid obsahuje dao gén, a jeho expresia je pod kontrolou trc promótora z E. coli. Nakoniec bol zavedený fragment DNA kódujúci polyhistidínový prívesok na 5' zakončení v dao géne, za vzniku plazmidu pKDAOHIS.
21-23
Zoznam sekvencix <110> ANTIBIOTICOS, S.A.U.
<120> „Enzymatický spôsob prípravy kyseliny 7β—(4— karboxybutanamid) cefalosporínovej pomocou modifikovaného enzýmu oxidázy D-aminokyseliny z Trigonopsis variabilis tvoreného v Escherichia coli.
<130> PCT-47 <150> ES 9702008 <151> 25.09.97 <160> 2 <210> SEQ ID NO: 1 <211> 3668 párov báz <212> DNA <213> Trigonopsis variabilis <220>
<221> CDS <222> (1481... 1503, 1543...2506) <223> dao gén <220>
<221> intrón <222> 1504...1442 <220>
<221> CDS <222> 2952...3668 <223> ORF 1 <400>
GGATCCTTAC GGTTCCTCGG ACTTCATCTT TCCAACATTT AGGTCCTTCG TGGACCTCCT GTACATGTTC TTCTGGGTAA ATGTTTTCGC AACAGTTGTT AGATCTTTAA TCACCAGAGG TCGCCAGTCT TTAATTCGAC GTACGCGAAA GAAGGAAATG AATCAGCCAT GCCAACGGCT AAAAGTCCTT TTCGTAAACG TGGTGCCAGA AGGCTGGAGA GCTAAGATCG GCCGCATTCT TTATATATAA
GAGGAAGATC GTAATGGAAC CCAAGGTTCT GTAGATCATT TTTCTTTGGT TCTTGAGCGA CTTGTCGGGA TCGAGATAAT TAGAAAGCCT GGAATAAGTC TTGACTCATT TTTGATAGAG CAACTCTGAC TCATTGCTCA GATGCGTGAC TGAGACTAGA GACAGCACTA GACGGCCAAC AGTTTGGAAT AGACAAGTGA TGAATTTGGA CTTGTAAGCC CCTGATCGTT AGCCAAAGGG GGCAAAAGTC
TGATAATGGA CACTGACAAA AATTCGTAGT ATTCTTTGTC TAGTAGATCT TAGCTCTGAC TAGGGACAGT AACCGAACTC CGGACTCTTA ATTCCATTCA TCCAGTTACT GTCTAACGAT GATCAAACGC ATATGATTGA GATAAGGACA GAAAAGCCAC TAACGTGATA TTGATGATTC TCCAGACATG CTCATGGCAG AACTGTCACC TGACTCAGTT TTGCCCTACT TTATAGCGTT GATTCAACGG
GAATTCTCTC TCGGCTGCTT TTCTTCTCAT TTCACGGCAA ACCATGCCAG CAGAACCAAT GATCCCAAAG AAATCTTGTG CGTTGGTCTT CTTTCACTTT GAAAGTTAGC GGCTTCATAC TTAGATCCAC TCGCGCGGGA ACGACTAAGG TGACTGAGAG TGATAAGTAA TACCACAAAA GCAGAATTTA CACCGTCTCA TTATAGAATT GACTCATCGG TATCTTGGTT ACACTCTTGA ATCAATAAAA
GTT
Val
ATT íle
GG Gly
GCTTTATGCC . GAGGTTTTGT TCAATAAAGC CTGTATCTAG TTAAGCGATC . CAAAAAGAAC TAATTGATAG . ATGGCTTGGC CATCTGTAAG GAGGACTTCT . TGGAAGCTTT ' AGGCTGTGAA CAATCTCAAT . TGACATCGAA i GAGTAGATGG < TAAAACAGCC . GGCTCTGTTG i AATCATACGA ( ACGGCCACTA < GTCCACCGGT l ACTTTTGGAT i CGAAAGCTTC l GCATGAGTTG l TAGGCAAATC I ATG GCT AAA Met Ala Lys 1 GTAAGTGCCT TGATACCAGA CGGCTGACAT TTGTTTAG T
ATGACTTGCA TCCCTTCAAC TGCAAACCGC TTCCTTCTGA AATCTCCTCT ACCAGGATCG ATCCTGAACT GTTCAATTGA CGACCGCGTG ATTTGACCGT CAACATGTCC TGTGATTGTT ACCGAACGAG GGTGACAACC ACTGGGGAGT ATGATTAGAC CCCGCTGACG GAAGTCAACG CAGTTGGCCG CTAAAGCACT AGTTTTTGTA CTATCTTGGA GCCGGTCAGA CGTGCTCGGA i ATC : íle
GCC Ala
GTT Val
GGT Gly
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1495
1548
GTT GCC GGT TTA ACT ACA GCT CTT CAA CTT CTT CGT AAA GGA CAT GAG 1596
