KR20220157398A - Jak 억제제의 결정형 및 그의 적용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 JAK 억제제로서의 결정형 및 JAK1 또는/및 TYK2 관련 질환의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서의 그의 용도를 개시한다.
Figure pct00005

(I)

Description

JAK 억제제의 결정형 및 그의 용도
본 발명은 JAK 억제제의 결정형 및 JAK1 또는/및 TYK2 관련 질병의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 2월 21일자로 출원된 중국 특허 출원 번호 CN202010110530.7의 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 참조로 통합된다.
JAK 키나제는 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 4가지 구성원을 갖는 세포내 비수용체 티로신 키나제의 패밀리이다 (Robert Roskoski Jr. (2016)). JAK1, JAK2 및 TYK2는 인간 조직 세포에서 발현된다. JAK3는 주로 조혈 조직 세포에서 발현되며, 일차적으로는 골수 세포, 흉선 세포, NK 세포, 활성화된 B 림프구 및 T 림프구에서 발현된다. 기능적으로 획득된 발현 또는 돌연변이 분석에서 JAK1 및 JAK3은 면역 조절과 더 관련이 있는 반면 JAK2는 적혈구 및 혈소판 생성과 직접적으로 관련이 있다. 기능 결핍 분석에서 JAK1과 JAK2의 기능 결핍은 생쥐 배아의 죽음을 초래한다. JAK1 및 JAK2의 기능 결핍과 관련된 질병은 인체에서 발견되지 않았으며, 이는 JAK1 및 JAK2의 생리적 기능의 중요성을 간접적으로 나타낸다. JAK3 기능 결핍은 심각한 종합적 면역 결핍을 일으킬 수 있다. 내인성 면역과 관련된 결함을 일으키는 것으로 보고된 TYK2의 기능에 대한 연구는 거의 없다 (James D. Clark, (2014)).
JAK의 다운스트림은 신호 전달 및 전사 활성화 패밀리(STAT)이다. JAK-STAT 경로는 다양한 사이토카인, 성장인자 및 호르몬으로부터의 세포외 신호를 핵으로 전달하고 수천 개의 단백질 코딩 유전자의 발현을 담당한다. 사이토카인이 그들의 수용체에 결합하면 JAK 패밀리 구성원들은 서로 자가 인산화 및/또는 트랜스-인산화된 다음 STAT-인산화되고 핵으로 이동하여 전사를 조절한다. JAK-STAT 세포 내 신호 전달은 인터페론, 대부분의 인터루킨 및 EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM CSF 및 PRL과 같은 다양한 사이토카인 및 내분비 인자에 적용 가능하다 (Vainchenker W. et al. (2008)). 다른 JAK 패밀리 구성원들은 다른 사이토카인 수용체에 선택적으로 결합하여 신호 전달 특이성을 제공함으로서 다른 생리학적 역할을 한다. 이러한 선택적 작용 방식은 JAK 억제제가 상대적으로 특정한 방식으로 질병 치료에 적용될 수 있도록 한다. IL-2 또는 IL-4 수용체는 공통의 γ 사슬과 함께 JAK1 및 JAK3에 결합하고, 동일한 β 구조를 갖는 I형 수용체는 JAK2에 결합한다. gp130(당단백질 130)을 사용하는 I형 수용체와 이종이량체 사이토카인에 의해 활성화된 I형 수용체는 JAK1/2 및 TYK2에 우선적으로 결합하고, 사이토카인과 같은 호르몬에 의해 활성화된 I형 수용체는 JAK2 키나제에 결합하여 이를 활성화시킨다. 인터페론의 II형 수용체는 JAK1 및 TYK2에 결합하는 반면, IL-10 사이토카인 패밀리의 수용체는 JAK1/2 및 TYK2에 결합한다. JAK 패밀리 구성원들에 대한 상기 사이토카인 및 이들의 수용체의 다양한 특이적 결합은 상이한 생리적 기능을 수행함으로써 상이한 질병의 치료 가능성을 제공한다.
JAK-STAT 신호전달 경로는 세포 증식, 분화, 세포사멸 및 면역 조절과 같은 많은 중요한 생물학적 과정에 관여한다. 기존 임상 데이터는 JAK2를 장기간 억제하면 G-CSF, TPO 및 EPO와 같은 사이토카인이 억제되어 조혈모세포의 증식 및 분화에 영향을 미친다는 것을 보여준다. JAK3의 억제는 NK 세포의 수를 감소시키고 감염 가능성을 증가시킨다. 따라서 JAK 억제제는 백혈구, 적혈구 및 림프구의 수와 기능에 다양한 정도로 영향을 미칠 수 있다. 그러나 사이토카인에 대한 작용 범위가 좁은 선택적 JAK1 또는/및 TYK2 억제제는 이론적으로 효능을 유지하고 안전성을 향상시킬 수 있다 (Daniella M. Schwartz, 등 (2017)).
US2009220688은 갈라파고스사의 류마티스 관절염 치료를 위한 임상 3상 약물인 필고티닙(Filgotinib)을 개시하고 있다.
Figure pct00001
본 발명의 목적은 JAK 억제제의 결정형 및 JAK1 또는/및 TYK2 관련 질병의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 그의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 2θ 각도에서 X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에 나타난 특징적인 회절 피크를 갖는 구조식 (I)의 화합물의 결정형 A를 제공한다: 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20° 및 19.06 ± 0.20°.
Figure pct00002
(I)
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 A의 X선 분말 회절 스펙트럼에는 특징적인 회절 피크가 하기와 같은 2θ 각도로 존재한다: 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20° 및 27.52 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 A의 X선 분말 회절 스펙트럼에는 특징적인 회절 피크가 하기와 같은 2θ 각도로 존재한다: 6.91±0.20°, 10.34±0.20°, 12.21±0.20°, 13.69±0.20°, 18.11±0.20°, 19.06±0.20°, 19.86± 0.20°, 20.59±0.20°, 22.06±0.20° 및 27.52±0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 A의 X선 분말 회절 스펙트럼에는 특징적인 회절 피크가 하기와 같은 2θ 각도로 존재한다: 6.91 ± 0.20°, 10.34 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 17.44 ± 0.20°, 18.11 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20°, 24.46 ± 0.20° 및 27.52 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 A는 도 1에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 A의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 1에 나타내었다.
구조식 (I)의 화합물의 결정형 A의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터.
번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%) 번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%)
1 6.91 100.0 18 25.88 8.3
2 10.34 13.7 19 26.18 4.9
3 12.21 64.7 20 26.93 2.8
4 13.69 23.1 21 27.52 18.9
5 14.44 9.8 22 28.73 2.6
6 16.11 3.1 23 29.12 8.2
7 17.44 12.2 24 29.92 6.8
8 18.11 18.7 25 31.56 6.9
9 18.76 11.7 26 31.86 9.6
10 19.06 76.7 27 32.43 6.0
11 19.86 32.6 28 32.64 7.2
12 20.59 28.8 29 33.04 2.5
13 22.06 24.8 30 33.30 2.3
14 22.63 6.8 31 34.52 10.0
15 23.49 2.4 32 35.21 3.9
16 24.46 12.0 33 35.56 2.8
17 25.27 4.6
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 A는 시차 주사 열량 측정 곡선 상에서 각각 152.19±3℃ 및 216.79±3℃에서 흡열 피크 값을 가지며, 161.50±3℃에서 발열 피크 값을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 A는 도 2에 도시된 DSC 스펙트럼을 갖는다.
본 발명은 하기 2θ 각도에서 X선 분말 회절 스펙트럼에 나타난 특징적인 회절 피크를 갖는 구조식 (I)의 화합물의 결정형 B를 제공한다: 5.13 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° and 21.18 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B의 X선 분말 회절 스펙트럼에서 특성 회절 피크는 하기의 2θ 각도에서 존재한다: 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° 및 21.18 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B의 X선 분말 회절 스펙트럼에서 특성 회절 피크는 하기의 2θ 각도에서 존재한다: 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20°, 21.18 ± 0.20° and 21.78 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B는 도 3에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 2에 나타내었다.
구조식 (I)의 화합물의 결정형 B의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터.
번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%) 번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%)
1 5.13 65.7 20 26.06 9.0
2 7.34 43.4 21 26.61 4.1
3 10.14 27.3 22 27.03 7.2
4 10.56 23.7 23 27.69 2.0
5 11.46 13.7 24 28.45 2.5
6 11.72 42.7 25 28.97 5.5
7 14.64 2.1 26 29.49 8.8
8 16.67 27.0 27 29.81 2.8
9 16.86 13.6 28 30.41 6.7
10 18.84 22.5 29 30.72 3.4
11 19.14 55.0 30 31.15 3.2
12 20.31 3.7 31 32.00 3.1
13 21.18 100.0 32 32.35 3.0
14 21.78 20.5 33 33.34 3.6
15 22.03 9.3 34 33.65 2.3
16 22.54 14.2 35 37.00 2.5
17 22.96 13.2 36 38.60 2.8
18 24.52 4.1 37 39.66 2.1
19 25.27 11.5
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B는 시차 주사 열량 측정 곡선 상에서 각각 193.99 ±3℃ 및 216.93 ±3℃에서 흡열 피크 값을 가지며, 200.10 ± 3℃에서 발열 피크 값을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B는 도 4에 도시된 DSC 스펙트럼을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B는 120 ± 3℃에서 열중량 분석 곡선(TGA)에서 최대 0.535%의 중량 손실을 나타낸다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 B는 도 5에 도시된 TGA 스펙트럼을 갖는다.
