KR20240054417A - 항체 약물 접합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

항체 약물 접합체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 GNAQ/GNA11 억제제를 생성하는 미생물 및 방법과 GNAQ/GNA11 억제제에 접합된 항-PMEL17 항체 또는 항원 결합 단편의 항체 약물 접합체를 제조하는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한, GNAQ/GNA11 억제제에 접합된 항-PMEL17 항체 또는 항원 결합 단편의 항체 약물 접합체를 포함하는 제형, 및 이러한 제형을 사용하여 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

항체 약물 접합체 및 이의 제조 방법 {ANTIBODY DRUG CONJUGATES AND METHODS FOR MAKING THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 4월 16일에 출원된 미국 가출원 63/176,046호, 및 2021년 10월 8일에 출원된 미국 가출원 63/254,031호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2022년 4월 15일에 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 N2067-7179WO_SL.txt이고 크기는 239,071 바이트이다.
포도막 흑색종(UM)은 전체 흑색종의 3~5%를 차지하며 발생률이 100만 명당 6~10건이고 미국에서 연간 2500~3000건이 새로 발생하는 희귀 악성종양이다. 우수한 국소적 질병 통제율(5년-OSR 70%)에도 불구하고, 최대 50%의 환자에서 전이성 질환이 발생한다(간 60%, 폐 25%; 중앙 OS 13개월, 2년-OSR 8%). 전이성 질환이 발생한 환자에 대해 이용가능한 입증된 표준 치료는 없다. 전이성 UM 환자의 결과를 개선하기 위해서는 특별히 승인된 치료법과 전용 질병 관리 전략에 대한 의학적 필요성이 높다.
GNAQ 또는 GNA11의 발암성 돌연변이는 포도막 흑색종의 특징적인 돌연변이이다. GNAQ/11 수준의 감소는 세포 증식 및 아폽토시스의 억제로 이어진다. 억제 효과는 GNAQ/11 활성을 억제하는 항체 약물 접합체의 표적화 전달에 의해 달성될 수 있다. 최근의 진전에도 불구하고, 항체 약물 접합체에 대한 신규한 생체 시료, 제조 방법, 및 제형의 개발은 여전히 필요하다.
적어도 부분적으로, 본 발명은 뎁시펩티드(예를 들어, 화합물 (A1))를 높은 역가 및/또는 단리 수율로 생성하는 유전자 조작 미생물(예를 들어, 크로모박테리움 백시니이)을 제공한다. 일부 구현예에서, 미생물은 뎁시펩티드의 생합성 유전자 클러스터(BGC)에 작동가능하게 연결된 비천연 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 뎁시펩티드의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 파괴된다. 본원에 기재된 미생물을 사용하여 뎁시펩티드(예를 들어, 화합물 (A1))를 생성하는 방법이 또한 기술된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 뎁시펩티드(예를 들어, 화합물 (A1))는, 예를 들어 본원에 기재된 공정에 따라, 항체 약물 접합체(예를 들어, 본원에 기재된 항체 약물 접합체)를 생성하는 데 사용될 수 있다.
또한 적어도 부분적으로, 본 발명은 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 공정을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 공정은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 환원시켜, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공정은 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하기에 충분한 산화 조건하에 보관하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 공정을 사용하는, 항체 약물 접합체(예를 들어, 본원에 기재된 항체 약물 접합체)를 제조하는 공정이 또한 본원에 기술된다. 본원에 기재된 공정에 의해 제조된 항체 약물 접합체는 본원에 기재된 제형으로 제형화될 수 있다.
또한 적어도 부분적으로, 본 발명은 항체 약물 접합체(예를 들어, 본원에 기재된 항체 약물 접합체)에 대한 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 항체 약물 접합체, 완충제, 안정화제, 및 계면활성제를 포함하고, 약 4.5 내지 약 6.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제형은 동결건조 제형이다. 본원에 기재된 제형은 장애, 예를 들어 암을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 PMEL17을 발현하고/하거나 GNAQ 또는 GNA11 유전자에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 암종(예를 들어, 간세포 암종), 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 점막 흑색종), 또는 이의 전이암이다.
조작된 미생물 및 화합물 생성 방법
일 양태에서, 본 발명은 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 미생물로서, 뉴클레오티드 서열이 비천연 프로모터에 작동가능하게 연결된, 미생물을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 미생물은 상기 화합물을 자연적으로 생성하는 유전자 조작 형태이다. 일부 구현예에서, 미생물은 박테리아이다. 일부 구현예에서, 미생물은 크로모박테리움이다. 일부 구현예에서, 미생물은 크로모박테리움 백시니이이다. 일부 구현예에서, 미생물은 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150(= ATCC BAA-2314, = NRRL B-50840, = MWU205)이다. 일부 구현예에서, 미생물은 단리된 미생물이다. 일부 구현예에서, 미생물은 합성 미생물이다.
일부 구현예에서, 핵산은 미생물의 염색체 상에 존재한다(예를 들어, 염색체에 자연적으로 위치하거나 염색체에 안정적으로 통합됨). 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 생합성 유전자 클러스터(BGC)에 위치한다. 일부 구현예에서, BGC는 화합물 (A1)-BGC이다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)-BGC는 도 1에 도시된 유전자 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, BGC는 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 또는 frsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, BGC는 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 frsH, 또는 이의 상동체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 또는 frsH, 또는 이의 상동체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 또는 frsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 317의 뉴클레오티드 서열을 사용, 또는 이의 기능적 단편을 사용, 또는 이에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 100, 약 90, 약 80, 약 70, 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 사용한 상동성 재조합 사건(예를 들어, 프로모터 교환)으로 인해 발생한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 비천연 프로모터는 동일한 미생물로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 비천연 프로모터는 상이한 미생물로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 vioP 프로모터, nptII 프로모터, rbs 프로모터, J23119 프로모터, pLpp 프로모터, PS12burk 프로모터, ErmE* 프로모터, 또는 Pem7 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 vioP 프로모터, nptII 프로모터, 또는 rbs 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 vioP 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 nptII 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 rbs 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 J23119 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 pLpp 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 Pem7 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 PS12burk 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 ErmE* 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 또는 FrsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체의 전사를 제어한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 전사를 제어한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 FrsA 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류, 예를 들어 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH 전부, 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류에 삽입된다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 비리보솜 펩티드 합성효소(NRPS) 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 구현예에서, NRPS는 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG, 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 MbtH-유사 단백질 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 구현예에서, MbtH-유사 단백질은 FrsB 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 말산염 탈수소효소이다. 일부 구현예에서, 말산염 탈수소효소는 FrsC 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 수산화효소이다. 일부 구현예에서, 수산화효소는 FrsH 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 핵산은 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드는 복수의 NRPS, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 NRPS는 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG 중 2개 이상(예를 들어, 3, 4개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드는 NRPS, MbtH-유사 단백질, 말산염 탈수소효소, 및 수산화효소, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드는 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함한다.
일부 구현예에서, 미생물은 상기 화합물의 증가된 역가를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 화합물이 생성될 수 있는 조건하에 배양되는 경우, 상기 화합물의 역가는 기준 미생물, 예를 들어 화합물 (A1)-BGC에 비천연 프로모터를 포함하지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10배 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 화합물이 생성될 수 있는 조건하에 배양되는 경우, 상기 화합물의 역가는 기준 미생물, 예를 들어 화합물 (A1)-BGC에 비천연 프로모터를 포함하지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)과 비교하여 적어도 약 100 mg/L, 약 200 mg/L, 약 300 mg/L, 약 400 mg/L, 약 500 mg/L, 약 600 mg/L, 약 700 mg/L, 약 800 mg/L, 약 900 mg/L, 또는 약 1000 mg/L 증가된다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경(예를 들어, 파괴)된다. 일부 구현예에서, 천연 생성물은 비올라세인, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC의 적어도 일부가 결실된다. 일부 구현예에서, 비올라세인-BGC가 변경(예를 들어, 파괴)된다. 일부 구현예에서, 화합물 J-BGC가 변경(예를 들어, 파괴)된다. 일부 구현예에서, 화합물 J-BGC는화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 및 화합물 D의 생성과 관련된다. 일부 구현예에서, 비올라세인-BGC 및 화합물 J-BGC 둘 모두가 변경(예를 들어, 파괴)된다. 일부 구현예에서, 천연 생성물의 생성이, 예를 들어 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%, 감소된다.
일부 구현예에서, 미생물은 상기 화합물의 증가된 단리 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 단리 수율은 기준 미생물, 예를 들어 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경되지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 이상 증가된다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC는 변경되지 않는다(예를 들어, 파괴되지 않음).
다른 양태에서, 본 발명은 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물을 생성하는 미생물로서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경된, 미생물을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 천연 생성물은 비올라세인, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC의 적어도 일부가 결실된다. 일부 구현예에서, 비올라세인-BGC가 변경(예를 들어, 파괴)된다. 일부 구현예에서, 화합물 J-BGC가 변경(예를 들어, 파괴)된다. 일부 구현예에서, 화합물 J-BGC는화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 및 화합물 D의 생성과 관련된다. 일부 구현예에서, 비올라세인-BGC 및 화합물 J-BGC 둘 모두가 변경(예를 들어, 파괴)된다. 일부 구현예에서, 천연 생성물의 생성이, 예를 들어 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%, 감소된다.
일부 구현예에서, 미생물은 상기 화합물의 증가된 단리 수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 단리 수율은 기준 미생물, 예를 들어 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경되지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 이상 증가된다.
다른 양태에서, 본 발명은 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물을 생성하는 방법으로서, 상기 화합물의 발현이 가능한 조건하에, 본원에 기재된 미생물을 배양(예를 들어, 발효)시켜 상기 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 미생물은 약 50 L 내지 약 500 L 규모, 예를 들어 약 50 L, 약 100 L, 약 150 L, 약 200 L, 약 250 L, 약 300 L, 약 350 L, 약 400 L, 약 450 L, 또는 약 500 L 규모로 배양(예를 들어, 발효)된다. 일부 구현예에서, 미생물은 약 1,000 L 내지 약 20,000 L 규모, 예를 들어 약 1,000 L 내지 약 10,000 L, 또는 약 10,000 L 내지 약 20,000 L, 예를 들어 약 1,000 L, 약 2,000 L, 약 5,000 L, 약 7,500 L, 약 10,000 L, 약 15,000 L, 또는 약 20,000 L 규모로 배양(예를 들어, 발효)된다.
일부 구현예에서, 배양(예를 들어, 발효)은 적어도 약 200 mL 역가의 상기 화합물, 예를 들어 적어도 약 250 mg/mL, 약 300 mg/L, 약 400 mg/L, 약 500 mg/L, 약 600 mg/L, 약 700 mg/L, 약 800 mg/L, 약 900 mg/L, 약 1000 mg/L, 약 1100 mg/L, 약 1200 mg/L, 약 1300 mg/L, 약 1400 mg/L, 약 1500 mg/L, 약 1600 mg/L, 약 1700 mg/L, 약 1800 mg/L, 약 1900 mg/L, 또는 약 2000 mg/L 역가의 상기 화합물을 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어 본원에 기재된 방법으로 측정시, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 순도로 상기 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, 뉴클레오티드 서열이 비천연 프로모터에 작동가능하게 연결된, 핵산을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 핵산은 미생물의 염색체 상에 존재한다(예를 들어, 염색체에 자연적으로 위치하거나 염색체에 안정적으로 통합됨). 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 생합성 유전자 클러스터(BGC)에 위치한다. 일부 구현예에서, BGC는 화합물 (A1)-BGC이다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)-BGC는 도 1에 도시된 유전자 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, BGC는 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 또는 frsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, BGC는 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 frsH, 또는 이의 상동체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, frsH, 또는 이의 상동체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치한다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, frsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 317의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 100, 약 90, 약 80, 약 70, 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 비천연 프로모터는 동일한 미생물로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 비천연 프로모터는 상이한 미생물로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 vioP 프로모터, nptII 프로모터, rbs 프로모터, J23119 프로모터, pLpp 프로모터, PS12burk 프로모터, ErmE* 프로모터, 또는 Pem7 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 vioP 프로모터, nptII 프로모터, 또는 rbs 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 vioP 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 nptII 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 rbs 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 J23119 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 pLpp 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 Pem7 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 PS12burk 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 ErmE* 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 약 60, 약 50, 약 40, 약 30, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 또는 약 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 또는 FrsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체의 전사를 제어한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 전사를 제어한다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 FrsA 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류, 예를 들어 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH 전부, 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류에 삽입된다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 비리보솜 펩티드 합성효소(NRPS) 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 구현예에서, NRPS는 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG, 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 MbtH-유사 단백질 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 구현예에서, MbtH-유사 단백질은 FrsB 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 말산염 탈수소효소이다. 일부 구현예에서, 말산염 탈수소효소는 FrsC 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드는 수산화효소이다. 일부 구현예에서, 수산화효소는 FrsH 또는 이의 상동체이다.
일부 구현예에서, 핵산은 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드는 복수의 NRPS, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 NRPS는 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG 중 2개 이상(예를 들어, 3, 4개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드는 NRPS, MbtH-유사 단백질, 말산염 탈수소효소, 및 수산화효소, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드는 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 핵산은 단리된 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 비자연발생 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 합성 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 돌연변이, 예를 들어 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 BGC로부터 유래된다. 일부 구현예에서, BGC는 화합물 J-BGC이다. 일부 구현예에서, 화합물 J-BGC는 도 1에 도시된 유전자 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 dis1, dis2, dis3, 또는 dis4 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, BGC는 dis1, dis2, dis3, 및 dis4, 또는 이의 상동체를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 특징으로 한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 또는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 세포를 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포를 조작하는 방법으로서, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 변경하여 세포를 조작하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 세포는 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물을 자연적으로 생성하는 미생물이다. 일부 구현예에서, 미생물은 박테리아, 예를 들어 크로모박테리움이다. 일부 구현예에서, 미생물은 크로모박테리움 백시니이, 예를 들어 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150(= ATCC BAA-2314, = NRRL B-50840, = MWU205)이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 파괴된다(예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부가 결실됨).
일부 구현예에서, 핵산은 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부)의 생성이, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%, 감소된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 BGC로부터 유래된다. 일부 구현예에서, BGC는 화합물 J-BGC이다. 일부 구현예에서, 화합물 J-BGC는 도 1에 도시된 유전자 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 dis1, dis2, dis3, 또는 dis4 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, BGC는 dis1, dis2, dis3, 및 dis4, 또는 이의 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경은 상기 화합물의 단리 수율을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 화합물의 단리 수율은 기준 미생물, 예를 들어 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경되지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 이상 증가된다.
부분 재산화 및 항체 약물 접합체 제조를 위한 공정
다른 양태에서, 본 발명은 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 공정으로서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; 및 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 산화 조건하에 보관하여, 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계를 포함하는 공정을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 불변 도메인에 위치한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 4개의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 각 CH1 영역에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡핑된 시스테인 잔기는 조작된 표면-노출 시스테인 잔기이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역의 잔기 152(EU 넘버링)에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기는 시스테인 또는 글루타티온으로 캡핑된다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 환원시켜, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 불변 도메인에 위치한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 4개의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2개의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 각 CH1 영역에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 디캡핑된 시스테인 잔기는 조작된 표면-노출 시스테인 잔기이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역의 잔기 152(EU 넘버링)에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 접촉시켜 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 환원시킴으로써 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 환원 세척 버퍼는 약 5 mM 내지 약 50 mM, 예를 들어 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 15 mM, 약 5 mM 내지 약 25 mM, 약 5 mM 내지 약 35 mM, 약 5 mM 내지 약 45 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 15 mM 내지 약 25 mM, 약 25 mM 내지 약 35 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 35 mM 내지 약 45 mM, 예를 들어 약 10 mM, 약 12 mM, 약 14 mM, 약 16 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 또는 약 30 mM의 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 환원 세척 버퍼는 약 5 mM 내지 약 15 mM의 시스테인, 예를 들어 약 10 mM의 시스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, 환원 세척 버퍼의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5, 예를 들어 약 6.5 내지 약 7.2, 또는 약 6.8 내지 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 환원 세척 버퍼의 pH는 약 6.8 내지 약 7.0, 예를 들어 약 6.9이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 접촉시키는 단계는 컬럼(예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼)에서 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 환원 세척 버퍼와 접촉시킨 후, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 용리액에 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용리액의 pH는 약 5.5 내지 약 6.0, 예를 들어 약 5.8이다. 일부 구현예에서, 용리액 중 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 5 g/L 내지 25 g/L, 예를 들어 약 8 g/L 내지 약 20 g/L, 약 10 g/L 내지 약 18 g/L, 약 12 g/L 내지 약 15 g/L, 약 5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 5 g/L 내지 약 15 g/L, 약 5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 20 g/L 내지 약 25 g/L, 약 15 g/L 내지 약 25 g/L, 약 10 g/L 내지 약 25 g/L, 약 10 g/L 내지 약 20 g/L, 약 13 g/L 내지 약 14 g/L, 약 12 g/L 내지 약 15 g/L, 예를 들어 약 5 g/L, 약 6 g/L, 약 7 g/L, 약 8 g/L, 약 9 g/L, 약 10 g/L, 약 11 g/L, 약 12 g/L, 약 13 g/L, 약 13.5 g/L, 약 14 g/L, 약 15 g/L, 약 16 g/L, 약 17 g/L, 약 18 g/L, 약 19 g/L, 약 20 g/L, 약 21 g/L, 약 22 g/L, 약 23 g/L, 약 24 g/L, 또는 약 25 g/L이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 교반과 함께 용리액에 보관된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 교반 없이 용리액에 보관된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 최대 약 50% 내지 약 70% 용량까지 채워져 용기에, 예를 들어 약 12시간 내지 약 96시간, 예를 들어 약 12시간 내지 약 84시간, 약 24시간 내지 약 84시간, 약 36시간 내지 약 72시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 60시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 72시간 내지 약 84시간, 약 60시간 내지 약 84시간, 약 48시간 내지 약 84시간, 약 36시간 내지 약 84시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 36시간 내지 약 60시간, 약 48시간 내지 약 72시간, 또는 약 72시간 내지 약 96시간, 예를 들어 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 약 84시간, 또는 약 96시간 동안, 보관된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 최대 약 60%까지 채워져 용기에 보관된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 48시간 내지 약 72시간 동안, 예를 들어 교반 없이, 보관된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 12시간 내지 약 36시간, 예를 들어 약 24시간 동안, 예를 들어 교반과 함께, 보관된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실온에서 보관된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 2℃ 내지 약 8℃(예를 들어, 약 4℃)에서, 예를 들어 적어도 48시간(예를 들어, 적어도 약 48시간 내지 약 96시간) 동안, 보관된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 공기 오버레이 상태로 보관된다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 링커-약물 모이어티(예를 들어, 본원에 기재된 링커-약물 모이어티)를 접합시켜 항체 약물 접합체(예를 들어, 본원에 기재된 항체 약물 접합체)를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 하기 화학식 (B)의 링커-약물 모이어티를 미리 형성하는 단계를 추가로 포함하며:
[화학식 (B)]
R8-LB-(D)n
식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
R8은 반응성 기이고;
LB는 절단성 또는 비절단성 링커이고,
n은 1, 2, 3, 또는 4이다.
일부 구현예에서, D는 본원에 기재된 GNAQ 억제제이다. 일부 구현예에서, D는 본원에 기재된 GNA11 억제제이다. 일부 구현예에서, D는 본원에 기재된 바와 같은 GNAQ 및 GNA11의 억제제이다. 일부 구현예에서, R은 본원에 기재된 반응성 기이다. 일부 구현예에서, LB는 본원에 기재된 절단성 링커이다. 일부 구현예에서, LB는 본원에 기재된 비절단성 링커이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PMEL17에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 항체 약물 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 공정은 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 온-사이트(on-site) 커플링(예를 들어, 중쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("HC1"))을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 공정은 약 25% 미만, 예를 들어 적어도 약 20%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 오프-사이트(off-site) 커플링(예를 들어, 경쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("LC1") 및/또는 중쇄당 2개의 링커-약물 모이어티("HC2"))을 생성한다. 일부 구현예에서, 비환원 CE-SDS로 측정시, 상기 공정은 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 순도를 야기한다.
다른 양태에서, 본 발명은 항-PMEL17 항체 약물 접합체를 생성하는 공정으로서,
하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 함께 제공하여, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 단계;
하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 산화 조건하에 보관하여, 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 링커-약물 모이어티를 접합시켜 항-PMEL17 항체 약물 접합체를 생성하는 단계를 포함하고,
항체 또는 이의 항원 결합 단편이 PMEL17에 결합하고;
링커-약물 모이어티가 하기 화학식 (B)를 갖는, 공정을 특징으로 한다:
[화학식 (B)]
R8-LB-(D)n
[식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
R8은 반응성 기이고;
LB는 절단성 또는 비절단성 링커이고,
n은 1, 2, 3, 또는 4임].
항체 약물 접합체의 제형
다른 양태에서, 본 발명은 항체 약물 접합체, 완충제, 안정화제, 및 계면활성제를 포함하는 제형으로서, 제형의 pH가 4.5 내지 6.5이고, 항체 약물 접합체가 화학식 (C)를 포함하는, 제형을 특징으로 한다:
[화학식 (C)]
Ab-(LA-(D)n)y
[식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
LA는 링커이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
일 구현예에서, D는 본원에 기재된 GNAQ 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 GNA11 억제제, 또는 본원에 기재된 GNAQ 및 GNA11의 억제제이다.
일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 약 5 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 예를 들어 약 10 mg 내지 약 30 mg, 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 18 mg/mL 내지 약 22 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 25 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 25 mg 내지 약 30 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 또는 약 18 mg/mL 내지 약 22 mg/mL, 예를 들어 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 11 mg/mL, 약 12 mg/mL, 약 13 mg/mL, 약 14 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 16 mg/mL, 약 17 mg/mL, 약 18 mg/mL, 약 19 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 21 mg/mL, 약 22 mg/mL, 약 23 mg/mL, 약 24 mg/mL, 또는 약 25 mg/mL의 농도로 존재한다.
일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 예를 들어 약 20 mg/mL의 농도로 존재한다.
일 구현예에서, 완충제는 히스티딘을 포함한다. 일 구현예에서, 완충제는 석시네이트를 포함한다. 일 구현예에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM, 예를 들어 약 10 mM 내지 약 40 nM, 약 15 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 15 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 35 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 15 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 15 mM 내지 약 25 mM, 약 25 mM 내지 약 35 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 35 mM 내지 약 45 mM, 예를 들어 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 또는 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 완충제는 약 15 mM 내지 약 25 mM, 예를 들어 약 20 mM의 농도로 존재한다.
일 구현예에서, 안정화제는 수크로스를 포함한다. 일 구현예에서, 안정화제는 트레할로스를 포함한다. 일 구현예에서, 안정화제는 약 100 mM 내지 약 500 mM, 예를 들어 약 150 mM 내지 약 450 mM, 약 200 mM 내지 약 400 mM, 약 250 mM 내지 약 350 mM, 약 100 mM 내지 약 450 mM, 약 100 mM 내지 약 400 mM, 약 100 mM 내지 약 350 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 250 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 약 450 mM 내지 약 500 mM, 약 400 mM 내지 약 500 mM, 약 350 mM 내지 약 500 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 약 250 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 250 mM, 약 200 mM 내지 약 250 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM, 약 300 mM 내지 약 400 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM, 예를 들어 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 240 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 또는 약 500 mM의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 안정화제는 약 200 mM 내지 약 300 mM, 예를 들어 약 240 mM의 농도로 존재한다.
일 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20을 포함한다. 일 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일 구현예에서, 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.06%, 예를 들어 약 0.02% 내지 약 0.05%, 약 0.03% 내지 약 0.04%, 약 0.01% 내지 약 0.05%, 약 0.01% 내지 약 0.04%, 약 0.01% 내지 약 0.03%, 약 0.01% 내지 약 0.02%, 약 0.05% 내지 약 0.06%, 약 0.04% 내지 약 0.06%, 약 0.03% 내지 약 0.06%, 약 0.02% 내지 약 0.06%, 약 0.02% 내지 약 0.04%, 약 0.03% 내지 약 0.05%, 예를 들어 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 또는 약 0.06%의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.03%, 예를 들어 약 0.02%의 농도로 존재한다.
일 구현예에서, 제형의 pH는 약 4.7 내지 약 5.3, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.2 내지 약 5.8, 약 5.4 내지 약 5.6, 약 5.2 내지 약 6.0, 약 5.4 내지 약 6.0, 약 5.6 내지 약 6.0, 약 5.8 내지 약 6.0, 약 5 내지 약 5.8, 약 5 내지 약 5.6.0, 약 5 내지 약 5.4, 약 5 내지 약 5.2, 약 4.8 내지 약 5.2, 약 5.1 내지 약 5.3, 약 5.2 내지 약 5.4, 약 5.3 내지 약 5.5, 약 5.5 내지 약 5.7, 약 5.6 내지 약 5.8, 약 5.7 내지 약 5.9, 약 4.9 내지 약 5.5, 약 5.5 내지 약 6.1, 또는 약 5.7 내지 약 6.3, 예를 들어 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 또는 약 6.5이다. 일 구현예에서, 제형의 pH는 약 5.0 내지 약 5.6, 예를 들어 약 5.3이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0 내지 약 5.6이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0 내지 약 5.6이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.3이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.3이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.7 내지 약 5.3이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.7 내지 약 5.3이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.03% 내지 약 0.05%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.03% 내지 약 0.05%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.04%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.04%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.03% 내지 약 0.05%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.03% 내지 약 0.05%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 약 10 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 10 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.7 내지 약 6.3이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.7 내지 약 6.3이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 6.0이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 6.0이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트를 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.9 내지 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.9 내지 약 5.5이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5 내지 약 6.1이다.
일 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5 내지 약 6.1이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.8이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 제형으로부터 동결건조된 동결건조 제형을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 약 5 mL 내지 약 5.5 mL의 제형이 동결건조된다.
일 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형과 비교하여, 동결건조 제형의 D는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 안정적이다. 일 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형과 비교하여, 동결건조 제형 내 개환 입체형태를 갖는 D의 백분율은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 낮다.
일 구현예에서, 동결건조 제형은 약 80 mg 내지 약 120 mg(예를 들어, 약 107 mg)의 항체 약물 접합체를 포함한다.
일 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 단량체 수준은 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다.
일 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 단편 수준은 약 3% 미만, 예를 들어 약 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 응집체 수준은 약 3% 미만, 예를 들어 약 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형의 분해 수준은 약 2% 미만, 예를 들어 약 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 10 μm 이상의 입자 수준은 약 300개 입자/ml 미만, 예를 들어 약 280개 입자/mL 미만, 약 260개 입자/mL 미만, 약 240개 입자/mL 미만, 약 220개 입자/mL 미만, 약 200개 입자/mL 미만, 약 180개 입자/mL 미만, 약 160개 입자/mL 미만, 약 140개 입자/mL 미만, 120개 입자/mL, 약 100개 입자/mL 미만, 80개 입자/mL, 60개 입자/mL, 40개 입자/mL, 20개 입자/mL, 또는 10개 입자/mL이다.
일 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 10 μm 초과의 입자 수준은 약 3배 이하, 예를 들어 약 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5배 이하만큼 증가된다.
일 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 25 μm 초과의 입자 수준은 약 3배 이하, 예를 들어 약 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5배 이하만큼 증가된다.
일 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 25 μm 초과의 입자 수준은 약 20개 입자/mL 미만, 예를 들어 약 15개 입자/mL, 10개 입자/mL, 5개 입자/mL, 또는 2개 입자/mL 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 모세관 전기영동으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 불순물 수준은 약 15% 미만, 예를 들어 약 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 모세관 전기영동으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 불순물 수준은 20% 이하, 예를 들어 약 15%, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 이하만큼 증가된다.
일 구현예에서, 예를 들어 모세관 구역 전기영동(CZE)으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 중성 변이체 수준은 약 50% 초과, 예를 들어 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과이다.
일 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 중성 변이체 수준은 약 20% 이하, 예를 들어 약 15%, 10%, 5%, 또는 2% 이하만큼 감소된다.
일 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 산성 변이체 수준은 약 30% 미만, 예를 들어 약 25%, 20%, 15%, 5%, 또는 2% 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 산성 변이체 수준은 약 50% 이하, 예를 들어 약 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이하만큼 증가된다.
일 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 염기성 변이체 수준은 약 30% 미만, 예를 들어 약 25%, 20%, 15%, 5%, 또는 2% 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 염기성 변이체 수준은 약 50% 이하, 예를 들어 약 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이하만큼 증가된다.
일 구현예에서, 예를 들어 생체활성 분석으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형의 효능은 약 25% 이하, 예를 들어 약 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 2% 이하만큼 감소된다.
일 구현예에서, 동결건조 제형의 삼투질 농도는 약 200 mOsm/L 내지 400 mOsm/L, 예를 들어 200 mOsm/L 내지 300 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 290 mOsm/L 내지 310 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 290 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 310 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 330 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 310 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 290 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 270 mOsm/L, 260 mOsm/L 내지 280 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 290 mOsm/L, 280 mOsm/L 내지 300 mOsm/L, 300 mOsm/L 내지 320 mOsm/L, 310 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 또는 320 mOsm/L 내지 340 mOsm/L, 예를 들어 200 mOsm/L, 250 mOsm/L, 260 mOsm/L, 270 mOsm/L, 280 mOsm/L, 290 mOsm/L, 300 mOsm/L, 310 mOsm/L, 320 mOsm/L, 330 mOsm/L, 340 mOsm/L, 350 mOsm/L, 또는 400 mOsm/L이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 동결건조 제형으로부터 재구성된 액상 제형을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 동결건조 제형을 포함하는 용기를 특징으로 한다.
일 구현예에서, 용기는 바이알, 예를 들어 25R 유리 바이알이다. 일 구현예에서, 용기는 마개 및 캡(예를 들어, 플립-오프 알루미늄 캡)을 추가로 포함한다.
치료 방법
다른 양태에서, 본 발명은 암 치료 방법으로서, 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC) 또는 본원에 기재된 제형을 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로 투여하여 암을 치료하는, 방법을 특징으로 한다.
일 구현예에서, ADC는 2 mg/kg 내지 15 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, ADC는 1 mg/kg, 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 12 mg/kg, 또는 16 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, ADC는 주 1회, 2주에 1회, 또는 4주에 1회 투여된다. 일 구현예에서, ADC는 2주에 1회 투여된다. 일 구현예에서, ADC는 정맥내로 투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 있다. 일 구현예에서, 대상체는 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 없다.
일 구현예에서, 암은 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, 흑색종은 PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 암은 흑색종이다. 일 구현예에서, 암은 악성 흑색종, 포도막 흑색종, 안구 흑색종, 안암, 안구 신생물, 피부 흑색종, 또는 점막 흑색종이다.
일 구현예에서, ADC는 하기 구조식을 가지며:
식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, y는 1, 2, 3, 또는 4이다. 일 구현예에서, y는 2이다.
일 구현예에서, Ab는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3.
일 구현예에서, Ab는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일 구현예에서, Ab는 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, Ab는 N-글리코실화 부위를 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, N-글리코실화 부위는 Asn306에 위치한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 전멜라닌소체 단백질 17(PMEL17), 인산화 ERK(pERK), 분화 클러스터 8(CD8), 예정사-리간드 1(PD-L1), 이중 특이성 포스파타제 6(DUSP6), Ras 구아닐-방출 단백질 3(RASGRP3), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현은 대상체의 샘플에서 측정된다. 일 구현예에서, 샘플은 ADC의 투여 전, 투여 중, 및/또는 투여 후에 대상체로부터 채취된다. 일 구현예에서, 샘플은 종양 샘플이다. 예를 들어, 종양 샘플은 보관된 조직 블록일 수 있거나, 바늘생검에 의해 얻을 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 mRNA 발현이 측정된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 단백질 발현이 측정된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 차세대 DNA 시퀀싱을 통해 하나 이상의 암 관련 유전자를 검출하는 단계, 전체 전사체 분석을 수행하는 단계, 하나 이상의 면역 및 암 관련 유전자의 발현을 측정하는 단계, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 대상체의 샘플에서 무세포 DNA(cfDNA)를 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 샘플은 ADC의 투여 전, 투여 중, 및/또는 투여 후에 대상체로부터 채취된다. 일 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 일 구현예에서, 무세포 DNA의 평가는 드라이버 돌연변이 상태, 예측 약력학, 종양 돌연변이 부담(TMB), 또는 내성 마커 중 하나 이상을 측정한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체(예를 들어, 본원에 기재된 대상체)의 질환(예를 들어, 본원에 기재된 질환)의 치료(예를 들어, 본원에 기재된 치료)를 평가하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라, 대상체의 샘플(예를 들어, 본원에 기재된 샘플)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하고/하거나 무세포 DNA(cfDNA)를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체(예를 들어, 본원에 기재된 대상체)의 질환(예를 들어, 본원에 기재된 질환)의 진행을 평가하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라, 대상체의 샘플(예를 들어, 본원에 기재된 샘플)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하고/하거나 무세포 DNA(cfDNA)를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체(예를 들어, 본원에 기재된 대상체)의 질환(예를 들어, 본원에 기재된 질환)에 대한 치료(예를 들어, 본원에 기재된 치료)를 선택하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라, 대상체의 샘플(예를 들어, 본원에 기재된 샘플)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하고/하거나 무세포 DNA(cfDNA)를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 질환(예를 들어, 본원에 기재된 질환)에 대한 치료(예를 들어, 본원에 기재된 치료)를 위한 대상체(예를 들어, 본원에 기재된 대상체)를 선택하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 따라, 대상체의 샘플(예를 들어, 본원에 기재된 샘플)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하고/하거나 무세포 DNA(cfDNA)를 평가하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
기타 구현예
본원에 기재된 양태 및 구현예는 하기 임의의 구현예를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, PMEL17에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1, 4, 5 또는 7의 중쇄 CDR1(상보성 결정 영역 1), 서열번호 2, 6 또는 8의 중쇄 CDR2(상보성 결정 영역 2), 및 서열번호 3 또는 9의 중쇄 CDR3(상보성 결정 영역 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 14, 17 또는 20의 경쇄 CDR1(상보성 결정 영역 1), 서열번호 15 또는 18의 경쇄 CDR2(상보성 결정 영역 2), 및 서열번호 16 또는 19의 경쇄 CDR3(상보성 결정 영역 3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열번호 33, 36, 37 또는 39의 중쇄 CDR1, 서열번호 34, 38 또는 40의 중쇄 CDR2, 서열번호 35 또는 41의 중쇄 CDR3, 서열번호 46, 49 또는 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48 또는 51의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(c) 서열번호 5, 7, 57 또는 60의 중쇄 CDR1, 서열번호 58, 61 또는 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 59 또는 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 68, 71 또는 74의 경쇄 CDR1, 서열번호 69 또는 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70 또는 73의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(d) 서열번호 79, 82, 83 또는 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 80, 84 또는 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 81 또는 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 92, 95 또는 98의 경쇄 CDR1, 서열번호 93 또는 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94 또는 97의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(e) 서열번호 103, 106, 107 또는 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 104, 108 또는 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 105 또는 111의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117 또는 118의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(f) 서열번호 123, 126, 127 또는 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 124, 128 또는 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 125 또는 131의 중쇄 CDR3, 서열번호 136, 139 또는 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 137 또는 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138 또는 141의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(g) 서열번호 123, 126, 127 또는 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 124, 128 또는 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 147 또는 148의 중쇄 CDR3, 서열번호 153, 156 또는 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50 또는 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155 또는 157의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(h) 서열번호 103, 106, 107 또는 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 104, 108 또는 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 163 또는 164의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169 또는 170의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(i) 서열번호 175, 178, 179 또는 181의 중쇄 CDR1, 서열번호 176, 180 또는 182의 중쇄 CDR2, 서열번호 177 또는 183의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188 또는 189의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(j) 서열번호 103, 106, 107 또는 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 104, 108 또는 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 194 또는 195의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200 또는 201의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(k) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 208 또는 214의 중쇄 CDR3, 서열번호 153, 156 또는 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50 또는 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219 또는 220의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(l) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 225 또는 226의 중쇄 CDR3, 서열번호 136, 139 또는 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 137 또는 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231 또는 232의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(m) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 HCDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 HCDR2, 및 서열번호 237 또는 238의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243, 245 또는 247의 LCDR1, 서열번호 47 또는 50의 LCDR2, 및 서열번호 244 또는 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(n) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 HCDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 HCDR2, 및 서열번호 252 또는 253의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153, 156 또는 158의 LCDR1, 서열번호 50 또는 154의 LCDR2, 및 서열번호 258 또는 259의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(o) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(p) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(q) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3;
(r) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(s) 서열번호 33의 중쇄 CDR1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(t) 서열번호 36의 중쇄 CDR1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(u) 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3;
(v) 서열번호 39의 중쇄 CDR1, 서열번호 40의 중쇄 CDR2, 서열번호 41의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(w) 서열번호 57의 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 69의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
(x) 서열번호 60의 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 69의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
(y) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 61의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 73의 경쇄 CDR3;
(z) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 74의 경쇄 CDR1, 서열번호 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
(aa) 서열번호 79의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 92의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
(bb) 서열번호 82의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 92의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
(cc) 서열번호 83의 중쇄 CDR1, 서열번호 84의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 95의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 97의 경쇄 CDR3;
(dd) 서열번호 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 98의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
(ee) 서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
(ff) 서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
(gg) 서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 118의 경쇄 CDR3;
(hh) 서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 111의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
(ii) 서열번호 123의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
(jj) 서열번호 126의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
(kk) 서열번호 127의 중쇄 CDR1, 서열번호 128의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 139의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 141의 경쇄 CDR3;
(ll) 서열번호 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 131의 중쇄 CDR3, 서열번호 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
(mm) 서열번호 123의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
(nn) 서열번호 126의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
(oo) 서열번호 127의 중쇄 CDR1, 서열번호 128의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 156의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 157의 경쇄 CDR3;
(pp) 서열번호 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 148의 중쇄 CDR3, 서열번호 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
(qq) 서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
(rr) 서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
(ss) 서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 170의 경쇄 CDR3;
(tt) 서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 164의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
(uu) 서열번호 175의 중쇄 CDR1, 서열번호 176의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
(vv) 서열번호 178의 중쇄 CDR1, 서열번호 176의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
(ww) 서열번호 179의 중쇄 CDR1, 서열번호 180의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 189의 경쇄 CDR3;
(xx) 서열번호 181의 중쇄 CDR1, 서열번호 182의 중쇄 CDR2, 서열번호 183의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
(yy) 서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
(zz) 서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
(aaa) 서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 201의 경쇄 CDR3;
(bbb) 서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 195의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
(ccc) 서열번호 206의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
(ddd) 서열번호 209의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
(eee) 서열번호 210의 중쇄 CDR1, 서열번호 211의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 156의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 220의 경쇄 CDR3;
(fff) 서열번호 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 214의 중쇄 CDR3, 서열번호 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
(ggg) 서열번호 206의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
(hhh) 서열번호 209의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
(iii) 서열번호 210의 중쇄 CDR1, 서열번호 211의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 139의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 232의 경쇄 CDR3;
(jjj) 서열번호 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 226의 중쇄 CDR3, 서열번호 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
(kkk) 서열번호 206의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243의 LCDR1, 서열번호 47의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(lll) 서열번호 209의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243의 LCDR1, 서열번호 47의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(mmm) 서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 245의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(nnn) 서열번호 212의 HCDR1, 서열번호 213의 HCDR2, 및 서열번호 238의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 247의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ooo) 서열번호 206의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153의 LCDR1, 서열번호 154의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ppp) 서열번호 209의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153의 LCDR1, 서열번호 154의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(qqq) 서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 156의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 259의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(rrr) 서열번호 212의 HCDR1, 서열번호 213의 HCDR2, 및 서열번호 253의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 158의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 구현예에서, PMEL17에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(c) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(d) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(e) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(f) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(g) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(h) 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(i) 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(j) 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(k) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(l) 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(m) 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(n) 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 233의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(o) 서열번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(p) 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
일부 구현예에서, PMEL17에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(c) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(e) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(f) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(g) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(h) 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(i) 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(j) 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(k) 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(l) 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 204의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(m) 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(n) 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(o) 서열번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(p) 서열번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(q) 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(r) 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(s) 서열번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 시스테인 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 E152C, S375C, 또는 E152C 및 S375C 둘 모두로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 E152C 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨).
일부 구현예에서, 항체 분자는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 단리된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 합성 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 조작된 항체이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 기재된 핵산에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 13, 24, 28, 32, 45, 56, 67, 78, 91, 102, 115, 122, 135, 146, 152, 162, 168, 174, 187, 193, 199, 205, 218, 224, 230, 236, 242, 251, 257, 263, 319, 또는 320의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 벡터에 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산 또는 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 본원에 기재된 숙주 세포에 존재한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계는 세포를 제거하고 배양물을 여과하는 단계; 친화성 크로마토그래피로 배양물을 정제하는 단계; pH를 3.4~3.6으로 조정한 후 pH를 5.8~6.2로 재조정하여 배양물 내 임의의 바이러스를 비활성화하고 배양물을 여과하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피로 배양물을 정제하고 배양물의 컬럼내 환원을 수행하는 단계; 배양물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 나노여과로 바이러스를 제거하는 단계; 항체를 함유한 배양물을 여과하는 단계; 및 정제된 항체를 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 본원에 기재된 공정에 의해 제조된 항체 약물 접합체이다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 화학식 (C)를 포함하며:
[화학식 (C)]
Ab-(LA-(D)n)y
식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
LA는 링커이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4이다.
일부 구현예에서, 상기 n은 1이다. 일부 구현예에서, 상기 y는 약 1 내지 약 4이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 절단성 링커 또는 비절단성 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 ValCit 펩티드 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 약물 모이어티는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이다.
일부 구현예에서, D는 다음과 같다:
.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 하기 구조식을 갖는다:
.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 하기 화학식 (C-2)를 가지며:
[화학식 (C-2)]
,
식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4이다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 항체 약물 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 존재한다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 본원에 기재된 제형에 존재한다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체 또는 제형은 의약으로서 사용된다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체 또는 제형은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 암을 치료 또는 예방하는 방법에 사용되며, 상기 방법은 상기 환자에게 항체 약물 접합체 또는 제형을 투여하는 단계를 포함하고, 암은 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, 암은 PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 암종(예를 들어, 간세포 암종), 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 점막 흑색종), 또는 이의 전이암이다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체 또는 제형은 하나 이상의 추가 치료 화합물과 조합하여 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료 화합물은 표준 치료 화학요법제, MDM2 억제제, MRC2 억제제, PKC 억제제, MAPK 억제제, 공동자극 분자, 또는 체크포인트 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING, 또는 CD83 리간드의 작용제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타의 억제제로부터 선택된다.
도 1은 C. 백시니이에서 화합물 (A1)(frsA-H) 및 화합물 J(dis1-4)의 유전자 구조 및 전이가능 요소 함유 BGC를 도시한다(76974 bp).
도 2는 프로모터 교환에 사용된 삽입 전략의 도식을 나타낸다.
도 3은 야생형과 비교하여 파괴 돌연변이체에서의 화합물 J의 생성을 나타낸다.
도 4는 화합물 J의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 화합물 F5의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 화합물 F3의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 화합물 D의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 화합물 J 생합성의 개략도를 도시한다. 도면에는 "Ser Val His Val Leu Val"이 서열번호 24로 개시되어 있다.
도 9는 예시적인 온-사이트 및 오프-사이트 접합을 도시한다.
도 10a는 화합물 (A1)-BGC의 구조(백색: NRPS 유전자, 및 흑색: 변형 효소를 암호화하는 유전자) 및 교환된 프로모터의 표현을 도시한다.
도 10b는 야생형 대비 배수 변화를 포함하는 다양한 C. 백시니이 프로모터 교환 돌연변이체로부터의 화합물 (A1)의 역가에 대한 막대 그래프를 도시한다.
도 11a는 C. 백시니이 야생형 및 C. 백시니이 vioP 돌연변이체의 배양 추출물의 HPLC-MS 추출 이온 크로마토그램(EIC) 1002.535~1002.545 Da를 도시한다.
도 11b는 화합물 (A1)의 세 가지 신규 유사체를 나타내는, L-Met가 공급된 C. 백시니이 vioP 돌연변이체의 배양 추출물의 HPLC-MS EIC 1020.49~1020.50 Da를 도시한다.
도 12a는 5 μg/mL 및 37℃로 인간 혈장에서 8시간 동안 인큐베이션 후 m/z 1002.52~1002.57에서의 화합물 (A1)(아래) 및 추가 100 ng의 화합물 5를 첨가한 동일한 샘플(최종 농도 6 μg/mL)의 HPLC-MS 추출 이온 크로마토그램(EIC)을 도시한다.
도 12b는 5 μg/mL 및 37℃로 인간 혈장에서 24시간 동안 화합물 (A1)을 인큐베이션한 후 화합물 (A1) 및 5의 절대 정량화 및 분율을 도시한다.
도 13a는 Gq 또는 G11 돌연변이 포도막 흑색종(UM) 세포주 및 Gq 또는 G11 야생형 피부 흑색종 세포주의 증식에 대한 화합물 (A1) 및 2 내지 8의 효과를 나타낸다. 항시적 활성 Gq 또는 G11 돌연변이체에 의해 유도되는 UM 세포주의 성장은 92.1 및 MP41 세포주에 대해 1 nM 미만의 GI50으로 화합물 (A1)에 의해 억제된 반면, 동형접합성 BRAF V600E 돌연변이 A375, 및 이형접합성 NRAS Q61K 돌연변이 SK-MEL-30을 보유하는 피부 흑색종 세포주의 성장은 화합물 (A1)에 의해 영향을 받지 않았다.
도 13b는 Gq 또는 G11 돌연변이 UM 세포주 및 Gq 또는 G11 야생형 피부 흑색종 세포주의 증식에 대한 화합물 9 내지 15의 효과를 나타낸다. 항시적 활성 Gq 또는 G11 돌연변이체에 의해 유도되는 UM 세포주의 성장은 92.1 및 MP41 세포주에 대해 1 nM 미만의 GI50으로 화합물 (A1)에 의해 억제된 반면, 동형접합성 BRAF V600E 돌연변이 A375, 및 이형접합성 NRAS Q61K 돌연변이 SK-MEL-30을 보유하는 피부 흑색종 세포주의 성장은 화합물 (A1)에 의해 영향을 받지 않았다.
도 14는 예시적인 ADC 제형의 SEC 데이터를 도시한다.
도 15는 예시적인 ADC 제형의 광 차폐 데이터를 도시한다.
도 16은 예시적인 ADC 제형의 모세관 전기영동 분석을 도시한다.
도 17은 예시적인 ADC 제형의 모세관 구역 전기영동(CZE) 분석을 도시한다.
도 18은 예시적인 동결건조물 ADC 제형의 분석을 도시한다.
도 19는 (CZE)를 이용한 페이로드의 pH 및 개환에 대한 데이터를 도시한다.
도 20은 2개월 보관 후 예시적인 ADC 제형에 대한 효능 저하 데이터를 도시한다.
도 21은 시노몰구스 원숭이에서의 화합물 (E) 3 mg/kg의 단회 i.v. 투약 후 총 항체(tmAb), 활성 ADC(tADCa), 및 비활성 ADC(tADCi)의 평균 노출 프로파일을 도시한다.
본 발명은 특정 미생물(예를 들어, 크로모박테리움)을 유전자 조작하여 특정 뎁시펩티드(예를 들어, 화합물 (A1))의 생성을 증가시킬 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초하고 있다. 화합물 (A1)은 A. 크레나타의 잎으로부터 단리될 수 있지만, 매우 적은 양 및 복잡한 기질로 인해 약물 개발 노력과 상업적 제조를 가능하게 하는 데 충분한 양의 화합물 (A1)에 대한 접근이 방해될 수 있다. 본원에 기재된 유전자 조작 미생물(예를 들어, 크로모박테리움), 핵산, 및 방법은 향상된 역가 및/또는 증가된 단리 수율로 화합물 (A1)을 제조하기 위한 개발가능한 생성 경로를 제공하여 충분한 양의 원료의약품 전구체에 대해 접근할 수 있도록 한다.
본 발명은 또한, 보다 높은 과잉환원을 목표로 하고 강력한 부분 재산화 단계를 설계함으로써, 항체 순도를 포함하지 않고도, 조작된 시스테인 잔기의 효율적인 디캡핑 및 목적하는 약물 대 항체 비를 달성할 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초하고 있다. 쇄내 이황화 가교의 과잉환원 및 개방은 원치 않는 오프-사이트 커플링을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 고유한 LC-HC 불안정성은 과잉환원에 대한 민감성을 초래할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, 개방된 쇄내 이황화 가교의 효율적인 부분 재산화는 생체내 높은 효능 달성 및 링커 페이로드 방출 저감을 위해 오프-사이트 접합을 최소화하는 데 중요한 것으로 여겨진다. 부분 재산화 단계에 대해 평가될 수 있는 인자는 다양한 용기 형상, 정의된 헤드스페이스(예를 들어, 60%) 여부, 혼합(예를 들어, 100 rpm) 여부, 또는 실온 또는 저온실 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 부분 재산화 단계를 GMP 제조 공정에 추가함으로써, 예를 들어 비환원 CE SDS로 측정시, 최종 원료의약품의 순도가 약 95%까지 증가될 수 있다. 특정 구현예에서, 약 2의 약물 대 항체 비가 달성된다. 다른 구현예에서, 약 4의 약물 대 항체 비가 달성된다.
정의
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 다음의 용어 및 어구는 다음의 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 달리 나타내지 않는 한, 복수형을 포함한다.
용어 "또는"은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하는 것으로 본원에서 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다.
"약" 및 "대략"은 일반적으로, 측정의 성질이나 정밀도를 고려할 때 양에 대해 허용되는 정도의 오차를 의미한다. 예시적인 오차 정도는 주어진 값 또는 값 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 일반적으로는 10% 이내, 더 일반적으로는 5% 이내이다.
용어 "생합성 유전자 클러스터" 또는 "BGC"는 대사산물의 생성을 위한 생합성 경로를 함께 암호화하는 2개 이상의 유전자가 국부적으로 클러스터링된 그룹을 상호교환적으로 지칭한다. 일부 구현예에서, 대사산물은 대사산물을 생성하는 유기체의 정상적인 성장, 발달, 또는 번식에 직접적으로 관여하지 않는 2차 또는 특수 대사산물이다.
용어 "알킬"은 특정 수의 탄소 원자를 갖는 1가 포화 탄화수소 쇄를 지칭한다. 예를 들어, C1-C6알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 지칭한다. 알킬기는 직선형 또는 분지형일 수 있다. 대표적인 분지형 알킬기는 1, 2, 또는 3개의 분지를 갖는다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필(n-프로필 및 이소프로필), 부틸(n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 및 t-부틸), 펜틸(n-펜틸, 이소펜틸, 및 네오펜틸), 및 헥실을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "절단성"은 2개의 모이어티를 공유 연결로 연결하되 생리학적 관련 조건하에서 분해되어 모이어티 사이의 공유 연결을 끊는 연결기 또는 링커 구성요소를 나타내며, 일반적으로 절단성 연결기는 세포 외부에서보다 세포내 환경에서 더 빠르게 생체내 절단되어, 페이로드의 방출이 표적 세포 내부에서 우선적으로 발생하도록 한다. 절단은 효소적이거나 비효소적일 수 있지만, 일반적으로 항체를 분해하지 않고 항체로부터 페이로드를 방출한다. 절단은 페이로드에 부착된 연결기 또는 링커 구성요소의 일부를 남길 수 있거나, 연결기의 어떤 잔기도 없이 페이로드를 방출할 수 있다.
본원에서 사용되는 "비절단성"은 생리학적 조건하에서 그다지 분해되기 쉽지 않은 연결기 또는 링커 구성요소를 나타낸다. 예를 들어, 이는 적어도 접합체의 항체 또는 항원 결합 단편 부분만큼 안정적이다. 이러한 연결기는 때때로 "안정적인" 것으로 지칭되는데, 이는 항체 또는 항원 결합 단편에 연결된 페이로드를 항체 또는 항원 결합 단편 자체가 적어도 부분적으로 분해될 때까지 유지할 정도로 연결기가 분해에 충분히 저항성을 갖는다는 것, 즉, 항체 또는 항원 결합 단편의 분해가 생체내에서 연결기의 절단에 앞서 일어난다는 것을 의미한다. 안정적이거나 비절단성인 연결기를 갖는 ADC의 항체 부분의 분해는 생체내 전달되는 페이로드 또는 약물 모이어티에 부착된 연결기의 일부 또는 전부(예를 들어, 항체로부터의 하나 이상의 아미노산기)를 남길 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 비공유적으로, 가역적으로 그리고 특정 방식으로 대응 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 패밀리의 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 자연발생 IgG 항체는 이황화 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2, 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항체"는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 항이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체는 임의의 이소형/클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY) 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2)를 가질 수 있다.
"상보성 결정 도메인" 또는 "상보성 결정 영역"("CDR")은 상호교환적으로 VL 및 VH의 초가변성 영역을 지칭한다. CDR은 표적 단백질에 대한 특이성을 보유하는 항체 쇄의 표적 단백질 결합 부위이다. 각각의 인간 VL 또는 VH에는 3개의 CDR(N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된 CDR1 내지 3)이 존재하고, 이들은 가변 도메인의 약 15~20%를 구성한다. CDR은 표적 단백질의 에피토프에 대해 구조적으로 상보적이며, 따라서 결합 특이성의 직접적인 원인이 된다. VL 또는 VH의 나머지 스트레치, 소위 프레임워크 영역은 아미노산 서열의 더 적은 변이를 나타낸다(Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000).
CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계에 잘 알려진 정의, 예를 들어 Kabat, Chothia, 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스(IMGT)(월드와이드 웹사이트 www.imgt.org/), 및 AbM을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)] 참조). 항원 결합 부위의 정의는 또한 다음과 같은 문헌에 설명되어 있다: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); and Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); 및 Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).