Val Ala Gly Leu Thr Thr Ala Leu Gin Leu Leu Arg Lys Gly His Glu
15 20 25
GTT ACA ATT GTG TCC GAG TTT ACG CCC GGT GAT CTT AGT ATC GGA TAT 1644
Val Thr íle Val Ser Glu Phe Thr Pro Gly Asp Leu Ser íle Gly Tyr
30 35 40
ACC TCG CCT TGG GCA GGT GCC AAC TGG CTC ACA TTT TAC GAT GGA GGC 1692
Thr Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Leu Thr Phe Tyr Asp Gly Gly
45 50 55
AAG TTA GCC GAC TAC GAT GCC GTC TCT TAT CCT ATC TTG CGA GAG CTG 1740
Lys Leu Ala Asp Tyr Asp Ala Val Ser Tyr Pro íle Leu Arg Glu Leu
60 65 70
GCT CGA AGC AGC CCC GAG GCT GGA ATT CGA CTC ATC AAC CAA CGC TCC 1788
Ala Arg Ser Ser Pro Glu Ala Gly íle Arg Leu íle Asn Gin Arg Ser
75 80 85 90
CAT GTT CTC AAG CGT GAT CTT CCT AAA CTG GAA GGT GCC ATG TCG GCC 1836
His Val Leu Lys Arg Asp Leu Pro Lys Leu Glu Gly Ala Met Ser Ala
95 100 105
ATC TGT CAA CGC AAC CCC TGG TTC AAA AAC ACA GTC GAT TCT TTC GAG 1884
íle Cys Gin Arg Asn Pro Trp Phe Lys Asn Thr Val Asp Ser Phe Glu
110 115 120
ATT ATC GAG GAC AGG TCC AGG ATT GTC CAC GAT GAT GTG GCT TAT CTA 1932
íle íle Glu Asp Arg Ser Arg íle Val His Asp Asp Val Ala Tyr Leu
125 130 135
GTC GAA TTT GCT TCC GTT TGT ATC CAC ACC GGA GTC TAC TTG AAC TGG 1980
Val Glu Phe Ala Ser Val Cys íle His Thr Gly Val Tyr Leu Asn Trp
145
140
150
CTG ATG TCC CAA TGC TTA TCG CTC GGC GCC ACG GTG GTT AAA CGT CGA 2028
Leu Met Ser Gin Cys Leu Ser Leu Gly Ala Thr Val Val Lys Arg Arg
155 160 • 165 170
GTG AAC CAT ATC AAG GAT GCC AAT TTA CTA CAC TCC TCA GGA TCA CGC 2076
VaL Asn His i'íe“ Lys Asp Ala Asn Leu Leu His Ser Ser Gly Ser Arg
175 180 185
ecc -GAC .GTG ATT GTC AÄC TGT AGT GGT CTC TTT GCC CGG TTC TTG .GGA 2124
Pro Asp Val íle Val Asn Cys Ser Gly Leu Phe Ala Arg Phe Leu Gly
190 195 200
GGC GTC GAG GAC AAG AAG ATG TAC CCT ATT CGA GGA CAA GTC GTC CTT 2172
Gly Val Glu Asp Lys Lys Met Tyr Pro íle Arg Gly Gin Val Val Leu
205 210 215
GTT CGA AAC TCT CTT CCT TTT ATG GCC TCC TTT TCC AGC ACT CCT GAA 2220
Val Arg Asn Ser Leu Pro Phe Met Ala Ser Phe Ser Ser Thr Pro Glu
220 225 230
AAA GAA AAT GAA GAC GAA GCT CTA TAT ATC ATG ACC CGA TTC GAT GGT 2268
Lys Glu Asn Glu Asp Glu Ala Leu Tyr íle Met Thr Arg Phe Asp Gly
235 240 245 250
ACT TCT ATC ATT GGC GGT TGT TTC CAA CCC AAC AAC TGG TCA TCC GAA 2316
Thr Ser íle íle Gly Gly Cys Phe Gin Pro Asn Asn Trp Ser Ser Glu
255 260 265
ccc GAT CCT TCT CTC ACC CAT CGA ATC CTG TCT AGA GCC CTC GAC CGA 2364
Pro Asp Pro Ser Leu Thr His Arg íle Leu Ser Arg Ala Leu Asp Arg
270 275 280
TTC CCG GAA CTG ACC AAA GAT GGC CCT CTT GAC ATT GTG CGC GAA TGC 2412
Phe Pro Glu Leu Thr Lys Asp Gly Pro Leu Asp íle Val Arg Glu Cys
285 290 295
GTT GGC CAC CGT CCT GGT AGA GAG GGC GGT CCC CGA GTA GAA TTA GAG 2460
Val Gly His Arg Pro Gly Arg Glu Gly Gly Pro Arg Val Glu Leu Glu