본 발명은 하기 2θ 각도에서 X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에 나타난 특징적인 회절 피크를 갖는 구조식 (I)의 화합물의 결정형 C를 제공한다: 8.92 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20° 및 20.26 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 C의 X선 분말 회절 스펙트럼에서 특성 회절 피크는 하기의 2θ 각도에서 존재한다: 5.76 ± 0.20°, 8.92 ± 0.20°, 11.50 ± 0.20°, 16.35 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20°, 19.17 ± 0.20°, 20.26 ± 0.20° 및 24.79 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 C는 도 6에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 C의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 3에 나타내었다.
구조식 (I)의 화합물의 결정형 C의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터.
번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%) 번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%)
1 5.76 19.3 8 18.66 29.0
2 8.92 31.2 9 19.17 22.1
3 11.50 13.9 10 20.26 100.0
4 14.28 11.4 11 22.98 6.2
5 16.35 23.6 12 24.79 24.0
6 17.54 11.4 13 29.77 5.1
7 17.99 7.5
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 C는 시차 주사 열량 측정 곡선 상에서 215.48℃에서 흡열 피크의 시작점을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 C는 도 7에 도시된 DSC 스펙트럼을 갖는다.
본 발명은 하기 2θ 각도에서 X선 분말 회절 스펙트럼에 나타난 특징적인 회절 피크를 갖는 구조식 (I)의 화합물의 결정형 D를 제공한다: 7.12 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20° 및 21.42 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 D의 X선 분말 회절 스펙트럼에서 특성 회절 피크는 하기의 2θ 각도에서 존재한다: 7.12 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° 및 28.72 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 D의 X선 분말 회절 스펙트럼에서 특성 회절 피크는 하기의 2θ 각도에서 존재한다: 7.12 ± 0.20°, 10.28 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 17.50 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° 및 28.72 ± 0.20°.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 D는 도 8에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 결정형 D의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 4에 나타내었다.
구조식 (I)의 화합물의 결정형 D의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터.
번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%) 번호 2θ 각도(°) 상대 강도(%)
1 7.12 100.0 14 21.42 44.1
2 10.28 12.3 15 21.84 7.9
3 10.68 2.7 16 23.95 3.0
4 12.45 36.0 17 24.50 5.1
5 13.04 7.2 18 25.74 4.3
6 14.28 26.7 19 26.69 4.9
7 14.64 30.4 20 27.24 2.5
8 16.06 3.1 21 28.72 17.0
9 17.30 7.2 22 29.49 5.0
10 17.50 10.8 23 31.80 4.3
11 18.31 16.1 24 34.05 7.8
12 20.54 77.4 25 36.04 6.1
13 20.93 20.5
본 발명은 또한 JAK1 및/또는 TYK2 관련 질환의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 상기 결정형 A, B, C 및 D의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본원의 약물은 류머티스 관절염의 치료를 위한 약물이다.
본 발명에 따른 구조식(I)의 화합물은 생체 내 약물 효과가 우수하고, 그 결정형이 안정적이며 빛, 열 및 습도의 영향을 덜 받고, 용해도가 높아 의약품으로서 폭넓은 전망을 갖는다.
도 1: 결정형 A의 XRPD 스펙트럼.
도 2: 결정형 A의 DSC 스펙트럼.
도 3: 결정형 B의 XRPD 스펙트럼.
도 4: 결정형 B의 DSC 스펙트럼.
도 5: 결정형 B의 TGA 스펙트럼.
도 6: 결정형 C의 XRPD 스펙트럼.
도 7: 결정형 C의 DSC 스펙트럼.
도 8: 결정형 D의 XRPD 스펙트럼.
정의 및 설명
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 다음의 용어 및 문구는 하기와 같은 의미를 갖는다. 구체적인 어구나 용어는 특별한 정의 없이 불확실하거나 불명확한 것으로 간주되어서는 안 되며, 통상적인 의미에 따라 이해되어야 한다. 본 명세서에 상품명이 나타나는 경우, 이는 해당 상품 또는 활성 성분을 나타내기 위한 것이다.
본 발명의 중간 화합물은 하기에 열거하는 구체적인 구현예, 다른 화학 합성법과의 조합에 의해 형성된 구현예 및 당업자에게 잘 알려진 등가 대체 방법을 포함하는 당업자에게 널리 공지된 다양한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 구현예는 본 발명의 구현예를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 특정 구현예의 화학 반응은 본 발명의 화학적 변화 및 필요한 시약 및 재료에 적합한 적합한 용매에서 완료된다. 본 발명의 화합물을 얻기 위해서는 당업자가 기존의 구현예를 바탕으로 합성 단계 또는 반응 과정을 수정하거나 선택하는 것이 필요한 경우가 있다.
본 발명은 실시예와 관련하여 설명될 것이지만, 본 발명에 어떠한 제한도 가하지 않을 것이다.
본 발명에 사용되는 모든 용매는 상업적으로 입수 가능하며, 추가 정제 없이 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 용매는 상업적으로 입수할 수 있다. 본 발명에서는 다음과 같은 약어들이 사용된다: DCM은 디클로로메탄을 나타내고; DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 나타내며; DMSO는 디메틸 설폭사이드를 나타내고; EtOH는 에탄올을 나타내며; MeOH는 메탄올을 나타내고; TFA는 트리플루오로아세트산을 나타내며; TsOH는 p-톨루엔술폰산을 나타내고; mp는 융점을 나타내며; EtSO3H는 에탄술폰산을 나타내고; MeSO3H는 메탄술폰산을 나타내며; ATP는 아데노신 삼인산을 나타내고; HEPES는 4-히드록시에틸 피페라진 에탄술폰산을 나타내며; EGTA는 에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸 에테르) 테트라아세트산을 나타내고; MgCl2는 이염화마그네슘을 나타내며; MnCl2는 이염화망간을 나타내고; DTT는 디티오트레이톨을 나타내며; DCC는 디시클로헥실카르보디이미드를 나타내고; DMAP는 4-디메틸아미노피리딘을 나타내며; EA는 에틸 아세테이트를 나타내고; LiHMDS는 헥사메틸디실리실아미노리튬을 나타내며; Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2는 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 디클로라이드의 디클로로메탄 착물을 나타내고; EDCI는 1-에틸-3(3-디메틸프로필아민) 카르보디이미드를 나타내며; 및 HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸을 나타낸다.
XRPD, DSC 및 TGA의 구체적 방법(장비 모델 및 매개 변수 포함)
본 발명에서 사용되는 분말 X선 회절(XRPD) 방법
XRPD 검출에는 약 10-20 mg의 시료가 사용된다.
자세한 XRPD 파라미터들은 다음과 같다:
광 튜브: Cu, Cu: K-알파 (λ= 1.54179Å).
광 튜브 전압: 40 kV, 광 튜브 전류: 40 mA
발산 슬릿: 0.60 mm
검출기 슬릿: 10.50 mm
비산 방지 슬릿: 7.10 mm
스캔 범위: 3-40도
스캔 속도: 10도/분
샘플 디스크 속도: 15 rpm/0 rpm
본 발명에서 사용되는 시차 열량 스캐너(DSC) 방법
샘플(0.5-1 mg)을 테스트를 위해 DSC 알루미늄 포트에 넣는다. 50 ml/min N2의 조건 하에서, 샘플을 10℃/min의 가열 속도로 30℃에서 250℃까지 가열한다.
본 발명에 사용되는 열중량 분석기(TGA) 방법
샘플(2-5 mg)을 테스트를 위해 TGA 백금 포트에 넣는다. 25 ml/min N2의 조건 하에서, 샘플을 상온에서 300℃까지 가열하거나 10℃/min의 가열 속도로 20%의 중량 감소가 되도록 가열한다.
본 발명에 사용되는 액체 크로마토그래피 분석 방법(HPLC)
함량 시험 및 분석을 위한 HPLC 방법
기구		 시마즈 고성능 액체 크로마토그래프
컬럼 조박스 SB C18, 4.6 mm * 150 mm, 5 μm
(PDS-HPLC-007)
이동상 A 0.1 % TFA 수용액
이동상 B 순수 아세토니트릴
현재 속도 1 mL/min
주입 부피 5 μL
검출 파장 254 nm
컬럼 온도 40°C
희석액 1/1(v/v) 아세토니트릴: 순수
시간 15 min
구배 용출 과정 시간 (분) 이동상 A (%) 이동상 B (%)
0.01 90 10
10.00 10 90
13.00 10 90
13.01 90 10
15.00 90 10
15.01 스톱
본 발명의 내용을 보다 잘 이해하기 위하여 구체적인 실시예에서 더 상세하게 설명하지만, 구체적인 실시예는 본 발명의 범위에 어떠한 제한을 가하려는 것은 아니다.
