KR20230149418A - 매실 종내 및 매실과 살구의 종간 구별용 ssr 마커 세트 및 이의 용도 - Google Patents

매실 종내 및 매실과 살구의 종간 구별용 ssr 마커 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 매실 종내 및 매실과 살구의 종간 구별용 SSR 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 매실과 살구의 종간 구별이 가능하고, 매실 종내의 '야생종, 천매, 왕매실 및 백가하' 품종을 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로, 매실과 살구의 원료 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 활용되거나 매실의 품종별 순도 유지, 품종 보호, 종자 분쟁 해결 등에도 이용될 수 있을 것이다.

Description

매실 종내 및 매실과 살구의 종간 구별용 SSR 마커 세트 및 이의 용도{SSR marker set for discriminating intra-species of Prunus mume and inter-species of Prunus mume and Prunus armeniaca and uses thereof}
본 발명은 매실 종내 및 매실과 살구의 종간 구별용 SSR 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
매실(Prunus mume; Japanese apricot, plum)은 장미과에 속하는 낙엽활엽교목 형태로, 매화나무의 핵과를 매실이라 부른다. 원산지는 중국 사천성으로 알려져 있으며 한국, 중국 및 일본 등에 널리 분포되어 있고 국내의 매실 주산지로는 전남 광양시, 순천시와 경남 하동군 등이 있다. 매실은 숙신산(succinic acid), 시트르산(citric acid), 말산(malic acid) 등의 유기산을 포함하며, 시토스테롤(sitosterol)과 같은 무기질을 내포하고 있으며 소화불량 해소, 피로 회복, 해열 작용 및 비타민C가 풍부하여 3000년 전부터 건강보조 식품이나 약재로도 많이 사용되어 왔다. 특히 2015년 한해 매실 2829톤이 농축액, 매실 절임, 매실주 등 많은 부분에서 가공되어 이용되었으며 간 기능 개선, 성인병 예방, 변비 예방 등 다양한 효능이 보고되었다.
매실은 이용 형태에 따라 꽃을 감상하기 위한 관상용의 화매(花梅)와 과실을 이용하는 실매(實梅)로 크게 나뉜다. 실매는 숙기의 빠르기 정도에 따라 조, 중, 만생종으로, 과실 크기에 따라 소, 중, 대매(大梅)로, 신맛의 정도에 따라 산매(酸梅)와 감매(酸梅)로, 익은 정도에 따라 청매(靑梅)와 숙매(熟梅)로 분류되기도 한다.
매실 품종 중 하나인 천매는 2011년에 신품종으로 등록된 품종으로, 매실 주산지에서 재배면적이 증가하고 있으며 착즙량이 많아 액기스용으로 사용된다. 또한, 왕매실은 일반매실에 비해 2~3배 크고 품질과 수확량이 매우 우수한 경제과수로 재배되고 있으며, 백가하는 일본에서 재배되어 온 품종으로 절임용보다는 양조용으로 사용되고 있다. 매실에도 다양한 품종들이 있어 각각의 특성에 따라 가공방법의 차이가 있으므로, 혼·오용의 문제가 발생할 경우를 대처하여 이들을 판별하기 위한 방법이 요구된다.
살구(Prunus armeniaca; apricot)는 장미과에 속하는 목본류 형태로, 원산지는 동부아시아이고 국내를 포함하여 중국, 일본, 유럽 등 넓게 분포되어 있다. 살구에는 β-카로틴(carotene) 등의 성분들이 포함되어 있고, 이는 체내에서 비타민A로 전환되어 눈 건강에 좋고 노화 예방에도 효과적이다. 살구는 독특한 향이 있어 신선한 상태로 이용되거나 통조림, 잼, 건과 등으로 가공되기도 하며, 씨는 행인이라고 하여 한방에서는 진해 거담약으로 널리 이용되고 있다.
매실과 살구는 과실 및 수체 모양이 매우 유사할 뿐만 아니라 아주 가까운 근연종으로 상호교잡이 가능하여 잡종 품종들이 많기 때문에, 매실의 출하기가 되면 매실 과실과 매우 유사한 미숙 상태의 살구 과실이 매실로 둔갑되어 농산물의 유통질서를 어지럽히고 있는 실정이다. 따라서, 매실과 살구 과실을 명확히 구분하는 것이 필요하지만, 종래에는 과실 내의 핵 모양, 핵 표면의 홈, 구멍 모양 등의 식물 형태적 특성을 이용해서 매실과 살구를 구분했기 때문에 전문가가 아니면 그 구분이 어려웠다. 또한 매실과 살구의 중간계통들에 대한 종 판별은 더욱 어려워서 이들 종을 명확하게 구별할 수 있는 DNA 표지의 개발이 절실히 요구되고 있다.