300 305 310
AAG ATC CCC GGC GTT GGC TTT GTT GTC CAT AAC TAT GGT GCC GCC GGT 2508
Lys íle Pro Gly Val Gly Phe Val Val His Asn Tyr Gly Ala Ala Gly
315 320 325 330
GCT GGT TAC CAG TCC TCT TAC GGC ATG GCT GAT GAA GCT GTT TCT TAC 2556
Ala Gly Tyr Gin Ser Ser Tyr Gly Met Ala Asp Glu Ala Val Ser Tyr
335 340 345
GTC GAA AGA GCT CTT ACT CGT CCA AAC CTT TAGAAATCAT GTATACAATT 2606
Val Glu Arg Ala Leu Thr Arg Pro Asn Leu
350 355
ATTCTCTCTC TATAAATCTA ATTTTTTTGT 1 GTGGTCTAAT ATTCGTAAAC ACGTCGCAGT 2666
CGTCTATGTC GCCCTCGTCA CCGTGTCCAA „ AGTCGTAAAG TGACTGATTG CAATTGCGAC 2726
AACACGTGAC TCGACCTGCC TCCTTACCTC : CCATCAACAA CAAAAGAAGC TGGCTAAGAT 2786
AGAGGTCTGT TGACGAGCAC TCGTAAGAAC : GGCAAACATA GAAAGGAGGC TCTATAATTA 2846
CCTGGAAACT GTGTTATATA CTATCACTAG i TGAGGGTGAG TGATTAGAAG CAAGGGGACT 2906
AGAATACTGA CATGGATAGA GATCCAGGAG 1 CCTTATAAAT AATCA ATG AAT ACA ATT 2963
Met Asn Thr íle
GAT TTG GAA TCT TGG GAT GAT GAT CCA GAT TTC GCA GAT GAC TTT GAG 3011
Asp Leu Glu Ser Trp Asp Asp Asp Pro Asp Phe Ala Asp Asp Phe Glu
360 365 370 375
AAT TTA AAG ACT CCA GCT CCT ACG TTT TAT GAA GCC AAC GAT GAG ATT 3059
Asn Leu Lys Thr Pro Ala Pro Thr Phe Tyr Glu Ala Asn Asp Glu íle
380 385 390
AGG GAT GGA GAA GAA GAG GAT GAT TTT TTC TCT CAA GAT TTC GAG TTG 3107
Arg Asp Gly Glu Glu Glu Asp Asp Phe Phe Ser Gin Asp Phe Glu Leu
395 400 405
GAT GAT AAG AAT ACA CTC GGA CGA CAG AAC AAG ATT TCG ACT AGT CAC 3155
Asp Asp Lys Asn Thr Leu Gly Arg Gin Asn Lys íle Ser Thr Ser His
410 415 420
CTA AAG TCC GCG AGT CAG GAA CAA GCA GAG ACC TCC TTT CGT GAC TCG 3203
Leu Lys Ser Ala Ser Gin Glu Gin Ala Glu Thr Ser Phe Arg Asp Ser
425 430 435
AAC GCT GGC GTC AAT GCT. TTC AGC TGC GGG ACT ATA AAA GCC TTA GGA 3251
Asn Ala Gly .Val Asn Ala Phe Ser Cys Gly Thr íle Lys Ala Leu Gly
’44O - •445 450 455
aag AAT AGG ATG ACG ACG GTG GAA GAG AAG TGG GAA AAG GAA GTT AGA 3299
Lys Asn Arg Met Thr Thr Val Glu Glu Lys Trp Glu Lys Glu Val Arg
'460 465 470
CGC GAT CAA ATT GGG TTC AAT GAA GCT ACT CTT AGA GCT CAT GAG ACT 3347
Arg Asp Gin íle Gly Phe Asn Glu Ala Thr Leu Arg Ala His Glu Thr
475 480 485
ACC AGA GAA TGG TTA AAA TCC CAG ACT GGC GAA GCT GGG ACT AAA AGC 3395
Thr Arg Glu Trp Leu Lys Ser Gin Thr Gly Glu Ala Gly Thr Lys Ser
490 495 500
AAG GTC TTT AGC CCA ATT CTC GAC GGA TCA TTC TTC GAA CCG CCT TTG 3443
Lys Val Phe Ser Pro íle Leu Asp Gly Ser Phe Phe Glu Pro Pro Leu
505 510 515
GAA TCT AAA GTC AGG CGT TAT CAT TCA CCC CGG AAA CAG GCA CCT CCT 3491
Glu Ser Lys Val Arg Arg Tyr His Ser Pro Arg Lys Gin Ala Pro Pro
520 525 530
CCT CCT CCT GAC GAT TTT TCA GAT GCA TTT GAA CTA TCT ACA GAA GAG 3539
Pro Pro Pro Asp Asp Phe Ser Asp Ala Phe Glu Leu Ser Thr Glu Glu
535 540 545 550