실시예 1: 구조식 (I)의 화합물의 제조
Figure pct00003
(I)
단계 1: LiHMDS(1 M, 51.2 mL)를 -78℃에서 화합물 1-1(10.2 g, 42.6 mmol)을 함유하는 THF(150 ml) 용액에 적가하였다. 상기 반응액을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, 1,1,1-트리플루오로-N-페닐-N-(트리플루오로메틸술포닐)메탄술폰아미드(16.7 g, 46.9 mmol)의 THF(150 ml) 용액을 여기에 첨가하고, 상기 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 반응을 포화 염화암모늄 250 mL로 중지시키고, 반응액을 물 200 mL로 희석한 다음, 에틸 아세테이트(200mL * 3)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축시켜 화합물 1-2를 얻었다. 조 생성물을 정제하지 않고 다음 반응에 직접 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.63 (br s, 1H) ,3.50-3.65 (m, 4H), 2.34 (br s, 4H), 1.88 (br t, J=5.90 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H).
단계 2: 아세트산 칼륨(12.7 g, 129.3 mmol) 및 (dppf)Cl2.CH2Cl2(3.5 g, 4.3 mmol)를 화합물 1-2(16 g, 43.1 mmol) 및 피나콜보레이트(12.0 g, 47.4 mmol)가 용해된 DMF(100 ml) 용액에 첨가하고, 이를 질소로 3회 교체한 후 70℃에서 3시간 동안 질소 분위기에서 교반하였다. 반응 용액을 물 300 ml와 에틸 아세테이트 400 ml의 혼합물에 분산시켰다. 유기상을 분리하고, 포화 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물 1-3을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.46 (br s, 1H), 3.71 - 3.53 (m, 4H), 2.31 (br d, J=3.0 Hz, 2H), 2.24 - 2.16 (m, 2H), 1.74 (t, J=6.3 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.26 (s, 12H).
단계 3: 질소 분위기에서, 탄산칼륨(3.8 g, 27.3 mmol) 및 Pd (dppf)Cl2.CH2Cl2 (744 mg, 911.0 μmol)를 화합물 1-3(3.5 g, 10.0 mmol) 및 N-(5-브로모-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-2-일)사이클로프로판 포름아미드(2.6 g, 9.1 mmol)함유한 디옥산(60 ml) 및 물(15 ml) 용액에 첨가하였다. 상기 반응 용액을 90℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 용액을 농축시키고, 생성된 조 생성물을 분리하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 1-4를 얻었다.
LCMS (ESI) m/z: 424.3[M + H]+.
단계 4: 화합물 1-4(3.5 g, 8.2 mmol)가 용해된 디클로로메탄(10 ml) 용액에 염산/에틸 아세테이트(4 M, 30 ml)를 첨가하고, 반응액을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 고체를 침전시키고, 여과 및 건조하여 화합물 1-5(3.3 g 염산염, 조 생성물)를 얻었으며, 이는 다음 반응에서 정제 없이 직접 사용되었다.
LCMS (ESI) m/z: 324.1[M + H]+.
단계 5: 화합물 1-5(3.0 g, 8.34 mmol, 염산염)가 용해되어 있는 메탄올(100 ml) 용액에 Pd/C(1 g, 10%)를 질소 분위기에서 첨가하였다. 수소로 3회 치환한 후 30℃에서 12시간 동안 수소 분위기(30 psi)에서 교반하였다. 반응액을 여과하고 농축하여 화합물 1-6 (3 g 염산염, 조 생성물)을 얻었으며, 이를 정제없이 다음 반응에서 직접 사용하였다.
LCMS (ESI) m/z: 326.2 [M + H]+.
단계 6: 화합물 1-6(0.87 g, 2.40 mmol, 염산염)을 N, N-디메틸포름아미드(10 ml)에 용해시키고, HOBt(487 mg, 3.6 mmol) 및 EDCI(691 mg, 3.6 mmol)을 첨가한 후, 이어서 (1S)-2,2-디플루오로시클로프로필포름산(32.6 mmol)과 디이소프로필 에틸아민 (621 mg, 4.8 mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 반응 용액을 15℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 그 후 감압하에서 농축하여 잔류물을 얻었으며, 이를 분취 HPLC(중성계) 하여 구조식(I)의 화합물을 얻었다.
1H NMR (400MHz, CD3OD) δ 7.32-7.73 (m, 2H), 6.95 (br s, 1H), 3.62-4.22 (m, 4H), 3.45 (br s, 1H), 3.18-3.37 (m, 1H), 2.61 (br s, 1H), 1.45-2.27 (m, 10H), 0.78-1.17 (m, 4H). LCMS (ESI) m/z: 430.0[M + H]+.
실시예 2: 개별 결정형의 제조 방법
구조식(I)의 화합물 50 mg을 2.0 ml 유리 바이알에 넣고, 여기에 메탄올과 물의 혼합물(부피비 1:1) 0.4 ml를 첨가하여 현탁액을 얻었다. 상기 현탁액에 마그네톤을 첨가하고 가열된 자기 교반기(40℃)에서 교반하였다. 100 시간 동안 교반한 후, 현탁된 샘플을 원심분리하고 밤새 35℃ 진공 건조 오븐에 넣었다. 건조된 샘플은 XRPD(도 1에 도시된 바와 같이)와 DSC(도 2에 도시된 바와 같이)에 의해 구조식(I)의 화합물의 결정형 A임이 결정되었다.
구조식(I)의 화합물 약 50 mg을 2.0 ml 유리 바이알에 넣고, 0.4 mL의 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 마그네톤을 첨가한 후, 상기 샘플을 가열된 자기 교반기(40℃)에서 교반하였다. 100 시간 동안 교반한 후, 현탁된 샘플을 원심분리하고 밤새 35℃ 진공 건조 오븐에 넣었다. 건조된 샘플은 XRPD(도 3에 도시된 바와 같이), DSC(도 4에 도시된 바와 같이) 및 TGA(도 5에 도시된 바와 같이)에 의해 구조식(I)의 화합물의 결정형 B이 결정되었다.
구조식(I)의 화합물의 결정형 A를 170°C로 가열하여, XRPD(도 6에 도시된 바와 같이)와 DSC(도 7에 도시된 바와 같이)로 동시에 확인되는 새로운 결정형, 즉 구조식(I)의 화합물의 결정형 C로 변화시켰다.
구조식(I)의 화합물 약 50 mg을 2.0 ml 유리 바이알에 넣고, 여기에 에탄올과 물의 혼합물(부피비 1:1) 0.4 ml를 첨가하여 현탁액을 얻었다. 상기 현탁액에 마그네톤을 첨가하고 가열된 자기 교반기(40℃)에서 교반하였다. 100 시간 동안 교반한 후, 현탁된 샘플을 원심분리하고 밤새 35℃ 진공 건조 오븐에 넣었다. 건조된 샘플은 XRPD(도 8에 도시된 바와 같이)에 의해 화학식(I)의 화합물의 결정형 D임이 결정되었다.
실시예 3: 화학식 (I)의 화합물의 결정형 B의 고체 안정성에 관한 연구
약 5 mg의 결정형 B를 건조하고 깨끗한 유리병에 넣고, 얇은 층으로 펴서 정식 시험용 샘플로 하였다. 이를 영향 요인 (60℃, 92.5% RH) 및 가속 조건 (40℃/75% RH 및 60℃/75% RH)의 시험조건 하에 배치하였다. 샘플을 완전히 노출시키고 알루미늄 호일로 덮고 작은 구멍들을 뚫었다. 샘플을 5일과 10일에 채취하여 분석하였다. 조명(가시광 1200000 룩스, UV 200 W) 아래 놓인 샘플들을 실온에서 완전히 노출시켰다.
실험 결과, 영향요인(고온 -60℃, 고습도 -92.5% RH, 빛)과 가속도(40℃/75%, 60℃/75%) 조건에서 결정 형태가 변하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 4: 구조식 (I)의 화합물의 결정형 B의 생물학적 배지 용해도에 관한 연구
1. 결정형 B의 생물학적 분석 용해도 실험
약 2 mg의 결정형 B 샘플을 샘플 병에 첨가한 다음 다른 용매[순수, SGF(모의 위액), FaSSIF(공복 상태의 모의 장액), FeSSIF(식사한 상태의 모의 장액)]를 각각 1.0 mL 첨가하고 진탕하였다. 상기 병은 37℃의 항온 오실레이터 상에서 진탕시켰다. 24시간 동안 진탕시킨 후, 원심분리하여 얻은 상등액의 용해도를 시험하였다. 상기 상등액을 일정 횟수로 희석(희석액: ACN/H2O (1/1)) 후(화합물의 낮은 용해도로 인해 10배 희석한 SGF를 제외하고 상등액을 2회 희석하였다) 그 농도를 HPLC로 결정하였다.
2. 희석제 및 이동상의 준비
희석제: 아세토니트릴:물 = 1:1. 이동상 A: 0.1% TFA 수용액, 예를 들어, 1 ml의 TFA를 1 L의 순수로 옮기고 고루 혼합한 후 초음파로 탈기하였다. 이동상 B: 100% 아세토니트릴.
3. 기준물질 및 검액의 준비
STD 용액의 준비: 결정형 B를 기준 물질로 사용하였다. 기준물질 약 5 mg을 유리병에 넣고 희석제 10 mL로 용해시킨 후 초음파로 약 10분간 완전히 녹인 후 상온으로 식히고 진탕시켰다. 두 개의 평행한 부분을 준비하여 STD1과 STD2로 표시하였다. 해당 STD1을 희석제로 10, 100, 1000, 2000배 희석하여 표준곡선으로 시험하였다.
검액의 준비: 상등액을 일정배 희석(희석액 ACN/H2O(1/1))한 후(화합물의 용해도가 작아 10배 희석한 SGF를 제외하고는 상등액을 2회 희석한다), 잘 흔든 후 1.5 ml 액상 바이알에 넣어 시험하고 HPLC로 농도를 결정하였다.
4. 생물학적 배지에서의 용해도 결과
생물학적 배지에서 결정형 B의 용해도 결과
완충액 H2O SGF FeSSIF FaSSIF
pH (24h) 7.02 1.91 5.09 6.52
용해도 (mg/ml) 24hr 0.211 0.727 0.166 0.214
LOQ=0.0001267mg/ml; Y=7778034.55X-1509.46
실험 결론: 결정형 B는 모의 생물학적 배지에서 우수한 용해도를 가지며, 이는 생체 내에서 좋은 생체이용률을 얻는 데 도움이 된다.
생물학적 활성 시험
실험예 1: JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2 키나아제의 시험관내 활성 시험
실험 재료
재조합 인간 JAK1, JAK2, JAK3, TYK2 프로테아제, 주요 기구 및 시약은 영국의 유로핀(Eurofins)에 의해 제공되었다.
실험 방법
JAK2, JAK3 및 TYK2의 희석: 20 mM 3-(N-모르폴린) 프로판설폰산(MOPS), 1 mM EDTA, 0.01% Brij-35.5% 글리세롤, 0.1% β-머캅토에탄올, 1 mg/ml BSA; JAK1의 희석: 20 mM TRIS, 0.2 mM EDTA, 0.1% β-머캅토에탄올, 0.01% Brij-35.5% 글리세롤. 모든 화합물을 100% DMSO 용액에 최종 결정 농도의 50배로 제조하였다. 시험 화합물을 농도 구배의 3배로 희석하여 최종 농도가 10 μM 내지 0.001 μM, 총 9개 농도가 되도록 하였다. 검출 반응에서 DMSO의 함량은 2%였다. 시험 화합물의 작업 원액을 반응의 첫 번째 성분으로 결정 구멍에 첨가한 다음, 나머지 성분을 하기의 결정 방법에 설명된 방식에 따라 첨가하였다.
JAK1(H) 효소 반응
JAK1(h)을 20 mM Tris/HCl, pH 75, 0.2 mM EDTA，500 μM MGEEPLYWSFPAKKK, 10 mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도가 조정됨)와 함께 배양하였다. Mg/ATP 혼합물을 첨가하여 반응을 개시하였다. 상온에서 40분간 배양 후 0.5% 인산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 상기 반응물 10 μL를 P30 필터 패드에 적하하고 0.425% 인산으로 3회 세척한 다음 4분 이내에 메탄올로 1회 세척하고 건조하고 섬광 계수하였다.
JAK2(h) 효소 반응
JAK2(h)를 8 mM MOPS, pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 100 μM KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC, 10 mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도가 조정됨)와 함께 배양하였다. Mg/ATP 혼합물을 첨가하여 반응을 개시하였다. 상온에서 40분간 배양 후 0.5% 인산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 상기 반응물 10 μL를 P30 필터 패드에 적하하고 0.425% 인산으로 3회 세척한 다음 4분 이내에 메탄올로 1회 세척하고 건조하고 섬광 계수하였다.
JAK3(h) 효소 반응
JAK3(h)를 8 mM MOPS, pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 500 μM GGEEEEYFELVKKKK, 10 mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도가 조정됨)와 함께 배양하였다. Mg/ATP 혼합물을 첨가하여 반응을 개시하였다. 상온에서 40분간 배양 후 0.5% 인산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 상기 반응물 10 μL를 P30 필터 패드에 적하하고 0.425% 인산으로 3회 세척한 다음 4분 이내에 메탄올로 1회 세척하고 건조하고 섬광 계수하였다.
TYK2(h) 효소 반응
TYK2(h)를 8 mM MOPS, pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 250 μM GGMEDIYFEFMGGKKK, 10 mM 마그네슘 아세테이트 및 [γ-33P]-ATP(필요에 따라 활성 및 농도가 조정됨)와 함께 배양하였다. Mg/ATP 혼합물을 첨가하여 반응을 개시하였다. 상온에서 40분간 배양 후 0.5% 인산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후 상기 반응물 10 μL를 P30 필터 패드에 적하하고 0.425% 인산으로 3회 세척한 다음 4분 이내에 메탄올로 1회 세척하고 건조하고 섬광 계수하였다.
데이터 분석
IDBS사의 XLFIT5(205 포뮬라) 분석을 통해 IC50 결과를 얻었다. 자세한 내용은 표 7 참조.
본 출원에 따른 화합물의 시험관 내 스크리닝 시험 결과
화합물 TYK2
(IC50, nM)		 JAK1
(IC50, nM)		 JAK2
(IC50, nM)		 JAK3
(IC50, nM)
화학식(I)의 화합물 36 3 37 1517
결론: 본 발명에 따른 구조식 (I)의 화합물은 4가지 키나제 서브타입 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2에 대한 시험관내 활성 시험에서 JAK1 및/또는 TYK2에 대해 우수한 선택적 억제를 나타내었다.
실험예 2: 약동학(PK) 시험
시험 화합물을 용해시킨 후 얻은 투명한 용액을 꼬리 정맥 및 위관을 통해 수컷 마우스(C57BL/6) 또는 래트(SD)(밤새 금식, 7-8주령)에 투여하였다. 시험 화합물 투여 후, 정맥 주입(2 mg/kg) 그룹에서는 투여 0.117, 0.333, 1, 2, 4, 7 및 24시간 후에, 위관 주입(15 mg/kg) 그룹에서는 투여 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 및 24시간 후에 하악 정맥에서 각각 채혈하고, 원심분리하여 혈장을 얻었다. 혈액 내 약물 농도는 LC-MS/MS에 의해 결정하였고, 관련 약동학적 매개변수는 WinNonlin™ 버전 6.3 약동학 소프트웨어를 사용하여 비방실 모델 선형 대수 사다리꼴 방법에 의해 계산하였다. 시험 결과는 하기와 같다.
마우스에서 구조식 (I)의 화합물의 PK 시험 결과
PK 매개변수r 결과
T1/2 (hr) 1.61
Cmax (nM) 5105
AUC0-inf (nM.hr) 9917
생체이용률 (%)a 38.1%
노트: T1/2: 반감기; Cmax: 피크 농도;
AUC0-inf: 0 시점에서 무한대까지의 혈장 농도 시간 곡선 아래의 면적;
생체이용률: 생체이용률.
결론: 본 발명의 화학식 (I)의 화합물은 마우스에서 구강 생체이용률이 우수하고 노출도가 높아 생체내 약물 효능이 우수하다.
실험예 3: 마우스에서 콜라겐 유도 관절염(CIA)의 생체 내 약력학적 연구
실험 목적:
류마티스 관절염(RA)은 흔히 발생하는 자가면역 질환의 일종으로 전 세계적으로 약 1%의 발병률을 보인다. 이는 관절 염증, 부상, 기형을 일으키는 자가면역반응 때문이며, 심할 경우 전신성 염증반응을 일으키게 된다. RA를 위한 약물의 연구 개발은 류마티스 관절염의 증상을 완화하고 환자의 삶의 질을 향상시키는 데 도움이 될 것이다. 콜라겐 유도 마우스 관절염 모델은 종종 RA의 치료에서 약물의 효능을 평가하기 위해 사용되며, 그 병인과 증상은 RA 질환과 유의한 상관관계가 있다. 상기 모델에 II형 콜라겐을 주입하여 B세포와 T세포의 뼈 콜라겐에 대한 반응성을 활성화시키면, 활성화된 B세포와 T세포가 관절에 침투하여 관절 손상을 일으켜 인간 류마티스 관절염과 유사한 일련의 증상을 유발한다. 마우스에서 콜라겐 유도 관절염은 류마티스 관절염의 약물 치료를 위한 후보 화합물의 전임상 평가에서 그 효과를 평가하는 데 종종 사용된다. 본 실험의 목적은 화학식(I)의 화합물 및 참조 화합물인 필고티닙이 마우스의 콜라겐 유도 관절염에 미치는 치료 효과를 조사하여 후속 임상 연구를 위한 전임상 약력학적 정보를 제공하는 것이다.
실험 방법:
1. II형 콜라겐/완전 프로인트 항원증강제 면역
아세트산의 준비: 2 N 아세트산을 100 mM으로 희석하고 0.22 마이크론 필터 멤브레인으로 여과한 후 4℃에서 보관하였다.
소의 II형 콜라겐 용액: 소의 II형 콜라겐(CII)을 100 mM 아세트산 용액에 용해시키고 4℃에서 밤새 보관하였다. 상기 콜라겐의 최종 농도는 8 mg/ml이었다.
유탁액의 준비: 밤새 보관된 CII 용액을 동일한 부피의 완전 프로인트 항원보강제와 혼합하고, 용액이 안정적인 유탁액을 형성할 때까지 얼음 위에서 약 60분 동안 30000 rpm으로 고속 균질화기 상에서 균질화시켰다.
2. 관절염 유도:
마우스를 무작위로 다른 처치 그룹들에 할당하였다. 첫 번째 면역일을 0일로 기록하고, 그 이후의 날들은 순서대로 표시하였다.
DBA/1 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 50 ㎕의 준비된 콜라겐 유탁액(200 ㎍의 CII 포함)을 꼬리(꼬리 뿌리에서 2-3 cm)에 피하 주사하였다.
21일째에 꼬리에 같은 양의 콜라겐 유탁액을 같은 방법으로 주입하였다. 정상 그룹의 마우스들은 면역화하지 않았다.
3. 투여 및 용량 설계
평균 임상점수가 약 1점에 도달한 28일째에, 발병률이 중간 정도인 50마리의 마우스를 선별해 체중과 점수에 따라 무작위로 5개의 처리 그룹으로 나눠 각 그룹에 8 마리의 쥐를 배정하였다.
모델의 성공적인 확립 여부를 측정하기 위한 기준 약물로서 덱사메타손(DEX.)을 0.3 mg/kg 용량(CIA 모델에서 일반적으로 사용되는 용량)으로 투여하였다. 또한, 본 실험 초기의 사전 실험 결과에 따라 표 9과 같이 시험 화합물과 기준 화합물인 필고티닙의 해당 용량을 결정하였다: 첫 번째 그룹은 아무 처리도 하지 않은 정상 마우스였다; 두 번째 그룹은 용매만 포함된 대조군으로 처리하였다; 세 번째 그룹은 0.3 mg/kg의 용량으로 덱사메타손을 처리하였다; 여섯 번째 그룹과 여덟 번째 그룹에는 각각 15 mg/kg과 15 mg/kg의 시험화합물과 기준 약물을 투여하였다. 마우스들에게 하루에 두 번씩 14일 동안 투여하였다.
그룹 및 용량 설계
그룹 시험하는 약물의 명칭 수 투여방법 농도 용량 빈도
mg/mL mg/kg
G1 정상 5 N/A N/A N/A N/A
G2 블랭크 (용매 대조군) 8 p.o. N/A N/A bid, 14 일
G3 덱사메타손(Dex.) 8 p.o. 0.03 0.3 qd, 14 일
G6 화학식(I)의 화합물 8 p.o. 1.5 15 bid, 14 일
G8 필고티닙 8 p.o. 1.5 15 bid, 14 일
노트: PO: 경구 투여; bid: 하루에 두 번; qd: 하루에 한 번.
4. 관절염 발병 지수의 결정
임상 관찰: DBA/1 마우스의 기본 건강 상태 및 체중 변화를 면역 전 7일부터 면역 후 21일까지 매일 관찰하였다(주 1회 기록). 22일 후, 실험이 종료될 때까지 마우스의 건강 상태, 이환율 및 체중 변화를 매일 관찰(일주일에 3회 이상 기록)하였다.
임상 점수: 면역 강화 후 마우스의 발생률을 매일 관찰하였다. 질병의 발병시(관절염의 임상증상), 마우스는 질병의 다양한 정도(발적, 부종, 관절 변형)에 따라 0-4점으로 점수화되었다. 사지 각각의 최대 점수는 4점, 각 동물의 최대 점수는 16점이었다. 점수 기준은 표 10에 나타내었다. 점수화는 적어도 일주일에 세 번 수행되었다.
관절염의 임상 점수 기준
점수 임상 증상
0 홍반 및 부종 없음
1 족근골, 발목 또는 중족골 근처의 홍반 또는 경미한 발적 및 부종, 한쪽 발가락의 발적 및 부종
2 발목과 중족골, 또는 2개 이상의 발가락의 경미한 홍반 및 부종
3 발목, 손목 및 중족골에 중등도의 홍반 및 부종
4 발목, 손목, 중족골 및 발가락이 모두 심하게 붉어지고 부어오름
5. 통계 처리
실험 데이터는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표현하였고, 곡선하 면적(AUC)은 일원 분산분석(one-way ANOVA)으로 분석하였으며(P < 0.05)인 경우 유의한 차이로 간주하였다.
실험 결과:
1. 임상 점수 및 발병률:
1차 접종 후 28일째(2차 접종 후 7일째)에 마우스에서 관절염의 임상 증상이 나타나기 시작하였다. 투여는 28일 째부터 시작하였다. 실험의 상세한 결과는 표 8-3에 나타내었다: 용매 대조군의 평균 임상 점수는 41일째에 5.8 까지 점차 증가하였다. 이는 콜라겐 유도 관절염 모델의 성공적인 확립을 시사한다. 15 mg/kg의 동일한 용량의 구조식 (I)의 화합물 및 필고티닙은 실험 종료 시점(41일째)에서 관절염 마우스의 임상 점수를 유의하게 감소시켰다. 상기 용량에서, 구조식 (I)의 화합물 및 필고티닙의 평균 임상 점수는 1.5 및 5.6으로 감소하였다(값은 표 11 참조). 구조식(I)의 화합물은 15 mg/kg에서 콜라겐 유도관절염을 효과적으로 감소시킬 수 있었다. 0.3 mg/kg의 덱사메타손(G3군)은 콜라겐 유도관절염의 임상 점수를 유의하게 억제할 수 있었다. 임상 점수는 27 일부터 약 0.3으로 유지되었고 31 일째에 0으로 감소했습니다 (임상 점수는 0으로 감소했습니다. 값은 표 11을 참조하십시오).
*본 발명에서의 평균 임상 점수
일 G2 대조군 G3 Dex. G6 화학식(I)의 화합물 G8 필고티닙 G1 정상군
21 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
24 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
27 0.38±0.18 0.25±0.16 0.50±0.19 0.25±0.16 0.00±0.00
28 0.50±0.19 0.50±0.27 0.63±0.26 0.63±0.26 0.00±0.00
29 1.38±0.38 0.25±0.16 1.00±0.38 0.88±0.40 0.00±0.00
31 2.50±0.73 0.00±0.00 1.38±0.53 1.88±0.81 0.00±0.00
34 4.25±0.73 0.00±0.00 1.50±0.63 2.63±0.82 0.00±0.00
36 4.75±1.08 0.00±0.00 1.75±0.67 3.88±1.27 0.00±0.00
38 5.38±1.00 0.00±0.00 1.88±0.77 4.88±1.39 0.00±0.00
41 5.75±0.96 0.00±0.00 1.50±0.71 5.63±1.45 0.00±0.00
*노트: 평균 임상 점수 ± 표준 오차
각 그룹에서 각 동물의 임상 점수 곡선을 분석함으로써, 곡선 하의 면적(AUC)을 계산하고, 용매 대조군에 대한 개별 투여 그룹의 억제율을 그룹 간의 평균 AUC를 통해 계산하였다. 자세한 결과는 표 12와 같다: 화학식(I)의 화합물과 필고티닙은 15 mg/kg의 동일 용량에서 관절염 동물의 임상 점수 AUC를 감소시킬 수 있었으며, 억제율은 각각 59.9% 및 18.7%이었다. 덱사메타손은 또한 억제율 97.3%로 관절염 동물의 임상 점수를 유의하게 감소시킬 수 있었다.
*발병률 곡선하의 면적
G2 대조군 G3 Dex. G6 화학식(I)의 화합물 G8 필고티닙
AUC ±SEM 51.75±10.97 1.38±0.81 20.75±8.05 42.06±12.50
억제율 N/A 97.3% 59.9% 18.7%
*노트: 곡선 아래의 면적 값은 투여 기간 동안 각 그룹과 각 마우스의 발생률 곡선 아래의 면적을 나타내는 동물의 임상 데이터를 기반으로 하는 Graphpad Prism® 소프트웨어에 재단되었다. 억제율 = (대조군 곡선 아래 면적의 평균값 - 투여군 곡선 아래 면적의 평균값)/대조군 곡선 아래 면적의 평균값.
다양한 처리 요인도 콜라겐 유발 관절염의 발병률에 영향을 줄 수 있다. 실험의 상세한 결과는 표 13에 나타내었다: 구조식 (I)의 화합물의 발생률은 29일째에 63%에 도달하였고 실험이 끝날 때까지 유지되었다(구체적인 값은 표 8-5 참조). 필고티닙 처리군의 발병률은 첫 투여 이후 감소하였다가 마지막 투여 이후 100%가 될 때까지 점차 증가하였다. 용매 대조군의 관절염 발병률은 면역 후 34일째에 100%에 도달하여 유지되었다. 양성대조군인 덱사메타손 0.3 mg/kg 처리군의 발병률은 투여 후 감소하기 시작하여 31일째 0%로 감소하였다.
*본 발명에서의 발생률
일 G2 대조군 G3 Dex. G6 화학식(I)의 화합물 G8 필고티닙 G1 정상군
21 0% 0% 0% 0% 0%
24 0% 0% 0% 0% 0%
27 38% 25% 50% 25% 0%
28 50% 38% 50% 50% 0%
29 75% 25% 63% 50% 0%
31 75% 0% 63% 75% 0%
34 100% 0% 63% 88% 0%
36 100% 0% 63% 88% 0%
38 100% 0% 63% 88% 0%
41 100% 0% 63% 100% 0%
*노트: 발병률 = 각 그룹의 동물 수/각 그룹의 총 동물 수 *100%
2. 체중
실험의 상세한 결과를 표 14에 나타내었다: 정상 그룹과 비교하여 마우스의 체중은 면역 모델링 후 감소하였다. 개별 투여군의 체중은 28일째부터 34일째까지 감소한 후 서서히 증가하기 시작하였다. 덱사메타손 그룹이 가장 큰 체중 감소를 보였으나 다른 그룹에 비해 유의한 차이는 없었다. 구조식 (I)의 화합물과 필고티닙 그룹 간에는 기본적으로 동일한 체중 변화 경향(구체적인 값은 표 14 참조)을 갖는 유의한 차이가 없었으며, 이는 상기 화합물이 마우스의 체중에 거의 영향을 미치지 않음을 시사한다.
*본 발명에서의 평균 체중
일 G2 대조군 G3 Dex. G6 화학식(I)의 화합물 G8 필고티닙 G1 정상군
21 22.38±0.23 22.41±0.26 22.38±0.30 22.63±0.27 22.30±1.10
24 21.89±0.67 22.36±0.20 22.33±0.37 22.50±0.33 23.00±1.07
27 21.96±0.63 22.35±0.25 21.99±0.44 22.25±0.32 23.22±1.11
28 22.14±0.56 22.43±0.26 22.08±0.51 22.30±0.35 23.12±1.12
29 21.89±0.47 21.51±0.23 21.59±0.41 21.95±0.40 22.30±1.15
31 21.64±0.48 21.24±0.23 21.80±0.58 21.61±0.49 23.78±1.17
34 22.21±0.54 20.71±0.26 22.18±0.53 21.46±0.57 23.70±1.24
36 22.40±0.52 21.28±0.20 22.53±0.47 21.84±0.61 24.26±1.36
38 21.79±0.44 19.91±0.20 22.09±0.40 20.88±0.54 23.56±1.32
41 23.06±0.49 20.84±0.30 22.99±0.34 22.30±0.52 24.24±1.42
*노트: 평균 체중 ± 표준 오차
결론: 마우스의 콜라겐 유도 관절염(CIA) 모델에서 화학식 (I)의 화합물은 우수한 질병 치료 효과를 나타내었고 마우스의 체중에 큰 영향을 미치지 않았으며 동일 용량의 필고티닙보다 우수하였다.
실험예 4: 래트에서 보조제 유도 관절염(AIA)의 생체내 약력학적 연구
실험 목적:
보조제 유도 관절염(AIA) 래트 모델은 류마티스 관절염 질환 연구 및 신약 개발에서 일반적으로 사용되는 동물 모델 중 하나이다. 그 병인 및 임상 증상은 인간 류마티스 관절염 질환과 유사하다. 상기 모델에서 마이코박테리움 투베르쿨로시스를 발바닥에 주입하면 뼈와 관절에 손상을 일으키는 면역 세포와 항체가 유도되어 관절 부종, 골용해, 활막 손상 및 기타 인간 류마티스 관절염과 유사한 증상을 포함한 전신성 반응을 일으켰다. 본 실험의 목적은 기준 화합물로 덱사메타손 및 필고티닙을 사용하여 보조제 유도 관절염 래트 모델에 대한 구조식 (I)의 화합물의 치료 효과를 평가하는 것이다. 본 실험에는 하기와 같은 8개의 그룹이 있다: 정상군, 용매 대조군(비히클 그룹), 구조식 (I)의 화합물의 1 mg/kg BID, 3 mg/kg BID, 10 mg/kg BID 및 30 mg/kg BID 처리군, 양성 대조군 약물인 덱사메타손 0.3 mg/kg QD 처리군 및 기준 화합물 필고티닙 30 mg/kg bid 처리군. 정상군을 제외한 모든 래트에게 관절염을 유도하기 위해 프로인트 완전 보조제를 0일째에 피하 주사하였다. 실험 프로토콜에 따라 그룹을 체중에 따라 나눈 후, 13일째에 점수를 매기고 14일 동안 투여를 계속하였다. 실험 과정 중, 체중, 발 부피(13일째 이후 주 3회 측정) 및 임상 점수를 모니터링하였다. 실험이 끝나면 헤마톡실린 에오신 (HE) 염색 및 병리학적 점수 분석을 위해 래트의 오른쪽 뒷발을 수거하였다.
실험 방법
1. 관절염 모델
보조제 준비: 결핵균 H37Ra 100 mg을 달아 약 5분간 분쇄한 후 파라핀유 3 mL를 가하여 분말을 녹이고 갈색 분주병에 옮겼다. 상기 모르타르를 각각 3 mL, 4 mL의 파라핀유로 2회 세척한 후, 얻어진 용액을 갈색 분주병에 옮겨 최종 농도 10 mg/mL가 되도록 하였다. 얼음물 혼합물에서 약 30분 동안 초음파 처리하는 것을 포함하여 초음파 파쇄를 수행하였다.
2. 관절염 유도
상기 준비된 보조제를 흔들어 혼합하고 1 mL 유리 주사기(20 G 니들)로 추출한 후 25G 니들로 기포를 제거하였다. 래트들을 이소플루란으로 마취하였다. 각각의 래트를 면역화하기 전에, 주사기를 거꾸로 놓아 결핵균이 완전히 혼합되도록 하였다. 마취 후 0.1 mL의 보조제를 래트의 왼발바닥에 피하주사하였다. 0.1 mL의 파라핀유를 정상 래트의 발바닥에 피하주사하였다. 보조제를 주사한 날을 0일로 하였다.
3. 투여
13일째에, 모든 동물에서 발의 홍반이나 부종 등의 관절염 증상이 나타났다. 동물들을 계층화하고 점수, 발 부피 및 체중에 따라 무작위로 그룹화하였다. 그룹화에 대해서는 표 15 참조. 70 마리의 래트를 7개의 그룹으로 나누었고, 각 그룹에 10 마리, 정상 그룹에는 5 마리의 래트를 배정하였다. 표 15에 따르면, 각 그룹의 투여량은 다음과 같았다. 위내 투여량은 5 mL/kg이었다. 화합물은 14일 동안 하루에 두 번 투여되었다.
그룹화 및 용량 설계
그룹 시험 약물 수 투여 방법 농도
mg/mL 		용량
mg/kg 		빈도
G1 정상군 (정상) 5 N/A N/A N/A N/A
G2 용매대조군 (비히클) 10 p.o. N/A N/A bid, 14 days
G3 덱사메타손 (Dex) 10 p.o. 0.06 0.3 qd, 14 days
G4 필고티닙 10 p.o. 6 30 bid, 14 days
G5 화학식(I)의 화합물 10 p.o. 0.2 1 bid, 14 days
G6 화학식(I)의 화합물 10 p.o. 0.6 3 bid, 14 days
G7 화학식(I)의 화합물 10 p.o. 2 10 bid, 14 days
G8 화학식(I)의 화합물 10 p.o. 6 30 bid, 14 days
4. 관절염 발병지수의 결정
체중: 13일째부터 27일째까지 주 3회 체중을 측정하였다.
발 부피: 면역전 1회, 13일째부터 27일째까지 주 3회 측정.
점수: 13일째부터 27일째까지 주 3회 점수화. 병변의 정도(발적, 부종, 관절 변형)에 따라 0~4점을 기준으로 점수를 평가하였다. 사지 각각의 최대 점수는 4점, 각 동물의 최대 점수는 12점이었다(주사측 왼쪽 뒷다리 제외). 점수 기준은 표 16에 나타내었다.
관절염의 임상 점수 기준
점수 임상 증상
0 홍반 및 발적 부종 없음
1 족근골, 발목 또는 중족골 부근의 홍반 또는 가벼운 발적 부종, 또는 한쪽 발가락의 홍반 및 발적 부종
2 발목 관절 및 중족골의 경미한 홍반 및 부종, 그리고 2개 이상의 발가락의 발적 부종 및 홍반
3 발목, 손목 및 중족골의 중등도 홍반 및 부종
4 발목, 손목, 중족골 및 발가락의 심한 발적 및 부종
5. 병리학적 분석
27일째에 래트를 안락사시켰다. 채혈 후 래트의 오른쪽 뒷발을 채취하여 10% 포르말린 용액에 담그고 포름산 용액으로 탈회한 후 파라핀에 포매하고 얇게 썰어 HE로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 관절 손상 정도를 4가지 측면에서 평가하였다: 염증세포 침윤, 판누스 형성, 연골 손상 및 골 흡수를 측정하고, 0-4의 기준에 따라 점수를 매겼다. 채점 기준은 다음과 같다(표 17).
관절염 병리 점수 기준
병리학적 변화 병리학적 특징 점수

염증세포 침윤


 눈에 띄는 염증 세포가 없다. 0
활막하 세포는 섬유성이며 매우 적은 양의 세포 침윤이 있다. 1
활막 세포가 증식하고 소량의 단핵구 침윤이 있다. 2
활막 세포가 증식하고 많은 수의 단핵구, 형질 세포 및 림프구 침윤이 있다. 3
관절 주위에 많은 수의 염증 세포 침윤, 조직 섬유증 및 활액 비후가 있다. 4



판누스 형성
 판누스 형성이 없다. 0
연골의 가장자리에 아주 소량의 판누스가 형성되었다. 1
연골 사이의 섬유조직이 증식하였고 관절 가장자리에 소량의 판누스가 형성되었다. 2
관절 연골의 표면 50%에 판누스가 형성되었다. 3
관절 연골 표면 전체에서 판누스 형성을 볼 수 있다. 4



연골 손상
 눈에 보이는 연골 손상이 없다. 0
관절 연골 세포가 증식하였다. 1
연골 세포 기질이 손실되고 적은 수의 연골 세포가 파괴되었다. 2
관절 주위의 섬유 조직이 증식하고 많은 수의 연골 세포가 파괴되었다. 3
관절 연골 사이에 많은 섬유조직 과형성 및 연골 침식이 있다. 4
골 흡수 가시적인 골 흡수가 없다. 0
활막의 가장자리에서 극소량의 골 흡수를 볼 수 있다. 1
골 조직의 작은 영역에서 소량의 파골세포를 볼 수 있다. 2
국소 연골하 골 조직에서 골 흡수가 있다. 3
광범위한 골 조직에서 골 흡수가 일어나고 연골 침식이 동반되었다. 4
6. 통계 처리
실험 데이터는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표현하였고, 체중, 임상 점수 및 병리학적 점수는 일원 분산분석(one-way ANOVA)으로 분석하였으며(P < 0.05)인 경우 유의한 차이로 간주하였다.
실험 결과
1. 임상 점수
본 실험에서, 덱사메타손 및 필고티닙을 기준으로 하여 래트 관절염(AIA) 모델에서 임상 점수 개선에 대한 구조식 (I)의 화합물의 효과를 평가하였다. 보조제로 면역시키고 6일째에 래트들에 관절염 증상이 나타나기 시작하였다. 13일째 투여 후에 용매 대조군의 평균 임상 점수는 점차 증가하였다. 실험 결과 용매 대조군의 평균 임상점수는 24일째에 정점을 찍고 약 8점을 유지하여 AIA 모델의 성공적인 확립을 알 수 있었다(표 18).
실험 최종일(27일째)에 구조식(I)의 화합물은 1, 3, 10, 30 mg/kg의 4가지 용량에서 관절염 래트의 임상점수를 유의하게 억제(용매 대조군 대비 P < 0.0001)하였으며, 용량 의존적으로 관절염 래트의 임상점수를 각각 5.4, 3.9, 3.2, 2.7로 감소시켰다(고용량군 및 저용량군 대비 P < 0.0001). 그 중에서도 구조식 (I)의 화합물 30 mg/kg의 효과가 가장 뚜렷하였다(17일째부터 용매 대조군과 비교하여 매우 유의한 차이가 있었다, P < 0.0001). 이 그룹의 평균 관절염 임상 점수는 13일째에 최고 6.0에서 27일째에 2.7로 감소하였다(표 18). 기준 화합물인 필고티닙 30 mg/kg BID 처리군의 점수는 27일째 실험 최종일에서 5.1로 감소하여 용매 대조군보다 유의하게 낮았으나(P < 0.001), 구조식 (I)의 화합물 30 mg/kg BID 처리군의 점수보다는 유의하게 높았다(P < 0.001). 구조식 (I)의 화합물의 관절염 임상 점수에 대한 개선 효과는 동일한 용량에서 필고티닙의 개선 효과보다 상당히 우수하였다.
양성대조군인 덱사메타손 처리군의 평균 임상점수는 13일째 이후에 최고치인 6.0에 도달하였다. 투여 후 임상 점수는 27일째 실험 종료일에서 2.7점으로 계속 하락하였다. 용매 대조군과 비교하여 17일째부터 매우 유의한 차이를 보였다(표 18).
2. 발 부피
본 실험에서 덱사메타손 및 필고티닙을 기준으로 하여 래트 관절염(AIA) 모델에서 화학식 I의 화합물의 발 부피에 대한 효과를 평가하였다. 용매 대조군 동물의 평균 발 부피는 13일째 1.9 mL에서 실험 종료일인 27일째에 2.9 mL로 꾸준히 증가하였으며, 이는 AIA 모델의 성공적인 확립을 나타낸다(표 9-5). 실험 종료시, 구조식 (I)의 화합물은 1, 3, 10 및 30 mg/kg의 용량에서 관절염 래트의 발 부피 증가를 유의하게 억제할 수 있었으며(용매 대조군 대비 P < 0.0001), 관절염 래트의 평균 발 부피는 각각 1.91 mL, 1.59 mL, 1.26 mL 및 1.21 mL로 용량 의존적으로 감소하였다(고용량군 및 저용량군 대비 P < 0.0001). 기준 화합물인 필고티닙 30 mg/kg BID 처리군에서는 실험 종료일인 27일째에 1.91로 감소하여 용매 대조군의 점수보다는 유의하게 낮았으나(P<0.0001), 구조식(I)의 화합물 30 mg/kg BID 처리군의 점수보다는 유의하게 높았다(P<0/0001). 구조식 (I)의 화합물의 래트 발 부피의 개선에 대한 효과는 동일 용량에서 필고티닙보다 유의하게 우수하였다. 양성대조군인 덱사메타손 역시 평균 발 부피의 증가를 잘 억제하였다. 투여 후 발의 부피는 꾸준히 감소하여 실험이 끝날 때까지 1.21 mL를 유지하였다. 용매 대조군과 비교하여 17일째부터 매우 유의한 차이를 보였다(표 19).
3. 체중
정상 그룹과 비교하여 래트의 체중은 면역 모델링 후 감소하였다. 투여 후 13일째 각 투여군의 체중은 용매대조군에 비해 서서히 지속적으로 증가한 반면, 양성대조군인 덱사메타손 처리군의 체중은 천천히 회복되었다. 이러한 결과는 래트가 필고티닙 및 구조식 (I)의 화합물에 대해 우수한 내성을 갖는다는 것을 시사한다. 구조식 (I)의 화합물 30 mg/kg 처리군의 체중이 가장 빠르게 증가하였고, 4회 투여시의 체중 증가 경향은 용량 의존적이었다(표 20).
4. 조직병리학적 검사 결과
용매 대조군 관절염 쥐의 총 병리학적 점수는 16 ± 0.00이었다. 상기 구조식(I)의 화합물 처리군의 점수는 1 mg/kg 투여군에서 13.3 ± 0.44로 감소하였고 (용매 대조군 대비 P = 0.09), 억제율은 16.9%였다. 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 용량 처리군에서 관절염 쥐의 병리학적 점수는 각각 11.3 ± 1.64, 4.4 ± 1.16, 1.6 ± 0.47로 유의하게 감소하였다. P 값은 각각 0.014, < 0.0001 및 < 0.0001이었다. 억제율은 각각 29.4%, 72.5% 및 90%이었다. 기준 화합물인 필고티닙 30 mg/kg 처리군의 총 병리학적 점수는 15.2 ± 0.49이었으며 억제율은 5%이었다. 용매 대조군과 비교하여 유의한 차이는 없었다. 동일한 용량(30 mg/kg)에서 구조식 (I)의 화합물 처리군의 총 병리학적 점수는 필고티닙 처리군의 총 병리학적 점수보다 유의하게 낮았다(P<0.0001). 대조군 화합물인 덱사메타손 0.3 mg/kg 처리는 관절염 래트의 병리학적 점수를 4.4±0.8로 유의하게 감소시켰고(P < 0.0001), 억제율은 72.5%였다(표 21).
임상 점수
일 정상군 용매대조군 덱사메타손
(0.3 mg/kg)		 필고티닙 (30 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (1 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (3 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (10 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (30 mg/kg)
평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차
13 0 0 6.1 0.5 6.0 0.5 6.0 0.6 6.0 0.5 6.0 0.6 6.0 0.5 6.0 0.5
15 0 0 7.3 0.4 5.3* 0.5 6.6 0.5 6.9 0.5 5.8 0.5 5.5* 0.4 4.5*** 0.4
17 0 0 7.6 0.4 4.1**** 0.5 6.3 0.6 6.7 0.4 5.4** 0.5 4.4**** 0.4 3.1**** 0.2
20 0 0 7.8 0.4 3.4**** 0.5 5.8** 0.6 6.0* 0.4 4.1**** 0.4 3.8**** 0.2 3.0**** 0.2
22 0 0 8.0 0.4 3.1**** 0.5 5.5*** 0.6 5.8** 0.4 4.0**** 0.4 3.7**** 0.3 2.8**** 0.2
24 0 0 8.1 0.3 3.1**** 0.5 5.4**** 0.5 5.6*** 0.4 4.0**** 0.4 3.4**** 0.2 2.7**** 0.2
27 0 0 8.1 0.3 2.9**** 0.5 5.1**** 0.5 5.4**** 0.3 3.9**** 0.4 3.2**** 0.1 2.7**** 0.2
*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001 vs.용매대조군, 일원분산분석.
발 부피
일 정상군 용매대조군 덱사메타손
(0.3 mg/kg)		 필고티닙 (30 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (1 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (3 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (10 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (30 mg/kg)
평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차
13 1.1 0.0 1.9 0.1 1.9 0.1 1.9 0.1 1.9 0.1 1.9 0.1 1.9 0.1 1.9 0.1
15 1.1 0.0 2.3 0.1 1.7**** 0.1 2.2 0.1 2.2 0.1 2.0* 0.1 1.8*** 0.1 1.6**** 0.1
17 1.1 0.0 2.4 0.1 1.4**** 0.1 2.0** 0.1 2.0** 0.1 1.9**** 0.1 1.6**** 0.1 1.4**** 0.1
20 1.0 0.0 2.5 0.1 1.3**** 0.1 1.9**** 0.1 1.9**** 0.1 1.8**** 0.1 1.5**** 0.1 1.3**** 0.1
22 1.1 0.0 2.6 0.1 1.3**** 0.1 2.0**** 0.1 1.9**** 0.1 1.7**** 0.1 1.4**** 0.1 1.2**** 0.0
24 1.1 0.0 2.8 0.1 1.2**** 0.1 2.0**** 0.1 1.9**** 0.1 1.6**** 0.1 1.3**** 0.1 1.2**** 0.0
27 1.1 0.0 2.9 0.1 1.2**** 0.1 1.9**** 0.1 1.9**** 0.1 1.6**** 0.1 1.3**** 0.0 1.2**** 0.0
*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001 vs.용매대조군, 일원분산분석.