최근 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종내 품종 간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위해 DNA 수준에서 유전자원의 다양성 연구를 가능하게 하는 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자마커는 소량의 DNA를 이용하여 식물의 생장과 관계없이 모든 조직에서 유전적 변이를 안정적으로 탐색하고 식별할 수 있어 형태적, 이화학적 판별에서의 한계를 보완하고 비교적 적은 비용으로 빠른 시간 안에 신뢰도 높은 분석이 가능하다. 본 발명에 사용된 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커는 주로 식물에서 널리 사용되는 분자마커로, PCR(Polymerase Chain Reaction) 기술을 이용하여 비교적 간단한 방법으로 다형성을 검출할 수 있으므로 실제 육종가들이나 육종연구자들도 선호하는 방법 중 하나이다. 또한, SSR 마커는 유전자 좌위마다 여러 대립 유전자를 검출할 수 있고, 높은 재현성을 보여 근연 종 내에서 호환성을 가지며, 형광 자동 유전형질 분석에서 효율적인 분석이 가능한 이점이 있다.
한편, 한국공개특허 제2011-0135835호에는 'RAPD 마커에 의한 매실 품종 판별 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머"가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0106967호에는 '매실과 살구 과실을 구분하는 방법 및 이를 위한 SCAR 표지 프라이머'가 개시되어 있으나, 본 발명의 매실 종내 및 매실과 살구의 종간 구별용 SSR 마커 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 매실(Prunus mume) 재래종, 매실 품종 '천매, 왕매실, 백가하' 및 살구(Prunus armeniaca) 재래종의 핵 게놈 서열을 비교하여 매실의 핵 게놈 서열에서 단순 반복 염기서열을 보이는 유전자좌를 기반으로 22개의 SSR(simple sequence repeat) 마커를 발굴하였고, 상기 SSR 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 다양한 매실과 살구 개체를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트가 매실과 살구를 구별할 수 있고, 매실 품종(재래종, 왕매실, 백가하, 천매) 간의 구별도 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 43 및 44의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 매실(Prunus mume) 종내 품종 판별 및 매실과 살구(Prunus armeniaca)의 종간 구별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물; 및 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 매실 종내 품종 판별 및 매실과 살구의 종간 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 매실 또는 살구 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 매실 종내 품종 판별 및 매실과 살구의 종간 구별 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 매실과 살구의 종간 구별이 가능하고, 매실 종내 '재래종, 천매, 왕매실 및 백가하' 품종을 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로, 한약재 및 식품으로 가공되어 유통되는 과정에서 매실과 살구를 명확히 판별하여 원료의 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 또한, 매실 품종별 순도 유지, 품종 보호, 그리고 종자의 분쟁 해결 등에도 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 SSR 마커를 이용하여 분석한 매실(Prunus mume, Pm) 재래종, 매실 품종 '천매, 왕매실, 백가하' 및 살구(Prunus armeniaca, Pa) 재래종에 대한 계통수를 보여주는 그림이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 43 및 44의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 매실(Prunus mume) 종내 품종 판별 및 매실과 살구(Prunus armeniaca)의 종간 구별용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 44의 서열 내의 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는 서열번호 1 내지 44의 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 매실 품종은 왕매실, 백가하 및 천매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 왕매실은 슈퍼왕매실이라고도 불리며, 일반 매실에 비해 2~3배 큰 초대형 우량 신품종이다. 또한, 상기 백가하는 매실과 살구가 교잡된 살구성 매실 품종이고, 상기 천매는 청매실의 대표 품종이다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물; 및 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 매실 종내 품종 판별 및 매실과 살구의 종간 구별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 전술한 바와 같으며, 상기 매실 품종은 왕매실, 백가하 및 천매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
매실 또는 살구 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 매실 종내 품종 판별 및 매실과 살구의 종간 구별 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 전술한 바와 같으며, 상기 매실 품종은 왕매실, 백가하 및 천매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 매실 또는 살구 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 매실 또는 살구 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 매실 또는 살구 의심 시료는 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 과수 또는 종자 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 매실 종내 품종 판별 및 매실과 살구의 종간 구별 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 44의 총 22개의 프라이머 세트를 이용하여 매실과 살구의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 후 Gene Scan 분석을 수행한 결과, 매실과 살구의 종간 구별이 가능함을 확인하였고, 매실 종내에서도 왕매실, 백가하 및 천매 품종이 서로 다른 집단으로 구분되어 품종별 판별이 가능함을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 유전자원 수집 및 DNA 추출
본 실험에서 사용된 매실 재래종 12개체, 천매 1개체, 왕매실 1개체, 백가하 1개체, 살구 재래종 2개체의 총 17개체(표 1)를 잎 형태로 샘플링하였고, DNA 추출은 액체질소를 사용해 급속 냉각 후 막자사발로 분쇄하여 Plant gDNA Extraction Kit(Biomedic, 한국)를 통해 DNA 추출 및 Elution buffer로 용출하였다.
2. SSR 마커 개발
매실의 핵 염기서열을 CLC Main Workbewnch 프로그램(version 20)을 이용하여 비교·분석한 후, 단순 반복 염기서열로 보이는 유전자좌위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 본 발명의 SSR motif와 이에 기반한 프라이머 세트 정보는 하기 표 2에 나타내었다.
3. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 DNA 증폭
상기 추출된 매실과 살구의 게놈 DNA를 각각 10 ng/㎕로 희석한 DNA 2 ㎕ (DNA 10 ng), SSR 프라이머 2 ㎕(forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕), Taq mixture(0.25 U/㎕ Taq DNA polymerase, 2x PCR buffer, 0.4 mM dNTPs, 3.2 mM MgCl2, 0.02% bromophenol blue; Dongsheng Biotech Co.,Ltd., 중국) 10 ㎕ 및 증류수 6 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕의 PCR 혼합물을 만들었다. PCR은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 각 프라이머 조건에 맞는 온도(표 1)에서 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 34회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃ 10분의 조건으로 수행하였다.
실시예 1. 본 발명의 SSR 프라이머 세트를 이용한 매실 종내 또는 종간 구별 확인
본 발명의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 매실 재래종, 매실 품종(왕매실, 백가하, 천매) 및 살구 재래종 시료를 대상으로 PCR을 수행한 후 PCR 증폭산물에 형광물질을 붙여 Gene Scan을 수행하였으며, 그 결과는 하기 표 3 및 4에 나타내었다.
또한, 상기 표 3 및 표 4의 결과를 이용하여 계통수를 작성하였다. 다형성 조사를 위해 PCR 및 형광 프라이머 적용 분석을 통해 산출된 대립유전자 크기(allele size) 값을 Power marker version 3.25(Liu and Muse, 2005)를 이용해 MAF(major alleles frequency), GN(genotype number), AN(allele number), GD(gene diversity), H(heterozygosity) 및 PIC(polymorphism information content)를 분석하였다. 계통수 분석을 위해 shared allele distance 방법으로 유전적 거리를 계산하였고, 계통수를 UPGMA(unweighed pair group method with arithmetic mean) 방식으로 작성하여 MEGA version 7으로 나타내었다.
계통수를 작성한 결과, 살구(Pa-21, Pa-24) 집단과 매실(Pm) 집단이 정확하게 구별되었고, 매실 집단 내에서도 왕매실(Pm-36), 백가하(Pm-38) 및 천매(Pm-33) 품종이 각각 서로 다른 집단으로 구별되는 것을 확인하였다. 또한, 왕매실과 Pm-12, 백가하와 Pm-44, 천매와 Pm-19는 서로 같은 집단으로 묶인 것으로 보아 Pm-12는 왕매실 품종, Pm-44는 백가하 품종, Pm-19는 천매 품종임을 확인하였다(도 1).
이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트는 매실과 살구의 종간 구별뿐만 아니라 왕매실, 백가하 및 천매의 매실 품종을 각각 정확하게 판별할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> SSR marker set for discriminating intra-species of Prunus mume and inter-species of Prunus mume and Prunus armeniaca and uses thereof <130> PN22111 <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tagcagcagt ggaagaag 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gagaagaaga agaggaagaa ag 22 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cttctccaag tttcctca 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cacttctctt catctctc 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccccacacac gctaaaaa 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gactcagaag aaaaccca 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgagagatg atagtggtc 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agtggggtta aagaggga 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atttgtatgg catggatgg 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ataaaggaga tggggtgg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 accctcttcc tctctctc 18 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggcggtggtt ttagttttt 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcactcttca ccttcttc 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cttgtcttct tcttctgc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 actgtgtttc tggaatgg 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gttggaggag agagaagg 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caggagagac aaaacaaaca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 agagaaagag acagagaaga 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gagaggagag gtgaaaag 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcgtagaggc agatttta 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gttctggatg gttttacct 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gatgagcaga tgaaagtgt 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cattattccc taaaccgttc 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 taaaaaagcc atgagcgac 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tcatgtgctg gtttcgtc 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gggcccacat atgcattatt 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ccctaatccc caccaaat 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gagagaaaat gaccggttga 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cctttcctga cctatattc 19 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ttcccctttc aatccaac 18 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ttaatttgtg gatgtgggg 19 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gaagggtgag gttgatgg 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gagggggtga aaaaggtg 18 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gctttggttt gcgttcatt 19 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aggagttctg cacaaaag 18 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 aatgaagagg gtgaaaagg 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ttattttggg gagttggggg 20 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 aaagggaggc aagagagaa 19 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ataccccaca tttctttcc 19 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cctgatcctc tttccatt 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cgcaacccaa cccacata 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cgggtgagag aagcaaaa 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gggtggcttt tattgttg 18 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tcttgtaagg tgtagtctgt 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 43 및 44의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 매실(Prunus mume) 종내 품종 판별 및 매실과 살구(Prunus armeniaca)의 종간 구별용 프라이머 세트 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 매실 품종은 왕매실, 백가하 및 천매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트 조성물; 및 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 매실(Prunus mume) 종내 품종 판별 및 매실과 살구(Prunus armeniaca)의 종간 구별용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dTNPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 매실 또는 살구 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 매실(Prunus mume) 종내 품종 판별 및 매실과 살구(Prunus armeniaca)의 종간 구별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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