CCA CTG AAA TTA AAA GTC CAA CCA GTT CAA CCT CAT ATG ACG CCT GCT 3587
Pro Leu Lys Leu Lys Val Gin Pro Val Gin Pro His Met Thr Pro Ala
555 560 565
CTG AGT GAT AAT GAT CTA TGG GGT GAG GAA TCT ATT GGT GTG CGA CGA 3635
Leu Ser Asp Asn Asp Leu Trp Gly Glu Glu Ser íle Gly Val Arg Arg
570 575 580
GGA GGC AGG GAC TCG TCA AGT ATG GGA GGA TCC 3668
Gly Gly Arg Asp Ser Ser Ser Met Gly Gly Ser
585 590
<210> SEQ ID NO: 2 <211> 1128 párov báz <212> DNA <213> Trigonopsis variabilis <220>
<221> CDS <222> 16...1107 <223> dao gén s pridaním na 5' zakončení nukleotidu kódujúceho 6 polyhistidínov (hisDAO) <400>
CACAGGAAAC AGACC ATG CAT CAT CAC CAC CAT CAC TTC ATG GCT AAA ATC 51
Met His His His His His His Phe Met Ala Lys íle 15 10
GTT GTT ATT GGG GCC GGT GTT GCC GGT TTA ACT ACA GCT CTT CAA CTT 99
Val Val 11-e Gly Ala Gly Val Ala Gly Leu Thr Thr Ala Leu Gin Leu
15 20 25
CTT CGT AAA GGA CAT GAG GTT ACA ATT GTG TCC GAG TTT ACG CCC GGT 147
Leu Arg Lys Gly His Glu Val Thr íle Val Ser Glu Phe Thr Pro Gly
30 35 40
GAT CTT AGT ATC GGA TAT ACC TCG CCT TGG GCA GGT GCC AAC TGG CTC 195
Asp Leu Ser íle Gly Tyr Thr Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Leu
45 50 55 60
ACA TTT TAC GAT GGA GGC AAG TTA GCC GAC TAC GAT GCC GTC TCT TAT 243
Thr Phe Tyr Asp Gly Gly Lys Leu Ala Asp Tyr Asp Ala Val Ser Tyr
65 70 75
CCT ATC TTG CGA GAG CTG GCT CGA AGC AGC CCC GAG GCT GGA ATT CGA 291
Pro íle Leu Arg Glu Leu Ala Arg Ser Ser Pro Glu Ala Gly íle Arg
80 85 90
CTC ATC AAC CAA CGC TCC CAT GTT CTC AAG CGT GAT CTT CCT AAA CTG 339
Leu íle Asn Gin Arg Ser His Val Leu Lys Arg Asp Leu Pro Lys Leu
95 100 105
GAA GGT GCC ATG TCG GCC ATC TGT CAA CGC· AAC CCC TGG TTC AAA AAC 387
Glu Gly Ala Met Ser Ala íle Cys Gin Arg Asn Pro Trp Phe Lys Asn
110 115 120
ACA GTC GAT TCT TTC GAG ATT ATC GAG GAC AGG TCC AGG ATT GTC CAC 435
Thr Val Asp Ser Phe Glu íle íle Glu Asp Arg Ser Arg íle Val His
125 130 135 140
GAT GAT GTG GCT TAT CTA GTC GAA TTT GCT TCC GTT TGT ATC CAC ACC 483
Asp Asp Val Ala Tyr Leu Val Glu Phe Ala Ser Val Cys íle His Thr
145 150 155
GGA GTC TAC TTG AAC TGG CTG ATG TCC CAA TGC TTA TCG CTC GGC GCC 531
Gly Val Tyr Leu Asn Trp Leu Met Ser Gin Cys Leu Ser Leu Gly Ala
- 160 165 170
ACG GTG GTT AAA CGT CGA GTG AAC CAT ATC AAG GAT GCC AAT TTA CTA 579
Thr Val Val Lys Arg Arg Val Asn His íle Lys Asp Ala Asn Leu Leu
175 180 185
CAC TCC TCA GGA TCA CGC CCC GAC GTG ATT GTC AAC TGT AGT GGT CTC 627
His Ser Ser Gly Ser Arg Pro Asp Val íle Val Asn Cys Ser Gly Leu
190 195 200
TTT GCC CGG TTC TTG GGA GGC GTC GAG GAC AAG AAG ATG TAC CCT ATT 675
Phe Ala Arg Phe Leu Gly Gly Val Glu Asp Lys Lys Met Tyr Pro íle
205 210 215 220
CGA GGA CAA GTC GTC CTT GTT CGA AAC TCT CTT CCT TTT ATG GCC TCC 723