체중
일 정상군 용매대조군 덱사메타손
(0.3 mg/kg)		 필고티닙 (30 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (1 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (3 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (10 mg/kg) 화학식 (I)의 화합물 (30 mg/kg)
평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차 평균 표준오차
0 177.6 2.0 182.0 2.3 182.2 2.7 182.7 2.9 182.0 1.6 187.0 2.2 181.6 2.2 181.2 2.3
13 210.2 3.4 168.1 3.3 169.1 2.5 168.0 3.0 168.0 1.3 169.6 1.4 168.5 2.5 169.3 2.2
15 209.8 3.1 167.7 3.1 162.4 2.1 167.5 2.9 170.1 2.0 172.3 1.5 171.1 2.7 174.8 2.2
17 212.5 2.7 168.0 3.0 160.5 1.5 168.3 3.0 168.9 1.5 170.9 1.7 175.2 2.7 180.6** 2.4
20 216.9 3.7 166.9 3.0 161.6 2.2 169.7 2.8 168.1 1.5 172.8 1.5 179.9** 3.3 188.9**** 2.5
22 218.8 3.1 168.9 3.0 163.5 2.2 171.2 2.6 169.6 1.4 177.0 1.3 186.3**** 3.5 196.0**** 2.2
24 218.7 3.5 171.7 2.7 163.7 2.0 174.3 3.7 173.6 1.8 179.8 1.8 190.1**** 2.5 198.8**** 2.2
27 220.1 3.7 177.2 2.8 163.4** 2.7 181.7 3.5 180.9 1.8 188.6* 1.7 198.2**** 2.9 206.3**** 2.7
*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001 vs.용매대조군, 일원분산분석.
병리학적 점수
그룹 병리학적 점수 (평균 ± 표준 오차)
염증세포 침윤 판누스 형성 연골 손상 골 흡수 총 점수
정상군 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
용매 대조군 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0 16.0±0.0
덱사메타손 아세테이트(0.3 mg/kg) 1.8±0.2 1.4±0.3 0.6±0.2 0.6±0.2 4.4±0.8****
필고티닙 (30 mg/kg) 4.0±0.0 3.9±0.1 3.7±0.2 3.6±0.2 15.2±0.5
화학식(I)의 화합물 (1 mg/kg) 3.6±0.3 3.5±0.3 3.3±0.4 2.9±0.5 13.3±1.4
화학식(I)의 화합물 (3 mg/kg) 3.3±0.3 3.2±0.3 2.5±0.5 2.3±0.5 11.3±1.6*
화학식(I)의 화합물 (10 mg/kg) 1.7±0.3 1.4±0.4 0.8±0.3 0.5±0.3 4.4±1.2****
화학식(I)의 화합물 (30 mg/kg) 0.6±0.2 0.5±0.2 0.3±0.1 0.2±0.1 1.6±0.5****
*p<0.05, ****p<0.001, v.s., 용매 대조군, 일원분산분석0
결론: 용매 대조군의 래트는 관절염의 임상 증상이 있었고 계속 악화되었다. 용매 대조군과 비교하여 구조식 (I)의 화합물(1, 3, 10, 30 mg/kg), 필고티닙(30 mg/kg) 및 덱사메타손(0.3 mg/kg)은 보조제 유도 관절염에 대해 유의한 억제 효과를 나타내었으며, 이는 발병 시간을 늦추고 임상 증상과 병리학적 변화를 유의하게 감소시켰다. 보조제 유도 관절염 모델에 대한 구조식 (I)의 화합물의 치료 효과는 용량 의존적이었다. 상기 실험 결과는 구조식 (I)의 화합물이 보조제 유도 관절염 래트에 명백한 치료 효과를 가지며, 그 효과가 필고티닙보다 우수함을 나타낸다.

Claims (26)

  1. X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20° 및 19.06 ± 0.20의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는 구조식 (I)의 화합물의 결정형 A.
    Figure pct00004

    (I)
  2. 제 1항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 6.91 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20° 및 27.52 ± 0.20°에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 A.
  3. 제 2항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 6.91 ± 0.20°, 10.34 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 18.11 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20° 및 27.52 ± 0.20°에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 A.
  4. 제 3항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 6.91 ± 0.20°, 10.34 ± 0.20°, 12.21 ± 0.20°, 13.69 ± 0.20°, 17.44 ± 0.20°, 18.11 ± 0.20°, 19.06 ± 0.20°, 19.86 ± 0.20°, 20.59 ± 0.20°, 22.06 ± 0.20°, 24.46 ± 0.20° 및 27.52 ± 0.20°에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 A.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 결정형 A는 도 1에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 결정형 A.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정형 A는 시차 주사 열량 측정 곡선 상에서 각각 152.19±3℃ 및 216.79±3℃에서 흡열 피크 값을 가지며, 161.50±3℃에서 발열 피크 값을 갖는것을 특징으로 하는, 결정형 A.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 결정형 A는 도 2에 도시된 DSC 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 A.
  8. X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 5.13 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° 및 21.18 ± 0.20°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 구조식 (I)의 화합물의 결정형 B.
  9. 제 8 항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20° 및 21.18 ± 0.20에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 B.
  10. 제 9 항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 5.13 ± 0.20°, 7.34 ± 0.20°, 10.14 ± 0.20°, 10.56 ± 0.20°, 11.72 ± 0.20°, 16.67 ± 0.20°, 19.14 ± 0.20°, 21.18 ± 0.20° 및 21.78 ± 0.20°에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 B.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 결정형 B는 도 3에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 B.
  12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정형 B는 시차 주사 열량 측정 곡선 상에서 각각 193.99±3℃ 및 216.93±3℃에서 흡열 피크 값을 가지며, 200.10±3℃에서 발열 피크 값을 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 B.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 결정형 B는 도 4에 도시된 DSC 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 B.
  14. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정형 B는 열중량 분석 곡선(TGA)의 120 ± 3℃에서 최대 0.535%의 중량 손실을 나타내는 것을 특징으로 하는, 결정형 B.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 결정형 B는 도 5에 도시된 TGA 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 B.
  16. X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 8.92 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20° 및 20.26 ± 0.20°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특지으로 하는,구조식 (I)의 화합물의 결정형 C.
  17. 제 14 항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 5.76 ± 0.20°, 8.92 ± 0.20°, 11.50 ± 0.20°, 16.35 ± 0.20°, 18.66 ± 0.20°, 19.17 ± 0.20°, 20.26 ± 0.20° 및 24.79 ± 0.20°에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 C.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 결정형 C는 도 6에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 C.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정형 C는 시차 주사 열량 측정 곡선 상의 215.48℃에서 흡열 피크의 시작점을 갖는 것을 특징으로 하는 결정형 C.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 결정형 C는 도 7에 도시된 DSC 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 결정형 C.
  21. X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 7.12 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20° 및 21.42 ± 0.20°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 구조식 (I)의 화합물의 결정형 D.
  22. 제 21 항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 7.12 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° 및 28.72 ± 0.20°에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 D.
  23. 제 22 항에 있어서, X선 분말 회절(XRPD) 스펙트럼에서 2θ 각도가 7.12 ± 0.20°, 10.28 ± 0.20°, 12.45 ± 0.20°, 14.64 ± 0.20°, 17.50 ± 0.20°, 18.31 ± 0.20°, 20.54 ± 0.20°, 21.42 ± 0.20° 및 28.72 ± 0.20°에서 특징적인 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, 결정형 D.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 결정형 D는 도 8에 도시된 XRPD 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 결정형 D.
  25. JAK1 및/또는 TYK2와 관련된 질병의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 결정형 A, 제 8항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 결정형 B, 제 16항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 결정형 C, 및 제 21항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 따른 결정형 D의 용도.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 약물이 류마티스 관절염 치료제인 용도.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2010010187A1 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
JO3041B1 (ar) * 2008-07-25 2016-09-05 Galapagos Nv مركبات جديدة مفيدة لمعالجة الأمراض التنكسية والالتهابية
WO2018019223A1 (zh) * 2016-07-26 2018-02-01 张文燕 作为选择性jak抑制剂化合物，该化合物的盐类及其治疗用途
CA3046965A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Janssen Pharmaceutica Nv Small molecule inhibitors of the jak family of kinases
CN108341814B (zh) * 2017-01-23 2021-09-03 上海翔锦生物科技有限公司 Jak激酶抑制剂及其应用
EP3842431B1 (en) * 2018-08-23 2023-12-27 Zhuhai United Laboratories Co., Ltd. [1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridine compound as jak inhibitor and application thereof
EP4105214A4 (en) * 2020-02-13 2023-11-08 Zhuhai United Laboratories Co., Ltd. USE OF JAK INHIBITORS IN THE MANUFACTURING OF DRUGS FOR TREATING JAK KINASE RELATED DISEASES
KR20230129248A (ko) * 2021-01-29 2023-09-07 주하이 유나이티드 라보라토리즈 컴퍼니 리미티드 Jak 억제제 또는 이의 염 또는 결정형을 함유하는 경구제제, 및 이의 제조 방법 및 응용

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