경쇄 및 중쇄는 둘 다 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 점이 이해될 것이다. 역으로, 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 불변 도메인(CH1, CH2, 또는 CH3)은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 규칙에 따라, 불변 영역 도메인의 넘버링은 불변 영역 도메인이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가된다. N-말단은 가변 영역이고, C-말단에는 불변 영역이 있으며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 결합 단편의 예는 VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 단일쇄 Fvs(scFv), 카멜리드 항체, 이황화-결합 Fv(sdFv), Fab 단편, F(ab') 단편; 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 또는 항체의 다른 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결되어 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄(단일쇄 Fv("scFv")로 알려져 있음)로서 생성될 수 있도록 한다(예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988; 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988] 참조). 이러한 단일쇄 항체도 용어 "항원 결합 단편"에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항원 결합 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이들 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 스크리닝된다.
항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 단일 도메인 항체, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR, 및 비스-scFv로 통합될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 피브로넥틴 타입 III(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 한 스캐폴드 내로 그라프트될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기술한 미국 특허 6,703,199호 참조).
항원 결합 단편은, 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단일쇄 분자로 통합될 수 있다(Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; 및 미국 특허 5,641,870호).
본원에서 사용되는 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전자 소스로부터 유래된 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 포함한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식세포계열 서열, 또는 인간 생식세포계열 서열의 돌연변이 버전, 또는 예를 들어 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같은 인간 프레임워크 서열 분석에서 유래된 공통 프레임워크 서열을 포함하는 항체로부터 유래된다. 또한 친화성 성숙을 위해 또는 제조/페이로드 접합 목적을 위해 하나 이상의 CDR이 돌연변이된 인간 서열로부터 유래된 항체가 포함된다. 문헌[Kilpatrick et al., "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS," Hybridoma. 1997 Aug;16(4):381-9] 참조.
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성 또는 제조의 촉진을 위한 보존적 치환)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인식"은 에피토프가 선형이든 입체형태이든 관계없이, 자신의 에피토프를 확인하고 이와 상호작용하는(예를 들어, 결합하는) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 용어 "에피토프"는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접한 아미노산들로부터 형성되거나 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산들로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산들로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출되었을 때 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리하면 일반적으로 소실된다. 에피토프는 일반적으로 특유의 공간적 입체형태의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당해 분야의 기술, 예를 들어 x선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다(예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용 강도를 의미한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 여러 부위에서 항원과 약한 비공유 결합력을 통해 상호작용하며; 상호작용이 많을수록 친화도는 더 강하다.
용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 그러나, 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대해 교차반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "상응하는 인간 생식세포계열 서열"은 인간 생식세포계열 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 암호화되는 공지된 모든 다른 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 기준 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 가장 높게 결정된 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 또한 평가된 모든 다른 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 기준 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 프레임워크 영역 단독, 상보성 결정 영역 단독, 프레임워크 및 상보성 결정 영역, (위에 정의된 바와 같은) 가변 분절, 또는 가변 영역을 포함하는 서열 또는 하위서열의 기타 조합일 수 있다. 서열 동일성은 본원에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 당업계에 알려진 다른 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 서열을 정렬하여 결정될 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 핵산 또는 아미노산 서열은 기준 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스(IMGT)(월드와이드 웹사이트 www.imgt.org/) 및 V-base(월드와이드 웹사이트 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)를 통해 결정될 수 있다.
항원(예를 들어, 단백질)과 항체, 항체 단편, 또는 항체-유래 결합제 간의 상호작용을 설명하는 맥락에서 사용될 때 어구 "특이적 결합" 또는 "선택적 결합"은 이종 집단의 단백질 및 기타 생물제제에서, 예를 들어 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 또는 조직 샘플에서 항원의 존재를 결정짓는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 특정 지정된 면역분석 조건하에, 특정 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정 항원에 백그라운드의 2배 이상 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에는 실질적으로 유의미한 양으로 결합하지 않는다. 일 구현예에서, 지정된 면역분석 조건하에, 특정 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정 항원에 백그라운드의 10배 이상 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에는 실질적으로 유의미한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은 항체 또는 제제가 특정 단백질에 대한 특이성에 대해 선택되었음을 필요로 할 수 있다. 필요에 따라 또는 적절하게, 이 선택은 다른 종(예를 들어, 마우스 또는 래트) 또는 다른 하위유형으로부터의 분자와 교차반응하는 항체를 제외시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 특정의 목적하는 분자와 교차반응하는 항체 또는 항체 단편이 선택된다.
특정 단백질과 특이적으로 면역반응성을 나타내는 항체를 선택하기 위해 다양한 면역분석 형식을 사용할 수 있다. 예를 들어, 단백질과 특이적으로 면역반응성을 나타내는 항체를 선택하기 위해 고상 ELISA 면역분석이 통상적으로 사용된다(예를 들어, 특이적 면역반응성을 결정하는 데 사용될 수 있는 면역분석 형식 및 조건에 대한 설명은 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조). 일반적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 백그라운드 신호에 비해 적어도 2배, 더 일반적으로는 백그라운드에 비해 적어도 10배 내지 100배의 신호를 생성할 것이다.
용어 "평형 해리 상수(KD, M)"는 해리 속도 상수(kd, 시간-1)를 결합 속도 상수(ka, 시간-1, M-1)로 나눈 것을 지칭한다. 평형 해리 상수는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 일반적으로 약 10-7 또는 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 구현예에서는 약 10-11 M, 10-12 M, 또는 10-13 M 미만의 평형 해리 상수를 가질 것이다.
용어 "생체이용률"은 환자에 투여된 소정 양의 약물의 전신 이용률(즉, 혈액/혈장 수준)을 지칭한다. 생체이용률은 투여된 투약 형태로부터 전신 순환에 도달하는 약물의 시간(속도) 및 총량(정도) 둘 모두의 측정치를 나타내는 절대 용어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 어구는 방법 또는 조성물에 포함된 활성 약제의 속 또는 종, 뿐만 아니라 방법 또는 조성물의 의도된 목적에 대해 비활성인 임의의 부형제도 나타낸다. 일부 구현예에서, "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 어구는 본 발명의 항체 약물 접합체 이외의 하나 이상의 추가 활성제의 포함을 명시적으로 배제한다. 일부 구현예에서, "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 어구는 본 발명의 항체 약물 접합체 및 제2 공동 투여제 이외의 하나 이상의 추가 활성제의 포함을 명시적으로 배제한다.
용어 "아미노산"은 자연발생, 합성, 및 비천연 아미노산뿐만 아니라 자연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연발생 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화된 것들뿐만 아니라 추후에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기, 및 R기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 구조가 다르지만, 자연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 이 코돈은 암호화되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 당업자는 핵산의 각 코돈(통상적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기술된 서열에 내재되어 있다.
폴리펩티드 서열에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"는, 소정 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별 치환, 결실, 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자 외에도 존재하며 이들을 배제하지 않는다. 다음의 8개 군이 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 구현예에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의미한 영향이나 변경을 일으키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "최적화"는 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포, 피키아(Pichia) 세포, 진균 세포, 트리코데르마(Trichoderma) 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 또는 인간 세포에서 선호되는 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 암호화하도록 변경된 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모체" 서열로도 알려진 시작 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 암호화되는 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 한 많이 유지하도록 조작된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한 퍼센트" 또는 "퍼센트 동일성"이라는 용어는 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 동일한 정도를 지칭한다. 두 서열은 비교되는 영역에 걸쳐 동일한 서열의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 갖는 경우 "동일"하다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사로 측정시 비교 창 또는 지정 영역에 걸쳐 최대로 일치되도록 비교 및 정렬한 경우, 두 서열이 동일 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율(즉, 특정 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐 60%의 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성)을 갖는다면 두 서열은 "실질적으로 동일"하다. 임의로, 동일성은 적어도 약 30개의 뉴클레오티드(또는 10개의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드(또는 20개, 50개, 200개 이상의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교의 경우, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열의 비교 대상인 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열과 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "비교 창"은 20 내지 600개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 수의 인접 위치의 분절에 대한 참조를 포함하고, 여기서 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법의 검색, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌[Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 두 가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 설명되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 우선, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 값 임계 점수 T와 일치하거나 이를 충족시키는, 쿼리 서열 내 길이 W의 짧은 단어를 식별하여 고득점 서열쌍(HSP)을 식별하는 단계를 수반한다. T는 인접 단어 점수 임계값으로 지칭된다(상기 Altschul 등의 문헌). 이러한 초기 인접 단어 적중은 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 단어 적중은 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한, 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 누적 점수는 파라미터 M(한 쌍의 일치하는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 채점 행렬을 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향의 단어 적중의 확장은 누적 정렬 점수가 최대 달성 값에서 X 양만큼 떨어지는 경우; 하나 이상의 음수 채점 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달한 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 또는 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 단어 길이 3, 기대값(E) 10, BLOSUM62 채점 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘이 제공하는 유사성의 한 척도는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 또한, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12, 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 BLOSUM62 행렬 또는 PAM250 행렬, 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 제공)의 GAP 프로그램에 통합된 알고리즘(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))을 사용하여 결정될 수 있다.
상기 언급된 서열 동일성의 백분율 외에, 두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 제1 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드가 후술하는 바와 같이, 제2 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체와 면역학적으로 교차반응성이라는 것이다. 따라서, 예를 들어 두 펩티드가 보존적 치환만이 상이한 경우에, 폴리펩티드는 일반적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 두 분자 또는 이들의 보체가 후술하는 바와 같이, 엄격한 조건하에 서로 혼성화한다는 것이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용되며, 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 합성, 자연발생, 및 비자연발생적이고, 기준 핵산과 결합 특성이 유사하며, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 제한 없이 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명백하게 표시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로는, 이하에 상술하는 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; 및 Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).
핵산과 관련하여 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예: DNA) 분절 간의 기능적 관계를 나타낸다. 일반적으로, 이는 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은 적절한 숙주 세포 또는 기타 발현 시스템에서 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 물리적으로 인접해 있다(즉, 이들은 시스(cis)-작용성이다). 그러나, 인핸서와 같은 일부 전사 조절 서열은 전사를 강화하는 암호화 서열에 물리적으로 인접해 있거나 매우 근접한 위치에 있을 필요가 없다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 자연발생 아미노산 중합체 및 비자연발생 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체를 함축적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 약물 접합체" 또는 "면역접합체"는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 화학요법제, 독소, 면역요법제, 이미징 프로브 등과 같은 다른 제제의 연결을 지칭한다. 연결은 공유 결합, 또는 비공유적 상호작용, 예컨대 정전기력을 통한 비공유적 상호작용일 수 있다. 항체 약물 접합체를 형성하기 위해, 당업계에 알려진 다양한 링커가 사용될 수 있다. 추가적으로, 항체 약물 접합체는 면역접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 융합 단백질 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 본래는 별개의 단백질(펩티드 및 폴리펩티드를 포함)을 암호화하는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 단편의 연결을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 융합 유전자의 번역은 원래 단백질 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 단백질을 생성한다.
용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함한다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독소" 또는 "세포독성제"는 세포의 성장 및 증식에 해롭고, 세포 또는 악성종양의 감소, 억제, 또는 파괴 작용을 할 수 있는 임의의 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "항암제"는 세포독성제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선요법제, 표적항암제, 및 면역요법제를 포함하는(이에 한정되지 않음), 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "약물 모이어티" 또는 "페이로드"는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 접합된 화학적 모이어티를 지칭하고, 임의의 치료제 또는 진단제, 예를 들어 항암제, 항염증제, 항감염제(예를 들어, 항진균제, 항균제, 항기생충제, 항바이러스제), 또는 마취제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약물 모이어티는 세포독소와 같은 항암제일 수 있다. 특정 구현예에서, 약물 모이어티는 표적 억제제 화합물이다. 또한, 페이로드는 생물물리학적 프로브, 형광단, 스핀 표지, 적외선 프로브, 친화성 프로브, 킬레이터, 분광 프로브, 방사성 프로브, 지질 분자, 폴리에틸렌 글리콜, 중합체, 스핀 표지, DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 표면, 항체, 항체 단편, 나노입자, 양자점, 리포솜, PLGA 입자, 당류, 또는 다당류일 수 있다.
일부 구현예에서, 약물 모이어티 또는 페이로드는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)이다. 일부 구현예에서, GNAQ/11 억제제는 IP3의 GNAQ/11-매개 생성을 억제하고/하거나 GNAQ/11 신호전달에 의존하는 세포(즉, GNAQ/11 돌연변이 포도막 흑색종 세포)에서 용량-반응 항증식 효과를 나타내는 분자이다. 일부 구현예에서, GNAQ/11 억제제는 비활성 GDP-결합 상태에서 GNAQ/11을 안정화하여 GDP 방출을 방지하거나, 활성 GTP-결합 상태에 결합하여 하류 이펙터와의 GNAQ/11 상호작용을 방지하는 화합물이다. 일부 구현예에서, GNAQ/11 억제제는 Q209L/P 돌연변이를 포함하는 것과 같은 돌연변이 GNAQ 및/또는 GNA11을 억제함으로써 기능한다. 표적 모이어티와 상용성인 링커에 이러한 약물 모이어티를 부착시키는 방법이 당업계에 알려진 방법과 함께 본 명세서에서 제공된다. 예를 들어, 문헌[Singh et al., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457] 참조.
GNAQ(CMC1, G-ALPHA-q, GAQ, SWS, 및 G 단백질 서브유닛 알파 q로도 알려진, 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(q) 서브유닛 알파) 및 GNA11(FBH, FBH2, FHH2, GNA-11, HHC2, HYPOC2, 및 G 단백질 서브유닛 알파 11로도 알려진, 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 서브유닛 알파-11)은 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 하류에서 작용하는 이종삼량체 G 단백질의 α 서브유닛을 구성하는 GTPase와 밀접하게 관련되어 있다. α 서브유닛은 구아노신 이인산(GDP)을 구아노신 삼인산(GTP)으로 교환함으로써 G 단백질 활성화를 위한 스위치 역할을 하여, 별개의 하류 이펙터의 활성화를 유도한다. GTP가 GDP로 가수분해됨에 따라, 활성화는 고유한 GTPase 활성에 의해 종료된다(Van Raamsdonk et al., 2010, N Engl J Med.; 363(23):2191-9). Gq 단백질 캐스케이드의 전형적인 활성화는 포스포리파제 C-β(PLC-β)를 통해 발생하며, 이는 인지질 포스파티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트를 가수분해하여 2개의 강력한 2차 메신저인 D-미오-이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤(DAG)을 방출한다. 세포내 Ca2+의 일시적 증가에 따라, IP3는 IP2, IP1, 및 미오-이노시톨로 빠르게 변형된다. 반면, DAG는 단백질 키나제 C(PKC)를 활성화하여, 세포 증식 및 생존을 조절하기 위해 핵으로 이동하는 RAF, MEK, 및 ERK의 연쇄 인산화를 유도한다(Krantz et al., 2017, Clin Ophthalmol.; 11:279-289).
인간 GNAQ의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 수탁번호 NP_002063 및 NM_002072로 GenBank에 공개되었다. 인간 GNAQ의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 또한 국제 출원 공개 WO 2020/128612호에 각각 서열번호 268 및 269로 기술되어 있다.
인간 GNA11의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 수탁번호 NP_002058 및 NM_002067로 GenBank에 공개되었다. 인간 GNA11의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 또한 국제 출원 공개 WO 2020/128612호에 각각 서열번호 270 및 271로 기술되어 있다.
"종양"은 악성이든 양성이든 신생물 세포 성장 및 증식, 그리고 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다.
용어 "항종양 활성"은 종양 세포 증식 속도, 생존율, 또는 전이 활성의 감소를 의미한다. 예를 들어, 항종양 활성은 치료 중 발생하는 비정상 세포의 성장속도 감소 또는 종양 크기 안정성 또는 감소, 또는 치료가 없는 대조군과 비교하여 치료로 인한 더 긴 생존에 의해 나타날 수 있다. 이러한 활성은 이종이식 모델, 동종이식 모델, MMTV 모델, 및 항종양 활성을 조사하기 위한 당업계에 알려진 기타 공지된 모델을 비롯한(이에 한정되지 않음), 허용된 시험관내 또는 생체내 종양 모델을 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "악성종양"은 비양성 종양 또는 암을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 조절되지 않거나 제어되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 악성종양을 포함한다. 예시적인 암은 암종(예를 들어, 간세포 암종), 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 및 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 점막 흑색종)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "암"은 원발성 악성 종양(예를 들어, 종양 세포가 원래 종양 부위 이외의 대상체 신체 부위로 이동하지 않은 종양), 및 속발성 악성 종양(예를 들어, 종양 세포가 원래 종양 부위와 상이한 2차 부위로 이동하는 전이로부터 발생한 종양)을 포함한다.
용어 "PMEL17"(전멜라닌소체 단백질(PMEL), D12S53E, ME20, ME20-M, ME20M, P1, P100, gp100, SI, SIL, 및 silver 유전자좌 단백질 상동체(SILV)라고도 함)은, 멜라닌 세포에서 생성되고 멜라닌 합성에 관여하는 단일-통과 유형 I 막관통 단백질을 지칭한다. 인간 PMEL17의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 수탁번호 NP_008859, NP_001307050, NP_001307051, NP_001186982, NP_001186983(아미노산 서열), 및 NM_006928, NM_001200053, NM_001200054, NM_001320121, NM_001320122(뉴클레오티드 서열)로 GenBank에 공개되었다. 인간 PMEL17의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 또한 국제 출원 공개 WO 2020/128612호에 서열번호 272~276(아미노산 서열) 및 서열번호 277~281(뉴클레오티드 서열)로 기술되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "PMEL17"은 PMEL17 단백질의 모든 자연발생 이소형, 또는 이의 변이체를 집합적으로 지칭하는 데 사용된다.
용어 "변이체"는 기준 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 변이체는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 보유하면서, 기준 폴리펩티드에 대해 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애의 "치료"라는 용어는 일 구현예에서 질환 또는 장애를 개선하는 것(즉, 질환 또는 이의 적어도 하나의 임상 증상의 진행을 늦추거나, 저지하거나, 감소시키는 것)을 의미한다. 다른 구현예에서, "치료"는 환자가 식별하지 못할 수도 있는 것을 포함하여 적어도 하나의 물리적 파라미터의 완화 또는 개선을 의미한다. 또 다른 구현예에서, "치료"는 질환 또는 장애의 물리적(예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학적(예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 모두에 의한 조절을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애의 "예방"이라는 용어는 질환 또는 장애의 예방적 처치; 또는 질환 또는 장애의 발병 또는 진행의 지연을 지칭한다.
용어 "치료적으로 허용되는 양" 또는 "치료 유효량"은 상호교환적으로, 목적하는 결과(즉, 종양 크기 감소, 종양 성장 억제, 전이 방지, 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 기생충 감염의 억제 또는 예방)를 발생시키기에 충분한 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 치료적으로 허용되는 양은 바람직하지 않은 부작용을 유도하거나 유발하지 않는다. 일부 구현예에서, 치료적으로 허용되는 양은 환자의 상태를 고려하여 의료 제공자에 의해 허용되는 부작용만을 유도하거나 유발한다. 치료적으로 허용되는 양은, 먼저 낮은 용량을 투여한 후, 원하는 효과가 달성될 때까지 해당 용량을 점진적으로 증가시켜 결정할 수 있다. 본 발명의 분자의 "예방적 유효 투여량" 및 "치료적 유효 투여량"은 각각, 암과 관련된 증상을 포함한 질환 증상의 발병을 방지하거나 이의 중증도를 감소시킬 수 있다.
용어 "공동 투여"는 개체의 혈액에 두 가지 활성제가 존재함을 의미한다. 공동 투여되는 활성제는 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다.
용어 "억제", "억제제", "결합 길항제", 또는 "길항제"는 소정 분자의 특정 파라미터, 예를 들어 활성의 감소를 포함한다. 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 이상의, 소정 분자의 활성 억제는 이 용어에 포함된다. 따라서, 억제가 100%일 필요는 없다.
용어 "활성화", "활성화제", 또는 "작용제"는 소정 분자의 특정 파라미터, 예를 들어 활성의 증가를 포함한다. 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 이상의, 소정 분자의 활성 증가는 이 용어에 포함된다.
크로모박테리움
크로모박테리움은 그람-음성 간상(rod-shaped) 박테리아 속이다. 현재 해당 속 내에는 11종(C. 알카니보란스, C. 아마조넨세, C. 아쿠아티쿰, C. 해몰리티쿰, C. 프라그미티스, C. 피시내, C. 슈도비올라세움, C. 리조리자에, C. 서브추가에, C. 백시니이, 및 C. 비올라세움)이 알려져 있다.
일부 구현예에서, 크로모박테리움은 C. 백시니이이다. C. 백시니이는 크랜베리 수목의 토양에서 단리되었고(Soby et al. (2013) Int J Syst Evol Microbiol.;63(5):1840-6), DSMZ 및 ATCC 균주 컬렉션 둘 모두에 기탁되었다(크로모박테리움 백시니이 DSM 25150 = ATCC BAA-2314, = NRRL B-50840, = MWU205). 균주의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank 수탁번호는 JN120869이다. C. 백시니이 DSM 25150의 드래프트 게놈은 문헌[Voeing et al. (2015) Genome Announc 3, e00477-15]에서 공개되었다(GenBank 수탁번호: NZ_JZJL00000000).
C. 백시니이는 영양 한천에서 쉽게 자라며, 28℃에서 2일 동안 인큐베이션하면 비올라세인의 생성으로 인해 어두운 보라색 금속 광택을 지닌 특유의 매끄러운 저볼록형 콜로니를 생성한다. C. 백시니이는 건강한 성인에게 질병을 일으킬 가능성이 거의 없으며, 실험실 직원과 환경에 대한 최소의 잠재적 위험을 가지고 있다.
본원에 기재된 미생물은 예를 들어, 뎁시펩티드(예를 들어, 화합물 (A1))를 자연적으로 생성하는 C. 백시니이의 돌연변이 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 화합물 (A1)의 역가를 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 화합물 (A1)의 단리 수율을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 화합물 (A1)의 역가를 증가시키는 돌연변이 및 화합물 (A1)의 단리 수율을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 프로모터 삽입 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 프로모터 삽입 돌연변이)를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 파괴 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 파괴 돌연변이)를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 복수의 파괴 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 복수의 파괴 돌연변이)를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 프로모터 삽입 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 프로모터 삽입 돌연변이) 및 파괴 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 파괴 돌연변이)를 포함한다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체는 프로모터 삽입 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 프로모터 삽입 돌연변이) 및 복수의 파괴 돌연변이(예를 들어, 본원에 기재된 복수의 파괴 돌연변이)를 포함한다.
프로모터 삽입 돌연변이체
일부 구현예에서, 동일하거나 유사한 조건하에 배양되는 경우, C. 백시니이 돌연변이체는 기준 C. 백시니이, 예를 들어 야생형 C. 백시니이와 비교하여 화합물 (A1)의 증가된 역가를 갖는다. 예를 들어, 화합물 (A1)-BGC 상류의 천연 프로모터가 변경될 수 있다(예를 들어, 비천연 프로모터, 예를 들어 더 강력한 비천연 프로모터로 대체될 수 있음). 이론에 구애됨이 없이, 화합물 (A1)-BGC는 단일 오페론을 포함하며 그 전사는 단일 프로모터에 의해 유도될 가능성이 높은 것으로 여겨진다.
비천연 프로모터는 자연적으로는 화합물 (A1)-BGC에 작동가능하게 연결되지 않는 프로모터 서열로서, 작동가능하게 연결될 경우 화합물 (A1)-BGC의 전사 활성을 증가시키는 임의의 프로모터 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 C. 백시니이로부터 유래된다(예를 들어 화합물 (A1)-BGC 이외의 BGC의 발현을 제어하는 프로모터, 예를 들어 vioP 프로모터). 다른 구현예에서, 비천연 프로모터는 C. 백시니이로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 E. 콜라이로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 항시성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터(예를 들어, vioP 프로모터)는 호모세린 락톤의 생성에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 비올라세인 프로모터이다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 리보솜 프로모터이다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 트랜스포존에 위치한다.
특정 구현예에서, 비천연 프로모터는 자연발생 프로모터이다. 다른 구현예에서, 비천연 프로모터는 합성 프로모터이다. 다른 구현예에서, 비천연 프로모터는, 예를 들어 관련된 자연발생 프로모터 그룹의 공통 서열을 포함하는, 공통 프로모터이다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 vioP 프로모터이다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 nptII 프로모터이다. 일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 rbs 프로모터이다.
기타 비천연 프로모터는 J23119 프로모터(예를 들어, parts.igem.org에 기재된 것), pLpp 프로모터(예를 들어, parts.igem.org에 기재된 것), PS12burk 프로모터(예를 들어, 문헌[Choi et al. (2008) App Environ Microbiol 74(4):1064-75]에 기재된 것), Erme* 프로모터(예를 들어, 문헌[Bibb et al. (1994) Mol Microbiol 14(3):533-45]에 기재된 것), 또는 Pem7 프로모터(예를 들어, 문헌[Zobel et al. (2015) ACS Synthetic Biology 4:1341-51]에 기재된 것)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 비천연 프로모터는 표 1에 기재된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 표 1에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
예를 들어, 균주 크로모박테리움 백시니이 vioP-frsA는 화합물 (A1)-BGC 앞에 프로모터 vioP를 삽입하여 번역 융합을 생성함으로써 균주 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150으로부터 발생된 돌연변이체이다. 프로모터 vioP는 균주의 고유한 비올라세인 BGC로부터 추출되었다. 프로모터 vioP의 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. 이 돌연변이체의 생성은 실시예 1에 기술되어 있다.
C. 백시니이의 비올라세인 프로모터와 C. 비올라세움의 비올라세인 프로모터는 본질적으로 동일한 기능 및 약 82%의 서열 동일성을 갖는다. C. 비올라세움의 vioP 프로모터는 예를 들어 문헌[Morohoshi et al. (2010) Bioscie. Biotechnol. Biochem.;74 (10),2116-2119 및 Zhang et al. (2011) Appl Microbiol Biotechnol;90:1963-1971]에 기술되어 있다.
다른 예로서, 균주 크로모박테리움 백시니이 nptII-frsA는 화합물 (A1)-BGC 앞에 프로모터 nptII을 삽입하여 번역 융합을 생성함으로써 균주 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150으로부터 발생된 돌연변이체이다. 프로모터 nptII은 항시성 프로모터이다. 프로모터 nptII의 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. 이 돌연변이체의 생성은 실시예 1에 기술되어 있다.
또 다른 예로서, 균주 크로모박테리움 백시니이 rbs-frsA는 화합물 (A1)-BGC 앞에 프로모터 rbs를 삽입하여 번역 융합을 생성함으로써 균주 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150으로부터 발생된 돌연변이체이다. 리보솜 프로모터 rbs는 항시성 프로모터이다. 프로모터 rbs의 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. 이 돌연변이체의 생성은 실시예 1에 기술되어 있다.
또 다른 예로서, 프로모터 vioP, nptII, 또는 rbs는 프로모터 J23119, P S12 burk, Erme*, 또는 pLpp로 대체될 수 있다. 프로모터 J23119는 합성 프로모터이다. 프로모터 J23119의 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. 프로모터 P S12 burk는 버크홀데리아 타일란덴시스의 리보솜 프로모터이다. 프로모터 P S12 burk의 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. 프로모터 P S12 burk는 또한 문헌[Choi et al. (2008) App Environ Microbiol 74(4):1064-75]에 기술되어 있다. P S12 burk는 S12burk.라고도 한다. 프로모터 ErmE*는 사카로폴리스포라 에리트라에아의 23S rRNA 메틸라제 프로모터이다. 프로모터 ErmE*의 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. 프로모터 ErmE*는 또한 문헌[Bibb et al. (1994) Mol Microbiol 14(3):533-45]에 기술되어 있다. 프로모터 pLpp는 합성 프로모터이다. 프로모터 pLpp의 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시되어 있다. 프로모터 pLpp는 또한 parts.igem.org에 기술되어 있다. pLpp는 Plpp라고도 한다.
일부 구현예에서, 동일한 조건하에 배양되는 경우, C. 백시니이 프로모터 삽입 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 기준 C. 백시니이, 예를 들어 화합물 (A1)-BGC에 프로모터 삽입 돌연변이가 없는 C. 백시니이 또는 야생형 C. 백시니이의 역가에 비해 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 증가된다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 프로모터 삽입 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 야생형 C. 백시니이의 화합물 (A1) 역가에 비해 적어도 약 3배, 예를 들어 적어도 약 3.5배 증가된다.
일부 구현예에서, 동일한 조건하에 배양되는 경우, C. 백시니이 프로모터 삽입 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 기준 C. 백시니이, 예를 들어 화합물 (A1)-BGC에 프로모터 삽입 돌연변이가 없는 C. 백시니이 또는 야생형 C. 백시니이의 역가와 비교하여 적어도 약 100 mg/L, 약 200 mg/L, 약 300 mg/L, 약 400 mg/L, 약 500 mg/L, 약 600 mg/L, 약 700 mg/L, 약 800 mg/L, 약 900 mg/L, 또는 약 1000 mg/L 증가된다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 프로모터 삽입 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 야생형 C. 백시니이의 화합물 (A1) 역가와 비교하여, 약 300 mg/L 이하에서 약 600 mg/L 이상 또는 약 800 mg/L 이상으로 증가된다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 프로모터 삽입 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 적어도 약 200 mg/L, 약 250 mg/L, 약 300 mg/L, 약 350 mg/L, 약 400 mg/L, 약 450 mg/L, 약 500 mg/L, 약 550 mg/L, 약 600 mg/L, 약 650 mg/L, 약 700 mg/L, 약 750 mg/L, 약 800 mg/L, 약 850 mg/L, 약 900 mg/L, 약 950 mg/L, 약 1000 mg/L, 약 1100 mg/L, 약 1200 mg/L, 약 1300 mg/L, 약 1400 mg/L, 약 1500 mg/L, 약 1600 mg/L, 약 1700 mg/L, 약 1800 mg/L, 약 1900 mg/L, 또는 약 2000 mg/L이다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 적어도 약 800 mg/L, 예를 들어 약 800 mg/L 내지 약 850 mg/L이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 동물 성분이 없는 배지에서 배양되는 경우, C. 백시니이 프로모터 삽입 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 적어도 약 600 mg/L, 예를 들어 약 600 mg/L 내지 약 650 mg/L이다.
본원에 기재된 C. 백시니이 프로모터 삽입 돌연변이체는 화합물 (A1)을 소규모(예를 들어, 연구 규모) 또는 대규모(예를 들어, 생산 규모)로 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)은 발효기 또는 생물반응기에서 생성된다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)은 약 50 L 내지 약 250 L, 예를 들어 약 50 L 내지 약 100 L, 약 100 L 내지 약 150 L, 또는 약 150 L 내지 약 250 L, 예를 들어 약 50 L, 약 100 L, 약 150 L, 약 200 L, 또는 약 250 L의 발효량으로 생성된다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)은 약 1,000 L 내지 약 20,000 L, 예를 들어 약 1,000 L 내지 약 10,000 L, 또는 약 10,000 L 내지 약 20,000 L, 예를 들어 약 1,000 L, 약 2,000 L, 약 5,000 L, 약 7,500 L, 약 10,000 L, 약 15,000 L, 또는 약 20,000 L의 발효량으로 생성된다.
파괴 돌연변이체
대안적으로 또는 조합하여, 일부 구현예에서, 동일한 조건하에 배양되는 경우, C. 백시니이 돌연변이체는 야생형 C. 백시니이와 비교하여, 화합물 (A1)의 증가된 단리 수율을 갖는다. 예를 들어, C. 백시니이에 의해 생성된 다른 천연 생성물의 수준 또는 활성이 감소될 수 있다(예를 들어, 이러한 천연 생성물의 BGC가 파괴될 수 있음). 이론에 구애됨이 없이, 화합물 (A1) 및 이의 유사체 외에도, C. 백시니이는 화합물 (A1)의 정제를 어느 정도 방해하는 적어도 두 가지의 추가 천연 생성물 클래스를 생성한다. 이들은 비올라세인 클래스 및 환형 리포뎁시펩티드 클래스에 속하며, 대표적으로 화합물 J가 가장 풍부하다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)의 단리 수율은 화합물 (A1)의 정제를 방해하는 부산물의 복잡성이 감소되면 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 비올라세인의 BGC가 변경(예를 들어, 파괴)되거나, 비올라세인-BGC의 하나 이상의 유전자가 녹아웃된다. 일부 구현예에서, 비올라세인의 수준 또는 활성이 감소(예를 들어, 제거)된다.
비올라세인은, 대부분의 크로모박테리아에 공통적이며 이 속의 명명 근거이기도 한 비스-인돌 구조의 보라색 색소이다. 비올라세인은 하기의 화학 구조를 갖는다:
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이의 생합성은 밝혀져 있으며, 각각의 BGC는 예를 들어 문헌[August et al. (2000) J Mol Microbiol Biotechnol.; 2(4):513-519]에 기술되어 있다. 발효액에 존재하는 다량의 비올라세인은 증발 단계마다 발생하는 침전 및 후속 가용화에 필요한 시간과 작업으로 인해 추출 공정 중에 문제가 된다. 따라서, 비올라세인을 제거하고 추가 침전을 방지하기 위해 1차 정제 단계로서 크기 배제 크로마토그래피를 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 화합물 J의 BGC가 변경(예를 들어, 파괴)되거나, 화합물 J-BGC의 하나 이상의 유전자가 녹아웃된다. 예를 들어, 화합물 J-BGC로부터 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 화합물(예를 들어, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 임의의 1개, 2개, 3개, 또는 전부)의 생성이 감소(예를 들어, 제거)된다. 일부 구현예에서, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 및 화합물 D의 생성이 감소(예를 들어, 제거)된다.
일부 구현예에서, 화합물 J의 수준 또는 활성이 감소(예를 들어, 제거)된다. 일부 구현예에서, 화합물 J의 BGC가 변경(예를 들어, 파괴)되거나, 화합물 J-BGC의 하나 이상의 유전자가 녹아웃된다.
화합물 J는 하기의 화학 구조를 갖는다:
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화합물 J(생합성 서열: N-Acyl-Ser-Val-His-Val-Leu-Val(서열번호 318)의 환형 헥사뎁시펩티드)의 역생합성 분석을 통해 C. 백시니이의 서열분석된 게놈으로부터 BGC를 확인할 수 있었다. 크기 배제 크로마토그래피 실행시 화합물 J 클래스의 구성원들은 화합물 (A1)이 풍부한 분획에서 함께 용리되고, 정제용 HPLC에 의한 추가 정제를 위한 가용화시 매우 높은 점도(거의 겔형)를 유발하여 컬럼으로의 주입을 방해한다. 결과적으로, 분획물은 일반적으로 추가 희석이 필요하며, 실행당 처리되는 화합물의 양은 제한된다.
일부 구현예에서, 화합물 F5의 수준 또는 활성이 감소(예를 들어, 제거)된다.
화합물 F5는 하기의 화학 구조를 갖는다:
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화합물 F5는 서열 N-(Z)-dec-3-에노일-1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 321)의 선형 리포펩티드이다. 화합물 J와 비교하여, 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이의 락톤이 가수분해되었다.
일부 구현예에서, 화합물 F3의 수준 또는 활성이 감소(예를 들어, 제거)된다.
화합물 F3는 하기의 화학 구조를 갖는다:
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화합물 F3은 서열 N-옥타노일-1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 322)의 환형 리포뎁시펩티드이다. 헥사펩티드 락톤 고리는 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이에 형성된다.
일부 구현예에서, 화합물 D의 수준 또는 활성이 감소(예를 들어, 제거)된다.
화합물 D는 하기의 화학 구조를 갖는다:
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화합물 D는 서열 N-옥타닐-1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 323)의 선형 리포펩티드이다. 화합물 F3과 비교하여, 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이의 락톤이 가수분해되었다.
일부 구현예에서, C. 백시니이 파괴 돌연변이체는 2개 이상(예를 들어, 3 또는 4개)의 파괴 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 비올라세인-BGC 및 화합물 J-BGC 둘 모두가 변경(예를 들어, 파괴)될 수 있다.
일부 구현예에서, 동일한 조건하에 배양되는 경우, C. 백시니이 파괴 돌연변이체의 화합물 (A1) 단리 수율은 기준 C. 백시니이, 예를 들어 파괴 돌연변이가 없는 C. 백시니이 또는 야생형 C. 백시니이에 비해 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%, 또는 적어도 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 또는 약 5배 증가된다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 파괴 돌연변이체의 화합물 (A1) 단리 수율은 적어도 약 60%, 예를 들어 약 65% 내지 약 70%이다. 일부 구현예에서, 야생형 C. 백시니이의 화합물 (A1) 단리 수율은 약 35% 내지 약 45%, 예를 들어 약 40%이다.
일부 구현예에서, 동일한 조건하에 배양되는 경우, C. 백시니이 파괴 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 기준 C. 백시니이, 예를 들어 파괴 돌연변이가 없는 C. 백시니이 또는 야생형 C. 백시니이와 비교하여 약 50%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 또는 약 10% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 파괴 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 적어도 약 200 mg/L, 약 250 mg/L, 약 300 mg/L, 약 350 mg/L, 약 400 mg/L, 약 450 mg/L, 약 500 mg/L, 약 550 mg/L, 약 600 mg/L, 약 650 mg/L, 약 700 mg/L, 약 750 mg/L, 약 800 mg/L, 약 850 mg/L, 약 900 mg/L, 약 950 mg/L, 약 1000 mg/L, 약 1100 mg/L, 약 1200 mg/L, 약 1300 mg/L, 약 1400 mg/L, 약 1500 mg/L, 약 1600 mg/L, 약 1700 mg/L, 약 1800 mg/L, 약 1900 mg/L, 또는 약 2000 mg/L이다. 일부 구현예에서, C. 백시니이 파괴 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 적어도 약 800 mg/L, 예를 들어 약 800 mg/L 내지 약 850 mg/L이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 동물 성분이 없는 배지에서 배양되는 경우, C. 백시니이 파괴 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 적어도 약 600 mg/L, 예를 들어 약 600 mg/L 내지 약 650 mg/L이다.
본원에 기재된 C. 백시니이 파괴 돌연변이체는 화합물 (A1)을 소규모(예를 들어, 연구 규모) 또는 대규모(예를 들어, 생산 규모)로 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)은 발효기 또는 생물반응기에서 생성된다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)은 약 50 L 내지 약 250 L, 예를 들어 약 50 L 내지 약 100 L, 약 100 L 내지 약 150 L, 또는 약 150 L 내지 약 250 L, 예를 들어 약 50 L, 약 100 L, 약 150 L, 약 200 L, 또는 약 250 L의 발효량으로 생성된다. 일부 구현예에서, 화합물 (A1)은 약 1,000 L 내지 약 20,000 L, 예를 들어 약 1,000 L 내지 약 10,000 L, 또는 약 10,000 L 내지 약 20,000 L, 예를 들어 약 1,000 L, 약 2,000 L, 약 5,000 L, 약 7,500 L, 약 10,000 L, 약 15,000 L, 또는 약 20,000 L의 발효량으로 생성된다.
화합물 (A1)의 생합성
뎁시펩티드, 화합물 (A1)은 문헌[Fujioka et al. (1988) J. Org. Chem.; 53 (12) 2820-2825]에 기술되어 있다. 이는 아르디시아 크레나타 전체 식물의 메탄올 추출물로부터 단리되었다. 거의 20년 이후, 화합물 (A1)은 실제 아르디시아 크레나타 식물의 엄격하게 절대적인 박테리아 내공생체인 칸디다투스 버크홀데리아 크레나타에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다(Carlier et al. (2016) Environ Microbiol.;18(8):2507-22; 화합물 (A1)의 생합성을 담당하는 생합성 유전자를 암호화하는 생합성 유전자 클러스터(BGC)의 DNA 서열에 대한 GenBank 수탁번호 LGTG01000643.1). E. 콜라이에서의 이종 발현에 의한 화합물 (A1) 생합성은 예를 들어 문헌[Cruesemann et al. (2018) Angew. Chem. Int. Ed.; 57, 836-840]에 기술되어 있다.
본원의 실시예 1에 기술된 바와 같이, B. 크레나타로부터의 화합물 (A1)-BGC의 번역된 아미노산 서열을 서열 데이터베이스의 박테리아 게놈 및 PacBio 시퀀싱 기술로 수행된 시퀀싱 작업으로부터의 박테리아 게놈에 대한 게놈 마이닝 작업에서 쿼리 서열로서 사용하였다. 번역된 아미노산 서열의 상동성이 매우 높고 단백질 기능이 동일하게 예측되는 클러스터가 C. 백시니이의 서열분석된 게놈에서 발견되었다. C. 백시니이가 화합물 (A1)-BGC를 보유하고 있다는 사실을 바탕으로, 공개된 드래프트 게놈(Voeing et al. (2015) Genome Announc 3, e00477-15)으로부터 frsC 및 frsH에 대한 의미 있는 BLAST 히트를 검색할 수 있었지만, 전장 유전자 frsA, frsD, frsE, frsF, frsG에 대해서는 검색할 수 없었다. 유사한 접근법을 통해 Hermes 등(2021)이 C. 백시니이를 A1의 생산자로서 확인하였다. 그러나, 클러스터가 6개의 콘티그에 걸쳐 분산되어 있었고, 전체 화합물 (A1)-BGC의 서열을 얻기 위해서는 광범위한 PCR 기반 갭 클로저(gap closure)를 수행해야 했다(GenBank 수탁번호: MT876545). 본원의 실시예 1에서 생성된 서열은 매우 동일한 반복 서열 스트레치에 관한 PacBio 시퀀싱의 이점을 보여준다. 추가의 거대 NRPS 및 여러 전이가능 요소를 암호화하는 상류 및 하류 영역을 포함하여 완전한 화합물 (A1)-BGC를 확인할 수 있었다(GenBank 수탁번호: BankIt2437961 BSeq#1 MW732719). C. 백시니이에서 화합물 (A1)(frsA-H) 및 화합물 J(dis1-4)의 전이가능 요소 함유 BGC 상의 유전자 구조(76974 bp)는 도 1에 도시되어 있다. 화합물 (A1)-BGC 및 NRPS A를 함유하는 게놈 영역의 구조는 표 2-1에 추가로 제시되어 있다.
완전 화합물 (A1)-BGC를 포함하나 이에 한정되지 않는 화합물 (A1)의 생합성은 또한, 예를 들어 문헌[Pistorius et al. Genetic Engineering of Chromobacterium Vaccinii DSM 25150 for Improved Production of FR900359. ChemRxiv. Cambridge: Cambridge Open Engage; 2021]에 개시되어 있으며, 그 전체는 참조로 포함된다.
세포 배양 및 발효
본원에 기재된 미생물은 화합물 (A1)의 생성이 가능한 조건하에서 배양될 수 있다. 일반적으로, 최적화될 수 있는 조건에는 탄소 공급원의 유형 및 양, 질소 공급원의 유형 및 양, 탄소 대 질소 비, 산소 수준, 성장 온도, pH, 바이오매스 생성 단계의 길이, 목적 생성물 축적 단계의 길이, 및 세포 채취의 시간이 포함된다.
일반적으로 배양 배지는 적합한 탄소 공급원을 함유한다. 탄소 공급원은 단당류(예를 들어, 글루코스, 프룩토스, 자일로스), 이당류(예를 들어, 락토스, 수크로스), 올리고당, 다당류(예를 들어, 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 기타 리그노셀룰로스 물질 또는 이들의 혼합물), 당 알코올(예를 들어, 글리세롤), 및 재생가능한 공급원료(예를 들어, 치즈 유청막 투과액, 옥수수 침지액, 사탕무 당밀, 보리 맥아)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 탄소 공급원은 또한 다음의 비제한적인 예 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: 선형 또는 분지형 알칸(예를 들어, 헥산), 선형 또는 분지형 알코올(예를 들어, 헥산올), 지방산(예를 들어, 약 10개의 탄소 내지 약 22개의 탄소), 지방산의 에스테르, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 및 식물성 오일(예를 들어, 대두유) 및 동물성 지방을 포함한 다양한 상업적 지방산 공급원. 탄소 공급원은 주요 생화학적 중간체로의 대사 전환이 발생할 수 있는 단일-탄소 공급원(예를 들어, 이산화탄소, 메탄올, 포름알데하이드, 포름산염, 및 탄소-함유 아민)을 포함할 수 있다. 활용되는 탄소 공급원은 다양한 탄소-함유 공급원을 포함할 수 있으며 조작된 미생물(들)의 선택에 의해서만 제한될 것으로 예상된다. 허용되는 성장 배지의 비제한적인 예는 Luria 배양액(LB) 한천, King 배지 B(KMB) 한천, 트립톤 처리 대두 배지, 효모 추출물 만니톨 배지(YEM), 글리세롤 효모 추출물(GYEA), 효모 추출물-펩톤-글리세롤(YPG), 펩톤 효모 추출물 글루코스(PYG) MacConkey 한천, 또는 맥아 추출물 한천, 또는 플라스크에 들어 있는 트립톤 처리 대두 배양액, LB 배양액, YEM 배양액, KMB 배양액, GYEA 배양액, YPG 배양액, PYG 배양액 등과 같은 적합한 액체 배지를 포함한다.
질소는 무기 공급원(예를 들어, (NH4)2SO4) 또는 유기 공급원(예를 들어, 우레아 또는 글루타메이트)으로부터 공급될 수 있다. 적절한 탄소 및 질소 공급원 외에도, 배양 배지는 또한, 적합한 미네랄, 염, 보조인자, 버퍼, 비타민, 금속 이온(예를 들어, Mn2+, Co2+, Zn2+, Mg2+), 및 미생물 배양에 적합한 기타 성분을 함유할 수 있다. 필요에 따라 다른 화학물질을 배양물에 추가할 수 있다. 이러한 화학물질의 비제한적인 예는 트립톤 펩톤, 탄산칼슘, 프로피온산, 프로피온산나트륨, L-이소류신, L-발린, L-페닐알라닌, L-페닐부티르산, L-페닐락트산, 염화나트륨, 글리세롤, Bacto 소이톤, Bacto 펩톤, Bacto 소이톤 펩톤, Bacto 효모 추출물, 소이 펩톤 F, 소이 펩톤 파파인 소화물, 식물성 펩톤, 식물성 효모 추출물, 브로드빈 펩톤, 카세인 펩톤, HEPES, 황산암모늄, 황산마그네슘, 소이아민, Amicase®, Tubermine®, 대두 단백질, 염이 없는 효모 추출물, Pharmamedia®, 감자 전분, L-페닐락테이트, 및 L-페닐피루베이트를 포함한다.
미생물은 때때로 복합 배지(예를 들어, 효모 추출물-펩톤-덱스트로스 배양액(YPD))에서 배양된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 상업적으로 제조된 통상적인 배지(예를 들어, LB 배지)이다. 다른 정의된 성장 배지 또는 합성 성장 배지가 당업계에 알려져 있으며 사용될 수도 있다.
미생물은 고체, 반고체, 또는 액체 배지 상에서 또는 내에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 배지는 플레이트에 부착된 세포로부터 배출된다. 특정 구현예에서, 당업계에 알려진 바와 같이, 세포를 파괴하지는 않지만 세포를 펠릿화하고 배지의 추출을 가능하게 하는 데 충분한 속도로 액체-세포 혼합물을 원심분리한다. 이어서, 세포를 새로운 배지에 재현탁시킬 수 있다. 관심 생성물은 당업계에 알려진 방법에 따라 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양된 미생물로부터 목적 생성물을 추출한다. 미생물 세포는 세포막을 전단하기에 충분한 속도의 원심분리를 통해 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 물리적으로 파괴되거나(예를 들어, 전단력, 초음파 처리), 화학적으로 파괴될 수 있다(예를 들어, 세제 또는 기타 용해제와 접촉). 상은 원심분리 또는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 분리될 수 있으며, 목적 생성물은 공지된 방법에 따라 단리될 수 있다.
발효 조건은 미생물을 (예를 들어, 정적 상태 또는 증식 상태로) 유지하는 데 적합한 임의의 배양 조건을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발효 조건은 온도, 산소 함량, 영양소 함량(예를 들어, 글루코스 함량), pH, 교반 수준(예를 들어, 분당 회전수), 가스 유량(예를 들어, 공기, 산소, 질소 가스), 산화환원 전위, 세포 밀도(예를 들어, 광학 밀도), 세포 생존율 등을 제한 없이 포함하는 여러 파라미터를 포함할 수 있다. 발효 조건의 변화(예를 들어, 발효 조건 전환)는 하나 이상의 발효 파라미터의 변경, 수정, 또는 이동이다. 예를 들어, 온도의 증가 또는 감소, pH의 증가 또는 감소(예를 들어, 산, 염기, 또는 이산화탄소의 추가 또는 제거), 산소 함량의 증가 또는 감소(예를 들어, 공기, 산소, 이산화탄소, 질소의 도입), 기압의 증가 또는 감소(예를 들어, 공기, 산소, 이산화탄소, 질소의 도입), 교반의 증가 또는 감소, 및/또는 영양소(예를 들어, 하나 이상의 당, 당 공급원, 바이오매스, 비타민 등)의 추가 또는 제거, 배양물과 플라스크 부피 비의 증가 또는 감소, 또는 이들의 조합을 통해 발효 조건을 변경할 수 있다. 발효 조건의 예는 본원에 기술되어 있다. 호기성 조건은 대개 약 50% 초과(예를 들어, 약 52%, 약 54%, 약 56%, 약 58%, 약 60%, 약 62%, 약 64%, 약 66%, 약 68%, 약 70%, 약 72%, 약 74%, 약 76%, 약 78%, 약 80%, 약 82%, 약 84%, 약 86%, 약 88%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%, 이들 중 임의의 수치 초과)의 용존 산소를 포함한다. 혐기성 조건은 대개 약 50% 미만(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 4%, 약 6%, 약 8%, 약 10%, 약 12%, 약 14%, 약 16%, 약 18%, 약 20%, 약 22%, 약 24%, 약 26%, 약 28%, 약 30%, 약 32%, 약 34%, 약 36%, 약 38%, 약 40%, 약 42%, 약 44%, 약 46%, 약 48%, 이들 중 임의의 수치 미만)의 용존 산소를 포함한다.
관심 생성물의 생성을 위해 다양한 발효 공정이 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 미생물 숙주로부터 목적 생성물을 생성하는 것은 예를 들어 회분식, 유가식, 또는 연속 발효 공정을 사용하여 수행된다.
회분식 발효 공정은 대개 폐쇄형 시스템이며, 공정의 시작시 배지 조성이 고정되고 공정 중에 pH 및 산소 수준의 유지에 필요한 것을 넘는 더 이상의 추가가 일어나지 않는다. 배양 공정의 시작시, 배지에 원하는 유기체가 접종되고, 배지에 추가의 공급원(예를 들어, 탄소 공급원 및 질소 공급원)을 추가하지 않고도 성장 또는 대사 활성이 발생하도록 허용된다. 회분식 공정에서 시스템의 대사산물 및 바이오매스의 조성은 배양이 종료되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 일반적인 회분식 공정에서, 세포는 정적 지체기를 거쳐 고성장 대수기로 진행하고, 최종적으로 성장 속도가 감소하거나 성장이 멈추는 정지기로 진행한다. 처치하지 않고 방치하면 정지기의 세포는 결국 사멸한다.
표준 회분식 공정의 변형은 유가식 공정이며, 발효 공정이 진행되는 동안 탄소 공급원이 발효조에 지속적으로 추가된다. 유가식 공정은 이화대사물 억제가 세포의 대사를 억제하는 경향이 있는 경우 또는 언제든지 배지에 제한된 양의 탄소 공급원이 있는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 유가식 시스템에서 탄소 공급원 농도의 측정은 pH, 용존 산소량, 및 폐가스(예를 들어, CO2)의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 기초하여 추정될 수 있다. 회분식 및 유가식 배양 방법은 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법의 예는 문헌[Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd ed., (1989) Sinauer Associates Sunderland, Mass. and Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227 (1992)]에서 확인할 수 있다.
연속 발효 공정에서는, 정의된 배지가 대개 생물반응기에 연속적으로 추가되는 한편 생성물 회수를 위해 동일한 양의 배양 부피가 동시에 제거된다. 연속 배양은 일반적으로 성장의 대수기의 세포를 일정한 세포 밀도로 유지한다. 연속 또는 반연속 배양 방법에서는 세포 성장 또는 최종 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조절이 가능하다. 예를 들어, 한 가지 접근법은 탄소 공급원을 제한하고 다른 모든 파라미터가 대사를 조절하도록 할 수 있다. 일부 시스템에서, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 반면, 성장에 영향을 미치는 여러 인자는 계속 변경될 수 있다. 연속 시스템은 대개 정상 상태 성장을 유지하므로, 세포 성장 속도가 배양물에서 배출되는 배지로 인한 세포 손실과 균형을 이루는 경우가 많다. 연속 배양 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술이 알려져 있고, 다양한 방법이 상기 Brock의 문헌에 자세히 설명되어 있다.
관심 생성물은 목적 생성물을 함유하는 배양된 미생물 내에 제공될 수 있고, 배양된 미생물은 신선하게 공급되거나 액체 배지에 동결되거나, 건조될 수 있다. 신선하거나 동결된 미생물은 필요에 따라 온도 조절될 수도 있는 적절한 방습 용기에 담을 수 있다. 관심 생성물은 때때로 실질적으로 세포가 없는 배양 배지에서 제공된다. 일부 구현예에서, 관심 생성물은 실질적으로 순수한(예를 들어, 50% 이상 순수한, 60% 이상 순수한, 70% 이상 순수한, 80% 이상 순수한, 90% 이상 순수한, 95% 이상 순수한, 99% 이상 순수한, 또는 99.5% 이상 순수한) 형태로 제공된다. 일부 구현예에서, 관심 생성물은 여러 하류 생성물 중 어느 하나로 변형될 수 있다.
약물 모이어티(D)
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 GNAQ 억제제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 GNA11 억제제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 화학식 (A)의 구조를 갖는 화합물이며:
[화학식 (A)]
,
식에서, Ro는 메틸 또는 에틸이고, Ri는 메틸 또는 i-프로필이고, R2는 메틸 또는 에틸이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (A1)이다:
[화합물 (A1)]
.
화합물 (A1)의 합성은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호의 실시예 3에 기술되어 있다.
화합물 (A1)의 대사 안정성 및 PK 특성은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호의 실시예 8 및 9에 각각 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 화학식 (Ab)의 구조를 갖는 화합물이며:
[화학식 (Ab)]
식에서, Ro은 메틸 또는 에틸이고, Ri, Rs, 및 Rt는 각각 독립적으로 메틸, i-프로필, 또는 메틸티오메틸이고, R2는 메틸 또는 에틸이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (Ab1)이다:
[화합물 (Ab1)]
.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (Ab2)이다:
[화합물 (Ab2)]
.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (Ab3)이다:
[화합물 (Ab3)]
.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 화학식 (Ac)의 구조를 갖는 화합물이며:
[화학식 (Ac)]
식에서, R1은 메틸 또는 이소프로필이고, R2는 메틸 또는 에틸이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (Ac1)이다:
[화합물 (Ac1)]
.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (Ac2)이다:
[화합물 (Ac2)]
.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (Ac3)이다:
[화합물 (Ac3)]
.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는 하기 구조식을 갖는 화합물 (Ac4)이며:
[화합물 (Ac4)]
식에서, R1은 메틸 또는 =CH2이고, R2는 메틸 또는 에틸이고, R3은 메틸, 에틸, 또는 이소프로필이고, R4는 H, N-Ac-Hle, 또는 N-Pr-Hle이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 약물 모이어티(D)는, 예를 들어 실시예 3에 개시된 바와 같은, 화합물 (A1) 및 2 내지 15 중 어느 하나이다.
링커-약물 모이어티(L A -(D) n )
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNA11 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNA11 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 비절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 비절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 비절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNA11 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 링커(LA)에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 약물 모이어티를 포함하고, 링커(LA)는 비절단성 링커이고, 하나 이상의 약물 모이어티는 각각 독립적으로 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)의 링커(LA)는 하기 화학식을 가지며:
식에서,
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
Y1은 , , , , , , , 또는 이고(Y1의 *는 X2에 대한 부착점을 나타내고 Y1의 **는 다른 부착점을 나타냄);
L1은 2가 펩티드 링커이고,
L2는 결합 또는 링커이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체의 링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 하기 화학식을 가지며:
식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
Y1은 , , , , , , , 또는 이고(Y1의 *는 X2에 대한 부착점을 나타내고 Y1의 **는 D에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 2가 펩티드 링커이고,
L2는 결합 또는 링커이다.
링커-약물 화합물(L B -(D) n )
일부 구현예에서, 본 발명의 링커-약물은 화학식 (B)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염이며:
[화학식 (B)]
R8-LB-(D)n
식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
R8은 반응성 기이고;
LB는 절단성 링커 또는 비절단성 링커이고,
n은 1, 2, 3, 또는 4이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 링커-약물은 화학식 (B)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염이고, 식에서
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
R8은 반응성 기이고;
LB는 자가-희생 스페이서, 포스페이트기, 카보네이트기, 및 2가 펩티드 링커로부터 선택된 하나 이상의 링커 구성요소를 포함하는 절단성 링커이고,
n은 1, 2, 3, 또는 4이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 링커-약물은 화학식 (B-1)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염이며:
[화학식 (B-1)]
식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
R8은 반응성 기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
Y1은 , , , , , , , 또는 이고(Y1의 *는 X2에 대한 부착점을 나타내고 Y1의 **는 D에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 2가 펩티드 링커이고,
L2는 결합 또는 링커이다.
본 발명의 링커-약물 화합물의 특정 구현예 및 예가 하기 추가의 열거된 구현예 목록에서 제공된다. 각 구현예에 명시된 특징을 다른 명시된 특징과 조합하여 본 발명의 추가 구현예를 제공할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
구현예 1. D가 GNAQ 억제제인, 화학식 (B) 또는 화학식 (B-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염.
구현예 2. D가 GNA11 억제제인, 화학식 (B) 또는 화학식 (B-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염.
구현예 3. D가 GNAQ 및 GNA11의 억제제인, 화학식 (B) 또는 화학식 (B-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염.
구현예 4. D가 하기 식인, 화학식 (B) 또는 화학식 (B-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
,
[식에서, R0은 메틸 또는 에틸이고, R1은 메틸 또는 이소프로필이고, R2는 메틸 또는 에틸이고, ***는 LB 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 4a. D가 하기 식인, 화학식 (Bb) 또는 화학식 (Bb-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
,
[식에서, R0은 메틸 또는 에틸이고, R1, Rs, Rt는 각각 독립적으로 메틸, 이소프로필, 또는 메틸티오메틸이고, R2는 메틸 또는 에틸이고, ***는 LB 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 4b. D가 하기 식인, 화학식 (Bc) 또는 화학식 (Bc-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
,
[식에서, R0은 메틸 또는 에틸이고, R1은 메틸 또는 이소프로필이고, R2는 메틸 또는 에틸이고, ***는 LB 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 5. D가 하기 식인, 화학식 (B) 또는 화학식 (B-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
,
[식에서, ***는 LB 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 6. 화학식 (B-2) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (B) 또는 화학식 (B-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (B-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (B-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 6a. 화학식 (Bb-2) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (Bb) 또는 화학식 (Bb-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (Bb-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1, Rs, 및 Rt는 각각 독립적으로 메틸, 메틸티오메틸, 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (Bb-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 6b. 화학식 (Bc-2) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (Bc) 또는 화학식 (Bc-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (Bc-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (Bc-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 7. 화학식 (B-2a) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (B), 화학식 (B-1), 또는 화학식 (B-2)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (B-2a)]
,
[식에서,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (B-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 8. 화학식 (B-3) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (B) 또는 화학식 (B-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (B-3)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (B-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 8a. 화학식 (Bb-3) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (Bb) 또는 화학식 (Bb-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (Bb-3)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1, Rs, 및 Rt는 각각 독립적으로 메틸, 메틸티오메틸, 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (Bb-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 8b. 화학식 (Bc-3) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (Bc) 또는 화학식 (Bc-1)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (Bc-3)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (Bc-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 9. 화학식 (B-3a) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는, 화학식 (B), 화학식 (B-1), 또는 화학식 (B-3)의 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 (B-3a)]
,
[식에서,
X2, L1, L2, 및 R8은 상기 화학식 (B-1)의 화합물에 정의된 바와 같음].
구현예 10. 구현예 6의 화학식 (B-2), 구현예 8의 화학식 (B-3)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
X2는 , , , , , , 및 로부터 선택된 자가-희생 스페이서이고(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 기에 대한 부착점 또는 기에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 2 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커이고;
L2는 링커이고,
R8은 , -N3, -ONH2, -NR4C(=O)CH=CH2, SH, -SSR13, -S(=O)2(CH=CH2), -NR4S(=O)2(CH=CH2), -NR4C(=O)CH2Br, -NR4C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -C(=O)NHNH2, , -CO2H, -NH2, , , , , , , , , , , 또는 로부터 선택되고, 여기서
각각의 R4는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, 및 -OH로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2, 및 -OH로부터 선택되고,
각각의 R7은 독립적으로 H, C1-6알킬, 플루오로, -C(=O)OH로 치환된 벤질옥시, -C(=O)OH로 치환된 벤질, -C(=O)OH로 치환된 C1-4알콕시, 및 -C(=O)OH로 치환된 C1-4알킬로부터 선택됨].
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, X2가 , , , , , , 및 로부터 선택된 자가-희생 스페이서인(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 Y1에 대한 부착점, 기에 대한 부착점, 또는 기에 대한 부착점을 나타냄), 화합물.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, X2가 인(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 Y1에 대한 부착점, 기에 대한 부착점, 또는 기에 대한 부착점을 나타냄), 화합물.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 2 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커인, 화합물.
구현예 14. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 발린, 시트룰린, 라이신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 알라닌, 류신, 트립토판, 및 티로신으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커인, 화합물.
구현예 15. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 적어도 하나의 발린(Val) 또는 시트룰린(Cit) 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커인, 화합물.
구현예 16. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 ValCit, PheLys, ValAla, 및 ValLys로부터 선택된 2가 디펩티드 링커인, 화합물.
구현예 17. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 (ValCit), (PheLys), (ValAla), (ValLys), 및 (LeuCit)로부터 선택된 2가 디펩티드 링커인(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄), 화합물.
구현예 18. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 ValCit인, 화합물.
구현예 19. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서,
L1이 (ValCit)인(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄), 화합물.
구현예 20. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가 링커인, 화합물.
구현예 21. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가
-*C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m**-, -*C(=O)(CH2)m**-, -*C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)m**-, -*C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m**-, -* ((CH2)mO)p(CH2)m**-, -* ((CH2)mO)p(CH2)m**-, -(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)(CH2)m**-, -* (CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m**-, -* ((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m**-, -* *((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m**-, -* (CH2)mC(R3)2**-, 및 -* (CH2)mC(R3)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m**-로부터 선택된 링커이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 R8에 대한 부착점을 나타냄);
각각의 R3은 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로부터 선택되고,
각각의 p는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 및 14로부터 선택되는, 화합물.
구현예 22. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가 -*C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m**- 또는 -*C(=O)(CH2)m**-이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 R8에 대한 부착점을 나타냄),
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택되고 p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14인, 화합물.
구현예 23. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가 , , 또는 인(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 R8에 대한 부착점을 나타냄), 화합물.
구현예 24. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, R8이 , -N3, -ONH2, -NR4C(=O)CH=CH2, SH, -SSR13, -S(=O)2(CH=CH2), -NR4S(=O)2(CH=CH2), -NR4C(=O)CH2Br, -NR4C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -C(=O)NHNH2, , -CO2H, -NH2, , , , , , , , , , , 또는 이고,
각각의 R4는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, 및 -OH로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2, 및 -OH로부터 선택되고,
각각의 R7은 독립적으로 H, C1-6알킬, 플루오로, -C(=O)OH로 치환된 벤질옥시, -C(=O)OH로 치환된 벤질, -C(=O)OH로 치환된 C1-4알콕시, 및 -C(=O)OH로 치환된 C1-4알킬로부터 선택되는, 화합물.
구현예 25. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, R8이 , -ONH2, , , 또는 인, 화합물.
구현예 26. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, R8이 인, 화합물.
구현예 27. 구현예 6의 화학식 (B-2)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
X2는 이고(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 기에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 (ValCit)이고(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄);
L2는 또는 이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 R8에 대한 부착점을 나타냄),
R8은 임].
구현예 28. 구현예 8의 화학식 (B-3)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
X2는 이고(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 기에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 (ValCit)이고(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄);
L2는 또는 이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 R8에 대한 부착점을 나타냄),
R8은 임].
구현예 29. 화학식 (B), 화학식 (B-1), 또는 화학식 (B-2)의 화합물로서, 하기의 화합물:
[화합물 (B1)]
.
구현예 30. 화학식 (B), 화학식 (B-1), 또는 화학식 (B-2)의 화합물로서, 하기의 화합물:
[화합물 (B4)]
.
구현예 31. 화학식 (B), 화학식 (B-1), 또는 화학식 (B-3)의 화합물로서, 하기의 화합물:
[화합물 (B7)]
.
구현예 32. 화학식 (B), 화학식 (B-1), 또는 화학식 (B-3)의 화합물로서, 하기의 화합물:
[화합물 (B10)]
.
예시적인 링커-약물 화합물의 합성은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호의 실시예 1에 기술되어 있다.
항체 약물 접합체
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체는 화학식 (C)의 접합체이며:
[화학식 (C)]
Ab-(LA-(D)n)y
식에서,
D는 약물 모이어티이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
LA는 링커이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4이고,
링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 공유결합으로 부착된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체는 화학식 (C)의 구조를 가지며:
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
LA는 자가-희생 스페이서, 포스페이트기, 카보네이트기, 및 2가 펩티드 링커로부터 선택된 하나 이상의 링커 구성요소를 포함하는 절단성 링커이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4이고,
링커-약물 모이어티(LA-(D)n)는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 공유결합으로 부착된다.
일부 구현예에서, 화학식 (C)의 항체 약물 접합체는 화학식 (C-1)의 접합체이며:
[화학식 (C-1)]
식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
Y1은 , , , , , , , 또는 이고(Y1의 *는 X2에 대한 부착점을 나타내고 Y1의 **는 D에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4이다.
화학식 (C)의 접합체에서, 하나 이상의 링커-약물 모이어티(LB-(D)n)가 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab에 공유결합으로 부착될 수 있으며, 이로써 하나 이상의 약물 모이어티 D를 링커 LA를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab에 공유결합으로 부착시킬 수 있다. LA는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab를 하나 이상의 약물 모이어티 D에 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 하나 이상의 약물 모이어티 D가 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab에 공유결합으로 연결된 화학식 (C)의 접합체는, 동일하거나 상이한 하나 이상의 반응성 작용기를 갖는 이작용성 또는 다작용성 링커 시약을 사용하여 형성될 수 있다. 이작용성 또는 다작용성 링커 시약의 반응성 작용기 중 하나는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab 상의 기, 예를 들어 티올 또는 아민(예를 들어, 시스테인, N-말단 또는 아미노산 측쇄, 예컨대 라이신)과 반응하여 링커 LA의 한쪽 말단과 공유 결합을 형성하는 데 사용된다. 이작용성 또는 다작용성 링커 시약의 이러한 반응성 작용기는 말레이미드, 티올, 및 NHS 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이작용성 또는 다작용성 링커 시약의 다른 반응성 작용기 또는 작용기들은 하나 이상의 약물 모이어티 D를 링커 LA에 공유결합으로 부착시키는 데 사용된다.
일부 구현예에서, LA는 절단성 링커이다. 일부 구현예에서, LA는 비절단성 링커이다. 일부 구현예에서, LA는 산-불안정성 링커, 광-불안정성 링커, 펩티다제 절단성 링커, 에스테라제 절단성 링커, 글리코시다제 절단성 링커, 포스포디에스테라제 절단성 링커, 이황화 결합 환원성 링커, 친수성 링커, 또는 디카복실산계 링커이다.
일부 구현예에서, LA는 자가-희생 스페이서, 포스페이트기, 카보네이트기, 및 2가 펩티드 링커로부터 선택된 하나 이상의 링커 구성요소를 포함하는 절단성 링커이다.
일부 구현예에서, LA는 자가-희생 스페이서, 포스페이트기, 카보네이트기, 2가 펩티드 링커, 및 2가 커플링기로부터 선택된 하나 이상의 링커 구성요소를 포함하는 절단성 링커이다.
일부 구현예에서 LA는 자가-희생 스페이서, 포스페이트기, 및 2가 펩티드 링커로부터 선택된 하나 이상의 링커 구성요소를 포함하는 절단성 링커이다.
일부 구현예에서, LA는 자가-희생 스페이서, 포스페이트기, 2가 펩티드 링커, 및 2가 커플링기로부터 선택된 하나 이상의 링커 구성요소를 포함하는 절단성 링커이다.
일부 구현예에서, 링커(LA)는 하기 화학식을 가지며,
식에서,
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
Y1은 , , , , , , , 또는 이고(Y1의 *는 X2에 대한 부착점을 나타내고 Y1의 **는 다른 부착점을 나타냄);
L1은 2가 펩티드 링커이고,
L2는 결합 또는 링커이다.
일부 구현예에서, 링커(LA)는 하기 화학식을 가지며,
식에서,
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
Y1은 , , , 또는 이고(Y1의 *는 X2에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 2가 펩티드 링커이고,
L2는 결합 또는 링커이다.
일부 구현예에서, 링커(LA)는 하기 화학식을 가지며,
식에서,
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
Y1은 , , , 또는 이고(Y1의 *는 X2에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 2가 펩티드 링커이고,
L2는 결합 또는 링커이다.
약물 대 항체 비는 특정 접합체 분자의 경우 정확한 정수 값을 갖지만(예를 들어, 화학식 (C)의 n과 y의 곱), 이 값이 많은 분자를 함유하는 샘플을 설명하는 데 사용될 때에는 일반적으로 접합 단계와 관련된 어느 정도의 이질성으로 인해 종종 평균값일 것임이 이해된다. 접합체의 샘플에 대한 평균 로딩은 본원에서 약물 대 항체 비 또는 "DAR"로 지칭된다. 일부 구현예에서, DAR은 약 1 내지 약 5이고, 일반적으로는 약 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 구현예에서, 샘플의 적어도 50 중량%는 평균 DAR ± 2를 갖는 화합물이고, 바람직하게는 샘플의 적어도 50%는 평균 DAR ± 1을 함유하는 접합체이다. 다른 구현예는 DAR이 약 2인 접합체를 포함한다. 일부 구현예에서, '약 y'의 DAR은 DAR에 대한 측정값이 화학식 (I)의 n과 y의 곱의 20% 이내임을 의미한다. 일부 구현예에서, '약 n'의 DAR은 DAR에 대한 측정값이 화학식 (II)의 n의 20% 이내임을 의미한다.
일부 구현예에서, 화학식 (C)의 접합체의 약물 대 항체의 평균 몰비(즉, 약물 대 항체 비(DAR)로도 알려진, n과 y의 곱의 평균값)는 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 6(예를 들어, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 또는 6.0), 약 1 내지 약 5, 약 1.5 내지 약 4.5, 또는 약 2 내지 약 4이다.
본 발명에 의해 제공되는 일부 구현예에서, 접합체는 실질적으로 높은 순도를 가지며 다음 특징 중 하나 이상을 갖는다: (a) 접합체 종의 약 90% 초과(예를 들어, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% 이상), 바람직하게는 약 95% 초과가 단량체임, (b) 접합체 제제 내 비접합 링커 수준이 약 10% 미만(예를 들어, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0% 이하)(전체 링커 대비), (c) 접합체 종의 10% 미만(예를 들어, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0% 이하)이 가교됨, (d) 접합체 제제 내 유리 약물(ADP-유도된 혈소판 응집 억제제, 예를 들어 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11 억제제) 수준이 약 2% 미만(예를 들어, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1.0%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 약 0.1%, 또는 약 0% 이하)(전체 약물 대비).
본 발명의 항체 약물 접합체의 특정 구현예 및 예가 하기 추가의 열거된 구현예 목록에서 제공된다. 각 구현예에 명시된 특징을 다른 명시된 특징과 조합하여 본 발명의 추가 구현예를 제공할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
구현예 33. D가 GNAQ 억제제인, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체.
구현예 34. D가 화합물 GNA11 억제제인, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체.
구현예 35. D가 GNAQ 및 GNA11의 억제제인, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체.
구현예 36. D가 하기 식인, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체:
,
[식에서, R0은 메틸 또는 에틸이고, R1은 메틸 또는 이소프로필이고, R2는 메틸 또는 에틸이고, ***는 LA 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 36a. D가 하기 식인, 화학식 (Cb) 또는 화학식 (Cb-1)의 접합체:
,
[식에서, R0은 메틸 또는 에틸이고, R1, Rs, 및 Rt는 각각 독립적으로 메틸, 메틸티오메틸, 또는 이소프로필이고, R2는 메틸 또는 에틸이고, ***는 LA 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 36b. D가 하기 식인, 화학식 (Cc) 또는 화학식 (Cc-1)의 접합체:
,
[식에서, R0은 메틸 또는 에틸이고, R1은 메틸 또는 이소프로필이고, R2는 메틸 또는 에틸이고, ***는 LA 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 37. D가 하기 식인, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체:
,
[식에서, ***는 LA 또는 Y1에 대한 부착점을 나타냄].
구현예 38. 화학식 (C-2)의 구조를 갖는, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체:
[화학식 (C-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 38a. 화학식 (Cb-2)의 구조를 갖는, 화학식 (Cb) 또는 화학식 (Cb-1)의 접합체:
[화학식 (Cb-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1, Rs, 및 Rt는 각각 독립적으로 메틸, 메틸티오메틸, 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 38b. 화학식 (Cc-2)의 구조를 갖는, 화학식 (Cc) 또는 화학식 (Cc-1)의 접합체:
[화학식 (Cc-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 39. 화학식 (C-2a)의 구조를 갖는, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체:
[화학식 (C-2a)]
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 40. 화학식 (C-3)의 구조를 갖는, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체:
[화학식 (C-3)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 40a. 화학식 (Cb-3)의 구조를 갖는, 화학식 (Cb) 또는 화학식 (Cb-1)의 접합체:
[화학식 (Cb-3)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1, Rs, 및 Rt는 각각 독립적으로 메틸, 메틸티오메틸, 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 40b. 화학식 (Cc-3)의 구조를 갖는, 화학식 (Cc) 또는 화학식 (Cc-1)의 접합체:
[화학식 (Cc-3)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 41. 화학식 (C-3a)의 구조를 갖는, 화학식 (C) 또는 화학식 (C-1)의 접합체:
[화학식 (C-3a)]
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 42. 구현예 54의 화학식 (C-2)의 접합체 또는 구현예 58의 화학식 (C-3)의 접합체:
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X2는 , , , , , , 및 로부터 선택된 자가-희생 스페이서이고(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 기에 대한 부착점 또는 기에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 2 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커이고;
L2는 링커이고;
X1은 , , , , , , -*NR4C(=O)CH2**-, -*NHC(=O)CH2**-, -*S(=O)2CH2CH2**-, -* (CH2)2S(=O)2CH2CH2**-, -*NR4S(=O)2CH2CH2**-, -*NR4C(=O)CH2CH2**-, -NH-, -C(=O)-, -*NHC(=O) **-, -*CH2NHCH2CH2**-, -*NHCH2CH2**-, -S-, , , , , , , , , , **-로부터 선택된 2가 커플링기이고(X1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 X1의 **는 Ab에 대한 부착점을 나타냄);
각각의 R4는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, 및 -OH로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2, 및 -OH로부터 선택되고,
각각의 R7은 독립적으로 H, C1-6알킬, 플루오로, -C(=O)OH로 치환된 벤질옥시, -C(=O)OH로 치환된 벤질, -C(=O)OH로 치환된 C1-4알콕시, 및 -C(=O)OH로 치환된 C1-4알킬로부터 선택되고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 43. 구현예 38 내지 42 중 어느 한 구현예에 있어서, X2가 , , , , , , 및 로부터 선택된 자가-희생 스페이서인(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 Y1에 대한 부착점 또는 기에 대한 부착점 또는 기에 대한 부착점을 나타냄), 접합체.
구현예 44. 구현예 38 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, X2가 인(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 Y1에 대한 부착점 또는 기에 대한 부착점 또는 기에 대한 부착점을 나타냄), 접합체.
구현예 45. 구현예 38 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 2 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커인, 접합체.
구현예 46. 구현예 38 내지 45 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 발린, 시트룰린, 라이신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 알라닌, 류신, 트립토판, 및 티로신으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커인, 접합체.
구현예 47. 구현예 38 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 적어도 하나의 발린(Val) 또는 시트룰린(Cit) 잔기를 포함하는 2가 펩티드 링커인, 접합체.
구현예 48. 구현예 38 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 ValCit, PheLys, ValAla, 및 ValLys로부터 선택된 2가 디펩티드 링커인, 접합체.
구현예 49. 구현예 38 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 (ValCit), (PheLys), (ValAla), (ValLys), 및 (LeuCit)로부터 선택된 2가 디펩티드 링커인(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄), 접합체.
구현예 50. 구현예 38 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, L1이 ValCit인, 접합체.
구현예 51. 구현예 38 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서,
L1이 (ValCit)인(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄), 접합체.
구현예 52. 구현예 38 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가 링커인, 접합체.
구현예 53. 구현예 38 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가
-*C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m**-, -*C(=O)(CH2)m**-, -*C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)m**-, -*C(=O)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m**-, -* ((CH2)mO)p(CH2)m**-, -* ((CH2)mO)p(CH2)m**-, -(CH2)m-, -*(CH2)mNHC(=O)(CH2)m**-, -* (CH2)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)m**-, -* ((CH2)mO)p(CH2)mNHC(=O)(CH2)m**-, -* *((CH2)mO)pCH2)mC(=O)NH(CH2)m**-, -* (CH2)mC(R3)2**-, 및 -* (CH2)mC(R3)2SS(CH2)mNHC(=O)(CH2)m**-로부터 선택된 링커이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 X1에 대한 부착점을 나타냄);
각각의 R3은 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로부터 선택되고,
각각의 p는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 및 14로부터 선택되는, 접합체.
구현예 54. 구현예 38 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가 -*C(=O)((CH2)mO)p(CH2)m**- 또는 -*C(=O)(CH2)m**-이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 X1에 대한 부착점을 나타냄),
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택되고 p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14인, 접합체.
구현예 55. 구현예 38 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, L2가 , , 또는 인(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 X1에 대한 부착점을 나타냄), 접합체.
구현예 56. 구현예 38 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서,
X1이 , , , , , , -*NR4C(=O)CH2**-, -*NHC(=O)CH2**-, -*S(=O)2CH2CH2**-, -* (CH2)2S(=O)2CH2CH2**-, -*NR4S(=O)2CH2CH2**-, -*NR4C(=O)CH2CH2**-, -NH-, -C(=O)-, -*NHC(=O) **-, -*CH2NHCH2CH2**-, -*NHCH2CH2**-, -S-, , , , , , , , , , **-로부터 선택된 2가 커플링기이고(X1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 X1의 **는 Ab에 대한 부착점을 나타냄);
각각의 R4는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
각각의 R5는 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, 및 -OH로부터 선택되고;
각각의 R6은 독립적으로 H, C1-C6알킬, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2, 및 -OH로부터 선택되고,
각각의 R7은 독립적으로 H, C1-6알킬, 플루오로, -C(=O)OH로 치환된 벤질옥시, -C(=O)OH로 치환된 벤질, -C(=O)OH로 치환된 C1-4알콕시, 및 -C(=O)OH로 치환된 C1-4알킬로부터 선택되는, 접합체.
구현예 57. 구현예 38 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서,
X1이 , , , , , 및 로부터 선택된 2가 커플링기인(X1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 X1의 **는 Ab에 대한 부착점을 나타냄), 접합체.
구현예 58. 구현예 38 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서,
X1이 , , 및 로부터 선택된 2가 커플링기인(X1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 X1의 **는 Ab에 대한 부착점을 나타냄), 접합체.
구현예 59. 구현예 38의 화학식 (C-2)의 접합체:
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
X1은 , , 및 로부터 선택된 2가 커플링기이고(X1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 X1의 **는 Ab에 대한 부착점을 나타냄);
X2는 이고(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 기에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 (ValCit)이고(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄);
L2는 또는 이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 R8에 대한 부착점을 나타냄),
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 60. 구현예 40의 화학식 (C-3)의 접합체:
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
X1은 , , 및 로부터 선택된 2가 커플링기이고(X1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 X1의 **는 Ab에 대한 부착점을 나타냄);
X2는 이고(X2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 X2의 **는 기에 대한 부착점을 나타냄);
L1은 (ValCit)이고(L1의 *는 L2에 대한 부착점을 나타내고 L1의 **는 X2에 대한 부착점을 나타냄);
L2는 또는 이고(L2의 *는 L1에 대한 부착점을 나타내고 L2의 **는 R8에 대한 부착점을 나타냄),
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
구현예 61. 하기 구조식을 갖는, 화학식 (C), 화학식 (C-1), 또는 화학식 (C-2)의 접합체:
[식에서,
y는 2 또는 4이고,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편임].
구현예 62. 하기 구조식을 갖는, 화학식 (C), 화학식 (C-1), 또는 화학식 (C-2)의 접합체:
[식에서,
y는 2 또는 4이고,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편임].
구현예 63. 하기 구조식을 갖는, 화학식 (C), 화학식 (C-1), 또는 화학식 (C-3)의 접합체:
[식에서,
y는 2 또는 4이고,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편임].
구현예 64. 하기 구조식을 갖는, 화학식 (C), 화학식 (C-1), 또는 화학식 (C-3)의 접합체:
[식에서,
y는 2 또는 4이고,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편임].
구현예 65. 하기 구조식을 갖는 화합물 (E)의 접합체:
[식에서,
y는 2이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편임].
또한, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 요망되는 생물학적 활성을 갖는 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 사이토카인, 아폽토시스제, 항혈관형성제와 같은 단백질, 또는 예를 들어 림포카인과 같은 생물학적 반응 조절제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 세포독소, 약물(예를 들어, 면역억제제), 또는 방사성독소와 같은 약물 모이어티에 접합된다. 세포독소의 예는 탁산(예를 들어, 국제(PCT) 특허 출원 WO 01/38318호 및 PCT/US03/02675호 참조), DNA-알킬화제(예를 들어, CC-1065 유사체), 안트라사이클린, 튜불리신 유사체, 듀오카마이신 유사체, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, 메이탄시노이드, 피롤로벤조디아지핀(PBD), 및 반응성 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 세포독성제(예를 들어, 문헌[Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000), Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000), Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991), Francisco et al., Blood (2003)(인쇄물 공개 전 전자 공개), 미국 특허 5,475,092호, 6,340,701호, 6,372,738호, 및 6,436,931호, 미국 특허 출원 공개 2001/0036923 A1호, 계류 중인 미국 특허 출원 일련번호 10/024,290 및 10/116,053, 및 국제(PCT) 특허 출원 WO 01/49698호]), 탁손, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, t. 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 치료제는 또한 예를 들어 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 제거제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오테파 클로람부실, 메이팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴, 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전 명칭은 다우노마이신) 및 독소루비신)), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전 명칭은 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. (예를 들어, Seattle Genetics의 US20090304721 참조).
본 발명의 항체, 항체 단편(항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물에 접합될 수 있는 세포독소의 다른 예는 듀오카마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 이들의 유도체를 포함한다.
항체에 치료제를 접합하기 위한 다양한 유형의 세포독소, 링커, 및 방법이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264] 참조).
본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 또한 방사성 동위원소에 접합되어 방사성 면역접합체라고도 하는 세포독성 방사성 약제를 생성할 수 있다. 진단적 또는 치료적 사용을 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 요오드-131, 인듐-111, 이트륨-90, 및 루테튬-177을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 방사성 면역접합체의 제조 방법은 당업계에 확립되어 있다. 방사성 면역접합체의 예는 ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals) 및 BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)을 포함하여, 상업적으로 이용가능하며, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성 면역접합체를 제조하기 위해 유사한 방법들이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 거대고리 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 일반적으로 알려져 있으며 문헌[Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; 및 Zimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50]에 기재되어 있고, 각 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능성 등가물은 또한, 이종 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 단편, 바람직하게는 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 또는 적어도 약 100개 아미노산의 폴리펩티드)에 접합되어 융합 단백질을 생성할 수 있다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)(예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인, 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링("DNA 셔플링"으로 총칭됨) 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 활성을 변경하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 또는 이의 단편). 개괄적으로 문헌[미국 특허 5,605,793호, 5,811,238호, 5,830,721호, 5,834,252호, 및 5,837,458호; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313] 참조(이들 특허 및 공개문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 항체 또는 이의 단편, 또는 암호화된 항체 및 이의 단편은 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입, 또는 다른 방법에 의해 무작위 돌연변이유발 처리됨으로써 변경될 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 구성요소, 모티프, 섹션, 파트, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 정제를 용이하게 하기 위해 펩티드와 같은 마커 서열에 접합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 마커 아미노산 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩티드(서열번호 267), 예컨대 pQE 벡터에 제공된 태그(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)이며, 그 외 많은 것들이 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어 문헌[Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘(서열번호 267)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는, 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 혈구응집소("HA") 태그(Wilson et al., (1984) Cell 37:767) 및 "FLAG" 태그(A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은 또한, 효능을 향상시키기 위해 종양-침투 펩티드에 접합될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 진단 시약 또는 검출가능한 시약에 접합된다. 이러한 면역접합체는 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발달, 진행, 및/또는 중증도의 모니터링 또는 예측, 예컨대 특정 요법의 효능 확인에 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제와 같은(이에 한정되지 않음) 다양한 효소; 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴과 같은(이에 한정되지 않음) 보결분자단; Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 또는 피코에리트린과 같은(이에 한정되지 않음) 형광 물질; 루미놀과 같은(이에 한정되지 않음) 발광 물질; 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿼린과 같은(이에 한정되지 않음) 생체발광 물질; 요오드(131I, 125I, 123I, 및 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 및 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 64Cu, 113Sn, 및 117Sn과 같은(이에 한정되지 않음) 방사성 물질; 및 다양한 양전자 방출 단층촬영술을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 비롯한(이에 한정되지 않음) 검출가능한 물질에 항체를 결합시켜 달성될 수 있다.
본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 또한, 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
접합 및 ADC의 제조
화학식 (C), 화학식 (C-1), 및 화학식 (C-2)의 항체 약물 접합체의 제조 공정
화학식 (C)의 접합체 형성을 위한 일반 반응식은 아래 반응식 1에 나타나 있다:
반응식 1
상기 식에서, RG1은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab 상의 반응성 기이며, 단지 예를 들어 티올, 아민, 또는 케톤이며, 이는 링커-약물 화합물에 부착된 상용성 반응성 기 R8과 반응하여, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab를 하나 이상의 링커-약물 모이어티에 공유결합으로 연결한다. RG1과 R8 기의 이러한 반응의 비제한적인 예는 티올(RG1)과 반응하여 석신이미드 고리를 제공하는 말레이미드(R8), 또는 케톤(RG1)과 반응하여 옥심을 제공하는 하이드록실아민(R8)이다.
일 구현예에서, D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)이고, La는 RG1과 R8이 반응할 때 형성되는 2가 커플링기를 추가로 포함하는 링커이고, n은 1, 2, 3, 또는 4이고, y는 1, 2, 3, 또는 4이다.
화학식 (C-1)의 접합체 형성을 위한 일반 반응식은 아래 반응식 2에 나타나 있다:
반응식 2
상기 식에서, RG1은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab 상의 반응성 기이며, 단지 예를 들어 티올, 아민, 또는 케톤이며, 이는 링커-약물 모이어티에 부착된 상용성 반응성 기 R8과 반응하여, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab를 하나 이상의 링커-약물 모이어티에 공유결합으로 연결한다. RG1과 R8 기의 이러한 반응의 비제한적인 예는 티올(RG1)과 반응하여 석신이미드 고리를 제공하는 말레이미드(R8), 또는 케톤(RG1)과 반응하여 옥심을 제공하는 하이드록실아민(R8)이다.
일 구현예에서, D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(GNAQ/GNA11 억제제)이고, X1은 RG1과 R8이 반응할 때 형성되는 2가 커플링기(예를 들어, 석신이미드 고리 또는 옥심)이고, Y1은 포스페이트기이고, X2는 자가-희생 스페이서이고, L1은 2가 펩티드 링커이고, L2는 결합 또는 링커이고, y는 1, 2, 3, 또는 4이다.
화학식 (C-2)의 접합체 형성을 위한 일반 반응식은 아래 반응식 3에 나타나 있다:
반응식 3
상기 식에서, RG1은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab 상의 반응성 기이며, 단지 예를 들어 티올, 아민, 또는 케톤이며, 이는 링커-약물 모이어티에 부착된 상용성 반응성 기 R8과 반응하여, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab를 하나 이상의 링커-약물 모이어티에 공유결합으로 연결한다. RG1과 R8 기의 이러한 반응의 비제한적인 예는 티올(RG1)과 반응하여 석신이미드 고리를 제공하는 말레이미드(R8), 또는 케톤(RG1)과 반응하여 옥심을 제공하는 하이드록실아민(R8)이다.
여기서 R0은 메틸이고, R1은 이소프로필이고, R2는 에틸이고, X1은 RG1과 R8이 반응할 때 형성되는 2가 커플링기(예를 들어, 석신이미드 고리 또는 옥심)이고, X2는 자가-희생 스페이서이고, L1은 2가 펩티드 링커이고, L2는 결합 또는 링커이고, y는 1, 2, 3, 또는 4이다.
화학식 (C-2)의 접합체 형성을 위한 일반 반응식은 아래 반응식 4에 나타나 있다:
반응식 4
상기 식에서, RG1은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab 상의 반응성 기이며, 단지 예를 들어 티올, 아민, 또는 케톤이며, 이는 링커-약물 모이어티에 부착된 상용성 반응성 기 R8과 반응하여, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 Ab를 하나 이상의 링커-약물 모이어티에 공유결합으로 연결한다. RG1과 R8 기의 이러한 반응의 비제한적인 예는 티올(RG1)과 반응하여 석신이미드 고리를 제공하는 말레이미드(R8), 또는 케톤(RG1)과 반응하여 옥심을 제공하는 하이드록실아민(R8)이다.
여기서 R0은 메틸이고, R1은 이소프로필이고, R2는 에틸이고, X1은 RG1과 R8이 반응할 때 형성되는 2가 커플링기(예를 들어, 석신이미드 고리 또는 옥심)이고, X2는 자가-희생 스페이서이고, L1은 2가 펩티드 링커이고, L2는 결합 또는 링커이고, y는 1, 2, 3, 또는 4이다.
조작된 시스테인 항체 잔기에 대한 접합 공정
본 발명의 접합체는 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 항체로 조작된 시스테인 잔기를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 부위-특이적 접합체는 균질하고, 개선된 특성을 갖는다(Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology 26:925-932).
포유류 세포에서 발현된 항체의 조작된 시스테인은 생합성 중에 글루타티온(GSH) 및/또는 시스테인과 같은 부가물(이황화물)에 의해 변형되기 때문에(Chen et al. 2009), 초기에 발현된 생성물의 조작된 시스테인은 티올 반응성 시약, 예컨대 말레이미도 또는 브로모- 또는 요오도-아세트아미드기에 대해 비반응성이다. 발현 후 조작된 시스테인 잔기에 페이로드를 접합시키기 위해서는, 이러한 이황화물 부가물을 환원시켜 글루타티온 또는 시스테인 부가물을 제거할 필요가 있으며, 이는 또한 일반적으로 발현 단백질 내 천연 이황화물의 환원을 수반한다. 부가된 조작된 시스테인의 탈보호는 먼저 항체를 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨(DTT), TCEP, 또는 환원된 시스테인에 노출시킨 다음, 항체의 모든 천연 이황화 결합을 재산화시켜 기능적 항체 구조를 복원 및/또는 안정화시키는 방법에 의해 달성될 수 있다.
항체 약물 접합체의 제조를 위해 조작된 시스테인 잔기로 항체를 환원시키고 재산화시키기 위해 여러 방법이 사용될 수 있다. 고농도의 CuSO4를 사용하여 이전에 문헌에 설명된 재산화 프로토콜을 따르려는 시도는 단백질 침전을 초래했다(Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology 26:925). 본 발명자들은 환원 및 항체 재산화를 위한 여러 상이한 방법으로 항체 약물 접합체를 성공적으로 제조하고 수득했다.
다음은 항체 약물 접합체의 제조를 위해 조작된 시스테인 잔기로 항체를 환원시키고 재산화시키는 방법이다: 새로 제조된 DTT를 정제된 Cys 돌연변이 항체에 10 mM의 최종 농도로 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 DTT와 함께 인큐베이션한 후, 매일 버퍼를 교환하면서 혼합물을 3일 동안 PBS에 대해 4℃에서 투석하여 DTT를 제거하고 항체의 천연 이황화 결합을 재산화시킨다. 대안적인 방법은 PBS로 평형화된 Sephadex G-25와 같은 탈염 컬럼을 통해 환원제를 제거하는 것이다. 단백질이 완전히 환원되면, 1 mM의 산화 아스코베이트(데하이드로-아스코브산)를 탈염된 샘플에 임의로 첨가하고 20~24시간 동안 재산화 인큐베이션을 수행한다.
다른 예시적인 방법에서, 조작된 Cys 잔기의 탈보호는 단백질 A-세파로스 수지에 결합된 항체에 20 mM 농도의 완전히 환원된 시스테인을 첨가함으로써 달성된다. Cys 부가물의 환원은 실온에서 약 30~60분 동안 인큐베이션하여 달성되고, 이후 환원제는 50베드의 PBS로 수지를 세척함으로써 신속하게 제거된다. 환원된 항체의 재산화는 세척된 슬러리를 실온에서 인큐베이션함(촉진제로서 50~2000 nM의 CuCl2가 첨가되거나 첨가되지 않음)으로써 달성된다. 황산구리의 사용을 제외하고, 본원의 예는 결과가 유사한 본원에 기재된 각각의 프로토콜을 사용한다. 재산화는 쇄내 이황화물을 복원하는 반면, 투석, 탈염, 또는 단백질 A 크로마토그래피는 환원제뿐만 아니라 항체의 조작된 시스테인에 처음에 연결된 시스테인 및 글루타티온을 제거한다. 재산화 공정을 모니터링하기 위해 일반적으로 HPLC 역상 크로마토그래피를 사용한다: 80℃로 가열된 PLRP-S 컬럼(4000 Å, 50 mm x 2.1 mm, Agilent)에 항체를 로딩하고, 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30~45% CH3CN의 선형 구배 및 215, 254, 및 280 nm에서의 피크 검출을 사용하여 1.5 mL/분으로 용리시킨다.
재산화 후, 항체를 링커-약물 화합물, 예를 들어 화학식 (B), 화학식 (B-1), 화학식 (B-2), 또는 화학식 (B-3)의 화합물에 접합시킨다(반응식 1 내지 4 참조). 예를 들어, 화학식 (B), 화학식 (B-1), 화학식 (B-2), 또는 화학식 (B-3)의 화합물을 PBS 버퍼(pH 7.2) 중 항체에 대해 5~10 몰 당량으로 재산화 Cys 돌연변이 항체에 첨가한다. 인큐베이션은 1~2시간 동안 수행된다. 접합 공정은 접합된 항체를 접합되지 않은 항체와 분리할 수 있는 역상 HPLC로 모니터링된다. 80℃로 가열된 PRLP-S 컬럼(4000 Å, 50 mm x 2.1 mm, Agilent)에서 접합 반응 혼합물을 분석하고, 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30~60% 아세토니트릴의 선형 구배에 의해 1.5 mL/분의 유량으로 컬럼의 용리를 수행한다. 컬럼으로부터의 단백질 용리는 280 nm, 254 nm, 및 215 nm에서 모니터링된다.
대안적으로, 단백질 A 수지에 결합된 항체의 경우, 항체가 재산화되면, 10 컬럼 부피의 PBS로 수지를 세척한 후, 동일 부피의 PBS에 수지를 재현탁시키고, (DMSO 중) 화학식 (B), 화학식 (B-1), 화학식 (B-2), 또는 화학식 (B-3)의 화합물을 8배 과량으로 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 수지를 50 컬럼 부피의 PBS로 세척하고, 생성된 항체 약물 접합체를 단백질 A 수지로부터 용리시키고, 1/10 부피의 1 M Tris pH 9.0으로 중화시키고, 버퍼를 적절한 버퍼로 교환하여 정제용 크기 배제 크로마토그래피(필요한 경우)를 수행한다.
면역접합체는 또한, 일반적으로 약물 대 항체 비(DAR)로 지칭되는, 항체 결합 모이어티에 대한 약물 모이어티의 평균 로딩 측면에서 특성화된다. DAR 값은 예를 들어, 환원 및 탈글리코실화된 샘플에 대한 LC-MS 데이터로부터 외삽된다. LC/MS는 ADC 내의 항체에 부착된 페이로드(약물 모이어티)의 평균 분자 수의 정량화를 가능하게 한다. HPLC는 항체를 경쇄와 중쇄로 분리하고, 또한 쇄당 링커-페이로드 기의 수에 따라 중쇄(HC)와 경쇄(LC)를 분리한다. 질량 스펙트럼 데이터는 혼합물의 성분 종, 예를 들어 LC, LC+1, LC+2, HC, HC+1, HC+2 등의 확인을 가능하게 한다. LC 및 HC 쇄의 평균 로딩으로부터, ADC에 대한 평균 DAR을 계산할 수 있다. 주어진 면역접합체 샘플에 대한 DAR은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 사량체 항체에 부착된 약물(페이로드) 분자의 평균 수를 나타낸다.
본 출원의 텍스트 전체에 걸쳐, 명세서의 텍스트와 서열 목록 사이에 차이가 존재할 경우, 명세서의 텍스트가 우선한다.
항-PMEL17 항체의 생성은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호의 실시예 2에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 항체는, 아미노산 또는 아미노산을 암호화하는 핵산이 돌연변이되었으나, 표 2에 기재된 서열에 대해 적어도 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 또는 약 95%의 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 2에 기재된 서열에 표시된 가변 영역과 비교할 때 가변 영역에 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5개의 아미노산이 돌연변이되었지만, 표 2에 열거된 항체와 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유한다.
이들 각각의 항체는 PMEL17에 결합할 수 있으므로, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열(아미노산 서열 및 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어, 본 발명의 다른 PMEL17-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭된" PMEL17-결합 항체는 당업계에 알려진 결합 분석(예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹선에 기재된 다른 분석)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 서열번호 10, 42, 64, 88, 112, 132, 149, 165, 184, 196, 215, 227, 239, 또는 254로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 21, 25, 29, 53, 75, 99, 119, 143, 159, 171, 190, 202, 221, 233, 248, 또는 260으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 단리된 단일클론 항체로서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열번호 12, 44, 66, 90, 114, 134, 151, 167, 186, 198, 217, 229, 241,256, 또는 315로 이루어진 군으로부터 선택된 포유류 발현 시스템의 세포내 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄; 및 서열번호 23, 27, 31, 55, 77, 101, 121, 145, 161, 173, 192, 204, 223, 235, 250, 또는 262로 이루어진 군으로부터 선택된 포유류의 세포내 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 단일클론 항체; 또는 (ii) 이의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 표 2에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 PMEL17-결합 항체를 제공한다. 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 1, 4, 5, 7, 33, 36, 37, 39, 57, 60, 79, 82, 83, 85, 103, 106, 107, 109, 123, 126, 127, 129, 175, 178, 179, 181, 206, 209, 210, 및 212에 제시되어 있다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 2, 6, 8, 34, 38, 40, 58, 61, 62, 80, 84, 86, 104, 108, 110, 124, 128, 130, 176, 180, 182, 207, 211, 및 213에 제시되어 있다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 3, 9, 35, 41, 59, 63, 81, 87, 105, 111, 125, 131, 147, 148, 163, 164, 177, 183, 194, 195, 208, 214, 225, 226, 237, 238, 252, 및 253에 제시되어 있다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 14, 17, 20, 46, 49, 52, 68, 71, 74, 92, 95, 98, 116, 136, 139, 142, 153, 156, 158, 243, 245, 및 247에 제시되어 있다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 15, 18, 47, 50, 69, 72, 93, 96, 137, 140, 및 154에 제시되어 있다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 16, 19, 48, 51, 70, 73, 94, 97, 117, 118, 138, 141, 155, 157, 169, 170188, 189, 200, 201, 219, 220, 231, 232, 244, 246, 258, 및 259에 제시되어 있다.
이들 각각의 항체가 PMEL17에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공됨을 고려하면, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다(즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있음). 이러한 "혼합 및 매칭된" PMEL17-결합 항체는 당업계에 알려진 결합 분석 및 실시예에 기재된 분석(예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 본 발명의 단일클론 항체에 대해 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 새로운 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1, 4, 5, 7, 33, 36, 37, 39, 57, 60, 79, 82, 83, 85, 103, 106, 107, 109, 123, 126, 127, 129, 175, 178, 179, 181, 206, 209, 210, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 2, 6, 8, 34, 38, 40, 58, 61, 62, 80, 84, 86, 104, 108, 110, 124, 128, 130, 176, 180, 182, 207, 211, 및 213으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 서열번호 3, 9, 35, 41, 59, 63, 81, 87, 105, 111, 125, 131, 147, 148, 163, 164, 177, 183, 194, 195, 208, 214, 225, 226, 237, 238, 252, 및 253로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 서열번호 14, 17, 20, 46, 49, 52, 68, 71, 74, 92, 95, 98, 116, 136, 139, 142, 153, 156, 158, 243, 245, 및 247로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 15, 18, 47, 50, 69, 72, 93, 96, 137, 140, 및 154로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16, 19, 48, 51, 70, 73, 94, 97, 117, 118, 138, 141, 155, 157, 169, 170, 188, 189, 200, 201, 219, 220, 231, 232, 244, 246, 258, 및 259로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 단리된 단일클론 항체로서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 1, 4, 5, 또는 7의 중쇄 CDR1; 서열번호 2, 6, 또는 8의 중쇄 CDR2; 서열번호 3 또는 9의 중쇄 CDR3; 서열번호 14, 17, 또는 20의 경쇄 CDR1; 서열번호 15 또는 18의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16 또는 19의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 33, 36, 37, 또는 39의 중쇄 CDR1; 서열번호 34, 38, 또는 40의 중쇄 CDR2; 서열번호 35 또는 41의 중쇄 CDR3; 서열번호 46, 49, 또는 52의 경쇄 CDR1; 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 48 또는 51의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 5, 7, 57, 또는 60의 중쇄 CDR1; 서열번호 58, 61, 또는 62의 중쇄 CDR2; 서열번호 59 또는 63의 중쇄 CDR3; 서열번호 68, 71, 또는 74의 경쇄 CDR1; 서열번호 69 또는 72의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 70 또는 73의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 79, 82, 83, 또는 85의 중쇄 CDR1; 서열번호 80, 84, 또는 86의 중쇄 CDR2; 서열번호 81 또는 87의 중쇄 CDR3; 서열번호 92, 95, 또는 98의 경쇄 CDR1; 서열번호 93 또는 96의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 94 또는 97의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 103, 106, 107, 또는 109의 중쇄 CDR1; 서열번호 104, 108, 또는 110의 중쇄 CDR2; 서열번호 105 또는 111의 중쇄 CDR3; 서열번호 49, 52, 또는 116의 경쇄 CDR1; 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 117 또는 118의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 123, 126, 127, 또는 129의 중쇄 CDR1; 서열번호 124, 128, 또는 130의 중쇄 CDR2; 서열번호 125 또는 131의 중쇄 CDR3; 서열번호 136, 139, 또는 142의 경쇄 CDR1; 서열번호 137 또는 140의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 138 또는 141의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 123, 126, 127, 또는 129의 중쇄 CDR1; 서열번호 124, 128, 또는 130의 중쇄 CDR2; 서열번호 147 또는 148의 중쇄 CDR3; 서열번호 153, 156, 또는 158의 경쇄 CDR1; 서열번호 50 또는 154의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 155 또는 157의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 103, 106, 107, 또는 109의 중쇄 CDR1; 서열번호 104, 108, 또는 110의 중쇄 CDR2; 서열번호 163 또는 164의 중쇄 CDR3; 서열번호 49, 52, 또는 116의 경쇄 CDR1; 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 169 또는 170의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 175, 178, 179, 또는 181의 중쇄 CDR1; 서열번호 176, 180, 또는 182의 중쇄 CDR2; 서열번호 177 또는 183의 중쇄 CDR3; 서열번호 49, 52, 또는 116의 경쇄 CDR1; 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 188 또는 189의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 103, 106, 107, 또는 109의 중쇄 CDR1; 서열번호 104, 108, 또는 110의 중쇄 CDR2; 서열번호 194 또는 195의 중쇄 CDR3; 서열번호 49, 52, 또는 116의 경쇄 CDR1; 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 200 또는 201의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 206, 209, 210, 또는 212의 중쇄 CDR1; 서열번호 207, 211, 또는 213의 중쇄 CDR2; 서열번호 208 또는 214의 중쇄 CDR3; 서열번호 153, 156, 또는 158의 경쇄 CDR1; 서열번호 50 또는 154의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 219 또는 220의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 206, 209, 210, 또는 212의 중쇄 CDR1; 서열번호 207, 211, 또는 213의 중쇄 CDR2; 서열번호 225 또는 226의 중쇄 CDR3; 서열번호 136, 139, 또는 142의 경쇄 CDR1; 서열번호 137 또는 140의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 231 또는 232의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 206, 209, 210, 또는 212의 HCDR1, 서열번호 207, 211, 또는 213의 HCDR2, 및 서열번호 237 또는 238의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 243, 245, 또는 247의 LCDR1, 서열번호 47 또는 50의 LCDR2, 및 서열번호 244 또는 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 206, 209, 210, 또는 212의 HCDR1, 서열번호 207, 211, 또는 213의 HCDR2, 및 서열번호 252 또는 253의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 153, 156, 또는 158의 LCDR1, 서열번호 50 또는 154의 LCDR2, 및 서열번호 258 또는 259의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 33의 중쇄 CDR1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
서열번호 36의 중쇄 CDR1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 39의 중쇄 CDR1, 서열번호 40의 중쇄 CDR2, 서열번호 41의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
a) 서열번호 57의 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 69의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
b) 서열번호 60의 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 69의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 61의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 73의 경쇄 CDR3; 또는
d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 74의 경쇄 CDR1, 서열번호 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 79의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 92의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
서열번호 82의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 92의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
서열번호 83의 중쇄 CDR1, 서열번호 84의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 95의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 97의 경쇄 CDR3;
서열번호 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 98의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 118의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 111의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 123의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
서열번호 126의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
서열번호 127의 중쇄 CDR1, 서열번호 128의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 139의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 141의 경쇄 CDR3;
서열번호 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 131의 중쇄 CDR3, 서열번호 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 123의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
서열번호 126의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
서열번호 127의 중쇄 CDR1, 서열번호 128의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 156의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 157의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 148의 중쇄 CDR3, 서열번호 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 170의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 164의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 175의 중쇄 CDR1, 서열번호 176의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
서열번호 178의 중쇄 CDR1, 서열번호 176의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
서열번호 179의 중쇄 CDR1, 서열번호 180의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 189의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 181의 중쇄 CDR1, 서열번호 182의 중쇄 CDR2, 서열번호 183의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 201의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 195의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 206의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
서열번호 209의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
서열번호 210의 중쇄 CDR1, 서열번호 211의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 156의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 220의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 214의 중쇄 CDR3, 서열번호 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 206의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
서열번호 209의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
서열번호 210의 중쇄 CDR1, 서열번호 211의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 139의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 232의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 226의 중쇄 CDR3, 서열번호 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 206의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243의 LCDR1, 서열번호 47의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열번호 209의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243의 LCDR1, 서열번호 47의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 245의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열번호 212의 HCDR1, 서열번호 213의 HCDR2, 및 서열번호 238의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 247의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 다음으로부터 선택된 CDR 서열을 포함한다:
서열번호 206의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153의 LCDR1, 서열번호 154의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열번호 209의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153의 LCDR1, 서열번호 154의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 156의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 259의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열번호 212의 HCDR1, 서열번호 213의 HCDR2, 및 서열번호 253의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 158의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 233의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 204의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체는 표 2에 기재된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)이다.
일부 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 IgG1/λ 이소형 서브클래스에 속한다. N-글리코실화 부위는 항체 또는 단편의 중쇄의 Asn306에 위치한다. 일부 구현예에서, PMEL17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 중쇄의 Asn306에 위치한 N-글리코실화 부위를 포함한다. 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)의 두 중쇄는 모두 Asn306에서 단백질 백본에 연결된 올리고당 쇄를 포함한다.
1. 에피토프 및 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 확인
본 발명은 또한, 표 2에 기재된 항-PMEL17 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하거나, 표 2에 기재된 항체와 교차경쟁하는 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공한다. 따라서, 예를 들어 BIACORE 또는 당업자에게 알려진 결합 측정 분석을 통해 PMEL17 결합 분석에서 본 발명의 다른 항체와 교차경쟁(예를 들어, 통계적으로 유의미한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제)하는 능력에 기초하여 추가의 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)이 확인될 수 있다. PMEL17(예를 들어, 인간 PMEL17)에 대한 본 발명의 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 PMEL17에 대한 결합에 대해 해당 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)과 경쟁할 수 있음을 보여주며; 이러한 항체는 비제한적인 이론에 따라, 경쟁 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)과 동일한 또는 관련된(예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 인접하거나 중첩되는) PMEL17 단백질 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 표 2에 기재된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)과 동일한 PMEL17 상의 에피토프에 결합하는 항체는 인간 또는 인간화 단일클론 항체이다. 이러한 인간 또는 인간화 단일클론 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
2. Fc 영역의 프레임워크의 추가 변경
본 발명의 면역접합체는, 예를 들어 항체의 특성을 향상시키기 위해 VH 및/또는 VL 내에 프레임워크 잔기에 대한 변형을 추가로 포함하는 변형된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키도록 이루어진다. 예를 들어, 한 가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식세포계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 유래된 생식세포계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을, 항체가 유래된 생식세포계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 이들의 생식세포계열 배열로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생식세포계열 서열로 "역돌연변이"될 수 있다. 이러한 "역돌연변이" 항체도 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이 접근법은 "탈면역화"라고도 하며, 미국 출원 공개 2003/0153043호에 더 상세히 기술되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에 이루어진 변형에 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 일반적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포독성(ADCC)을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 항체의 글리코실화를 변경하고 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 이러한 구현예 각각을 이하 더 상세히 설명한다.
일부 구현예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경(예를 들어 증가 또는 감소)되도록 변형된다. 이 접근법은 미국 특허 5,677,425호에 추가로 기술되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항체 단편은 약물 모이어티에 대한 접합 부위로서, 변형되거나 조작된 아미노산 잔기, 예를 들어 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다(Junutula JR, et al., Nat Biotechnol 2008, 26:925-932). 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 위치에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하는 변형된 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 시스테인 치환 부위는 항체 또는 항체 단편의 불변 영역에 존재하므로, 다양한 항체 또는 항체 단편에 적용될 수 있고, 이들 부위는 안정적이고 균질한 접합체를 제공하도록 선택된다. 변형된 항체 또는 단편은 1개, 2개 이상의 시스테인 치환을 가질 수 있고, 이들 치환은 본원에 기재된 바와 같은 다른 변형 및 접합 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 시스테인을 항체의 특정 위치에 삽입하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Lyons et al., (1990) Protein Eng., 3:703-708, WO 2011/005481, WO2014/124316, WO 2015/138615] 참조). 특정 구현예에서, 변형된 항체는 항체의 중쇄의 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 191, 195, 197, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400, 및 422번 위치로부터 선택된 불변 영역에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 일부 구현예에서, 변형된 항체 또는 항체 단편은 항체 또는 항체 단편의 경쇄의 107, 108, 109, 114, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 197, 199, 및 203번 위치로부터 선택된 불변 영역에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨), 경쇄는 인간 카파 경쇄이다. 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 불변 영역에 2개 이상의 아미노산의 시스테인 치환의 조합을 포함하며, 이 조합은 항체 중쇄의 375번 위치, 항체 중쇄의 152번 위치, 항체 중쇄의 360번 위치, 또는 항체 경쇄의 107번 위치에서의 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 불변 영역에 하나의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며, 치환은 항체 중쇄의 375번 위치, 항체 중쇄의 152번 위치, 항체 중쇄의 360번 위치, 항체 경쇄의 107번 위치, 항체 경쇄의 165번 위치, 또는 항체 경쇄의 159번 위치이고(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨), 경쇄는 인간 카파쇄이다. 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 불변 영역에 2개의 아미노산의 시스테인 치환의 조합을 포함하며, 이 조합은 항체 중쇄의 375번 위치 및 항체 중쇄의 152번 위치에서의 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 항체 중쇄의 360번 위치에 하나의 아미노산의 시스테인 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 다른 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 항체 경쇄의 107번 위치에 하나의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨), 경쇄는 카파쇄이다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 면역접합체에 유용한 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 변형되거나 조작된 항체, 예컨대 천연 서열의 적어도 하나의 아미노산 대신, Pcl, 피롤리신, 펩티드 태그(예컨대, S6, A1, 및 ybbR 태그), 및 비천연 아미노산을 비롯한 하나 이상의 (시스테인 이외의) 다른 반응성 아미노산을 도입하도록 변형된 항체를 포함하므로, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 대한 접합을 위한 항체 또는 항원 결합 단편 상의 반응 부위에 상보적 반응성을 제공한다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편은 약물에 대한 접합 부위로서 Pcl 또는 피롤리신(문헌[W. Ou, et al., (2011) PNAS 108 (26), 10437-10442; WO 2014/124258]) 또는 비천연 아미노산(문헌[J.Y. Axup, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (2012), pp. 16101-16106]; 검토를 위해 문헌[C.C. Liu and P.G. Schultz (2010) Annu Rev Biochem 79, 413-444; C.H. Kim, et al., (2013) Curr Opin Chem Biol. 17, 412-419] 참조)을 포함하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 효소 접합 방법을 위한 펩티드 태그가 항체에 도입될 수 있다(Strop P., et al., Chem Biol. 2013, 20(2):161-7; Rabuka D., Curr Opin Chem Biol. 2010 Dec;14(6):790-6; Rabuka D, et al., Nat Protoc. 2012, 7(6):1052-67). 또 다른 예는 조효소 A 유사체의 접합을 위한 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)의 사용이다(WO 2013/184514 및 문헌[Gruenewald et al., (2015) Bioconjugate Chem. 26 (12), 2554-62]). 이러한 변형되거나 조작된 항체를 페이로드 또는 링커-페이로드 조합과 접합시키는 방법은 당업계에 알려져 있다.
다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코커스 단백질 A(SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역 내로 도입된다. 이 접근법은 미국 특허 6,165,745호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 구현예에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경하기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모항체의 항원-결합 능력을 유지하도록 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성요소일 수 있다. 이 접근법은 예를 들어 미국 특허 5,624,821호 및 5,648,260호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 C1q 결합의 변경 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)의 감소 또는 소멸을 나타내도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이 접근법은 예를 들어 미국 특허 6,194,551호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경됨으로서, 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이 접근법은 예를 들어 PCT 공개 WO 94/29351에 기술되어 있다. 동종이형 아미노산 잔기는 IgG1, IgG2, 및 IgG3 서브클래스의 중쇄의 불변 영역뿐만 아니라 문헌[Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)]에 기재된 바와 같은 카파 이소형의 경쇄의 불변 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이러한 돌연변이를 포함하는 항체 융합 단백질 복합체는 감소된 항체-의존적 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 매개하거나, ADCC 또는 CDC를 매개하지 않는다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 L234 및 L235는 A234 및 A235로 치환된다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 N267은 A267로 치환된다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 D265 및 P329는 A265 및 A329로 치환된다. 다른 항체 Fc 침묵 돌연변이가 사용될 수도 있다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경됨으로서, 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이 접근법은 예를 들어 Bodmer 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 아미노산은 하나 이상의 동종이형 아미노산 잔기로 대체된다. 동종이형 아미노산 잔기는 또한, IgG1, IgG2, 및 IgG3 서브클래스의 중쇄의 불변 영역뿐만 아니라 문헌[Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)]에 기재된 바와 같은 카파 이소형의 경쇄의 불변 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화 항체(즉, 글리코실화가 결여된 항체)가 제조될 수 있다. 글리코실화는 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 미국 특허 5,714,350호 및 6,350,861호에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 항체는 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 6,277,375호에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 5,869,046호 및 6,121,022호에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취한 회수 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
3. 항-PMEL17 항체의 생성
항-PMEL17 항체 및 이의 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 재조합 발현, 화학적 합성, 및 항체 사량체의 효소적 분해를 비롯한(이에 한정되지 않음) 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 생성될 수 있는 반면, 전장 단일클론 항체는 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생성에 의해 얻을 수 있다. 재조합 발현은 당업계에 알려진 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등에서 일어날 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 분절을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11, 43, 65, 89, 113, 133, 150, 166, 185, 197, 216, 228, 240, 및 255로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22, 26, 30, 54, 76, 100, 120, 144, 160, 172, 191, 203, 222, 234, 249, 및 261로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13, 45, 67, 91, 115, 135, 152, 168, 187, 199, 218, 230, 242, 257, 319, 및 320의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24, 28, 32, 56, 78, 102, 122, 146, 162, 174, 193, 205, 224, 236, 251, 및 263의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항-PMEL17 항체의 가변 영역 서열만을 암호화할 수 있다. 이들은 또한 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 모두를 암호화할 수 있다. 일부 폴리뉴클레오티드 서열은 예시된 마우스 항-PMEL17 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 마우스 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 각각 실질적으로 동일한 2개의 폴리펩티드 분절을 암호화한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 드노보(de novo) 고상 DNA 합성에 의해, 또는 항-PMEL17 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 기존의 서열(예를 들어, 아래 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 핵산의 직접 화학 합성은 문헌[Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포아미다이트 방법; 및 미국 특허 4,458,066호의 고체 지지체 방법과 같은, 당업계에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR을 통해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은 예를 들어 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한, 상기 항-PMEL17 항체를 생성하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 발명에서 제공된다. 항-PMEL17 항체 쇄 또는 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터 및 비바이러스 발현 벡터 둘 모두를 사용하여 포유류 숙주 세포에서 항체를 생성할 수 있다. 비바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터(일반적으로는, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 포함), 및 인간 인공 염색체를 포함한다(예를 들어, 문헌[Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조). 예를 들어, 포유류(예를 들어, 인간) 세포에서의 항-PMEL17 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNATM3.1/His, pEBVHis A, B & C(Invitrogen, San Diego, CA), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현을 위한 당업계에 알려진 여러 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 기반 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스, 백시니아 바이러스 벡터, 및 셈리키 포레스트 바이러스(SFV; Semliki Forest virus) 기반 벡터를 포함한다. 상기 Brent 등의 문헌; 문헌[Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995]; 및 문헌[Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992] 참조.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현될 의도된 숙주 세포에 따라 다르다. 일반적으로, 발현 벡터는 항-PMEL17 항체 쇄 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도 조건인 경우를 제외하고는, 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 유도성 프로모터가 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터, 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은 발현 산물이 숙주 세포에 의해 더 잘 허용되는 암호화 서열에 대한 집단의 편향 없이 비유도 조건하에 증식될 수 있다. 프로모터 외에도, 항-PMEL17 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현을 위한 다른 조절 요소가 또한 필요하거나 요구될 수 있다. 이러한 요소는 일반적으로 ATG 개시 코돈 및 인접 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 또한, 사용되는 세포 시스템에 적합한 인핸서를 포함함으로써 발현 효율이 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, 포유류 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서를 사용할 수 있다.
발현 벡터는 삽입된 항-PMEL17 항체 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하기 위해 분비 신호 서열 위치를 또한 제공할 수 있다. 삽입된 항-PMEL17 항체 서열은 벡터에 포함되기 전에 신호 서열에 연결되는 경우가 더 많다. 항-PMEL17 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 수용하는 데 사용되는 벡터는 때때로 불변 영역 또는 그 일부를 또한 암호화한다. 이러한 벡터는 가변 영역을 불변 영역과의 융합 단백질로서 발현되도록 하여 온전한 항체 또는 이의 단편의 생성을 유도한다. 일반적으로, 이러한 불변 영역은 인간 불변 영역이다.
항-PMEL17 항체 쇄를 보유 및 발현하기 위한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. E. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현하는 데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스, 및 다른 엔테로박테리아세애, 예컨대 살모네라, 세라티아, 및 다양한 슈도모나스 종을 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 숙주 세포와 공존할 수 있는 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 기점)을 일반적으로 포함하는 발현 벡터를 제조하는 것도 가능하다. 또한, 많은 다양한 잘 알려진 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열과 함께, 일반적으로 발현을 제어하며, 전사 및 번역의 개시 및 완료를 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 항-PMEL17 폴리펩티드를 발현시키기 위해 효모와 같은 다른 미생물이 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합하여 곤충 세포가 사용될 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PMEL17 폴리펩티드를 발현시키고 생성하기 위해 포유류 숙주 세포가 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주(예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 골수종 하이브리도마 클론), 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유류 세포주(예를 들어, 아래에 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸성 또는 정상적 또는 비정상적인 불멸성 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마를 포함하여, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되어 왔다. 폴리펩티드를 발현시키기 위해 포유류 조직 세포 배양을 사용하는 것은 예를 들어 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 개괄적으로 논의되어 있다. 포유류 숙주 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서(예를 들어, 문헌[Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 일반적으로 포유류 유전자로부터 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 항시적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정가능 또는 조절가능한 프로모터일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 항시성 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 항시성 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 극초기 CMV 프로모터), 항시성 CMV 프로모터, 및 당업계에 알려진 프로모터-인핸서 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵생물 세포의 경우 염화칼슘 형질감염이 통상적으로 사용되는 반면, 다른 세포 숙주의 경우 인산칼슘 처리 또는 전기천공이 사용될 수 있다(개괄적으로, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed.] 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 발리스틱(ballistic) 방법, 비로좀, 면역리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합(문헌[Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997]), 제제-강화 DNA 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질을 장기간 고수율로 생성하기 위해서는 안정적인 발현이 필요한 경우가 많다. 예를 들어, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선별마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 항-PMEL17 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주가 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후, 선별 배지로 전환하기 전에 세포를 강화 배지에서 1~2일 동안 성장시킬 수 있다. 선별마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것이며, 선별마커의 존재는 선별 배지에서 도입 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장을 가능하게 한다. 안정적으로 형질감염된 내성 세포는 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
항-PMEL 항체 약물 접합체의 생성을 위한 공정은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호의 실시예 4에 기술되어 있다. 예시적 ADC의 PK 특성은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호의 실시예 18에 기술되어 있다. 버퍼, 마우스, 래트, 및 인간 혈장에서의 항-PMEL17-GNAQ/11i ADC의 시험관내 안정성, 및 마우스에서의 항-PMEL17-GNAQ/11i ADC의 생체내 안정성은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호에 기술되어 있다.
치료적 용도
본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형은 고형암 또는 헴 악성종양과 같은 암의 치료 또는 예방을 포함하는(이에 한정되지 않음) 다양한 용도에 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형은 종양 성장 억제, 분화 유도, 종양 부피 감소, 및/또는 종양의 종양원성 감소에 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 방법일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 환자에게 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 환자의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 환자의 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형을 제공한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 환자의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 용도를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형으로 치료되는 질환은 암이다. 특정 구현예에서, 암은 본 발명의 항체 약물 접합체가 결합하는 PMEL17 발현 세포를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 암은 건강한 환자에 비해 PMEL17의 발현 증가를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, PMEL17의 발현은 PMEL17 RNA의 증가에 의해 측정될 수 있다. 다른 구현예에서, 암은 PMEL17의 DNA 복제 수의 증가를 특징으로 한다. PMEL17 발현 수준을 측정하거나 결정하는 다른 방법은 당업자에게 알려져 있다. 특정 구현예에서, 암은 돌연변이, 예를 들어 GNAQ 및/또는 GNA11 유전자에서 Q209 또는 R183에 영향을 미치는 활성화 돌연변이를 특징으로 한다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 질환의 예는 암종(예를 들어, 간세포 암종), 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 점막 흑색종), 또는 이의 전이암을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질환은 흑색종이다. 일부 구현예에서, 흑색종은 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하는 비포도막 흑색종이다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, GNAQ/11 돌연변이가 있는 비포도막 흑색종은 다른 돌연변이(예를 들어, BRAF, NRAS)가 있는 흑색종보다 포도막 흑색종과 생물학적으로 더 관련이 있을 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 흑색종은 BRAF 돌연변이, NRAS 돌연변이, 또는 둘 모두를 갖고 있지 않다. 일부 구현예에서, 흑색종은 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하는 점막 흑색종이다.
본 발명은 암의 치료 또는 예방 방법으로서, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 암은 암종, 간세포 암종, 육종, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 점막 흑색종, 또는 이의 전이암과 같은 고형암이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 암은 내성 암 및/또는 재발성 암이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 종양 성장 억제 방법으로서, 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 종양은 암종, 간세포 암종, 육종, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 점막 흑색종, 또는 이의 전이암과 같은 고형암의 종양이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 종양이 있거나 종양이 제거되었다.
특정 구현예에서, 종양은 항체 약물 접합체가 결합하는 PMEL17을 발현한다. 특정 구현예에서, 종양은 인간 PMEL17을 과발현한다. 특정 구현예에서, 종양은 PMEL17 유전자의 증가된 복제 수를 갖는다. 특정 구현예에서, 종양은 돌연변이, 예를 들어 GNAQ 및/또는 GNA11 유전자에서 Q209 또는 R183에 영향을 미치는 활성화 돌연변이를 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형으로 치료하기 위한 환자를 선택하는 방법으로서, 상기 항체 약물 접합체 또는 제형의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 PMEL17의 발현을 측정함으로써 환자를 선택하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 돌연변이, 예를 들어 GNAQ 또는 GNA11 유전자에서 Q209 또는 R183에 영향을 미치는 활성화 돌연변이를 식별함으로써 환자를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 환자의 PMEL17 발현 수준을 측정하는 단계뿐만 아니라 GNAQ 및/또는 GNA11 유전자를 검출하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 방법의 대상체 또는 환자는 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 투여 전에, 이중특이적 gp100 펩티드-HLA-지정 CD3 T 세포 관여자, 예를 들어 테벤타푸스프로 치료받은 적이 있다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 방법의 대상체 또는 환자는 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 투여 전에, 이중특이적 gp100 펩티드-HLA-지정 CD3 T 세포 관여자, 예를 들어 테벤타푸스프로 치료받은 적이 없다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 방법의 대상체 또는 환자는 포도막 흑색종(예를 들어, 전이성 포도막 흑색종)을 앓고 있으며, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 투여 전에, 이중특이적 gp100 펩티드-HLA-지정 CD3 T 세포 관여자, 예를 들어 테벤타푸스프로 치료받은 적이 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 방법의 대상체 또는 환자는 포도막 흑색종(예를 들어, 전이성 포도막 흑색종)을 앓고 있으며, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 투여 전에, 이중특이적 gp100 펩티드-HLA-지정 CD3 T 세포 관여자, 예를 들어 테벤타푸스프로 치료받은 적이 없다. 이론에 구애됨이 없이, 일부 구현예에서, 특정 테벤타푸스프-치료 환자는 PMEL17 발현이 최대 50% 감소할 수 있는 것으로 여겨진다.
질환의 치료 또는 예방을 위해, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형의 적절한 투여량은 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 이전 요법, 환자의 임상 기록 등과 같은 다양한 요인에 따라 다르다. 항체 약물 접합체 또는 제형은 1회 투여되거나, 수일에서 수개월까지 지속되는 일련의 치료에 걸쳐 투여되거나, 또는 완치가 이루어지거나 질병 상태의 완화(예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투약 스케줄은 환자의 신체 내 약물 축적 측정으로부터 계산될 수 있으며, 항체 약물 접합체 또는 제형의 상대적 효능에 따라 달라질 것이다. 치료 의사는 체액 또는 조직에서 측정된 약물의 체류 시간 및 농도에 기초하여 투약 반복률을 추정할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 대상체 또는 환자의 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법에 사용될 수 있는 예시적인 바이오마커는 전멜라닌소체 단백질 17(PMEL17), 인산화 ERK(pERK), 분화 클러스터 8(CD8), 예정사-리간드 1(PD-L1), 이중 특이성 포스파타제 6(DUSP6), Ras 구아닐-방출 단백질 3(RASGRP3), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 샘플은 종양 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 종양에 인접한 조직으로부터의 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 체액 샘플, 예를 들어 혈액, 척수액 등이다. 일부 구현예에서, 샘플은 무세포 DNA(cfDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 기준으로 사용되는 비질환 조직이다.
일부 구현예에서, 바이오마커는 당업계에 알려진 방법에 의해 측정된다. 예를 들어, 바이오마커의 발현은 피험자 또는 환자의 조직 또는 체액 샘플로부터의 핵산 샘플을 정량화하여 측정 및/또는 모니터링될 수 있다. 일반적인 정량화 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 실시간 PCR, 서던 블로팅, 노던 블로팅, 인시튜 혼성화, DNA 시퀀싱, 및/또는 전체 전사체 분석을 포함한다. 다른 예에서, 바이오마커의 발현은 웨스턴블로팅, 효소결합 면역흡착 분석(ELISA), 및/또는 질량분석법과 같은 기술을 통해 하나 이상의 바이오마커의 단백질 수준을 측정함으로써 측정 및/또는 모니터링될 수 있다.
본원에 기재된 GNAQ/11 억제제 및 본원에 기재된 항체 약물 접합체의 시험관내 및 생체내 항암 활성은 또한, 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호의 실시예에 기술되어 있다.
암을 치료 또는 진단하는 방법
특정 예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형은 암 치료 방법에 사용된다.
일 양태에서, 본 발명은 암성 종양의 성장이 억제 또는 감소되도록, 본원에 기재된 ADC, 또는 본원에 기재된 ADC를 포함하는 제형을 사용하는 생체내 대상체 치료에 관한 것이다.
특정 구현예에서, ADC 또는 제형은 본원에 개시된 투약 요법에 따라 투여되거나 사용된다. 특정 구현예에서, ADC 또는 제형은 암 또는 이의 증상을 치료하는 데 효과적인 양으로 투여된다.
본원에 기재된 ADC 또는 제형은 암성 종양의 성장을 억제하기 위해 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 ADC 또는 제형은 본원에 기재된 바와 같은 제2 치료제 또는 요법과 조합하여 사용될 수 있다. ADC 또는 제형과 제2 치료제 또는 요법은 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 대상체의 종양 세포 성장을 억제하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 ADC 또는 제형의 치료 유효량을, 예를 들어 본원에 기재된 투약 요법에 따라, 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, ADC는 본원에 기재된 제형의 형태로 투여된다.
다른 양태에서, 대상체를 치료하는 방법, 예를 들어 대상체에서 과다증식성 병태 또는 장애(예를 들어, 암 또는 이의 전이성 병변)를 감소시키거나 완화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 ADC, 또는 본원에 기재된 ADC를 포함하는 제형을 본원에 개시된 투약 요법에 따라 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 암은 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, 흑색종은 PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함한다. 예시적인 암은 고형 종양, 혈액암, 연조직 종양, 및 전이성 병변을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 암은 흑색종이다. 특정 구현예에서, 흑색종은 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 점막 흑색종이다. 특정 구현예에서, 암은 암종, 육종, 백혈병, 또는 림프종이다. 일 구현예에서, 암종은 간세포 암종이다. 특정 구현예에서, 암은 안암 또는 안구 신생물이다. 일부 구현예에서, 암은 MSI가 높은 암이다. 일부 구현예에서, 암은 전이성 암이다. 다른 구현예에서, 암은 진행성 암이다. 다른 구현예에서, 암은 재발성 또는 불응성 암이다.
본원에 개시된 방법, ADC, 조성물, 및 제형은 상기 언급된 암과 관련된 전이성 병변을 치료하는 데 유용하다.
일부 구현예에서, ADC는 1 mg/kg 내지 20 mg/kg(예를 들어, 1 mg/kg 내지 16 mg/kg 또는 2 mg/kg 내지 15 mg/kg)의 용량으로, 예를 들어 2주에 1회, 또는 4주에 1회, 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, ADC는 1 mg/kg, 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 12 mg/kg, 또는 16 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 2주에 1회, 또는 4주에 1회, 정맥내로 투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 있다. 일 구현예에서, 대상체는 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 없다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체의 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 방법은 본원에 기재된 ADC 또는 제형을 포함하는 암 치료의 평가(예를 들어, 모니터링), 본원에 기재된 질환(예를 들어, 본원에 기재된 질환의 진행)의 평가(예를 들어, 모니터링), 암이 있는 대상체에 대한 본원에 기재된 ADC 또는 제형을 포함하는 치료의 선택, 및/또는 본원에 기재된 ADC 또는 제형을 포함하는 암 치료를 위한 대상체의 선택에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현의 측정에 기초하여, 치료를 개시하거나, 계속하거나, 중단할 수 있다.
예시적인 바이오마커는 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 샘플은 종양 샘플, 종양 인접 조직, 체액(예를 들어, 혈액, 혈청, 척수액, 또는 소변)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 샘플은 무세포 DNA(cfDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 기준으로 사용되는 비질환 조직이다. 바이오마커는 당업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어 샘플 내 핵산 및/또는 단백질 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다.
병용 요법
특정 예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형은 다른 치료법, 예컨대 수술 및 방사선 요법, 치료제, 예컨대 다른 항암제, 항알레르기제, 항오심제(또는 항구토제), 진통제, 세포보호제, 및 이들의 조합과 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형은 항암 특성을 갖는 제2 화합물과 약학적 조합 제형으로, 또는 병용 요법으로서의 투약 요법으로 조합된다. 약학적 조합 제형 또는 투약 요법의 제2 화합물은 서로 부정적으로 영향을 미치지 않도록 이 조합의 항체 또는 면역접합체에 대해 상보적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형은 화학요법제, 면역조절제, 티로신 키나제 억제제, GNAQ/GNA11 하류 신호전달 경로 억제제, IAP 억제제, Bcl2 억제제, Mcl1 억제제, 및 기타 GNAQ/GNA11 억제제와 조합하여(이에 한정되지 않음) 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적 조합"은 하나의 투약 단위 형태의 고정 조합을 지칭하거나, 또는 두 가지 이상의 치료제가 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에서 개별적으로 투여될 수 있고, 특히 이러한 시간 간격을 통해 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 시너지 효과를 나타낼 수 있는 병용 투여를 위한 비고정 조합 또는 부품 키트를 지칭한다.
용어 "병용 요법"은 본 발명에 기술된 치료적 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 두 가지 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 이러한 투여는 이들 치료제를 실질적으로 동시적인 방식으로, 예컨대 고정된 비의 활성 성분들을 갖는 단일 캡슐로 공동 투여하는 것을 포함한다. 대안적으로, 이러한 투여는 각각의 활성 성분에 대해 다중 또는 개별 용기(예를 들어, 캡슐, 분말, 및 액체)로 공동 투여하는 것을 포함한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 목적하는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 또한, 이러한 투여는 거의 동시에 또는 서로 다른 시점에 각 유형의 치료제를 순차적으로 사용하는 것도 포함한다. 어느 경우든, 치료 요법은 본원에 기재된 병태 또는 장애의 치료 또는 예방에 있어서 약물 조합의 이로운 효과를 제공할 것이다.
병용 요법은 "시너지 효과"를 제공할 수 있고 "시너지적"임을 입증할 수 있다. 즉, 활성 성분들이 함께 사용될 때 달성되는 효과가 화합물을 개별적으로 사용함으로써 발생하는 효과의 합보다 크다. 시너지 효과는 활성 성분이 (1) 공동 제형화되어 조합된 단위 투약 제형으로 동시에 투여되거나 전달될 때; (2) 개별 제형으로서 교대로 또는 병행하여 전달될 때; 또는 (3) 일부 다른 요법에 의해 전달될 때, 얻을 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우, 시너지 효과는 화합물이 순차적으로, 예를 들어 개별 주사기로 서로 달리 주사하여 투여되거나 전달될 때 얻을 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는, 각각의 활성 성분의 유효 투여량이 순차적으로, 즉 연속하여 투여되는 반면, 병용 요법에서는 두 가지 이상의 활성 성분의 유효 투여량이 함께 투여된다.
병용 요법에서의 사용을 위해 고려되는 일반적인 화학요법제는 아나스트로졸(Arimidex®), 비칼루타미드(Casodex®), 황산블레오마이신(Blenoxane®), 부설판(Myleran®), 부설판 주사(Busulfex®), 카페시타빈(Xeloda®), N4-펜톡시카보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카보플라틴(Paraplatin®), 카무스틴(BiCNU®), 클로람부실(Leukeran®), 시스플라틴(Platinol®), 클라드리빈(Leustatin®), 시클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 사이타라빈, 사이토신 아라비노시드(Cytosar-U®), 사이타라빈 리포솜 주사(DepoCyt®), 다카바진(DTIC-Dome®), 닥티노마이신(Actinomycin D, Cosmegan), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사(DaunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀(Taxotere®), 독소루비신 하이드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 에토포시드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 5-플루오로우라실(Adrucil®, Efudex®), 플루타미드(Eulexin®), 테자시티빈, 젬시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아(Hydrea®), 아이다루비신(Idamycin®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(Camptosar®), L-아스파라기나제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(Alkeran®), 6-머캅토퓨린(Purinethol®), 메토트렉세이트(Folex®), 미톡산트론(Novantrone®), 마일로타그, 파클리탁셀(Taxol®), 피닉스(Yttrium90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카무스틴 임플란트가 있는 폴리페프로산 20(Gliadel®), 타목시펜 시트레이트(Nolvadex®), 테니포시드(Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(Tirazone®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(Hycamptin®), 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Oncovin®), 비노렐빈(Navelbine®), 및 페메트렉시드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체를 하나 이상의 MDM2 억제제, PKC 억제제, PRC2 억제제, MAPK 억제제, GPCR 억제제, 티로신 키나제 억제제(BTK 억제제, EGFR 억제제, Her2 억제제, Her3 억제제, IGFR 억제제, 및 Met 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
예를 들어, MDM2 억제제는 RG7112(RO5045337); RG7388(RO5503781, 이다사누틀린); MI-77301(SAR405838); MK-8242(SCH-900242); AMG232; CGM097; DS3032b; HDM201; 및 ALRN-6924를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예를 들어,PKC 억제제는 발라놀; 리루졸; 스타우로스포린; 엔자스타우린; δV1-1(KAI-9803 또는 델카서팁); εV1-2(KAI-1678); 아프리노카르센; 미도스타우린(PKC412); UCN-01(7-하이드록시-스타우로스포린); 로틀레린(5, 7, 디하이드록시-2,2-디메틸-6-(2,4,6-트리하이드록시-3-메틸-5-아세틸벤질)-8-시나모일-1,2-크로멘); 및 브리오스타틴 1을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, PRC2 억제제는 EI1; EPZ011989; EPZ005687; 테트라메틸피페리디닐 벤즈아미드; UNC1999; 및 GSK126을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, MAPK 억제제는 베무라페닙(젤보라프); 다브라페닙(타핀라); 엔코라페닙(브라프토비); 트라메티닙(멕키니스트); 코비메티닙(코텔릭); 비니메티닙(Mektovi); 및 울릭서티닙을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 티로신 키나제 억제제는 이브루티닙(PCI-32765); 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®); 리니파닙(N-[4-(3-아미노-1H-인다졸-4-일)페닐]-N'-(2-플루오로-5-메틸페닐)우레아(ABT 869로도 알려짐, Genentech에서 입수가능); 수니티닙 말레이트(Sutent®); 보수티닙(4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[3-(4-메틸피페라진-1-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴(SKI-606으로도 알려져 있고, 미국 특허 6,780,996호에 기재되어 있음); 다사티닙(Sprycel®); 파조파닙(Votrient®); 소라페닙(Nexavar®); 작티마(ZD6474); 및 이마티닙 또는 이마티닙 메실레이트(Gilvec® 및 Gleevec®)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제는 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®), 제피티닙(Iressa®); N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3"S")-테트라하이드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4(디메틸아미노)-2-부텐아미드, Tovok®); 반데타닙(Caprelsa®); 라파티닙(Tykerb®); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); 카너티닙 디하이드로클로라이드(CI-1033); 6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(AEE788, CAS 497839-62-0); 무브리티닙(TAK165); 펠리티닙(EKB569); 아파티닙(BIBW2992); 네라티닙(HKI-272); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르(BMS599626); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸시클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8); 및 4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀(PKI166, CAS 187724-61-4)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
EGFR 항체는 세툭시맙(Erbitux®); 파니투무맙(Vectibix®); 마투주맙(EMD-72000); 니모투주맙(hR3); 잘루투무맙; TheraCIM h-R3; MDX0447(CAS 339151-96-1); 및 ch806(mAb-806, CAS 946414-09-1)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2 수용체)(Neu, ErbB-2, CD340, 또는 p185로도 알려짐) 억제제는 트라스투주맙(Herceptin®); 퍼투주맙(Omnitarg®); 트라스투주맙 엠탄신(Kadcyla®); 네라티닙(HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-클로로-4-[(피리딘-2-일)메톡시]페닐]아미노]-3-시아노-7-에톡시퀴놀린-6-일]-4-(디메틸아미노)부트-2-엔아미드, PCT 공개 WO 05/028443호에 기재되어 있음); 라파티닙 또는 라파티닙 디토실레이트(Tykerb®); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); (2E)-N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3S)-테트라하이드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드(BIBW-2992, CAS 850140-72-6); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르(BMS 599626, CAS 714971-09-2); 카너티닙 디하이드로클로라이드(PD183805 또는 CI-1033); 및 N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸시클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Her3 억제제는 LJM716, MM-121, AMG-888, RG7116, REGN-1400, AV-203, MP-RM-1, MM-111, 및 MEHD-7945A를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
MET 억제제는 카보자니티닙(XL184, CAS 849217-68-1); 포레티닙(GSK1363089, 이전 명칭 XL880, CAS 849217-64-7); 티반티닙(ARQ197, CAS 1000873-98-2); 1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-N-(5-(7-메톡시퀴놀린-4-일옥시)피리딘-2-일)-5-메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디하이드로-1H-피라졸-4-카복사미드(AMG 458); 크리조티닙(Xalkori®, PF-02341066); (3Z)-5-(2,3-디하이드로-1H-인돌-1-일설포닐)-3-({3,5-디메틸-4-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일}메틸렌)-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(SU11271); (3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-({3,5-디메틸-4-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일}메틸렌)-N-메틸-2-옥소인돌린-5-설폰아미드(SU11274); (3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-{[3,5-디메틸-4-(3-모르폴린-4-일프로필)-1H-피롤-2-일]메틸렌}-N-메틸-2-옥소인돌린-5-설폰아미드(SU11606); 6-[디플루오로[6-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸로[4,3-b]피리다진-3-일]메틸]-퀴놀린(JNJ38877605, CAS 943540-75-8); 2-[4-[1-(퀴놀린-6-일메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피라진-6-일]-1H-피라졸-1-일]에탄올(PF04217903, CAS 956905-27-4); N-((2R)-1,4-디옥산-2-일메틸)-N-메틸-N'-[3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-옥소-5H-벤조[4,5]시클로헵타[1,2-b]피리딘-7-일]설파미드(MK2461, CAS 917879-39-1); 6-[[6-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸로[4,3-b]피리다진-3-일]티오]-퀴놀린(SGX523, CAS 1022150-57-7); 및 (3Z)-5-[[(2,6-디클로로페닐)페틸]설포닐]-3-[[3,5-디메틸-4-[[(2R)-2-(1-피롤리디닐메틸)-1-피롤리디닐]카보닐]-1H-피롤-2-일]메틸렌]-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(PHA665752, CAS 477575-56-7)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
IGF1R 억제제는 BMS-754807, XL-228, OSI-906, GSK0904529A, A-928605, AXL1717, KW-2450, MK0646, AMG479, IMCA12, MEDI-573, 및 BI836845를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Yee, JNCI, 104; 975 (2012)] 참조.
일부 구현예에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형을 하나 이상의 GNAQ/GNA11 하류 신호전달 경로 억제제(β-아레스틴 억제제, GRK 억제제, MAPK 억제제, PI3K 억제제, JAK 억제제 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K) 억제제는 이델라리십(Zydelig, GS-1101, Cal-101), 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸설포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린(GDC 0941로도 알려져 있고, PCT 공개 WO 09/036082호 및 WO 09/055730호에 기재되어 있음); 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디하이드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴(BEZ 235 또는 NVP-BEZ 235로도 알려져 있고, PCT 공개 WO 06/122806호에 기재되어 있음); 4-(트리플루오로메틸)-5-(2,6-모르폴리노피리미딘-4-일)피리딘-2-아민(BKM120 또는 NVP-BKM120으로도 알려져 있고, PCT 공개 WO2007/084786호에 기재되어 있음); 토자세르팁(VX680 또는 MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-피리디닐)-6-퀴놀리닐]메틸렌]-2,4-티아졸리딘디온(GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(아세틸옥시)-1-[(디-2-프로페닐아미노)메틸렌]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-옥타하이드로-11-하이드록시-4-(메톡시메틸)-4a,6a-디메틸-시클로펜타[5,6]나프토[1,2-c]피란-2,7,10(1H)-트리온(PX866, CAS 502632-66-8); 및 8-페닐-2-(모르폴린-4-일)-크로멘-4-온(LY294002, CAS 154447-36-6)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형을 하나 이상의 아폽토시스 촉진제(IAP 억제제, Bcl2 억제제, MCl1 억제제, 트레일(Trail) 제제, Chk 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
예를 들어, IAP 억제제는 LCL161, GDC-0917, AEG-35156, AT406, 및 TL32711을 포함하나 이에 한정되지 않는다. IAP 억제제의 다른 예는 WO04/005284, WO 04/007529, WO05/097791, WO 05/069894, WO 05/069888, WO 05/094818, US2006/0014700, US2006/0025347, WO 06/069063, WO 06/010118, WO 06/017295, 및 WO08/134679(이들은 모두 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
BCL-2 억제제는 베네토클락스(GDC-0199, ABT-199, RG7601로도 알려져 있음); 4-[4-[[2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-시클로헥센-1-일]메틸]-1-피페라지닐]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-모르폴리닐)-1-[(페닐티오)메틸]프로필]아미노]-3-[(트리플루오로메틸)설포닐]페닐]설포닐]벤즈아미드(ABT-263으로도 알려져 있고, PCT 공개 WO 09/155386호에 기재되어 있음); 테트로카신 A; 안티마이신; 고시폴((-)BL-193); 오바토클락스; 에틸-2-아미노-6-시클로펜틸-4-(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸)-4H크로몬-3-카복실레이트(HA14-1); 오블리머센(G3139, Genasense®); Bak BH3 펩티드; (-)-고시폴 아세트산(AT-101); 4-[4-[(4'-클로로[1,1'-바이페닐]-2-일)메틸]-1-피페라지닐]-N-[[4-[[(1R)-3-(디메틸아미노)-1-[(페닐티오)메틸]프로필]아미노]-3-니트로페닐]설포닐]-벤즈아미드(ABT-737, CAS 852808-04-9); 및 나비토클락스(ABT-263, CAS 923564-51-6)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
DR4(TRAILR1) 및 DR5(TRAILR2)를 포함하는 아폽토시스촉진 수용체 작용제(PARA)는 둘라너민(AMG-951, RhApo2L/TRAIL); 마파투무맙(HRS-ETR1, CAS 658052-09-6); 렉사투무맙(HGS-ETR2, CAS 845816-02-6); 아포맙(Apomab®); 코나투무맙(AMG655, CAS 896731-82-1); 및 티가투주맙(CS1008, CAS 946415-34-5, Daiichi Sankyo에서 입수가능)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
체크포인트 키나제(CHK) 억제제는 7-하이드록시스타우로스포린(UCN-01); 6-브로모-3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(3R)-3-피페리디닐-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-아민(SCH900776, CAS 891494-63-6); 5-(3-플루오로페닐)-3-우레이도티오펜-2-카복실산 N-[(S)-피페리딘-3-일]아미드(AZD7762, CAS 860352-01-8); 4-[((3S)-1-아자바이시클로[2.2.2]옥트-3-일)아미노]-3-(1H-벤즈이미다졸-2-일)-6-클로로퀴놀린-2(1H)-온(CHIR 124, CAS 405168-58-3); 7-아미노닥티노마이신(7-AAD), 이소그라눌라티미드, 탈브로모히메니알디신; N-[5-브로모-4-메틸-2-[(2S)-2-모르폴리닐메톡시]-페닐]-N'-(5-메틸-2-피라지닐)우레아(LY2603618, CAS 911222-45-2); 설포라판(CAS 4478-93-7, 4-메틸설피닐부틸 이소티오시아네이트); 9,10,11,12-테트라하이드로-9,12-에폭시-1H-디인돌로[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]피롤로[3,4-i][1,6]벤조디아조신-1,3(2H)-디온(SB-218078, CAS 135897-06-2); 및 TAT-S216A(YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL(서열번호 282)), 및 CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체 또는 제형을 하나 이상의 면역조절제(예를 들어, 공동자극 분자의 활성화제 또는 면역 체크포인트 분자의 억제제 중 하나 이상)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 면역조절자는 공동자극 분자의 활성화제이다. 일 구현예에서, 공동자극 분자의 작용제는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING, 또는 CD83 리간드의 작용제(예를 들어, 작용성 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 가용성 융합체)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 면역조절자는 면역 체크포인트 분자의 억제제이다. 일 구현예에서, 면역조절제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타의 억제제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 또는 CTLA4, 또는 이들의 임의의 조합을 억제한다. 용어 "억제" 또는 "억제제"는 소정 분자, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제의 특정 파라미터, 예를 들어 활성의 감소를 포함한다. 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상의 활성(예를 들어, PD-1 또는 PD-L1 활성) 억제는 이 용어에 포함된다. 따라서, 억제가 100%일 필요는 없다.
억제 분자의 억제는 DNA, RNA, 또는 단백질 수준에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제 분자의 발현을 억제하기 위해 억제 핵산(예를 들어, dsRNA, siRNA, 또는 shRNA)이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 억제 신호의 억제제는 억제 분자에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어 가용성 리간드(예를 들어, PD-1-Ig 또는 CTLA-4 Ig), 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타, 또는 이들의 조합에 결합하는 항체 또는 이의 단편(본원에서 "항체 분자"라고도 함)이다.
일부 구현예에서, 항체 분자는 전장 항체 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv 단편(svFv))이다. 또 다른 구현예에서, 항체 분자는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는, 구체적으로는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 중쇄 불변 영역, 보다 구체적으로는 IgG1 또는 IgG4(예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4)의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역(Fc)을 갖는다. 일 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4이다. 일 구현예에서, 불변 영역은 항체 분자의 특성을 바꾸기 위해(예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능, 또는 보체 기능 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키기 위해) 변경, 예를 들어 돌연변이된다.
특정 구현예에서, 항체 분자는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 분자의 형태이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 또는 PD-L1에 대한 제1 결합 특이성, 및 제2 결합 특이성, 예를 들어 TIM-3, LAG-3, 또는 PD-L2에 대한 제2 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 또는 PD-L1 및 TIM-3에 결합한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 또는 PD-L1 및 LAG-3에 결합한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 및 PD-L1에 결합한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 및 PD-L2에 결합한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 TIM-3 및 LAG-3에 결합한다. 상기 분자들의 임의의 조합은 다중특이적 항체 분자, 예를 들어 PD-1 또는 PD-1에 대한 제1 결합 특이성, 및 TIM-3, LAG-3, 또는 PD-L2 중 둘 이상에 대한 제2 및 제3 결합 특이성을 포함하는 삼중특이적 항체에서 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절자는 PD-1, 예를 들어 인간 PD-1의 억제제이다. 다른 구현예에서, 면역조절자는 PD-L1, 예를 들어 인간 PD-L1의 억제제이다. 일 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제는 PD-1 또는 PD-L1에 대한 항체 분자이다. PD-1 또는 PD-L1 억제제는 단독으로, 또는 다른 면역조절자와 조합하여, 예를 들어 LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA4의 억제제와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제, 예를 들어 항-PD-1 또는 PD-L1 항체 분자는 LAG-3 억제제, 예를 들어 항-LAG-3 항체 분자와 조합하여 투여된다. 다른 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제, 예를 들어 항-PD-1 또는 PD-L1 항체 분자는 TIM-3 억제제, 예를 들어 항-TIM-3 항체 분자와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제, 예를 들어 항-PD-1 항체 분자는 LAG-3 억제제, 예를 들어 항-LAG-3 항체 분자, 및 TIM-3 억제제, 예를 들어 항-TIM-3 항체 분자와 조합하여 투여된다. PD-1 억제제(예를 들어, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 중 하나 이상)와 면역조절자의 다른 조합도 본 발명에 속한다. 당업계에 알려지거나 본원에 개시된 임의의 항체 분자가 체크포인트 분자의 억제제의 상기 조합에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 피딜리주맙으로부터 선택되는 항-PD-1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙이다. 니볼루맙의 다른 명칭은 MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538, 또는 BMS-936558을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(CAS 등록 번호: 946414-94-4)이다. 니볼루맙은 PD-1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 단일클론 항체이다. 니볼루맙(클론 5C4), 및 PD-1에 특이적으로 결합하는 다른 인간 단일클론 항체는 미국 특허 8,008,449호 및 PCT 공개 WO2006/121168호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다. 펨브롤리주맙(상표명 KEYTRUDA, 이전 명칭 람브롤리주맙, Merck 3745, MK-3475, 또는 SCH-900475로도 알려짐)은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG4 단일클론 항체이다. 펨브롤리주맙은 예를 들어 문헌[Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, PCT 공개 WO2009/114335호, 및 미국 특허 8,354,509호]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 피딜리주맙이다. 피딜리주맙(CT-011; Cure Tech)은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG1k 단일클론 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 단일클론 항체는 PCT 공개 WO2009/101611호에 개시되어 있다. 다른 항-PD-1 항체는 미국 특허 8,609,089호, 미국 공개 2010028330호, 및/또는 미국 공개 20120114649호에 개시되어 있다. 다른 항-PD-1 항체는 AMP 514(Amplimmune)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 스파탈리주맙으로도 알려진 PDR001 또는 WO2015/112900에 개시된 임의의 다른 항-PD-1 항체이다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 불변 영역(예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 면역어드헤신(예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 구현예에서, PD-1 억제제는 AMP-224이다.
일부 구현예에서, PD-L1 억제제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PD-L1 억제제는, 본원에 개시된 서열(또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어 특정된 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 서열)을 갖는, 예를 들어 WO 2013/0179174에 개시된 YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, 또는 MDX-1105MSB-0010718C(A09-246-2라고도 함)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, PD-L1 억제제는 MDX-1105이다. BMS-936559로도 알려진 MDX-1105는 PCT 공개 WO2007/005874호에 기재된 항-PD-L1 항체이다.
일부 구현예에서, PD-L1 억제제는 YW243.55.S70이다. YW243.55.S70 항체는 PCT 공개 WO 2010/077634호에 기재된 항-PD-L1(서열번호 20 및 21에 각각 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)이다.
일부 구현예에서, PD-L1 억제제는 MDPL3280A(Genentech/Roche)이다. MDPL3280A는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 단일클론 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 단일클론 항체는 미국 특허 7,943,743호 및 미국 공개 20120039906호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, PD-L2 억제제는 AMP-224이다. AMP-224는 PD1과 B7-H1(예를 들어, PCT 공개 WO2010/027827호 및 WO2011/066342호에 개시된 B7-DCIg; Amplimmune) 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다.
일부 구현예에서, LAG-3 억제제는 항-LAG-3 항체 분자이다. 일 구현예에서, LAG-3 억제제는 BMS-986016이다. 일 구현예에서, LAG-3 억제제는 LAG525 또는 WO2015/138920에 개시된 임의의 항-LAG3 항체이다.
일부 구현예에서, TIM-3 억제제는 항-TIM3 항체 분자이다. 일 구현예에서, TIM-3 억제제는 MBG453 또는 WO2015/117002에 개시된 임의의 항-TIM3 항체이다.
약학적 조성물 및 제형
면역접합체(예를 들어, 본원에 기재된 공정에 의해 제조된 면역접합체)를 포함하는 약학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 본 발명의 면역접합체는 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합된다. 조성물은 PMEL17 발현 암(암종(예를 들어, 간세포 암종), 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 점막 흑색종), 또는 이의 전이암을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 치료 또는 예방하는 데 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 면역접합체 또는 약학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 대상체에게 투여하기에 적합한 제형(예를 들어, 투여 제형 또는 투약 형태)으로 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형은 액상 제형이다. 다른 구현예에서, 제형은 재구성되거나 건조된 제형, 예를 들어 동결건조 제형으로부터 재구성되거나 건조된 제형이다. 다른 구현예에서, 제형은 동결건조 또는 건조된 제형이다.
일부 구현예에서, 제형은 본원에 기재된 항체 약물 접합체(예를 들어, 본원에 기재된 공정에 의해 제조된 항체 약물 접합체), 완충제, 안정화제, 및 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 4.5 내지 6.5이다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 약 5 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 예를 들어 약 10 mg 내지 약 30 mg, 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 18 mg/mL 내지 약 22 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 25 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 25 mg 내지 약 30 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 또는 약 18 mg/mL 내지 약 22 mg/mL, 예를 들어 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 9 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 11 mg/mL, 약 12 mg/mL, 약 13 mg/mL, 약 14 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 16 mg/mL, 약 17 mg/mL, 약 18 mg/mL, 약 19 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 21 mg/mL, 약 22 mg/mL, 약 23 mg/mL, 약 24 mg/mL, 또는 약 25 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 예를 들어 약 20 mg/mL의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 완충제는 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 석시네이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM, 예를 들어 약 10 mM 내지 약 40 nM, 약 15 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 15 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 40 mM 내지 약 50 mM, 약 35 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 15 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 15 mM 내지 약 25 mM, 약 25 mM 내지 약 35 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 35 mM 내지 약 45 mM, 예를 들어 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 또는 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 완충제는 약 15 mM 내지 약 25 mM, 예를 들어 약 20 mM의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 안정화제는 수크로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제는 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제는 약 100 mM 내지 약 500 mM, 예를 들어 약 150 mM 내지 약 450 mM, 약 200 mM 내지 약 400 mM, 약 250 mM 내지 약 350 mM, 약 100 mM 내지 약 450 mM, 약 100 mM 내지 약 400 mM, 약 100 mM 내지 약 350 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 250 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 약 450 mM 내지 약 500 mM, 약 400 mM 내지 약 500 mM, 약 350 mM 내지 약 500 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 약 250 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 250 mM, 약 200 mM 내지 약 250 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM, 약 300 mM 내지 약 400 mM, 또는 약 350 mM 내지 약 450 mM, 예를 들어 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 240 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 또는 약 500 mM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 안정화제는 약 200 mM 내지 약 300 mM, 예를 들어 약 240 mM의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20을 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.06%, 예를 들어 약 0.02% 내지 약 0.05%, 약 0.03% 내지 약 0.04%, 약 0.01% 내지 약 0.05%, 약 0.01% 내지 약 0.04%, 약 0.01% 내지 약 0.03%, 약 0.01% 내지 약 0.02%, 약 0.05% 내지 약 0.06%, 약 0.04% 내지 약 0.06%, 약 0.03% 내지 약 0.06%, 약 0.02% 내지 약 0.06%, 약 0.02% 내지 약 0.04%, 약 0.03% 내지 약 0.05%, 예를 들어 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 또는 약 0.06%의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.03%, 예를 들어 약 0.02%의 농도로 존재한다.
일부 구현예에서, 제형의 pH는 약 4.7 내지 약 5.3, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.2 내지 약 5.8, 약 5.4 내지 약 5.6, 약 5.2 내지 약 6.0, 약 5.4 내지 약 6.0, 약 5.6 내지 약 6.0, 약 5.8 내지 약 6.0, 약 5 내지 약 5.8, 약 5 내지 약 5.6.0, 약 5 내지 약 5.4, 약 5 내지 약 5.2, 약 4.8 내지 약 5.2, 약 5.1 내지 약 5.3, 약 5.2 내지 약 5.4, 약 5.3 내지 약 5.5, 약 5.5 내지 약 5.7, 약 5.6 내지 약 5.8, 약 5.7 내지 약 5.9, 약 4.9 내지 약 5.5, 약 5.5 내지 약 6.1, 또는 약 5.7 내지 약 6.3, 예를 들어 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 또는 약 6.5이다. 일부 구현예에서, 제형의 pH는 약 5.0 내지 약 5.6, 예를 들어 약 5.3이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0 내지 약 5.6이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.3이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0 내지 약 5.6이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.3이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.7 내지 약 5.3이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.7 내지 약 5.3이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.0이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.05% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.04%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.05% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.04%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.05% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 10 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.05% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2 내지 약 5.8이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 10 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.7 내지 약 6.3이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 6.0이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.7 내지 약 6.3이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 6.0이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.9 내지 약 5.5이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 4.9 내지 약 5.5이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.2이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5 내지 약 6.1이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.8이다.
일부 구현예에서, 제형은 약 15 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.01% 내지 약 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.5 내지 약 6.1이다. 일부 구현예에서, 제형은 약 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 약 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 약 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 약 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH는 약 5.8이다.
일 구현예에서, 제형은 실시예 4, 예를 들어 표 27에 기재된 제형이다. 일 구현예에서, 제형은 pH 5.0에서 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 20 mM의 히스티딘, 240 mM의 수크로스, 0.02%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일 구현예에서, 제형은 pH 5.5에서 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 20 mM의 히스티딘, 240 mM의 수크로스, 0.02%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일 구현예에서, 제형은 pH 5.5에서 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 20 mM의 히스티딘, 240 mM의 수크로스, 0.04%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일 구현예에서, 제형은 pH 5.5에서 10 mg/mL의 항체 약물 접합체, 20 mM의 히스티딘, 240 mM의 수크로스, 0.02%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일 구현예에서, 제형은 pH 6.0에서 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 20 mM의 히스티딘, 240 mM의 수크로스, 0.02%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일 구현예에서, 제형은 pH 5.2에서 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 20 mM의 히스티딘, 240 mM의 수크로스, 0.02%의 폴리소르베이트를 포함한다. 일 구현예에서, 제형은 pH 5.8에서 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 20 mM의 히스티딘, 240 mM의 수크로스, 0.02%의 폴리소르베이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 기준 제형(예를 들어, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형)과 비교하여, 제형(예를 들어, 동결건조 제형)의 D는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 안정적이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 기준 제형(예를 들어, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형)과 비교하여, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 개환 입체형태를 갖는 D의 백분율은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 낮다.
일부 구현예에서, 제형(예를 들어, 동결건조 제형)은 약 80 mg 내지 약 120 mg(예를 들어, 약 107 mg)의 항체 약물 접합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약 5 mL 내지 약 5.5 mL의 제형이 동결건조된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 단량체 수준은 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 단편 수준은 약 3% 미만, 예를 들어 약 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 응집체 수준은 약 3% 미만, 예를 들어 약 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 SEC로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형)의 분해 수준은 약 2% 미만, 예를 들어 약 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만이다.
일 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 동결건조 제형 내 10 μm 이상의 입자 수준은 약 300개 입자/ml 미만, 예를 들어 약 280개 입자/mL 미만, 약 260개 입자/mL 미만, 약 240개 입자/mL 미만, 약 220개 입자/mL 미만, 약 200개 입자/mL 미만, 약 180개 입자/mL 미만, 약 160개 입자/mL 미만, 약 140개 입자/mL 미만, 120개 입자/mL, 약 100개 입자/mL 미만, 80개 입자/mL, 60개 입자/mL, 40개 입자/mL, 20개 입자/mL, 또는 10개 입자/mL이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 10 μm 초과의 입자 수준은 약 3배 이하, 예를 들어 약 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5배 이하만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 25 μm 초과의 입자 수준은 약 3배 이하, 예를 들어 약 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5배 이하만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 25 μm 초과의 입자 수준은 약 20개 입자/mL 미만, 예를 들어 약 15개 입자/mL, 10개 입자/mL, 5개 입자/mL, 또는 2개 입자/mL 미만이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 모세관 전기영동으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 불순물 수준은 약 15% 미만, 예를 들어 약 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 모세관 전기영동으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 불순물 수준은 20% 이하, 예를 들어 약 15%, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 이하만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 모세관 구역 전기영동(CZE)으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 중성 변이체 수준은 약 50% 초과, 예를 들어 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 중성 변이체 수준은 약 20% 이하, 예를 들어 약 15%, 10%, 5%, 또는 2% 이하만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 산성 변이체 수준은 약 30% 미만, 예를 들어 약 25%, 20%, 15%, 5%, 또는 2% 미만이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 산성 변이체 수준은 약 50% 이하, 예를 들어 약 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이하만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 0주, 약 4주, 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 염기성 변이체 수준은 약 30% 미만, 예를 들어 약 25%, 20%, 15%, 5%, 또는 2% 미만이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CZE로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 4주 또는 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형) 내 염기성 변이체 수준은 약 50% 이하, 예를 들어 약 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이하만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 생체활성 분석으로 측정시, 약 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 약 8주 동안 보관 후, 제형(예를 들어, 동결건조 제형)의 효능은 약 25% 이하, 예를 들어 약 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 2% 이하만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 제형(예를 들어, 동결건조 제형)의 삼투질 농도는 약 200 mOsm/L 내지 400 mOsm/L, 예를 들어 200 mOsm/L 내지 300 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 290 mOsm/L 내지 310 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 290 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 310 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 330 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 310 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 290 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 270 mOsm/L, 260 mOsm/L 내지 280 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 290 mOsm/L, 280 mOsm/L 내지 300 mOsm/L, 300 mOsm/L 내지 320 mOsm/L, 310 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 또는 320 mOsm/L 내지 340 mOsm/L, 예를 들어 200 mOsm/L, 250 mOsm/L, 260 mOsm/L, 270 mOsm/L, 280 mOsm/L, 290 mOsm/L, 300 mOsm/L, 310 mOsm/L, 320 mOsm/L, 330 mOsm/L, 340 mOsm/L, 350 mOsm/L, 또는 400 mOsm/L이다.
일부 구현예에서, 제형은 용기에 존재한다. 일부 구현예에서, 용기는 바이알, 예를 들어 25R 유리 바이알이다. 일부 구현예에서, 용기는 마개 및 캡(예를 들어, 플립-오프 알루미늄 캡)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 스크류 마개가 있는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 병에 보관되며, 예를 들어 두 가지 모두 USP 클래스 VI를 준수한다. 일부 구현예에서, 용기(예를 들어, 병) 및/또는 마개는 충전하기 전에 감마 방사선으로 멸균된다. 일부 구현예에서, 용기(예를 들어, 병)는 USP에 따라 비발열성인 것으로 확인된다.
특정 구현예에서, 제형은 생체내 적절한 분포를 보장한다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB; blood-brain barrier)은 많은 고친수성 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물은 (필요한 경우) BBB 통과를 보장하기 위해, 예를 들어 리포솜으로 제형화될 수 있다. 리포솜 제조 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811호; 5,374,548호; 및 5,399,331호 참조. 리포솜은 특정 세포 또는 기관에 선택적으로 수송되어 표적 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산 또는 비오틴(예를 들어, Low 등의 미국 특허 5,416,016호); 만노시드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120(Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다(또한, 문헌[K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273] 참조).
치료제 및 진단제의 제형은 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와, 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수용액, 로션, 또는 현탁액의 형태로 혼합하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000] 참조).
치료제에 대한 투여 요법의 선택은 개체의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 수준, 개체의 면역원성, 및 생물학적 기질 내 표적 세포의 접근성을 포함한 여러 인자에 따라 다르다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 허용되는 부작용 수준에 맞게 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로 특정 개체 및 치료되는 병태의 중증도에 따라 다르다. 항체, 사이토카인, 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 데 있어서 지침을 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000] 참조).
적절한 용량의 결정은 예를 들어 치료 또는 예방에 영향을 미치는 것으로 당업계에서 알려지거나 추측되거나 치료 또는 예방에 영향을 미칠 것으로 예상되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 최적 용량보다 다소 적은 양으로 용량을 시작하여, 이후 임의의 부정적 부작용에 비해 원하는 효과 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 용량을 조금씩 증가시킨다. 중요한 진단 조치는 예를 들어 염증의 증상 또는 생성된 염증성 사이토카인의 수준의 조치를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 알려진 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 면역접합체를 포함하는 조성물은 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어 1일, 1주의 간격으로, 또는 주 1~7회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 5주에 1회, 6주에 1회, 7주에 1회, 또는 8주에 1회 투약함으로써 제공될 수 있다. 투약은 정맥내로, 피하로, 국소적으로, 경구로, 비강으로, 직장으로, 근육내로, 뇌내로, 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 구체적인 용량 프로토콜은 바람직하지 않은 심각한 부작용을 피하는 최대 용량 또는 투약 빈도를 포함하는 것이다.
본 발명의 면역접합체의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중을 기준으로 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 투여량은 환자의 체중을 기준으로 약 0.0001 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.0001 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.0001 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 0.0001 내지 약 2 mg/kg, 약 0.0001 내지 약 1 mg/kg, 약 0.0001 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.0001 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.0001 mg/kg 내지 약 0.25 mg/kg, 약 0.0001 내지 약 0.15 mg/kg, 약 0.0001 내지 약 0.10 mg/kg, 약 0.001 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 내지 약 0.25 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 0.10 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 면역접합체의 투여량은 환자의 체중(kg)에 투여될 용량(mg/kg)을 곱하여 계산될 수 있다.
일부 구현예에서, 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, e.g., 약 2 mg/kg 내지 약 16 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 12 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 12 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 16 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 16 mg/kg, 약 8 mg/kg 내지 약 16 mg/kg, 약 12 mg/kg 내지 약 16 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 3 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 5 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 9 mg/kg, 약 11 mg/kg 내지 13 mg/kg, 또는 약 15 mg/kg 내지 약 16 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 2 mg/kg 내지 약 15 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 12 mg/kg, 또는 약 16 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 1 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 2 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 4 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 8 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 12 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 16 mg/kg이다.
본 발명의 면역접합체의 용량은 반복될 수 있으며, 투여는 약 1일 미만, 적어도 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 5일, 약 10일, 약 15일, 약 30일, 약 45일, 약 2개월, 약 75일, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월씩 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 주 2회, 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 또는 그 이하의 빈도로 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 면역접합체의 용량은 2주마다 반복된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 약 2 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 투여량으로 2주에 1회 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 12 mg/kg, 또는 약 16 mg/kg의 투여량으로 2주에 1회 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 약 2 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 투여량으로 주 1회 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 12 mg/kg, 또는 약 16 mg/kg의 투여량으로 주 1회 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 약 2 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 투여량으로 4주에 1회 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 12 mg/kg, 또는 약 16 mg/kg의 투여량으로 4주에 1회 정맥내로 투여된다.
특정 환자에 대한 유효량은 치료되는 병태, 환자의 전반적 건강, 투여의 방법, 경로 및 용량, 및 부작용의 심각성과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다(예를 들어, 문헌[Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001] 참조).
투여 경로는 예를 들어 국소 또는 피부 적용, 피하, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 병변내 투여에 의한 주사 또는 주입, 또는 지속방출 시스템 또는 이식에 의한 것일 수 있다(예를 들어, 문헌[Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; 미국 특허 6,350,466호 및 6,316,024호] 참조). 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 또는 주사 부위의 통증을 완화시키는 리도카인과 같은 국소 마취제, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제 함유 제형의 사용에 의해 폐 투여가 이용될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,019,968호, 5,985,320호, 5,985,309호, 5,934,272호, 5,874,064호, 5,855,913호, 5,290,540호, 및 4,880,078호; 및 PCT 공개 WO 92/19244호, WO 97/32572호, WO 97/44013호, WO 98/31346호, 및 WO 99/66903호 참조(각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨).
본 발명의 조성물은 또한 당업계에 알려진 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 면역접합체에 대한 선택된 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 비경구 투여는 일반적으로 주사에 의한 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 나타낼 수 있으며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 제한 없이 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 국소, 표피, 또는 점막 투여 경로와 같은 비경구 경로를 통해, 예를 들어 비강내, 경구, 질내, 직장내, 설하, 또는 국소 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 주입에 의해 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 피하 투여된다.
본 발명의 면역접합체가 제어방출 또는 지속방출 시스템으로 투여되는 경우, 펌프를 사용하여 제어방출 또는 지속방출을 달성할 수 있다(상기 Langer의 문헌; 문헌[Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989] 참조). 고분자 재료를 사용하여 본 발명의 요법의 제어방출 또는 지속방출을 달성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983] 참조; 또한 문헌[Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; 미국 특허 5,679,377호; 미국 특허 5,916,597호; 미국 특허 5,912,015호; 미국 특허 5,989,463호; 미국 특허 5,128,326호; PCT 공개 WO 99/15154호; 및 PCT 공개 WO 99/20253호] 참조). 지속방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 지속방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 침출성 불순물이 없고, 보관시 안정적이고, 무균이고, 생분해성이다. 제어방출 또는 지속방출 시스템은 예방 또는 치료 표적에 근접하여 위치할 수 있으므로, 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, 상기 Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138, 1984] 참조).
제어방출 시스템은 Langer의 검토(Science 249:1527-1533, 1990)에서 논의된다. 본 발명의 하나 이상의 면역접합체를 포함하는 지속방출 제형을 생성하기 위해, 당업자에게 알려진 임의의 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 4,526,938호, PCT 공개 WO 91/05548, PCT 공개 WO 96/20698, Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996; Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997; 및 Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997] 참조(각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨).
국소 투여의 경우, 본 발명의 면역접합체는 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 겔, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀젼의 형태, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)] 참조. 분무 불가능한 국소 투약 형태의 경우, 국소 적용에 적합하고, 일부 예에서, 물보다 더 큰 동적 점도를 갖는 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하는 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 일반적으로 사용된다. 적합한 제형은 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 도찰제, 살브 등을 제한 없이 포함하며, 이들은 필요에 따라 멸균되거나, 예를 들어 삼투압과 같은 다양한 특성에 영향을 미치는 보조제(예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제, 또는 염)와 혼합된다. 다른 적합한 국소 투약 형태는 분무가능한 에어로졸 제제를 포함하며, 활성 성분은, 일부 예에서, 고체 또는 액체 불활성 담체와 조합하여, 가압 휘발물(예를 들어, 프레온과 같은 가스 추진제)과의 혼합물 또는 스퀴즈병(squeeze bottle)으로 패키징된다. 필요에 따라, 보습제 또는 습윤제가 약학적 조성물 및 투약 형태에 첨가될 수도 있다. 이러한 추가 성분의 예는 당업계에 잘 알려져 있다.
비강내 투여의 경우, 면역접합체를 포함하는 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트, 또는 점적 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 사용을 위한 예방제 또는 치료제는 적절한 추진제(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 기타 적합한 가스)를 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취분기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)가 화합물과 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
제2 치료제, 예를 들어 사이토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제, 또는 방사선과의 공동 투여 또는 치료 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.] 참조). 유효량의 치료제는 증상을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 약 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%만큼 감소시킬 수 있다.
본 발명의 면역접합체와 조합하여 투여될 수 있는 추가 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 본 발명의 면역접합체와 5분 미만의 간격, 30분 미만의 간격, 1시간의 간격, 약 1시간의 간격, 약 1 내지 약 2시간의 간격, 약 2시간 내지 약 3시간의 간격, 약 3시간 내지 약 4시간의 간격, 약 4시간 내지 약 5시간의 간격, 약 5시간 내지 약 6시간의 간격, 약 6시간 내지 약 7시간의 간격, 약 7시간 내지 약 8시간의 간격, 약 8시간 내지 약 9시간의 간격, 약 9시간 내지 약 10시간의 간격, 약 10시간 내지 약 11시간의 간격, 약 11시간 내지 약 12시간의 간격, 약 12시간 내지 18시간의 간격, 18시간 내지 24시간의 간격, 24시간 내지 36시간의 간격, 36시간 내지 48시간의 간격, 48시간 내지 52시간의 간격, 52시간 내지 60시간의 간격, 60시간 내지 72시간의 간격, 72시간 내지 84시간의 간격, 84시간 내지 96시간의 간격, 또는 96시간 내지 120시간의 간격을 두고 투여될 수 있다. 하나의 동일한 환자 방문 내에서 둘 이상의 요법이 투여될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 면역접합체를 포함하는 약학적 조성물을 단독으로 또는 다른 요법과 조합하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 발명의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 순환적으로 투여될 수도 있다. 요법(예를 들어, 제제) 중 하나에 대한 내성 발생의 감소, 요법(예를 들어, 제제) 중 하나의 부작용의 방지 또는 감소, 및/또는 요법의 효능 개선을 위해, 순환 요법은 일정 기간 동안의 제1 요법(예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여에 이은 일정 기간 동안의 제2 요법(예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 및 이러한 순차적 투여의 반복, 즉 사이클을 포함한다.
본 발명의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 병행적으로 투여될 수 있다.
용어 "병행적으로"는 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)을 정확히 동시에 투여하는 것으로 제한되는 것이 아니라, 본 발명의 항체 약물 접합체가 다른 요법(들)과 함께 작용하여 이들이 달리 투여되는 경우보다 증가된 이익을 제공할 수 있도록 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물이 일정 순서로 일정 시간 간격 내에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 예를 들어, 각각의 요법은 동시에 또는 상이한 시점에 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있지만; 동시에 투여되지 않는 경우, 이들은 원하는 치료 효과 또는 예방 효과를 제공하도록 충분히 가까운 시간 내에 투여되어야 한다. 각각의 요법은 임의의 적절한 형태로, 임의의 적합한 경로에 의해 개별적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 5분 미만의 간격, 15분 미만의 간격, 30분 미만의 간격, 1시간 미만의 간격, 약 1시간의 간격, 약 1시간 내지 약 2시간의 간격, 약 2시간 내지 약 3시간의 간격, 약 3시간 내지 약 4시간의 간격, 약 4시간 내지 약 5시간의 간격, 약 5시간 내지 약 6시간의 간격, 약 6시간 내지 약 7시간의 간격, 약 7시간 내지 약 8시간의 간격, 약 8시간 내지 약 9시간의 간격, 약 9시간 내지 약 10시간의 간격, 약 10시간 내지 약 11시간의 간격, 약 11시간 내지 약 12시간의 간격, 24시간의 간격, 48시간의 간격, 72시간의 간격, 또는 1주의 간격을 두고 대상체에게 투여된다. 다른 구현예에서, 동일한 환자 방문 내에서 둘 이상의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)이 투여된다.
병용 요법의 예방제 또는 치료제는 동일한 약학적 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 병용 요법의 예방제 또는 치료제는 개별 약학적 조성물로 대상체에게 병행적으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 동일한 또는 상이한 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 병용 요법의 예방제 또는 치료제는 동일한 약학적 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 병용 요법의 예방제 또는 치료제는 개별 약학적 조성물로 대상체에게 병행적으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 동일한 또는 상이한 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 하기의 열거 구현예를 포함한다.
열거 구현예
1. 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 미생물로서, 뉴클레오티드 서열이 비천연 프로모터에 작동가능하게 연결된, 미생물.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물을 자연적으로 생성하는 유전자 조작 형태의 미생물인 미생물.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 박테리아, 예를 들어 크로모박테리움인 미생물.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 크로모박테리움 백시니이, 예를 들어 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150(= ATCC BAA-2314, = NRRL B-50840, = MWU205)인 미생물.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서, 단리된 미생물 또는 합성 미생물인 미생물.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 미생물의 염색체에 위치하는(예를 들어, 염색체에 자연적으로 위치하거나 염색체에 안정적으로 통합된), 미생물.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 생합성 유전자 클러스터(BGC)에 위치하는, 미생물.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, BGC가, 예를 들어 도 1에 도시된, 화합물 (A1)-BGC인, 미생물.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, BGC가 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 또는 frsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함하는, 미생물.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, BGC가 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 frsH, 또는 이의 상동체를 포함하는, 미생물.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 또는 frsH, 또는 이의 상동체에 위치하는, 미생물.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 미생물.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, frsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 미생물.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 서열번호 310의 뉴클레오티드 서열을 사용, 또는 이의 기능적 단편을 사용, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 사용한 상동성 재조합 사건(예를 들어, 프로모터 교환)으로 인해 발생한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 동일한 미생물로부터 유래되는, 미생물.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 상이한 미생물로부터 유래되는, 미생물.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 vioP 프로모터, nptII 프로모터, rbs 프로모터, J23119 프로모터, pLpp 프로모터, PS12burk 프로모터, Pem7, 또는 ErmE* 프로모터를 포함하고, 임의로, 비천연 프로모터가 vioP 프로모터, nptII 프로모터, 또는 rbs 프로모터를 포함하는, 미생물.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 vioP 프로모터를 포함하는, 미생물.
37. 구현예 1 내지 36 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
38. 구현예 1 내지 37 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 nptII 프로모터를 포함하는, 미생물.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 rbs 프로모터를 포함하는, 미생물.
43. 구현예 1 내지 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
44. 구현예 1 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 J23119 프로모터를 포함하는, 미생물.
46. 구현예 1 내지 45 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
47. 구현예 1 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
48. 구현예 1 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 pLpp 프로모터를 포함하는, 미생물.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
50. 구현예 1 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
51. 구현예 1 내지 50 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 Pem7 프로모터를 포함하는, 미생물.
52. 구현예 1 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
53. 구현예 1 내지 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
54. 구현예 1 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 PS12burk 프로모터를 포함하는, 미생물.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
56. 구현예 1 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
57. 구현예 1 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 ErmE* 프로모터를 포함하는, 미생물.
58. 구현예 1 내지 57 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
59. 구현예 1 내지 58 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 미생물.
60. 구현예 1 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 또는 FrsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체의 전사를 제어하는, 미생물.
61. 구현예 1 내지 60 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 전사를 제어하는, 미생물.
62. 구현예 1 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 FrsA 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류, 예를 들어 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH 전부, 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류에 삽입된, 미생물.
63. 구현예 1 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 비리보솜 펩티드 합성효소(NRPS) 또는 이의 기능적 단편인, 미생물.
64. 구현예 1 내지 63 중 어느 한 구현예에 있어서, NRPS가 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG, 또는 이의 상동체인, 미생물.
65. 구현예 1 내지 64 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 MbtH-유사 단백질 또는 이의 기능적 단편인, 미생물.
66. 구현예 1 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, MbtH-유사 단백질이 FrsB 또는 이의 상동체인, 미생물.
67. 구현예 1 내지 66 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 말산염 탈수소효소인, 미생물.
68. 구현예 1 내지 67 중 어느 한 구현예에 있어서, 말산염 탈수소효소가 FrsC 또는 이의 상동체인, 미생물.
69. 구현예 1 내지 68 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 수산화효소인, 미생물.
70. 구현예 1 내지 69 중 어느 한 구현예에 있어서, 수산화효소가 FrsH 또는 이의 상동체인, 미생물.
71. 구현예 1 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미생물.
72. 구현예 1 내지 71 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드가 복수의 NRPS, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 미생물.
73. 구현예 1 내지 72 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 NRPS가 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG 중 2개 이상(예를 들어, 3, 4개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함하는, 미생물.
74. 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드가 NRPS, MbtH-유사 단백질, 말산염 탈수소효소, 및 수산화효소, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 미생물.
75. 구현예 1 내지 74 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드가 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함하는, 미생물.
76. 구현예 1 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, 미생물이 상기 화합물의 증가된 역가를 갖는, 미생물.
77. 구현예 1 내지 76 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물이 생성될 수 있는 조건하에 배양되는 경우, 상기 화합물의 역가가 기준 미생물, 예를 들어 화합물 (A1)-BGC에 비천연 프로모터를 포함하지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 증가되는, 미생물.
78. 구현예 1 내지 77 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물이 생성될 수 있는 조건하에 배양되는 경우, 상기 화합물의 역가가 기준 미생물, 예를 들어 화합물 (A1)-BGC에 비천연 프로모터를 포함하지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)과 비교하여 적어도 약 100 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 400 mg/L, 500 mg/L, 600 mg/L, 700 mg/L, 800 mg/L, 900 mg/L, 또는 1000 mg/L 증가되는, 미생물.
79. 구현예 1 내지 78 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경된(예를 들어, 파괴된), 미생물.
80. 구현예 1 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 천연 생성물이 비올라세인, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부)을 포함하는, 미생물.
81. 구현예 1 내지 80 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC의 적어도 일부가 결실된, 미생물.
82. 구현예 1 내지 81 중 어느 한 구현예에 있어서, 비올라세인-BGC가 변경된(예를 들어, 파괴된), 미생물.
83. 구현예 1 내지 82 중 어느 한 구현예에 있어서, 화합물 J-BGC가 변경된(예를 들어, 파괴된), 미생물.
84. 구현예 1 내지 83 중 어느 한 구현예에 있어서, 화합물 J-BGC가 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 및 화합물 D의 생성과 관련된, 미생물.
85. 구현예 1 내지 84 중 어느 한 구현예에 있어서, 비올라세인-BGC 및 화합물 J-BGC 둘 모두가 변경된(예를 들어, 파괴된), 미생물.
86. 구현예 1 내지 85 중 어느 한 구현예에 있어서, 천연 생성물의 생성이, 예를 들어 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 감소되는, 미생물.
87. 구현예 1 내지 86 중 어느 한 구현예에 있어서, 미생물이 상기 화합물의 증가된 단리 수율을 갖는, 미생물.
88. 구현예 1 내지 87 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 단리 수율이 기준 미생물, 예를 들어 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경되지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 증가되는, 미생물.
89. 구현예 1 내지 88 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경되지 않은(예를 들어, 파괴되지 않은), 미생물.
90. 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물을 생성하는 미생물로서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경된, 미생물.
91. 구현예 90에 있어서, 천연 생성물이 비올라세인, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부)을 포함하는, 미생물.
92. 구현예 90 또는 91에 있어서, 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC의 적어도 일부가 결실된, 미생물.
93. 구현예 90 내지 92 중 어느 한 구현예에 있어서, 비올라세인-BGC가 변경된(예를 들어, 파괴된), 미생물.
94. 구현예 90 내지 93 중 어느 한 구현예에 있어서, 화합물 J-BGC가 변경된(예를 들어, 파괴된), 미생물.
95. 구현예 90 내지 94 중 어느 한 구현예에 있어서, 화합물 J-BGC가 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 및 화합물 D의 생성과 관련된, 미생물.
96. 구현예 90 내지 95 중 어느 한 구현예에 있어서, 비올라세인-BGC 및 화합물 J-BGC 둘 모두가 변경된(예를 들어, 파괴된), 미생물.
97. 구현예 90 내지 96 중 어느 한 구현예에 있어서, 천연 생성물의 생성이, 예를 들어 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 감소되는, 미생물.
98. 구현예 90 내지 97 중 어느 한 구현예에 있어서, 미생물이 상기 화합물의 증가된 단리 수율을 갖는, 미생물.
99. 구현예 90 내지 98 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 단리 수율이 기준 미생물, 예를 들어 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경되지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 증가되는, 미생물.
100. 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물을 생성하는 방법으로서, 상기 화합물의 발현이 가능한 조건하에 구현예 1 내지 84 중 어느 한 구현예의 미생물을 배양(예를 들어, 발효)시켜, 상기 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
101. 구현예 100에 있어서, 미생물이 50 L 내지 500 L 규모, 예를 들어 50 L, 100 L, 150 L, 200 L, 250 L, 300 L, 350 L, 400 L, 450 L, 또는 500 L 규모로 배양(예를 들어, 발효)되는, 방법.
102. 구현예 100에 있어서, 미생물이 1,000 L 내지 20,000 L 규모, 예를 들어 1,000 L 내지 10,000 L 또는 10,000 L 내지 20,000 L, 예를 들어 1,000 L, 2,000 L, 5,000 L, 7,500 L, 10,000 L, 15,000 L, 또는 20,000 L 규모로 배양(예를 들어, 발효)되는, 방법.
103. 구현예 100 내지 102 중 어느 한 구현예에 있어서, 배양(예를 들어, 발효)이 적어도 200 mL 역가의 상기 화합물, 예를 들어 적어도 250 mg/mL, 300 mg/L, 400 mg/L, 500 mg/L, 600 mg/L, 700 mg/L, 800 mg/L, 900 mg/L, 1000 mg/L, 1100 mg/L, 1200 mg/L, 1300 mg/L, 1400 mg/L, 1500 mg/L, 1600 mg/L, 1700 mg/L, 1800 mg/L, 1900 mg/L, 또는 2000 mg/L 역가의 상기 화합물을 생성하는, 방법.
104. 구현예 100 내지 103 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 본원에 기재된 방법으로 측정시, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 순도로 상기 화합물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
105. 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, 뉴클레오티드 서열이 비천연 프로모터에 작동가능하게 연결된, 핵산.
106. 구현예 105에 있어서, 핵산이 미생물의 염색체에 위치하는(예를 들어, 염색체에 자연적으로 위치하거나 염색체에 안정적으로 통합되는), 핵산.
107. 구현예 105 또는 106에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 생합성 유전자 클러스터(BGC)에 위치하는, 핵산.
108. 구현예 105 내지 107 중 어느 한 구현예에 있어서, BGC가 화합물 (A1)-BGC인, 핵산.
109. 구현예 105 내지 108 중 어느 한 구현예에 있어서, 화합물 (A1)-BGC가 도 1에 도시된 유전자 구조를 갖는, 핵산.
110. 구현예 105 내지 109 중 어느 한 구현예에 있어서, BGC가 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 또는 frsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함하는, 핵산.
111. 구현예 105 내지 110 중 어느 한 구현예에 있어서, BGC가 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 frsH, 또는 이의 상동체를 포함하는, 핵산.
112. 구현예 105 내지 111 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, frsH, 또는 이의 상동체에 위치하는, 핵산.
113. 구현예 105 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
114. 구현예 105 내지 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
115. 구현예 105 내지 114 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
116. 구현예 105 내지 115 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
117. 구현예 105 내지 116 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
118. 구현예 105 내지 117 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
119. 구현예 105 내지 118 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
120. 구현예 105 내지 119 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함하는 영역에 위치하는, 핵산.
121. 구현예 105 내지 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, frsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
122. 구현예 105 내지 121 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
123. 구현예 105 내지 122 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA 및 frsB, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
124. 구현예 105 내지 123 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, 및 frsC, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
125. 구현예 105 내지 124 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, 및 frsD, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
126. 구현예 105 내지 125 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, 및 frsE, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
127. 구현예 105 내지 126 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, 및 frsF, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
128. 구현예 105 내지 127 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, 및 frsG, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
129. 구현예 105 내지 128 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 frsA, frsB, frsC, frsD, frsE, frsF, frsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 암호화 서열을 포함하는, 핵산.
130. 구현예 105 내지 129 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 서열번호 310의 뉴클레오티드 서열을 사용, 또는 이의 기능적 단편을 사용, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 사용한 상동성 재조합 사건(예를 들어, 프로모터 교환)으로 인해 발생한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
131. 구현예 105 내지 130 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
132. 구현예 105 내지 131 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 vioP 프로모터, nptII 프로모터, rbs 프로모터, J23119 프로모터, pLpp 프로모터, PS12burk 프로모터, Pem7, 또는 ErmE* 프로모터를 포함하고, 임의로, 비천연 프로모터가 vioP 프로모터, nptII 프로모터, 또는 rbs 프로모터를 포함하는, 핵산.
133. 구현예 105 내지 132 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
134. 구현예 105 내지 133 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264~266, 268~271, 또는 316 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
135. 구현예 105 내지 134 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 vioP 프로모터를 포함하는, 핵산.
136. 구현예 105 내지 135 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
137. 구현예 105 내지 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 264의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
138. 구현예 105 내지 137 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 nptII 프로모터를 포함하는, 핵산.
139. 구현예 105 내지 138 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
140. 구현예 105 내지 139 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 265의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
141. 구현예 105 내지 140 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 rbs 프로모터를 포함하는, 핵산.
142. 구현예 105 내지 141 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
143. 구현예 105 내지 142 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 266의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
144. 구현예 105 내지 143 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 J23119 프로모터를 포함하는, 핵산.
145. 구현예 105 내지 144 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
146. 구현예 105 내지 145 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 316의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
147. 구현예 105 내지 146 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 pLpp 프로모터를 포함하는, 핵산.
148. 구현예 105 내지 147 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
149. 구현예 105 내지 148 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 268의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
150. 구현예 105 내지 149 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 Pem7 프로모터를 포함하는, 핵산.
151. 구현예 105 내지 150 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
152. 구현예 105 내지 151 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 269의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
153. 구현예 105 내지 152 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 PS12burk 프로모터를 포함하는, 핵산.
154. 구현예 105 내지 153 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
155. 구현예 105 내지 154 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 270의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
156. 구현예 105 내지 155 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 ErmE* 프로모터를 포함하는, 핵산.
157. 구현예 105 내지 156 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖거나, 또는 이와 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
158. 구현예 105 내지 157 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 서열번호 271의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
159. 구현예 105 내지 158 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 또는 FrsH 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 전부), 또는 이의 상동체의 전사를 제어하는, 핵산.
160. 구현예 105 내지 159 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체의 전사를 제어하는, 핵산.
161. 구현예 105 내지 160 중 어느 한 구현예에 있어서, 비천연 프로모터가 FrsA 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류, 예를 들어 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH 전부, 또는 이의 상동체의 암호화 영역의 상류에 삽입된, 핵산.
162. 구현예 105 내지 161 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 비리보솜 펩티드 합성효소(NRPS) 또는 이의 기능적 단편인, 핵산.
163. 구현예 105 내지 162 중 어느 한 구현예에 있어서, NRPS가 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG, 또는 이의 상동체인, 핵산.
164. 구현예 105 내지 163 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 MbtH-유사 단백질 또는 이의 기능적 단편인, 핵산.
165. 구현예 105 내지 164 중 어느 한 구현예에 있어서, MbtH-유사 단백질이 FrsB 또는 이의 상동체인, 핵산.
166. 구현예 105 내지 165 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 말산염 탈수소효소인, 핵산.
167. 구현예 105 내지 166 중 어느 한 구현예에 있어서, 말산염 탈수소효소가 FrsC 또는 이의 상동체인, 핵산.
168. 구현예 105 내지 167 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 폴리펩티드가 수산화효소인, 핵산.
169. 구현예 105 내지 168 중 어느 한 구현예에 있어서, 수산화효소가 FrsH 또는 이의 상동체인, 핵산.
170. 구현예 105 내지 169 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
171. 구현예 105 내지 170 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드가 복수의 NRPS, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 핵산.
172. 구현예 105 내지 171 중 어느 한 구현예에 있어서, 복수의 NRPS가 FrsA, FrsD, FrsE, FrsF, 또는 FrsG 중 2개 이상(예를 들어, 3, 4개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함하는, 핵산.
173. 구현예 105 내지 172 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드가 NRPS, MbtH-유사 단백질, 말산염 탈수소효소, 및 수산화효소, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 핵산.
174. 구현예 105 내지 173 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드가 FrsA, FrsB, FrsC, FrsD, FrsE, FrsF, FrsG, 및 FrsH, 또는 이의 상동체를 포함하는, 핵산.
175. 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
176. 구현예 175에 있어서, 단리된 핵산, 비자연발생 핵산, 또는 합성 핵산인 핵산.
177. 구현예 175 또는 176에 있어서, 돌연변이, 예를 들어 결실을 포함하는 핵산.
178. 구현예 175 내지 177 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
179. 구현예 175 내지 178 중 어느 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 BGC로부터 유래되는, 핵산.
180. 구현예 175 내지 179 중 어느 한 구현예에 있어서, BGC가 화합물 J-BGC인, 핵산.
181. 구현예 175 내지 180 중 어느 한 구현예에 있어서, 화합물 J-BGC가 도 1에 도시된 유전자 구조를 갖는, 핵산.
182. 구현예 175 내지 181 중 어느 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 dis1, dis2, dis3, 또는 dis4 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함하는, 핵산.
183. 구현예 175 내지 182 중 어느 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 dis1, dis2, dis3, 및 dis4, 또는 이의 상동체를 포함하는, 핵산.
184. 구현예 175 내지 183 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
185. 구현예 105 내지 184 중 어느 한 구현예의 핵산을 포함하는 벡터.
186. 구현예 105 내지 184 중 어느 한 구현예의 핵산 또는 구현예 185의 벡터를 포함하는 세포.
187. 세포를 조작하는 방법으로서, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 변경하여, 세포를 조작하는 단계를 포함하는 방법.
188. 구현예 187에 있어서, 세포가 화학식 (A1)의 구조를 갖는 화합물을 자연적으로 생성하는 미생물인, 방법.
189. 구현예 187 또는 188에 있어서, 미생물이 박테리아, 예를 들어 크로모박테리움인, 방법.
190. 구현예 187 내지 189 중 어느 한 구현예에 있어서, 미생물이 크로모박테리움 백시니이, 예를 들어 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150(= ATCC BAA-2314, = NRRL B-50840, = MWU205)인, 방법.
191. 구현예 187 내지 190 중 어느 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 파괴되는(예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부가 결실되는), 방법.
192. 구현예 187 내지 191 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상의 생성과 관련된 복수의 폴리펩티드를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
193. 구현예 187 내지 192 중 어느 한 구현예에 있어서, 화합물 J, 화합물 F5, 화합물 F3, 또는 화합물 D 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부)의 생성이, 예를 들어 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 감소되는, 방법.
194. 구현예 187 내지 193 중 어느 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 BGC로부터 유래되는, 방법.
195. 구현예 194에 있어서, BGC가 화합물 J-BGC인, 방법.
196. 구현예 195에 있어서, 화합물 J-BGC가 도 1에 도시된 유전자 구조를 갖는, 방법.
197. 구현예 187 내지 196 중 어느 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 dis1, dis2, dis3, 또는 dis4 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개, 또는 전부), 또는 이의 상동체를 포함하는, 방법.
198. 구현예 187 내지 197 중 어느 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 dis1, dis2, dis3, 및 dis4, 또는 이의 상동체를 포함하는, 방법.
199. 구현예 187 내지 198 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산이 GenBank 수탁번호 BankIt2437961 BSeq#1 MW732719와 관련된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
200. 구현예 187 내지 199 중 어느 한 구현예에 있어서, 변경이 상기 화합물의 단리 수율을 증가시키는, 방법.
201. 구현예 187 내지 200 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 화합물의 단리 수율이 기준 미생물, 예를 들어 상기 화합물의 단리를 방해하는 천연 생성물의 BGC가 변경되지 않은 그 외에는 동일한 미생물(예를 들어, 야생형)에 비해 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 증가되는, 방법.
202. 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 공정으로서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 환원시켜 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; 및 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 산화 조건하에 보관하여, 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계를 포함하는 공정.
203. 구현예 202에 있어서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 불변 도메인에 위치하는, 공정.
204. 구현예 202 또는 203에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 4개의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
205. 구현예 202 내지 204 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 2개의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
206. 구현예 202 내지 205 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
207. 구현예 202 내지 206 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 각 CH1 영역에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
208. 구현예 202 내지 207 중 어느 한 구현예에 있어서, 캡핑된 시스테인 잔기가 조작된 표면-노출 시스테인 잔기인, 공정.
209. 구현예 202 내지 208 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역의 잔기 152(EU 넘버링)에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
210. 구현예 202 내지 209 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기가 시스테인 또는 글루타티온으로 캡핑되는, 공정.
211. 구현예 202 내지 210 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 불변 도메인에 위치하는, 공정.
212. 구현예 202 내지 211 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 4개의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
213. 구현예 202 내지 212 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 2개의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
214. 구현예 202 내지 213 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
215. 구현예 202 내지 214 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 각 CH1 영역에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
216. 구현예 202 내지 215 중 어느 한 구현예에 있어서, 디캡핑된 시스테인 잔기가 조작된 표면-노출 시스테인 잔기인, 공정.
217. 구현예 202 내지 216 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역의 잔기 152(EU 넘버링)에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
218. 구현예 202 내지 217 중 어느 한 구현예에 있어서, 공정이 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 접촉시켜 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 환원시킴으로써 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 단계를 포함하는, 공정.
219. 구현예 202 내지 218 중 어느 한 구현예에 있어서, 환원 세척 버퍼가 5 mM 내지 50 mM, 예를 들어 10 mM 내지 40 mM, 20 mM 내지 30 mM, 5 mM 내지 15 mM, 5 mM 내지 25 mM, 5 mM 내지 35 mM, 5 mM 내지 45 mM, 40 mM 내지 50 mM, 30 mM 내지 50 mM, 20 mM 내지 50 mM, 10 mM 내지 50 mM, 10 mM 내지 20 mM, 15 mM 내지 25 mM, 25 mM 내지 35 mM, 30 mM 내지 40 mM, 또는 35 mM 내지 45 mM, 예를 들어 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 20 mM, 25 mM, 또는 30 mM의 시스테인을 포함하는, 공정.
220. 구현예 202 내지 219 중 어느 한 구현예에 있어서, 환원 세척 버퍼가 5 mM 내지 15 mM 시스테인, 예를 들어 10 mM의 시스테인을 포함하는, 공정.
221. 구현예 202 내지 220 중 어느 한 구현예에 있어서, 환원 세척 버퍼의 pH가 6.0 내지 7.5, 예를 들어 6.5 내지 7.2, 또는 6.8 내지 7.0인, 공정.
222. 구현예 202 내지 221 중 어느 한 구현예에 있어서, 환원 세척 버퍼의 pH가 6.8 내지 7.0, 예를 들어 6.9인, 공정.
223. 구현예 202 내지 222 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 접촉시키는 단계가 컬럼(예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼)에서 수행되는, 공정.
224. 구현예 202 내지 223 중 어느 한 구현예에 있어서, 환원 세척 버퍼와 접촉시킨 후, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 용리액에 수집하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
225. 구현예 202 내지 224 중 어느 한 구현예에 있어서, 용리액의 pH가 5.5 내지 6.0, 예를 들어 5.8인, 공정.
226. 구현예 202 내지 225 중 어느 한 구현예에 있어서, 용리액 중 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도가 5 g/L 내지 25 g/L, 예를 들어 8 g/L 내지 20 g/L, 10 g/L 내지 18 g/L, 12 g/L 내지 15 g/L, 5 g/L 내지 20 g/L, 5 g/L 내지 15 g/L, 5 g/L 내지 10 g/L, 20 g/L 내지 25 g/L, 15 g/L 내지 25 g/L, 10 g/L 내지 25 g/L, 10 g/L 내지 20 g/L, 13 g/L 내지 14 g/L, 12 g/L 내지 15 g/L, 예를 들어 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L, 12 g/L, 13 g/L, 13.5 g/L, 14 g/L, 15 g/L, 16 g/L, 17 g/L, 18 g/L, 19 g/L, 20 g/L, 21 g/L, 22 g/L, 23 g/L, 24 g/L, 또는 25 g/L인, 공정.
227. 구현예 202 내지 226 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 교반과 함께 용리액에 보관되는, 공정.
228. 구현예 202 내지 227 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 교반 없이 용리액에 보관되는, 공정.
229. 구현예 202 내지 228 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 최대 50% 내지 70% 용량까지 채워져 용기에, 예를 들어 12시간 내지 96시간, 예를 들어 12시간 내지 84시간, 24시간 내지 84시간, 36시간 내지 72시간, 48시간 내지 60시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 36시간, 72시간 내지 84시간, 60시간 내지 84시간, 48시간 내지 84시간, 36시간 내지 84시간, 12시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 36시간 내지 60시간, 48시간 내지 72시간, 또는 72시간 내지 96시간, 예를 들어 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 또는 96시간 동안, 보관되는, 공정.
230. 구현예 202 내지 229 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 최대 60%까지 채워져 용기에 보관되는, 공정.
231. 구현예 202 내지 230 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 48시간 내지 72시간 동안, 예를 들어 교반 없이, 보관되는, 공정.
232. 구현예 202 내지 231 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 12시간 내지 36시간, 예를 들어 24시간 동안, 예를 들어 교반과 함께, 보관되는, 공정.
233. 구현예 202 내지 232 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 실온에서 보관되는, 공정.
234. 구현예 202 내지 233 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 2℃ 내지 8℃(예를 들어, 4℃)에서, 예를 들어 적어도 48시간(예를 들어, 48시간 내지 96시간) 동안, 보관되는, 공정.
235. 구현예 202 내지 234 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 공기 오버레이 상태로 보관되는, 공정.
236. 구현예 202 내지 235 중 어느 한 구현예에 있어서, 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
237. 구현예 202 내지 236 중 어느 한 구현예에 있어서, 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 링커-약물 모이어티(예를 들어, 본원에 기재된 링커-약물 모이어티)를 접합시켜 항체 약물 접합체(예를 들어, 본원에 기재된 항체 약물 접합체)를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
238. 구현예 202 내지 237 중 어느 한 구현예에 있어서, 하기 화학식 (B)의 링커-약물 모이어티를 미리 형성하는 단계를 추가로 포함하는 공정:
[화학식 (B)]
R8-LB-(D)n
[식에서,
D는 GNAQ 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 GNAQ 억제제), GNA11 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 GNA11 억제제), 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 GNAQ 및 GNA11의 억제제)이고;
R8은 반응성 기(예를 들어, 본원에 기재된 반응성 기)이고;
LB는 절단성 또는 비절단성 링커(예를 들어, 본원에 기재된 절단성 링커 또는 본원에 기재된 비절단성 링커)이고,
n은 1, 2, 3, 또는 4임].
239. 구현예 202 내지 238 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 약물 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
240. 구현예 202 내지 239 중 어느 한 구현예에 있어서, 공정이 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 온-사이트 커플링(예를 들어, 중쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("HC1"))을 생성하는, 공정.
241. 구현예 202 내지 240 중 어느 한 구현예에 있어서, 공정이 25% 미만, 예를 들어 적어도 20%, 15%, 10%, 또는 5%의 오프-사이트 커플링(예를 들어, 경쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("LC1") 및/또는 중쇄당 2개의 링커-약물 모이어티("HC2"))을 생성하는, 공정.
242. 구현예 202 내지 241 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 비환원 CE-SDS로 측정시, 공정이 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 순도를 야기하는, 공정.
243. 항-PMEL17 항체 약물 접합체를 생성하는 공정으로서,
하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 접촉시켜, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 단계;
하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 산화 조건하에 보관하여, 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 링커-약물 모이어티를 접합시켜,
항-PMEL17 항체 약물 접합체를 생성하는 단계를 포함하고,
항체 또는 이의 항원 결합 단편이 PMEL17에 결합하고;
링커-약물 모이어티가 하기 화학식 (B)를 갖는, 공정:
[화학식 (B)]
R8-LB-(D)n
[식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제이고;
R8은 반응성 기이고;
LB는 절단성 또는 비절단성 링커이고,
n은 1, 2, 3, 또는 4임].
244. 항체 약물 접합체, 완충제, 안정화제, 및 계면활성제를 포함하는 제형으로서,
제형의 pH가 4.5 내지 6.5이고;
항체 약물 접합체가 화학식 (C)를 포함하는, 제형:
[화학식 (C)]
Ab-(LA-(D)n)y
[식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제)이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이고;
LA는 링커(예를 들어, 본원에 기재된 링커)이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
245. 구현예 244에 있어서, 항체 약물 접합체가 5 mg/mL 내지 30 mg/mL, 예를 들어 10 mg 내지 30 mg, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL, 18 mg/mL 내지 22 mg/mL, 10 mg/mL 내지 25 mg/mL, 10 mg/mL 내지 20 mg/mL, 10 mg/mL 내지 15 mg/mL, 25 mg 내지 30 mg/mL, 20 mg/mL 내지 30 mg/mL, 5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL, 또는 18 mg/mL 내지 22 mg/mL, 예를 들어 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 또는 25 mg/mL의 농도로 존재하는, 제형.
246. 구현예 244 또는 245에 있어서, 항체 약물 접합체가 15 mg/mL 내지 25 mg/mL, 예를 들어 20 mg/mL의 농도로 존재하는, 제형.
247. 구현예 244 내지 246 중 어느 한 구현예에 있어서, 완충제가 히스티딘 또는 석시네이트를 포함하는, 제형.
248. 구현예 244 내지 247 중 어느 한 구현예에 있어서, 완충제가 5 mM 내지 50 mM, 예를 들어 10 mM 내지 40 nM, 15 mM 내지 35 mM, 20 mM 내지 30 mM, 5 mM 내지 40 mM, 5 mM 내지 30 mM, 5 mM 내지 20 mM, 5 mM 내지 15 mM, 5 mM 내지 10 mM, 40 mM 내지 50 mM, 35 mM 내지 50 mM, 30 mM 내지 50 mM, 25 mM 내지 50 mM, 20 mM 내지 50 mM, 15 mM 내지 50 mM, 10 mM 내지 50 mM, 10 mM 내지 20 mM, 15 mM 내지 25 mM, 25 mM 내지 35 mM, 30 mM 내지 40 mM, 또는 35 mM 내지 45 mM, 예를 들어 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 또는 50 mM의 농도로 존재하는, 제형.
249. 구현예 244 내지 248 중 어느 한 구현예에 있어서, 완충제가 15 mM 내지 25 mM, 예를 들어 20 mM의 농도로 존재하는, 제형.
250. 구현예 244 내지 249 중 어느 한 구현예에 있어서, 안정화제가 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는, 제형.
251. 구현예 244 내지 250 중 어느 한 구현예에 있어서, 안정화제가 100 mM 내지 500 mM, 예를 들어 150 mM 내지 450 mM, 200 mM 내지 400 mM, 250 mM 내지 350 mM, 100 mM 내지 450 mM, 100 mM 내지 400 mM, 100 mM 내지 350 mM, 100 mM 내지 300 mM, 100 mM 내지 250 mM, 100 mM 내지 200 mM, 100 mM 내지 150 mM, 450 mM 내지 500 mM, 400 mM 내지 500 mM, 350 mM 내지 500 mM, 300 mM 내지 500 mM, 250 mM 내지 500 mM, 200 mM 내지 500 mM, 150 mM 내지 500 mM, 150 mM 내지 250 mM, 200 mM 내지 250 mM, 200 mM 내지 300 mM, 300 mM 내지 400 mM, 또는 350 mM 내지 450 mM, 예를 들어 100 mM, 150 mM, 200 mM, 240 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 또는 500 mM의 농도로 존재하는, 제형.
252. 구현예 244 내지 251 중 어느 한 구현예에 있어서, 안정화제가 200 mM 내지 300 mM, 예를 들어 240 mM의 농도로 존재하는, 제형.
253. 구현예 244 내지 252 중 어느 한 구현예에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는, 제형.
254. 구현예 244 내지 253 중 어느 한 구현예에 있어서, 계면활성제가 0.01% 내지 0.06%, 예를 들어 0.02% 내지 0.05%, 0.03% 내지 0.04%, 0.01% 내지 0.05%, 0.01% 내지 0.04%, 0.01% 내지 0.03%, 0.01% 내지 0.02%, 0.05% 내지 0.06%, 0.04% 내지 0.06%, 0.03% 내지 0.06%, 0.02% 내지 0.06%, 0.02% 내지 0.04%, 0.03% 내지 0.05%, 예를 들어 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 또는 0.06%의 농도로 존재하는, 제형.
255. 구현예 244 내지 254 중 어느 한 구현예에 있어서, 계면활성제가 0.01% 내지 0.05%, 예를 들어 0.02%의 농도로 존재하는, 제형.
256. 구현예 244 내지 255 중 어느 한 구현예에 있어서, 제형의 pH가 4.7 내지 5.3, 5.0 내지 6.0, 5.2 내지 5.8, 5.4 내지 5.6, 5.2 내지 6.0, 5.4 내지 6.0, 5.6 내지 6.0, 5.8 내지 6.0, 5 내지 5.8, 5 내지 5.6.0, 5 내지 5.4, 5 내지 5.2, 4.8 내지 5.2, 5.1 내지 5.3, 5.2 내지 5.4, 5.3 내지 5.5, 5.5 내지 5.7, 5.6 내지 5.8, 5.7 내지 5.9, 4.9 내지 5.5, 5.5 내지 6.1, 또는 5.7 내지 6.3, 예를 들어 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5인, 제형.
257. 구현예 244 내지 256 중 어느 한 구현예에 있어서, 제형의 pH가 5.0 내지 5.6, 예를 들어 5.3인, 제형.
258. 구현예 244 내지 257 중 어느 한 구현예에 있어서, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.01% 내지 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.0 내지 5.6인, 제형.
259. 구현예 244 내지 258 중 어느 한 구현예에 있어서, 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.3인, 제형.
260. 구현예 244 내지 259 중 어느 한 구현예에 있어서, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.01% 내지 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 4.7 내지 5.3인, 제형.
261. 구현예 244 내지 260 중 어느 한 구현예에 있어서, 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.0인, 제형.
262. 구현예 244 내지 261 중 어느 한 구현예에 있어서, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.01% 내지 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.2 내지 5.8인, 제형.
263. 구현예 244 내지 262 중 어느 한 구현예에 있어서, 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.5인, 제형.
264. 구현예 244 내지 263 중 어느 한 구현예에 있어서, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.03% 내지 0.05%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.2 내지 5.8인, 제형.
265. 구현예 244 내지 264 중 어느 한 구현예에 있어서, 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.04%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.5인, 제형.
266. 구현예 244 내지 265 중 어느 한 구현예에 있어서, 5 mg/mL 내지 15 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.01% 내지 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.2 내지 5.8인, 제형.
267. 구현예 244 내지 266 중 어느 한 구현예에 있어서, 10 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.5인, 제형.
268. 구현예 244 내지 267 중 어느 한 구현예에 있어서, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.01% 내지 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.7 내지 6.3인, 제형.
269. 구현예 244 내지 268 중 어느 한 구현예에 있어서, 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 6.0인, 제형.
270. 구현예 244 내지 269 중 어느 한 구현예에 있어서, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.01% 내지 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 4.9 내지 5.5인, 제형.
271. 구현예 244 내지 270 중 어느 한 구현예에 있어서, 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.2인, 제형.
272. 구현예 244 내지 271 중 어느 한 구현예에 있어서, 15 mg/mL 내지 25 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 15 mM 내지 25 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 200 mM 내지 300 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.01% 내지 0.03%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.5 내지 6.1인, 제형.
273. 구현예 244 내지 272 중 어느 한 구현예에 있어서, 20 mg/mL의 항체 약물 접합체, 히스티딘을 포함하는 20 mM의 완충제, 수크로스를 포함하는 240 mM의 안정화제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.02%의 계면활성제를 포함하고, 제형의 pH가 5.8인, 제형.
274. 구현예 244 내지 273 중 어느 한 구현예의 제형으로부터 동결건조된 동결건조 제형.
275. 구현예 274에 있어서, 제형의 5 mL 내지 5.5 mL가 동결건조된, 동결건조 제형.
276. 구현예 274 또는 275에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 5℃ 또는 25℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형과 비교하여, D가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 안정적인, 동결건조 제형.
277. 구현예 274 내지 276 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형과 비교하여, D가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 안정적인, 동결건조 제형.
278. 구현예 274 내지 277 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 5℃ 또는 25℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형과 비교하여, 개환 입체형태를 갖는 D의 백분율이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 낮은, 동결건조 제형.
279. 구현예 274 내지 278 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 동결건조되지 않은 그 외에는 동일한 제형과 비교하여, 개환 입체형태를 갖는 D의 백분율이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 낮은, 동결건조 제형.
280. 구현예 274 내지 279 중 어느 한 구현예에 있어서, 80 mg 내지 120 mg(예를 들어, 107 mg)의 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조 제형.
281. 구현예 274 내지 280 중 어느 한 구현예의 동결건조 제형으로부터 재구성된 액상 제형.
282. 구현예 244 내지 281 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 SEC로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 제형 내 단량체 수준이 적어도 95%, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99%인, 제형.
283. 구현예 244 내지 282 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 SEC로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 제형 내 단편 수준이 3% 미만, 예를 들어 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만인, 제형.
284. 구현예 244 내지 283 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 SEC로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 제형 내 응집체 수준이 3% 미만, 예를 들어 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만인, 제형.
285. 구현예 244 내지 284 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 SEC로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 또는 8주 동안 보관 후, 분해 수준이 2% 미만, 예를 들어 1.5%, 1%, 또는 0.5% 미만인, 제형.
286. 구현예 244 내지 285 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 제형 내 10 μm 이상의 입자 수준이 약 300개 입자/ml 미만, 예를 들어 약 280개 입자/mL 미만, 약 260개 입자/mL 미만, 약 240개 입자/mL 미만, 약 220개 입자/mL 미만, 약 200개 입자/mL 미만, 약 180개 입자/mL 미만, 약 160개 입자/mL 미만, 약 140개 입자/mL 미만, 약 120개 입자/mL 미만, 100개 입자/mL 미만, 80개 입자/mL, 60개 입자/mL, 40개 입자/mL, 20개 입자/mL, 또는 10개 입자/mL인, 제형.
287. 구현예 244 내지 286 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 또는 8주 동안 보관 후, 제형 내 10 μm 이상의 입자 수준이 3배 이하, 예를 들어 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5배 이하만큼 증가되는, 제형.
288. 구현예 244 내지 287 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 또는 8주 동안 보관 후, 제형 내 25 μm 초과의 입자 수준이 3배 이하, 예를 들어 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5배 이하만큼 증가되는, 제형.
289. 구현예 244 내지 288 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 광 차폐로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 제형 내 25 μm 초과의 입자 수준이 20개 입자/mL 미만, 예를 들어 15개 입자/mL, 10개 입자/mL, 5개 입자/mL, 또는 2개 입자/mL 미만인, 제형.
290. 구현예 244 내지 289 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 모세관 전기영동으로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 불순물 수준이 15% 미만, 예를 들어 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만인, 제형.
291. 구현예 244 내지 290 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 모세관 전기영동으로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 또는 8주 동안 보관 후, 불순물 수준이 20% 이하, 예를 들어 15%, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 이하만큼 증가되는, 제형.
292. 구현예 244 내지 291 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 모세관 구역 전기영동(CZE)으로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 중성 변이체 수준이 50% 초과, 예를 들어 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과인, 제형.
293. 구현예 244 내지 292 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 또는 8주 동안 보관 후, 중성 변이체 수준이 20% 이하, 예를 들어 15%, 10%, 5%, 또는 2% 이하만큼 감소되는, 제형.
294. 구현예 244 내지 293 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 산성 변이체 수준이 30% 미만, 예를 들어 25%, 20%, 15%, 5%, 또는 2% 미만인, 제형.
295. 구현예 244 내지 294 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 또는 8주 동안 보관 후, 산성 변이체 수준이 50% 이하, 예를 들어 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이하만큼 증가되는, 제형.
296. 구현예 244 내지 295 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 0주, 4주, 또는 8주 동안 보관 후, 염기성 변이체 수준이 30% 미만, 예를 들어 25%, 20%, 15%, 5%, 또는 2% 미만인, 제형.
297. 구현예 244 내지 296 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 CZE로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 또는 8주 동안 보관 후, 염기성 변이체 수준이 50% 이하, 예를 들어 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이하만큼 증가되는, 제형.
298. 구현예 244 내지 297 중 어느 한 구현예에 있어서, 예를 들어 생체활성 분석으로 측정시, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 8주 동안 보관 후, 효능이 25% 이하, 예를 들어 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 2% 이하만큼 감소되는, 제형.
299. 구현예 244 내지 298 중 어느 한 구현예에 있어서, 제형의 삼투질 농도가 200 mOsm/L 내지 400 mOsm/L, 예를 들어 200 mOsm/L 내지 300 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 290 mOsm/L 내지 310 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 290 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 310 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 330 mOsm/L 내지 350 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 310 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 290 mOsm/L, 250 mOsm/L 내지 270 mOsm/L, 260 mOsm/L 내지 280 mOsm/L, 270 mOsm/L 내지 290 mOsm/L, 280 mOsm/L 내지 300 mOsm/L, 300 mOsm/L 내지 320 mOsm/L, 310 mOsm/L 내지 330 mOsm/L, 또는 320 mOsm/L 내지 340 mOsm/L, 예를 들어 200 mOsm/L, 250 mOsm/L, 260 mOsm/L, 270 mOsm/L, 280 mOsm/L, 290 mOsm/L, 300 mOsm/L, 310 mOsm/L, 320 mOsm/L, 330 mOsm/L, 340 mOsm/L, 350 mOsm/L, 또는 400 mOsm/L인, 제형.
300. 구현예 274 내지 299 중 어느 한 구현예의 동결건조 제형을 포함하는 용기.
301. 구현예 300에 있어서, 바이알, 예를 들어 20R 유리 바이알 또는 25R 유리 바이알인 용기.
302. 구현예 300 또는 301에 있어서, 마개 및 캡(예를 들어, 플립-오프 알루미늄 캡)을 추가로 포함하는 용기.
303. 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 대상체에게 구현예 244 내지 299 중 어느 한 구현예의 제형을 투여하는 단계를 포함하고, 암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, 암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하는, 방법.
304. 구현예 303에 있어서, 암이 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종, 또는 이의 전이암인, 방법.
305. 구현예 304에 있어서, 암종이 간세포 암종 또는 이의 전이성 병변인, 방법.
306. 구현예 304에 있어서, 흑색종이 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 점막 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 이의 전이성 병변인, 방법.
307. 구현예 303 내지 306 중 어느 한 구현예에 있어서, 제형이 하나 이상의 추가 치료 화합물과 조합하여 환자에게 투여되는, 방법.
308. 구현예 303 내지 307 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가 치료 화합물이 표준 치료 화학요법제, MDM2 억제제, MRC2 억제제, PKC 억제제, MAPK 억제제, 공동자극 분자, 또는 체크포인트 억제제로부터 선택되는, 방법.
309. 구현예 308에 있어서, 공동자극 분자가 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING, 또는 CD83 리간드의 작용제로부터 선택되는, 방법.
310. 구현예 309에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타의 억제제로부터 선택되는, 방법.
311. 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 구현예 244 내지 299 중 어느 한 구현예의 제형으로서, 상기 방법이 대상체에게 구현예 244 내지 299 중 어느 한 구현예의 제형을 투여하는 단계를 포함하고, 암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, 암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하는, 제형.
312. 구현예 311에 있어서, 암이 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종, 또는 이의 전이성 병변인, 제형.
313. 구현예 312에 있어서, 암종이 간세포 암종 또는 이의 전이성 병변인, 제형.
314. 구현예 312에 있어서, 흑색종이 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 점막 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 이의 전이성 병변인, 제형.
315. 구현예 311 내지 314 중 어느 한 구현예에 있어서, 제형이 하나 이상의 추가 치료 화합물과 조합하여 환자에게 투여되는, 제형.
316. 구현예 311 내지 315 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가 치료 화합물이 표준 치료 화학요법제, MDM2 억제제, MRC2 억제제, PKC 억제제, MAPK 억제제, 공동자극 분자, 또는 체크포인트 억제제로부터 선택되는, 제형.
317. 구현예 311 내지 316 중 어느 한 구현예에 있어서, 공동자극 분자가 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING, 또는 CD83 리간드의 작용제로부터 선택되는, 제형.
318. 구현예 311 내지 317 중 어느 한 구현예에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타의 억제제로부터 선택되는, 제형.
319. 구현예 202 내지 243 중 어느 한 구현예, 구현예 244 내지 299 중 어느 한 구현예, 구현예 300 내지 302 중 어느 한 구현예, 구현예 303 내지 310 중 어느 한 구현예, 또는 구현예 311 내지 318 중 어느 한 구현예에 있어서, PMEL17에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다음을 포함하는, 공정, 제형, 용기, 방법, 또는 제형:
(a) 서열번호 1, 4, 5 또는 7의 중쇄 CDR1(상보성 결정 영역 1), 서열번호 2, 6 또는 8의 중쇄 CDR2(상보성 결정 영역 2), 및 서열번호 3 또는 9의 중쇄 CDR3(상보성 결정 영역 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 14, 17 또는 20의 경쇄 CDR1(상보성 결정 영역 1), 서열번호 15 또는 18의 경쇄 CDR2(상보성 결정 영역 2), 및 서열번호 16 또는 19의 경쇄 CDR3(상보성 결정 영역 3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열번호 33, 36, 37 또는 39의 중쇄 CDR1, 서열번호 34, 38 또는 40의 중쇄 CDR2, 서열번호 35 또는 41의 중쇄 CDR3, 서열번호 46, 49 또는 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48 또는 51의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(c) 서열번호 5, 7, 57 또는 60의 중쇄 CDR1, 서열번호 58, 61 또는 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 59 또는 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 68, 71 또는 74의 경쇄 CDR1, 서열번호 69 또는 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70 또는 73의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(d) 서열번호 79, 82, 83 또는 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 80, 84 또는 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 81 또는 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 92, 95 또는 98의 경쇄 CDR1, 서열번호 93 또는 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94 또는 97의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(e) 서열번호 103, 106, 107 또는 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 104, 108 또는 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 105 또는 111의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117 또는 118의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(f) 서열번호 123, 126, 127 또는 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 124, 128 또는 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 125 또는 131의 중쇄 CDR3, 서열번호 136, 139 또는 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 137 또는 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138 또는 141의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(g) 서열번호 123, 126, 127 또는 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 124, 128 또는 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 147 또는 148의 중쇄 CDR3, 서열번호 153, 156 또는 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50 또는 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155 또는 157의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(h) 서열번호 103, 106, 107 또는 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 104, 108 또는 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 163 또는 164의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169 또는 170의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(i) 서열번호 175, 178, 179 또는 181의 중쇄 CDR1, 서열번호 176, 180 또는 182의 중쇄 CDR2, 서열번호 177 또는 183의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188 또는 189의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(j) 서열번호 103, 106, 107 또는 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 104, 108 또는 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 194 또는 195의 중쇄 CDR3, 서열번호 49, 52 또는 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47 또는 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200 또는 201의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(k) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 208 또는 214의 중쇄 CDR3, 서열번호 153, 156 또는 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50 또는 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219 또는 220의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(l) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 225 또는 226의 중쇄 CDR3, 서열번호 136, 139 또는 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 137 또는 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231 또는 232의 경쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(m) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 HCDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 HCDR2, 및 서열번호 237 또는 238의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243, 245 또는 247의 LCDR1, 서열번호 47 또는 50의 LCDR2, 및 서열번호 244 또는 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(n) 서열번호 206, 209, 210 또는 212의 HCDR1, 서열번호 207, 211 또는 213의 HCDR2, 및 서열번호 252 또는 253의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153, 156 또는 158의 LCDR1, 서열번호 50 또는 154의 LCDR2, 및 서열번호 258 또는 259의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(o) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(p) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(q) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3;
(r) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(s) 서열번호 33의 중쇄 CDR1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(t) 서열번호 36의 중쇄 CDR1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 46의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(u) 서열번호 37의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3;
(v) 서열번호 39의 중쇄 CDR1, 서열번호 40의 중쇄 CDR2, 서열번호 41의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 48의 경쇄 CDR3;
(w) 서열번호 57의 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 69의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
(x) 서열번호 60의 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 69의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
(y) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 61의 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 중쇄 CDR3, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 73의 경쇄 CDR3;
(z) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 62의 중쇄 CDR2, 서열번호 63의 중쇄 CDR3, 서열번호 74의 경쇄 CDR1, 서열번호 72의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 70의 경쇄 CDR3;
(aa) 서열번호 79의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 92의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
(bb) 서열번호 82의 중쇄 CDR1, 서열번호 80의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 92의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
(cc) 서열번호 83의 중쇄 CDR1, 서열번호 84의 중쇄 CDR2, 서열번호 81의 중쇄 CDR3, 서열번호 95의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 97의 경쇄 CDR3;
(dd) 서열번호 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 87의 중쇄 CDR3, 서열번호 98의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 94의 경쇄 CDR3;
(ee) 서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
(ff) 서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
(gg) 서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 118의 경쇄 CDR3;
(hh) 서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 111의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3;
(ii) 서열번호 123의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
(jj) 서열번호 126의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
(kk) 서열번호 127의 중쇄 CDR1, 서열번호 128의 중쇄 CDR2, 서열번호 125의 중쇄 CDR3, 서열번호 139의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 141의 경쇄 CDR3;
(ll) 서열번호 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 131의 중쇄 CDR3, 서열번호 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3;
(mm) 서열번호 123의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
(nn) 서열번호 126의 중쇄 CDR1, 서열번호 124의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
(oo) 서열번호 127의 중쇄 CDR1, 서열번호 128의 중쇄 CDR2, 서열번호 147의 중쇄 CDR3, 서열번호 156의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 157의 경쇄 CDR3;
(pp) 서열번호 129의 중쇄 CDR1, 서열번호 130의 중쇄 CDR2, 서열번호 148의 중쇄 CDR3, 서열번호 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 155의 경쇄 CDR3;
(qq) 서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
(rr) 서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
(ss) 서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 163의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 170의 경쇄 CDR3;
(tt) 서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 164의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 169의 경쇄 CDR3;
(uu) 서열번호 175의 중쇄 CDR1, 서열번호 176의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
(vv) 서열번호 178의 중쇄 CDR1, 서열번호 176의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
(ww) 서열번호 179의 중쇄 CDR1, 서열번호 180의 중쇄 CDR2, 서열번호 177의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 189의 경쇄 CDR3;
(xx) 서열번호 181의 중쇄 CDR1, 서열번호 182의 중쇄 CDR2, 서열번호 183의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 188의 경쇄 CDR3;
(yy) 서열번호 103의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
(zz) 서열번호 106의 중쇄 CDR1, 서열번호 104의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 116의 경쇄 CDR1, 서열번호 47의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
(aaa) 서열번호 107의 중쇄 CDR1, 서열번호 108의 중쇄 CDR2, 서열번호 194의 중쇄 CDR3, 서열번호 49의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 201의 경쇄 CDR3;
(bbb) 서열번호 109의 중쇄 CDR1, 서열번호 110의 중쇄 CDR2, 서열번호 195의 중쇄 CDR3, 서열번호 52의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3;
(ccc) 서열번호 206의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
(ddd) 서열번호 209의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 153의 경쇄 CDR1, 서열번호 154의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
(eee) 서열번호 210의 중쇄 CDR1, 서열번호 211의 중쇄 CDR2, 서열번호 208의 중쇄 CDR3, 서열번호 156의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 220의 경쇄 CDR3;
(fff) 서열번호 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 214의 중쇄 CDR3, 서열번호 158의 경쇄 CDR1, 서열번호 50의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 219의 경쇄 CDR3;
(ggg) 서열번호 206의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
(hhh) 서열번호 209의 중쇄 CDR1, 서열번호 207의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
(iii) 서열번호 210의 중쇄 CDR1, 서열번호 211의 중쇄 CDR2, 서열번호 225의 중쇄 CDR3, 서열번호 139의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 232의 경쇄 CDR3;
(jjj) 서열번호 212의 중쇄 CDR1, 서열번호 213의 중쇄 CDR2, 서열번호 226의 중쇄 CDR3, 서열번호 142의 경쇄 CDR1, 서열번호 140의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 231의 경쇄 CDR3;
(kkk) 서열번호 206의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243의 LCDR1, 서열번호 47의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(lll) 서열번호 209의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 243의 LCDR1, 서열번호 47의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(mmm) 서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 및 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 245의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(nnn) 서열번호 212의 HCDR1, 서열번호 213의 HCDR2, 및 서열번호 238의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 247의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 244의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ooo) 서열번호 206의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153의 LCDR1, 서열번호 154의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ppp) 서열번호 209의 HCDR1, 서열번호 207의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 153의 LCDR1, 서열번호 154의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(qqq) 서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 및 서열번호 252의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 156의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 259의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(rrr) 서열번호 212의 HCDR1, 서열번호 213의 HCDR2, 및 서열번호 253의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 158의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 258의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
320. 구현예 202 내지 243 또는 319 중 어느 한 구현예, 구현예 244 내지 299 또는 319 중 어느 한 구현예, 구현예 300 내지 302 또는 319 중 어느 한 구현예, 구현예 303 내지 310 또는 319 중 어느 한 구현예, 또는 구현예 311 내지 319 중 어느 한 구현예에 있어서, PMEL17에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다음을 포함하는, 공정, 제형, 용기, 방법, 또는 제형:
(a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(c) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(d) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(e) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(f) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(g) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(h) 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(i) 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(j) 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(k) 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(l) 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(m) 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(n) 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 233의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(o) 서열번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(p) 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
321. 구현예 202 내지 243, 319, 또는 320 중 어느 한 구현예, 구현예 244 내지 299, 319, 또는 320 중 어느 한 구현예, 구현예 300 내지 302, 319, 또는 320 중 어느 한 구현예, 구현예 303 내지 310, 319, 또는 320 중 어느 한 구현예, 또는 구현예 311 내지 320 중 어느 한 구현예에 있어서, PMEL17에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다음을 포함하는, 공정, 제형, 용기, 방법, 또는 제형:
(a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(c) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(e) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(f) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(g) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(h) 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(i) 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(j) 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(k) 서열번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(l) 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 204의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(m) 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(n) 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(o) 서열번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(p) 서열번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(q) 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(r) 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(s) 서열번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
322. 구현예 202 내지 243 또는 319 내지 321 중 어느 한 구현예, 구현예 244 내지 299 또는 319 내지 321 중 어느 한 구현예, 구현예 300 내지 302 또는 319 내지 321 중 어느 한 구현예, 구현예 303 내지 310 또는 319 내지 321 중 어느 한 구현예, 또는 구현예 311 내지 321 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하나 이상의 시스테인 치환을 포함하는, 공정, 제형, 용기, 방법, 또는 제형.
323. 구현예 202 내지 243 또는 319 내지 322 중 어느 한 구현예, 구현예 244 내지 299 또는 319 내지 322 중 어느 한 구현예, 구현예 300 내지 302 또는 319 내지 322 중 어느 한 구현예, 구현예 303 내지 310 또는 319 내지 322 중 어느 한 구현예, 또는 구현예 311 내지 322 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 E152C, S375C, 또는 E152C 및 S375C 둘 모두로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 치환을 포함하는(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨), 공정, 제형, 용기, 방법, 또는 제형.
324. 구현예 202 내지 243 또는 319 내지 323 중 어느 한 구현예, 구현예 244 내지 299 또는 319 내지 323 중 어느 한 구현예, 구현예 300 내지 302 또는 319 내지 323 중 어느 한 구현예, 구현예 303 내지 310 또는 319 내지 323 중 어느 한 구현예, 또는 구현예 311 내지 323 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체가 단일클론 항체, 단리된 항체, 합성 항체, 또는 조작된 항체인, 공정, 제형, 용기, 방법, 또는 제형.
325. 구현예 237 내지 243 또는 319 내지 324 중 어느 한 구현예, 구현예 244 내지 299 또는 319 내지 324 중 어느 한 구현예, 구현예 300 내지 302 또는 319 내지 324 중 어느 한 구현예, 구현예 303 내지 310 또는 319 내지 324 중 어느 한 구현예, 또는 구현예 311 내지 324 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 약물 접합체가 화학식 (C)를 포함하는, 공정, 제형, 용기, 방법, 또는 제형:
[화학식 (C)]
Ab-(LA-(D)n)y
[식에서,
D는 GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, GNAQ 억제제, GNA11 억제제, 또는 GNAQ 및 GNA11의 억제제)이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이고;
LA는 링커(예를 들어, 본원에 기재된 링커)이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
326. 구현예 325에 있어서, 상기 n이 1인, 공정 또는 제형.
327. 구현예 325 또는 326에 있어서, 상기 y가 2인, 공정 또는 제형.
328. 구현예 325 내지 327 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커가 절단성 링커 또는 비절단성 링커인, 공정 또는 제형.
329. 구현예 325 내지 328 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커가 ValCit 펩티드 링커를 포함하는, 공정 또는 제형.
330. 구현예 325 내지 329 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 약물 모이어티가 GNAQ 및 GNA11의 억제제인, 공정 또는 제형.
331. 구현예 325 내지 330 중 어느 한 구현예에 있어서, D가 하기 식인, 공정 또는 제형:
.
332. 구현예 325 내지 331 중 어느 한 구현예에 있어서, D가 화합물 (A1) 또는 화합물 2 내지 15 중 어느 하나인, 공정 또는 제형.
333. 구현예 325 내지 331 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 약물 접합체가 하기 구조식을 갖는, 공정 또는 제형:
.
334. 구현예 325 내지 330 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 약물 접합체가 하기 화학식 (C-2)를 갖는, 공정 또는 제형:
[화학식 (C-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
335. 구현예 325 내지 330 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 약물 접합체가 하기 화학식 (Cb-2)를 갖는, 공정 또는 제형:
[화학식 (Cb-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1, Rs, 및 Rt는 각각 독립적으로 메틸, 메틸티오메틸, 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
336. 구현예 325 내지 330 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 약물 접합체가 하기 화학식 (Cc-2)를 갖는, 공정 또는 제형:
[화학식 (Cc-2)]
,
[식에서,
R0은 메틸 또는 에틸이고;
R1은 메틸 또는 이소프로필이고;
R2는 메틸 또는 에틸이고;
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
X1은 2가 커플링기이고;
X2는 자가-희생 스페이서이고;
L1은 2가 펩티드 링커이고;
L2는 결합 또는 링커이고,
y는 1, 2, 3, 또는 4임].
337. 치료 방법으로서, 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC)를, 예를 들어 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 2주에 1회 정맥내로, 투여하는 단계를 포함하고, 임의로 ADC가 하기 구조식을 가지며:
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
y는 2임];
암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하고,
이로써 암을 치료하는, 방법.
338. 구현예 337에 있어서, ADC가 2 mg/kg 내지 15 mg/kg의 용량으로 2주에 1회 정맥내로 투여되는, 방법.
339. 구현예 337에 있어서, ADC가 1 mg/kg, 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 12 mg/kg, 또는 16 mg/kg의 용량으로 2주에 1회 정맥내로 투여되는, 방법.
340. 구현예 337 내지 339 중 어느 한 구현예에 있어서, 암이 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종, 또는 이의 전이암인, 방법.
341. 구현예 340에 있어서, 암종이 간세포 암종 또는 이의 전이성 병변인, 방법.
342. 구현예 340에 있어서, 흑색종이 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 악성 흑색종, 안구 흑색종, 점막 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 또는 이의 전이성 병변인, 방법.
343. 구현예 337 내지 342 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 있는, 방법.
344. 구현예 337 내지 342 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 없는, 방법.
345. 구현예 337 내지 344 중 어느 한 구현예에 있어서, Ab가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
346. 구현예 337 내지 345 중 어느 한 구현예에 있어서, Ab가 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.
347. 구현예 346에 있어서, 중쇄가 Asn306에 위치한 N-글리코실화 부위를 포함하는, 방법.
348. 구현예 337 내지 347 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체의 샘플에서 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
349. 구현예 348에 있어서, 샘플이 ADC의 투여 전, 투여 중, 및/또는 투여 후에 대상체로부터 채취되는, 방법.
350. 구현예 348 또는 349에 있어서, 샘플이 종양 샘플, 종양 인접 조직 샘플, 또는 체액 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 척수액, 또는 소변)인, 방법.
351. 대상체의 암 치료용 의약의 제조에 있어서 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC)의 용도로서, 임의로 ADC가 하기 구조식을 가지며:
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
y는 2임];
암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하고, 임의로 ADC가 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 2주에 1회 정맥내로, 투여되는, 용도.
352. 구현예 351에 있어서, ADC가 2 mg/kg 내지 15 mg/kg의 용량으로 2주에 1회 정맥내로 투여되는, 용도.
353. 구현예 351에 있어서, ADC가 1 mg/kg, 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 12 mg/kg, 또는 16 mg/kg의 용량으로 2주에 1회 정맥내로 투여되는, 용도.
354. 구현예 351 내지 353 중 어느 한 구현예에 있어서, 암이 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종, 또는 이의 전이암인, 용도.
355. 구현예 354에 있어서, 암종이 간세포 암종 또는 이의 전이성 병변인, 용도.
356. 구현예 354에 있어서, 흑색종이 악성 흑색종, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 점막 흑색종, 또는 이의 전이성 병변인, 용도.
357. 구현예 351 내지 356 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 있는, 용도.
358. 구현예 351 내지 356 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 없는, 용도.
359. 구현예 351 내지 358 중 어느 한 구현예에 있어서, Ab가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 용도.
360. 구현예 351 내지 359 중 어느 한 구현예에 있어서, Ab가 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 용도.
361. 구현예 360에 있어서, 중쇄가 Asn306에 위치한 N-글리코실화 부위를 포함하는, 용도.
362. 구현예 351 내지 361 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체의 샘플에서 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 추가로 포함하는 용도.
363. 구현예 362에 있어서, 샘플이 ADC의 투여 전, 투여 중, 및/또는 투여 후에 대상체로부터 채취되는, 용도.
364. 구현예 362 또는 363에 있어서, 샘플이 종양 샘플, 종양 인접 조직 샘플, 또는 체액 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 척수액, 또는 소변)인, 용도.
365. 대상체의 암 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC)로서, 임의로 ADC가 하기 구조식을 가지며:
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
y는 2임];
암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하고, 임의로 ADC가 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 2주에 1회 정맥내로, 투여되는, ADC.
366. 구현예 365에 있어서, ADC가 2 mg/kg 내지 15 mg/kg의 용량으로 2주에 1회 정맥내로 투여되는, ADC.
367. 구현예 365에 있어서, ADC가 1 mg/kg, 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 12 mg/kg, 또는 16 mg/kg의 용량으로 2주에 1회 정맥내로 투여되는, ADC.
368. 구현예 355 내지 367 중 어느 한 구현예에 있어서, 암이 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 안암, 안구 신생물, 흑색종, 또는 이의 전이암인, ADC.
369. 구현예 368에 있어서, 암종이 간세포 암종 또는 이의 전이성 병변인, ADC.
370. 구현예 368에 있어서, 흑색종이 악성 흑색종, 포도막 흑색종, 비포도막 흑색종, 안구 흑색종, 피하 흑색종, 피부 흑색종, 점막 흑색종, 또는 이의 전이성 병변인, ADC.
371. 구현예 365 내지 370 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 있는, ADC.
372. 구현예 365 내지 370 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 ADC의 투여 전에 테벤타푸스프 치료를 받은 적이 없는, ADC.
373. 구현예 365 내지 372 중 어느 한 구현예에 있어서, Ab가 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, ADC.
374. 구현예 365 내지 373 중 어느 한 구현예에 있어서, Ab가 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, ADC.
375. 구현예 374에 있어서, 중쇄가 Asn306에 위치한 N-글리코실화 부위를 포함하는, ADC.
376. 구현예 365 내지 375 중 어느 한 구현예에 있어서, 사용이 대상체의 샘플에서 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 추가로 포함하는, ADC.
377. 구현예 376에 있어서, 샘플이 ADC의 투여 전, 투여 중, 및/또는 투여 후에 대상체로부터 채취되는, ADC.
378. 구현예 376 또는 377에 있어서, 샘플이 종양 샘플, 종양 인접 조직 샘플, 또는 체액 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 척수액, 또는 소변)인, ADC.
379. 대상체의 암 치료를 평가하는 방법으로서, 대상체의 샘플에서 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하고, 치료는 대상체에게 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC)를, 예를 들어 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 2주에 1회 정맥내로, 투여하는 것을 포함하고, 임의로 ADC가 하기 구조식을 가지며:
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
y는 2임];
암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하고,
이로써 대상체의 암 치료를 평가하는, 방법.
380. 대상체의 암 진행을 평가하는 방법으로서, 대상체의 샘플에서 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하고, 대상체가 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC)를, 예를 들어 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로, 예를 들어 2주에 1회 정맥내로, 투여받았거나, 투여 중이거나 투여할 예정이고, 임의로 ADC가 하기 구조식을 가지며:
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
y는 2임];
암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하고,
이로써 대상체의 암 진행을 평가하는, 방법.
381. 암이 있는 대상체에 대한 치료를 선택하는 방법으로서, 대상체의 샘플에서 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하고, 치료는 대상체에게 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC)를, 예를 들어 본원에 기재된 용량으로(예를 들어, 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로), 예를 들어 2주에 1회 정맥내로, 투여하는 것을 포함하고, 임의로 ADC가 하기 구조식을 가지며:
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
y는 2임];
암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하고,
이로써 암이 있는 대상체에 대한 치료를 선택하는, 방법.
382. 암 치료를 위한 대상체를 선택하는 방법으로서, 대상체의 샘플에서 PMEL17, pERK, CD8, PD-L1, DUSP6, RASGRP3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하고, 치료는 대상체에게 본원에 기재된 항체 약물 접합체(ADC)를, 예를 들어 본원에 기재된 용량으로(예를 들어, 1 mg/kg 내지 16 mg/kg의 용량으로), 예를 들어 2주에 1회 정맥내로, 투여하는 것을 포함하고, 임의로 ADC가 하기 구조식을 가지며:
,
[식에서,
Ab는 인간 PMEL17 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(b) 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1, 서열번호 15의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
(c) 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
(d) 서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 18의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 16의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
y는 2임];
암이 PMEL17을 발현하고 GNAQ 또는 GNA11 유전자의 돌연변이를 포함하거나, PMEL17을 발현하고 GNAQ, GNA11, 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하고,
이로써 암 치료를 위한 대상체를 선택하는, 방법.
하기의 실시예는 본 발명의 일부 구현예를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니며; 당업자에게 알려진 다른 절차, 방법, 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 예시적인 특성에 의해 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 크로모박테리움 백시니이 의 유전자 조작 및 화합물 (A1)의 발효적 생성 및 단리
화합물 (A1)의 대안적이고 확장가능한 생성 방법을 확인하기 위해, 게놈 서열 데이터베이스 및 시퀀싱 작업으로부터 생성된 게놈 서열의 박테리아 게놈에 대한 게놈 마이닝 작업을 시작하였다. 칸디다투스 B. 크레나타로부터의 화합물 (A1)-BGC의 번역된 아미노산 서열을 쿼리 서열로 사용하였다. 번역된 아미노산 서열의 상동성이 매우 높고 단백질 기능이 동일하게 예측되는 클러스터가 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150의 게놈에서 발견되었다.
화합물 (A1)의 생성 방법
크로모박테리움 백시니이 DSM 25150 - 화합물 (A1)을 생성하는 박테리아
균주의 기원
C. 백시니이라고도 하는 박테리아 균주 크로모박테리움 백시니이 DSM 25150(= ATCC BAA-2314, = NRRL B-50840, = MWU205)는 독일의 미생물 및 세포 배양 컬렉션 DSMZ에서 입수하였다.
형태학적 특성
크로모박테리움은 그람-음성 간상(rod-shaped) 박테리아 속이다. C. 백시니이는 LB 한천에서 쉽게 자라며, 28℃에서 2일 동안 인큐베이션하면 비올라세인의 생성으로 인해 어두운 보라색 금속 광택을 지닌 특유의 매끄러운 저볼록형 콜로니를 생성한다.
C. 백시니이 DSM 25150의 게놈 시퀀싱
세포를 12 mL의 LB에서 200 rpm으로 30℃에서 밤새 성장시켰다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 4.5 mL SET 버퍼(2.42 g/L Tris-(하이드록시메틸)-아미노메탄, 9.31 g/L NaEDTA, 4.38 g/L NaCl)에 재현탁시켰다. 유리 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화하고, 5 mL의 페놀을 첨가하였다. 이어서, 샘플을 2분 동안 완전히 진탕하고 4℃에서 12000 x g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브에 옮기고 페놀 추출을 2차 반복하였다. 이후 5 mL의 클로로포름을 첨가하고, 샘플을 1분 동안 완전히 진탕한 후, 4℃에서 12000-x g로 30분 동안 원심분리하였다. 상부의 상을 새로운 튜브에 옮겼다. 2차 클로로포름 추출 단계 후, 5 μL/mL의 RNAase A를 첨가하고, 샘플을 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플 부피의 2배에 해당하는 이소프로판올을 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 접종 루프를 사용하여 이소프로판올 혼합물에서 게놈 DNA를 조심스럽게 꺼내고, 70% 에탄올 500 μL를 함유하는 Eppendorf 튜브에 옮겼다. 12000-x g로 10분 동안 원심분리 후, 상청액을 버리고 70% 에탄올 500 μL로 교체하였다. 2차 세척 단계 후, 상청액을 다시 버리고, 펠릿을 공기 건조시킨 후, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 50 μL에 용해시켰다.
SMRT(Single Molecule, Real-time) Link 버전: 4.0.0.190159를 사용하여 PacBio의 Sequel 시스템에서 게놈 시퀀싱을 수행하였다. 결합 키트로서 Sequel™ Binding Kit 2.0을 적용하고, Sequel™ Sequencing Plate 2.0을 시퀀싱 키트 플레이트로서 사용하였다.
계층적 게놈 조립 프로세스 HGAP 버전 4(Chin et al. (2013) Nat Methods;10(6):563-9)를 사용하여 C. 백시니이 게놈의 드노보 조립을 수행하였다. 조립 결과 게놈 크기가 5091614 bp이고 평균 적용 범위가 434.0인 하나의 닫힌 콘티그가 생성되었다.
C. 백시니이 게놈에서 오픈 리딩 프레임을 확인하기 위해, 3 유전자 예측 프로그램 Critica(Badger et al. (1999) Mol Biol Evol 16(4):512-24), Glimmer(Kelley et al. (2012) Nucleic Acids Res 40(1)), 및 Prodigal(Hyatt et al. (2010) BMC Bioinformatics 11:119)을 적용하였다. 이후 antiSMASH 5.0(Blin et al. (2019) Nucleic acids Res. 2;47(W1):W81-W87)을 사용하여 2차 대사산물 생합성 유전자 클러스터에 대해 게놈을 분석하였다.
게놈 마이닝에 의한 C. 백시니이 DSM 25150 내 화합물 (A1)-BGC의 확인
B. 크레나타로부터의 화합물 (A1)-BGC의 번역된 아미노산 서열을 서열 데이터베이스의 박테리아 게놈 및 PacBio 시퀀싱 기술로 수행된 시퀀싱 작업으로부터의 박테리아 게놈에 대한 게놈 마이닝 작업에서 쿼리 서열로서 사용하였다. 번역된 아미노산 서열의 상동성이 매우 높고 단백질 기능이 동일하게 예측되는 클러스터가 C. 백시니이의 서열분석된 게놈에서 발견되었다. 본 실시예에서 생성된 서열은 매우 동일한 반복 서열 스트레치에 관한 PacBio 시퀀싱의 이점을 보여준다. 추가의 거대 NRPS 및 여러 전이가능 요소를 암호화하는 상류 및 하류 영역을 포함하여 완전한 화합물 (A1)-BGC를 확인할 수 있었다(GenBank 수탁번호: BankIt2437961 BSeq#1 MW732719). C. 백시니이에서 화합물 (A1)(frsA-H) 및 화합물 J(dis1-4)의 전이가능 요소 함유 BGC 상의 유전자 구조(76974 bp)는 도 1에 도시되어 있다. 화합물 (A1)-BGC 및 NRPS A를 포함하는 게놈 영역의 구조는 표 3에 추가로 제시되어 있다.
배양 조건
사용된 배양 배지에 대한 진탕 플라스크 총 부피의 비는 4 내지 5였다. C. 백시니이의 -80℃ 앰플을 해동하고, 25 mL의 LB(표 4) 배지에서 전배양물을 접종하는 데 사용하였다. 전배양물을 진폭 50 mm의 회전 진탕기에서 200 rpm으로 28℃에서 12~16시간 동안 배양하였다. 25 mL의 LB 배지의 주 배양물에 전배양물 1%를 접종하고, 이를 50 mm 진폭의 회전 진탕기에서 200 rpm으로 24℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 배양은 삼중으로 수행되었다. 배양물 채취시 배양액을 동결시키고 -20℃에서 적어도 24시간 동안 유지하였다.
분석 방법
HPLC-UV-MS 분석을 위한 샘플 준비
5 mL의 동결-해동 배양액을 15 mL 코니칼 원심분리 튜브에 옮기고 5 mL의 아세토니트릴과 완전히 혼합하였다. 2 g의 황산마그네슘 및 0.5 g의 아세트산나트륨을 혼합물에 첨가하고 격렬하게 진탕하였다. 혼합물을 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상 분리를 얻었다. 4 mL의 유기층을 시험관에 옮기고 용매를 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 400 μL의 DMSO에 용해시키고 실온에서 10분 동안 진탕하였다. 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 후, 용액의 분취량을 HPLC 바이알에 옮겼다. 이로써 샘플은 10배 농축된다.
샘플 분석
BEH C18 컬럼(1.7 μM, 2.1x100 mm 컬럼 + 2.1x10 mm 전치 컬럼; Waters AG)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 유량은 0.9 mL/분이었다. 컬럼 오븐을 60℃로 설정하였다. 용매 조성 및 구배는 표 6에 제공되어 있다. 220 nm 파장에서의 흡수를 주요 판독값으로 사용하였다. MS 신호와 CAD 신호를 동시에 기록하였다.
외부 표준물질(10, 50, 100, 200, 400 μg/mL 화합물 (A1))로 생성된 검량선(220 nm에서의 UV 피크 면적 기준)을 사용하여 UV로 A1의 정량화를 수행하였다. 샘플 및 표준물질 둘 모두에 대해 주입 부피는 1 μL였다.
게놈 통합에 의한 C. 백시니이 돌연변이체의 생성
다음 섹션에서는 안정적인 게놈 통합에 의해 생성된 C. 백시니이의 돌연변이체 생성에 대해 설명한다. 예시적인 C. 백시니이 돌연변이체는 표 7에 제시되어 있다. 예시적인 프로모터 서열은 표 8에 제시되어 있다. 프로모터 교환에 사용된 삽입 전략의 도식은 도 2에 도시되어 있다.
유전자 구성체의 생성
비올라세인, rbs, 또는 nptII 프로모터 및 A1 생합성 유전자 frsA의 처음 1200 bp를 포함하는 합성 DNA는 Genewiz에서 주문되어 pUC57 백본에 클로닝된 상태로 전달되었다. 모든 플라스미드 pUC57 프로모터 플라스미드를 E. 콜라이 XL1 Blue로 형질전환시키고, 50 μg/mL의 카나마이신이 함유된 LB 한천(표 5)에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고 다음 날, 루프를 50 μg/mL의 카나마이신이 함유된 50 mL의 LB 배지(표 4)에 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. Qiagen Plasmid Plus midi 키트를 사용하여 세 가지 pUC57 프로모터 플라스미드 모두의 Midi-prep을 수행하였다. pUC57 프로모터 플라스미드를 NotI 및 XbaI로 분해하여 각각의 프로모터-frsA 단편을 절단하였다. 이어서, 정제된 각각의 프로모터-frsA 단편(Macherey Nagel의 NucleoSpin gel and PCR clean up 키트)을, Roche의 Rapid DNA Ligation 키트를 사용하여, 내부 접합 벡터인 NotI 및 XbaI 사전분해 pApra 플라스미드에 클로닝하였다. 라이게이션 혼합물을 E. 콜라이 XL1 Blue 세포로 형질전환시키고, 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 LB 한천에 플레이팅하였다. 단일 클론이 나타날 때까지 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 LB 배지에서 단일 클론을 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, NucleoSpin plasmid Easy Pure 키트(Macherey Nagel)를 사용하여 플라스미드를 단리하고, 시퀀싱 또는 제한 분해를 통해 pApra-프로모터-frsA 구성체를 검증하였다. J23119, Plpp, PS12burk, 또는 ErmE* 프로모터를 포함하는 프로모터 구성체의 경우, 프로모터 서열 및 frsA의 처음 1200 bp를 Genewiz 또는 Genscript에서 합성적으로 생성하고, 각 합성 회사에서 pApra 백본에 직접 삽입하였다. 비올라세인-BGC에서 vioB 유전자를 비활성화하기 위해, 인공 정지 코돈을 포함하는 1004 bp 길이의 합성 삽입물을 주문하고 Genewiz에서 플라스미드 pApra에 클로닝하였다. Qiagen Plasmid Plus midi 키트를 사용하여 pApra_vioB_KO의 midi-prep을 생성하였다. pApra_vioB_KO를 XbaI 및 NdeI로 분해한 후, 정제된 삽입물을 XbaI 및 NdeI 사전절단 pPhoto 백본(내부 벡터 백본)에 라이게이션하여 pPhoto_vioB_KO를 생성하였다. 라이게이션 혼합물을 E. 콜라이 XL1 blue 세포로 형질전환시키고, 50 μg/mL의 클로람페니콜이 함유된 LB 한천에 플레이팅하였다. 단일 클론이 나타날 때까지 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 μg/mL의 클로람페니콜이 함유된 LB 배지에서 단일 클론을 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, NucleoSpin plasmid Easy Pure 키트(Macherey Nagel)를 사용하여 플라스미드를 단리하고, XbaI 및 NdeI을 사용하여 대조 분해를 통해 검증하였다. 화합물 J-BGC의 파괴를 위해, 인공 정지 코돈을 포함하는 1053 bp 길이의 합성 삽입물을 주문하고 Genewiz에서 플라스미드 pUC57에 클로닝하였다. 플라스미드 pUC57-KO_dis를 E. 콜라이 XL1 Blue로 형질전환시키고, 50 μg/mL의 카나마이신이 함유된 LB 한천에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고 다음 날, 루프를 50 μg/mL의 카나마이신이 함유된 50 mL의 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. Qiagen Plasmid Plus midi 키트를 사용하여 pUC57-KO_dis의 midi-prep을 생성하였다. pUC57-KO_dis를 XbaI 및 EcoRV로 분해하여 KO_dis 단편을 수득하였다. 이어서, 정제된 KO_dis 단편(Macherey Nagel의 NucleoSpin gel and PCR clean up 키트)을, Roche의 Rapid DNA Ligation 키트를 사용하여, EcoRV 및 XbaI 사전분해 pApra 플라스미드에 클로닝하였다. 라이게이션 혼합물을 E. 콜라이 XL1 blue 세포로 형질전환시키고, 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 LB 한천에 플레이팅하였다. 단일 클론이 나타날 때까지 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 LB 배지에서 단일 클론을 37℃에서 밤새 배양하였다. XbaI 및 EcoRV를 사용하여 제한 분해를 통해 올바른 클론의 검증을 수행하였다.
전기 반응능 E. 콜라이 ST18의 제조
E. 콜라이 ST18 루프를 사용하여, 50 μg/mL의 5-아미노레불린산(영양요구성 돌연변이체의 성장에 절대적으로 필요한 보충제)이 보충된 10 mL의 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 배양물을 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 2 mL의 밤새 배양한 배양물을 사용하여, 50 μg/mL의 5-아미노레불린산이 보충된 250 mL의 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 0.4~0.6의 OD600까지 인큐베이션하였다. 배양물을 15~30분 동안 빙수조로 빠르게 옮기고, 안정적인 냉각을 위해 가끔식 선회시켰다. 이어서, 배양물을 빙냉 50 mL 튜브에 옮기고, 세포를 2500 g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하고, 50 mL의 빙냉 멸균 이중증류수에 재현탁시켰다. 세척 단계를 2차 반복한 후, 각각의 펠릿을 25 mL의 빙냉 멸균 이중증류수에 재현탁시켰다. 세척 단계를 3차 반복한 후, 각각의 펠릿을 10 mL의 빙냉 멸균 10% 글리세롤에 재현탁시키고, 튜브를 모았다. 세포를 2500 g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하고, 가볍게 선회시켜 500 μL의 빙냉 멸균 10% 글리세롤에 재현탁시키고, 50 μL의 분취량을 준비하고 -80℃에서 보관하였다.
E. 콜라이 ST18을 사용한 C. 백시니이 의 접합
전기 반응능 E. 콜라이 ST18을 pApra-vioP-frsA, pApra-nptII-frsA, pApra-rbs-frsA, pApra-vioB-KO, 및 pApra-dis-KO로 형질전환시켰다. 전기천공 조건: 0.1cm 전기천공 큐벳에서 1.5 kV, 200 Ω 및 25 μF. 50 μg/mL의 5-아미노레불린산이 함유된 LB 배지(37℃)에서 1시간 동안 회수를 수행하였다. 이후, 50 μg/mL의 5-아미노레불린산 및 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 LB 한천에 세포를 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 해당 구성체가 함유된 E. 콜라이 ST18 루프를 사용하여, 50 μg/mL의 5-아미노레불린산 및 100 μg/mL의 아프라마이신이 보충된 2 mL의 LB 배지에 접종하였다. 37℃에서 200 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 동시에, 2 mL의 LB 배지에 C. 백시니이를 접종하고, 28℃에서 200 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 5-아미노레불린산 및 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 25 mL의 LB 배지에 500 μL의 밤새 배양한 E. 콜라이 배양물을 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 0.6~0.8의 OD600까지 배양하였다. 동시에, 25 mL의 LB 배지에 500 μL의 밤새 배양한 C. 백시니이 배양물을 접종하고, 28℃에서 200 rpm으로 0.6~0.8의 OD600까지 배양하였다. 세포를 1000 g로 10분 동안 원심분리하고, 10 mL의 LB 배지에 재현탁하였다. 세척 단계를 2차 반복한 후, 각각의 펠릿을 1 mL의 LB 배지에 재현탁시켰다. E. 콜라이와 C. 백시니이를 1:3의 비로 혼합하고, 50 μg/mL의 5-아미노레불린산이 함유된 LB 한천 플레이트에 점적하였다. 37℃에서 2시간 동안 초기 인큐베이션한 후, 플레이트를 28℃로 옮기고 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 점적을 1 mL의 LB 배지에 재현탁하였다. 1:100으로 희석하고, 200 μL의 희석된 샘플과 희석되지 않은 샘플을 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 단일 클론이 나타날 때까지(1~2일) 플레이트를 28℃에서 인큐베이션하였다.
접합완료체의 유전형 및 표현형 검증
단일 접합완료체를 100 μg/mL의 아프라마이신이 보충된 LB 한천 플레이트에 다시 면선접종하고, 28℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 프로모터 구성체의 올바른 통합을 PCR로 검증하였다. 이를 위해 소량의 세포 덩어리를 10 μl의 물에 옮겼다. 샘플을 95℃에서 10분 동안 끓이고, 해당 검증 프라이머(표 9)를 사용하여 PCR Hot Start Master Mix 반응에 2 μL를 적용하였다. 올바른 접합완료체는 적절한 크기의 밴드를 나타낸 반면, 야생형 및 거짓양성 클론은 PCR 산물을 나타내지 않았다. 예를 들어, 올바른 접합완료체는 검증 프라이머 vioPcontfwd 또는 nptIIKOntfwd 및 PromoKOntrev를 사용하여 vioP 통합의 경우 1638 bp에서 그리고 nptII 통합의 경우 1482 bp에서 밴드를 나타냈다. 프라이머 Aprafwd 및 Aprarev를 사용하여 아프라마이신 내성 카세트를 증폭함으로써 rbs 프로모터의 통합을 검증하였다. vioB의 녹아웃 및 화합물 J-BGC의 파괴도 PCR로 검증하였다. 올바른 vioB KO 돌연변이체의 경우, 프라이머 vioBKOfwd 및 pApraKOntrev에 대해 1287 bp 및 프라이머 pApraKOntfwd 및 vioBKOrev에 대해 1126 bp의 PCR 밴드가 얻어졌다. 올바른 dis KO 돌연변이체의 경우, 프라이머 Aprafwd 및 Aprarev는 560 bp의 PCR 산물을 생성하였다. 올바른 유전자형을 나타내는 접합완료체를 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 3 mL의 LB 배지에 접종하고, 28℃에서 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 냉동바이알을 준비하기 위해, 1 mL의 밤새 배양한 배양물을 60% 글리세롤 0.5 mL와 혼합하고, -80℃에서 보관하였다. 표현형 대조군을 위해, 25 mL의 LB에 밤새 배양한 배양물 1%를 접종하고, 200 rpm으로 24℃에서 48시간 동안 배양하였다. 채취시, 배양액을 메탄올과 1:1 비율로 추출하였다. 1000 rpm으로 30분 동안 진탕한 후, 샘플을 11000 g로 2분 동안 원심분리하고, 150 μL의 상청액을 HPLC-MS로 분석하여 화합물 (A1)의 역가를 분석하였다.
이중 돌연변이체 vio B KO + dis KO의 생성
첫 번째 단계에서, pPhoto_vioB_KO를 전술한 바와 같이 C. 백시니이에 접합시키고, 50 μg/mL의 클로람페니콜이 함유된 LB 한천에서 선택하였다. 프라이머 vioBKOfwd 및 pPhoto_KOntrev를 사용하여 PCR로 1351 bp의 PCR 산물을 생성함으로써 올바른 접합완료체를 검증하였다. C. 백시니이 vioB KO를 사용하여, 50 μg/mL의 클로람페니콜이 함유된 2 mL의 LB 배지에 접종하고, 28℃에서 200 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 동시에, pApra_KO_dis가 함유된 E. 콜라이 ST18 루프를 사용하여, 50 μg/mL의 5-아미노레불린산 및 100 μg/mL의 아프라마이신이 보충된 2 mL의 LB 배지에 접종하였다. 다음 날, 5-아미노레불린산 및 100 μg/mL의 아프라마이신이 함유된 25 mL의 LB 배지에 500 μL의 밤새 배양한 E. 콜라이 배양물을 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 0.6~0.8의 OD600까지 배양하였다. 동시에, 50 μg/mL의 클로람페니콜이 함유된 25 mL의 LB 배지에 500 μL의 밤새 배양한 C. 백시니이 배양물을 접종하고, 28℃에서 200 rpm으로 0.6~0.8의 OD600까지 배양하였다. 세포를 1000 g로 10분 동안 원심분리하고, 10 mL의 LB 배지에 재현탁하였다. 세척 단계를 2차 반복한 후, 각각의 펠릿을 1 mL의 LB 배지에 재현탁시켰다. E. 콜라이와 C. 백시니이를 1:3의 비로 혼합하고, 50 μg/mL의 5-아미노레불린산이 함유된 LB 한천 플레이트에 점적하였다. 37℃에서 2시간 동안 초기 인큐베이션한 후, 플레이트를 28℃로 옮기고 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 점적을 1 mL의 LB 배지에 재현탁하였다. 1:100으로 희석하고, 200 μL의 희석된 샘플과 희석되지 않은 샘플을 100 μg/mL의 아프라마이신 및 50 μg/mL의 클로람페니콜이 함유된 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 단일 클론이 나타날 때까지(1~2일) 플레이트를 28℃에서 인큐베이션하였다. 전술한 바와 같이 프라이머 pAprafwd 및 pAprarev를 사용하여 PCR로 이중 돌연변이체를 검증하였다.
돌연변이체 검증에 사용된 프라이머는 표 9에 제시되어 있다. 프로모터 교환을 위한 상동성 frsA 단편의 서열은 표 10에 제시되어 있다.
결과
C. 백시니이 에 의한 A1 생성의 검증
C. 백시니이의 배양 후 추출 및 HPLC-HRMS 분석을 통해 화합물 (A1)의 생성을 확인하였다. 화합물 (A1)을 배양액으로부터 단리하고, 1D- 및 2D-NMR 실험을 통해 철저히 특성화하였다. 모든 신호 및 관찰된 상관관계는 문헌[Reher et al. (2018) J Nat Prod.; 81(7):1628-1635]에 보고된 것 및 이전에 아르디시아 크레나타의 잎에서 단리된 기준 물질과 매우 잘 일치한다.
프로모터 삽입 돌연변이체
화합물 (A1)의 역가를 증가시키기 위해, 화합물 (A1)-BGC 상류의 천연 프로모터를 다른 프로모터로 대체하였다. 이 전략은 클러스터가 단일 오페론으로 구성되고 전사가 단일 프로모터에 의해 유도될 가능성이 높다는 점에서 기대되었다. 이러한 맥락에서 여러 상이한 프로모터(ErmE*, J23119, nptII, plpp, P S12 burk, rbs, 및 vioP)를 조사하였다. vioP를 제외하고, 이들은 모두 항시성 프로모터이다. 리보솜 프로모터 rbs(C. 백시니이의 게놈 서열로부터 추출된 서열) 및 프로모터 nptII(네오마이신 내성 카세트 유래)은 항시성 프로모터이다. 프로모터 vioP는 C. 백시니이의 비올라세인-BGC로부터 추출되었다. 이 프로모터는 문헌[Morohoshi et al. (2010) Bioscie. Biotechnol. Biochem.;74 (10),2116-2119]에서 기술된 바와 같이 쿼럼 센싱(quorum sensing)에 관여하는 N-아실 호모세린 락톤(N-AHL)을 통해 조절된다. 유전적으로 검증된 돌연변이체를 삼중으로 배양하여 화합물 (A1)의 역가에 대한 프로모터 삽입의 영향을 분석하였다.
rbs, nptII, 및 P S12 burk 돌연변이체의 A1 역가는 야생형의 값보다 낮았지만, vioP, ErmE*, plpp, 및 J23119 프로모터를 각각 삽입한 결과, 화합물 (A1)의 역가가 4배 넘게 증가했다(표 11).
비올라세인 파괴 돌연변이체
화합물 (A1) 및 이의 유사체 외에도, C. 백시니이는, 대부분의 크로모박테리아에 공통적이며 이 속의 명명 근거이기도 한 비스-인돌 구조의 보라색 색소인 비올라세인 및 데스옥시비올라세인을 생성한다. 이의 생합성은 밝혀져 있으며, 각각의 BGC는 예를 들어 문헌[August et al. (2000) J Mol Microbiol Biotechnol.; 2(4):513-519]을 통해 공개되었다. C. 백시니이에 의해 생성된 다량의 비올라세인은 증발할 때마다 난용성 잔류물이 형성되어 추출 및 정제 공정 중에 문제가 되었다. 화합물 (A1)의 정제를 용이하게 하기 위해, 유전자 vioB의 녹아웃을 수행하였다.
생성된 돌연변이체에는 비올라세인 생성이 없었는데, 이는 보라색이 결여되어 있다는 점에서 분명하다. 화합물 (A1)의 역가 및 이의 단리 수율은 야생형 균주와 유사했다.
화합물 J 파괴 돌연변이체
또한, 비올라세인 외에 신규 환형 리포뎁시펩티드 클래스가 C. 백시니이의 배양 추출물에서 발견되었다. 단리 및 구조 규명(아래 참조)을 통해 2개의 환형 리포뎁시펩티드와 2개의 선형 리포뎁시펩티드가 밝혀졌다(모두 서열 N-Acyl-1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 318)의 6개 아미노산으로 구성됨). 환형 화합물은 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이에 형성된 헥사펩티드 락톤 고리를 특징으로 한다.
이들 화합물은 화합물 (A1)의 정제 공정 중에 문제를 유발하였다. 정제용 HPLC에 의한 화합물 (A1) 정제용 농축 분획을 제조할 때, 이러한 리포펩티드의 존재로 인해 점도가 매우 높은(거의 겔형) 용액이 얻어졌다. 이로 인해 샘플 주입이 방해되었고 추가 희석이 필요했다. 이에 따라 실행당 처리되는 화합물 (A1)의 양이 제한되었다.
화합물 J의 형성에 관여하는 dis-BGC의 비활성화 돌연변이체가 생성되었다. 이 돌연변이체에서는 이 클래스의 모든 구성원의 생성이 없는 것으로 나타났다(도 3).
이 돌연변이체는 C. 백시니이 야생형과 비슷한 화합물 (A1) 역가를 생성했다. 이 돌연변이체의 배양 추출물로부터 화합물 (A1)을 정제한 경우 야생형 균주의 추출물에 비해 향상된 단리 수율을 나타냈다(68% 대 40%).
이중 돌연변이체
화학적 백그라운드의 복잡성을 더욱 더 줄이기 위해 화합물 J 및 비올라세인-BGC 둘 모두의 이중 돌연변이체를 생성하였다. 2차 대사산물 클래스 둘 모두가 이중 돌연변이체에서 생성되지 않았다. 화합물 (A1)의 역가는 C. 백시니이 야생형과 비슷했다. 화합물 (A1)의 단리 수율은 화합물 J 파괴 돌연변이체에 대해 얻은 것과 비슷했다.
화합물 J의 구조 규명
화합물 J는 서열 N-(Z)-dec-3-enoyl -1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 321)의 환형 리포뎁시펩티드이다. 헥사펩티드 락톤 고리는 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이에 형성된다.
HR-MS 및 HR-MS/MS
MS 및 MS/MS 스펙트럼은 Bruker Daltonics의 maXis 4G QTOF 질량분석기에서 양이온화 모드로 기록되었다. 단편화 에너지는 스펙트럼의 우측 상단에 제공된다. 화합물 J를 비정질 백색 분말로서 정제하였다. HR-ESIMS 데이터는 RDBE = 12인 C40H66N8O8의 분자식을 나타냈다.
NMR
화합물 J의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼은 DMSO-d6에서 600 MHz로 기록되었다. 화합물 J의 1H NMR 스펙트럼 및 HSQC NMR 스펙트럼의 분석은 6개의 아미드 수소(δH 7.19, 7.82, 7.88, 7.96, 8.08, 8.43), 2개의 올레핀 메틴 수소(δH 5.47, 5.48), 및 2개의 방향족 수소(δH 6.85, 7.54)의 존재를 나타냈다. 또한, δH 3.9-4.5(3.95, 4.17 2회, 4.24, 4.33, 4.48)에서 6개의 α-아미노 메틴 수소 신호가 검출되었으며, 이는 화합물 J의 구조에 6개의 아미노산 단위가 포함되어 있음을 시사한다. 13C NMR 스펙트럼에서 7개의 카보닐 탄소 원자(δC 168.7, 170.6, 170.9, 171.0, 171.4, 171.6, 172.5)에 해당하는 신호뿐만 아니라 합산으로 화합물 J의 12 이중결합 당량 중 10을 차지하는 5개의 sp2 탄소 원자(δC 118.0, 122.7, 129.2, 132.0, 134.9)가 관찰되었다. 이는 화합물 J가 이환식 화합물임을 나타낸다. 또한, 1개의 산소-결합 탄소 원자(δC 62.6) 및 아미노산의 α 위치에 있는 6개의 탄소 원자(δC 51.3, 52.3, 54.3, 57.2, 57.9, 58.3)에 해당하는 탄소 신호가 검출되었다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼 데이터를 사용한 HSQC NMR 스펙트럼 해석을 통해 모든 1-결합 1H-13C 상관관계를 지정하였다(표 12, 도 4).
화합물 J의 화학 구조 및 원자 번호는 아래와 같다.
COSY 및 HMBC NMR 데이터의 조합 분석 결과(도 5), 화합물 J가 4개의 공통 아미노산(히스티딘, 류신, 세린, 발린)을 함유하는 것으로 나타났다. 또한, 이를 통해 dec-3-에노일 단위의 존재를 확인하였다. 12-CH2(δH 2.96, 3.06)와 6-CH2(δH 2.00) 사이의 관찰된 ROESY 상관관계와 조합하여 6-C(δC 27.1)의 탄소 이동을 통해 이중결합 구조를 Z로서 확인하였다.
이어서, 3-결합 1H-13C 커플링을 통해 아미노산 단위 사이의 연결을 규명하였다(도 5). 18-CH(δH 4.17)/C-14(δC 168.7), 25-CH(δH 4.33)/C-19(δC 171.0), 31-CH(δH 3.95)/C-26(δC 171.6), 38-CH(δH 4.24)/C-33(δC 170.9), 43-CH(δH 4.17)/C-39(δC 172.5). 16-CH2(δH 4.18, 4.38)/C-44(δC 170.6)의 커플링에 의해 거대고리 구조가 규명되었다. 이 서열을 아미노산 단위의 아미드 수소와 α-수소 사이의 ROESY 상관관계를 통해 추가로 비교 검토하고 확인하였다.
13-CH(δH 4.48) 내지 C-2(δC 171.4)의 HMBC 상관관계 및 1-NH(δH 8.08)와 12-CH2(δH 2.96 및 3.06) 사이의 ROESY 상관관계를 통해 (Z)-dec-3-에논산 단위는 1-NH에 연결된 것으로 확인되었다.
화합물 J의 주요 상관관계는 아래와 같다.
.
화합물 F5의 구조 규명
화합물 F5는 서열 N-(Z)-dec-3-에노일-1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 321)의 선형 리포펩티드이다. 화합물 J와 비교하여, 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이의 락톤이 가수분해되었다.
HR-MS 및 HR-MS/MS
MS 및 MS/MS 스펙트럼은 Bruker Daltonics의 maXis 4G QTOF 질량분석기에서 양이온화 모드로 기록되었다. 단편화 에너지는 스펙트럼의 우측 상단에 제공된다. 화합물 F5를 비정질 백색 분말로서 정제하였다. HR-ESIMS 데이터는 RDBE = 11인 C40H68N8O9의 분자식을 나타냈다.
NMR
화합물 F5의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼은 DMSO-d6에서 600 MHz로 기록되었다. 화합물 F5와 화합물 J에 대한 NMR 데이터는 유사했다(표 13). 가장 유의미한 차이는 HMBC에서 13-CH2 내지 41-C의 사라진 상관관계(도 5) 및 화합물 J에 대한 16-CH2(δH 4.18 및 4.38) 대비 13-CH2(δH 3.49 및 3.55)의 이동 차이였다. 관찰된 불포화 수 11과 조합하여 이러한 관찰은 화합물 F5가 선형 리포펩티드임을 나타냈다.
화합물 F5의 화학 구조 및 원자 번호는 아래와 같다.
화합물 F5의 주요 상관관계는 아래와 같다.
화합물 F3의 구조 규명
화합물 F3은 서열 N-옥타노일-1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 322)의 환형 리포뎁시펩티드이다. 헥사펩티드 락톤 고리는 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이에 형성된다.
HR-MS 및 HR-MS/MS
MS 및 MS/MS 스펙트럼은 Bruker Daltonics의 maXis 4G QTOF 질량분석기에서 양이온화 모드로 기록되었다. 단편화 에너지는 스펙트럼의 우측 상단에 제공된다. 화합물 F3을 비정질 백색 분말로서 정제하였다. HR-ESIMS 데이터는 RDBE = 11인 C38H64N8O8의 분자식을 나타냈다.
NMR
화합물 F3의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼은 DMSO-d6에서 600 MHz로 기록되었다. 화합물 F3과 화합물 J에 대한 NMR 데이터는 유사했다(표 14; 도 6). 화합물 J와 비교하여, 화합물 F3에 대한 불포화 수 11 및 사라진 2개의 올레핀 메틴 수소(δH 5.47, 5.48)는 화합물 F3에서 데세노일 측쇄 대신 옥타닐을 나타냈다. 관찰된 불포화 수 11과 조합하여, HMBC에서 13-CH2 내지 41-C의 관찰된 HMBC 상관관계는 화합물 F3이 환형 리포뎁시펩티드임을 나타냈다.
화합물 F3의 화학 구조 및 원자 번호는 아래와 같다.
화합물 D의 구조 규명
화합물 D는 서열 N-옥타닐-1Ser-2Val-3His-4Val-5Leu-6Val(서열번호 323)의 선형 리포펩티드이다. 화합물 F3과 비교하여, 1Ser 하이드록실기와 6Val의 C-말단 카복실기 사이의 락톤이 가수분해되었다.
HR-MS 및 HR-MS/MS
MS 및 MS/MS 스펙트럼은 Bruker Daltonics의 maXis 4G QTOF 질량분석기에서 양이온화 모드로 기록되었다. 단편화 에너지는 스펙트럼의 우측 상단에 제공된다. 화합물 D를 비정질 백색 분말로서 정제하였다. HR-ESIMS 데이터는 RDBE = 10인 C38H66N8O9의 분자식을 나타냈다.
NMR
화합물 D의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼은 DMSO-d6에서 600 MHz로 기록되었다. 화합물 D와 화합물 F3에 대한 NMR 데이터는 유사했다(표 15; 도 7). 가장 유의미한 차이는 HMBC에서 13-CH2 내지 41-C의 사라진 상관관계 및 화합물 F3에 대한 13-CH2(δH 4.19 및 4.38) 대비 13-CH2(δH 3.50 및 3.56)의 이동 차이였다. 관찰된 불포화 수 10과 조합하여 이러한 관찰은 화합물 D가 선형 리포펩티드임을 나타냈다.
화합물 D의 화학 구조 및 원자 번호는 아래와 같다.
화합물 J 및 관련 유사체의 생합성
화합물 J(생합성 서열: N-Acyl-Ser-Val-His-Val-Leu-Val(서열번호 318)의 환형 헥사뎁시펩티드)의 역생합성 분석을 통해 C. 백시니이의 내부적으로 서열분석된 게놈으로부터 BGC를 간단하게 확인할 수 있었다. BGC는 A1-BGC의 바로 하류에 위치한다. 화합물 J-BGC는 4개의 유전자 dis1, dis2, dis3, dis4로 구성된다. 이들의 추정된 단백질 생성물은 모듈형 구조를 갖는 전형적인 비리보솜 펩티드 합성효소(NRPS) 효소이다. dis2 및 dis3 유전자는 dis1의 부분 서열의 유전자 중복을 나타낸다. 화합물 J 및 관련 유사체의 생합성의 경우, dis2 및 dis3에 의해 암호화된 효소는 기능이 없다. 화합물 J의 조립 라인은 총 6개의 모듈과 20개의 도메인을 포함한다. 각각의 아데닐화(A) 도메인의 기질 특이성은 추정 결합-포켓 구성요소인 소위 Stachelhaus 코드(Stachelhaus et al. (1999) Chem Biol.;6(8):493-505)에 따라 예측되었다. 예측된 아미노산과 관찰된 아미노산은 거의 완벽하게 일치한다(표 16). Dis1의 제3 A 도메인의 경우에만, 예측된 Tyr 대신 His의 통합이 관찰된다.
Dis1의 N-말단에 위치한 C 도메인은 활성화된 지방산 모이어티로 Ser을 N-아실화할 것으로 예상된다. Dis4의 C-말단에 있는 티오에스테라제(TE) 도메인은 최종 생성물의 오프-로딩 및 분자내 고리화를 촉매한다(도 8).
실시예 2: 부분 재산화 및 항체 약물 접합체 생성을 위한 공정
항-PMEL17 항체 약물 접합체의 생성을 위한 조건을 스크리닝하여 약물 대 항체 비 및 온-사이트 커플링 %를 최적화하였다. 규모에 따른 항-PMEL17 항체 약물 접합체의 생성은 환원 세척 단계에 이은 부분 재산화 단계를 통해 이루어졌다. 환원 세척은 조작된 시스테인 잔기의 디캡핑을 제공했으며, 이는 항체에 대한 약물의 커플링을 위한 개방 부위를 제공한다. 환원 세척 단계의 과잉환원(예를 들어, 표적화된 시스테인 잔기뿐만 아니라 쇄내 이황화 가교 둘 모두의 환원)은 오프-타겟 시스테인 잔기의 재캡핑을 야기(예를 들어, 쇄내 이황화 가교를 재형성)하는 부분 재산화 단계를 통해 교정되었다. 과잉 환원-재산화 공정에서, 도 9에 도시된 바와 같이, 온-사이트(HC1) 또는 오프-사이트(LC1 또는 HC2)에서 항체에 약물이 접합될 가능성이 있다.
항체를 RMP 단백질 A 수지(GE)와 함께 적절한 크기의 일회용 컬럼에서 혼합하여 10 mg의 Ab 대 PBS 중 1 ml의 수지의 비로 15분 동안 인큐베이션하였다. 시스테인 HCl을 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하면서 인큐베이션하여 반응성 시스테인이 탈차단되도록 하였다. 시스테인 HCl 농도와 pH를 조절하여 약물 대 항체 비와 온-사이트 커플링 %를 최적화하였다. pH 6에서 시스테인 HCl 세척의 농도는 10 내지 30 mM(즉, 10, 12, 14, 16, 20, 25, 및 30 mM)로 다양했다. 버퍼 pH는 6.95 내지 7.25의 범위에 걸쳐 다양했다. 대체 링커를 항체에 커플링시키고 대체물 대 항체 비(SAR)를 평가하여 조건을 평가하였다. 진공 매니폴드에서 4 컬럼 부피의 PBS로 수지를 신속하게 세척하였다. 이어서, 250 nM의 CuCl2가 함유된 동일 부피의 PBS에 수지를 재현탁시켰다. 시점을 취하여 항체 쇄간 이황화물의 형성을 모니터링하였다. 각 시점에, 25 μL의 수지 슬러리를 제거하고, 20 mM의 본원에 기재된 화합물 (B1) 또는 화합물 (B2) 1 μL를 첨가하고, 튜브를 여러 번 가볍게 흔들었다. 수지를 회전 침강시키고, 상청액을 제거한 후, 50 μL의 항체 용리 버퍼(Thermo)로 용리하였다. 수지를 펠릿화하고, Agilent PLRP-S 4000A 5 um, 4.6x50 mm 컬럼(버퍼 A는 물, 0.1% TFA, 버퍼 B는 아세토니트릴, 0.1% TFA, 컬럼은 80℃로 유지, 유량은 1.5 ml/분)을 사용하여 역상 크로마토그래피로 상청액을 분석하였다. 시험된 각 조건 세트에 대해, 샘플을 실온에서 3일 동안 재산화시킨 후, SAR을 측정하였다. 이 스크리닝 결과의 선택은 표 17에 요약되어 있다.
재산화 단계를 최적화하기 위해 조절된 조건은 용기 형상, 헤드스페이스의 양, 혼합의 양, 온도, pH, 및 항체 농도였다. pH의 증가 및 항체 농도의 감소는 재산화를 가속화시키는 것으로 관찰되었다. 추가 개발을 위해, 5.8의 pH 및 13.5 g/L의 단백질 농도에서 CEC 용리액에 대해 재산화를 수행하였다. 재산화 공정에 대한 용기 형상의 영향을 확인하기 위해, 비이커(즉, 원통형 용기) 및 삼각 플라스크(즉, 테이퍼 용기) 둘 모두에서 재산화를 수행하였다. 헤드스페이스의 영향을 평가하기 위해, 헤드스페이스가 60%인 용기와 헤드스페이스가 없는 용기에서 재산화 단계를 수행하였다. 혼합의 영향을 평가하기 위해, 교반 없이 그리고 100 rpm의 교반 속도로 재산화를 수행하였다. 용기 형상, 헤드스페이스, 또는 혼합의 변화에 따른 재산화에 대한 영향은 관찰되지 않았다. 실온(즉, 25℃) 및 저온실 둘 모두에서 재산화를 수행하였으며; 낮은 온도에서 재산화가 느려졌다. 약물 항체 접합체의 생성을 위해, CEC 용리액을 최대 60%의 공기 오버레이가 있는 탱크에서 48 내지 72시간 동안 유지하여 재산화를 제공하였다. 재산화 단계 후, 온-사이트 대 오프-사이트 커플링 및 순도의 개선이 관찰되었다.
요약하면, 재산화는 5일 동안 평가되었다. 재산화는 48시간 후에 일어났다. 이 소규모 실험에서는 헤드스페이스, 용기 형상, 또는 혼합에 대한 뚜렷한 영향을 감지할 수 없었지만, 혼합으로 인해 탁도가 증가할 수 있다. 저온실에서는 훨씬 더 느린 재산화가 관찰되었다. 스케일링 효과와 용존 산소에 대한 버퍼 준비 효과를 완전히 배제할 수 없으므로 다음과 같은 재산화 단계가 제안되었다: 공기 오버레이와 함께 최대 60%까지 채워진 탱크에서 CEC 용리액을 48시간 내지 3일 유지. 교반은 더 큰 규모의 재산화에 유리할 수 있다.
항체가 사슬간 이황화 결합을 재형성한 것으로 확인되면, 10 컬럼 부피의 PBS로 수지를 세척하고, 동일 부피의 PBS에 수지를 재현탁시키고, DMSO 중 8 당량의 링커-페이로드(20 mM)를 첨가한 다음, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 50 컬럼 부피의 PBS로 수지를 세척하였다. 항체 용리 버퍼를 사용하여 단백질 A 수지로부터 ADC를 용리하고 1/10 부피의 1 M Tris pH 9.0으로 중화시켰다. 이어서, ADC를 PBS 또는 다른 적합한 버퍼로 버퍼 교환하고, 필요한 경우, 응집체를 제거하기 위한 정제용 크기 배제 크로마토그래피(S200 Increase; GE)를 수행하였다. 단량체 비율 측정을 위한 분석용 SEC, DAR 측정을 위한 질량분광법, 내독소 부하 측정을 위한 LAL 테스트의 분석을 수행하고, 항체의 소멸 계수 및 분자량을 이용하여 A280으로 단백질 농도를 측정하였다.
과잉 환원 단계에 이은 전용의 강력한 재산화 단계를 목표로 함으로써, 조작된 시스테인을 효율적으로 디캡핑하여 표적 부위에서 고순도로 약물-항체 접합을 제공하였다.
실시예 3: 화합물 (A1) 및 유사체의 단리 및 분석
화합물 (A1) 조립 라인의 천연 프로모터의 교환에서 다양한 프로모터를 특성화하여, 화합물 (A1)의 생성이 유의미하게 증가된 과발현 돌연변이체를 생성하였다. 이로써, 존재비가 적은 신규 화합물 (A1) 유사체의 단리 및 구조 규명이 가능해졌다. 또한, Gαq/11 돌연변이가 있는 포도막 흑색종 세포주에 대한 15개 크로모뎁신의 항증식 활성을 조사하고, 혈장에서 형성된 화합물 (A1)의 주요 대사산물을 특성화하였다.
실시예 1에 기술된 바와 같이, 게놈 마이닝 접근법을 통해, 크로모박테리움 백시니이 MWU205(본원에서 C. 백시니이라고도 함)를 화합물 (A1)의 생산자로서 확인하였다. LB 배지에서 배양시 C. 백시니이 배양액에서의 화합물 (A1)의 역가는 5~10 mg/L 범위였으며, 이는 효율적인 생명공학적 생산의 전제조건을 충족하지 못했다. 따라서, 유전자 조작을 통해 C. 백시니이의 생성을 개선하기 위한 접근법을 조사하였다. 화합물 (A1)-BGC는 단일 오페론으로 구성된 8개의 유전자 frsA-H를 포함한다. BGC에는 추가적인 조절 유전자가 없기 때문에 frsA 상류의 천연 프로모터를 대체 프로모터로 교환하는 것을 고려하였다. E. 콜라이를 공여자로서 사용하는 C. 백시니이에 대한 접합 프로토콜을 확립하고, 상동성 재조합에 의한 게놈 통합을 통해 목적하는 프로모터 교환 돌연변이체를 생성하도록 유전자 구성체를 설계하였다. 이러한 맥락에서 6개의 서로 다른 프로모터(ErmE*, J23119, nptII, Plpp, rbs, 및 vioP)를 조사하였다(도 10a). vioP를 제외하고, 이들은 모두 항시성 프로모터이다. C. 백시니이의 게놈 서열로부터 리보솜 rbs 프로모터의 서열을 추출하였다. 쿼럼 센싱에 관여하는 N-아실 호모세린 락톤을 통해 조절되는 vioP 프로모터를 C. 백시니이의 비올라세인 BGC로부터 추출하였다. 유전적으로 검증된 돌연변이체를 삼중으로 배양하여 화합물 (A1) 역가에 대한 프로모터 삽입의 영향을 분석하였다. rbs 및 nptII 돌연변이체의 화합물 (A1) 역가는 야생형의 값보다 낮았지만, vioP, J23119, Plpp, 및 ErmE* 프로모터의 삽입으로 인해 FR 역가가 4.4~8.4배 증가하였다(도 10b). 이러한 결과는 화합물 (A1)의 생성을 위한 확장가능하고 지속가능하며 비용 효과적인 생명공학적 공정을 확립하기 위한 추가적인 균주 최적화를 가능하게 한다.
C. 백시니이 vioP 돌연변이체의 배양 추출물로부터 화합물 (A1)을 단리했을 때, 질량 차이가 +18 Da인 세 가지 화합물이 농축된 분획에서 매우 낮은 존재비로 검출되었다. 이들 화합물이 가수분해된 화합물 (A1)에 해당할 수 있다는 초기 가정은 HR-ESIMS 데이터(화학식: C49H78N7O16+ ; 계산치 [M+H]+ = 1020.5500; 실측치 [M+H]+ = 1020.4948 Δ = 54.09 ppm)에 의해 반증되었다. 이들 세 가지 화합물의 분자식은 HR ESIMS에 의해 C48H74N7O15S+(계산치 [M+H]+ = 1020.4958; Δ = 0.98 ppm)로 규명되었다. 그러나, 이들 화합물의 존재비는 단리하기에는 너무 낮았다. 분자 내 황의 존재는 시스테인(Cys) 또는 메티오닌(Met)의 혼입으로 인해 발생하는 것으로 의심되었다. 실제로, L Cys가 아닌 L-Met를 배양액에 공급하면 이들 화합물의 존재비가 증가했다(도 11b). L-Met의 공급과 함께 생물반응기에서 50 L 규모로 C. 백시니이 vioP 돌연변이체를 후속 배양함으로써, 광범위한 1D 및 2D NMR 실험을 통한 구조적 지정(아래 표시)을 위한 세 가지 화합물 모두의 충분한 양을 단리할 수 있었다(1H, 13C, 1H 1H COSY, 1H-1H ROESY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC). 2 내지 4와 (A1)의 1H 및 13C 화학적 이동을 비교한 결과, 8개의 잔기 중 5개에 대해 매우 양호한 일치를 보였다(Ala, N 메틸데하이드로알라닌(N Me Dha), 3-페닐락트산(Pla), N,O-Me2-Thr, N-Me-Ala; 보충 정보 참조). 화합물 2 내지 4의 주요 차이점은 각각 3개의 하이드록시류신(Hle) 잔기 중 하나에서 발견되었으며, 이는 화합물 (A1)의 구조에서의 이들의 위치에 따라 N 아세틸화 또는 N 프로피오닐화에 의해 추가로 변형된다. 화합물 2의 경우, N 아세틸하이드록시류신(N Ac-Hle) 잔기의 이동은 화합물 (A1)에 대해 관찰된 것과 크게 다른 반면, N 프로피오닐하이드록시류신(N Pr Hle) 및 Hle 잔기에 대한 이동은 화합물 (A1)의 이동과 잘 일치했다. 2의 1D 및 2D NMR 스펙트럼을 평가한 결과, NAc Hle 잔기가 N 아세틸하이드록시메티오닌(N-Ac-Hme) 잔기로 대체된 것으로 나타났다.
화합물 (A1) 및 유사체 화합물 2 내지 7의 구조는 아래와 같다.
N-Ac-Hme 잔기 내에서 예상되는 COSY 및 HMBC 상관관계가 관찰되었으며, 다른 잔기에 대한 연결성은 Pla 잔기의 α-위치에서 N-Ac-Hme 카보닐까지 그리고 N,O-Me2-Thr 잔기의 N-Ac-Hme β-위치에서 카보닐까지 HMBC에서 관찰된 3-결합 1H-13C 커플링에 의해 규명되었다. 화합물 3의 경우, N,O-Me2-Thr 잔기의 α-위치에서 Hme 카보닐까지, N-Me-Ala 잔기의 Hme α-위치에서 카보닐까지, 그리고 N-Pr-Hle 측쇄의 Hme β-위치에서 카보닐까지의 HMBC 상관관계에 의해 확인된 바와 같이(상기 참조), 하이드록시메티오닌(Hme) 잔기가 (A1)의 Hle 잔기를 대체한다. 화합물 4에서는, Hle 잔기의 β-위치에서 N-Pr-Hme 카보닐까지 그리고 프로피오닐의 N-Pr-Hme α-위치에서 카보닐까지의 HMBC 상관관계에 의해 규명된 바와 같이, N-Pr-Hle 측쇄가 N-프로피오닐하이드록실메티오닌(N-Pr-Hme)으로 대체된다. 동일한 생합성 조립 라인에서 생성되었으므로, 화합물 2 내지 4의 배열은 화합물 (A1)의 배열과 동일할 것으로 여겨진다. N-아세틸화 또는 N-프로피오닐화에 의한 변형을 포함하여, Hle 잔기가 Hme로 단일 대체된 세 가지 가능한 화합물 (A1) 유사체 모두의 존재는 (A1)의 생합성 조립 라인에서 현저한 유연성을 나타낸다. 초기 생합성 분기는 FrsA, FrsD, 또는 FrsG의 아데닐화(A) 도메인을 통해 각각 L-Leu 대신 L-Met를 선택하고 활성화한 후, 각각의 하류 티올화(T) 도메인을 프라이밍하는 것이다. 비헴(non-heme) 철(II) 모노옥시게나제 FrsH는 T 도메인에 연결된 L-Leu의 β-수산화를 촉매하는 것으로 입증되었으며, 이는 L-Met의 β-수산화도 촉매할 수 있는 것으로 보인다. FrsA와 FrsD의 축합(C) 도메인은 T 도메인에 연결된 Hme를 수용하여 각각 N-프로피오닐화와 N-아세틸화를 촉매할 수 있는 것으로 보인다. 또한, 조립에서 관련 C 도메인은 Hme 잔기와 다양한 (뎁시)펩티드 중간체의 축합을 촉매할 수 있는 것으로 보인다. L-Met는 L-Leu와의 적절한 입체 유사성과 조합하여 β-수산화에 대한 가능성을 제공하기 때문에, 서로 다른 진입점에서 하류 생합성 캐스케이드에 대한 "공통 분모"인 것으로 보인다. 특히 C 도메인의 이러한 유연성은 조립 라인의 유전자 조작에 의한 화합물 (A1)의 추가 유사체 생성에 유리하다.
C. 백시니이 vioP 돌연변이체의 배양 추출물을 분석한 결과, (A1)과 정확한 질량이 동일한 제2 피크가 추가로 나타났으며, 이는 HPLC에서 더 짧은 체류 시간으로 용리되었다(도 11a). C. 백시니이 vioP 돌연변이체에 의해 생성된 (A1)의 역가가 높아짐에 따라, 화합물 5의 생성도 증가하여, 유사체 화합물 6과 함께, 화합물 5의 단리 및 후속 구조 규명이 가능해졌다. 또한, 크로모박테리움 종 QS3666의 배양 추출물로부터 화합물 10의 이성질체(화합물 7)를 단리하였다. 광범위한 1D 및 2D NMR 실험 데이터를 평가한 결과, 이들 이성질체, 화합물 5 내지 7의 구조가 N-Ac-Hle(YM의 N-Ac-Thr) 잔기의 탈수와 함께 N,O-Me2-Thr과 N-Ac-Hle(YM의 N-Ac-Thr) 잔기 사이의 마크로락톤의 형식적 가수분해에 의해 화합물 (A1), 8, 및 화합물 10에서 발생하는 선형 뎁시펩티드인 것으로 나타났다. 이는 N-Ac-Hle 및 N-Ac-Thr 잔기의 각각의 α- 및 β-메틴기에 대한 1H 및 13C 신호의 손실에 의해 추정되었다. 각각의 13C 신호가 올레핀 범위(화합물 5의 경우 δC 124.8 및 144.0)로 동시에 이동한다는 것은 이중결합의 존재 및 이에 따라 화합물 5 및 6의 N-아세틸데하이드로류신(N-Ac-Dhl) 잔기 및 화합물 7의 N-아세틸데하이드로부티린(N-Ac-Dhb) 잔기의 존재를 나타냈다. 이소프로필기의 3차 탄소와 N-Ac-Dhl의 NH 사이의 강한 NOE와 조합하여 올레핀 양성자와 이소프로필기의 3차 탄소에 있는 양성자 사이의 강한 NOE로 인해 화합물 5 및 6의 이중결합 배열은 Z로서 규명되었다. 화합물 7은 유사한 NOE를 나타냈다. 또한, 화합물 5의 선형 구성은 4-브로모페나실 브로마이드를 사용한 유도체화 및 생성된 생성물의 HR-MS/MS 스펙트럼 해석을 통해 뒷받침되었다. 배양 추출물에서 화합물 5의 수화된 유사체가 검출되지 않았기 때문에, 화합물 A1로부터 화합물 5의 형성이 E1cB 제거 메커니즘을 통해 일어날 가능성이 있다고 가정하였다. 동위원소 표지 실험은 이 가설을 더욱 뒷받침한다. 화합물 (A1)을 알칼리성 18O-물로 처리하면, 화합물 5는 18O를 포함하지 않고 형성된다. 그러나 가수분해-탈수 순서에서, 예상되는 생성물은 가수분해 중에 화합물 5의 카복실산 작용기에 18O를 통합했을 것이며 16O-하이드록시기를 제거했을 것이다(관찰되지 않음). 배양 추출물로부터 단리하는 대신, DMSO 중 트리에틸아민으로 화합물 (A1), 8, 또는 10을 처리하여 양호한 수율로 화합물 5 내지 7을 얻을 수 있다. N-Pr-Hle 측쇄의 하이드록실이 마크로락톤 중 하나와 에스테르 교환반응함으로 인해 발생하는 두 가지 잠재적 구조가 제안되었다.
또한, 화합물 (A1)의 안정성을 마우스, 원숭이, 및 인간 혈장에서 조사하였다. 화합물 (A1)을 8시간 동안 인큐베이션한 후, 인간 혈장 샘플에 화합물 5의 추가 기준 물질을 첨가함으로써, 대신에 형성된 화합물 (A1) 이성질체가 화합물 5에 해당한다는 것이 명확하게 입증될 수 있었다(도 12a). 또한, 최대 24시간 동안 인간 혈장에서 화합물 1을 인큐베이션한 후, 화합물 (A1) 및 5의 절대 정량화를 수행하였다. 24시간의 인큐베이션 후 화합물 (A1)과 5의 합친 분획은 전개된 화합물 (A1) 농도의 약 90%를 차지했으며(도 12b), 이로써 화합물 5가 인간 혈장에서 형성된 주요 대사산물임을 나타낸다. 마우스 및 원숭이 혈장을 사용하여 매우 유사한 결과를 얻었다.
본원에 제시된 15개의 크로모뎁신(11개는 화합물 (A1)-클래스에서 유래되고, 4개는 화합물 10-클래스에서 유래됨)을 4개의 암 세포주에 대한 세포 증식 분석에서 특성화하였다. C. 백시니이의 배양액으로부터 화합물 (A1), 2 내지 6, 8, 9, 및 12를 단리하였다. 화합물 10에 대해 앞서 기술한 바와 같이, 화합물 (A1)로부터 화합물 10 및 11을 제조하였다. 크로모박테리움 종 QS3666의 배양액으로부터 화합물 7 및 13 내지 15를 단리하였다. 성인에서 가장 흔한 안암인 포도막 흑색종은 재발성 핫스팟 Q209 및 R183에서의 Gαq 및 Gα11의 발암성 기능 획득 돌연변이에 의해 유전적으로 정의된다. 두 돌연변이 모두 GTPase 활성을 둔화시켜 단백질의 GTP-결합된 활성 입체형태를 유도한다. 화합물 (A1)은 비활성 GDP-결합 Gαβγ 이종삼량체에 활성 Gαq/11을 항시적으로 포획하여 이러한 종양단백질을 억제한다. 화합물 (A1)에 반응하여, Gαq/11-돌연변이 포도막 흑색종 세포는 세포 주기를 정지시키고 멜라닌세포 분화 및 아폽토시스를 겪는다. 전신 투여된 화합물 (A1)은 내약성이 좋은 용량에서 Gαq-돌연변이 포도막 흑색종 이종이식편의 성장을 선택적으로 억제했지만, BRAF(V600E)에 의해 유발된 종양에는 영향을 미치지 않았다. 시험 패널의 암 세포주 중 2개인 92.1과 MP41은 각각 이형접합성 GNAQ Q209L 또는 GNA11 Q209L 돌연변이가 있는 포도막 흑색종 세포주였다. 다른 두 세포주인 A375와 SK MEL 30은 GNAQ 또는 GNA11에 발암성 돌연변이가 없지만 각각 동형접합성 BRAF V600E 또는 이형접합성 NRAS Q61K 돌연변이를 보유하는 피부 흑색종 세포이다. 이 데이터세트는 포도막 흑색종 세포주에 대한 항증식 활성과 관련하여 화합물 (A1) 및 유사체의 포괄적인 편집을 나타낸다.
화합물 8 내지 15의 구조는 아래와 같다.
92.1(GNAQ Q209L), MP41(GNA11 Q209L), A375 및 SK-MEL-30(둘 모두 GNAQ/11 야생형) 세포주에서 세포 증식 억제에 대한 시험 화합물의 성장 억제 (GI)50 값을 효능별로 순위를 매겨 표 19에 나타내었다.
GNAQ/GNA11 돌연변이 세포주에 대한 크로모뎁신의 선택적 항증식 프로파일은 GNAQ/GNA11 신호전달과 독립적인 A375 및 SK MEL 30 세포주에 대한 활성의 결여에 의해 확인된다. 92.1 및 MP41 세포주를 사용한 효능 순위는 이전 SAR 연구와 잘 일치한다. 화합물 (A1)은 1 nM 미만의 범위에서 뛰어난 효능을 지닌 가장 강력한 화합물이다. 화합물 8, 9, 및 11은 2 내지 3배만큼 효능이 감소한다. 흥미롭게도, 새로 확인된 유사체 화합물 4는 화합물 2 및 3의 경우 약 15배와 대조적으로, 불과 2배 낮은 활성을 갖는다. 이러한 결과는 Voss 등의 최근 보고와 일치하며, 이는 표적 단백질에 대한 결합 동역학 및 체류 시간 연장과 관련하여, 화합물 2 및 3의 다양한 잔기에서의 화합물 (A1)의 "친유성 앵커"의 중요성을 강조한다. 화합물 4의 유지된 효능은 스캐폴드의 잠재적인 합성 또는 생합성 변형에 대한 기대되는 출구 벡터를 나타낸다. 화합물 10은 (A1)에 비해 효능이 약 25~30배 낮은 반면, 화합물 14는 불과 약 10배만큼 감소한다. 화합물 (A1) 클래스(화합물 (A1) 및 8)와 화합물 10 클래스(화합물 10 및 14)의 구성원에 대한 일치된 분자 쌍 분석은 R4에서의 N-프로피오닐기의 기여 감소와 비교하여 R3에서의 이소프로필기에 의한 중요한 효능 기여를 강조한다. 화합물 12의 화합물 (A1) 코어 구조는 성장 억제와 관련하여 화합물 (A1)에 비해 3,000배 초과의 변화를 나타낸다. 특히, 이러한 배수 변화는 동적 질량 재분배 기반의 실시간 생세포 표현형 바이오센싱을 사용한 Gαq 단백질 억제와 관련하여 보고된 것(16배 변화)에 비해 상당히 높다. 화합물 10 코어 구조 화합물 15는 10 μM 초과의 GI50 값을 가지며, 시험된 최고 용량에서 일부 항증식 활성이 관찰되었다. 선형화 뎁시펩티드 화합물 5 내지 7에는 항증식 활성이 전혀 없다. 이 실험 설정에서, 화합물의 세포 투과성은 관찰된 항증식 효능에 기여하는 중요한 인자였다. 따라서, 모든 화합물을 저유출 MCDK 분석으로 특성화하였으며, 수동 세포 투과성을 평가하기 위해 EPSA(노출된 극성 표면적)를 측정하였다. N 아실 Hle 측쇄를 특징으로 하는 모든 거대고리 크로모뎁신은 흡수율 %(FA %; 평균 약 60% FA ± 20%) 및 EPSA 값과 관련하여 유사한 결과를 나타낸다. N-아실-Hle 측쇄가 결여된 코어 구조의 화합물 12 및 15는 약 5배의 FA % 감소 및 약간의 EPSA 변화를 나타내는 반면, 선형화 화합물 5 내지 7은 10배 이상의 FA % 감소 및 2배 초과의 EPSA 변화를 보여, 이들 화합물의 수동 세포 투과성을 크게 감소시킬 가능성이 매우 높음을 나타낸다. Gαq/11 단백질에 대한 화합물 12 및 15의 결합 친화도 및 동역학의 비편향적 평가는 예를 들어 정제된 단백질을 이용한 표면 플라즈몬 공명과 같은 실험 설정을 필요로 할 것이다.
요약하면, C. 백시니이의 성공적인 유전자 조작으로 인해 화합물 (A1)의 생성이 증가된 돌연변이체가 생성되고, 이는 화합물 (A1)의 확장가능한 생성에 대한 지속가능하고 수율 높은 생명공학적 공정을 확립하기 위한 추가 균주 및 공정 개발을 가능하게 한다. 과잉생성 돌연변이체는 생합성 조립 라인의 유연성에 대한 이해를 높일 수 하는 5개의 신규 크로모뎁신의 단리 및 구조적 특성화를 가능하게 했으며, 인간 혈장에서 형성된 화합물 (A1)의 주요 대사산물의 구조적 지정을 가능하게 했다. 또한, 세포 증식 분석에서 15개 크로모뎁신의 포괄적인 SAR은 Gαq/11 돌연변이가 있는 암 세포주에 대한 뛰어난 효능과 선택성을 강조한다.
보충 정보
실험 절차
박테리아 균주 및 배양 조건, 클로닝 및 접합, 조사된 프로모터의 서열은 본원 명세서(예를 들어, 실시예 1)에 기술되어 있다.
화합물 단리 및 분석 절차
화합물 단리: 50 L의 배양액을 50 L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 증발 건조시켰다. 미정제 추출물을 30 L의 메탄올/물(9/1)에 용해시키고, 각 30 L의 시클로헥산으로 3회 추출하였다. 메탄올/물 층을 물만 남을 때까지 증발시켰다. 이어서, 이를 25 L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 증발 건조시켰다. 탈지된 추출물을 400 mL의 메탄올에 용해시키고, 용리액으로서 메탄올 및 Sephadex LH20이 충전된 컬럼(길이 25 cm, 직경 12. 5 cm)에서 SEC로 분별하였다. 각 200 mL의 분획을 수집하고, 수집된 분획을 크로모뎁신 또는 발히뎁신의 존재에 대해 UPLC-UV-MS로 분석하였다. 풍부한 분획을 모아 증발 건조시켰다. 농축된 분획을 메탄올에 용해시키고, Sunfire C18 컬럼 상의 정제용 HPLC(30 x 150 mm, 5 μm 입자 크기; 용리액 A: 0.1%의 포름산을 함유하는 탈이온수, 용리액 B: 0.1%의 포름산을 함유하는 메탄올; 유량 60 mL/분; 구배: 15분 내에 65% B에서85% B)로 추가로 정제하였다. 분별은 질량분석법에 의해 시작되었다. 풍부한 분획을 모아 증발 건조시켰다. 필요한 경우, 2차 정제용 HPLC 정제를 수행하여 순도 95% 초과의 화합물을 수득하였다.
LC-UV-MS 측정: 포토다이오드 어레이와 하전 에어로졸 검출기가 장착된 Vanquish UHPLC(Thermo Scientific)에서 측정을 수행하였다. UHPLC는 Orbitrap ID-X(Thermo Scientific) 질량분석기에 연결되었다. MS 스펙트럼은 60,000의 질량 분해능으로 기록되었고, MS/MS 스펙트럼은 15,000의 질량 분해능으로 기록되었다. 스펙트럼은 FreeStyle™ 1.5 소프트웨어(Thermo Scientific)를 사용하여 처리하였다. 화합물 (A1)의 정량화는 Chromeleon™ 7.3을 사용하여 평가하였다.
LC-UV-MS 분석을 위한 샘플 준비: 5 mL의 동결-해동 배양액을 15 mL 코니칼 원심분리 튜브에 옮기고 5 mL의 CH3CN과 완전히 혼합하였다. 2 g의 황산마그네슘 및 0.5 g의 아세트산나트륨을 혼합물에 첨가하고 격렬하게 진탕하였다. 혼합물을 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상 분리를 얻었다. 4 mL의 유기층을 시험관에 옮기고 용매를 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 400 μL의 DMSO에 용해시키고 실온에서 10분 동안 진탕하였다. 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 후, 용액의 분취량을 HPLC 바이알에 옮겼다. 이로써 샘플은 10배 농축된다. LC 방법: BEH C18 컬럼(1.7 μM, 2.1x100 mm 컬럼 + 2.1x10 mm 전치 컬럼; Waters AG)을 사용하여 0.9 mL/분의 유량 및 60℃의 컬럼 온도에서 샘플을 분석하였다. 시작 조건은 0.02%의 포름산을 함유하는 95% H2O 및 0.014%의 포름산을 함유하는 5% CH3CN이었다. 구배는 0.2분 후에 시작되었고 6분 내에 100% CH3CN까지 선형적으로 증가했다. PDA-, MS-, 및 CAD-신호를 동시에 기록하였다. 10, 50, 100, 200, 및 400 μg/mL 화합물 (A1)의 외부 표준물질로 생성된 검량선을 사용하여 220 nm의 UV로 화합물 (A1)의 정량화를 수행하였다. 샘플 및 표준물질 둘 모두에 대해 주입 부피는 1 μL였다.
LC 방법: BEH C18 컬럼(1.7 μM, 2.1x100 mm 컬럼 + 2.1x10 mm 전치 컬럼; Waters AG)을 사용하여 0.9 mL/분의 유량 및 60℃의 컬럼 온도에서 샘플을 분석하였다. 시작 조건은 0.02%의 포름산을 함유하는 95% H2O 및 0.014%의 포름산을 함유하는 5% CH3CN이었다. 구배는 0.2분 후에 시작되었고 6분 내에 100% CH3CN까지 선형적으로 증가했다. PDA-, MS-, 및 CAD-신호를 동시에 기록하였다. 10, 50, 100, 200, 및 400 μg/mL FR의 외부 표준물질로 생성된 검량선을 사용하여 220 nm의 UV로 FR의 정량화를 수행하였다. 샘플 및 표준물질 둘 모두에 대해 주입 부피는 1 μL였다.
NMR 측정: NMR 실험은 600 MHz(1H) 및 150 MHz(13C)에서 작동하는 Bruker Ultrashield 600 Plus NMR 분광계에서 수행하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker Topspin(버전 3.5) 및 MestReNova(버전 14.2)를 사용하여 처리하였다. 스펙트럼은 DMSO-d6의 경우 δH/C 2.50/39.52, CD3CN의 경우 δH/C 1.94/1.32에서 공명이 있는 잔류 용매 신호를 기준으로 하였다.
합성 절차
화합물 10 및 11의 제조: 화합물 (A1)(20 mg, 0.20 mmol) 및 포름산암모늄(12.6 mg, 0.2 mmol)을 1 mL의 메탄올에 용해시켰다. 탄소 상의 팔라듐(8.5 mg, 0.0080 mmol)을 첨가한 후, 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 셀라이트를 통한 여과로 반응물을 중단시키고 증발 건조시켰다. 생성된 잔류물을 정제용 HPLC로 정제하여 95% 초과의 순도 및 각각 약 20% 및 15%의 단리 수율을 갖는 7 및 8을 수득하였다.
5 내지 7의 제조: 화합물 (A1), 8, 또는 10(50 mg, 약 0.05 mmol)을 2 mL의 DMSO에 용해시켰다. 트리에틸아민(70 μL, 0.5 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 100℃에서 4시간 동안 교반하였다. 100 mL의 물을 부어 반응물을 ??칭한 후, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 증발 건조시켰다. 생성된 잔류물을 정제용 HPLC로 정제하여 95% 초과의 순도 및 약 40%의 단리 수율을 갖는 5 내지 7을 수득하였다.
4-브로모페나실 브로마이드를 이용한 화합물 5의 유도체화: 화합물 5(2 mg, 2 μmol)를 1 mL의 아세토니트릴에 용해시켰다. 4 브로모페나실 브로마이드(0.66 mg, 2.4 μmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.31 mg, 2.4 μmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 20℃에서 30분 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가하여 반응물을 ??칭하여 생성물을 침전시키고, 이를 원심분리하고 아세토니트릴에 용해시켜 회수하였다. 미정제 반응 생성물을 LC-MS/MS 실험에 사용하여 상보적 분석 방법으로 5의 선형 서열을 증명하였다.
세포 증식 분석
크로모뎁신(화합물 (A1) 및 2 내지 15)을 이용한 세포 증식 분석: 세포주 설명: 92.1 - 이형접합성 GNAQ Q209L 돌연변이가 있는, 원발성 종양으로부터 유래된 포도막 흑색종 세포주. Sigma Aldrich로부터 구입. MP41(CRL-3297) - 이형접합성 GNA11 Q209L 돌연변이가 있는, 원발성 종양 유래 포도막 흑색종 세포주. ATCC로부터 구입. A375 - 동형접합성 BRAF V600E 돌연변이가 있는, 피부 흑색종 세포주. 출처: 암 세포주 백과사전(CCLE). SK-MEL-30 - 이형접합성 NRAS Q61K 돌연변이가 있는, 피부 흑색종 세포주. 출처: CCLE.
세포를 37℃, 5% CO2, 및 95% 상대 습도에서 100 μL의 총 부피로 96웰 플레이트에서 배양하였다. A375, DMEM 배지(DMEM 고글루코스(4.5 g/L), Bioconcept, ref. 1-26F01-I)를 제외하고, 모든 세포주는 RPMI 배지(L-글루타민이 없는 RPMI 1640, Bioconcept ref. 1-41F01-I)에서 배양되었고, 10% FCS(Bioconcept, ref. 2-01F30-I)로 보충되었다. 화합물로 처리하기 전날 밤 웰당 2~3천개의 세포를 96웰 플레이트에 접종하였다(농도 범위: 1/3 희석 단계로 260 nM부터 0.036 nM까지; 7의 경우, 농도 범위는 1/3 희석 단계로 10000 nM부터 1.52 nM까지 증가됨). 처리 96시간 후 웰당 10 ul의 레자주린을 첨가하여 세포 생존율을 측정하였다. 결과를 분석하고 GraphPad Prism 9.0.1을 사용하여 플롯팅하였다.
세포 투과성 평가
MDCK-저유출 단층을 이용한 세포 기반 트랜스웰 분석: 수동 투과성을 측정하기 위해, 저유출 수송체 활성(MDCK-LE)을 갖는 MDCK 세포 서브클론에서 화합물 (A1) 및 2 내지 15를 시험하였다. 인큐베이션은 앞서 기술한 바와 같이 계약 연구 기관에서 수행하였다.
초임계 유체 크로마토그래피에 의한 ESAPSA 측정: 화합물 (A1) 및 2 내지 15를 초임계 유체 크로마토그래피(SFC)로 시험하여 ESAPSA 값을 측정하였다. Chirex 3014 컬럼(5 μM, 3x100 mm 컬럼, 100 Å 기공 크기; Phenomenex)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 시작 조건은 20 mM의 포름산암모늄을 함유하는 5% 메탄올 및 95% scCO2였다. 구배는 4.5분 내에 20 mM의 포름산암모늄을 함유하는 60% 메탄올까지 선형적으로 증가했다.
혈장 인큐베이션 및 정량화
혈장 인큐베이션 및 샘플 준비: 화합물 (A1)을 PBS 및 모은 혼합 성별 마우스(CD-1), 시노몰구스 원숭이, 및 인간 혈장에 5.00 μg/mL로 첨가하였다. 샘플을 650 rpm으로 진탕하면서 37℃의 Thermomixer(Eppendorf)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 24시간 후, 각 인큐베이션 튜브로부터 50 μL의 분취량(n=3)을 채취하였다. 일반 내부 표준물질인 글리벤클라미드와 와파린 둘 모두를 62.5 ng/mL로 함유하는 200 μL의 아세토니트릴로 50 μL의 샘플을 ??칭하였다. 샘플을 잠시 볼텍싱하고, 4000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 200 μL의 상청액을 깨끗한 800 μL의 96웰 샘플 수집 플레이트에 옮겼다.
LC-MS/MS에 의한 정량화: LC-MS/MS 분석은 SRM 획득 모드를 사용하여 AB Sciex QTRAP 6500에 연결된 Shimadzu Nexera UPLC로 수행하였다(3 μL 주입). ACE 3 C18-PFP(3 μM, 2.1x50 mm 컬럼)을 사용하여 65℃의 컬럼 온도에서 샘플을 분석하였다. 시작 조건은 0.1%의 포름산을 함유하는 97% H2O 및 0.1%의 포름산을 함유하는 3% CH3CN이었다. MS-MRM(포지티브 모드의 전기 분무, 이온 분무 전압: 5000 V, 소스 온도: 500℃, 커튼 가스: 25 psig, 분무기 가스: 60 psig, 터보 이온 분무 가스: 40 psig, 질량 범위: 낮음, 분해능 Q1/Q3: 단위, 충돌 가스: 중간, 체류 시간: 12 msec)으로 화합물 (A1) 및 5의 정량화를 수행하였다 각각 10.0, 5.00, 2.50, 1.00, 0.500, 0.100, 0.050, 및 0.010 μg/mL 농도의 화합물 (A1) 및 5의 검량 표준물질로 개별 검량선을 확립하였다. Analyst Classic 알고리즘을 사용하는 AB Sciex Analyst 소프트웨어(v.1.7)로 피크 적분 및 정량화를 수행하였다.
FR의 혈장 인큐베이션에 대한 5의 첨가: 37℃에서 8시간 동안 인간 혈장에서 인큐베이션한 후 준비된 샘플에 100 ng의 5를 첨가하였다(최종 농도 6 μg/mL). BEH C18 컬럼(1.7 μM, 2.1x100 mm 컬럼; Waters AG)을 사용하여 0.5 mL/분의 유량 및 40℃의 컬럼 온도에서 첨가 전후의 샘플을 분석하였다. 시작 조건은 0.1%의 포름산을 함유하는 70% 물 및 0.1%의 포름산을 함유하는 30% CH3CN이었다. 구배는 0.5분 후에 시작되었고, 1.5분 내에 99% CH3CN까지 선형적으로 증가했다. LC-MS 분석은 MSe 획득 모드를 사용하여 Waters Synapt G2-Si QTOF에 연결된 Waters Acquity I-Class UPLC로 수행하였다(5 μL 주입).
결과
C. 백시니이의 프로모터 삽입 돌연변이체의 특성화
화합물 (A1)의 생성에 대한 가장 강한 긍정적 효과는 프로모터 ermE* 및 plpp에 대해 관찰되었고, 그 다음으로 J23119 및 vioP에 대해 관찰되었다. 프로모터 nptll 및 rbs는 야생형 대조군에 비해 낮은 화합물 (A1) 역가를 나타냈다.
화합물 2 내지 4의 구조 규명
탄소 원자 수와 잔기가 지정된 화합물 (A1) 및 2의 화학 구조 및 원자 번호는 아래와 같다.
탄소 원자 수와 잔기가 지정된 화합물 3 및 4의 화학 구조 및 원자 번호는 아래와 같다.
탄소 원자 수와 잔기가 지정된 화합물 5 및 7의 화학 구조 및 원자 번호는 아래와 같다.
2 내지 4에 대한 생합성 제안
세포 증식에 대한 크로모뎁신의 효과
Gq 또는 G11 돌연변이 UM 세포주 및 Gq 또는 G11 야생형 피부 흑색종 세포주의 증식에 대한 시험 화합물의 효과는 도 13a 및 도 13b에 도시되어 있다.
수동 세포 투과성의 평가
인간 혈장 인큐베이션에서의 화합물 (A1) 및 5의 정량화
실시예 4: 항체 약물 접합체에 대한 제형의 개발
예시적인 PMEL17 항체-약물(GNAQ 및/또는 GNA11 억제제) 접합체에 대한 7개의 서로 다른 제형을 시험하였다(표 27).
일단 제형화되면, 제형을 다양한 보관 조건에 적용하여 안정성을 측정하였다. 바이알 내 동결건조물(LYVI) 연구는 제형화된 ADC를 5±3℃, 25±2℃, 또는 40±2℃에서 0, 1, 2, 또는 4개월에 걸쳐 시험하였다(표 28). 바이알 내 액체(LIVI) 연구는 제형을 5±3℃, 25±2℃/60±5% 상대 습도(RH), 또는 40±2℃/75±5% RH에서 0 또는 1개월에 걸쳐 시험하였다(표 29).
분석
이어서, 다양한 보관 조건에서 0, 1개월, 2개월, 또는 4개월 후에 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 제형을 분석하였다. 0개월과 4개월 사이에, 2% 미만의 단량체 함량의 분해가 관찰되었으며, ADC의 응집이 주요 분해 메커니즘 중 하나인 것으로 판단되었다(도 14). 또한, 눈에 보이지 않는 입자를 검출하기 위해 광 차폐를 사용하여 샘플을 분석하였다. 이 분석에서는 눈에 보이지 않는 입자가 시간이 지나도 크게 증가하지 않는 것으로 나타났다(도 15). 모세관 전기영동에서는 PMEL17 항체로부터 유래된 불순물이 나타났다(도 16). 모세관 구역 전기영동을 사용하여, 다양한 제형에서 높은 수준의 전하 변이체가 존재함이 확인되었고(도 17), LIVI의 경우 모세관 구역 전기영동은 더 낮은 pH와 상관관계가 있음이 확인되었다(도 19).
LYVI는 페이로드의 가수분해를 통한 개환을 통한 분해를 방지함으로써 페이로드의 안정화를 가능하게 하는 것으로 확인되었고(도 18), LIVI의 경우 개환은 높은 pH와 상관관계가 있음이 확인되었다(도 19).
2개월의 보관 기간 후에 효능을 시험하기 위해 제형을 분석하였다. 분석 결과, F1, F2, F3, 및 F5 제형의 경우 2개월 후에도 효능 저하가 없는 것으로 나타났다(도 20).
20R topline 바이알을 사용하여 ADC 동결건조 사이클 실행가능성 시험을 수행하였다.
실시예 5: 시노몰구스 원숭이에서의 화합물 (E)의 평가
예시적 ADC인 화합물 (E)를 3 내지 75 mg/kg의 용량 범위에서 단회 용량으로 또는 반복 용량으로 시노몰구스 원숭이에게 정맥내 투여하였다. 총 항체(tmAb) 수준을 측정하였다. tmAb 노출은 시간이 지남에 따라 감소했으며 제거 반감기는 약 100시간이었다. 총 활성 ADC(tACDa; 적어도 하나의 활성 페이로드를 운반하는 ADC)에 대한 노출은 반감기가 약 40시간으로 더 빠르게 감소한 반면, 총 비활성 ADC(tACDi; 적어도 하나의 비활성 페이로드를 운반하는 ADC)는 투약 후 약 72시간 후에 최대로 증가했으며, 이후에는 tmAb와 거의 평행하게 감소했다(도 21). tACDa 및 tACDi의 노출 프로파일은 파파인 방출 분석(PRA)으로 측정된 접합된 활성 및 비활성 페이로드의 농도-시간 프로파일과 일치했다.
화합물 (E)는 3 내지 75 mg/kg에서 대략 용량 비례적인 노출을 나타냈다. 3회 Q2W 용량(1.0~1.4) 후에 tmAb 및 tADCi에 대한 약간의 축적만이 관찰된 반면, tADCa는 축적되지 않았다. 유리 활성 페이로드의 혈장 노출은 모든 샘플에서(가장 높은 75 mg/kg의 시험 화합물 (E) 용량에서도) 매우 낮은 수준(1 ng/mL 미만)에서만 검출되었다. 결과는 혈장 안정성의 시험관내 평가와 일치했다. 표적-매개 약물 특징은 관찰되지 않았다.
6주의 비-GLP 용량 범위 확인(DRF) 연구(4회 용량) 및 중요한 GLP-준수 13주 독성 연구(7회 용량) 둘 모두에서 시노몰구스 원숭이를 대상으로 화합물 (E)의 비임상적 안전성 프로파일을 평가하였다. 모든 생활 관찰뿐만 아니라 대부분의 임상 및 해부학적 병리 관찰은 화합물 (A1)의 약리학(Gq/11 단백질 억제)과 관련될 수 있다. 모든 결과는 중증도가 미미하거나 경미했으며, 시험된 모든 용량 수준에서 3주의 회복 기간 내에 전체 또는 부분 가역성을 나타냈으므로; 최고 비중증 독성 용량(HNSTD)은 최고 시험 용량인 75 mg/kg Q2W로 설정되었다.
여러 ADC의 두 가지 후향적 분석에서는, 시노몰구스 원숭이를 대상으로 BSA 기반의 변환된 HNSTD의 1/6을 사용하여 시작 용량을 선택하면 일반적으로 1상 시험에서 효과적 용량 증량과 안전성 평가가 허용되는 균형을 이루는 것으로 나타났다. 이 접근법은 또한 치료 용량 미만 수준에서 환자를 치료하는 것을 방지하고 MTD의 효율적인 결정을 가능하게 한다. 상기에 기초하여, 화합물 (E)의 시작 용량은 75 mg/kg(HNSTD)의 BSA 변환에 의해 계산되었으며, 안전 계수 6을 적용하여 4 mg/kg의 시작 용량이 산출되었다.
4 mg/kg에서의 예측된 인간 PK를 기반으로, 제안된 시작 용량(4 mg/kg Q2W) 대비 시노몰구스 원숭이의 HNSTD에서 달성된 노출 안전 여유, 및 예측된 유효 용량 범위(2~15mg/kg Q2W)가 표 30에 제시되어 있다.
예측된 인간 PK 및 종양 성장 억제의 계산 모델을 기반으로, Q2W 투여되는 2 내지 15 mg/kg에서 달성되는 노출은 환자에서 항종양 활성을 달성할 것으로 예측된다. 이러한 투약 요법이 실시예 5에 기술된 연구를 위해 선택되었다. 예를 들어 새로운 임상 데이터에 기초하여, 증가 또는 감소된 빈도의 투약 요법(예를 들어, QW 또는 Q4W)이 사용될 수 있다.
실시예 6: 전이성 포도막 흑색종(MUM) 및 기타 GNAQ/11 돌연변이 흑색종 환자에서의 화합물 (E)의 연구
본 실시예는 전이성 포도막 흑색종(MUM) 및 기타 GNAQ/11 돌연변이 흑색종 환자에서의 예시적 ADC인 화합물 (E)의 제I/II상 연구를 기술한다. 본 연구의 목적은 MUM 및 GNAQ/11 돌연변이가 있는 기타 흑색종 환자에서 단일 제제로서의 화합물 (E)의 안전성, 내약성, 및 항종양 활성을 특성화하는 것이다.
목적 및 평가변수
제I상의 1차 목적은 안전성 및 내약성을 특성화하고 단일 제제로서의 화합물 (E)에 대한 추가 연구를 위한 MTD 및/또는 RD 및 요법을 확인하는 것이다. 1차 목적의 평가변수는 치료 첫 28일 동안의 용량 제한 독성(DLT)의 발생률과 중증도, 및 검사 값, 심전도(ECG), 및 활력징후의 변화를 포함한, 이상사례(AE) 및 중대한 이상사례(SAE)의 발생률과 중증도를 결정하는 것이다. 평가변수로서의 내약성은 용량 중단, 용량 감소, 및 휴지의 빈도를 살펴봄으로써 결정된다.
제I상의 2차 목적은 다음과 같다: 1) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 약동학 특성화; 2) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 면역원성 평가; 및 3) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 예비 항종양 활성 평가. 2차 목적의 평가변수는 총 mAb, 접합된 활성 및 비활성 페이로드, 및 접합되지 않은 활성 페이로드에 대한 PK 파라미터(예를 들어, AUC, Cmax, CL, 및 반감기)를 결정하는 것이다. 항약물 항체(ADA)의 유병률과 발생률뿐만 아니라 RECIST v1.1에 따른 최적 전체 반응(BOR) 및 전체 반응률(ORR)이 제I상의 2차 목적에 대한 평가변수로서 결정된다. ORR은 RECIST 1.1에 따른 중앙 평가에 따라, 연구 치료 시작부터 PD, 사망, 새로운 요법의 시작, 동의 철회, 또는 연구 종료 중 먼저 도달하는 시점까지 기록된 BOR이 확인된 완전 반응(CR) 또는 확인된 부분 반응(PR)인 환자의 비율로 정의된다.
본 연구의 제II상의 1차 목적은 RECIST 1.1에 따른 ORR을 평가변수로 하여, 단일 제제로서의 화합물 (E)의 항종양 활성을 평가하는 것이다.
제II상의 2차 목적은 다음과 같다: 1) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 항종양 활성의 추가 평가; 2) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 전체 생존기간 평가; 3) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 안전성과 내약성의 추가 특성화; 및 4) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 약동학의 추가 특성화. 목적은 RECIST v1.1에 따라 반응 기간(DoR), 무진행 생존기간(PFS), 및 DCR을 결정함으로써 평가된다. 전체 생존기간이 또한 결정된다. 안전성 평가변수는 검사 값, ECG, 및 활력징후의 변화를 포함한, AE 및 SAE의 발생률과 중증도를 포함한다. 내약성 평가변수는 용량 중단, 용량 감소, 및 휴지의 빈도를 살펴봄으로써 결정된다. PK 파라미터는 총 mAb, 접합된 활성 및 비활성 페이로드, 및 접합되지 않은 활성 페이로드를 포함한다(예를 들어, AUC, Cmax, CL, 및 반감기).
제I상의 탐색적 목적은 단일 제제로서의 화합물 (E)의 예비 항종양 활성을 평가하는 것이다. 제I/II상의 탐색적 목적은 다음과 같다: 1) 종양 내 ADC 표적의 존재의 평가; 2) 종양에서의 약력학과 PK/PD 관계의 평가 및 종양에서의 표적 억제 정도의 정량화; 3) 화합물 (E)의 약력학(PD) 효과의 평가; 4) 단일 제제로서의 화합물 (E)의 면역조절 효과의 특성화; 5) 종양 및 cfDNA의 효능 및/또는 내성의 잠재적 예측 마커 대비 무세포 DNA(cfDNA)의 유전적 특성 및 예후 마커의 평가; 및 6) 종양 치료 후 전사체 프로파일 변화의 평가(예를 들어, 종양의 질환 반응, 모니터링, 및 내성에 대한 GNAQ/11 유전자 발현 표지의 정의). 탐색적 목적에 대한 평가변수는 RESCIST v1.1 및 OS에 따른 PFS의 평가; 종양에서의 PMEL 단백질 발현 및 기준선, 치료 중, 및 치료 종료시의 변화; 화합물 (E) 관련 화합물의 노출 및/또는 유도된 PK 파라미터 사이의 상관관계의 결정; 바이오마커(예를 들어, 기준선, 치료 중, 및 치료 종료시 종양에서의 DUSP6 및 RASGRP3 mRNA 및 pERK 단백질 발현의 변화); 종양 조직에서의 PD 마커(예를 들어, DUSP6, RASGRP3, 및 pERK)의 기준선으로부터의 변화; 및 종양 샘플에서의 면역 세포 마커(예를 들어, CD8, PD-L1)의 기준선으로부터의 변화를 포함한다. 암 관련 유전자에서의 기준선 및 기준선 이후 유전자 변화 및/또는 cfDNA 수준의 기준선으로부터의 변화, 및 종양 샘플에서의 RECIST v1.1에 따른 항종양 평가변수 및 유전자 발현 프로파일의 기준선으로부터의 변화도 관찰된다.
연구 설계
본 연구에는 2개의 파트가 있다: 제I상, 용량 증량 파트에 이어지는 제II상 파트. 용량 증량은 MUM 및 GNAQ/11 돌연변이가 있는 기타 흑색종을 앓고 있는 성인 환자에게 실시된다. 최대 허용 용량(MTD) 및/또는 권장 용량(RD)이 용량 증량 파트에서 결정되면, 연구는 제II상 파트로 계속될 수 있다. 제II상 파트는 MUM 환자의 두 그룹, 즉 이전에 테벤타푸스프 치료를 받은 그룹과 테벤타푸스프 경험이 없는 그룹을 대상으로 진행된다. MUM 외에도, 비포도막 GNAQ/11 돌연변이 흑색종 환자의 세 번째 그룹도 탐색될 수 있다.
연구의 증량 파트는 MUM 및 GNAQ/11 돌연변이가 있는 기타 흑색종 환자를 대상으로 수행된다. 모든 용량 증량 결정은 과용량 제어 증량(EWOC; Escalation with Overdose Control) 원칙에 따라 적응형 베이지안 로지스틱 회귀 모델(BLRM)에 따른다. MTD를 정의하기 위해 용량 증량 동안 대략 최소 14명의 환자가 필요할 수 있다. RD는 추가 탐색을 위해 권장되는 요법, 용량, 및 스케줄을 나타낸다. 연구 치료의 안전성(용량-DLT 관계 포함)과 내약성이 평가되고, PK, PD, 및 예비 항종양 활성을 포함한 이용가능한 모든 데이터의 검토를 바탕으로 제II상에서 사용하기 위한 용량 및 스케줄을 포함한 요법이 확인된다.
시작하려면 화합물 (E) 단일 제제를 28일 주기 동안 2주마다(Q2W) 투여한다. 새로운 데이터를 기반으로, 예비 PK, PD, 안전성, 및 효능 결과를 포함한 이용가능한 비임상 및 임상 데이터에 의해 뒷받침되는 경우, 대체 투약 요법(예를 들어, 감소 또는 증가된 투약 빈도)이 연구 중에 적용될 수 있다. MTD/RD가 확인되면, 정의된 환자 모집단에서 단일 제제로서의 화합물 (E)의 항종양 활성을 평가하고 연구 치료의 안전성, PK, 및 PD를 추가로 특성화하기 위해 제II상 파트에서 연구를 계속한다. 등록에는 이전에 테벤타푸스프 치료를 받은 그룹과 테벤타푸스프 경험이 없는 그룹이 모두 포함된다. 탐색될 경우, 등록에는 비포도막 GNAQ/11 돌연변이 흑색종 그룹이 포함될 수도 있다.
연구 모집단:
연구에 포함되려면 환자는 다음 기준을 모두 충족해야 한다:
1. 용량 증량 연구에 대한 사전 동의 시점에 18세 이상이어야 한다. 제II상의 경우, 사전 동의 시점에 12세 이상의 환자. 환자의 체중은 최소 40kg이어야 한다.
2. 18세 이상 환자의 경우 1 이하의 ECOG 수행도; 16세 이상 18세 미만 환자의 경우 70 이상의 Karnofsky 수행도; 12세 이상 16세 미만 환자의 경우 70 이상의 Lansky 수행도
3. 등록 당시 측정가능한 질환, 적어도 한 치수(기록할 가장 긴 직경)에서 통상적인 기술로 20 mm 초과 또는 CT 스캔으로 10 mm 초과로 정확하게 측정될 수 있는 하나의 병변.
4. 환자는 치료 기관의 자체 지침 및 요구 사항에 따라 연구에 필요한 생검을 받는 데 적합하고 받을 의향이 있어야 한다.
용량 증량 연구(제I상)의 모든 환자의 경우:
1. MUM 환자: 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 전이성 질환을 갖는 포도막 흑색종. 환자는 치료 경험이 없거나, 이전에 여러 차례 치료를 받았고 가장 최근 치료에서 진행된 상태이어야 한다.
2. 비-MUM 환자: 표준 요법 이후에 진행되었거나 만족스러운 대체 요법이 없고 국소 데이터에 기초하여 GNAQ/11 돌연변이의 증거가 있는 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 전이성 질환을 갖는 진행성 피부 또는 점막 흑색종.
제II상 참여 환자의 경우:
1. 테벤타푸스프 경험이 없는 그룹: 표준 요법 이후에 진행되었거나 만족스러운 대체 요법이 없는 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 전이성 질환을 갖는 포도막 흑색종의 진단.
2. 이전에 테벤타푸스프 치료를 받은 그룹: 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 전이성 질환을 갖는 포도막 흑색종의 진단. 환자는 이전에 테벤타푸스프 치료를 받았고 진행된 상태이어야 한다.
3. 비-MUM 환자: 표준 요법 이후에 진행되었거나 만족스러운 대체 요법이 없는 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 전이성 질환을 갖는, 국소 데이터에 기초하여 GNAQ/11 돌연변이가 있는 피부 또는 점막 흑색종의 진단을 받은 환자.
다음 기준 중 하나라도 충족하는 환자는 본 연구에 포함될 자격이 없다:
1. 본 연구에서 치료되는 것 이외의 악성 질환.
2. 활동성 뇌 전이, 즉 증상이 있는 뇌 전이 또는 알려진 연수막 질환.
3. 활동성 출혈이나 출혈 체질 또는 심각한 응고 장애(가족력 포함), 또는 생검을 방해할 수 있는 장기간의 전신 항응고가 필요한 의학적 상태의 증거.
4. 시험자의 의견으로는 심각한 주입 반응의 위험이 증가할 수 있는, ADC 또는 단일클론 항체에 대한 아나필락시스 또는 기타 중증 과민성/주입 반응의 병력.
5. 명시된 기간 내에 연구 치료의 첫 번째 용량 전에 다음의 항암 요법 중 하나를 사용한 치료:
a. 플루오로피리미딘 요법의 경우 2주 이내
b. 방사선 요법의 경우 4주 이내, 또는 연구 치료의 첫 번째 용량 전 2주 이내 완화를 위한 제한된 현장 방사선.
c. 화학 요법 또는 생물학적 요법(단일클론 항체 포함) 또는 연속적 또는 간헐적 소분자 치료제 또는 기타 연구용 제제의 경우 4주 이내 또는 5반감기 이내(둘 중 더 짧은 쪽).
d. 니트로소우레아 및 미토마이신 C와 같은, 주요 지연 독성이 있는 세포독성제의 경우 6주 이내.
e. CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1 길항제와 같은 면역 종양 요법의 경우 4주 이내.
f. 테벤타푸스프 치료의 경우 4주 이내
6. 치료를 요하는 울혈성 심부전과 같은 임상적으로 유의미하고/하거나 조절되지 않는 심장 질환(NYHA 등급 ≥ 2) 또는 의학적 치료에도 불구하고 임상적으로 유의미한 부정맥.
다른 포함/배제 기준이 적용될 수 있다.
연구 치료
화합물 (E)는 바이알 내 100 mg 동결건조물로서 제공된다(주입용 용액에 대한 분말). 시작용량은 2주에 1회(Q2W) 정맥내 투여되는 4 mg/kg이다. 표 31은 본 연구에서 평가된 시작 용량 및 용량 수준을 기술한다.
약동학
혈청, 혈장, 및 혈액에서 화합물 (E)의 단일 용량 및 정상 상태 PK를 특성화하기 위해 연구의 용량 증량 및 제II상 파트에서 모든 환자로부터 일련의 혈액 샘플을 수집한다. 또한, 남은 혈장/혈청/혈액 샘플은 탐색적 PK 및/또는 바이오마커 분석에 사용될 수 있다. 이는 충분한 샘플이 남아 있는 경우 단백질 결합 분석, 대사산물 프로파일링, 탐색적 바이오마커 분석, 단백질 결합, 또는 기타 분석을 위해 남은 혈청, 혈장, 및 혈액 샘플을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
인간 혈청 내 화합물 (E)(전체 항체로서)의 농도는 검증된 리간드 결합 분석을 통해 측정된다. 접합된 활성 및 비활성 인산화 페이로드의 농도는 파파인과의 인큐베이션 후 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 분석을 사용하는 검증된 분석을 통해 혈장에서 분석된다. 혈액 내 비접합 농도는 검증된 LC-MS/MS 분석을 통해 측정된다. 항약물 항체는 검증된 리간드 결합 분석을 통해 분석된다.
바이오마커
바이오마커 분석은 분자 및 세포 수준에서 연구 요법의 효과를 조사하는 데 사용될 뿐만 아니라 마커의 변화가 노출 및 임상 결과와 어떻게 관련될 수 있는지 확인하는 데 사용된다. 또한, 효능뿐만 아니라 내성 메커니즘에 대한 잠재적인 예측 마커가 탐색될 수 있다. 예시적인 바이오마커는 표 32에 기재되어 있다.
새로 채취한 치료 전 및 치료 중의 쌍을 이루는 종양 샘플이 필요하며, 스크리닝, 치료 중, 및 질병 진행 시점에 수집된다(선택 사항). 여러 면역 체크포인트 표적, 표적 조절, 및 세포 집단의 상태가 종양 조직에서 분석될 수 있다. PMEL17 및 pERK를 포함하는(이에 한정되지 않음) 바이오마커의 발현 및 국소화는 IHC 또는 적합하다고 간주되는 추가 기술을 통해 측정될 수 있다. 종양 표본은 mRNA에서의 DUSP6 및 RASGRP3의 발현에 대해 조사된다. 암 관련 유전자의 시퀀싱이 종양에서 수행될 수 있다. 종양은 스크리닝, 치료 중, 및 치료 종료 시점에 서열분석될 수 있다. 혈액은 cfDNA의 서열 분석이 가능하도록 치료 중 및 치료 종료 시점에 수집된다. 이 분석은 새로운 내성 돌연변이와 기존의 내성 돌연변이의 존재를 탐색하고, 잠재적으로는 다양한 시점에서 종양 및 cfDNA에서의 종양 돌연변이 부담을 탐색하고, 임상 반응 및 종양 내성 발달과의 관계를 조사한다. 연구 동안, 위에 명시된 바이오마커 외에도, 임의의 나머지 바이오마커 및/또는 PK 샘플에 대해 탐색적 바이오마커 연구가 수행될 수 있다.
기타 예는 전체가 참조로 포함되는 국제 출원 공개 WO 2020/128612호 및 미국 출원 공개 US 2020/0197528호에 기술되어 있다.
참조에 의한 통합
본원에 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원, 및 수탁번호는 각각의 개별 공보 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 통합된 것으로 표시된 것처럼 전문이 본원에 참조로 통합된다.
균등물
본 발명이 특정 양태를 참조하여 개시되었지만, 당업자가 본 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 양태 및 변형을 고안할 수 있음이 분명하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 양태 및 동등한 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
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accctgacca ttagcggcac ccaggcggaa 240 gacgaagcgg attattactg ccagtcttgg gaccattctt actctctggt tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaactgt cctgggacaa cctaaggccg ctccctccgt gaccctgttc 360 ccccccagct ccgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatcagcgac 420 ttctaccctg gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480 gtggagacaa ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540 agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac agaagctaca gctgccaggt cacccacgag 600 ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gc 642 <210> 25 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Arg Asp Lys Phe Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 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tgccaggatc 60 acttgttccg gggacgcatt gcgggacaag ttcgtgtact ggtaccagca gaagccgggt 120 caagccccag tgctcgtgat ctacgacgac aacaaccggc cttccggtat ccccgaacgc 180 ttctccggat ccaatagcgg aaacaccgcc accctgacca tttcgagagc tcaggccggg 240 gatgaagcgg actactactg ccagtcatgg gatcactcgt actccctcgt cgtgtttgga 300 ggcggcacga agcttactgt gctgggccag cctaaggccg ctccctccgt gaccctgttc 360 ccccccagct ccgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatcagcgac 420 ttctaccctg gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480 gtggagacaa ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540 agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac agaagctaca gctgccaggt cacccacgag 600 ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gc 642 <210> 29 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Arg Asp Lys Phe Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys 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Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Arg Asp Lys Phe Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp His Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 32 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 tcgtacgagc tcactcaacc gccttctgtg tccgtgtcac ccgggcagac tgcctccatt 60 acctgttcgg gagatgccct gcgcgacaag tttgtgtact ggtaccagca gaagcccgga 120 cagtcgccag tgctcgtcat ctatgacgac aacaacagac cttccggtat cccggaacgg 180 ttcagcggaa gcaattccgg caacaccgct accctgacca ttagcggcac tcaggccatg 240 gacgaagcgg attactactg ccaatcctgg gaccactcat actcccttgt ggtgttcggt 300 ggcggaacga agctgaccgt cctgggccag cctaaggccg ctccctccgt gaccctgttc 360 ccccccagct ccgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatcagcgac 420 ttctaccctg gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480 gtggagacaa ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540 agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac agaagctaca gctgccaggt cacccacgag 600 ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gc 642 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Glu Val Arg Met Ile Phe Asp Tyr 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Thr Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ile Pro Ile Leu Gly Ile 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Ala Arg Glu Val Arg Met Ile Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Arg Met Ile Phe 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polynucleotide <400> 45 caggtgcaat tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtt 60 agctgcaaag catccggagg gacgttttct acttacgcta tctcttgggt gcgccaggcc 120 ccgggccagg gcctcgagtg gatgggccgt atcatcccga tcctgggcat cgcgaactac 180 gcccagaaat ttcagggccg ggtgaccatt accgccgatg aaagcaccag caccgcctat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgaagtt 300 cgtatgatct tcgattactg gggccaaggc accctggtga ctgttagctc agcctctacg 360 aaaggcccaa gcgtatttcc cctggctcct tctagtaaat caacctcagg tggtacagca 420 gcccttggct gcctggtcaa agactatttc ccctgtccgg tgaccgtctc atggaactca 480 ggtgctttga catctggtgt gcatacattc ccagctgtgc tgcaaagtag tggactgtac 540 agcctttcca gcgtggtcac ggtgccaagt agctccttgg gtactcagac ttatatctgc 600 aatgtgaacc acaagccctc taacacgaag gtggacaagc gcgtggagcc caaatcttgc 660 gataagacgc atacttgtcc cccatgccct gctcctgagc tgttgggagg cccgtcagtg 720 ttcttgttcc ctccgaagcc taaggacact ttgatgataa gtaggacacc agaggtgact 780 tgcgtggtgg ttgatgtgtc ccatgaagat cccgaggtca aatttaattg gtacgtagat 840 ggtgtcgaag ttcacaatgc taagactaag ccaagggaag agcagtacaa cagtacatat 900 agggtagtct ccgtgctgac agtcctccac caggactggt tgaacggcaa ggaatacaaa 960 tgtaaggtgt caaacaaagc tctgcctgct cccattgaga aaacaatctc taaagccaaa 1020 ggccagccga gagagcccca agtctacact ttgcccccga gcagggagga aatgaccaag 1080 aatcaggtga gtctgacgtg cctcgtcaaa ggattttatc catgcgatat tgcagttgaa 1140 tgggagagca atggccagcc agagaacaac tataaaacca caccacccgt gctcgactct 1200 gatggcagct tcttcctcta tagcaagctg acagtcgata aatctcgctg gcagcaaggc 1260 aatgtgttct cctgctccgt catgcacgag gctttgcata accattatac tcaaaaatct 1320 ctgtccctgt cacctggtaa a 1341 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Gln Gln Ser Tyr Asp Tyr Tyr Thr 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 50 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Ala Ala Ser 1 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ser Tyr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 53 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu 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639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 56 gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgca gagccagcca gtctatttct tcttacctgg cttggtacca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactatt aatctacgct gcttcttctc tgcaaagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggatc cggcaccgat ttcaccctga ccattagctc tctgcaaccg 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tcttacgact actacacctt tggccagggc 300 acgaaagttg aaattaaacg tacggtggca gctccgtctg ttttcatctt tccacctagc 360 gacgagcaac tcaaaagtgg tacagcatcc gtggtttgtc tgctgaacaa tttttacccc 420 agggaggcta aggtccagtg gaaagtcgat aacgctcttc agtctggcaa cagtcaggag 480 agcgtcacag agcaggactc taaggatagc acttatagtc tgtcctccac gctgacactg 540 tctaaagcgg attatgagaa gcacaaggtt tacgcctgtg aggtaacgca ccaaggactc 600 tcctccccag ttaccaaatc tttcaacaga ggagaatgt 639 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Gly 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Synthetic peptide <400> 63 Ala Arg Glu Gly Ser Ser Tyr Phe Tyr Met Ala Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Asp Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Ser Tyr Phe Tyr Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 caggttcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60 tcctgcaaag caagcggcgg 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tccagagaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagatgtg 300 ggcgtgatgg actattgggg ccagggcaca ctggtcaccg ttagctctgc tagcaccaag 360 ggcccaagtg tgtttcccct ggcccccagc agcaagtcta cttccggcgg aactgctgcc 420 ctgggttgcc tggtgaagga ctacttcccc tgtcccgtga cagtgtcctg gaactctggg 480 gctctgactt ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 540 ctgagcagcg tggtgacagt gccctccagc tctctgggaa cccagaccta tatctgcaac 600 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 660 aagacccaca cctgcccccc ctgcccagct ccagaactgc tgggagggcc ttccgtgttc 720 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggaccca gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtacaacag cacctacagg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga atacaagtgc 960 aaagtctcca acaaggccct gccagcccca atcgaaaaga caatcagcaa ggccaagggc 1020 cagccacggg agccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccct gtgatatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac 1200 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaagt ccaggtggca gcagggcaac 1260 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 agcctgagcc ccggcaag 1338 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Ser Gly Asp Asn Leu Gly Thr Tyr Tyr Ala His 1 5 10 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Ser Gln Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Gly Ala Trp Asp Ala Pro Ser Pro Glu Leu Val 1 5 10 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Asp Asn Leu Gly 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gggcacctac tacgcccact ggtatcagca gaagcctgga 120 caggctcccg tgctggtcat ctacagccag tctcacagac ccagcggcat ccccgagaga 180 ttcagcggca gcaatagcgg caataccgcc acactgacca tcagcagagc acaggctggc 240 gacgaggccg attactattg tggcgcttgg gacgccccat ctcctgagct tgtttttggc 300 ggaggcacca agctgacagt gctgggacag cctaaggccg ctccctccgt gaccctgttc 360 ccccccagct ccgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatcagcgac 420 ttctaccctg gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480 gtggagacaa ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540 agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac agaagctaca gctgccaggt cacccacgag 600 ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gc 642 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser 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Synthetic polynucleotide <400> 113 gaagttcagc tgctggaatc tggcggagga ctggttcaac ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt cacctttagc agctacgcca tgagctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gccttgaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggcag cacatattac 180 gccgactctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagagccttc 300 cggctgtact ggctggatgt ttggggacag ggcaccctgg tcacagtgtc atct 354 <210> 114 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 114 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 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tctccaacaa ggccctgcca gccccaatcg aaaagacaat cagcaaggcc 1020 aagggccagc cacgggagcc ccaggtgtac accctgcccc ccagccggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggcttct acccctgtga tatcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc agtgctggac 1200 agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag 1260 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 tccctgagcc tgagccccgg caag 1344 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 116 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Gln Gln Val Tyr Ser Ala Pro Val Thr 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 118 Val Tyr Ser Ala Pro Val 1 5 <210> 119 <211> 107 <212> PRT <213> 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<210> 134 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 134 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Arg Arg Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 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ctggggctct gacttccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg acagtgccct ccagctctct gggaacccag 600 acctatatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660 cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc cagctccaga actgctggga 720 gggccttccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900 aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaagaataca agtgcaaagt ctccaacaag gccctgccag ccccaatcga aaagacaatc 1020 agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta cccctgtgat 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgagcct 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Sequence: Synthetic peptide <400> 158 Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 159 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 159 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Thr Trp Arg Thr Pro Gly 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 160 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 160 gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60 atcacctgta gagccagcca gggcatcagc aactacctgg cctggtatca gcagaaaccc 120 ggcaaggtgc ccaagctgct 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ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Ser Arg Leu Ile Ala Pro Trp Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 164 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Ala Arg Ser Arg Leu Ile Ala Pro Trp Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 165 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 165 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly 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gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 175 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 176 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 176 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 177 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 177 Gly Ser Ser Ala Ala Ser Gly Leu Ser Gly Asp Leu 1 5 10 <210> 178 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Synthetic peptide <400> 195 Ala Arg Ala Tyr Lys Leu Ser Trp Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 196 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 196 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Lys Leu Ser Trp Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 197 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 197 gaagttcagc tgctggaatc tggcggagga ctggttcaac ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt cacctttagc agctacgcca tgagctgggt ccgacaggct 120 cctggcaaag gccttgaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggcag cacatattac 180 gccgactctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagagcctac 300 aagctgagct ggctggatct ttggggccag ggcacactgg tcacagtgtc atct 354 <210> 198 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 198 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Lys Leu Ser Trp Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 205 gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60 atcacctgta gagccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaaactgct gatctatgcc gccagctctc tgcagtctgg cgtgccaagc 180 agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatatctag cctgcagcca 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcaa gtttggtacg cccctgtgac ctttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 206 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 206 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser 1 5 10 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ctgctgggag ggccttccgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 agcaggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga cccagaggtg 840 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 900 gagcagtaca acagcaccta cagggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaagtc tccaacaagg ccctgccagc cccaatcgaa 1020 aagacaatca gcaaggccaa gggccagcca cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc 1080 agccgggagg agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac 1140 ccctgtgata tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1200 acccccccag tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1260 aagtccaggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggca ag 1362 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 219 Gln Gln Leu Ile Phe Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 220 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 220 Leu Ile Phe Phe Pro Leu 1 5 <210> 221 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Phe Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 222 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 222 gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60 atcacctgta gagccagcca gggcatcagc aactacctgg cctggtatca gcagaaaccc 120 ggcaaggtgc ccaagctgct gatctacgct gccagcacac tgcagagcgg agtgcctagc 180 agattttctg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatatctag cctgcagcca 240 gaggacgtgg ccacctacta ttgccagcag ctgatcttct tccctctgac ctttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 223 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Phe Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 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caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 225 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 225 Ala Ser His Arg Leu His Ser Leu Phe Asp Val 1 5 10 <210> 226 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 226 Ala Arg Ala Ser His Arg Leu His Ser Leu Phe Asp Val 1 5 10 <210> 227 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 227 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 229 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ala Ser His Arg Leu His Ser Leu Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 231 Gln Gln Gly Leu Phe Tyr Pro His Thr 1 5 <210> 232 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 232 Gly Leu Phe Tyr Pro His 1 5 <210> 233 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 233 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Phe Tyr Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 234 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 234 gacatccaga tgacacagag ccccagcaca ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60 atcacctgta gagccagcca gagcatctcc tcttggctgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgat gccagcagcc tggaaagcgg cgtgccaagc 180 agattttctg gcagcggctc tggcaccgag ttcaccctga ccatatctag cctgcagcca 240 gaggacttcg ccacctacta ttgtcagcag ggcctgttct accctcacac ctttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 235 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 235 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Phe Tyr Pro His 85 90 95 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420 ggcggaactg ctgccctggg ttgcctggtg aaggactact tcccctgtcc cgtgacagtg 480 tcctggaact ctggggctct gacttccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg acagtgccct ccagctctct gggaacccag 600 acctatatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660 cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc cagctccaga actgctggga 720 gggccttccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900 aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaagaataca agtgcaaagt ctccaacaag gccctgccag ccccaatcga aaagacaatc 1020 agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta cccctgtgat 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aag 1353 <210> 243 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 243 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 244 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 244 Gln Gln Tyr Ile Phe Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 245 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 245 Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 246 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 246 Tyr Ile Phe Tyr Pro Leu 1 5 <210> 247 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 247 Gln Gly Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 248 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 248 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Phe Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 249 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 249 gacatccaga tgacacagag ccctagctcc gtgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60 atcacctgta gagccagcca gggcatctct tcttggctgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctatgcc gcttccagtc tgcagagcgg cgtgccaagc 180 agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatatctag cctgcagcca 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacatcttct accctctgac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 250 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 250 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Phe Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 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ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 252 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 252 Val Ala Ser Pro Ser Ala Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 253 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 253 Ala Arg Val Ala Ser Pro Ser Ala Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 254 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 254 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Ala Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 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caagacccac acctgccccc cctgcccagc tccagaactg 720 ctgggagggc cttccgtgtt cctgttcccc cccaagccca aggacaccct gatgatcagc 780 aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgtccc acgaggaccc agaggtgaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc cagagaggag 900 cagtacaaca gcacctacag ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 960 aacggcaaag aatacaagtg caaagtctcc aacaaggccc tgccagcccc aatcgaaaag 1020 acaatcagca aggccaaggg ccagccacgg gagccccagg tgtacaccct gccccccagc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tggtgaaggg cttctacccc 1140 tgtgatatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1200 cccccagtgc tggacagcga cggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1260 tccaggtggc agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320 cactacaccc agaagtccct gagcctgagc cccggcaag 1359 <210> 258 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 258 Gln Gln Ser Leu Phe Ala Pro Phe Thr 1 5 <210> 259 <211> 6 <212> PRT 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aactacctgg cctggtatca gcagaaaccc 120 ggcaaggtgc ccaagctgct gatctacgct gccagcacac tgcagagcgg agtgcctagc 180 agattttctg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatatctag cctgcagcca 240 gaggacgtgg ccacctacta ctgtcagcag agcctgttcg cccctttcac ctttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 262 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 262 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Phe Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 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tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 264 <211> 318 <212> DNA <213> Chromobacterium vaccinii <400> 264 cgtcgttgat cccaggcagc cctttgtctc cgtttctcca cgtcatgccc tgacccttgg 60 aacaggatgg gccgtcctgt cagacaatat gcttgatgaa ttagttcggt tgaactaacg 120 tggctgaaaa ttacaaaggc atttaatttt aaaaatataa atgccttata aatttcatgc 180 cgggaaaccg gtcatgacga ggatacaaga ggctgcatcc cgatttcgag gcgagagtgc 240 caagcattta cgtcgtccat gcccgttcgt tgttgccgcg cggcgggcgt gaattgaaca 300 gtcaaaggga cattcgcg 318 <210> 265 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 265 tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc 60 tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga 120 tctgatcaag agacaggata aggaggtaca gattcat 157 <210> 266 <211> 164 <212> DNA <213> Chromobacterium vaccinii <400> 266 caccggcctg acggccaagt gttgaaaaaa cgctgctcca tcaacggtta acgttggcgg 60 ggcggcgttt tttatttgac gctgggccgt tgactaaaat ataatcctcc gtcctttctg 120 gaggcgtgtt gtcttcggga agaatcaact aggaactgat agta 164 <210> 267 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 267 His His His His His His 1 5 <210> 268 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 atcaaaaaaa tattctcaac ataaaaaact ttgtgtaata cttgtaacg 49 <210> 269 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac 60 taaaccatg 69 <210> 270 <211> 162 <212> DNA <213> Burkholderia thailandensis <400> 270 gagctgttga ctcgcttggg attttcggaa tatcatgccg ggtgggcccg ggaaagccac 60 gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca 120 ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg tt 162 <210> 271 <211> 207 <212> DNA <213> Saccharopolyspora erythraea <400> 271 ggatccgacg tccatgcgag tgtccgttcg agtggcggct tgcgcccgat gctagtcgcg 60 gttgatcggc gatcgcaggt gcacgcggtc catcttgacg gctggcgaga ggtgcgggga 120 ggatctgacc gacgcggtcc acacgtggca ccgcgatgct gttgacagcc aatcgtgccg 180 gttggtagaa tacagaacca ctccaca 207 <210> 272 <400> 272 000 <210> 273 <400> 273 000 <210> 274 <400> 274 000 <210> 275 <400> 275 000 <210> 276 <400> 276 000 <210> 277 <400> 277 000 <210> 278 <400> 278 000 <210> 279 <400> 279 000 <210> 280 <400> 280 000 <210> 281 <400> 281 000 <210> 282 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 282 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Tyr Arg Ser Pro 1 5 10 15 Ala Met Pro Glu Asn Leu 20 <210> 283 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 283 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Leu Leu Thr Asp Ile Ser Tyr Ser Arg Tyr Trp 100 105 110 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Cys Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 284 <400> 284 000 <210> 285 <400> 285 000 <210> 286 <400> 286 000 <210> 287 <400> 287 000 <210> 288 <400> 288 000 <210> 289 <400> 289 000 <210> 290 <400> 290 000 <210> 291 <400> 291 000 <210> 292 <400> 292 000 <210> 293 <400> 293 000 <210> 294 <400> 294 000 <210> 295 <400> 295 000 <210> 296 <400> 296 000 <210> 297 <400> 297 000 <210> 298 <400> 298 000 <210> 299 <400> 299 000 <210> 300 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 300 ctccgtttct ccacgtcatg cc 22 <210> 301 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 301 gttccagtcg accagcagtt gc 22 <210> 302 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 302 gtatgttgtg tggaattgtg agc 23 <210> 303 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 303 ccactacaac gactacttgc 20 <210> 304 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 304 gacagcaagc gaaccggaat tgc 23 <210> 305 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 305 gatccgtcga cctgcagg 18 <210> 306 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 306 ctgaacacct tgtccgacat gaacg 25 <210> 307 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 307 catgaccgac tggaccttcc 20 <210> 308 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 308 ccacagctcc ttccgtagc 19 <210> 309 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 309 cagcaactta aatagcctct aagg 24 <210> 310 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 310 gctgctccat caacggttaa cg 22 <210> 311 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 311 cttgacagct agctcagtcc tagg 24 <210> 312 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 312 tcggaatatc atgccgggtg g 21 <210> 313 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 313 ctggaggcgt gttgtcttcg g 21 <210> 314 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 314 cgatgctagt cgcggttgat cg 22 <210> 315 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 315 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Gly Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 316 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagc 35 <210> 317 <211> 1200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: frsA fragment sequence <400> 317 atgaaaaaca gtgaatcgcc aatccatcat tttcaggcat cttcagcaca gctggatgta 60 tggatttctc aggaagtttc accgaatctg cccaacaata ttgccgagta tctgaatctc 120 gccggctcgt tggatgctgg attgtttctg caggctttaa gccaggtcgc cagtgagagc 180 gcggagctgc aatacaactt ccgtcacgat ggtctccagt tgaccaagtt tcgtcgagat 240 gatgaaggct gggagccgga cttcatcgat gtatcgacgc acggcgagcc ggaacacgca 300 gccctgcgcg ccatgcggga gcgggtggag aaacccttcg atctggcgcg ggacgcgttg 360 tttcgctgga ccttgatccg cctggccgac gagcgccaca tcttctgcca tgtgtatcac 420 cacatcgcga tggatggggc cggctatgtg atgctgctgc agcgcatagc cgaggtttac 480 ggcgcgctgc gggaaggcca gccggcaccg gcctgcggtt tcgccgatgc ggatgccatc 540 gtccgcgagg aagagcgcta ccgccagtcg gagcagttcg cggtcgaccg ggcattctgg 600 caagcgcgct cggccgagct ggcgacggcg gagccgccgc tgccggcggc cgatggcccg 660 ttcctggcgt tcgcccagac ggcggtgatt ccggaagacg cctgcggcgg gctgcggatg 720 acggccgagc ggctgggcgt ctcccagtcc cgtttgctga cagcagccat cgtcgcttat 780 ttccatcgct ggggcggcca gcaagagatc ttgttccggc tggcggtatc ggcgcgcagc 840 gatgcgacgc gacacgcgcc cggccacctg gcgcatgcgt tgccgctgct ggccagcctg 900 ccgccgcgcg ccagtctggc cgacatcgcg cgacagctgg acggcgaggt ggagcggatg 960 cgtccgcata cccgctatcg ggctgaggac atcgtgcgcg accaggccgg tgccggtttg 1020 gggcgcgggg cgcaggggcc tgtgatcaac ctcatgcctt ttgcttaccg cttcgagttt 1080 ggcgcctgtc gcgtggagtc cgcccatcag ctgaccgtcg gcgtgctgga cacgctggaa 1140 gtggcggtgc acgaccgcaa gaacggtgac ggcctccacc tcgatttgta cgcatccgag 1200 <210> 318 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 318 Ser Val His Val Leu Val 1 5 <210> 319 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 319 caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaaaaaac ccggctcctc cgtgaaagtg 60 tcctgcaaag cctccggcgg cacattctcc gactacgcca tcacatgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggcggc atcatcccca tcttcggcac agccaactac 180 gcccagaaat tccagggcag ggtgacaatc acagccgacg agtccacatc cacagcctac 240 atggagctgt cctccctgag gtccgaggac acagccgtgt actactgcgc cagggagggc 300 ggcctgctga cagacatctc ctactccagg tactggttcg cctactgggg ccagggcaca 360 ctggtgacag tgtcctccgc ctccacaaag ggcccctccg tgttccccct ggccccctcc 420 tccaaatcca catccggcgg cacagccgcc ctgggctgcc tggtgaaaga ctacttcccc 480 tgccccgtga cagtgtcctg gaactccggc gccctgacat ccggcgtgca cacattcccc 540 gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc ctgtcctccg tggtgacagt gccctcctcc 600 tccctgggca cacagacata catctgcaac gtgaaccaca aaccctccaa cacaaaagtg 660 gacaaaaggg tggagcccaa atcctgcgac aaaacacaca catgcccccc ctgccccgcc 720 cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc ctgttccccc ccaaacccaa agacacactg 780 atgatctcca ggacacccga ggtgacatgc gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc 840 gaggtgaaat tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa aacaaaaccc 900 agggaggagc agtacaactc cacatacagg gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag 960 gactggctga acggcaaaga gtacaaatgc aaagtgtcca acaaagccct gcccgccccc 1020 atcgagaaaa caatctccaa agccaaaggc cagcccaggg agccccaggt gtacacactg 1080 cccccctcca gggaggagat gacaaaaaac caggtgtccc tgacatgcct ggtgaaaggc 1140 ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg gagtccaacg gccagcccga gaacaactac 1200 aaaacaacac cccccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctgtactc caaactgaca 1260 gtggacaaat ccaggtggca gcagggcaac gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc 1320 ctgcacaacc actacacaca gaaatccctg tccctgtccc ccggcaaa 1368 <210> 320 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 320 caggttcagc tgctggaatc tggcggagga ctggttcaac ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctttggca tgagctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcagctaca gcggcagcga tacctactac 180 gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagatgtg 300 ggcgtgatgg actattgggg ccagggcaca ctggtcaccg ttagctctgc tagcaccaag 360 ggcccaagtg tgtttcccct ggcccccagc agcaagtcta cttccggcgg aactgctgcc 420 ctgggttgcc tggtgaagga ctacttcccc tgtcccgtga cagtgtcctg gaactctggg 480 gctctgactt ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 540 ctgagcagcg tggtgacagt gccctccagc tctctgggaa cccagaccta tatctgcaac 600 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 660 aagacccaca cctgcccccc ctgcccagct ccagaactgc tgggagggcc ttccgtgttc 720 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggaccca gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtacaacag cacctacagg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga atacaagtgc 960 aaagtctcca acaaggccct gccagcccca atcgaaaaga caatcagcaa ggccaagggc 1020 cagccacggg agccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gtgatatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac 1200 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaagt ccaggtggca gcagggcaac 1260 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 agcctgagcc ccggcaag 1338 <210> 321 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 321 Ser Val His Val Leu Val 1 5 <210> 322 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 322 Ser Val His Val Leu Val 1 5 <210> 323 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 323 Ser Val His Val Leu Val 1 5 <210> 324 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 324 Ser Val His Val Leu Val 1 5

Claims (34)

  1. 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 공정으로서,
    하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계;
    하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 환원시켜 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; 및
    하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하나 이상의 오프-타겟 시스테인 잔기의 재캡핑이 가능한 산화 조건하에 보관하여,
    부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계
    를 포함하는 공정.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 불변 도메인에 위치하는, 공정.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 2개 또는 4개의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하며, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 각 CH1 영역에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기가 하나 이상의 조작된 표면-노출 시스테인 잔기인, 공정.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역의 잔기 152(EU 넘버링)에 위치한 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기가 시스테인 또는 글루타티온으로 캡핑되는, 공정.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 불변 도메인에 위치하는, 공정.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 2개 또는 4개의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하며, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 각 CH1 영역에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기가 하나 이상의 조작된 표면-노출 시스테인 잔기인, 공정.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CH1 영역의 잔기 152(EU 넘버링)에 위치한 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는, 공정.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 공정이 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 접촉시켜 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 환원시킴으로써 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 단계를 포함하는, 공정.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 세척 버퍼가 5 mM 내지 50 mM의 시스테인을 포함하며, 임의로 환원 세척 버퍼가 10 mM 내지 40 mM, 20 mM 내지 30 mM, 5 mM 내지 15 mM, 5 mM 내지 25 mM, 5 mM 내지 35 mM, 5 mM 내지 45 mM, 40 mM 내지 50 mM, 30 mM 내지 50 mM, 20 mM 내지 50 mM, 10 mM 내지 50 mM, 10 mM 내지 20 mM, 15 mM 내지 25 mM, 25 mM 내지 35 mM, 30 mM 내지 40 mM, 또는 35 mM 내지 45 mM의 시스테인을 포함하며, 임의로 환원 세척 버퍼가 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 20 mM, 25 mM, 또는 30 mM의 시스테인을 포함하는, 공정.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 세척 버퍼의 pH가 6.0 내지 7.5이고, 임의로 pH가 6.5 내지 7.2, 또는 6.8 내지 7.0이고, 임의로 pH가 6.9인, 공정.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환원 세척 버퍼와 접촉시키는 단계가 컬럼에서 수행되며, 임의로 컬럼이 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼인, 공정.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 세척 버퍼와 접촉시킨 후, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 용리액에 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 공정.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 용리액의 pH가 5.5 내지 6.0이며, 임의로 pH가 5.8인, 공정.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 용리액 중 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도가 5 g/L 내지 25 g/L이며, 임의로 용리액 중 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도가 8 g/L 내지 20 g/L, 10 g/L 내지 18 g/L, 12 g/L 내지 15 g/L, 5 g/L 내지 20 g/L, 5 g/L 내지 15 g/L, 5 g/L 내지 10 g/L, 20 g/L 내지 25 g/L, 15 g/L 내지 25 g/L, 10 g/L 내지 25 g/L, 10 g/L 내지 20 g/L, 13 g/L 내지 14 g/L, 12 g/L 내지 15 g/L이며, 임의로 용리액 중 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도가 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L, 12 g/L, 13 g/L, 13.5 g/L, 14 g/L, 15 g/L, 16 g/L, 17 g/L, 18 g/L, 19 g/L, 20 g/L, 21 g/L, 22 g/L, 23 g/L, 24 g/L, 또는 25 g/L인, 공정.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 교반과 함께 용리액에 보관되는, 공정.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 교반 없이 용리액에 보관되는, 공정.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 최대 50% 내지 70% 용량, 또는 최대 60% 용량까지 채워져 용기에 보관되며, 임의로 용기가 최대 60% 용량까지 채워지는, 공정.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 12시간 내지 96시간 동안 보관되며, 임의로 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 12시간 내지 84시간, 24시간 내지 84시간, 36시간 내지 72시간, 48시간 내지 60시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 36시간, 72시간 내지 84시간, 60시간 내지 84시간, 48시간 내지 84시간, 36시간 내지 84시간, 12시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 36시간 내지 60시간, 48시간 내지 72시간, 또는 72시간 내지 96시간 동안 보관되며, 임의로 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 또는 96시간 동안 보관되는, 공정.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 실온에서, 또는 2℃ 내지 8℃, 또는 4℃에서 보관되는, 공정.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 디캡핑된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 공기 오버레이 상태로 보관되는, 공정.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 191, 195, 197, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400, 및 422번 위치로 이루어진 군으부터 선택된 위치에서의 그의 불변 영역에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며, 위치는 EU 시스템에 따라 넘버링되는, 공정.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄의 107, 108, 109, 114, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 197, 199, 및 203번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 그의 불변 영역에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며, 위치는 EU 시스템에 따라 넘버링되며, 경쇄는 인간 카파 경쇄인, 공정.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄의 152번 위치, 375번 위치, 또는 152번 및 375번 위치 둘 모두에서의 그의 불변 영역에 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며, 위치는 EU 시스템에 따라 넘버링되는, 공정.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 공정에 의해 생성된 부분 재산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 링커-약물 모이어티를 접합시켜 항체 약물 접합체를 생성하는 단계를 포함하는, 항체 약물 접합체를 생성하는 공정.
  31. 제30항에 있어서, 항체 약물 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 공정이 적어도 75%의 온-사이트(on-site) 커플링 또는 중쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("HC1")를 생성하며, 임의로 공정이 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 온-사이트 커플링 또는 중쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("HC1")를 생성하는, 공정.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 공정이 25% 미만의 오프-사이트(off-site) 커플링, 또는 경쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("LC1") 및/또는 중쇄당 2개의 링커-약물 모이어티("HC2")를 생성하며, 임의로 공정이 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 오프-사이트 커플링, 또는 경쇄당 하나의 링커-약물 모이어티("LC1") 및/또는 중쇄당 2개의 링커-약물 모이어티("HC2")를 생성하는, 공정.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 공정이 적어도 70%의 순도를 야기하며, 임의로 공정이 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 순도를 야기하며, 임의로 순도가 비환원 CE-SDS로 측정되는, 공정.
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