Arg Gly Gin Val Val Leu Val Arg Asn Ser Leu Pro Phe Met Ala Ser
225 230 235
TTT TCC AGC ACT CCT GAA AAA GAA AAT GAA GAC GAA GCT CTA TAT ATC 771
Phe Ser Ser Thr Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asp Glu Ala Leu Tyr íle
240 245 250
ATG ACC CGA TTC GAT GGT ACT TCT ATC ATT GGC GGT TGT TTC CAA CCC 819
Met Thr Arg Phe Asp Gly Thr Ser íle íle Gly Gly Cys Phe Gin Pro
255 260 265
AAC AAC TGG TCA TCC GAA CCC GAT CCT TCT CTC ACC CAT CGA ATC CTG 867
Asn Asn Trp Ser Ser Glu Pro Asp Pro Ser Leu Thr His Arg íle Leu
270 275 280
TCT AGA GCC CTC GAC CGA TTC CCG GAA CTG ACC AAA GAT GGC CCT CTT 915
Ser Arg Ala Leu Asp Arg Phe Pro G1U Leu Thr Lys Asp Gly Pro Leu
285 290 295 300
GAC ATT GTG CGC GAA TGC GTT GGC
Asp íle Val Arg Glu Cys Val Gly
- 305
ccc CGA GTA GAA TTA GAG AAG ATC
Pro Arg Val Glu Leu Glu Lys íle
320
AAC TAT GGT GCC GCC GGT GCT GGT
Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly
335 340
GAT GAA GCT GTT TCT TAC GTC GAA
Asp Glu Ala Val Ser Tyr Val Glu
• 350 355
TAGAAGCTTG GCTGTTTTGG C
CAC CGT CCT GGT AGA GAG GGC GGT 963
His Arg Pro Gly Arg Glu Gly Gly
310 315
ccc GGC GTT GGC TTT GTT GTC CAT 1011
Pro Gly Val Gly Phe Val Val His
325 330
TAC CAG TCC TCT TAC GGC ATG GCT 1059
Tyr Gin Ser Ser Tyr Gly Met Ala
345
AGA GCT CTT ACT CGT CCA AAC CTT 1107
Arg Ala Leu Thr Arg Pro Asn Leu
360 364
1128
~7>V W *77

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. - Spôsob prípravy modifikovaného enzýmu oxidázy Daminokyseliny z Trigonopsis variabilis v hostiteľskom organizme inom, ako ľudskom, vyznačujúci sa nasledujúcimi krokmi:
    (a) izolácia DNA pre gén, ktorý kóduje oxidázu D-aminokyseliny z ktoréhokoľvek kmeňa mikroorganizmov, produkujúcich uvedený enzým;
    (b) odstránenie intrónu z uvedeného génu pomocou postupu založeného na použití syntetických oligonukleotidov a polymerázovej reťazovej reakcie (PCR);
    (c) inzercia fragmentu DNA získaného v (b) do plazmidu, ktorý je schopný replikácie v hostiteľskom organizme;
    (d) fúzia 5' zakončenia štruktúrnej oblasti génu bez intrónu, ktorý kóduje oxidázu D-aminokyseliny a syntetického spojovníka, ktorý obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu šesť histidínov;
    (e) transformácia hostiteľského organizmu rekombinantným plazmidom z kroku (d);
    (f) rast transformovaných buniek získaných z hostiteľského organizmu z kroku (e) vo vhodnom kultivačnom médiu za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu oxidázy D-aminokyseliny;
    (g) izolácia enzýmu oxidázy D-aminokyseliny z bunkovej kultúry z kroku (f) pomocou afinitnej chromatografie.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že gén, ktorý kóduje enzým oxidáza D-aminokyseliny, je gén z Trigonopsis variabilis.
  3. 3. Spôsob podľa nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m, že hostiteľský organizmus je Escherichia coli.
  4. 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že afinitná chromatografia použitá na izoláciu modifikovaného enzýmu je založená na nosiči s dvojmocnými katiónmi.
  5. 5. Príprava a prečistenie modifikovaného enzýmu oxidázy D-aminokyseliny vyznačujúce sa tým, že sa použije ktorýkoľvek z predchádzajúcich nárokov.
  6. 6. Spôsob použitia enzýmu oxidázy D-aminokyseliny podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že sa použije pri enzymatickej syntéze kyseliny 7β-(4-karboxybutanamid) cefalosporcipovej .
  7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že cefalosporín C reaguje s enzýmom oxidáza D-aminokyseliny vo vodnom médiu.
  8. 8. Spôsob podľa nárokov 6 a 7, vyznačuj úci sa t ý m, že enzymatická reakcia sa uskutočňuje pomocou imobilizovaného enzýmu oxidáza D-aminokyseliny.
SK648-99A 1997-09-25 1998-09-24 Enzymatic process for the preparation of cephalosporanic 7beta-(4-carboxybutanamide) acid by means of the modified enzyme d-aminoacid oxidase of i(trigonopsis variabilis) produced in i(escherichia coli) SK64899A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES009702008A ES2131018B1 (es) 1997-09-25 1997-09-25 Un procedimiento enzimatico para preparar acido 7beta-(4-carboxibutanamido)cefalosporanico utilizando la enzima d-aminoacido oxidasa de trigonopsis variabilis modificada producida en escherichia coli.
PCT/ES1998/000262 WO1999015632A1 (es) 1997-09-25 1998-09-24 UN PROCEDIMIENTO ENZIMATICO PARA PREPARAR ACIDO 7β-(4-CARBOXIBUTANAMIDO) CEFALOSPORANICO UTILIZANDO LA ENZIMA D-AMINOACIDO OXIDASA DE TRIGONOPSIS VARIABILIS MODIFICADA PRODUCIDA EN ESCHERICHIA COLI.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK64899A3 true SK64899A3 (en) 2000-05-16

Family

ID=8300695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK648-99A SK64899A3 (en) 1997-09-25 1998-09-24 Enzymatic process for the preparation of cephalosporanic 7beta-(4-carboxybutanamide) acid by means of the modified enzyme d-aminoacid oxidase of i(trigonopsis variabilis) produced in i(escherichia coli)

Country Status (17)

Country Link
US (1) US6635458B2 (sk)
EP (1) EP0969088A1 (sk)
JP (1) JP2001506868A (sk)
KR (1) KR20000069110A (sk)
CN (1) CN1246147A (sk)
AU (1) AU9162898A (sk)
CA (1) CA2272354A1 (sk)
CZ (1) CZ182399A3 (sk)
EE (1) EE9900205A (sk)
ES (1) ES2131018B1 (sk)
HU (1) HUP0000797A2 (sk)
IL (1) IL129533A0 (sk)
LT (1) LT4628B (sk)
LV (1) LV12359B (sk)
SK (1) SK64899A3 (sk)
WO (1) WO1999015632A1 (sk)
ZA (1) ZA988754B (sk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100342014C (zh) * 2004-04-08 2007-10-10 百瑞全球有限公司 重组d－氨基酸氧化酶
CN1912130B (zh) * 2005-08-08 2011-06-15 百瑞全球有限公司 一种用于制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法
CN101016540B (zh) * 2006-02-10 2010-04-07 台湾尖端先进生技医药股份有限公司 C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2268022B1 (sk) * 1974-04-22 1977-06-24 Rhone Poulenc Ind
JPS62262994A (ja) * 1986-05-12 1987-11-16 Asahi Chem Ind Co Ltd Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
CA2100987C (en) 1992-07-27 1999-06-15 Kaoru Furuya A transformant capable of producing d-amino acid oxidase
US5397653A (en) 1993-04-30 1995-03-14 Westinghouse Electric Corporation Filler wire composition and method of welding turbine component with filter wire composition and its product thereof
ES2109194B1 (es) 1996-04-22 1998-07-16 Antibioticos Sa Un procedimiento para producir la enzima d-aminoacido oxidasa de rhodotorula gracilis en celulas hospedantes.

Also Published As

Publication number Publication date
ES2131018A1 (es) 1999-07-01
LV12359B (en) 2000-03-20
EE9900205A (et) 1999-12-15
CZ182399A3 (cs) 1999-09-15
ES2131018B1 (es) 2000-04-01
KR20000069110A (ko) 2000-11-25
CA2272354A1 (en) 1999-04-01
IL129533A0 (en) 2000-02-29
US20030119087A1 (en) 2003-06-26
HUP0000797A2 (en) 2000-07-28
CN1246147A (zh) 2000-03-01
US6635458B2 (en) 2003-10-21
LV12359A (lv) 1999-10-20
WO1999015632A1 (es) 1999-04-01
LT4628B (lt) 2000-02-25
LT99051A (en) 1999-10-25
ZA988754B (en) 1999-06-28
JP2001506868A (ja) 2001-05-29
AU9162898A (en) 1999-04-12
EP0969088A1 (en) 2000-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4012257B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用方法
JP4510351B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
JP3950196B2 (ja) アルコールデヒドロゲナーゼ及びキラルヒドロキシ化合物の酵素的生産へのその使用
US5726032A (en) Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA
AU698889B2 (en) Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase B
US7399624B2 (en) Cephalosporin C acylases
WO1995004149A1 (en) Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca
Alonso et al. Engineering the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis to facilitate its overproduction in Escherichia coli and its downstream processing by tailor-made metal chelate supports
AU628265B2 (en) Cloned n-methylhydantoinase
WO2007094178A1 (ja) 新規な（ｓ，ｓ）－ブタンジオール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法
US6187574B1 (en) Process for producing the enzyme D-amino acid oxidase of Rhodotorula gracilis in host cells
SK64899A3 (en) Enzymatic process for the preparation of cephalosporanic 7beta-(4-carboxybutanamide) acid by means of the modified enzyme d-aminoacid oxidase of i(trigonopsis variabilis) produced in i(escherichia coli)
KR20070069196A (ko) 당전이 효소의 효소활성을 향상시키는 방법
JP5230234B2 (ja) 還元酵素及びその利用
CN106795511B (zh) 氧化酶、编码该酶的多核苷酸、以及它们的应用
MXPA99004513A (en) ENZYMATIC PROCESS FOR THE PREPARATION OF CEPHALOSPORANIC 7$b(g)-(4-CARBOXYBUTANAMIDE) ACID BY MEANS OF THE MODIFIED ENZYME D-AMINOACID OXIDASE OF TRIGONOPSIS VARIABILIS
JP4039037B2 (ja) 還元酵素遺伝子及びその利用
US5789226A (en) Genes encoding enzymes of bali restriction-modification system
JP2005034156A (ja) 菌類からのα−１，４−グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物での発現
JP3330670B2 (ja) アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法
JPH08238087A (ja) サルコシンオキシダーゼおよびその製造法
JPH0779775A (ja) Ｎａｄ（ｈ）結合型酸化還元不均化酵素およびその遺伝子
JPH09262089A (ja) ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼのｂ型サブユニットをコードするｄｎａ
EP0716698A1 (en) Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA