KR20210010529A - 안지오텐시노젠(AGT) iRNA 조성물 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

안지오텐시노젠(AGT) iRNA 조성물 및 이들의 사용 방법 Download PDF

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도날드 포스터
그레고리 힌클
마크 케이. 슐레겔
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알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 AGT 유전자를 표적화하는 RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 작용제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 AGT 유전자의 발현을 억제하기 위해 그러한 RNAi 작용제를 사용하는 방법 및 AGT-연관 장애, 예를 들어, 고혈압을 예방하고 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

안지오텐시노젠(AGT) iRNA 조성물 및 이들의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2018년 5월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 62/671,094, 2018년 9월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 62/727,141, 및 2019년 3월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/816,996과 관련된다. 그 각각의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 본원에 그 전체 내용이 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2019년 5월 3일에 생성된 상기 ASCII 사본은 121301_08620_SL.txt로 명명되고 272,488 바이트 크기이다.
레닌-안지오텐신-알도스테론계(renin-angiotensin-aldosterone system: RAAS)는 혈압 조절에 중요한 역할을 한다. RAAS 캐스케이드는 간으로부터의 안지오텐시노젠(angiotensinogen) 방출, 및 신장의 사구체옆 세포에 의한 순환계로의 레닌 방출로 시작된다. 레닌 분비는 원위 세뇨관의 Na+ 부하, β-교감신경 자극, 또는 신장 관류 감소를 포함한 여러 요인에 의해 자극된다. 혈장내 활성 레닌은 안지오텐시노젠(간으로부터 생성)을 안지오텐신 I으로 절단하고, 이는 이후 순환 및 국소 발현된 안지오텐신-전환 효소(angiotensin-converting enzyme: ACE)에 의해 안지오텐신 II로 전환시킨다. RAAS에 대한 안지오텐신 II의 대부분의 효과는 안지오텐신 II형 1 수용체(angiotensin II type 1 receptor: AT1R)에 대한 이의 결합에 의해 발휘되어 동맥 혈관수축, 관형 및 사구체 효과, 예컨대, 향상된 Na+ 재흡수 또는 사구체 여과율 조절을 야기한다. 또한, 아드레노코르티코트로핀, 항-이뇨 호르몬, 카테콜아민, 엔도텔린, 세로토닌, 및 Mg2+ 및 K+의 수준과 같은 다른 자극과 함께, AT1R 자극은 알도스테론 방출을 야기하고, 이는 결과적으로 신장 원위 곡세뇨관에서 Na+ 및 K+ 배출을 촉진한다.
예를 들어, 과도한 안지오텐신 II 생산 또는 AT1R 자극으로 이어지는 RAAS의 조절장애는 고혈압을 초래하고, 고혈압은, 예를 들어, 심장, 신장 및 동맥에서 산화 스트레스 증가, 염증 촉진, 비대, 및 섬유증을 유발하고, 예를 들어, 좌심실 섬유증, 동맥 재구성 및 사구체경화증을 초래할 수 있다.
고혈압은 성인 인구의 20% 내지 50%에 영향을 미치는 선진국에서 가장 만연하고 있는 조절 가능한 질환이다. 고혈압은 기대 수명 단축, 만성 신장 질환, 뇌졸중, 심근 경색, 심부전, 동맥류(예를 들어, 대동맥류), 말초 동맥 질환, 심장 손상(예를 들어, 심장 확장 또는 비대) 및 기타 심혈관 관련 질환, 장애, 또는 병태와 같은 다양한 질환, 장애 및 병태에 대한 주요 위험 요소이다. 또한, 고혈압은 전체 뇌졸중의 62% 및 모든 심장 질환 사례의 49%를 차지하거나 이에 기여하는 심혈관 이환율 및 사망률에 대한 중요한 위험 요소인 것으로 밝혀졌다. 2017년에, 고혈압의 진단, 예방, 치료에 대한 지침의 변경은 고혈압과 관련된 질환 및 장애의 발병 위험을 더 감소시키기 위해 훨씬 더 낮은 혈압을 목표로 제공하는 것으로 이루어졌다(예를 들어, 문헌[Reboussin et al. Systematic Review for the 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol.　2017 Nov 7. pii: S0735-1097(17)41517-8. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.004; 및 Whelton et al. (2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 2017 Nov 7. pii: S0735-1097(17)41519-1. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.006] 참조).
고혈압 치료에 이용 가능한 다수의 항-고혈압 약물에도 불구하고, 2/3가 넘는 대상체가 하나의 항-고혈압제로 조절되지 않고 상이한 약물 부류로부터 선택된 둘 이상의 항-고혈압제를 필요로 한다. 이는 추가로 약제의 수가 증가하면 순응도가 감소하고 부작용이 증가하므로 조절된 혈압을 갖는 대상체의 수를 감소시킨다.
발명의 요약
본 발명은 안지오텐시노젠(AGT)을 인코딩하는 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 주는 iRNA 조성물을 제공한다. AGT는 세포, 예를 들어, 대상체, 예컨대, 인간 대상체 중의 세포 내에 있을 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 안지오텐시노젠(AGT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보 핵산(dsRNA) 작용제로서, dsRNA 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 635 내지 658, 636 내지 658, 642 내지 667, 642 내지 664, 645 내지 667, 1248 내지 1273, 1248 내지 1272, 1248 내지 1270, 1250 내지 1272, 1251 내지 1273, 1580 내지 1602, 1584 내지 1606, 1587 내지 1609, 1601 내지 1623, 1881 내지 1903, 2074 내지 2097, 2074 내지 2096, 2075 내지 2097, 2080 내지 2102, 2272 내지 2294, 2276 내지 2298, 2281 내지 2304, 2281 내지 2303, 또는 2282 내지 2304 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 이중 가닥 리보 핵산(dsRNA) 작용제를 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 635 내지 658, 636 내지 658, 642 내지 667, 642 내지 664, 645 내지 667, 1248 내지 1273, 1248 내지 1272, 1248 내지 1270, 1250 내지 1272, 1251 내지 1273, 1580 내지 1602, 1584 내지 1606, 1587 내지 1609, 1601 내지 1623, 1881 내지 1903, 2074 내지 2097, 2074 내지 2096, 2075 내지 2097, 2080 내지 2102, 2272 내지 2294, 2276 내지 2298, 2281 내지 2304, 2281 내지 2303, 또는 2282 내지 2304 중 어느 하나의 적어도 21 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 21 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 안티센스 가닥은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 센스 가닥은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 안티센스 가닥은 AD-85481(5'-UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA-3'(SEQ ID NO: 9))의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 센스 가닥은 AD-85481(5'-GUCAUCCACAAUGAGAGUACA-3'(SEQ ID NO: 10))의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥은 AD-85481(5'-UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA-3'(SEQ ID NO: 9) 및 5'-GUCAUCCACAAUGAGAGUACA-3'(SEQ ID NO: 10))의 센스 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 실질적으로 모든 센스 가닥의 뉴클레오티드 및 실질적으로 모든 안티센스 가닥의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 모든 센스 가닥의 뉴클레오티드 및 모든 안티센스 가닥의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 변형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠김 뉴클레오티드, 비잠김 뉴클레오티드, 형태가 제약된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오티드, 2'-하이드록실-변형 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오티드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드, 열적 탈안정화 뉴클레오티드, 글리콜 변형 뉴클레오티드(glycol modified nucleotide: GNA), 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오티드; 및 이들의 조합의 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에 있어서, 뉴클레오티드에 대한 변형은 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-하이드록실, GNA, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에 있어서, 뉴클레오티드에 대한 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 특정 구현예에 있어서, 변형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 글리콜 변형 뉴클레오티드(GNA), 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오티드; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 변형 중 적어도 하나는 열적 탈안정화 뉴클레오티드 변형이다. 특정 구현예에 있어서, 열적 탈안정화 뉴클레오티드 변형은 무염기 변형; 듀플렉스에서 대항하는 뉴클레오티드와의 미스매치; 및 탈안정화 당 변형, 2'-데옥시 변형, 비사이클릭 뉴클레오티드, 비잠김 핵산(unlocked nucleic acid: UNA), 및 글리세롤 핵산(GNA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 구현예에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이는 19 내지 21 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이는 21 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제의 각 가닥의 길이는 독립적으로 30 뉴클레오티드 이하이다. 특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1 뉴클레오티드 또는 적어도 2 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제는 리간드를 추가로 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 리간드는 dsRNA 작용제의 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이션된다. 특정 구현예에 있어서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체이고, 예를 들어, 여기서 리간드는 하기 화합물이다:
Figure pct00001
.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제는 하기 화학식에 나타낸 바와 같은 리간드에 컨쥬게이션된다:
Figure pct00002
(식 중, X는 O 또는 S이고, 예를 들어, X는 O이다).
특정 구현예에 있어서, 본 발명은 sdRNA 작용제로서, 안티센스 가닥은 인간 AGT를 인코딩하는 mRNA에 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 서열 중 하나의 적어도 19개의 뉴클레오티드를 포함하는, sdRNA 작용제를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 안티센스 가닥은 인간 AGT를 인코딩하는 mRNA에 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상보성 영역은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 서열 중 어느 하나로 이루어진다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명은 dsRNA 작용제로서, 안티센스 가닥은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 화학적 변형 뉴클레오티드 서열을 포함하는, dsRNA 작용제를 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명은 dsRNA 작용제로서, 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-85481의 화학적 변형 뉴클레오티드 서열(5'- usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3'(SEQ ID NO: 11))을 포함하고, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-O-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고; dT는 데옥시-티민이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고;(Tgn)은 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체인, dsRNA 작용제를 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명은 dsRNA 작용제로서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 화학적 변형 뉴클레오티드 서열을 포함하는, dsRNA 작용제를 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명은 dsRNA 작용제로서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 듀플렉스 AD-85481의 화학적 변형 뉴클레오티드 서열(5'- usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3'(SEQ ID NO: 11) 및 5'- gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3'(SEQ ID NO: 12))을 포함하고, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-O-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고; dT는 데옥시-티민이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; (Tgn)은 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체이고; 센스 가닥의 3'-말단은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀(L96) 리간드에 선택적으로 컨쥬게이션되는, dsRNA 작용제를 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명은 dsRNA 작용제로서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 듀플렉스 AD-85481의 화학적 변형 뉴클레오티드 서열(5'- usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3'(SEQ ID NO: 11) 및 5'- gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3'(SEQ ID NO: 12))로 이루어지고, 센스 가닥의 3'-말단은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀(L96) 리간드에 컨쥬게이션되고, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-메틸시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-메틸구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-메틸우리딘-3'-포스페이트이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-O-플루오로아데노신-3'-포스페이트, 2'-O-플루오로시티딘-3'-포스페이트, 2'-O-플루오로구아노신-3'-포스페이트, 및 2'-O-플루오로우리딘-3'-포스페이트이고; dT는 데옥시-티민이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; (Tgn)은 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체인, dsRNA 작용제를 제공한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제의 이중 가닥 영역의 길이는 약 19 내지 30 뉴클레오티드 쌍, 길이는 약 19 내지 25 뉴클레오티드 쌍, 길이는 약 23 내지 27 뉴클레오티드 쌍, 길이는 약 19 내지 23 뉴클레오티드 쌍, 길이는 약 21 내지 23 뉴클레오티드 쌍이다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제의 각 가닥의 길이는 독립적으로 19 내지 30 뉴클레오티드이다.
특정 구현예에 있어서, 리간드는 1가, 2가, 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합은 하나의 가닥의 3'-말단에 있다. 특정 구현예에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥이다. 특정 구현예에 있어서, 가닥은 센스 가닥이다. 특정 구현예에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단에 있다. 특정 구현예에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥이다. 특정 구현예에 있어서, 가닥은 센스 가닥이다. 특정 구현예에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합은 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단에 모두 있다. 특정 구현예에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥이다.
특정 구현예에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 dsRNA 작용제는 AU 염기쌍인 염기쌍을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제는 총 21 뉴클레오티드를 갖는 센스 가닥, 및 총 23 뉴클레오티드를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제를 함유하는 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제를 포함하는 AGT를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 약학적 조성물은 dsRNA 작용제 및 지질 제형을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포에서 AGT 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서,
(a) 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 약학적 조성물과 세포를 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 세포를 AGT 유전자의 mRNA 전사물 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지하여 세포에서 AGT 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 세포는 대상체 내에 있다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 AGT-연관 장애로 진단받았다.
특정 구현예에 있어서, AGT-연관 장애는 고혈압, 고혈압증, 경계성 고혈압, 원발성 고혈압, 속발성 고혈압 고립성 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신-관련 고혈압, 당뇨병 고혈압, 저항 고혈압, 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 골드블라트 고혈압, 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정성 고혈압; 고혈압성 심장 질환, 고혈압성 신병증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 혈관병증, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨병성 심근병증, 사구체경화증, 대동맥 협착, 대동맥류, 심실 섬유증, 심부전, 심근경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질환, 신부전, 전신 경화증, 자궁내 성장 제한(intrauterine growth restriction: IUGR), 태아 성장 제한, 비만, 간 지방증/지방간, 비알코올성 지방간염(non-alcoholic Steatohepatitis: NASH), 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD); 포도당 불내성, 2형 당뇨병(비-인슐린 의존성 당뇨병), 및 대사 증후군으로부터 선택된다.
특정 구현예에 있어서, 대상체는 적어도 130 mm Hg의 수축기 혈압 또는 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 적어도 140 mm Hg의 수축기 혈압 또는 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 염 민감성에 취약한 그룹의 일부이거나, 과체중이거나, 비만이거나, 임신 중이다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제와 세포를 접촉시키는 것은 AGT의 발현을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%(예를 들어, 먼저 세포를 dsRNA 작용제와 접촉시키기 전; 예를 들어, 대상체에 대한 첫 용량의 dsRNA 작용제의 투여 전 AGT의 발현 수준에 비해) 억제한다. 특정 구현예에 있어서, AGT의 발현을 억제하는 것은 대상체 혈청 표본(들)에서 AGT 단백질 수준을, 예를 들어, 먼저 dsRNA 작용제와 세포를 접촉시키기 전 AGT의 발현 수준에 비해, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 감소시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 AGT-연관 장애를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체에서 AGT-연관 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 적어도 130 mm Hg의 수축기 혈압 또는 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 적어도 140 mm Hg의 수축기 혈압 및 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 염 민감성에 취약한 그룹의 일부이거나, 과체중이거나, 비만이거나, 임신 중이다.
본 발명의 특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에 있어서, dsRNA 작용제는 대상체에게 피하로 투여된다. 특정 구현예에 있어서, AGT의 수준은 대상체에서 측정된다. 특정 구현예에 있어서, 대상체에서 AGT의 수준은 대상체 혈액 표본(들), 혈청 표본(들), 또는 소변 표본(들)에서의 AGT 단백질 수준이다.
특정 구현예에 있어서, 고혈압의 치료를 위한 추가 치료제가 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에 있어서, 추가 치료제는 이뇨제, 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제(angiotensin II receptor antagonist), 베타-차단제(beta-blocker), 혈관확장제(vasodialator), 칼슘 통로 차단제(calcium channel blocker), 알도스테론 길항제(aldosterone antagonist), 알파2-효능제(alpha2-agonist), 레닌 억제제(renin inhibitor), 알파-차단제(alpha-blocker), 말초 작용 아드레날린성 작용제(peripheral acting adrenergic agent), 선택적 D1 수용체 부분 효능제(selective D1 receptor partial agonist), 비선택적 알파-아드레날린성 길항제(nonselective alpha-adrenergic antagonist), 합성제, 및 스테로이드성 항염류코르티코이드 작용제(steroidal antimineralocorticoid agent); 또는 임의의 상기 물질들의 조합, 및 작용제들의 조합으로서 제형화된 고혈압 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에 있어서, 추가 치료제는 안지오텐신 II 수용체 길항제, 예를 들어, 로사르탄(losartan), 발사르탄(valsartan), 올메사르탄(olmesartan), 에프로사르탄(eprosartan), 및 아질사르탄(azilsartan)을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 추가 치료제는 안지오텐신 수용체-네프릴리신 억제제(angiotensin receptor-neprilysin inhibitor: ARNi), 예를 들어, 엔트레스토®(Entresto®), 사쿠비트릴(sacubitril)/발사르탄; 또는 엔도텔린 수용체 길항제(endothelin receptor antagonist: ERA), 예를 들어, 시탁센탄(sitaxentan), 암브리센탄(ambrisentan), 아트라센탄(atrasentan), BQ-123, 지보텐탄(zibotentan), 보센탄(bosentan), 마시텐탄(macitentan), 및 테조센탄(tezosentan)이다.
본 발명은 또한 AGT-연관 장애의 치료를 위한 본원에 제공된 dsRNA 작용제 및 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 용도는 본 발명에 의해 제공된 임의의 방법을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다.
도 1a는 단회 3 mg/kg 용량의 지시된 siRNA로 처리된 시노몰구스 원숭이(그룹 당 n = 3)에서 혈청 AGT 단백질 수준을 나타내는 그래프이다. AGT 수준은 처리전 AGT 수준의 퍼센트로 나타나 있다.
도 1b는 1일째에 단회 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 3 mg/kg 용량의 AD-85481 또는 AD-67327로 처리된 시노몰구스 원숭이(그룹 당 n = 3)에서 혈청 AGT 단백질 수준을 나타내는 그래프이다. AGT 수준은 처리전 AGT 수준의 퍼센트로 나타나 있다.
도 1c는 3회 용량으로 4주 마다 1회 1 mg/kg 용량의 AD-85481 또는 AD-67327이 투여된 시노몰구스 원숭이(그룹 당 n = 3)에서 혈청 AGT 단백질 수준을 나타내는 그래프이다. AGT 수준은 처리전 AGT 수준의 퍼센트로 나타나 있다.
도 2a 내지 도 2g는 비히클, 발사르탄(31 mg/kg/일), 래트 특이적 AGT-siRNA(10 mg/kg q2w), 캅토프릴(100 mg/kg/일), 발사르탄과 캅토프릴, 또는 발사르탄과 AGT-siRNA로 처리된 자연유발 고혈압 래트(그룹 당 n = 9)의 연구에서 다양한 파라미터의 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 연구(4주째)의 시작(실선 막대) 및 종료(점선 막대)에서 혈장 AGT 수준을 나타낸 것이다.
도 2b는 기준과 비교한 일일 혈압 판독을 나타낸 것이다.
도 2c는 심장 중량:경골 길이 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2d는 연구(4주째)의 시작(실선 막대) 및 종료(점선 막대)에서 혈장 레닌 활성 수준을 나타내는 그래프이다.
도 2e는 평균 동맥압(MAP)(mm Hg)에 대해 그래프로 나타낸 심장 중량:경골 길이의 그래프이다.
도 2f는 심근세포 크기의 그래프이다.
도 2g는 N-말단 pro b-타입 나트륨이뇨 펩타이드(NT-proBNP) 수준의 그래프이다.
도 3은 자연유발 고혈압 래트 연구에서 소변 AGT 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 자연유발 고혈압 래트 연구에서 혈액 Ang I의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 자연유발 고혈압 래트 연구에서 혈액 Ang II의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4c는 자연유발 고혈압 래트 연구에서 혈액 Ang I에 대한 혈액 Ang II의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 자연유발 고혈압 래트 연구에서 신장 Ang I의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5b는 자연유발 고혈압 래트 연구에서 신장 Ang II의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5c는 자연유발 고혈압 래트 연구에서 신장 Ang I에 대한 신장 Ang II의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 6a는 자연유발 래트 고혈압 연구에서 신장 피질 및 수질에서의 안지오텐신 수용체 1a의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 6b는 자연유발 래트 고혈압 연구에서 신장 피질 및 수질에서의 안지오텐신 1b 수용체의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 6c는 자연유발 래트 고혈압 연구에서 신장 피질 및 수질에서의 ACE의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 7은 자연유발 래트 고혈압 연구에서 기준 및 처리 시작 후 4주째의 소변 부피를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 공급 식이 유발 비만(DIO) 마우스 또는 정상 사료 공급 마우스(그룹 당 n = 5)의 평균 체중을 나타내는 그래프이다.
도 8b는 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 공급 식이 유발 비만(DIO) 마우스 또는 정상 사료 공급 마우스의 말단 간, 지방, 및 근육 중량(그룹 당 n = 5)을 나타내는 그래프이다.
도 9a는 첫 치료 투여 전 0주째에 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 공급 식이 유발 비만(DIO) 마우스 또는 정상 사료 공급 마우스(그룹 당 n = 5)의 혈장 포도당 수준(mg/dL)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 실험 6주째에 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 공급 식이 유발 비만(DIO) 마우스 또는 정상 사료 공급 마우스(그룹 당 n = 5)의 혈장 포도당 수준(mg/dL)을 나타내는 그래프이다.
도 9c는 실험 12주째에 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 공급 식이 유발 비만(DIO) 마우스 또는 정상 사료 공급 마우스(그룹 당 n = 5)의 혈장 포도당 수준(mg/dL)을 나타내는 그래프이다.
도 10a는 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 고과당(HF HFr) 공급 마우스, 또는 정상 사료 공급(LFD) 마우스의 평균 체중을 나타내는 그래프이다.
도 10b는 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 고과당(HF HFr) 공급 마우스, 또는 정상 사료 공급(LFD) 마우스의 평균 누적 체중 증가를 나타내는 그래프이다.
도 11a 내지 도 11c는 실험 20주째에 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 고과당(HF HFr) 공급 마우스, 또는 정상 사료 공급(LFD) 마우스의 혈청 간 효소를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 고과당(HF HFr) 공급 마우스, 또는 정상 사료 공급(LFD) 마우스의 알라닌 아미노기전이효소(ALT) 수준을 나타내는 그래프이다.
도 11b는 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 고과당(HF HFr) 공급 마우스, 또는 정상 사료 공급(LFD) 마우스의 아스파르테이트 아미노기전이효소(AST) 수준을 나타내는 그래프이다.
도 11c는 AGT dsRNA 작용제 또는 PBS로 처리된 고지방 고과당(HF HFr) 공급 마우스, 또는 정상 사료 공급(LFD) 마우스의 글루타메이트 데하이드로게나제(GLDH) 수준을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 AGT 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 제공한다. 유전자는 세포, 예컨대 인간과 같은 대상체 내의 세포에 있을 수 있다. 이들 iRNA의 사용은 포유류에서 상응하는 유전자(AGT 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다.
본 발명의 iRNA는 다른 포유류 종의 AGT 오르소로그에서 보존된 유전자 부분을 포함하는, 인간 AGT 유전자를 표적화하도록 설계되었다. 이론에 구속되지 않으면서, 상기 특성의 조합 또는 하위-조합 및 이들 iRNA에서 특정 표적 부위 또는 특정 변형은 본 발명의 iRNA에 개선된 유효성, 안정성, 효력, 내구성, 및 안전성을 부여하는 것으로 여겨진다.
따라서, 본 발명은 AGT 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 사용하여, AGT-연관 장애, 예컨대, 고혈압을 치료하고 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 iRNA는 길이가 최대 약 30 뉴클레오티드 이하, 예컨대, 길이가 19 내지 30, 19 내지 29, 19 내지 28, 19 내지 27, 19 내지 26, 19 내지 25, 19 내지 24, 19 내지 23, 19 내지 22, 19 내지 21, 19 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 29, 20 내지 28, 20 내지 27, 20 내지 26, 20 내지 25, 20 내지 24, 20 내지 23, 20 내지 22, 20 내지 21, 21 내지 30, 21 내지 29, 21 내지 28, 21 내지 27, 21 내지 26, 21 내지 25, 21 내지 24, 21 내지 23, 또는 21 내지 22 뉴클레오티드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하고, 상기 영역은 AGT 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제의 하나 또는 두 가닥 모두는 길이가 최대 66 뉴클레오티드, 예컨대, 길이가 36 내지 66, 26 내지 36, 25 내지 36, 31 내지 60, 22 내지 43, 27 내지 53 뉴클레오티드이며, AGT 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부와 실질적으로 상보적인 적어도 19 연속 뉴클레오티드의 영역을 갖는다. 일부 구현예에 있어서, 더 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 그러한 iRNA 작용제는 바람직하게는 길이가 20 내지 60 뉴클레오티드인 제2 RNA 가닥(센스 가닥)을 포함할 수 있고, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 18 내지 30 연속 뉴클레오티드의 듀플렉스를 형성한다.
본 발명의 iRNA의 사용은 포유류에서 상응하는 유전자(AGT 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다. 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여, 본 발명자들은 AGT 유전자를 표적화하는 iRNA가 RNAi를 매개하여 AGT 발현의 유의한 억제를 야기할 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 대상체에서 AGT 발현의 억제는 AGT-연관 장애, 예를 들어, 고혈압의 발병을 예방하거나 치료할 것이다. 따라서, 이러한 iRNA를 포함하는 방법 및 조성물은 AGT-연관 장애, 예를 들어, 고혈압에 취약하거나 이로 진단받은 대상체를 예방하고 치료하는 데 유용하다. 따라서, 본원의 방법 및 조성물은 대상체에서 AGT의 수준을 감소시키는 데 유용하다.
하기 상세한 설명은 AGT 유전자의 발현을 억제하기 위해 iRNA를 함유하는 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지 뿐만 아니라 AGT 유전자의 발현 감소로 이득을 얻을 대상체, 예컨대, AGT-연관 장애, 예컨대, 고혈압에 취약하거나 이로 진단받은 대상체를 치료하기 위한 조성물, 용도, 및 방법을 개시한다.
I. 정의
본 발명이 더 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 우선 정의한다. 또한, 매개변수의 값 또는 값의 범위가 인용될 때마다, 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 일부로 의도된다는 것을 주지하여야 한다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나를 초과하는(예컨대, 적어도 하나)을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들면, "하나의 구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나를 초과하는 구성요소, 예컨대, 복수의 구성요소를 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 이에 한정되지 않는"이라는 어구를 의미하는 것으로 본원에서 사용되고, 상기 어구와 교환 가능하게 사용된다.
"또는"이라는 용어는 맥락이 명백히 달리 표시하지 않으면, "및/또는"이라는 용어를 의미하는 것으로 본원에서 사용되고, 상기 용어와 교환 가능하게 사용된다. 예를 들면, "센스 가닥 또는 안티센스 가닥"은 "센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥"으로 이해된다.
본원에 사용된 "약"이라는 용어는 업계에서의 통상적인 관용 범위 내임을 의미한다. 예를 들면, "약"은 평균으로부터 약 2 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 약은 ±10%를 의미한다. 특정 구현예에 있어서, 약은 ±5%를 의미한다. 약이 수치 시리즈 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "약"이 시리즈 또는 범위 내의 각각의 수치를 수식할 수 있음이 이해된다.
수치 또는 수치 시리즈 앞의 "적어도"라는 용어는 맥락으로부터 명백한 바와 같이, "적어도"라는 용어에 인접한 수치, 및 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 수치 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 핵산 분자 내의 뉴클레오티드의 수는 정수여야 한다. 예를 들면 "21 뉴클레오티드 핵산 분자의 적어도 19 뉴클레오티드"는 19, 20, 또는 21 뉴클레오티드가 표시된 특성을 가짐을 의미한다. 적어도가 수치 시리즈 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "적어도"가 시리즈 또는 범위 내의 각각의 수치를 수식할 수 있음이 이해된다.
본원에 사용된 "이하" 또는 "미만"은, 맥락으로부터 논리적인 바와 같이, 0까지의, 어구에 인접한 값 및 논리적인 더 낮은 값 또는 정수로서 이해된다. 예를 들면, "2 뉴클레오티드 이하"의 오버행을 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. "이하"가 수치 시리즈 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "이하"가 시리즈 또는 범위 내의 각각의 수치를 수식할 수 있음이 이해된다. 본원에 사용된 범위는 상한 및 하한을 모두 포함한다.
서열 및 전사물 또는 다른 서열 상에서의 그 표시 부위 간 상충 시, 명세서에서 인용된 뉴클레오티드 서열이 우선이 된다.
용어 "AGT"와 상호교환적으로 사용되는, 본원에서 사용된 바와 같은 "안지오텐시노젠"은 세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 A, 구성원 8; 알파-1 항프로테이나제; 항트립신; 세르핀A8; 안지오텐신 I; 세르핀 A8; 안지오텐신 II; 알파-1 항프로테이나제 안지오텐시노젠; 항트립신; 프리-안지오텐시노젠2; ANHU; 세린 프로테이나제 억제제; 및 시스테인 프로테이나제 억제제로도 당업계에 알려져 있는, 잘-알려져 있는 유전자 및 폴리펩타이드를 지칭한다.
용어 "AGT"는, 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 GI:188595658(NM_000029.3; SEQ ID NO:1)에서 확인될 수 있는 아미노산 및 완전 코딩 서열인, 인간 AGT; 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 GI: 90075391(AB170313.1: SEQ ID NO:3)에서 확인될 수 있는 아미노산 및 완전 코딩 서열인, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) AGT; 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 GI: 113461997(NM_007428.3; SEQ ID NO:5)에서 확인될 수 있는 아미노산 및 완전 코딩 서열인, 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus)); 및 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 GI:51036672(NM_134432; SEQ ID NO:7)에서 확인될 수 있는 아미노산 및 완전 코딩 서열인, 래트 AGT(라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus)) AGT를 포함한다.
AGT mRNA 서열의 추가 예는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스, 예를 들어, 진뱅크, UniProt, OMIM, 및 마카카 게놈 프로젝트 웹 사이트를 이용하여 용이하게 입수 가능하다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "AGT"는 또한 AGT 유전자의 자연발생적 DNA 서열 변이, 예컨대, AGT 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 지칭한다. 예시적인 SNP는 www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp￢￢_ref.cgi?geneId=183에서 이용 가능한 dbSNP 데이터베이스에서 확인될 수 있다. AGT 유전자 내 서열 변이의 비-제한적 예는, 예를 들어, 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,589,584에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, AGT 유전자 내에서 서열 변형은 위치 -532(전사 시작 부위에 대해)에서 C→T; 위치 -386에서 G→A; 위치 -218에서 G→A; 위치 -18에서 C→T; 위치 -6 및 -10에서 G→A 및 A→C; 위치 +10(비번역)에서 C→T; 위치 +521에서 C→T(T174M); 위치 +597에서 T→C(P199P); 위치 +704에서 T→C(M235T; 또한, 예를 들어, 참조 SNP(refSNP) 클러스터 리포트: rs699, www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP에서 이용 가능); 위치 +743에서 A→G(Y248C); 위치 +813에서 C→T(N271N); 위치 +1017에서 G→A(L339L); 위치 +1075에서 C→A(L359M); 및/또는 위치 +1162에서 G→A(V388M)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "표적 서열"은 일차 전사 생성물의 RNA 가공 생성물인 mRNA를 포함하는, AGT 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 서열의 표적 부분은 AGT 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열 부분에서 또는 그 근처에서 iRNA-지시 절단을 위한 기질로 작용하도록 적어도 충분히 길 것이다. 일 구현예에 있어서, 표적 서열은 AGT의 단백질 코딩 영역 내에 있다.
표적 서열은 길이가 약 19 내지 36 뉴클레오티드, 예컨대, 바람직하게는 길이가 약 19 내지 30 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 표적 서열은 길이가 약 19 내지 30 뉴클레오티드, 19 내지 30, 19 내지 29, 19 내지 28, 19 내지 27, 19 내지 26, 19 내지 25, 19 내지 24, 19 내지 23, 19 내지 22, 19 내지 21, 19 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 29, 20 내지 28, 20 내지 27, 20 내지 26, 20 내지 25, 20 내지 24, 20 내지 23, 20 내지 22, 20 내지 21, 21 내지 30, 21 내지 29, 21 내지 28, 21 내지 27, 21 내지 26, 21 내지 25, 21 내지 24, 21 내지 23, 또는 21 내지 22 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 인용된 범위 및 길이에 중간인 범위 및 길이도 본 발명의 일부로 고려된다.
본원에 사용된 "서열을 포함하는 가닥"이라는 용어는 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 지칭되는 서열에 의해 기술되는 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
"G", "C", "A", "T", 및 "U" 각각은 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘, 및 우라실 각각을 함유하는 뉴클레오티드를 일반적으로 나타낸다. 그러나, "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"라는 용어는 하기에 더욱 상술된 바와 같이 변형된 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 모이어티를 지칭할 수도 있다는 것을 알 것이다(예컨대, 표 2 참고). 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 그러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오티드를 포함하여, 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 형성 성질을 실질적으로 변경시키지 않으면서 기타 모이어티에 의해 대체될 수 있다는 것을 충분히 인지한다. 예를 들면, 제한 없이, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드는 본 발명에서 특징된 dsRNA의 뉴클레오티드 서열 내에서, 예를 들면, 이노신을 함유하는 뉴클레오티드에 의해 대체될 수 있다. 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드 내의 어딘가의 아데닌 및 시토신은 구아닌 및 우라실과 각각 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 그러한 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본 발명에서 특징된 조성물 및 방법에 적합하다.
본원에 교환 가능하게 사용된 "iRNA", "RNAi 작용제", "iRNA 작용제", "RNA 간섭제"라는 용어는 상기 용어가 본원에 정의된 바와 같이 RNA를 포함하고, RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC) 경로를 통하여 RNA 전사물의 표적된 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭(RNAi)로 알려진 공정을 통해 mRNA의 서열-특이적 분해를 지시한다. iRNA는 세포, 예컨대, 포유류 대상체와 같은 대상체 내의 세포 내에서 AGT 유전자의 발현을 조절, 예컨대, 억제한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 표적 RNA의 절단을 지시하는 표적 RNA 서열, 예컨대, AGT 표적 mRNA 서열과 상호작용하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이론에 구속되지 않으면서, 세포로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)(Sharp 등 (2001) Genes Dev. 2001, 15:485)로 알려진 III형 엔도뉴클레아제에 의하여 siRNA로 분해되는 것으로 여겨진다. 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 두 개 염기 3' 오버행을 갖는 19 내지 23 염기쌍 단 간섭 RNA로 처리한다(Bernstein 등 (2001) Nature 409:363). 이후, siRNA는 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)로 포함되어, 여기서 하나 이상의 헬리카제는 siRNA 듀플렉스를 풀어내어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있도록 한다(Nykanen 등 (2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA에 결합시에, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단시켜 침묵화를 유도한다(Elbashir 등 (2001) Genes Dev. 15:188). 따라서, 일 양태에 있어서, 본 발명은 세포 내에 발생되고, 표적 유전자, 즉, AGT 유전자의 침묵화를 일으키는 RISC 복합체의 형성을 촉진하는 단일 가닥 RNA(siRNA)에 관한 것이다. 따라서, "siRNA"라는 용어는 상술한 iRNA를 지칭하는 것으로 본원에서 사용되기도 한다.
특정 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체 내로 도입되는 단일-가닥 siRNA(ssRNAi)일 수 있다. 단일-가닥 RNAi 작용제는 RISC 엔도뉴클레아제, Argonaute 2에 결합하고, 이어서 표적 mRNA를 절단한다. 단일-가닥 siRNA는 일반적으로 15 내지 30 뉴클레오티드이며 화학적으로 변형된다. 단일-가닥 siRNA의 설계 및 평가는 미국 특허 번호 8,101,348호 및 문헌[Lima 등 (2012) Cell 150:883-894]에 기술되며, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기술된 임의의 안티센스 뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 바와 같은 단일-가닥 siRNA로서 또는 문헌[Lima 등 (2012) Cell 150:883-894]에 기술된 방법에 의해 화학적으로 변형되어 사용될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물, 용도, 및 방법에서 사용하기 위한 "iRNA"는 이중 가닥 RNA이며, 본원에서 "이중 가닥 RNAi 작용제", "이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자", "dsRNA 작용제", 또는 "dsRNA"로 지칭된다. "dsRNA"라는 용어는 표적 RNA, 즉, AGT 유전자에 대하여 "센스" 및 "안티센스" 배향성을 갖는 것으로 지칭된, 2개의 반평행(anti-parallel) 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는, 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에 있어서, 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 본원에서 RNA 간섭 또는 RNAi로 지칭되는 전사 후 유전자-침묵화 메커니즘을 통해 표적 RNA, 예컨대, mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자의 각각의 가닥의 대부분의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드지만, 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 각각의 가닥 또는 두 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예컨대, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "iRNA"는 화학적 변형을 가진 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다; iRNA는 여러 뉴클레오티드에 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"라는 용어는 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오티드간 결합, 또는 변형된 뉴클레오염기, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 변형된 뉴클레오티드라는 용어는, 예컨대 뉴클레오시드 결합, 당 모이어티, 또는 뉴클레오염기에 대한 작용기 또는 작용 원자의 치환, 부가 또는 제거를 포함한다. 본 발명의 작용제에서 사용하기 적합한 변형은 본원에 개시되거나 업계에 알려져 있는 모든 유형의 변형을 포함한다. siRNA 유형 분자에서 사용된 바와 같은 임의의 그러한 변형이 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "iRNA" 또는 "RNAi 작용제"에 포함된다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해 원하는 표적 RNA의 특이적인 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있으며, 길이가 약 19 내지 36 염기쌍, 예컨대, 길이가 약 19 내지 30 염기쌍, 예를 들면, 길이가 약 19 내지 30, 19 내지 29, 19 내지 28, 19 내지 27, 19 내지 26, 19 내지 25, 19 내지 24, 19 내지 23, 19 내지 22, 19 내지 21, 19 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 29, 20 내지 28, 20 내지 27, 20 내지 26, 20 내지 25, 20 내지 24, 20 내지 23, 20 내지 22, 20 내지 21, 21 내지 30, 21 내지 29, 21 내지 28, 21 내지 27, 21 내지 26, 21 내지 25, 21 내지 24, 21 내지 23, 또는 21 내지 22 염기쌍과 같이, 길이가 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36 염기쌍에 이를 수 있다. 상기 인용된 범위 및 길이에 중간인 범위 및 길이도 본 발명의 일부로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 두 개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 개별 RNA 분자일 수 있다. 두 개 가닥이 하나의 더 큰 분자의 부분이며, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 비단속 사슬에 의하여 결합되는 경우에, 결합 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로 지칭된다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍이 아닌 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 헤어핀 루프는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 23 이상의 쌍이 아닌 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 헤어핀 루프는 10 이하의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 헤어핀 루프는 8 이하의 쌍이 아닌 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 헤어핀 루프는 4 내지 10의 쌍이 아닌 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 헤어핀 루프는 4 내지 8 뉴클레오티드일 수 있다.
dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 개별 RNA 분자로 구성되는 경우에, 그러한 분자는 꼭 그러할 필요는 없지만, 공유적으로 결합될 수 있다. 두 개 가닥이 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 비단속 사슬이 아닌 수단에 의하여 공유적으로 결합되는 경우에, 결합 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기 쌍의 최대수는 dsRNA의 최단 가닥에 존재하는 뉴클레오티드의 수에 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행을 차감한 숫자이다. 듀플렉스 구조에 더하여, RNAi는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA 작용제는 dsRNA이며, 그 각각의 가닥은 19 내지 23 뉴클레오티드를 포함하고, 이는 표적 RNA 서열, 예컨대, AGT 유전자와 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시한다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA는 표적 RNA 서열, 예컨대, AGT 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 24 내지 30 뉴클레오티드의 dsRNA이다.
본원에 사용된 "뉴클레오티드 오버행"이라는 용어는 이중 가닥 iRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출하는 적어도 하나의 쌍이 아닌 뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 나머지 가닥의 5'-말단을 벗어나 연장하거나 그 반대인 경우, 뉴클레오티드 오버행이 있다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있고; 대안적으로, 오버행은 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하여, 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 유사체로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단, 또는 양 말단 상에 존재할 수 있다.
특정 구현예에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1 내지 10 뉴클레오티드, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 상의 오버행은 10 뉴클레오티드 초과의 연장된 길이, 예컨대, 1 내지 30 뉴클레오티드, 2 내지 30 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 10 내지 25 뉴클레오티드, 10 내지 20 뉴클레오티드, 또는 10 내지 15 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥 상에 있다. 특정 구현예에 있어서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에 있어서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에 있어서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥 상에 있다. 특정 구현예에 있어서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에 있어서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에 있어서, 연장된 오버행의 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체된다. 특정 구현예에 있어서, 오버행은 오버행이 생리적 조건 하에 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가-상보적 부분을 포함한다.
"평활성" 또는 "평활성 말단"은 이중 가닥 RNA 작용제의 말단에 쌍이 아닌 뉴클레오티드가 없음을, 즉 뉴클레오티드 오버행이 없음을 의미한다. "평활성 말단을 가진" 이중 가닥 RNA 작용제는 그 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥이다, 즉 분자의 양 말단에 뉴클레오티드 오버행이 없다. 본 발명의 RNAi 작용제는 하나의 말단에 뉴클레오티드 오버행이 없거나(즉 하나의 오버행 및 하나의 평활성 말단을 가진 작용제) 양 말단에 뉴클레오티드 오버행이 없는 RNAi 작용제를 포함한다. 가장 자주, 그러한 분자는 그 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥일 것이다.
"안티센스 가닥" 또는 "길잡이 가닥(guide strand)"이라는 용어는 표적 서열, 예컨대, AGT mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA, 예컨대, dsRNA의 가닥을 지칭한다. 본원에 사용된 "상보성의 영역"이라는 용어는 서열, 예를 들면, 표적 서열, 예컨대, 본원에 정의된 바와 같이 AGT 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성의 영역이 표적 서열에 대하여 완전 상보적이지 않은 경우에, 미스매치가 분자의 내부 또는 말단 영역에 있을 수 있다. 일반적으로, 가장 잘 관용되는 미스매치는 말단 영역에, 예컨대, iRNA의 5'- 또는 3'-말단의 5, 4, 또는 3 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 구현예에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제는 안티센스 가닥에 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제는 센스 가닥에 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 미스매치는, 예를 들면, iRNA의 3'-말단으로부터 5, 4, 3 뉴클레오티드 내에 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 뉴클레오티드 미스매치는, 예를 들면, iRNA의 3'-말단 뉴클레오티드에 있다.
본원에 사용된 "센스 가닥" 또는 "승객 가닥(passenger strand)"이라는 용어는 그 용어가 본원에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된"은 전체적이 아닌 대부분이 변형되며 5, 4, 3, 2, 또는 1 이하의 미변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "절단 영역"이라는 용어는 절단 부위에 바로 인접해 위치하는 영역을 지칭한다. 절단 부위는 절단이 일어나는 표적 상의 부위이다. 일부 구현예에 있어서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 말단 및 이에 바로 인접한 3개 염기를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 말단 및 이에 바로 인접한 2개 염기를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 절단 부위는 구체적으로 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 10 및 11에 의해 결합된 부위에서 일어나며, 절단 영역은 뉴클레오티드 11, 12 및 13을 포함한다.
본원에 사용되고 달리 지시되지 않으면, 제2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오티드 서열을 기술하는 데 사용될 때 "상보적"이라는 용어는 당업자가 이해하는 바와 같이, 상기 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 특정 조건 하에서 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하는 상기 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 그러한 조건은 예를 들면, 가혹한 조건일 수 있는데, 가혹한 조건은 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12 내지 16시간 이후에 세척을 포함할 수 있다(예컨대, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, 등 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press 참고). 유기체 내에서 직면할 수 있는 생리학적으로 적절한 조건과 같은 기타 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 최종적인 적용에 따른 2개 서열의 상보성의 시험에 대해 가장 적절한 조건의 세트를 결정할 수 있다.
iRNA, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 dsRNA 내의 상보적 서열은 하나 또는 양쪽의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐서 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대하여 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기-쌍형성을 포함한다. 그러한 서열은 본원에서 서로에 대하여 "완전 상보적"이라고 지칭될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원에서 제2 서열에 대하여 "실질적으로 상보적"으로 지칭되는 경우, 상기 두 서열은 완전 상보적일 수 있거나, 이들의 최종적인 적용, 예컨대, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제에 대하여 가장 적절한 조건하에서 혼성화할 수 있는 능력을 유지하면서, 혼성화 시 최대 30 염기쌍의 듀플렉스에 대하여 이들은 하나 이상이지만, 일반적으로 5, 4, 3, 또는 2개 이하의 미스매치된 염기쌍을 형성할 수 있다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시에 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계되는 경우, 그러한 오버행은 상보성의 결정에 대하여 미스매치로 간주되지 않는다. 예를 들면, 길이가 더 긴 올리고뉴클레오티드가 길이가 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 대하여 완전 상보적인 21 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 길이가 21 뉴클레오티드인 하나의 올리고뉴클레오티드 및 길이가 23 뉴클레오티드인 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA는 본원에 기술된 목적을 위해 "완전 상보적"으로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "상보적" 서열은 혼성화할 수 있는 능력에 대하여 상기 요구사항이 충족되는 한, 비-왓슨-크릭 염기쌍 또는 비-천연 및 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍을 또한 포함하거나 완전히 이들로부터 형성될 수도 있다. 그러한 비-왓슨-크릭 염기쌍은 G:U 워블(Wobble) 또는 후그스타인 염기쌍 형성을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 "상보적", "완전 상보적" 및 "실질적으로 상보적"이라는 용어는 이들의 사용의 맥락에서 이해될 수 있는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이, 또는 이중 가닥 RNA 작용제의 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이의 염기 매칭에 대하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된, 전령 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오티드는 관심 대상의 mRNA(예컨대, AGT 유전자를 인코딩하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, 서열이 AGT 유전자를 인코딩하는 mRNA의 비단속 부분에 실질적으로 상보적이라면 폴리뉴클레오티드는 AGT mRNA의 적어도 일부분에 상보적이다.
따라서, 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 센스 가닥 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 AGT 서열에 완전 상보적이다. 다른 구현예에 있어서, 본원에 개시된 센스 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 AGT 서열에 실질적으로 상보적이고, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 중 어느 하나, 또는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 중 어느 하나의 단편의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 상보적인, 예컨대, 적어도 90%, 또는 95% 상보적; 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
이에 따라서, 일부 구현예에 있어서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 AGT 서열에 완전 상보적이다. 다른 구현예에 있어서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 AGT 서열에 실질적으로 상보적이고, SEQ ID NO:1의 단편의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 상보적, 예컨대, 약 90%, 또는 약 95% 상보적인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 1의 단편은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 632 내지 658, 635 내지 658, 636 내지 658, 1248 내지 1273, 1248 내지 1270, 1250 내지 1272, 1251 내지 1273, 1580 내지 1602, 1584 내지 1606, 1587 내지 1609, 1601 내지 1623, 1881 내지 1903, 2074 내지 2097, 2074 내지 2096, 2075 내지 2097, 2080 내지 2102, 2272 내지 2294, 2276 내지 2298, 2281 내지 2304, 2281 내지 2303, 또는 2282 내지 2304의 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에 있어서, 듀플렉스는 uscsucccAfcCfUfUfuucuucuaauL96(SEQ ID NO: 13)으로 이루어진 센스 가닥 및 asUfsuagAfagaaaagGfuGfggagascsu(SEQ ID NO: 14)로 이루어진 안티센스 가닥으로 이루어지지 않는다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA는 표적 AGT 서열과 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며 표 3, 표 5, 또는 표 6에서의 센스 가닥 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열의 균등한 영역에 대해 그 전체 길이, 또는 표 3, 표 5, 또는 표 6에서 센스 가닥 중 어느 하나의 단편에 걸쳐 적어도 약 90% 상보적인, 예컨대 약 90%, 95%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA는 안티센스 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 상보적이고, 다시 표적 AGT 서열과 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표 3, 5, 또는 6에서의 안티센스 가닥 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열의 균등한 영역에 대해 그 전체 길이, 또는 표 3 또는 5에서의 안티센스 가닥 중 어느 하나의 단편에 걸쳐 적어도 약 90% 상보적인, 예컨대 약 90%, 95%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 표 3 또는 표 5에서 센스 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, 및 AD-85655로부터 선택된다.
일반적으로, "iRNA"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 변형은 본원에 개시되거나 업계에 알려진 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. dsRNA 분자에서 사용된 바와 같이, 그러한 임의의 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "iRNA"에 포함된다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 작용제는 안티센스 억제 메커니즘을 통해 표적 mRNA를 억제하는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자이다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자는 표적 mRNA 내의 서열과 상보적이다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA와의 염기쌍 형성 및 번역 기구의 물리적 폐쇄에 의해 화학양론적 방식으로 번역을 억제할 수 있다(Dias, N. 등 (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355 참고). 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자는 길이가 약 14 내지 약 30 뉴클레오티드일 수 있고 표적 서열과 상보적인 서열을 갖는다. 예를 들면, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자는 본원에 기술된 안티센스 서열 중 어느 하나로부터의 적어도 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 연속 뉴클레오티드인 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 dsRNA와 같이, "세포를 iRNA와 접촉시키는 단계"라는 어구는 임의의 가능한 수단에 의하여 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포를 iRNA와 접촉시키는 단계는 시험관 내 세포를 상기 iRNA와 접촉시키는 단계 또는 생체 내 세포를 상기 iRNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉시키는 단계는 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, iRNA는 방법을 수행하는 개인에 의하여 세포와 물리적으로 접촉될 수 있거나, 대안적으로, iRNA는 이를 이후에 세포와 접촉시키도록 하거나 접촉시키도록 유도하는 상황에 둘 수 있다.
시험관 내 세포를 접촉시키는 단계는 예를 들면, 세포를 iRNA와 배양함으로써 수행될 수 있다. 생체 내 세포를 접촉시키는 단계는 예를 들면, 작용제가 이후에 접촉될 세포가 위치하는 조직에 도달하도록, iRNA를 세포가 위치하는 조직으로 또는 조직 근처에 주사하거나, iRNA를 다른 영역, 예컨대, 혈류 또는 피하 공간으로 주사함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, iRNA는 iRNA를 관심 부위, 예컨대, 간으로 향하게 하는 리간드, 예컨대, GalNAc를 함유하거나 이에 결합될 수 있다. 시험관 내 및 생체 내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 예를 들면, 세포는 또한 iRNA와 시험관 내에서 접촉될 수 있고, 이후 대상체로 이식될 수도 있다.
특정 구현예에 있어서, 세포를 iRNA와 접촉시키는 단계는 세포로의 섭취 또는 흡수를 용이하게 하거나 유발함으로써 "도입하는 단계" 또는 "iRNA를 세포로 전달하는 단계"를 포함한다. iRNA의 흡수 또는 섭취는 보조받지 않은 확산 또는 활성 세포 공정을 통하거나 보조 작용제 또는 장치에 의하여 발생할 수 있다. iRNA를 세포로 도입하는 단계는 시험관 내 또는 생체 내일 수 있다. 예를 들면, 생체 내 도입을 위해, iRNA는 조직 부위로 주사되거나 전신으로 투여될 수 있다. 세포로의 시험관 내 도입은 업계에 알려진 방법, 예컨대 전기천공 및 리포펙션을 포함한다. 추가 접근은 하기 본원에 기술되거나 업계에 알려져 있다.
"지질 나노입자" 또는 "LNP"라는 용어는 약학적 활성 분자, 예컨대 핵산 분자, 예컨대, iRNA 또는 iRNA가 전사되는 플라스미드를 캡슐화하는 지질층을 포함하는 소포이다. LNP는, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,858,225, 6,815,432, 8,158,601, 및 8,058,069호에 기술되며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 내인성으로 또는 이종성으로, 표적 유전자를 발현하는, (인간 그리고 예컨대 원숭이 및 침팬지와 같은 비-인간 영장류와 같은) 영장류, (소, 돼지, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니 피그, 고양이, 개, 생쥐, 또는 마우스와 같은) 비-영장류를 포함하는 포유류 또는 조류와 같은 동물이다. 일 구현예에 있어서, 대상체는 인간, 예컨대, AGT 발현의 감소로부터 유리할 질환 또는 장애에 대해 치료되거나 평가되는 인간; AGT 발현 감소로부터 유리할 질환 또는 장애에 대한 위험에 있는 인간; AGT 발현 감소로부터 유리할 질환 똔느 장애를 갖는 인간; 또는 본원에 기재된 바와 같은 AGT 발현의 감소로부터 유리할 질환 또는 장애에 대해 치료되는 인간이다. 고혈압과 같은 AGT-연관 장애에 대한 진단 기준은 하기에서 제공된다. 일부 구현예에 있어서, 대상체는 여성 인간이다. 다른 구현예에 있어서, 대상체는 남성 인간이다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 염 민감성에 취약한 그룹의 일부, 예를 들어, 흑인 또는 노인(65세 이상의 연령)이다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 과체중이거나 비만이고, 예를 들어, 중심성 비만을 앓고 있는 대상체이다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 정주형이다. 특정 구현예에 있어서, 대상체는 임신 중이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체에서 AGT-연관 장애, 예를 들어, 고혈압의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 감소시키는 것과 같은 유리하거나 요망되는 결과를 지칭한다. 치료는 또한, 검출 가능 또는 검출 불가에 상관 없이 원치 않는 AGT 발현, 예를 들어, 안지오텐신 II 타입 1 수용체 활성화(AT1R)(예를 들어, 고혈압, 만성 신장 질환, 뇌졸중, 심근경색, 심부전, 동맥류, 말초 동맥 질환, 심장 질환, 산화 스트레스 증가, 예를 들어, 초산화물 형성 증가, 염증, 혈관수축, 나트륨 및 수분 보유, 칼륨 및 마그네슘 손실, 레닌 억제, 근세포 및 평활근 비대, 콜라겐 합성 증가, 혈관 자극, 심근 및 신장 섬유증, 심장 수축 속도 및 힘 증가, 심박수 변화, 예를 들어, 부정맥 증가, 플라스미노겐 활성화제 억제제 1(PAI1)의 자극, 교감 신경계의 활성화, 및 엔도텔린 분비 증가)와 관련된 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소, 자궁내 성장 제한(IUGR) 또는 태아 성장 제한을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임신-관련 고혈압 증상(예를 들어, 자간전증 및 자간증), 악성 고혈압 관련 증상, 고알도스테론증 관련 증상; 원치 않는 AT1R 활성화 정도 감소; 만성 AT1R 활성화 상태 안정화(즉, 악화 없음); 원치 않는 AT1R 활성화(예를 들어, 고혈압, 만성 신장 질환, 뇌졸중, 심근경색, 심부전, 동맥류, 말초 동맥 질환, 심장 질환, 산화 스트레스 증가, 예를 들어, 초산화물 형성 증가, 염증, 혈관수축, 나트륨 및 수분 보유, 칼륨 및 마그네슘 손실, 레닌 억제, 근세포 및 평활근 비대, 콜라겐 합성 증가, 혈관 자극, 심근 및 신장 섬유증, 심장 수축 속도 및 힘 증가, 심박수 변화, 예를 들어, 부정맥 증가, 플라스미노겐 활성화제 억제제 1(PAI1)의 자극, 교감 신경계의 활성화, 및 엔도텔린 분비 증가)의 개선 또는 완화를 포함한다. AGT-연관 장애는 또한 비만, 간 지방증/지방간, 예를 들어, 비알코올성 지방간염(NASH) 및 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 포도당 불내성, 2형 당뇨병(비-인슐린 의존성 당뇨병), 및 대사 증후군을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 고혈압은 저 혈장 레닌 활성 또는 혈장 레닌 농도와 관련된 고혈압을 포함한다. "치료"는 또한 치료의 부재에서 예상되는 생존과 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다.
대상체에서 AGT 유전자 발현 또는 agt 단백질 생산 수준, 또는 질환 마커 또는 증상의 문맥에서 용어 "더 낮은"은 그러한 수준의 통계적으로 유의한 감소를 지칭한다. 감소는, 예를 들어, 관련 세포 또는 조직, 예를 들어, 간 세포, 또는 다른 대상체 표본, 예를 들어, 이로부터 유래된 혈액 또는 혈청, 소변에서 검출 방법에 대한 검출 수준의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 그 미만일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "예방" 또는 "예방하는"은 질환 또는 장애와 관련하여 사용될 때, 예를 들어, 예를 들어, 노화, 유전적 요인, 호르몬 변화,식이, 및 좌식 생활방식으로 인해 AGT-연관 장애에 취약한 대상체에서 AGT 유전자의 발현 또는 agt 단백질의 생산의 감소로부터 유리할 것이다. 특정 구현예에 있어서, 질환 또는 장애는, 예를 들어, 원치 않는 AT1R 활성화의 증상, 예컨대, 고혈압, 만성 신장 질환, 뇌졸중, 심근경색, 심부전, 동맥류, 말초 동맥 질환, 심장 질환, 산화 스트레스 증가, 예를 들어, 초산화물 형성 증가, 염증, 혈관수축, 나트륨 및 수분 보유, 칼륨 및 마그네슘 손실, 레닌 억제, 근세포 및 평활근 비대, 콜라겐 합성 증가, 혈관 자극, 심근 및 신장 섬유증, 심장 수축 속도 및 힘 증가, 심박수 변화, 예를 들어, 부정맥 증가, 플라스미노겐 활성화제 억제제 1(PAI1)의 자극, 교감 신경계의 활성화, 및 엔도텔린 분비 증가이다. AGT-연관 장애는 또한 비만, 간 지방증/지방간, 예를 들어, 비알코올성 지방간염(NASH) 및 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 포도당 불내성, 2형 당뇨병(비-인슐린 의존성 당뇨병), 및 대사 증후군을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 고혈압은 저 혈장 레닌 활성 또는 혈장 레닌 농도와 관련된 고혈압을 포함한다. 예를 들어, 고혈압을 발생시킬 가능성은 고혈압에 대한 하나 이상의 위험 요소를 갖는 개인이 고혈압을 발생시키지 않거나, 동일한 위험 요소를 갖고 본원에 기재된 바와 같은 치료를 받지 않은 인구에 비해 더 적은 중증도로 고혈압을 발생시킬 때 감소된다. AGT-연관 장애, 예를 들어, 고혈압 발생 실패 또는 고혈압 발생 시간의 수개월 또는 수년 지연은 효과적인 예방으로 간주된다. IRNA 작용제의 경우 예방은 1회 보다 많은 용량의 투여를 필요로 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "안지오텐시노젠-관련 질환" 또는 "AGT-관련 질환"은 레닌-안지오텐신-알도스테론계(RAAS) 활성화에 의해 초래되거나 이와 관련된 질환 또는 장애, 또는 RAAS 비활성화에 반응하는 증상 또는 이의 증상이 진행하는 질환 또는 장애이다. 용어 "안지오텐시노젠-관련 질환"은 AGT 발현의 감소로부터 유리할 질환, 장애 또는 병태를 포함한다. 이러한 질환은 전형적으로 고혈압과 관련된다. 안지오텐시노젠-관련 질환의 비제한적 예는 고혈압, 예를 들어, 경계성 고혈압(고혈압 전단계로도 알려짐), 원발성 고혈압(본태성 고혈압 또는 특발성 고혈압으로도 알려짐), 속발성 고혈압(본태성 고혈압으로도 알려짐), 고립성 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신-관련 고혈압(예를 들어, 자간전증, 자간증, 및 산후 자간전증), 당뇨병 고혈압, 저항 고혈압, 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압(신장 고혈압으로도 알려짐), 골드블라트 고혈압, 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정성 고혈압; 고혈압성 심장 질환, 고혈압성 신병증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 혈관병증(말초 혈관 질환 포함), 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨병성 심근병증, 사구체경화증, 대동맥 협착, 대동맥류, 심실 섬유증, 수면무호흡증, 심부전(예를 들어, 좌심실 수축성 기능장애), 심근경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질환, 예를 들어, 만성 신장 질환 또는 선택적으로 임신의 맥락에서 당뇨병성 신병증, 신부전, 예를 들어, 만성 신부전, 및 전신 경화증(예를 들어, 경피증 신발증)을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, AGT- 관련 질환은 자궁내 성장 제한(IUGR) 또는 태아 성장 제한을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, AGT-연관 장애는 또한 비만, 간 지방증/지방간, 예를 들어, 비알코올성 지방간염(NASH) 및 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 포도당 불내성, 2형 당뇨병(비-인슐린 의존성 당뇨병), 및 대사 증후군을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 고혈압은 저 혈장 레닌 활성 또는 혈장 레닌 농도와 관련된 고혈압을 포함한다.
고혈압의 임계치 및 고혈압 단계는 이하에서 상세하게 논의된다.
일 구현예에 있어서, 안지오텐시노젠-관련 질환은 원발성 고혈압이다. "원발성 고혈압"은 환경적 또는 유전적 원인의 결과(예를 들어, 명백한 근본적인 의학적 원인이 없는 결과)이다.
일 구현예에 있어서, 안지오텐시노젠-관련 질환은 속발성 고혈압이다. "속발성 고혈압"은 신장, 혈관 및 내분비 원인, 예를 들어, 신장 실질 질환(예를 들어, 다낭성 신장, 사구체 또는 간질 질환), 신장 혈관 질환(예를 들어, 신장 동맥 협착증, 섬유근 이형성증), 내분비 장애(예를 들어, 아드레노코르티코 스테로이드 또는 미네랄로코르티코이드 과잉, 크롬친화세포종, 갑상선기능항진증 또는 갑상선기능저하증, 성장 호르몬 과잉, 부갑상선기능항진증), 대동맥 협착, 또는 경구 피암약 사용을 포함하는 여러 병인일 수 있는 확인 가능한 근본적인 장애를 갖는다.
일 구현예에 있어서, 안지오텐시노젠-관련 질환은 임신-관련 고혈압, 예를 들어, 임신 중 만성 고혈압, 임신성 고혈압, 자간전증, 자간증, 만성 고혈압에 겹친 자간전증, HELLP 증후군, 및 임신성 고혈압(임신 중 일시적 고혈압, 임신 후반기에 확인된 만성 고혈압, 및 임신-유발 고혈압(PIH)으로도 알려짐)이다. 임신-관련 고혈압에 대한 진단 기준은 하기에서 제공된다.
일 구현예에 있어서, 안지오텐시노젠-관련 질환은 저항 고혈압이다. "저항 고혈압"은 상이한 부류의 세 가지 항고혈압제(이 중 하나는 티아자이드 이뇨제임)의 동시 사용에도 불구하고 목표 초과(예를 들어, 수축기 130 mm Hg 초과 또는 이완기 90 초과)로 유지되는 혈압이다. 네 가지 이상의 약제로 혈압을 조절한 대상체가 또한 저항 고혈압을 갖는 것으로 간주된다.
"치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 임의의 치료에 적용될 수 있는 합당한 이득/위험율에서 일부 원하는 효과를 생성하는 RNAi 작용제의 양도 포함한다. 본 발명의 방법에 채용되는 iRNA는 그러한 치료에 적용될 수 있는 합당한 이득/위험율을 생성하는 데 충분한 양으로 투여될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 어구는 철저한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 합당한 이득/위험율에 상응하는, 인간 대상체 및 동물 대상체의 조직과 접촉하여 사용하기 적합한, 그러한 화합물, 물질, 조성물, 또는 투여형을 지칭하는 것으로 본원에서 채용된다.
본원에 사용된 "약학적으로-허용 가능한 담체"라는 어구는 신체의 일 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 대상 화합물을 전하거나 수송하는 데 포함되는, 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제, 제조 보조물(예컨대, 윤활제, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산) 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로-허용 가능한 물질, 조성물, 또는 운반체를 의미한다. 각각의 담체는 제형의 기타 성분과 양립할 수 있으며 치료받는 대상체에게 해가 되지 않는 의미에서 "허용 가능"하여야 한다. 그러한 담체는 당업계에 공지되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 주사를 통한 투여를 위한 담체를 포함한다.
본원에 사용된 "표본"이라는 용어는 대상체 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라 대상체로부터 분리된 유사한 유체, 세포 또는 조직의 집합을 포함한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장액, 혈장, 뇌척수액, 안 유체(ocular fluids), 림프, 소변, 타액 등을 포함한다. 조직 표본은 조직, 기관, 또는 국소화된 영역으로부터 나온 표본을 포함할 수 있다. 예를 들면, 표본은 특정 기관, 기관의 부분 또는 그러한 기관 내의 유체 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 표본은 간(예컨대, 전체 간 또는 간의 특정 분절 또는 예컨대, 간세포와 같이 간 내의 특정 유형의 세포)으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, "대상체로부터 유래된 표본"은 대상체로부터 수득한 소변을 지칭한다. "대상체로부터 유래된 표본"은 대상체로부터의 혈액 또는 혈액 유래 혈청 또는 혈장을 지칭할 수 있다.
I. 본 발명의 iRNA
본 발명은 AGT 유전자의 발현을 억제하는 iRNA를 제공한다. 바람직한 구현예에 있어서, iRNA는 세포, 예컨대 대상체, 예컨대 포유류, 예컨대 AGT-연관 장애, 예컨대, 고혈압의 발생에 취약한 인간 내의 세포에서 AGT 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNAi 작용제는 AGT 유전자의 발현에서 형성되는 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성의 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성의 영역은 길이가 약 19 내지 30 뉴클레오티드(예컨대, 길이가 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 또는 19 뉴클레오티드)이다. AGT 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 시, iRNA는 AGT 유전자(예컨대, 인간, 영장류, 비-영장류, 또는 래트 AGT 유전자)의 발현을, 예를 들면, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA)-기반 방법에 의해, 또는 단백질-기반 방법, 예컨대 면역형광 분석에 의해, 예를 들면, 웨스턴 블로팅 또는 유세포 측정 기법을 사용하여 검정된 바와 같이, 적어도 약 50% 억제한다. 바람직한 구현예에 있어서, 발현의 억제는 실시예에서, 특히 여기 제공된 적절한 유기체 세포주에서 10 nM 농도의 siRNA로, 실시예 2에서 제공되는 qPCR 방법에 의해 결정된다. 바람직한 구현예에 있어서, 생체 내 발현의 억제는, 예컨대 RNA 발현의 최하점에서 3 mg/kg의 단회 용량이 투여된 경우, 인간 유전자를 발현하는 설치류, 예컨대 인간 표적 유전자를 발현하는 마우스 또는 AAV-감염 마우스에서 인간 유전자의 녹다운에 의해 결정된다. 간에서의 RNA 발현은 실시예 2에 제공된 PCR 방법을 사용하여 결정된다.
dsRNA는 상보적이며 dsRNA가 사용될 조건 하에서 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 한 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열에 대하여 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 전체적으로 상보적인 상보성의 영역을 포함한다. 표적 서열은 AGT 유전자의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 나머지 가닥(센스 가닥)은 두 가닥이 적합한 조건 하에서 결합되는 경우 혼성화하고 듀플렉스 구조를 형성하도록, 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함한다. 본원 어딘가에서 기술되고 업계에 알려진 바와 같이, dsRNA의 상보적 서열도 개별 올리고뉴클레오티드 상에 있는 것과 반대되는 바와 같이, 단일 핵산 분자의 자가-상보적 영역으로 포함될 수도 있다.
일반적으로, 듀플렉스 구조는 길이가 19 내지 30 염기쌍이다. 유사하게, 표적 서열에 대한 상보성의 영역은 길이가 19 내지 30 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에 있어서, dsRNA는 길이가 약 19 내지 약 23 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 25 내지 약 30 뉴클레오티드이다. 일반적으로, dsRNA는 다이서 효소에 대한 기질로서 역할을 할 만큼 길다. 예를 들면, 길이가 약 21 내지 23 뉴클레오티드보다 더 긴 dsRNA는 다이서에 대한 기질로서 역할할 수 있다는 것은 주지되어 있다. 당업자도 인식하는 바와 같이, 절단용으로 표적된 RNA의 영역은 가장 흔하게는 더 길이가 긴 RNA 분자, 흔하게는 mRNA 분자의 일부일 것이다. 적절한 경우에 있어서, mRNA 표적의 "일부"는 mRNA 표적이 RNAi-지시된 절단(즉, RISC 경로를 통한 절단)에 대한 기질이 되도록 하는 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
또한, 당업자는 듀플렉스 영역이 dsRNA의 제1 기능적 부분, 예컨대, 약 19 내지 약 30 염기쌍, 예컨대, 약 19 내지 30, 19 내지 29, 19 내지 28, 19 내지 27, 19 내지 26, 19 내지 25, 19 내지 24, 19 내지 23, 19 내지 22, 19 내지 21, 19 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 29, 20 내지 28, 20 내지 27, 20 내지 26, 20 내지 25, 20 내지 24, 20 내지 23, 20 내지 22, 20 내지 21, 21 내지 30, 21 내지 29, 21 내지 28, 21 내지 27, 21 내지 26, 21 내지 25, 21 내지 24, 21 내지 23, 또는 21 내지 22 염기쌍의 듀플렉스 영역이라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 일 구현예에 있어서, 절단용으로 원하는 RNA를 표적화하는 예컨대, 15 내지 30 염기쌍의 기능적 듀플렉스로 처리되는 정도로, 30 염기쌍을 초과하는 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 당업자는 일 구현예에 있어서, miRNA는 dsRNA이라는 것을 인식할 것이다. 다른 구현예에 있어서, dsRNA는 자연발생적 miRNA가 아니다. 다른 구현예에 있어서, AGT 유전자 발현을 표적화하는 데 유용한 iRNA 작용제는 더 큰 dsRNA의 절단에 의하여 표적 세포 내에서 발생되지 않는다.
본원에 기술된 dsRNA는 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행, 예컨대, 1 내지 4, 2 내지 4, 1 내지 3, 2 내지 3, 1, 2, 3, 또는 4 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 갖는 dsRNA는 그 평활성 말단인 상대역에 비해 더 우수한 억제 특성을 가질 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하여, 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 구성될 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단, 또는 양 말단 상에 존재할 수 있다.
dsRNA는 업계에 알려진 표준 방법에 의하여 합성될 수 있다. 본 발명의 이중 가닥 RNAi 화합물은 2-단계 과정을 이용하여 제조될 수 있다. 우선, 이중 가닥 RNA 분자의 개별 가닥은 별개로 제조된다. 이후, 성분 가닥은 어닐링된다. siRNA 화합물의 개별 가닥은 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 양쪽 모두를 사용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 가닥이 용이하게 제조될 수 있다는 장점을 제공한다. 유사하게 본 발명의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 양쪽 모두를 사용하여 제조될 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 적어도 두 개의 뉴클레오티드 서열, 센스 서열 및 안티-센스 서열을 포함한다. 센스 가닥은 표 3, 5, 및 6에 제공된 서열의 군으로부터 선택되며, 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥은 표 3, 5, 및 6의 서열의 군으로부터 선택된다. 이 양태에 있어서, 2개 서열 중 하나는 2개 서열 중 나머지 하나에 상보적이며, 서열 중 하나는 AGT 유전자의 발현에서 발생된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 이 양태에 있어서, dsRNA는 2개 올리고뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 표 5, 또는 6의 센스 가닥으로 기술되고, 제2 올리고뉴클레오티드는 표 3, 5 또는 6에서의 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥으로 기술된다. 특정 구현예에 있어서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 개별 올리고뉴클레오티드 상에 함유된다. 다른 구현예에 있어서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 단일 올리고뉴클레오티드 상에 포함된다. 특정 구현예에 있어서, 표 3 또는 5로부터의 센스 또는 안티센스 가닥은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, 및 AD-85655로부터 선택된다.
표 3에서의 서열은 변형된 또는 컨쥬게이션된 서열로 기술되지 않지만, 본 발명의 iRNA의 RNA, 예컨대 본 발명이 dsRNA는 표 3에 나타낸 서열 중 어느 하나, 또는 변형된 표 5 또는 6의 서열, 또는 컨쥬게이션된 표 5 또는 6의 서열을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 다시 말하면, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은, 변형되지 않은, 컨쥬게이션되지 않은, 변형된, 또는 컨쥬게이션된 표 3, 5, 및 6의 dsRNA를 포함한다.
당업자는 약 20 내지 23 염기쌍, 예컨대, 21 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는 데 특히 효과적인 것으로 인정된 것을 충분히 알고 있다(Elbashir 등, EMBO 2001, 20:6877-6888). 그러나, 다른 사람들은 더 짧거나 더 긴 dsRNA 듀플렉스 구조도 효과적일 수 있다는 것을 알아냈다(Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim 등 (2005) Nat Biotech 23:222-226). 상술된 구현예에 있어서, 표 3, 5, 및 6 중 어느 하나에 제공된 올리고뉴클레오티드 서열의 성질을 이용하여, 본원에 기술된 dsRNA는 최소 21 뉴클레오티드의 길이인 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 표 3, 5, 및 6의 서열 중 하나에서 하나 또는 양 말단 상의 일부 뉴클레오티드만 뺀 서열을 가진, 길이가 더 짧은 듀플렉스는 상술한 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있다고 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, 표 3, 5, 및 6의 서열 중 하나로부터 유래된 적어도 19, 20 이상의 연속 뉴클레오티드의 서열을 가지며, AGT 유전자의 발현을 억제하는 능력에 있어서 전체 서열을 포함하는 dsRNA와는 약 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하의 억제 정도로 상이한 dsRNA가 본 발명의 범위 내라고 고려된다.
또한, 표 3, 5, 및 6에 제공된 RNA는 RISC-매개 절단에 감수성인 AGT 전사물에서의 부위(들)을 동정한다. 이와 같이, 본 발명은 또한 그러한 부위 중 하나 내에서 표적화하는 iRNA를 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, iRNA는 상기 iRNA가 그 특정 부위 내의 어딘가에서 전사물의 절단을 촉진한다면, RNA 전사물의 특정 부위 내에서 표적화한다고 한다. 그러한 iRNA는 AGT 유전자에서 선택된 서열에 연속적인 영역으로부터 취한 추가적인 뉴클레오티드 서열에 결합된, 표 3, 5, 및 6에 제공된 서열 중 하나로부터 적어도 약 19 연속 뉴클레오티드를 일반적으로 포함할 것이다.
II. 본 발명의 변형된 iRNA
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA의 RNA, 예컨대, dsRNA는 변형되지 않으며, 예컨대 업계에 알려지고 본원에 기술된 화학적 변형 또는 컨쥬게이션을 포함하지 않는다. 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA의 RNA, 예컨대, dsRNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 기타 유익한 특징을 향상시킨다. 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, iRNA의 모든 뉴클레오티드 또는 iRNA의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된다, 즉 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 미변형된 뉴클레오티드가 iRNA의 가닥에 존재한다.
본 발명에서 특징된 핵산은 본원에 참조로서 포함되어 있는 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. 등 (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기술된 방법과 같이 업계에 확립된 방법에 의하여 합성되거나 변형될 수 있다. 변형은 예를 들면, 말단 변형, 예컨대, 5'-말단 변형(인산화, 컨쥬게이션, 반전된 결합) 또는 3'-말단 변형(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 반전된 결합 등); 염기 변형, 예컨대, 안정화 염기, 불안정화 염기 또는 파트너의 확장된 레퍼토리(expanded repertoire)와 염기쌍을 형성하는 염기로 대체, 염기의 제거(무염기 뉴클레오티드들), 또는 컨쥬게이션된 염기; 당 변형(예컨대, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 또는 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본원에 기술된 구현예에서 유용한 iRNA 화합물의 구체적인 예는 변형된 골격 또는 비 천연 인터뉴클레오시드 결합을 함유하는 RNA를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 변형된 골격을 갖는 RNA는 다른 RNA는 특히, 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 이 명세서의 목적을 위하여, 그리고 때때로 업계에서 참고되는 바와 같이, 그 인터뉴클레오시드 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA도 올리고뉴클레오시드인 것으로 고려될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 변형된 iRNA는 그 인터뉴클레오시드 골격 내에 인 원자를 가질 것이다.
변형된 RNA 골격은 예를 들면, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포아미데이트 및 아미노알킬포스포아미데이트를 포함하는 포스포아미데이트, 티오노포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보통의 3'-5' 결합, 이들의 2'-5' 결합된 유사체 및 반전된 극성을 갖는 것을 갖는 보라노포스페이트를 포함하며, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 결합된 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2'이다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029호; 및 미국 특허 RE39464호를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 골격은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오시드 결합 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 인터뉴클레오시드 결합에 의하여 형성된 골격을 갖는다. 이들은(부분적으로는 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 결합; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 화합물을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439호를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 결합, 즉, 골격 둘 다가 신규한 기로 대체되는 적합한 RNA 의태물이 본원에 제공된 iRNA에서 사용하기 위해 고려된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과 혼성화하기 위해 유지된다. RNA 의태물이 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 하나의 그러한 올리고머 화합물은 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에 있어서, RNA의 당 골격은 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격을 포함하는 아미드로 대체된다. 뉴클레오염기는 유지되며 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262호를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 iRNA에 사용하기 적합한 추가적인 PNA 화합물은 예를 들면, 문헌[Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497-1500]에 기술되어 있다.
본 발명에서 특징된 일부 구현예는 포스포로티오에이트 골격을 갖는 RNA 및 헤테로원자 골격, 및 특히, 상기 참조된 미국 특허 번호 5,489,677호의 --CH2--NH--CH2--, [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 알려진] --CH2--N(CH3)--O--CH2--, --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2-- [여기서, 자연상태 포스포디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2--로 표시됨] 및 상기 참조된 미국 특허 번호 5,602,240호의 아미드 골격을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에서 특징된 RNA는 상기-참조된 미국 특허 번호 5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는다.
변형된 RNA는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수도 있다. 본원에서 특징된 iRNA, 예컨대, dsRNA는 2'-위치에서 하기사항 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 미치환 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)·nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2을 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 기타 구현예에 있어서, dsRNA는 2' 위치에서 하기사항 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기(cleaving group), 지시기, 인터컬레이터, iRNA의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기 또는 iRNA의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기. 일부 구현예에 있어서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려진 2'-O--CH2CH2OCH3)(Martin 등, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 다른 예시적인 변형은 본원에서 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(업계에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려짐), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다. 추가적인 예시적 변형은 하기: 5'-Me-2'-F 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오티드(이들 세 패밀리에서의 R 및 S 이성질체 모두); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA(N-메틸아세트아미드)를 포함한다.
기타 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. iRNA의 RNA상의 기타 위치, 특히, 3' 말단 뉴클레오티드 상 또는 2'-5' 결합된 dsRNA에서 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형도 이루어질 수 있다. iRNA는 펜토푸라노실 당을 대신하여 시클로부틸 모이어티와 같은 당 의태물을 가질 수도 있다. 그러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그중 일부가 본 출원과 공유되어 있는 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920호를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 특허의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
iRNA는(업계에서 단순히 "염기"로 자주 지칭되는) 뉴클레오염기 변형 또는 치환을 포함할 수도 있다. 본원에 사용된 "미변형된" 또는 "천연" 뉴클레오염기는 퓨린계인 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘계인 티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U)를 포함한다. 변형된 뉴클레오염기는 데옥시-티민(dT), 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-디아자구아닌 및 7-디아자아데닌, 및 3-디아자구아닌 및 3-디아자아데닌과 같은 기타 합성 및 천연 뉴클레오염기를 포함한다. 다른 뉴클레오염기는 미국 특허 번호 3,687,808호에 개시된 것, 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것; 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것, 문헌[Englisch 등, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것 및 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, DsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것을 포함한다. 그러한 뉴클레오염기 중 특정한 것은 본 발명에서 특징된 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는 데 특히 유용하다. 그러한 것은 5-치환된 피리미딘, 6-아자미리미딘 및, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환으로 인해 핵산 듀플렉스 안정성이 0.6℃ 내지 1.2℃ 정도 증가하는 것으로 밝혀져 있으며(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 더욱 더 특히, 2'-O-메톡시에틸 당 변환과 조합되는 경우 5-메틸시토신 치환은 예시적인 염기 치환이다.
기타 변형된 뉴클레오염기뿐만 아니라 상기 언급된 변형된 뉴클레오염기 중 일부의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 상기 표시된 미국 특허 번호 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; 및 7,495,088호를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
iRNA의 RNA는 변형되어 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)를 포함할 수도 있다. 잠금 핵산은 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이며, 상기 리보스 모이어티는 2' 및 4 탄소를 연결하는 여분의 가교를 포함한다. 이 구조는 3'-엔도 구조 형태(conformation)에서 리보스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 잠금 핵산을 첨가하면 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 비표적(off-target) 효과를 감소시키는 것으로 밝혀져 있다(Elmen, J. 등 (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. 등 (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. 등 (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
일부 구현예에 있어서, iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의 바이시클릭 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. "바이시클릭 당"은 2 원자의 가교에 의해 변형된 푸라노실 고리이다. "바이시클릭 뉴클레오시드"("BNA")는 당 고리의 2 탄소 원자를 연결하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드이며, 이에 따라 바이시클릭 고리계를 형성한다. 특정 구현예에 있어서, 가교는 당 고리의 4' 탄소 및 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 구현예에 있어서, 본 발명의 작용제는 하나 이상의 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 잠금 핵산은 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이며, 여기서 리보스 모이어티는 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 가교를 포함한다. 다시 말하면, LNA는 4'-CH2-O-2' 가교를 포함하는 바이시클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드이다. 이 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 잠금 핵산을 첨가하면 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 비표적 효과를 감소시키는 것으로 밝혀져 있다(Elmen, J. 등 (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. 등 (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. 등 (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). 본 발명의 폴리뉴클레오티드에서 사용하기 위한 바이시클릭 뉴클레오시드의 예는 4' 및 2' 리보실 고리 원자 간 가교를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드 작용제는 4'에서 2'으로의 가교를 포함하는 하나 이상의 바이시클릭 뉴클레오시드를 포함한다. 그러한 4'에서 2'으로의 가교형성 바이시클릭 뉴클레오시드의 예는 4'-(CH2)―O-2'(LNA); 4'-(CH2)―S-2'; 4'-(CH2)2―O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)―O-2'("구속된 에틸" 또는 "cEt"로도 지칭됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)―O-2'(및 이들의 유사체; 예컨대, 미국 특허 번호 7,399,845호 참고); 4'-C(CH3)(CH3)―O-2'(및 이들의 유사체, 예컨대, 미국 특허 번호 8,278,283호 참고); 4'-CH2―N(OCH3)-2'(및 이들의 유사체; 예컨대, 미국 특허 번호 8,278,425호 참고); 4'-CH2―O―N(CH3)-2'(예컨대, 미국 특허 공개 번호 2004/0171570호 참고); 4'-CH2―N(R)―O-2'(식 중, R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임(예컨대, 미국 특허 번호 7,427,672호 참고); 4'-CH2―C(H)(CH3)-2'(예컨대, Chattopadhyaya 등, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134 참고); 및 4'-CH2―C(=CH2)-2'(및 이들의 유사체; 예컨대, 미국 특허 번호 8,278,426 참고)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 각각의 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
잠금 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 추가적인 대표 미국 특허 및 미국 특허 공개는 하기: 미국 특허 번호 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133; 7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; 미국 2008/0039618; 및 미국 2009/0012281호를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
임의의 상기 바이시클릭 뉴클레오시드는 예를 들면 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 배치를 가지고 제조될 수 있다(WO 99/14226 참고).
iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의 구속된 에틸 뉴클레오티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "구속된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 바이시클릭 당 모이어티를 포함하는 잠금 핵산이다. 일 구현예에 있어서, 구속된 에틸 뉴클레오티드는 본원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태이다.
본 발명의 iRNA는 또한 하나 이상의 "형태가 제약된 뉴클레오티드"("CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 -C5' 탄소를 연결하는 링커를 갖는 뉴클레오티드 유사체이다. CRN은 리보스 고리를 안정한 형태로 잠그고 mRNA에 대한 혼성화 친화도를 증가시킨다. 링커는 안정성 및 친화도를 위해 최적 위치에 산소를 배치하기 충분한 길이어서 리보스 고리 주름을 더 적게 일으킨다.
상기 주지된 특정 CRN의 제조를 교시하는 대표 공보는 미국 특허 공개 번호 2013/0190383호; 및 PCT 공개 WO 2013/036868호를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA는 UNA(비잠금 핵산) 뉴클레오티드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 비잠금 비고리형 핵산으로, 여기서 당의 임의의 결합이 제거되어 비잠금 "당" 잔기를 형성한다. 일 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 간 결합(즉, C1' 및 C4' 탄소 간 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포함한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2' 및 C3' 탄소 간 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다(본원에 참조로 포함되는 Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) 및 Fluiter 등, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 참고).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공보는 미국 특허 번호 8,314,227호; 및 미국 특허 공개 번호 2013/0096289; 2013/0011922; 및 2011/0313020호를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
RNA 분자의 말단에 또한 잠재적으로 안정화시키는 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-히드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-0-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 반전된 염기 dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 이 변형의 개시물은 PCT 공개 번호 WO 2011/005861호에서 찾을 수 있다.
본 발명의 iRNA의 뉴클레오티드의 다른 변형은 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 의태물, 예컨대, iRNA의 안티센스 가닥 상의 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 의태물을 포함한다. 적합한 포스페이트 의태물은, 예를 들면 미국 특허 공개 번호 2012/0157511호에 개시되어 있으며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
A. 본 발명의 모티프를 포함하는 변형된 iRNA
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제는, 예를 들면, WO2013/075035에 개시된 바와 같은 화학적 변형을 작는 작용제를 포함하며, 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. WO2013/075035는 특히 절단 부위에서 또는 그 근처에서, dsRNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내로 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형을 갖는 모티프를 제공한다. 일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다른 경우 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은 존재하는 경우, 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 단속한다. dsRNAi 작용제는, 예를 들면 센스 가닥 상의, GalNAc 유도체 리간드와 선택적으로 컨쥬게이션될 수 있다.
보다 구체적으로, 이중 가닥 RNA 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 dsRNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서, 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형을 갖는 하나 이상의 모티프를 갖도록 완전히 변형되는 경우, dsRNAi 작용제의 유전자 침묵화 활성이 관찰되었다.
따라서, 본 발명은 생체내에서 표적 유전자(즉, AGT 유전자)의 발현을 억제할 수 있는 이중 가닥 RNA 작용제를 제공한다. RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 작용제의 각 가닥은, 예를 들어, 길이가 17 내지 30 뉴클레오티드, 길이가 25 내지 30 뉴클레오티드, 길이가 27 내지 30 뉴클레오티드, 길이가 19 내지 25 뉴클레오티드, 길이가 19 내지 23 뉴클레오티드, 길이가 19 내지 21 뉴클레오티드, 길이가 21 내지 25 뉴클레오티드, 또는 길이가 21 내지 23 뉴클레오티드일 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 통상적으로 본원에서 "dsRNAi 작용제"로도 지칭되는 유플렉스 이중 가닥 RNA("dsRNA")를 형성한다. dsRNAi 작용제의 듀플렉스 영역의 길이는, 예를 들어, 27 내지 30 뉴클레오티드 쌍, 길이는 19 내지 25 뉴클레오티드 쌍, 길이는 19 내지 23 뉴클레오티드 쌍, 길이는 19 내지 21 뉴클레오티드 쌍, 길이는 21 내지 25 뉴클레오티드 쌍, 또는 길이는 21 내지 23 뉴클레오티드 쌍일 수 있는 듀플렉스 영역일 수 있다. 또 다른 예에서, 듀플렉스 영역의 길이는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 및 27 뉴클레오티드로부터 선택된다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 하나 또는 두 가닥 모두의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에 하나 이상의 오버행 영역 또는 캡핑기를 함유할 수 있다. 오버행은, 독립적으로, 길이가 1 내지 6 뉴클레오티드, 예를 들면 길이가 2 내지 6 뉴클레오티드, 길이가 1 내지 5 뉴클레오티드, 길이가 2 내지 5 뉴클레오티드, 길이가 1 내지 4 뉴클레오티드, 길이가 2 내지 4 뉴클레오티드, 길이가 1 내지 3 뉴클레오티드, 길이가 2 내지 3 뉴클레오티드, 또는 길이가 1 내지 2 뉴클레오티드일 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 오버행 영역은 상기 제공된 바와 같은 연장된 오버행 영역을 포함할 수 있다. 오버행은 한 가닥이 다른 것보다 긴 결과, 또는 동일한 길이의 두 가닥이 엇갈린 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수도 있고 또는 표적화되는 유전자 서열과 상보적일 수도 있고 또는 또 다른 서열일 수도 있다. 제1 및 제2 가닥은 또한, 예컨대 추가 염기에 의해 헤어핀을 형성하도록, 또는 다른 비-염기 링커에 의해 결합될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 오버행 영역에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-당 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 2'-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 변형된 또는 미변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, TT는 어느 가닥의 어느 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수도 있고 또는 표적화되는 유전자 서열과 상보적일 수도 있고 또는 또 다른 서열일 수도 있다.
dsRNAi 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥에서의 5'- 또는 3'-오버행은 인산화될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 오버행 영역(들)은 2 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트를 갖는 2 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 여기서 2 뉴클레오티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥의 3'-말단에 존재재한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
dsRNAi 작용제는 단일 오버행만을 함유할 수 있고, 이는 그 전반적 안정성에 영향을 미치지 않고, RNAi의 간섭 활성을 강화시킬 수 있다. 예를 들면, 단일-가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단에, 또는 대안적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치할 수 있다. RNAi는 또한 안티센스 가닥의 5'-말단(또는 센스 가닥의 3'-말단)에 위치한, 또는 반대로 위치한 평활성 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, dsRNAi 작용제의 안티센스 가닥은 3'-말단에 뉴클레오티드 오버행을 가지며, 5'-말단은 평활성이다. 이론에 구속되지 않으면서, 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 비대칭 평활성 말단 및 안티센스 가닥의 3'-오버행은 길잡이 가닥의 RISC 공정으로의 로딩을 선호한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 길이 19 뉴클레오티드의 이중 말단 평활체(bluntmer)이며, 여기서 센스 가닥은 5' 말단의 위치 7, 8, 9에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5' 말단의 위치 11, 12, 13에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
다른 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 길이 20 뉴클레오티드의 이중 말단 평활체이며, 여기서 센스 가닥은 5' 말단의 위치 8, 9, 10에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5' 말단의 위치 11, 12, 13에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
또 다른 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 길이 21 뉴클레오티드의 이중 말단 평활체이며, 여기서 센스 가닥은 5' 말단의 위치 9, 10, 11에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5' 말단의 위치 11, 12, 13에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 길이 21 뉴클레오티드 센스 가닥 및 23 뉴클레오티드 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 5' 말단의 위치 9, 10, 11에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유하고; 안티센스 가닥은 5' 말단의 위치 11, 12, 13에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형을 갖는 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 여기서 RNAi 작용제의 하나의 말단은 평활성인 반면, 다른 말단은 2 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 바람직하게는, 2 뉴클레오티드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 있다.
2 뉴클레오티드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 경우, 말단의 3 뉴클레오티드 간에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 있을 수 있고, 여기서 3 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이고, 제3 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 다음의 쌍형성 뉴클레오티드이다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 다에서 말단의 3 뉴클레오티드 간 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 모티프의 일부인 뉴클레오티드를 포함하여, dsRNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에서의 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에 있어서, 각각의 잔기는, 예컨대 교대 모티프에서, 2'-O-메틸 또는 3'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 선택적으로, dsRNAi 작용제는 리간드(바람직하게는 GalNAc3)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 길이가 25 내지 30 뉴클레오티드 잔기이고, 5' 말단 뉴클레오티드(위치 1)로부터 시작하여 제1 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8 리보뉴클레오티드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36 내지 66 뉴클레오티드 잔기이고, 3' 말단 뉴클레오티드로부터 시작하여 센스 가닥의 위치 1 내지 23과 쌍을 형성한 위치에 적어도 8 리보뉴클레오티드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 적어도 안티센스 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍이 아니고, 최대 6 연속 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍이 아니어서, 1 내지 6 뉴클레오티드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍이 아닌 10 내지 30 연속 뉴클레오티드를 포함하여, 10 내지 30 뉴클레오티드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 및 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬되는 경우 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하여 센스 및 안티센스 가닥 간에 실질적으로 듀플렉스된 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유류 세포 내로 도입되는 경우 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19 리보뉴클레오티드를 따라 표적 RNA와 충분히 상보적이고; 센스 가닥은 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 모티프의 적어도 하나는 절단 부위에서 또는 그 근처에서 일어난다. 안티센스 가닥은 절단 부위에서 또는 그 근처에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 dsRNAi 작용제는 적어도 25 및 최대 29 뉴클레오티드인 길이를 갖는 제1 가닥 및 5' 말단으로부터의 위치 11, 12, 13에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 갖는 최대 30 뉴클레오티드인 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 제1 가닥의 3' 말단 및 제2 가닥의 5' 말단은 평활성 말단을 형성하고 제2 가닥은 제1 가닥보다 그 3' 말단이 1 내지 4 뉴클레오티드 더 길고, 듀플렉스 영역은 길이가 적어도 25 뉴클레오티드이고, 제2 가닥은 RNAi 작용제가 포유류 세포 내로 도입되는 경우 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 제2 가닥 길이의 적어도 19 뉴클레오티드를 따라 표적 mRNA와 충분히 상보적이고, dsRNAi 작용제의 다이서 절단은 우선적으로 제2 가닥의 3'-말단을 포함하는 siRNA를 생성하여 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, dsRNAi 작용제는 리간드를 추가로 포함한다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 센스 가닥은 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하며, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥의 절단 위치에서 일어난다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 안티센스 가닥은 또한 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥의 절단 위치에서 또는 그 근처에서 일어난다.
길이가 19 내지 23 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 갖는 dsRNAi 작용제에 있어서, 안티센스 가닥의 절단 부위는 통상적으로 5'-말단으로부터의 10, 11, 및 12 위치 근처이다. 따라서 3개의 동일한 변형의 모티프는 안티센스 가닥의 9, 10, 11 위치; 10, 11, 12 위치; 11, 12, 13 위치; 12, 13, 14 위치; 또는 13, 14, 15 위치에서 일어날 수 있고, 카운팅은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 제1 뉴클레오티드에서 시작하거나, 카운팅은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내의 제1 쌍형성 뉴클레오티드에서 시작된다. 안티센스 가닥에서의 절단 부위는 또한 5'-말단으로부터 dsRNAi 작용제의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변화할 수 있다.
dsRNAi 작용제의 센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 3 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있고; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 가질 수 있다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 센스 가닥 상의 3 뉴클레오티드의 하나의 모티프 및 안티센스 가닥 상의 3 뉴클레오티드의 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오티드 중첩을 갖도록, 즉 센스 가닥에서의 모티프의 3 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 안티센스 가닥에서의 모티프의 3 뉴클레오티드 중 적어도 하나와 염기쌍을 형성하도록 정렬될 수 있다. 대안적으로, 적어도 2 뉴클레오티드가 중첩될 수 있거나, 모든 3 뉴클레오티드가 중첩될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 센스 가닥은 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 하나를 초과하는 모티프를 함유할 수 있다. 제1 모티프는 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 일어날 수 있고 다른 모티프는 윙(wing) 변형일 수 있다. 본원에서 "윙 변형"이라는 용어는 같은 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 모티프와 분리되는 가닥의 또 다른 부분에서 생긴 모티프를 지칭한다. 윙 변형은 제1 모티프에 인접하거나 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 구분된다. 모티프가 서로 바로 인접한 경우 모티프의 화학은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 구분되는 경우 화학은 동일하거나 상이할 수 있다. 2 이상의 윙 변형이 존재할 수 있다. 예를 들면, 2개의 윙 변형이 존재하는 경우, 각각의 윙 변형은 절단 부위에서 또는 그 근처에서 또는 선도 모티프의 어느 쪽 상에 있는 제1 모티프 대비 하나의 말단에서 일어날 수 있다.
센스 가닥과 마찬가지로, dsRNAi 작용제의 안티센스 가닥은 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 하나를 초과하는 모티프를 함유할 수 있고, 적어도 하나의 모티프는 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 일어난다. 상기 안티센스 가닥은 또한 센스 가닥 상에 존재할 수 있는 윙 변형과 유사한 정렬로 하나 이상의 윙 변형을 함유할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 통상적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에 처음 1 또는 2개의 말단 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
다른 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 통상적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에서 듀플렉스 영역 내에 처음 1 또는 2개의 쌍형성 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
dsRNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 변형을 함유하는 경우, 윙 변형은 듀플렉스 영역의 동일한 말단 상에 속할 수 있고, 1, 2, 또는 3 뉴클레오티드의 중첩을 갖는다.
dsRNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 변형을 함유하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 하나의 가닥으로부터의 2 변형이 각각 듀플렉스 영역의 하나의 말단 상에 속하고, 1, 2, 또는 3 뉴클레오티드의 중첩을 갖고; 하나의 가닥으로부터의 2 변형이 각각 듀플렉스 영역의 다른 말단 상에 속하고, 1, 2, 또는 3 뉴클레오티드의 중첩을 갖고; 하나의 가닥으로부터의 2 변형이 선도 모티프의 각 측면 상에 속하고, 듀플렉스 영역에 1, 2, 또는 3 뉴클레오티드의 중첩을 갖도록 정렬될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 모티프의 일부인 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에서의 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드는 하나 또는 둘 다의 비-결합 포스페이트 산소 또는 하나 이상의 결합 포스페이트 산소의 하나 이상의 변경; 리보스 당의 구성분, 예컨대, 리보스 당 상의 2'-히드록실의 변경; 포스페이트 모이어티의 "탈포스포" 링커로의 전체 대체; 자연발생적 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형을 포함할 수 있는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
핵산은 서브유닛의 중합체이므로, 다수의 변형, 예컨대 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-결합 O의 변형은 핵산 내에서 반복되는 위치에서 일어난다. 일부 경우에서, 변형은 핵산에서의 모든 대상 위치에서 일어날 것이지만, 여러 경우에서는 그렇지 않을 것이다. 예로서, 변형은 3'- 또는 5'-말단 위치에서만 일어날 수 있고, 말단 영역, 예컨대 말단 뉴클레오티드 상의 위치 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10 뉴클레오티드에서만 일어날 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 둘 다에서 일어날 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 일어날 수 있거나 RNA의 단일 가닥 영역에서만 일어날 수 있다. 예를 들면, 비-결합 O 위치에서의 포스포로티오에이트 변형은 하나 또는 두 말단 모두에서만 일어날 수 있거나, 말단 영역, 예컨대 말단 뉴클레오티드 상의 위치 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10 뉴클레오티드에서만 일어날 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 영역에서, 특히 말단에서 일어날 수 있다. 5'-말단 또는 말단은 인산화될 수 있다.
안정성을 향상시키거나, 오버행에 특정 염기를 포함시키거나, 단일 가닥 오버행에, 예컨대, 5'- 또는 3'-오버행에, 또는 둘 다에, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 대리물을 포함시키는 것이 가능할 수 있다. 예를 들면, 오버행에 퓨린 뉴클레오티드를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 3'- 또는 5'-오버행에서의 모든 또는 일부 염기는, 예컨대 본원에 기술된 변형으로 변형될 수 있다. 변형은, 예컨대 업계에 알려진 변형을 갖는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예컨대, 뉴클레오염기의 리보당 대신 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 2'-O-메틸 변형, 및 포스페이트기에서의 변형, 예컨대 포스포로티오에이트 변형의 사용을 포함할 수 있다. 오버행이 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
일부 구현예에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-히드록실, 또는 2'-플루오로로 변형된다. 가닥은 하나를 초과하는 변형을 함유할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다.
적어도 2개의 상이한 변형이 통상적으로 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 존재한다. 이들 2 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형 등일 수 있다.
특정 구현예에 있어서, Na 또는 Nb는 교대 패턴의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 "교대 모티프"라는 용어는 하나 이상의 변형을 가지며, 각각의 변형이 하나의 가닥의 교대 뉴클레오티드 상에서 일어나는 모티프를 지칭한다. 교대 뉴클레오티드는 2 뉴클레오티드마다 하나 또는 3 뉴클레오티드마다 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들면, A, B 및 C가 각각 뉴클레오티드의 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교대 모티프는 "ABABABABABAB...", "AABBAABBAABB...", "AABAABAABAAB...", "AAABAAABAAAB...", "AAABBBAAABBB..." 또는 "ABCABCABCABC..." 등일 수 있다.
교대 모티프에 함유된 변형의 유형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, A, B, C, D가 각각 뉴클레오티드 상의 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교대 패턴, 즉 2 뉴클레오티드마다의 변형은 동일할 수 있지만, 각각의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 모티프 내에 몇몇 변형 가능성, 예컨대 "ABABAB...", "ACACAC...", "BDBDBD..." 또는 "CDCDCD..." 등으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 dsRNAi 작용제는 안티센스 가닥 상의 교대 모티프에 대한 변형 패턴이 이동된 데 비해 센스 가닥 상의 교대 모티프에 대해 변형 패턴을 포함한다. 이동은 센스 가닥의 뉴클레오티드의 변형된 그룹이 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 상이하게 변형된 그룹에 상응하도록 그리고 반대의 경우도 마찬가지이도록 될 수 있다. 예를 들면, 센스 가닥은 dsRNA 듀플렉스에서 안티센스 가닥과 쌍을 형성한 경우, 센스 가닥에서의 교대 모티프는 가닥의 5'에서 3'으로 "ABABAB"로 시작될 수 있고 안티센스 가닥에서의 교대 모티프는 듀플렉스 영역 내에서 가닥의 5'에서 3'으로 "BABABA"로 시작될 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥에서의 교대 모티프는 가닥의 5'에서 3'으로 "AABBAABB"로 시작될 수 있고 안티센스 가닥에서의 교대 모티프는 듀플렉스 영역 내에서 가닥의 5'에서 3'으로 "BBAABBAA"로 시작될 수 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 간의 변형 패턴의 전체적인 또는 부분적인 이동이 존재한다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 처음에 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형의 교대 모티프 패턴이 처음에 안티센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형의 교대 모티프 패턴 대비 이동을 갖는다, 즉 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드는 안티센스 가닥 상의 2'-F 변형된 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하는 등이다. 센스 가닥의 1 위치는 2'-F 변형으로 시작될 수 있고, 안티센스 가닥의 1 위치는 2'-O-메틸 변형으로 시작될 수 있다.
센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 대한 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프의 도입은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 존재하는 초기 변형 패턴을 단속한다. 센스 또는 안티센스 가닥에 대한 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프의 도입에 의한 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴의 이러한 단속은 표적 유전자에 대한 유전자 침묵화 활성을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형 모티프가 임의의 가닥에 도입되는 경우, 모티프 다음 뉴클레오티드의 변형은 모티프의 변형과 상이한 변형이다. 예를 들면, 모티프를 함유하는 서열 부분이 "...NaYYYNb..."인 경우, 식 중 "Y"는 3 연속 뉴클레오티의 3개의 동일한 변형 모티프의 변형을 나타내고, "Na" 및 "Nb"는 Y의 변형과 상이한 모티프 "YYY" 다음 뉴클레오티드에 대한 변형을 나타내며, Na 및 Nb는 동일하거나 상이한 변형일 수 있다. 대안적으로, Na 또는 Nb는 윙 변형이 존재하는 경우 부재하거나 존재할 수 있다.
iRNA는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합 변형은 가닥의 임의의 위치에서 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 임의의 뉴클레오티드 상에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오티드에서 일어날 수 있거나; 각각의 뉴클레오티드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에서 교대 패턴으로 일어날 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 패턴으로 뉴클레오티드간 결합 변형을 모두 포함할 수 있다. 센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 결합 변형의 교대 패턴 대비 이동을 가질 수 있다. 일 구현예에 있어서, 이중-가닥 RNAi 작용제는 6 내지 8 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함하고, 센스 가닥은 5'-말단 또는 3'-말단에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 포함한다. 예를 들면, 오버행 영역은 두 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 갖는 2 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드간 결합 변형은 또한 듀플렉스 영역 내에서 오버행 뉴클레오티드를 말단 쌍형성 뉴클레오티드와 결합시키도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 또는 모든 오버행 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 통해 결합될 수 있고, 선택적으로, 오버행 뉴클레오티드를 오버행 뉴클레오티드 다음의 쌍형성 뉴클레오티드와 결합시키는 추가적인 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합이 있을 수 있다. 예를 들면, 말단 3 뉴클레오티드 간에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재할 수 있고, 3 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이며, 세번째는 오버행 뉴클레오티드 다음의 쌍형성 뉴클레오티드이다. 이들 말단 3 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단, 또는 안티센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 2-뉴클레오티드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 있고, 말단 3 뉴클레오티드 간 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재하고, 3 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이며, 세번째 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 다음의 쌍형성 뉴클레오티드이다. 선택적으로, dsRNAi 작용제는 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 다에서 말단 3 뉴클레오티드 간 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 가질 수 있다.
일 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 표적과, 듀플렉스 내에, 또는 이들의 조합으로 미스매치(들)를 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 일어날 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 이들의 성향을 기준으로 순위가 매겨질 수 있다(예컨대, 특정 쌍형성의 연합 또는 해리의 자유 에너지를 기준으로, 가장 간단한 접근은 개별 쌍 기준으로 쌍을 조사하는 것이지만, 다음 인근 또는 유사한 분석이 또한 사용될 수 있음). 해리의 촉진의 관점에서: A:U가 G:C 대비 바람직하며; G:U가 G:C 대비 바람직하고; I:C가 G:C 대비 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예컨대, 비-정규 또는 정규 외 쌍형성(본원 어딘가에 기술됨)이 정규(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 대비 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성이 정규 쌍형성 대비 바람직하다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, A:U, G:U, I:C, 및 미스매치된 쌍, 예컨대, 비-정규, 또는 정규 쌍형성 또는 범용 염기를 포함하는 쌍형성 이외의 쌍으로부터 독립적으로 선택된 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2, 3, 4, 또는 5 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 안티센스 가닥에서 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 1 위치에서의 뉴클레오티드는 A, dA, dU, U, 및 dT로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2, 또는 3 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들면, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 제1 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
다른 구현예에 있어서, 센스 가닥의 3'-말단의 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT)이거나 안티센스 가닥의 3'-말단의 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT)이다. 예를 들면, 센스, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 3'-말단 상에 짧은 데옥시-티민 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 2 dT 뉴클레오티드가 존재한다.
특정 구현예에 있어서, 센스 가닥 서열은 화학식 I로 나타낼 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00003
식 중,
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이며;
p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0 내지 25개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 0 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각의 np 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않으며;
XXX, YYY, 및 ZZZ는 각각 독립적으로 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다. 바람직하게는 YYY는 모두 2'-F 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에 있어서, Na 또는 Nb는 교대 패턴의 변형을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 일어난다. 예를 들면, dsRNAi 작용제가 길이가 17 내지 23 뉴클레오티드인 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 일어날 수 있고(예컨대 위치 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12; 또는 11, 12, 13에서 일어날 수 있음), 카운팅은 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작되거나; 선택적으로 카운팅은 5'-말단으로부터 듀플렉스 내의 제1 쌍형성 뉴클레오티드에서 시작된다.
일 구현예에 있어서, i는 1이고 j는 0이거나, i은 0이고 j는 1이거나, i 및 j는 둘 다 1이다. 따라서 센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
[화학식 Ib]
Figure pct00004
[화학식 Ic]
Figure pct00005
; 또는
[화학식 Id]
Figure pct00006
.
센스 가닥이 화학식 Ib로 나타나는 경우, Nb는 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 Ic로 나타나는 경우, Nb는 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 Id로 나타나는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 바람직하게는, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 각각의 Na는 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
각각의 X, Y 및 Z는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, i는 0이고 j는 0이고, 센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
[화학식 Ia]
Figure pct00007
.
센스 가닥이 화학식 Ia로 나타나는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
일 구현예에 있어서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 II로 나타낼 수 있다:
[화학식 II]
Figure pct00008
식 중,
k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이며;
p' 및 q'은 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na'은 독립적으로 0 내지 25개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb'은 독립적으로 0 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각의 np' 및 nq'은 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
Nb' 및 Y'은 동일한 변형을 갖지 않고,
X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z'은 각각 독립적으로 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, Na' 또는 Nb'은 교대 패턴의 변형을 포함한다.
Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 일어난다. 예를 들면, dsRNAi 작용제가 길이 17 내지 23 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15에서 일어날 수 있고, 카운팅은 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작되거나; 선택적으로, 카운팅은 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1 쌍형성 뉴클레오티드에서 시작된다. 바람직하게는, Y'Y'Y' 모티프는 위치 11, 12, 13에서 일어난다
특정 구현예에 있어서, Y'Y'Y' 모티프는 모두 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드이다.
특정 구현예에 있어서, k는 1이고 l은 0이거나, k는 0이고 l은 1이거나, k 및 l은 둘 다 1이다.
따라서 안티센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
[화학식 IIb]
Figure pct00009
;
[화학식 IIc]
Figure pct00010
; 또는
[화학식 IId]
Figure pct00011
.
안티센스 가닥이 화학식 IIb로 나타나는 경우, Nb'은 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'은 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 IIc로 나타나는 경우, Nb'은 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'은 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 IId로 나타나는 경우, 각각의 Nb'은 독립적으로 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'은 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 바람직하게는, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
다른 구현예에 있어서, k는 0이고 l은 0이고 안티센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
[화학식 Ia]
Figure pct00012
.
안티센스 가닥이 화학식 IIa로 나타나는 경우, 각각의 Na'은 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
각각의 X', Y' 및 Z'은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로 LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-히드록실, 또는 2'-플루오로로 변형될 수 있다. 예를 들면, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 각각의 X, Y, Z, X', Y', 및 Z'은 특히 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21 nt인 경우 가닥의 9, 10, 및 11 위치에서 일어나는 YYY 모티프를 함유할 수 있고, 카운팅은 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작되거나, 선택적으로, 카운팅은 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1 쌍형성 뉴클레오티드에서 시작되고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 듀플렉스 영역의 반대 말단에서 윙 변형으로서 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 추가로 함유할 수 있고; XXX 및 ZZZ는 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
일부 구현예에 있어서, 안티센스 가닥은 가닥의 11, 12, 13 위치에서 일어나는 Y'Y'Y' 모티프를 함유할 수 있고, 카운팅은 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오티드에서 시작되거나, 선택적으로, 카운팅은 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1 쌍형성 뉴클레오티드에서 시작되고; Y'은 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 듀플렉스 영역의 반대 말단에서 윙 변형으로서 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 추가로 함유할 수 있고; X'X'X' 및 Z'Z'Z'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
상기 화학식 Ia, Ib, Ic, 및 Id 중 어느 하나로 나타낸 센스 가닥은 각각 화학식 IIa, IIb, IIc, 및 IId 중 어느 하나로 나타내는 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 dsRNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있고, 각각의 가닥은 14 내지 30 뉴클레오티드를 갖고, iRNA 듀플렉스는 화학식 III으로 나타난다:
[화학식 III]
Figure pct00013
식 중,
i, j, k, 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이며;
p, p', q, 및 q'은 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na 및 Na'은 독립적으로 0 내지 25개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'은 독립적으로 0 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있는, 각각 np', np, nq', 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z'은 각각 독립적으로 3 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일 구현예에 있어서, i는 0이고 j는 0이거나; i는 1이고 j는 0이거나; i는 0이고 j는 1이거나; i 및 j는 둘 다 0이거나; i 및 j는 둘 다 1이다. 또 다른 구현예에 있어서, k는 0이고 l은 0이거나; k는 1이고 l은 0이거나; k는 0이고 l은 1이거나; k 및 l은 둘 다 0이거나; k 및 l은 둘 다 1이다.
iRNA 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기 화학식을 포함한다:
[화학식 IIIa]
Figure pct00014
[화학식 IIIb]
Figure pct00015
[화학식 IIIc]
Figure pct00016
[화학식 IIId]
Figure pct00017
dsRNAi 작용제가 화학식 IIIa로 나타나는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 작용제가 화학식 IIIb로 나타나는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 작용제가 화학식 IIIc로 나타나는 경우, 각각의 Nb, Nb'은 독립적으로 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 작용제가 화학식 IIId로 나타나는 경우, 각각의 Nb, Nb'은 독립적으로 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 10, 0 내지 7, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na'은 독립적으로 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na', Nb, 및 Nb'은 독립적으로 교대 패턴의 변형을 포함한다.
화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId에서 각각의 X, Y, 및 Z는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
dsRNAi 작용제가 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타나는 경우, 적어도 하나의 Y 뉴클레오티드는 하나의 Y' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로 적어도 2개의 Y 뉴클레오티드가 상응하는 Y' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하거나; 모든 3개의 Y 뉴클레오티드가 모두 상응하는 Y' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다.
dsRNAi 작용제가 화학식 IIIb 또는 IIId로 나타나는 경우, 적어도 하나의 Z 뉴클레오티드는 하나의 Z' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, 적어도 2개의 Z 뉴클레오티드가 상응하는 Z' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하거나; 모든 3개의 Z 뉴클레오티드가 모두 상응하는 Z' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다.
dsRNAi 작용제가 화학식 IIIc 또는 IIId로 나타나는 경우, 적어도 하나의 X 뉴클레오티드는 하나의 X' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, 적어도 2개의 X 뉴클레오티드가 상응하는 X' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하거나; 모든 3개의 X 뉴클레오티드가 모두 상응하는 X' 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다.
특정 구현예에 있어서, Y 뉴클레오티드 상의 변형은 Y' 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하거나, Z 뉴클레오티드 상의 변형은 Z' 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하거나, X 뉴클레오티드 상의 변형은 X' 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하다.
특정 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제가 화학식 IIId로 나타나는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 다른 구현예에 있어서, RNAi 작용제가 화학식 IIId로 나타나는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'은 0 초과이고, 적어도 하나의 np'은 포스포로티오에이트 결합을 통해 주변 뉴클레오티드와 결합된다. 또 다른 구현예에 있어서, RNAi 작용제가 화학식 IIId로 나타나는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'은 0 초과이고, 적어도 하나의 np'은 포스포로티오에이트 결합을 통해 주변 뉴클레오티드와 결합되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커(후술됨)를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이션된다. 다른 구현예에 있어서, RNAi 작용제가 화학식 IIId로 나타나는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'은 0 초과이고, 적어도 하나의 np'은 포스포로티오에이트 결합을 통해 주변 뉴클레오티드와 결합되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이션된다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제가 화학식 IIIa로 나타나는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'은 0 초과이고, 적어도 하나의 np'은 포스포로티오에이트 결합을 통해 주변 뉴클레오티드와 결합되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이션된다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타내는 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이며, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 선택적으로, 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. 각각의 듀플렉스는 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 각각의 듀플렉스는 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, dsRNAi 작용제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타내는 적어도 3, 4, 5, 6 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이며, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 선택적으로, 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. 각각의 듀플렉스는 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 각각의 듀플렉스는 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId 중 적어도 하나로 나타내는 2 dsRNAi 작용제는 5' 말단에서 서로, 및 3' 말단의 하나 또는 둘 다와 결합되고, 선택적으로 리간드에 컨쥬게이션된다. 각각의 작용제는 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 각각의 작용제는 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 2'-플루오로 변형을 함유하는 소수의 뉴클레오티드, 예컨대, 2'-플루오로 변형을 갖는 10 이하의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들면, RNAi 작용제는 2'-플루오로 변형을 갖는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 2'-플루오로 변형을 갖는 10 뉴클레오티드, 예컨대, 센스 가닥에 2'-플루오로 변형을 갖는 4 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에 2'-플루오로 변형을 갖는 6 뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 2'-플루오로 변형을 갖는 6 뉴클레오티드, 예컨대, 센스 가닥에 2'-플루오로 변형을 갖는 4 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에 2'-플루오로 변형을 갖는 2 뉴클레오티드를 함유한다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 2'-플루오로 변형을 갖는 매우 소수의 뉴클레오티드, 예컨대, 2'-플루오로 변형을 갖는 2 이하의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들면, RNAi 작용제는 2'-플루오로 변형을 갖는 2, 1 또는 0 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 2'-플루오로 변형을 갖는 2 뉴클레오티드, 예컨대, 센스 가닥에 2-플루오로 변형을 갖는 0 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에 2'-플루오로 변형을 갖는 2 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
다양한 공보가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다량체성 iRNA를 기술한다. 이러한 공보는 WO2007/091269, 미국 특허 번호 7,858,769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520호를 포함하며, 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이, iRNA에 대한 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 컨쥬게이션을 함유하는 iRNA는 iRNA의 하나 이상의 특성을 최적화할 수 있다. 여러 경우에서, 탄수화물 모이어티는 iRNA의 변형된 서브유닛에 부착될 것이다. 예를 들면, iRNA의 하나 이상의 리보뉴클레오티드 서브유닛의 리보스 당은 또 다른 모이어티, 예컨대, 탄수화물 리간드가 부착되는 비-탄수화물(바람직하게는 고리형) 담체로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보스 당이 이렇게 대체된 리보뉴클레오티드 서브유닛은 본원에 리보스 대체 변형 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 고리형 담체는 카보시클릭 고리계(즉 모든 고리 원자가 탄소 원자임), 또는 헤테로시클릭 고리계(즉 하나 이상의 고리 원자가 헤테로원자, 예컨대, 질소, 산소, 황일 수 있음)일 수 있다. 고리형 담체는 모노시클릭 고리계일 수 있거나, 2개 이상의 고리, 예컨대 융합 고리를 함유할 수 있다. 고리형 담체는 완전 포화 고리계일 수 있거나, 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다.
리간드는 담체를 통해 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 담체는 (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 바람직하게는 2개의 "골격 부착점" 및 (ii) 적어도 하나의 "테터링 부착점"을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "골격 부착점"은 작용기, 예컨대 히드록실기, 또는 일반적으로, 리보핵산의 골격, 예컨대 포스페이트, 또는 변형된 포스페이트, 예컨대, 황 함유 골격 내로의 담체의 도입을 위해 이용 가능하고 적합한 결합을 지칭한다. 일부 구현예에 있어서 "테터링 부착점"(TAP)은 고리형 담체의 구성분 고리 원자, 예컨대, 선택된 모이어티를 연결하는 탄소 원자 또는 헤테로원자(골격 부착점을 제공하는 원자와 구별됨)를 지칭한다. 모이어티는, 예컨대, 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류, 또는 다당류일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 고리형 담체에 개재 테터에 의해 연결된다. 따라서, 고리형 담체는 종종 작용기, 예컨대 아미노기를 포함하거나, 일반적으로, 구성분 고리에 또 다른 화학적 실체, 예컨대 리간드의 도입 또는 테터링에 적합한 결합을 제공할 것이다.
iRNA는 담체를 통해 리간드에 컨쥬게이션될 수 있고, 여기서 담체는 고리형 또는 비고리형 기일 수 있고; 바람직하게는, 고리형 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸릴, 및 데칼린으로부터 선택되며; 바람직하게는, 비고리형 기는 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, iRNA 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14 내지 40 뉴클레오티드를 갖는다. RNAi 작용제는 화학식 L로 나타낼 수 있다:
[화학식 L]
Figure pct00018
화학식 L에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변형을 함유하는 뉴클레오티드이다. 일 구현예에 있어서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 2'-OMe 변형을 함유한다. 일 구현예에 있어서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 2'-OMe 또는 2'-F 변형을 함유한다. 일 구현예에 있어서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4' 중 적어도 하나는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형을 함유한다.
C1은 안티센스 가닥의 시드 영역과 반대 부위(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2 내지 8)에 배치된 열적 탈안정화 뉴클레오티드이다. 예를 들면, C1은 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2 내지 8에서 뉴클레오티드와 쌍을 형성하는 센스 가닥의 위치에 있다. 일 예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 15에 있다. C1 뉴클레오티드는 무염기 변형; 듀플렉스 내 반대 뉴클레오티드와의 미스매치; 및 당 변형, 예컨대 2'-데옥시 변형 또는 비고리형 뉴클레오티드, 예컨대, 비잠금 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)을 포함할 수 있는 열적 탈안정화 변형을 보유한다. 일 구현예에 있어서, C1은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 열적 탈안정화 변형을 갖는다: i) 안티센스 가닥에서 반대 뉴클레오티드와의 미스매치; ii) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 무염기 변형:
Figure pct00019
; 및 iii) 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 당 변형:
Figure pct00020
,
Figure pct00021
,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
,
Figure pct00024
, 및
Figure pct00025
식 중, B는 변형된 또는 미변형된 뉴클레오염기이며, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 일 구현예에 있어서, C1에서 열적 탈안정화 변형은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, 및 U:T로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미스매치이며; 선택적으로, 미스매치쌍에서 적어도 하나의 뉴클레오염기는 2'-데옥시 뉴클레오염기이다. 일 예에서, C1에서 열적 탈안정화 변형은 GNA 또는
Figure pct00026
이다.
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형의 입체 부피 이하인 입체 부피를 뉴클레오티드에 제공하는 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다. 입체 부피는 변형의 입체 효과의 합을 지칭한다. 뉴클레오티드 변형의 입체 효과를 결정하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 변형은 뉴클레오티드의 리보스 당의 2' 위치에 있거나, 비-리보스 뉴클레오티드, 비고리형 뉴클레오티드, 또는 리보스 당의 2' 위치와 유사하거나 동등한 뉴클레오티드의 골격에 대한 변형일 수 있고, 2'-OMe 변형의 입체 부피 이하인 입체 부피를 뉴클레오티드에 제공한다. 예를 들면, T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로부터 선택된다. 일 구현예에 있어서, T1은 DNA이다. 일 구현예에 있어서, T1'은 DNA, RNA 또는 LNA이다. 일 구현예에 있어서, T2'은 DNA 또는 RNA이다. 일 구현예에 있어서, T3'은 DNA 또는 RNA이다.
n1, n3, 및 q1은 독립적으로 길이가 4 내지 15 뉴클레오티드이다.
n5, q3, 및 q7은 독립적으로 길이가 1 내지 6 뉴클레오티드(들)이다.
n4, q2, 및 q6은 독립적으로 길이가 1 내지 3 뉴클레오티드(들)이며; 대안적으로, n4는 0이다.
q5는 독립적으로 길이가 0 내지 10 뉴클레오티드(들)이다.
n2 및 q4는 독립적으로 길이가 0 내지 3 뉴클레오티드(들)이다.
대안적으로, n4는 길이가 0 내지 3 뉴클레오티드(들)이다.
일 구현예에 있어서, n4는 0일 수 있다. 일 예에서, n4는 0이며, q2 및 q6은 1이다. 또 다른 예에서, n4는 0이며, q2 및 q6은 1이고, 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, n4, q2, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에 있어서, n2, n4, q2, q4, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에 있어서, 센스 가닥의 길이가 19 내지 22 뉴클레오티드이고 n4가 1인 경우, C1은 센스 가닥의 5'-말단의 위치 14 내지 17에 있다. 일 구현예에 있어서, C1은 센스 가닥의 5'-말단의 위치 15에 있다.
일 구현예에 있어서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2에서 시작된다. 일 예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2에 있고 q6은 1이다.
일 구현예에 있어서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 14에서 시작된다. 일 예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 14에 있고 q2는 1이다.
예시적인 구현예에 있어서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2에서 시작되고 T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 14에서 시작된다. 일 예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2에서 시작되고 q6은 1이고 T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 14에서 시작되고 q2는 1이다.
일 구현예에 있어서, T1' 및 T3'은 길이 11 뉴클레오티드(즉, T1' 및 T3' 뉴클레오티드를 카운팅하지 않고)에 의해 분리된다.
일 구현예에 있어서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 14에 있다. 일 예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 14에 있고 q2는 1이고, 변형은 2' 위치 또는 2'-OMe 리보스보다 작은 입체 부피를 제공하는 비-리보스, 비고리형 또는 골격에서의 위치에 있다.
일 구현예에 있어서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2에 있다. 일 예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2에 있고 q6은 1이고, 변형은 2' 위치 또는 2'-OMe 리보스 이하의 입체 부피를 제공하는 비-리보스, 비고리형 또는 골격에서의 위치에 있다.
일 구현예에 있어서, T1은 센스 가닥의 절단 부위에 있다. 일 예에서, 센스 가닥이 길이가 19 내지 22 뉴클레오티드이며 n2가 1인 경우, T1은 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 11에 있다. 예시적인 구현예에 있어서, 센스 가닥의 길이가 19 내지 22 뉴클레오티드이고 n2가 1인 경우, T1은 센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 11에서 센스 가닥의 절단 부위에 있다.
일 구현예에 있어서, T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 6에서 시작된다. 일 예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 6 내지 10에 있고, q4는 1이다.
예시적인 구현예에 있어서, 센스 가닥의 길이가 19 내지 22 뉴클레오티드이고, n2가 1인 경우, T1은 센스 가닥의 절단 부위, 예를 들면, 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 11에 있고; T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 14에 있고, q2는 1이고, T1'에 대한 변형은 리보스 당의 2' 위치 또는 2'-OMe 리보스보다 작은 입체 부피를 제공하는 비-리보스, 비고리형 또는 골격에서의 위치에 있고; T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 6 내지 10에 있고, q4는 1이고; T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 2에 있고, q6은 1이고, T3'에 대한 변형은 2' 위치 또는 2'-OMe 리보스 이하의 입체 부피를 제공하는 비-리보스, 비고리형 또는 골격에서의 위치에 있다.
일 구현예에 있어서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 8에서 시작된다. 일 예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 8에서 시작되고, q4는 2이다.
일 구현예에 있어서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 9에서 시작된다. 일 예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 위치 9에서 있고, q4는 1이다.
일 구현예에 있어서, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이며, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, n4는 0이며, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 6이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 6이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로 안티센스 가닥의 3' 말단에 적어도 2개의 추가 TT를 갖는다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로 안티센스 가닥의 3' 말단에 적어도 2개의 추가 TT를 갖고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함).
RNAi 작용제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함할 수 있다. 5'-말단 인-함유 기는 5'-말단 포스페이트(5'-P), 5'-말단 포스포로티오에이트(5'-PS), 5'-말단 포스포로디티오에이트(5'-PS2), 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP), 5'-말단 메틸포스포네이트(MePhos), 또는 5'-데옥시-5'-C-말로닐(
Figure pct00027
)일 수 있다. 5'-말단 인-함유 기가 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP)인 경우, 5'-VP는 5'-E-VP 이성질체(즉, 트랜스-비닐포스페이트,
Figure pct00028
), 5'-Z-VP 이성질체(즉, 시스-비닐포스페이트,
Figure pct00029
), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함한다.
일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 5'-P를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 5'-PS를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 5'-E-VP를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 5'-Z-VP를 포함한다.
일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에 있어서, RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. The dsRNA 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNAi RNA 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP(예컨대, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 표적화 리간드를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP(예컨대, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합) 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP(예컨대, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합) 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-VP(예컨대, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합) 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에 있어서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이며, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1 내지 5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함), 및 안티센스 가닥의 위치 1 및 2에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형 및 위치 18 내지 23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합 변형을 갖는다(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 카운팅함). RNAi 작용제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드; 및
(iii) 위치 1, 3, 5, 7, 9 내지 11, 13, 17, 19, 및 21의 2'-F 변형, 및 위치 2, 4, 6, 8, 12, 14 내지 16, 18, 및 20의 2'-OMe 변형(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 3, 5, 9, 11 내지 13, 15, 17, 19, 21, 및 23의 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 4, 6 내지 8, 10, 14, 16, 18, 20, 및 22의 2'F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 dsRNA 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1, 3, 5, 7, 9 내지 11, 13, 15, 17, 19, 및 21에 2'-F 변형, 및 위치 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 및 20에 2'-OMe 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11 내지 13, 15, 17, 19, 및 21 내지 23에 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 및 20에 2'F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
를 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8, 10, 및 12 내지 21에 2'-OMe 변형, 위치 7, 및 9에 2'-F 변형, 및 위치 11에 데옥시-뉴클레오티드(예컨대 dT)(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 및 19 내지 23에 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 4 내지 6, 8, 10, 12, 14, 16, 및 18에 2'-F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 내지 21에 2'-OMe 변형, 및 위치 7, 9, 11, 13, 및 15에 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이
(ii) 위치 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21 내지 23에 2'-OMe 변형, 및 위치 2 내지 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20에 2'-F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1 내지 9, 및 12 내지 21에 2'-OMe 변형, 및 위치 10, 및 11에 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이
(ii) 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11 내지 13, 15, 17, 19, 및 21 내지 23에 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 및 20에 2'-F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1, 3, 5, 7, 9 내지 11, 및 13에 2'-F 변형, 및 위치 2, 4, 6, 8, 12, 및 14 내지 21에 2'-OMe 변형; 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 3, 5 내지 7, 9, 11 내지 13, 15, 17 내지 19, 및 21 내지 23에 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 4, 8, 10, 14, 16, 및 20에 2'-F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 15, 17, 및 19 내지 21에 2'-OMe 변형, 및 위치 3, 5, 7, 9 내지 11, 13, 16, 및 18에 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 25 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 4, 6, 7, 9, 11 내지 13, 15, 17, 및 19 내지 23에 2'-OMe 변형, 위치 2, 3, 5, 8, 10, 14, 16, 및 18에 2'-F 변형, 및 위치 24 및 25에 데스옥시-뉴클레오티드(예컨대 dT)(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 4 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8, 및 12 내지 21에 2'-OMe 변형, 및 위치 7, 및 9 내지 11에 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 3 내지 5, 7, 8, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 23에 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 6, 9, 14, 및 16에 2'-F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8, 및 12 내지 21에 2'-OMe 변형, 및 위치 7, 및 9 내지 11에 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 3 내지 5, 7, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 23에 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에 2'-F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 22 및 23 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 RNAi 작용제는 하기:
(a) 하기를 갖는 센스 가닥:
(i) 19 뉴클레오티드 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNac 유도체를 포함하는 리간드;
(iii) 위치 1 내지 4, 6, 및 10 내지 19에 2'-OMe 변형, 및 위치 5, 및 7 내지 9에 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
및
(b) 하기를 갖는 안티센스 가닥:
(i) 21 뉴클레오티드 길이;
(ii) 위치 1, 3 내지 5, 7, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 21에 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에 2'-F 변형(5' 말단으로부터 카운팅함); 및
(iii) 뉴클레오티드 위치 1 및 2 간, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 간, 뉴클레오티드 위치 19 및 20 간, 그리고 뉴클레오티드 위치 20 및 21 간 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합(5' 말단으로부터 카운팅함);
을 포함하며, 상기 RNAi 작용제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2 뉴클레오티드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활성 말단을 갖는다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 iRNA는 표 3, 표 5, 또는 표 6에 열거된 작용제로부터 선택된 작용제이다. 이들 작용제는 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
III. 리간드에 컨쥬게이션된 iRNA
본 발명의 iRNA의 RNA의 또 다른 변형에는 활성, 세포 분포, 또는 iRNA의 예컨대 세포 내로의 세포 섭취를 향상시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 컨쥬게이트를 iRNA에 화학적으로 결합시키는 것이 관여된다. 그러한 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티를 포함하지만 이에 한정되지 않는다(Letsinger 등, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556). 다른 구현예에 있어서, 리간드는 콜산(Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예컨대, 베릴-S-트리틸티올(Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras 등, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)이다.
특정 구현예에 있어서, 리간드는 리간드를 포함하는 iRNA 작용제의 분포, 표적화, 또는 수명을 변경한다. 바람직한 구현예에 있어서, 리간드는 예컨대, 리간드와 같은 부재된 종과 비교하여, 선택된 표적, 예컨대, 분자, 세포 또는 세포 유형, 격실, 예컨대, 세포 또는 기관 격실, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대하여 향상된 친화도를 제공한다. 바람직한 리간드는 듀플렉스된 핵산 내에서 듀플렉스 쌍형성에 참여하지 않는다.
리간드는 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 리포단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예컨대, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 또는 히알루론산); 또는 지질과 같은 자연발생적 물질을 포함할 수 있다. 리간드는 합성 중합체, 예컨대, 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수도 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 공중합체, 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는: 폴리에틸렌이민, 폴리라이신(PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민(peptidomimetic polyamine), 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 헬리칼 펩티드를 포함한다.
리간드는 표적화기, 예컨대, 세포 또는 조직 표적 작용제, 예컨대, 렉틴, 글리코단백질, 지질 또는 단백질, 예컨대, 신장 세포와 같은 특정된 세포 유형과 결합하는 항체를 포함할 수도 있다. 표적화기는 갑상선 자극 호르몬, 멜라노트로핀, 렉틴, 글리코단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 의태물일 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 리간드는 다가 갈락토스, 예컨대, N-아세틸-갈락토사민이다.
리간드의 다른 예는 염료, 삽입성 작용제(예컨대, 아크리딘), 가교제(예컨대, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환 방향족 탄화수소(예컨대, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예컨대, EDTA), 친지방성 분자, 예컨대, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스틱산,O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜레닉산(cholenic acid), 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진)및 펩티드 컨쥬게이트(예컨대, 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화 작용제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예컨대, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사선표지 마커, 효소, 합텐(예컨대, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예컨대, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예컨대, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 컨쥬게이트, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예컨대, 글리코단백질, 또는 펩티드, 예컨대, 공-리간드에 대한 특정 친화도를 갖는 분자, 또는 항체, 예컨대, 간세포와 같은 특정된 세포 유형과 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수도 있다. 이들은 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 공통인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스와 같은 비-펩티드성 종을 포함할 수도 있다. 리간드는 예를 들면, 리포다당류, p38 MAP 키나아제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예컨대, 세포의 미소관, 미세섬유, 또는 중간 필라멘트를 파열시킴으로써 세포의 세포골격을 파열시킴으로써 예컨대, iRNA 작용제의 세포로의 섭취를 증가시킬 수 있는 약물과 같은 물질일 수 있다. 약물은 예를 들면, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리데(japlakinolide), 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리데(swinholide) A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본원에 기술된 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절제(PK 조절제)로 작용한다. PK 조절제는 리포필, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 또한 혈청 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있어서, 짧은 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 골격 내에서 복수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 약 5 염기, 10 염기, 15 염기, 또는 20 염기의 올리고뉴클레오티드는 리간드로서(예컨대, PK 조절 리간드로서) 본 발명에 따른다. 또한, 혈청 구성성분(예컨대, 혈청 단백질)을 결합하는 압타머는 본원에 기술된 구현예에 있어서 PK 조절 리간드로서 사용하기 적합하다.
본 발명의 리간드-컨쥬게이션된 iRNA는 결합 분자를 올리고뉴클레오티드 상에 부착하여 유래된 것과 같이 펜던트 반응 관능성(pendant reactive functionality)를 지니는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 합성될 수 있다(아래에 기술됨). 이 반응성 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 이용 가능한 리간드, 다양한 보호기 중 어느 하나를 지니는 합성된 리간드, 또는 이에 부착된 결합 모이어티를 갖는 리간드와 직접적으로 반응될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 고체상 합성의 주지의 기술을 통해 용이하게 통상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 예를 들면, Applied Biosystems®(Foster City, Calif.)를 포함하는 몇몇 판매 회사에 의해 판매된다. 당업계에 알려진 그러한 합성을 위한 임의의 다른 방법이 추가적으로 또는 대안적으로 채용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 기타 올리고뉴클레오티드를 제조하는 유사한 기술을 이용하는 것도 알려져 있다.
본 발명의 리간드-컨쥬게이션된 iRNA 및 리간드-분자 보유 서열-특이적 결합된 뉴클레오시드에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체 또는 결합 모이어티를 이미 보유하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 컨쥬게이트 전구체, 리간드 분자를 이미 보유하는 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-컨쥬게이트 전구체 또는 비-뉴클레오시드 리간드-보유 빌딩 블락을 활용하여 적합한 DNA 합성기 상에서 조립될 수 있다.
결합 모이어티를 이미 보유한 뉴클레오티드-컨쥬게이트 전구체를 사용하는 경우, 서열-특이적 결합된 뉴클레오시드의 합성이 통상적으로 완료되며, 리간드 분자는 이후 결합 모이어티와 반응하여 리간드-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 일부 구현예에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 결합된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 합성에 상업적으로 이용 가능하며 통상적으로 사용되는 표준 포스포라미디트 및 비-표준 포스포라미디트에 더하여 리간드-뉴클레오시드 컨쥬게이트로부터 유래된 포스포라미디트를 사용하여 자동화된 합성기에 의하여 합성된다.
A. 지질 컨쥬게이트
특정 구현예에 있어서, 리간드 또는 컨쥬게이트는 지질 또는 지질계 분자이다. 그러한 지질 또는 지질계 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA)와 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예컨대, 신체의 비-신장 표적 조직으로 컨쥬게이트의 분포가 이루어지도록 한다. 예를 들면, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA와 결합할 수 있는 기타 분자는 리간드로 사용될 수도 있다. 예를 들면, 나프록센 또는 아스피린을 사용할 수 있다. 지질 또는 지질계 리간드는 (a) 컨쥬게이트의 분해에 대한 내성을 증가시키거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로 표적 또는 수송을 증가시키거나, (c) 혈청 단백질, 예컨대, HSA로의 결합을 조정하는 데 사용될 수 있다.
지질계 리간드는 컨쥬게이트의 표적 조직으로의 결합을 억제, 예컨대, 조절하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, HSA에 더 강하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장에 표적될 가능성이 적을 것이며, 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적을 것이다. HSA 와 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장에 컨쥬게이트를 표적화하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 지질계 리간드는 HSA와 결합한다. 바람직하게는, 컨쥬게이트가 바람직하게는 비-신장 조직으로 분포되도록 충분한 친화도로 HSA와 결합한다. 그러나, 친화도는 그다지 강하지 않아서 HSA-리간드 결합이 반전될 수 없는 것이 바람직하다.
다른 구현예에 있어서, 지질계 리간드는 컨쥬게이트가 바람직하게는 신장으로 분포되도록 HSA와 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않는다. 신장 세포에 표적화되는 기타 모이어티가 또한 지질계 리간드 대신에, 또는 이에 더하여, 사용될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 리간드는 모이어티, 예컨대, 표적 세포, 예컨대, 증식하는 세포에 의하여 섭취되는 비타민이다. 이들은 예컨대, 악성 또는 비-악성 형태, 예컨대, 암 세포의 원하지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 특히 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E 및 K를 포함한다. 기타 예시적인 비타민은 비타민 B, 예컨대, 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 간 세포와 같은 표적 세포에 의하여 섭취되는 비타민 및 영양분을 포함한다. HSA 및 저밀도 리포단백질(LDL)도 포함된다.
B. 세포 투과제
또 다른 양태에 있어서, 리간드는 세포-투과제, 바람직하게는 헬리칼 세포-투과제이다. 바람직하게는, 작용제는 양친매성이다. 예시적인 작용제는 태트(tat) 또는 안테노페디아(antennopedia)와 같은 펩티드이다. 작용제가 펩티드이면, 펩티딜미메틱(peptidylmimetic), 인베르토머(invertomer), 비-펩티드 또는 슈도-펩티드 결합 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 헬리칼 작용제는 바람직하게는 친유상 및 소유상을 갖는, 바람직하게는 알파-헬릭칼 작용제이다.
리간드는 펩티드 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic)일 수 있다. 펩티도미메틱(본원에서 올리고펩티도미메틱이라고도 함)은 중성 펩티드와 유사한 정의된 3-차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. 펩티드 및 펩티도미메틱이 iRNA 작용제에 부착되면 세포 인식 및 흡수를 향상시키는 것에 의한 것과 같이, iRNA의 약동학적 분포에 영향을 줄 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱 모이어티는 길이가 약 5 내지 50 아미노산, 예컨대, 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 아미노산일 수 있다.
펩티드 또는 펩티도미메틱은 예를 들면, 세포 투과 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드 또는 소수성 펩티드(예컨대, 주로 Tyr, Trp, 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속성 펩티드 또는 가교된 펩티드일 수 있다. 또 다른 대안에 있어서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO: 15)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 포함하는 RFGF 유사체(예컨대, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:16))는 표적화 모이어티일 수도 있다. 펩티드 모이어티는 세포막을 가로질러 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 단백질을 포함하는 더 큰 극성 분자를 운반할 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 예를 들면, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:17)) 및 초파리 Antennapedia 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:18))로부터 나온 서열은 전달 펩티드로서 기능할 수 있다는 것이 발견되었다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 파지-표시 라이브러리 또는 알갱이당-한 분자(one-bead-one) 화합물(OBOC) 조합 라이브러리로부터 동정된 펩티드와 같은 DNA의 임의적 서열에 의하여 인코딩될 수 있다(Lam 등., Nature, 354:82-84, 1991). 세포 표적화 목적으로 포함된 단량체 단위를 통해 dsRNA 작용제에 속박된 펩티드 또는 펩티도미메틱의 예는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩티드 또는 RGD 의태물이다. 펩티드 모이어티는 길이가 약 5 아미노산 내지 약 40 아미노산에 이를 수 있다. 펩티드 모이어티는 안정성을 증가시키거나 형태적 특성을 지시하는 것과 같은 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기에 기술된 구조적 변형 중 임의의 것이 활용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 RGD 펩티드는 선형 또는 고리형일 수 있으며, 변형되어, 예컨대, 글리코실화 또는 메틸화되어 특정 조직(들)으로의 표적화를 용이하게 할 수 있다. RGD-함유 펩티드 및 펩티도미메틱은 합성 RGD 의태물뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD에 더하여, 인테그린 리간드를 표적화하는 기타 모이어티를 사용할 수 있다. 이 리간드의 바람직한 컨쥬게이트는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적화한다.
"세포 투과 펩티드"는 세포, 예컨대, 박테리아 또는 진균 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩티드는 예를 들면, α-헬리칼 선형 펩티드(예컨대, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩티드(예컨대, α-디펜신(defensin), β-디펜신 또는 박테네신), 또는 하나 또는 두 개의 우성 아미노산만을 포함하는 펩티드(예컨대, PR-39 또는 인도리시딘)일 수 있다. 세포 투과 펩티드는 핵 위치 신호(NLS)를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 세포 투과 펩티드는 HIV-1 gp41 및 SV40 대형 T 항원의 NLS의 융합 펩티드 도메인으로부터 유래된 MPG와 같은 양자 양친매성 펩티드(bipartite amphipathic peptide)일 수 있다(Simeoni 등, Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
C. 탄수화물 컨쥬게이트
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 구현예에 있어서, iRNA는 탄수화물을 더 포함한다. 탄수화물 컨쥬게이션된 iRNA는 본원에 기술된 바와 같이 생체 내 치료용에 적합한 조성물뿐만 아니라 핵산의 생체 내 전달에 유리하다. 본원에 사용된 "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께(선형, 분지형 또는 고리형일 수 있는) 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 이루어진 탄수화물 그 자체, 또는 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께(선형, 분지형 또는 고리형일 수 있는) 적어도 6개의 탄소 원자를 각각 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 이루어진 탄수화물 모이어티를 그 일부로서 갖는 화합물 중 하나인 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물로는 당(단당류, 이당류, 삼당류, 및 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 단위를 포함하는 단당류, 이당류, 삼당류, 및 올리고당류) 및, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 및 다당류 검과 같은 다당류를 포함한다. 특이적인 단당류로는 C5 이상의(예컨대, C5, C6, C7 또는 C8) 당을 들 수 있으며; 이당류 및 삼당류는 2 또는 3 단당류 단위를 갖는 당(예컨대, C5, C6, C7 또는 C8)을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 단당류이다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
[화학식 II]
Figure pct00030
,
[화학식 III]
Figure pct00031
,
[화학식 IV]
Figure pct00032
,
[화학식 V]
Figure pct00033
,
[화학식 VI]
Figure pct00034
,
[화학식 VII]
Figure pct00035
,
[화학식 VIII]
Figure pct00036
,
[화학식 IX]
Figure pct00037
,
[화학식 X]
Figure pct00038
,
[화학식 XI]
Figure pct00039
[화학식 XII]
Figure pct00040
,
[화학식 XIII]
Figure pct00041
,
[화학식 XIV]
Figure pct00042
,
[화학식 XV]
Figure pct00043
,
[화학식 XVI]
Figure pct00044
,
[화학식 XVII]
Figure pct00045
,
[화학식 XVIII]
Figure pct00046
,
[화학식 XIX]
Figure pct00047
,
[화학식 XX]
Figure pct00048
,
[화학식 XXI]
Figure pct00049
,
[화학식 XXII]
Figure pct00050
,
[화학식 XXIII]
Figure pct00051
;
[화학식 XXIV]
Figure pct00052
,
(식 중, Y는 O 또는 S이고 n은 3 내지 6임);
[화학식 XXV]
Figure pct00053
,
(식 중, Y는 O 또는 S이고 n은 3 내지 6임);
[화학식 XXVI]
Figure pct00054
;
[화학식 XXVII]
Figure pct00055
,
(식 중, X는 O 또는 S임);
[화학식 XXVII]
Figure pct00056
,
[화학식 XXIX]
Figure pct00057
;
[화학식 XXX]
Figure pct00058
[화학식 XXXI]
Figure pct00059
;
[화학식 XXXII]
Figure pct00060
, 및
[화학식 XXXIII]
Figure pct00061
.
[화학식 XXXIV]
Figure pct00062
.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 단당류이다. 일 구현예에 있어서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민, 예컨대 하기 화합물이다:
[화학식 II]
Figure pct00063
.
본원에 기술된 구현예에서 사용하기 위한 또 다른 대표 탄수화물 컨쥬게이트는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다:
[화학식 XXXVI]
Figure pct00064
식 중, X 또는 Y 중 하나는 올리고뉴클레오티드이며, 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 특정 구현예에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 일부 구현예에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 또 다른 구현예에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 iRNA 작용제, 예컨대, dsRNA 작용제의 센스 가닥의 5' 말단, 또는 본원에 기술된 바와 같은 이중 표적화 RNAi 작용제의 하나 또는 두 센스 가닥의 5' 말단에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 복수의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 또는 6) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하며, 각각 독립적으로 복수의 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 작용제의 복수의 뉴클레오티드에 부착된다.
일부 구현예에 있어서, 예를 들면, 본 발명의 iRNA 작용제의 두 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이의 비단속 뉴클레오티드 사슬에 의해 연결되어 복수의 쌍이 아닌 뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍이 아닌 뉴클레오티드는 독립적으로 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 탄수화물 컨쥬게이트는 상술된 바와 같은, PK 조절제 또는 세포 투과 펩티드와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가 리간드를 더 포함한다.
본 발명에서 사용하기 적합한 추가 탄수화물 컨쥬게이트 및 링커는 PCT 공개 번호 WO 2014/179620 및 WO 2014/179627호에 기술된 것을 포함하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
D. 링커
일부 구현예에 있어서, 본원에 기술된 컨쥬게이트 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 다양한 링커로 iRNA 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
"링커" 또는 "결합기"라는 용어는 화합물의 두 부분을 연결하는, 예컨대, 화합물의 두 부분을 공유적으로 부착하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 통상적으로 NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, 또는 예컨대 치환되거나 미치환된 알킬, 치환되거나 미치환된 알케닐, 치환되거나 미치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로시클릴알킬, 알킬헤테로시클릴알케닐, 알킬헤테로시클릴알키닐, 알케닐헤테로시클릴알킬, 알케닐헤테로시클릴알케닐, 알케닐헤테로시클릴알키닐, 알키닐헤테로시클릴알킬, 알키닐헤테로시클릴알케닐, 알키닐헤테로시클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴로서, 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 미치환된 아릴, 치환되거나 미치환된 헤테로아릴, 또는 치환되거나 미치환된 헤테로시클릭에 의하여 단속되거나 종결될 수 있으며; R8은 수소, 아실, 지방족, 또는 치환된 지방족인, 그러나 이에 한정되지 않는 원자의 사슬과 같은 단위인 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 링커는 약 1 내지 24 원자, 2 내지 24, 3 내지 24, 4 내지 24, 5 내지 24, 6 내지 24, 6 내지 18, 7 내지 18, 8 내지 18, 7 내지 17, 8 내지 17, 6 내지 16, 7 내지 17 또는 8 내지 16 원자이다.
절단 가능한 결합기는 세포 밖에서는 충분히 안정한 것이지만, 표적 세포로 들어오면 절단되어 링커가 함께 이어 놓고 있는 2개 부분을 방출하는 것이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 절단 가능한 결합기는 대상체의 혈액 내 또는(예컨대, 혈액 또는 혈청 내에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 제2 기준 조건 하보다 표적 세포 내 또는(예컨대, 세포 내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 제1 기준 조건 하에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 또는 적어도 100배 더 빠르게 절단된다.
절단 가능한 결합기는 절단 작용제, 예컨대, pH, 산화환원 전위, 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로, 절단 작용제는 혈청 또는 혈액 내에서보다 세포 내에서 더 우세하거나 더 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 그러한 분해 작용제의 예로는: 예컨대, 환원에 의하여 산화환원 절단 가능한 결합기를 분해시킬 수 있는, 세포 내에 존재하는 메르캅탄과 같은 산화 또는 환원 효소 또는 환원제를 비롯하여, 특정 기질에 대하여 선택되거나 기질 특이성이 없는 산화환원 작용제; 에스테라아제; 산성 환경을 발생시킬 수 있는 엔도솜 또는 작용제, 예컨대, 5 이하의 pH를 일으키는 엔도솜 또는 작용제; 일반적인 산으로 작용함으로써 산 절단 가능한 결합기를 혼성화하거나 분해시킬 수 있는 효소, (기질 특이적일 수 있는) 펩티다아제 및 포스파타아제를 포함한다.
디설파이드 결합과 같은 절단 가능한 결합기는 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면에, 평균 세포 내 pH는 이보다 약간 더 낮은 약 7.1 내지 7.3에 이른다. 엔도솜은 5.5 내지 6.0의 범위에 이르는 더 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 5.0 근처의 좀 더 산성인 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되는 절단 가능한 결합기를 가짐으로써, 세포 내부의 리간드로부터 또는 세포의 원하는 격실로 양이온성 지질을 방출하게 된다.
링커는 특정 효소에 의하여 절단될 수 있는 절단 가능한 결합기를 포함할 수 있다. 링커 내로 포함되는 절단 가능한 결합기의 유형은 표적되는 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 간-표적 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 결합될 수 있다. 간 세포는 에스테라아제가 풍부하며, 따라서, 링커는 에스테라아제가 풍부하지 않은 세포 유형 내에서 보다 간 세포 내에서 더 효율적으로 절단될 것이다. 에스테라아제가 풍부한 기타 세포-유형은 폐, 신장 피질 및 고환의 세포를 포함한다.
펩티드 결합을 포함하는 링커는 간 세포 및 윤활막세포와 같이, 펩티다아제가 풍부한 세포 유형을 표적화하는 경우에 사용될 수 있다.
일반적으로, 절단 가능한 결합기 후보의 적합성은 후보 결합기를 절단하는 분해 작용제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한, 절단 가능한 결합기 후보에 대하여 혈액 내에서 또는 기타 비표적 조직과 접촉하는 경우에 절단에 저항하는 능력을 시험하는 것도 바람직할 것이다. 따라서, 표적 세포 내에서 절단을 나타내도록 선택되는 제1 조건과 기타 조직 또는 생물학적 유체, 예컨대, 혈액 또는 혈청 내에서 절단을 나타내도록 선택되는 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적 민감도를 결정할 수 있다. 평가는 무세포 시스템, 세포 내, 세포 배양 내, 장기 또는 조직 배양 내, 또는 전체 동물 내에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건 내에서 초기 평가를 실시하고 전체 동물 내에서 다음 평가에 의하여 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서와 비교하여 세포 내(또는 세포 내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 빨리 절단된다.
i. 산화환원 절단 가능한 결합기
특정 구현예에 있어서, 절단 가능한 결합기는 산화 또는 환원시에 절단되는 산화환원 절단 가능한 결합기이다. 환원적으로 절단 가능한 결합기의 일 예는 디설파이드 결합기(-S-S-)이다. 절단 가능한 결합기 후보가 적합한 "환원적으로 절단 가능한 결합기"인지 여부 또는 예를 들면, 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적 작용제와의 용도에 적합한지 여부를 결정하기 위하여, 본원에 기술된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들면, 후보는 세포, 예컨대, 표적 세포 내에서 관찰될 수 있는 절단 속도를 모방하는, 업계에 알려진 시약을 사용한 기타 환원제, 또는 디티오트레이톨(DTT)을 사용한 배양에 의하여 평가될 수 있다. 후보는 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수도 있다. 하나의 구현예에 있어서, 후보 화합물은 혈액 내에서 최대 약 10% 정도 절단된다. 다른 구현예에 있어서, 유용한 후보 화합물은 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서와 비교하여 세포 내(또는 세포 내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 약 100배 더 빨리 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포 내 매질을 모방하도록 선택된 조건 하에서 그리고 세포외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 역동학 분석법을 이용하여 결정될 수 있다.
ii. 포스페이트계 절단 가능한 결합기
다른 구현예에 있어서, 절단 가능한 링커는 포스페이트계 절단 가능한 결합기를 포함한다. 포스페이트계 절단 가능한 결합기는 포스페이트기를 분해시키거나 혼성화하는 작용제에 의하여 절단된다. 세포 내에서 포스페이트기를 절단하는 작용제의 일 예는 세포 내에서 포스파타아제와 같은 효소이다. 포스페이트계 결합기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, 및 -O-P(S)(Rk)-S이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 일 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 그러한 후보는 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단 가능한 결합기
다른 구현예에 있어서, 절단 가능한 링커는 산 절단 가능한 결합기를 포함한다. 산 절단 가능한 결합기는 산 조건 하에서 절단되는 결합기이다. 바람직한 구현예에 있어서, 산 절단 가능한 결합기는 약 6.5 이하(예컨대, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하)의 pH를 갖는 산성 환경에서나 또는 일반적인 산으로 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의하여 절단된다. 세포 내에서, 엔도솜 및 리소좀과 같은 특이적인 낮은 pH 세포 기관은 산 절단 가능한 결합기에 대하여 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단 가능한 결합기의 예로는 히드라존, 에스테르 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 산 절단 가능한 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)을 가질 수 있다. 바람직한 일 구현예는 에스테르(알콕시기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 삼차 알킬기인 경우이다. 그러한 후보는 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르계 결합기
다른 구현예에 있어서, 절단 가능한 링커는 에스테르계 절단 가능한 결합기를 포함한다. 에스테르계 절단 가능한 결합기는 세포 내에서 에스테라아제 및 아미다아제와 같은 효소에 의하여 절단된다. 에스테르계 절단 가능한 결합기의 예로는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기의 에스테르를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 에스테르 절단 가능한 기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-을 갖는다. 이들 후보는 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
v. 펩티드계 절단기
또 다른 구현예에 있어서, 절단 가능한 링커는 펩티드계 절단 가능한 결합기를 포함한다. 펩티드계 절단 가능한 결합기는 세포 내에서 펩티다아제 및 프로테아제와 같은 효소에 의하여 절단된다. 펩티다아제계 절단 가능한 결합기는 아미노산 사이에서 형성되어 올리고펩티드(예컨대, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 수득하는 펩티드 결합이다. 펩티드계 절단 가능한 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 사이에서 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 아미노산 사이에서 형성되어 펩티드 및 단백질을 수득하는 아미드 결합의 특별한 유형이다. 펩티드계 절단기는 일반적으로 아미노산 사이에서 형성되어 펩티드 및 단백질을 수득하는 펩티드 결합(즉, 아미드 결합)에 한정되고 전체 아미드 기능기를 포함하지 않는다. 펩티드계 절단 가능한 결합기는 일반식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-를 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R기이다. 이들 후보는 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 컨쥬게이션된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 링커를 갖는 iRNA 탄수화물 컨쥬게이트의 비제한적 예는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다:
[화학식 XXXVII]
Figure pct00065
,
[화학식 XXXVIII]
Figure pct00066
,
[화학식 XXXIX]
Figure pct00067
,
[화학식 XL]
Figure pct00068
[화학식 XLI]
Figure pct00069
[화학식 XLII]
Figure pct00070
,
[화학식 XLIII]
Figure pct00071
, 및
[화학식 XLIV]
Figure pct00072
,
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 구현예에 있어서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc"(N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 화학식 XLV 내지 XLVI 중 어느 하나에 나타낸 구조의 기로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 컨쥬게이션된다:
[화학식 XXXXV]
Figure pct00073
,
[화학식 XLVI]
Figure pct00074
,
[화학식 XLVII]
Figure pct00075
[화학식 XLVII]
Figure pct00076
식 중,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각각의 경우에 대해 독립적으로 0 내지 20을 나타내며, 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각의 경우에 대해 각각 독립적으로 부재하거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 각각의 경우에 대해 독립적으로 부재하거나, 알킬렌, 치환 알킬렌이며, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C, 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 단속되거나 종결될 수 있고;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각의 경우에 대해 각각 독립적으로 부재하거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure pct00077
Figure pct00078
또는 헤테로시클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드; 즉 각각의 경우에 대해 각각 독립적으로 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류, 또는 다당류를 나타내고; Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 컨쥬게이트화 GalNAc 유도체는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제, 예컨대 화학식 XLIX의 작용제와 사용하기 위해 특히 유용하다:
[화학식 XLIX]
Figure pct00079
,
식 중, L5A, L5B 및 L5C는 단당류, 예컨대 GalNAc 유도체를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 컨쥬게이션하는 적합한 2가 및 3가 분지형 링커기의 예는 상기에서 화학식 II, VII, XI, X, 및 XIII으로 인용된 구조를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있는 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928; 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 및 8,106,022호를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형되는 것은 필요하지 않으며, 사실상 상기 언급된 변형 중 하나를 초과하는 것이 단일 화합물 내 또는 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오시드에 포함될 수 있다. 본 발명은 키메릭 화합물인 iRNA 화합물도 포함한다.
본 발명의 맥락에 있어서 "키메릭" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 각각이 적어도 하나의 모노머 단위, 즉, dsRNA 화합물의 경우 뉴클레오티드로 이루어진 둘 이상의 화학적으로 별개인 영역을 포함하는 iRNA 화합물, 바람직하게는, dsRNAi 작용제이다. 이들 iRNA는 통상적으로 RNA가 변형되어 iRNA 상에 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 섭취, 또는 표적 핵산에 대해 증가된 결합 친화도를 부여하는 적어도 하나의 영역을 포함한다. iRNA의 추가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성물을 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로 작용할 수 있다. 예를 들면, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. 그러므로, RNase H의 활성화로 인해 RNA 표적의 절단이 일어나서, 유전자 발현의 iRNA 억제의 효율을 현저히 향상시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 키메릭 dsRNA가 사용되는 경우 더 짧은 iRNA으로 필적할만한 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요하면, 업계에 알려진 연관된 핵산 혼성화 기법에 의하여 일상적으로 검출될 수 있다.
특정한 경우에 있어서, iRNA의 RNA는 비-리간드 기에 의해 변형될 수 있다. iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 향상시키기 위해 수많은 비-리간드 분자가 iRNA에 컨쥬게이션되었으며, 그러한 컨쥬게이션을 수행하기 위한 절차는 과학 문헌에서 이용 가능하다. 그러한 비-리간드 모이어티는 콜레스테롤(Kubo, T. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1): 54-61; Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예컨대, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-락-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-락-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)와 같은 지질 모이어티를 포함한다. 그러한 RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기에 열거되어 있다. 통상적인 컨쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 보유하는 RNA의 합성을 포함한다. 이후 아미노기는 적절한 커플링제 또는 활성화제를 사용하여 컨쥬게이트 되는 분자와 반응된다. 컨쥬게이션 반응은 RNA의 고체 지지체에 여전히 결합됨으로써 또는 용액 상에서 RNA의 후속의 절단으로 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 컨쥬게이트의 정제는 통상적으로 순수한 컨쥬게이트를 제공할 수 있다.
IV. 본 발명의 iRNA의 전달
세포, 예컨대 인간 대상체(예컨대, 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 AGT 연관 장애, 예컨대 고혈압에 취약하거나 이로 진단받은 대상체)와 같은 대상체 내의 세포에 대한 본 발명의 iRNA의 전달은 여러 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 전달은 세포를 본 발명의 iRNA와 시험관 내 또는 생체 내로 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체 내 전달은 iRNA, 예컨대, dsRNA를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직집적으로 수행될 수도 있다. 대안적으로, 생체 내 전달은 iRNA의 발현을 인코딩하고 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 그러한 대안은 하기에서 더 토의된다.
일반적으로, (시험관 내 또는 생체 내) 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 본 발명의 iRNA와의 용도를 위해 적합하게 할 수 있다(예컨대, 본원에서 그 전체가 참조로 포함되어 있는, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 및 WO94/02595호 참고). 생체 내 전달을 위해, iRNA 분자를 전달하기 위해 고려하는 인자는 예를 들면, 전달된 분자의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 방지 및 표적 조직 내에서 전달된 분자의 축적을 포함한다. RNA 간섭은 또한 직접 주사에 의한 CNS로의 국부적 전달에 성공한 것으로 나타났다(Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602). RNA 또는 약학적 담체의 변형은 또한 표적 조직에 대한 iRNA의 표적화를 허용하고, 바람직하지 않은 표적 외 효과를 막을 수 있다. iRNA 분자는 세포 흡수를 향상시키고 분해를 방지하기 위해 콜레스테롤과 같은 친유성 기에 화학적 컨쥬게이션에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 컨쥬게이션된 ApoB에 대항하여 유도된 iRNA는 마우스에 전신으로 주사되었고, 간과 공장 둘 다에서 apoB mRNA의 녹다운을 야기하였다(Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178).
대안적인 구현예에 있어서, iRNA는 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 대전된 양이온성 전달 시스템은 iRNA 분자(음으로 대전됨)의 결합을 용이하게 하고, 음으로 대전된 세포막에서의 상호작용을 향상시켜 세포에 의하여 iRNA의 효율적인 섭취를 가능하게도 한다. 양이온 지질, 덴드리머 또는 중합체는 iRNA에 결합될 수 있거나 유도되어 iRNA를 둘러싸는 소포 또는 미셀을 형성할 수 있다(예컨대, Kim SH, 등 (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116 참고). 소포 또는 미셀의 형성은 iRNA가 전신으로 투여되는 경우 iRNA의 분해를 더 방지한다. 양이온성 iRNA 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 충분히 당업자의 능력 내에 있다(예컨대, 그 전체가 본원에서 참조로 포함되어 있는 Sorensen, DR, 등 (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN, 등 (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS 등 (2007) J. Hypertens. 25:197-205 참고). iRNA의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비-한정 예는 DOTAP(Sorensen, DR., 등 (2003), 상기; Verma, UN, 등 (2003), 상기; Verma, UN. 등 (2003), 상기), "고체 핵산 지질 입자"(Zimmermann, TS, 등 (2006) Nature 441:111-114), 카르디올리핀(Chien, PY, 등 (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A, 등 (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), 폴리에틸렌이민(Bonnet ME, 등 (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드(Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), 및 폴리아미도아민(Tomalia, DA, 등 (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., 등 (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, iRNA는 전신 투여를 위해 시클로덱스트린과 복합체를 형성한다. iRNA 및 시클로덱스트린의 투여 방법 및 약학적 조성물은 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는, 미국 특허 번호 7,427,605호에서 찾을 수 있다.
A. 본 발명의 벡터 인코딩된 iRNA
AGT 유전자를 표적화하는 iRNA는 DNA 또는 RNA 벡터로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다(예컨대, Couture, A, 등, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A. 등, 국제 PCT 공개 번호 WO 00/22113, Conrad, 국제 PCT 공개 번호 WO 00/22114, 및 Conrad, 미국 특허 번호 6,054,299호 참고). 발현은 사용된 특이적인 컨스트럭트 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 일시적(수 시간 내지 수 주의 규모) 또는 지속적(수 주 또는 수 개월 이상)일 수 있다. 이들 이식유전자는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있는 선형 컨스트럭트, 원형 플라스미드, 또는 바이러스성 벡터로 도입될 수 있다. 이식유전자는 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구성될 수도 있다(Gassmann 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 활용될 수 있는 바이러스성 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이스성 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노-연관 바이러스 벡터; (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 오르토폭스(orthopox)와 같은 수두 바이러스 벡터, 예컨대, 우두 바이러스 벡터 또는 조류두, 예컨대, 카나리아 수두 또는 계두; 및 (j) 헬퍼(helper)-종속 또는 유전자미함유(gutless) 아데노바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 복제-결함 바이러스도 유리할 수 있다. 상이한 벡터가 세포 게놈으로 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 컨스트럭트는 원한다면, 전달감염용 바이러스성 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 컨스트럭트는 에피솜의 복제가 가능한 벡터, 예컨대, EPV 및 EBV 벡터로 포함될 수 있다. iRNA의 재조합 발현용 컨스트럭트는 일반적으로 표적 세포 내에서 iRNA의 발현을 확보하는 데 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서 등을 필요로 할 것이다. 벡터 및 컨스트럭트에 대하여 고려되는 기타 양태는 업계에 알려져 있다.
V. 본 발명의 약학적 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 iRNA를 포함하는 약학적 조성물 및 제형을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 본원에 기술된 바와 같은 iRNA, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. iRNA를 함유하는 약학적 조성물은 AGT 연관 장애, 예컨대, 고혈압의 방지 또는 치료에 유용하다. 그러한 약학적 조성물은 전달 방식에 기반하여 제형화된다. 일 예는 비경구 전달을 통해, 예컨대 피하(SC), 근육 내(IM), 또는 정맥 내(IV) 전달에 의해 전신 투여를 위해 제형화된 조성물이다. 본 발명의 약학적 조성물은 AGT 유전자의 발현을 억제하기 충분한 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 AGT 유전자의 발현을 억제하기 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 iRNA의 적합한 용량은 일당 수여자의 체중 kg당 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램의 범위에 있을 것이며, 일반적으로 일당 체중 kg당 약 1 내지 50 mg의 범위에 있을 것이다. 통상적으로, 본 발명의 iRNA의 적합한 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 5.0 mg/kg, 바람직하게는 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg 범위에 있을 것이다. 반복-용량 요법은 정기적으로, 예컨대, 1개월, 3개월 내지 6개월 1회, 또는 1년 1회의 iRNA의 치료량 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, iRNA는 약 1개월 1회 내지 약 6개월 1회 투여된다.
최초 치료 요법 후, 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 치료 기간은 질병의 중증도를 기준으로 결정될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 약학적 조성물의 단회 용량은 장기 지속될 수 있어서, 용량이 1, 2, 3, 또는 4개월 이하 간격으로 투여된다. 본 발명의 일부 구현예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물의 단회 용량은 약 1개월 1회 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물의 단회 용량은 분기별로(즉, 약 3개월마다) 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물의 단회 용량은 1년에 2회(즉, 약 6개월 1회) 투여된다.
당업자는 대상체에 존재하는 돌연변이, 이전 치료, 대상체의 일반 건강 또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 투여량 및 시점에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 적절한 바에 따라, 조성물의 예방적 또는 치료적 유효량으로의 대상체 치료는 단회 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
iRNA는 특정 조직(예를 들어, 간세포)을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 용액, 에멀션, 및 리포좀-함유 제형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조성물은 예비성형된 액체, 자가-에멀션화 고형물, 및 자가-에멀션화 반고형물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. 제형은 간을 표적화하는 것들을 포함한다.
단위 투여형으로 편리하게 존재할 수 있는 본 발명의 약학적 제형은 제약 산업에 잘 알려져 있는 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술은 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 활성 성분을 회합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 담체와 활성 성분을 균일하고 친밀하게 회합함으로써 제조된다.
A. 추가 제형
i. 에멀션
본 발명의 조성물은 에멀션으로 제조 및 제형화될 수 있다. 에멀션은 통상적으로 직경이 보통 0.1 ㎛를 초과하는 소적의 형태로 하나의 액체를 다른 액체에 분산시킨 이종 시스템이다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi 등, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301 참고). 에멀션은 종종 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2개의 혼합되지 않는 액체상을 포함하는 2상계이다. 일반적으로, 에멀션은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 종류일 수 있다. 수상이 크기가 큰 유상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 유중수(w/o) 에멀션이라고 불린다. 대안적으로, 유상이 크기가 큰 수상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 수중유(o/w) 에멀션이라고 불린다. 에멀션은 분산된 상, 및 수상, 유상 중 용액으로 또는 분리상으로서 자체적으로 존재할 수 있는 활성 약물에 더하여 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약학적 부형제는 필요하다면 에멀션에 존재할 수도 있다. 약학적 에멀션은 예를 들면, 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀션의 경우에서와 같이 2상을 초과하여 구성된 다중 에멀션일 수도 있다. 그러한 복합체 제형은 종종 단순 2상 에멀션이 제공하지 않는 특정 장점을 제공한다. o/w 에멀션의 개별 유성 소적이 작은 물 소적을 둘러싸는 복수의 에멀션은 w/o/w 에멀션을 구성한다. 마찬가지로, 유성 연속상 내에 안정화된 물의 소구체립에 둘러싸인 유성 소적의 시스템은 o/w/o 에멀션을 제공한다.
에멀션은 열역학적 안정성이 거의 없거나 열역학적 안정성이 전혀 없는 것을 특징으로 한다. 종종, 에멀션의 분산되거나 불연속적 상은 외부 또는 연속상으로 잘 분산되며, 유화제의 사용을 통하거나 제형의 점도를 통해 이 형태로 유지된다. 에멀션을 안정화시키는 다른 수단은 에멀션의 어느 한 상으로 포함될 수 있는 유화제의 사용을 수반한다. 유화제는 합성 계면활성제, 자연발생적 유화제, 흡수 베이스 및 미세하게 분산된 고체의 4개 카테고리로 넓게 분류될 수 있다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199 참고).
표면 활성제라고도 알려진 합성 계면활성제는 에멀션의 제형에서 광범위한 적용가능성을 찾으며 문헌에서 검토되었다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY; Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p.199 참고). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이며 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성의 비율은 친수성/친지방성 균형(HLB)라고 칭하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는 데 있어서 가치있는 도구이다. 계면활성제는 친수성기의 성질에 기초하여 상이한 클래스로 분류될 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성, 및 양쪽성(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285 참고).
매우 다양한 비-에멀션화 물질이 또한 에멀션 제형에 포함되며, 에멀션의 특성에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 습윤제, 친수성 콜로이드, 보존제, 및 항산화제를 포함한다(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
피부, 경구, 및 비경구 경로를 통한 에멀션 제형 적용, 및 이들의 제조를 위한 방법은 문헌(예를 들어, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199] 참조)에 보고되어 있다.
ii. 마이크로에멀션
본 발명의 일 구현예에 있어서, iRNA 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀션으로 제형화된다. 마이크로에멀션은 단일 광학적 등방성이며 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 기름, 및 양친매성 물질의 시스템으로 정의될 수 있다(예컨대, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245 참고). 통상적으로 마이크로에멀션은 우선 오일을 수용성 계면활성제 용액에 분산시킨 후 일반적으로, 중간 사슬-길이 알코올인 제4 성분의 충분량을 첨가하여 투명 시스템을 형성하여 제조되는 시스템이다. 그러므로, 마이크로에멀션은 표면-활성 분자의 계면 필름에 의하여 안정화된 2개의 비혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 맑은 분산액으로 기술되었다(Leung 및 Shah, Controlled Release of Drugs에서: Polymers 및 Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215).
iii. 미세입자
본 발명의 iRNA는 입자, 예컨대, 미세입자 내로 포함될 수 있다. 미세입자는 스프레이-건조에 의하여 생성될 수 있지만, 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이 기법의 조합을 포함하는 기타 방법에 의하여 생성될 수도 있다.
iv. 침투 향상제
일 구현예에 있어서, 본 발명은 다양한 침투 향상제를 채용하여 동물의 피부에 핵산, 특히 iRNA를 효율적으로 전달한다. 대부분의 약물은 이온화 및 비이온화 형태 양쪽 모두로 용액 내에 존재한다. 그러나, 주로 지질 용해성 또는 친지방성 약물만이 세포막을 용이하게 관통한다. 비친지방성 약물조차 관통되는 막이 침투 향상제로 처리되면 세포막을 관통할 수 있다는 것을 알게 되었다. 세포막을 통과하여 비친지방성 약물의 확산을 돕는 것뿐만 아니라, 침투 향상제는 친지방성 약물의 투과도도 향상시킨다.
침투 향상제는 다섯 개의 광범위한 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(예컨대, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92 참고). 각각의 상기 언급된 부류의 침투 증진제 및 약학적 조성물의 제조에서의 이들의 용도 및 약학적 작용제의 전달은 당업계에 잘 알려져 있다.
v. 부형제
담체 화합물과 달리, "약학적 담체" 또는 "부형제"는 약학적으로 허용 가능한 용매, 현탁제, 또는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 임의의 기타 약리학적 불활성 비히클이다. 부형제는 고체 또는 액체일 수 있으며, 염두에 둔 계획된 투여 방식으로 핵산 및 주어진 약학적 조성물의 기타 구성성분과 조합되는 경우 요망되는 벌크, 컨시스턴시 등을 제공하도록 선택된다. 이러한 작용제는 당업계에 잘 알려져 있다.
vi. 기타 구성요소
본 발명의 조성물은 약학적 조성물에서 종래 발견되는 기타 부가 구성요소를 업계에 확립된 사용 수준에서 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 조성물은 예를 들면, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 소염제와 같은 추가의 양립 가능한 약학적으로 활성인 물질을 함유할 수 있거나, 염료, 풍미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제와 같이, 본 발명의 조성물의 다양한 투여형을 물리적으로 제형화하는 데 유용한 추가적인 물질을 함유할 수 있다. 그러나, 그러한 물질은 첨가되는 경우, 본 발명의 조성물의 구성성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다. 제형은 살균될 수 있으며, 원한다면, 제형의 핵산(들)과 유해하게 반응하지 않는, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 풍미제, 또는 방향 물질 등과 같은 보조제와 혼합될 수 있다.
수용성 현탁액은 예를 들면, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수도 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 특징인 약학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 및 (b) 비-iRNA 메커니즘에 의해 기능하며 AGT 연관 장애, 예컨대 고혈압의 치료에 유용한 하나 이상의 작용제를 포함한다.
그러한 화합물의 독성 및 예방적 효능은 예컨대, LD50(집단의 50%까지 치사하는 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 예방적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서 표준 약학적 절차에 의하여 결정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 투여량의 범위를 인간용으로 제형화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에서 특징된 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50, 바람직하게는 ED80 또는 ED90을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 채용된 투여형 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에서 특징된 방법에 사용된 임의의 화합물에 대하여, 예방적 유효 용량은 세포 배양 분석법으로부터 최초로 추정될 수 있다. 용량은, 상기 화합물의 순환 혈장 농도 범위, 또는 적절한 경우 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도) 또는 더 높은 수준의 억제를 포함하는 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록(예컨대, 감소된 농도의 폴리펩티드를 달성) 동물 모델 내에서 제형화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
이의 투여에 부가하여, 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 특징인 iRNA는 AGT 연관 장애, 예컨대 고혈압의 방지 또는 치료를 위해 사용되는 다른 알려진 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 임의의 경우, 투여 의사는 업계에 알려지거나 본원에 기술된 유효성의 표준 측정을 사용하여 관찰된 결과를 기준으로 iRNA의 투여량 및 투여 시점을 조정할 수 있다.
VI. AGT 발현을 억제하는 방법
본 발명은 또한 세포에서 AGT 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 세포를 세포에서 AGT 발현을 억제하기 효과적인 양의 RNAi 작용제, 예컨대, 이중 가닥 RNA 작용제와 접촉시켜 세포에서 AGT 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
세포와 iRNA, 예컨대, 이중 가닥 RNA 작용제의 접촉은 시험관 내 또는 생체 내 수행될 수 있다. 생체 내 세포의 iRNA와의 접촉은 대상체, 예컨대, 인간 대상체 내의 세포 또는 세포군과 iRNA의 접촉을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내 세포 접촉 방법의 조합도 가능하다. 세포의 접촉은 상기 논의된 바와 같이 직접적이거나 간접적일 수 있다. 또한, 세포의 접촉은 본원에 기술되거나 업계에 알려진 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예컨대 GalNAc3 리간드, 또는 RNAi 작용제를 관심 부위로 보내는 임의의 다른 리간드이다.
본원에 사용된 "억제하는"이라는 용어는 "감소시키는", "침묵화하는", "하향조절하는", "저해하는" 및 기타 유사 용어와 교환 가능하게 이용되며, 임의의 수준의 억제를 포함한다.
"AGT의 발현을 억제하는"이라는 어구는 AGT 유전자의 변이체 또는 돌연변이체뿐만 아니라 임의의 AGT 유전자(예컨대, 마우스 AGT 유전자, 생쥐 AGT 유전자, 원숭이 AGT 유전자, 또는 인간 AGT 유전자)의 발현의 억제를 지칭하려는 것이다. 따라서, AGT 유전자는 유전적으로 조작된 세포, 세포군, 또는 유기체의 맥락에서 야생형 AGT 유전자, 돌연변이체 AGT유전자, 또는 트랜스제닉 AGT 유전자일 수 있다.
"AGT 유전자의 발현을 억제하는"은 AGT 유전자의 임의의 수준의 억제, 예컨대, AGT 유전자의 발현의 적어도 부분적 저해를 포함한다. AGT 유전자의 발현은 AGT 유전자 발현과 연관된 임의의 변수의 수준, 또는 수준 변화, 예컨대, AGT mRNA 수준 또는 AGT 단백질 수준을 기준으로 평가될 수 있다. 상기 수준은, 예를 들면, 대상체로부터 유래되는 표본을 포함하는 개별 세포 또는 세포군에서 평가될 수 있다. AGT는 주로 간에서뿐만 아니라, 뇌, 담낭, 심장 및 신장에서도 발현되고, 순환하며 존재함이 이해된다.
억제는 대조군 수준 대비 AGT 발현과 연관된 하나 이상의 변수의 절대 또는 상대 수준의 감소에 의해 평가될 수 있다. 대조군 수준은 업계에 활용되는 임의의 형태의 대조군 수준, 예컨대, 투여전(pre-dose) 기저 수준, 또는(예컨대, 완충제 유일 대조군 또는 불활성 작용제 대조군과 같은) 대조군으로 처리 또는 미처리된 유사한 대상체, 세포 또는 표본으로부터 결정된 수준일 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에 있어서, AGT 유전자의 발현은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼, 또는 검정의 검출 수준 미만까지 억제된다. 바람직한 구현예에 있어서, AGT 유전자의 발현은 적어도 70%만큼 억제된다. 다른 조직, 예컨대 뇌에서 발현의 유의미한 억제 없이, 특정 조직, 예컨대 간에서의 AGT 발현의 억제가 요망될 수 있음이 추가로 이해된다. 바람직한 구현예에 있어서, 발현 수준은 적절한 종이 매칭된 세포주에서 10 nM siRNA 농도로 실시예 2에서 제공된 검정 방법을 사용하여 결정된다.
특정 구현예에 있어서, 생체 내 발현의 억제는, 예컨대, RNA 발현의 최하점에서 3 mg/kg의 단회 용량으로 투여되는 경우, 인간 유전자를 발현하는 설치류, 예컨대, 인간 표적 유전자(즉, AGT)를 발현하는 AAV-감염 마우스에서 인간 유전자의 녹다운에 의해 결정된다. 모델 동물 시스템에서 내인성 유전자의 발현 녹다운도, 예컨대 RNA 발현의 최하점에서 3 mg/kg의 단회 용량의 투여 후, 결정될 수 있다. 이러한 시스템은 인간 iRNA가 모델 동물 유전자의 효과적인 녹다운을 제공하도록 인간 유전자 및 모델 동물 유전자의 핵산 서열이 충분히 가까운 경우 유용하다. 간에서의 RNA 발현은 실시예 2에 제공된 PCR 방법을 사용하여 결정된다.
AGT 유전자의 발현의 억제는 제1 세포 또는 세포군과 실질적으로 동일하지만, 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포군(iRNA로 처리되지 않거나 관심 유전자에 표적화된 iRNA로 처리되지 않은 대조군 세포(들))과 비교하여, AGT 유전자가 전사되고 AGT 유전자의 발현이 억제되도록 처리된(예컨대, 세포 또는 세포들을 본 발명의 iRNA와 접촉시켜, 또는 본 발명의 iRNA를 세포가 존재하거나 존재했던 대상체에 투여하여) 제1 세포 또는 세포군(그러한 세포는, 예를 들면 대상체로부터 유래된 표본에 존재할 수 있음)에 의해 발현된 mRNA의 양의 감소에 의하여 표시될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 억제는 종이 매칭된 세포주에서 10 nM siRNA 농도를 사용하고 대조군 세포에서의 mRNA 수준의 백분율로서 처리된 세포에서의 mRNA 수준을 하기 식을 사용하여 표현하는 실시예 2에서 제공된 방법에 의해 평가된다:
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다른 구현예에 있어서, AGT 유전자의 발현 억제는 AGT 유전자 발현과 기능적으로 연관된 매개변수, 예컨대, 대상체로부터의 혈액 또는 혈청에서의 AGT 단백질 수준의 감소의 관점에서 평가될 수 있다. AGT 유전자 침묵화는 내인성으로 또는 발현 컨스트럭트로부터 이종성으로 AGT를 발현하는 임의의 세포에서, 업계에 알려진 임의의 검정에 의해 결정될 수 있다.
AGT 단백질의 발현 억제는 세포 또는 세포군에서 또는 대상체 표본에서 발현되는 AGT 단백질의 수준(예컨대, 대상체로부터 유래된 혈액 표본에서의 단백질 수준)의 감소에 의해 표시될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, mRNA 억제의 평가를 위해, 처리된 세포 또는 세포군에서 단백질 발현 수준의 억제는 대조군 세포 또는 세포군에서 단백질 수준의 백분율로서, 또는 대상체 표본, 예컨대, 혈액 또는 이로부터 유래된 혈청에서의 단백질 수준의 변화로 유사하게 표현될 수 있다.
AGT 유전자의 발현 억제를 평가하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포, 세포군, 또는 대상체 표본은 아직 본 발명의 RNAi 작용제와 접촉된 바 없는 세포, 세포군, 또는 대상체 표본을 포함한다. 예를 들면, 대조군 세포, 세포군, 또는 대상체 표본은 RNAi 작용제로의 대상체 처리 전에 개별 대상체(예컨대, 인간 또는 동물 대상체) 또는 적절히 매칭된 집단 대조군으로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포군에 의해 발현되는 AGT mRNA의 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 표본에서 AGT의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 일부, 예컨대, AGT 유전자의 mRNA를 검출하여 결정된다. RNA는, 예를 들면, 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNeasy™ RNA 제조 키트(Qiagen®) 또는 PAXgene™(PreAnalytix™, Switzerland)을 사용하는 것을 포함하는 RNA 추출 기법을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 혼성화를 활용하는 통상적인 검정 포맷은 핵 런-온 검정, RT-PCR, RNaze 보호 검정, 노던 블로팅, 원 위치 혼성화, 및 마이크로어레이 분석을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, AGT의 발현 수준은 핵산 탐침을 사용하여 결정된다. 본원에 사용된 "탐침"이라는 용어는 특정 AGT에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 탐침은 당업자에 의해 합성될 수 있거나, 적절한 생물학적 제조물로부터 유도될 수 있다. 탐침은 표지되도록 구체적으로 설계될 수 있다. 탐침으로서 활용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체, 및 유기 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석 및 탐침 어레이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 혼성화 또는 증폭 검정에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 결정을 위한 하나의 방법에는 분리된 mRNA를 AGT mRNA와 혼성화할 수 있는 핵산 분자(탐침)와 접촉시키는 단계가 관여된다. 일 구현예에 있어서, mRNA는, 예를 들면 분리된 mRNA를 아가로스 겔 상에 걸고 mRNA를 겔로부터 막, 예컨대 니트로셀룰로스로 전달함으로써 고체 표면 상에서 고정화되고 탐침과 접촉된다. 대안적인 구현예에 있어서, 탐침(들)은 고체 표면 상에 고정화되고, mRNA는, 예를 들면, Affymetrix® 유전자 칩 어레이에서 탐침(들)과 접촉된다. 당업자는 AGT mRNA 수준의 결정에서 사용하기 위해 알려진 mRNA 검출 방법을 쉽게 적용할 수 있다.
표본에서 AGT의 발현 수준을 결정하는 대안적인 방법에는 예를 들면 RT-PCR(Mullis, 1987, 미국 특허 번호 4,683,202호에 나타낸 실험적 구현예), 리가아제 연쇄 반응(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자가 지속 서열 복제(Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 복제효소(Lizardi 등 (1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 써클 복제(Lizardi 등, 미국 특허 번호 5,854,033호) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 표본에서, 예를 들어 mRNA의 핵산 증폭 또는 역전사효소(cDNA를 제조하기 위한) 공정에 이어서 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하는 증폭된 분자의 검출이 관여된다. 이들 검출 방식은 특히 이러한 분자가 매우 소수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 유용하다. 본 발명의 특정 구현예에 있어서, AGT의 발현 수준은 정량적 형광성 RT-PCR(즉, TaqMan™ System)에 의해 결정된다. 바람직한 구현예에 있어서, 발현 수준은 종이 매칭된 세포주에서 10 nM siRNA 농도를 사용하여 실시예 2에서 제공된 방법에 의해 결정된다.
AGT mRNA의 발현 수준은(예컨대 혼성화 분석, 예컨대 노던, 서던, 도트 등에서 사용되는) 막 블롯, 또는 마이크로웰, 표본 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934호를 참고한다. AGT 발현 수준의 결정은 또한 용액에서 핵산 탐침을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에 있어서, mRNA 발현 수준은 분지형 DNA(bDNA) 검정 또는 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 평가된다. 이들 방법의 사용은 본원에 제시된 실시예에 기술되고 예시된다. 바람직한 구현예에 있어서, 발현 수준은 종이 매칭된 세포주에서 10 nM siRNA 농도를 사용하여 실시예 2에서 제공된 방법에 의해 결정된다.
AGT 단백질 발현의 수준은 단백질 수준의 측정을 위해 업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 그러한 방법은, 예를 들면, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 고확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광측정, 비색 검정, 분광측정 검정, 유세포 측정, 면역확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블로팅, 방사선면역검정(RIA), 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 전기화학발광 검정 등을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 본 발명의 방법에서의 유효성은 AGT mRNA 또는 단백질 수준의 감소에 의해 평가된다(예컨대, 간 생검에서).
본 발명의 방법의 일부 구현예에 있어서, iRNA는 iRNA가 대상체 내의 특정 부위로 전달되도록 대상체에 투여된다. AGT의 발현 억제는 대상체 내의 특정 부위로부터의 유체 또는 조직(예컨대, 간 또는 혈액)에서 유래된 표본에서 AGT mRNA 또는 agt 단백질의 수준 또는 수준 변화의 측정을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에 사용된 분석물질의 수준 검출 또는 결정이라는 용어는 물질, 예컨대 단백질, RNA가 존재하는지를 결정하기 위한 단계를 수행함을 의미하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같은 검출하는 또는 결정하는 방법은 사용된 방법에 대한 검출 수준 미만인 분석물질 수준의 검출 또는 결정을 포함한다.
VII. 발명의 예방 및 치료 방법
본 발명은 또한 본 발명의 iRNA를 사용하는 방법 또는 AGT의 발현을 억제하여 AGT 연관 장애, 예를 들어, 고혈압, 예를 들어, 고혈압증을 예방하거나 치료하는 본 발명의 iRNA를 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체내에서 siRNA와 접촉될 수 있다. 즉, 세포는 대상체 내에 있을 수 있다.
본 발명의 방법을 이용한 치료에 적합한 세포는 AGT 유전자를 발현하는 임의의 세포, 예를 들어, 간 세포, 뇌 세포, 담낭 세포, 심장 세포, 또는 신장 세포일 수 있지만, 바람직하게는 간 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 세포는 포유류 세포, 예를 들어, 영장류 세포(예컨대, 키메라 비-인간 동물에서의 인간 세포를 포함하는 인간 세포, 또는 비-인간 영장류 세포, 예를 들어, 원숭이 세포 또는 침팬지 세포), 또는 비-영장류 세포일 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 간 세포이다. 본 발명의 방법에서, AGT 발현은 세포에서 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95로, 또는 검정의 검출 수준보다 낮은 수준으로 억제된다.
본 발명의 생체 내 방법은 대상체에 iRNA를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 iRNA는 RNAi 작용제가 투여될 포유류의 AGT 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 조성물은 두개 내(예컨대, 뇌실 내, 뇌실질 내 및 척수강 내), 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 직장 및(볼 및 설하를 포함하여) 국소 투여를 포함하여, 경구, 복강 내 또는 비경구 경로를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 업계에 알려진 임의의 수단에 의하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 조성물은 정맥 내 주입 또는 주사에 의하여 투여된다. 특정 구현예에 있어서, 조성물은 피하 주사에 의하여 투여된다. 특정 구현예에 있어서, 조성물은 근육 내 주사에 의하여 투여된다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 또한 포유류에서 AGT 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 포유류의 세포에서 AGT 유전자를 표적화하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 포유류에 투여하는 단계 및 AGT 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 수득하기 충분한 시간 동안 포유류를 유지하여 세포에서 AGT 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 유전자 발현의 감소는 업계에 알려진 임의의 방법에 의해, 그리고 본원에, 예컨대 실시예 2에 기술된 qRT-PCR과 같은 방법에 의해 평가될 수 있다. 단백질 생산의 감소는 업계에 알려진 임의의 방법, 예컨대 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 천자 간 생검 표본은 AGT 유전자 또는 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로 작용한다. 다른 구현예에 있어서, 혈액 표본은 agt 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 대상체 표본으로 작용한다.
본 발명은 추가로 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대, 고혈압으로 진단받은 대상체에서의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 이를 필요로 하는 대상체에서의 예방 방법을 제공한다. 본 발명의 치료 방법은 AGT 유전자를 표적화하는 iRNA 또는 AGT 유전자를 표적화하는 iRNA를 포함하는 약학적 조성물의 예방적 유효량으로, 대상체, 예컨대, AGT 발현의 감소로 이득을 얻을 대상체에 본 발명의 iRNA를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 iRNA는 "유리 iRNA"로서 투여될 수 있다. 유리 iRNA는 약학적 조성물의 부재 하에서 투여된다. 드러난(naked) iRNA는 적합한 완충 용액 내에 있을 수 있다. 완충 용액은 아세트산염, 시트르산염, 프롤라민, 탄산염, 또는 인산염, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 완충 용액은 인산염 완충 식염수(PBS)이다. iRNA를 함유하는 완충 용액의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 투여하기에 적합하도록 조정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 iRNA는 dsRNA 리포좀 제형과 같이 약학적 조성물로서 투여될 수 있다.
AGT 유전자 발현의 억제로 이득을 보게 되는 대상체는 고혈압증에 취약하거나 이로 진단받은 대상체이다.
일 구현예에 있어서, 방법은 표적 AGT 유전자의 발현이, 예컨대, 용량당 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1개월 내지 6개월, 1개월 내지 3개월, 또는 3개월 내지 6개월 동안 감소되도록 본원에서 특징되는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 조성물은 3개월 내지 6개월 마다 1회 투여된다.
바람직하게는, 본원에서 특징으로 하는 방법 및 조성물에 유용한 iRNA는 표적 AGT 유전자의 RNA(일차 또는 가공)를 특이적으로 표적화한다. iRNA를 사용하여 이러한 유전자들의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 iRNA의 투여는 AGT 연관 장애, 예를 들어, 고혈압, 예를 들어, 고혈압증의 예방 또는 치료를 야기할 수 있다. 다양한 유형의 고혈압에 대한 진단 기준은 하기에서 제공된다.
대상체는 치료량, 예컨대, 약 0.01 mg/kg 내지 약 200 mg/kg의 iRNA이 투여될 수 있다.
iRNA는 바람직하게는 피하로, 즉, 피하 주사에 의해 투여된다. 하나 이상의 주사는 요망되는 용량의 iRNA를 대상체에게 전달하기 위해 사용될 수 있다. 주사는 소정 기간에 걸쳐 반복될 수 있다.
투여는 정기적으로 반복될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 최초 치료 요법 후, 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 반복-용량 계획은 정기적으로, 예컨대, 개월 당 1회 내지 연 1회 치료량의 iRNA의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, iRNA는 약 개월 당 1회 내지 약 3개월 마다 1회, 또는 약 3개월 마다 1회 내지 약 6개월 마다 1회 투여된다.
VIII. 고혈압증에 대한 진단 기준, 위험 요소, 및 치료
최근 고혈압증의 예방 및 치료를 위한 실행 지침이 개정되었다. 광범위한 보고가 Reboussin 등(Systematic Review for the 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol.　2017 Nov 7. pii: S0735-1097(17)41517-8. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.004.) 및 Whelton 등(2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 2017 Nov 7. pii: S0735-1097(17)41519-1. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.006.)에 의해 공개되었다. 새로운 지침의 일부 주요 내용은 하기에서 제공된다. 그러나, 이러한 지침은 본 출원의 출원 시점에 고혈압증에 대한 진단 및 모니터링 기준과 치료에 관한 당업자의 지식을 제공하는 것으로 이해되어야 하며, 본원에 참조로 포함된다.
A. 진단 기준
혈압 상승과 심혈관 질환 위험 증가 간에는 끊임없는 연관성이 존재하지만 임상 및 공중 보건 의사 결정을 위해 혈압 수준을 분류하는 것이 유용하다. 혈압은 건강관리 환경에서 측정된 평균 혈압(오피스 압력)을 기준으로 4단계로 분류될 수 있다: 하기 표에 나타나 있는 바와 같이 정상, 고혈압 전단계, 및 1단계 또는 2단계 고혈압(문헌[Whelton et al., 2017]로부터).
Figure pct00081
혈압은 2회 이상으로 얻어진 평균 2회 이상의 신중한 판독에 기초한 혈압을 지시한다. 신중한 혈압 판독을 얻기 위한 모범적인 실행은 문헌[Whelton et al., 2017]에 상세하게 나타나 있으며, 당업계에 알려져 있다.
이러한 범주화는 JNC 7 보고(Chobanian et al; the National High Blood Pressure Education Program Coordinating Committee. Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Hypertension. 2003;42:1206-52)에서 이전에 권장된 것과 다른데, 1단계 고혈압은 이제 130 내지 139의 수축기 혈압(SBP) 또는 80 mm Hg 내지 89 mm Hg의 이완기 혈압(DBP)으로 규정되고, 본 문헌에서의 2단계 고혈압은 JNC 7 보고에서의 1단계 및 2단계에 상응한다. 이러한 범주에 대한 근거는 SBP/DBP와 심혈관 질환 위험 간의 연관성, 혈압을 낮추기 위한 생활방식 변형에 대한 무작위 임상 시험, 및 심혈관 질환을 예방하기 위한 항고혈압 약제로의 치료에 대한 무작위 임상 시험과 관련된 관찰 데이터를 기초로 한다.
2단계 고혈압이 있는 성인들 사이에 심혈관 질환의 위험 증가는 잘 확립되어 있다. 점점 더 많은 개별 연구와 관찰 데이터의 메타-분석에서 정상 혈압에서 고혈압 전단계 및 1단계 고혈압으로 진행됨에 따라 점진적으로 더 높은 심혈관 질환 위험의 증감이 보고되었다. 이러한 다수의 메타-분석에서, 관상 동맥 심장 질환 및 뇌졸중의 위험 비율은 120-129/80-84 mm Hg 대 120/80 mm Hg 미만의 SBP/DBP 비교의 경우 1.1 내지 1.5, 및 130-139/85-89 mm Hg 대 120/80 mm Hg 미만의 SBP/DBP 비교의 경우 1.5 내지 2.0이다. 이러한 위험 증감은 성별 및 인종/민족성으로 규정된 하위그룹에 걸쳐 일관된다. 혈압 상승과 관련된 심혈관 질환 위험의 상대적 증가는 약화되었지만 노인들 사이에서는 여전히 존재한다. 고혈압 전단계 및 1단계 및 2단계 고혈압이 있는 개인들에게는 생활방식 변형 및 약리학적 항고혈압 치료가 권장된다. 치료에 의해 혈압이 정상화되지 않더라도 고혈압 단계 감소에 의해 임상적 유용성이 얻어질 수 있다.
B. 위험 요소
고혈압은 유전성, 생활방식, 식이, 및 2차 위험 요소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 요소들의 조합으로부터 초래되는 복합 질환이다. 고혈압은 또한 임신과 관련이 있을 수 있다. 고혈압의 복합적인 성질로 인해 고혈압의 치료에는 여러 개입이 필요할 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 식이 및 생활방식의 변형을 포함하여 비-약리학적 개입은 고혈압의 예방 및 치료에 유용할 수 있다. 추가로, 개입은 개인의 혈압을 완전히 정상화하지 않고도 임상적 유용성을 제공할 수 있다.
1. 유전적 위험 요소
단일-유전자 돌연변이가 고혈압의 생리를 충분히 설명하는, 글루코코르티코이드-치료 가능 알도스테론증, 리들 증후군(Liddle's syndrome), 고든 증후군(Gordon's syndrome) 등과 같은 여러 단일유전자 형태의 고혈압이 확인되었으며, 이러한 장애들은 희귀하다. 혈압과 고혈압에 기여하는 알려진 유전적 변이형의 현재 목록은 25개 초과의 희귀 돌연변이와 120개의 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함한다. 그러나, 일부 개인에서 유전적 요소가 고혈압에 기여할 수 있더라도, 유전적 변이는 혈압 변이의 단지 약 3.5%만을 차지하는 것으로 추정된다.
2. 식이 및 알코올 섭취
고혈압을 유발하는 일반적인 환경 및 생활방식 위험 요소는 불량한 식이, 신체 활동 부족, 및 알코올 과잉 섭취를 포함한다. 이러한 요소들은 사람이 과체중 또는 비만이 되게 하여, 고혈압이 발생하거나 악화될 가능성을 더 증가시킬 수 있다. 혈압 상승은 허리-대-엉덩이 비율 증가 또는 기타 주요 지방 분포 측정과 훨씬 더 강력한 연관성이 있다. 아동기 비만 및 진행성 비만은 삶에서 노년 고혈압과 강력한 연관성이 있다. 정상 체중에 도달하면 고혈압의 발생 위험을 비만인 적이 전혀 없었던 사람의 것으로 감소시킬 수 있다.
나트륨, 칼륨, 마그네슘, 및 칼슘의 섭취는 또한 혈압에 유의한 영향을 미칠 수 있다. 나트륨 섭취는 혈압과 양의 상관관계에 있으며 노화-관련 혈압 상승의 많은 부분을 설명한다. 특정 그룹은 흑인 및 노인(65세 이상)이 있는 다른 그룹, 및 더 높은 수준의 혈압 또는 동반질환, 예컨대, 만성 신장 질환, 진성 당뇨병, 또는 대사 증후군이 있는 그룹보다 나트륨 섭취 증가에 더 취약하다. 종합하면, 이러한 그룹들은 미국 성인의 절반 이상을 구성한다. 염 민감성은 혈압과 관계없이 심혈관 질환 및 전 원인 사망률의 증가에 대한 지표일 수 있다. 현재, 염 민감도의 인지를 위한 기술은 임상 환경에서 실용적이지 않다. 따라서, 염 민감성은 그룹 특징으로 가장 잘 고려된다.
칼륨 섭취는 혈압 및 뇌졸중에 반비례하며, 칼륨의 수준이 높을수록 혈압에 대한 나트륨의 영향이 둔화되는 것으로 보인다. 더 낮은 나트륨-칼륨 비율은 단독의 상응하는 나트륨 또는 칼륨 수준에 대해 언급되는 것보다 더 낮은 혈압과 관련된다. 심혈관 질환의 위험에 대해서도 유사한 관찰이 있었다.
알코올 섭취는 오랫동안 고혈압과 관련되어 왔다. 미국에서, 알코올 섭취는, 여성보다 남성에서 부담이 더 크게, 고혈압 인구 부담의 약 10%를 차지하는 것으로 추정되었다.
식이 또는 알코올 섭취의 변화는 고혈압의 예방 또는 치료의 한 양상일 수 있는 것으로 이해된다.
3. 신체 활동
신체 활동/신체 적성과 혈압 수준 간에는 잘 확립된 역 상관관계가 존재한다. 적당한 수준의 신체 활동도 고혈압 감소에 유익한 것으로 입증되었다.
신체 활동의 증가는 고혈압의 예방 또는 치료의 한 양상일 수 있는 것으로 이해된다.
4. 속발성 위험 요소
속발성 고혈압은 중증의 혈압 상승, 약리학적 저항 고혈압, 급성 고혈압 발병, 선행하여 약물 요법으로 고혈압이 조절되는 환자의 혈압 상승, 노인의 이완기 고혈압 발병, 및 고혈압의 기간 또는 중증도에 불균형한 표적 기관 손상에 기초할 수 있다. 속발성 고혈압은 혈압 상승이 있는 젊은 환자(30세 미만의 연령)에서 의심될 것이나, 원발성 고혈압이 어린 나이, 특히, 흑인에서 나타나는 것은 특이한 것이 아니며, 일부 형태의 속발성 고혈압, 예컨대, 신혈관 질환은 노인(65세 이상의 연령)에게서 더 흔하다. 속발성 고혈압의 다수 원인은 특정 장애를 시사하는 임상 소견 또는 소견의 그룹과 강력한 관련이 있다. 그러한 경우, 기저 질환의 치료는 고혈압 치료에 전형적으로 사용되는 작용제를 투여하지 않으면서 혈압 상승의 소견을 해소할 수 있다.
5. 임신
임신은 고혈압의 위험 요소이고, 임신 중 고혈압은 노년의 심혈관 질환 및 고혈압의 위험 요소이다. 임신 관련 고혈압증에 대한 보고는 2013년에 미국 산부인과 대학(ACOG)(American College of Obstetricians and Gynecologists, Task Force on Hypertension in Pregnancy. Hypertension in pregnancy. Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists' Task Force on Hypertension in Pregnancy. Obstet Gynecol. 2013;122:1122-31)에 의해 공개되었다. 보고의 일부 주요 내용은 하기에서 제공된다. 그러나, 보고는 본 출원의 출원 시점에 임신 중 고혈압에 대한 진단 및 모니터링 기준과 치료에 관한 당업자의 지식을 제공하는 것으로 이해되어야 하며, 본원에 참조로 포함된다.
자간전증에 대한 진단 기준은 하기 표에서 제공된다(ACOG 보고, 2013의 표 1로부터).
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임신 중 혈압 관리는 ACE 억제제 및 ARB를 포함하여 다수의 흔히 사용되는 항고혈압제가 태아에 대한 잠재적인 위험으로 인해 임신 중에 금기된다는 사실로 인해 어렵다. 임신 중 항고혈압 치료의 목표는 중증 고혈압의 예방 및 출산 전 태아에게 성숙을 위해 더 많은 시간을 허용하도록 임신 연장의 가능성을 포함한다. 임신-관련 중증 고혈압에 대한 치료의 검토에는 특정 작용제를 권장하기에 충분한 증거가 확인되지 않았고; 오히려, 이러한 환경에서는 임상의 경험이 권장되었다(Duley L, Meher S, Jones L. Drugs for treatment of very high blood pressure during pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 2013;7:CD001449.).
C. 치료
고혈압의 치료는 흔히 신장 기능 저하를 포함하여 다른 동반질환(이에 대하여 대상체가 또한 치료를 받을 수 있음)과 함께 빈번하게 존재하기 때문에 복잡하다. 고혈압이 있는 성인을 관리하는 임상의는 특히 향후 부정적인 심혈관 질환 결과의 위험을 줄이는 데 중점을 두면서 전반적인 환자 건강에 초점을 맞춰야 한다. 모든 환자 위험 요인은 포괄적인 비약리학적 및 약리학적 전략 세트와 통합된 방식으로 관리되어야 한다. 환자의 혈압과 향후 심혈관 질환 사례의 위험성이 증가함에 따라, 혈압 관리가 강화되어야 한다.
혈압 수준만을 토대로 한 혈압-강하 약제로 고혈압을 치료하는 것은 비용 효율적인 것으로 여겨지지만, 절대 심혈관 질환 위험과 혈압 수준을 조합하여 이용하여 그러한 치료를 유도하는 것이 보다 효율적이며, 심혈관 질환의 위험을 감소시키는 데 있어서 혈압 수준만을 이용하는 것에 비해 보다 비용 효율적이다. 단일 작용제로 시작한 다수 환자들은 후속적으로 이들의 혈압 목표치에 이르기 위해 상이한 약리학적 부류로부터 2개 이상의 약물을 필요로 할 것이다. 각 작용제의 약리학적 기전을 아는 것이 중요하다. 보완적 활성이 있는 약물 요법은, 제2 항고혈압제가 첫 작용제에 대한 보완 반응을 차단하거나 상이한 승압 기전에 영향을 주기 위해 사용되는 경우, 혈압의 추가 강하를 야기할 수 있다. 예를 들어, 티아자이드 이뇨제는 레닌-안지오텐신-알도스테론계를 자극할 수 있다. 티아자이드에 ACE 억제제 또는 ARB를 첨가함으로써, 추가 혈압 강하 효과가 얻어질 수 있다. 조합 요법의 이용이 또한 순응도를 향상시킬 수 있다. 항고혈압 약물 요법의 몇 가지 2회 및 3회 고정 용량 약물 조합이 성분들 간의 보완적인 작용 기전으로 이용 가능하다.
경구 항고혈압 약물을 열거한 문헌[Whelton et al. 2017]으로부터의 표 18이 하기에서 제공된다. 고혈압 치료용 치료제 부류 및 그러한 부류 내에 속하는 약물이 제공된다. 용량 범위, 빈도, 및 코멘트가 또한 제공된다.
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Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용되는 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 전체 내용, 뿐만 아니라 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1. iRNA 합성
시약의 출처
시약의 출처가 본원에서 구체적으로 주어지지 않은 경우에, 그러한 시약은 분자 생물학에서 응용을 위해 품질/순도 표준으로 분자 생물학에 대한 시약의 임의의 공급자로부터 얻을 수 있다.
siRNA 설계
인간 AGT 유전자(인간: NCBI refseqID NM_000029.3; NCBI 유전자ID: 183)를 표적화하는 일련의 siRNA를 커스텀 R 및 피톤(Python) 스크립트를 사용하여 설계하였다. 인간 NM_000029 REFSEQ mRNA, 버전 3은 2587개 염기의 길이를 가졌다.
미변형 AGT 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 상세한 목록은 표 3에 나타나 있다. 변형 AGT 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 상세한 목록은 표 5에 나타나 있다.
siRNA 합성
siRNA를 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용하여 합성하고 어닐링하였다.
실시예 2. 시험관내 스크리닝 방법
세포 배양 및 384-웰 형질감염
Hep3B 세포(ATCC, 매너서스, VA)를 37℃, 5% CO2의 분위기에서, 10% FBS(ATCC)가 보충된 이글의 최소 필수 배지(Gibco)에서 거의 포화상태로 성장시킨 다음, 트립신으로 처리하여 플레이트에서 떼어내었다.
웰 당 4.9 μl의 Opti-MEM + 0.1 μl의 리포펙타민 RNAiMax(Invitrogen, 칼즈배드 CA. cat # 13778-150)를, 384-웰 플레이트에서 개별 웰에 5 μl의 각 siRNA 듀플렉스에 첨가함으로써 형질감염을 수행하였다. 혼합물을 이후 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 5,000 개 Hep3B 세포를 함유하는 50 μl의 완전 성장 배지를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포를 24 시간 동안 인큐베이션한 후, RNA 정제하였다. 단일 용량 실험은 10 nM 및 0.1 nM의 최종 듀플렉스 농도에서 수행하고, 용량 반응 실험은 10 nM 내지 37.5 fM 범위에 걸쳐 8-점 6-배 연속 희석을 이용하여 수행하였다.
AGT mRNA를 표적화하는 추가 dsRNA 작용제는 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO 2015/179724에 기재되어 있다.
DYNABEADS mRNA 분리 키트(Invitrogen™, 파트 #: 610-12)를 사용한 총 RNA 분리
세포를 웰 당 3 uL의 비드를 함유하는 75 μl의 용해/결합 완충액에 용해시키고, 정전기적 진탕기 상에서 10분 동안 혼합하였다. 자기 플레이트 지지체를 이용하여 Biotek EL406 상에서 세척 단계를 자동화시켰다. 비드를 세척 간 흡입 단계로, 완충액 A에서 1회, 완충액 B에서 1회, 그리고 완충액 E에서 2회 세척하였다(90 μL에서). 최종 흡입 후, 후술되는 바와 같이, 완료된 10 μL의 RT 혼합물을 각 웰에 첨가하였다.
ABI 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, 포스터 시티, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성:
반응 당 1 ul 10X 완충액, 0.4 μl 25X dNTP, 1 μl 랜덤 프라이머, 0.5 μl 역전사효소, 0.5 μl RNAse 억제제 및 6.6 μl H2O의 마스터 믹스(master mix)를 웰 마다 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 정전기적 진탕기 상에서 10분 동안 진탕한 뒤, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 여기에 이어서, 플레이트를 8분 동안 80℃에서 진탕하였다.
실시간 PCR:
384 웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)에서 웰 당 0.5 μl 인간 GAPDH TaqMan 탐침(4326317E), 0.5 μl 마우스 AGT(Hs00174854m1), 2 μl 뉴클레아제-비함유 물 및 5 μl Lightcycler 480 탐침 마스터 믹스(Roche Cat # 04887301001)를 함유하는 마스터 믹스에 2 μl의 cDNA를 첨가하였다. 실시간 PCR은 LightCycler480 실시간 PCR 시스템(Roche)에서 수행하였다.
상대 배수 변화(relative fold change)를 계산하기 위해, 데이터를 △△Ct 방법을 이용해서 분석하고, 10 nM AD-1955로 형질감염된 세포, 또는 mock 형질감염된 세포로 수행한 분석법에 대해 정상화(normalization)하였다. IC50은 XLFit를 이용해 4개의 파라미터 피트 모델을 사용해 계산하고, AD-1955로 형질감염되거나 mock-형질감염된 세포로 정상화하였다. AD-1955의 센스 및 안티센스 서열은 다음과 같다: 센스: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO:19) 및 안티센스 UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO: 20). 스크리닝으로부터의 결과는 표 4에 나타나 있다.
[표 2]
핵산 서열 표현에 사용된 뉴클레오티드 단량체의 약어. 이러한 단량체들은, 올리고뉴클레오티드에 존재하는 경우, 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결된다는 것이 이해될 것이다.
Figure pct00088
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[표 3]
AGT dsRNA 작용제의 비변형 센스 및 안티센스 가닥 서열
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[표 4]
Hep3B 세포에서 AGT 단일 10 nM 및 0.1 nM 용량 스크린
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[표 5]
hAGT dsRNA 작용제의 변형 센스 및 안티센스 가닥 서열
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[표 6]
hAGT dsRNA 작용제의 추가 변형 센스 및 안티센스 가닥 서열
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실시예 3. 인간 AGT를 발현하는 AAV로 형질도입된 마우스에서 dsRNA 듀플렉스의 생체내 스크리닝
인간 안지오텐시노젠을 발현하기 위해, C57/BL6 마우스를 먼저 인간 AGT 전사물을 발현하는 AAV(아데노-관련 바이러스) 벡터로 형질도입하였다. AAV 도입으로부터 적어도 2주 후, 기준 순환 인간 AGT 수준에 대해 마우스로부터 혈액을 얻은 다음, 동물에게 표 5 및 표 6에 제공된 dsRNA 작용제의 서브세트 중 하나의 단일 3 mg/kg 용량을 제공하였다(그룹 당 N = 3). dsRNA 작용제의 투여 후 14일째에 동물로부터 다시 혈액을 얻었다. 인간 AGT 수준을 제조업체의 프로토콜(IBL America #27412)에 따라 인간 안지오텐시노젠에 특이적인 ELISA를 이용하여 정량화하였다. 데이터를 기준 값의 퍼센트로 표현하고, 평균과 표준 편차의 합으로 나타냈다. 특정 dsRNA 듀플렉스를 추가 분석을 위해 선택하였다.
[표 7]
AAV-인간 AGT 형질도입 마우스에서 AGT 단일 3 mg/kg 용량 스크린
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실시예 4. 시노몰구스 원숭이에서 dsRNA 듀플렉스의 생체내 스크리닝
상기 마우스 연구에서 확인된 관심 대상의 듀플렉스를 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 동물(그룹 당 N= 3)에게 1일째에 단일 3 mg/kg 피하 용량의 dsRNA 작용제(AD-85481, AD-126306, AD-126307, AD-126308, 또는 AD-133362)를 제공하였다. 투여 -6일, 투여 후 1일째, 4일째, 8일째, 15일째, 22일째, 29일째, 32일째, 35일째, 43일째, 57일째, 71일째, 85일째, 및 99일째에 혈액을 얻었다. 순환 AGT 수준을 제조업체의 프로토콜(IBL America #27412)에 따라 인간 안지오텐시노젠(및 시노몰구스와 교차-반응성)에 특이적인 ELISA를 이용하여 정량화하였다. 데이터를 기준 값의 퍼센트로 표현하고, 평균 +/- 표준 편차로 나타냈다. 결과는 도 1a에 나타나 있다. AD-85481, AD-126306, 및 AD-133362 간의 분명한 차이는 비-인간 영장류에서 전형적인 연구-대-연구 가변성의 범위 내에 있었다.
AD-67327 및 AD-85481의 활성을 평가하기 위해 용량-반응 연구를 수행하였다. 실험은 개별적으로 수행되었지만, 사용된 방법은 본질적으로 동일했으며, 결과는 도 1b에 함께 제시되어 있다. 시노몰구스 원숭이는 1일째에 단일 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 또는 3 mg/kg 피하 용량의 dsRNA 작용제를 받았다. AD-67327의 경우 투여 -6일, 투여 후 1일째, 8일째, 15일째, 22일째, 29일째, 36일째, 43일째, 50일째, 57일째, 64일째, 71일째 및 78일째에 그리고 AD-85481의 경우 투여 -6일, 투여 후 1일째, 4일째, 8일째, 15일째, 22일째, 29일째, 32일째, 35일째, 43일째, 57일째, 71일째, 85일째, 및 99일째에 혈액을 얻었다. 순환 AGT 수준을 제조업체의 프로토콜(IBL America #27412)에 따라 인간 안지오텐시노젠(및 시노몰구스와 교차-반응성)에 특이적인 ELISA를 이용하여 정량화하였다. 데이터를 기준 값의 퍼센트로 표현하고, 평균 + 표준 편차로 나타냈다. 결과는 도 1b에 나타나 있다. 이러한 데이터들은 AD-67327에 비해 AD-85481의 경우 효능 및 지속력의 대략 3-배 향상을 입증한다.
AD-67327 및 AD-85481의 효능 및 지속력을 알아내기 위해 다중용량 연구를 수행하였다. 실험은 개별적으로 수행되었지만, 사용된 방법은 본질적으로 동일했으며, 결과는 도 1c에 함께 제시되어 있다. 시노몰구스 원숭이에게 3 주 동안 4주 마다 1회(q4w 투여) 1 mg/kg 용량의 AD-67327 또는 AD-85481을 피하로 투여하였다(첫 투여 후 1일째, 29일째, 및 57일째). AD-67327의 첫 투여 -6일, 첫 투여 후 1일째, 8일째, 15일째, 22일째, 29일째, 36일째, 43일째, 50일째, 57일째, 64일째, 71일째 및 78일째에 그리고 AD-85481의 첫 투여 -8일, 첫 투여 후 1일째, 4일째, 8일째, 15일째, 22일째, 29일째, 36일째, 43일째, 57일째, 64일째, 71일째, 85일째, 99일째에 순환 AGT의 평가를 위해 혈액을 얻었다. 이러한 데이터들은 AD-67327에 비해 AD-85481에 의한 표적 사일런싱의 효능 및 지속력의 증가를 입증한다.
실시예 5. 자연유발 고혈압 래트 모델에서 AGT dsRNA로의 고혈압 치료
자연유발 고혈압 래트 모델에서 AGT 녹다운의 효과를 시험하기 위해 래트 특이적 dsRNA를 설계하였다. 자연유발 고혈압 래트(그룹 당 N = 9)에게 2주 마다 1회(10 mg/kg q2w) 10 mg/kg 용량의 래트-특이적 AGT dsRNA, 또는 일일 경구 용량의 ARB 발사르탄(31 mg/kg/일), 또는 일일 경구 용량의 ACE 억제제 캅토프릴(100 mg/kg/일)을 피하로 투여하였다. 선택된 조합(래트 특이적 dsRNA 작용제 + 발사르탄 또는 캅토프릴 + 발사르탄)을 또한 평가하고, 상기 언급된 바와 같이 투여하였다. 평균 동맥압을 4주 기간에 걸쳐 텔레메트리(telemetry)에 의해 측정하였다. 4주간의 처리 후, 동물들을 i.p. 펜토바르비탈 주사에 의해 마취하고, 혈장 AGT, 혈장 레닌, 혈장 안지오텐신 II, 혈장 알도스테론, 혈장 K+, 및 혈장 레닌 활성의 측정을 위해 간문맥으로부터 혈액을 채취하였다. 심장 중량 및 경골 길이(심장 중량의 정상화를 위한)를 또한 얻었다.
래트-특이적 dsRNA 작용제로의 처리는 처리 전 수준에 비해 단독으로 또는 발사르탄과 조합하여 투여될 때 혈장 AGT 수준을 98% 이상 녹다운시켰다(도 2a). 발사르탄과 캅토프릴 조합으로의 처리는 또한 혈청 AGT 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 입증되었다. 모든 처리는 레닌의 수준을 증가시켰고, 발사르탄과 dsRNA 작용제 조합으로 처리된 동물에서 가장 큰 증가가 발생했으며, 단독의 dsRNA 작용제-처리군에서 상당한 증가가 이어졌다. 발사르탄과 dsRNA 작용제로의 조합 처리만이 순환 안지오텐신 II 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. dsRNA 작용제로의 처리 후 소변 AGT가 감소하는 경향이 관찰되었는데, 이는 신장에서 AGT 단백질의 수준이 dsRNA 작용제로의 처리에 의해 유의하게 억제되지 않는다는 것을 시사한다(도 3). 발사르탄과 dsRNA 작용제의 조합만이 소변 AGT를 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 처리는 알도스테론 수준을 변경시키지 않았다. 혈장 K+는 모든 그룹에서 증가하는 경향이 있었는데, 발사르탄 + siRNA 조합 처리군에서만 유의성이 달성되었다.
도 2b는 실험 내내 텔레메트리에 의해 측정되고 시작 혈압 수준과 관련하여 그래프로 표시된 평균 동맥압 수준을 나타낸 것이다. 각각의 처리는 비처리 동물에 비해 혈압의 통계적으로 유의한 감소를 야기하였다. 통계적 비교(p<0.05)는 기준(#) 또는 발사르탄 + 캅토프릴($)에 대해 기록된 것이다. 발사르탄 + 래트-특이적 dsRNA 작용제로의 처리는 평균 동맥압을 감소시키는 데 캅토프릴 + 발사르탄으로의 처리보다 유의하게 더 우수했다.
도 2c는 심장 비대의 척도를 제공하기 위해 경골 길이로 정상화된 심장 중량을 나타낸 것이다. 발사르탄 + 캅토프릴 및 발사르탄 + dsRNA 작용제로의 처리는 대조군에 비해 심장 비대를 감소시키는 데 효과적이며(p<0.05), 발사르탄 + dsRNA 작용제는 또한 발사르탄 + 캅토프릴에 비해 심장 비대를 감소시키는 데 효과적이었다(p<0.05). 도 2e는 경골 길이 대 MAP에 대한 심장 중량의 산점도와 동일한 데이터를 도시하고 있다. 심장 비대와 MAP 간의 선형 관계가 관찰되는데, 발사르탄 + dsRNA 작용제는 심장 비대의 가장 큰 감소를 제공하였다. 심근세포 크기는 발사르탄을 제외한 모든 그룹에서 비히클에 비해 감소된 반면(도 2f), NT-proBNP는 캅토프릴 + 발사르탄 그룹에서 감소되고, 발사르탄 + dsRNA 그룹에서 감소 경향이 관찰되었다(도 2g).
도 2d는 기준에 대한 4주째 수준의 상대 레닌 활성을 나타낸 것이다. 감소된 안지오텐신 신호전달을 반영하는 혈장 레닌 활성(PRA)은 dsRNA 작용제 처리로 PRA의 분명한 증가를 지시하고 있다(단독의 dsRNA 작용제와 발사르탄 + siRNA 둘 다의 경우, 기준과 대조군 둘 다에 대해 p <0.05). PRA 검정은 과잉의 안지오텐시노젠의 존재 하에 혈액 표본에서 레닌에 의해 생성된 안지오텐신 I의 양을 정량화함으로써 레닌 활성을 측정한다. 이러한 데이터들은 AGT-dsRNA 작용제로의 처리 후 안지오텐신 II 신호전달의 감소, 및 발사르탄과의 공동-처리에 의한 효과 향상을 입증한다. 상향조절로 인해, 순환 안지오텐신 II는 AGT 수준이 거의 완전히 녹다운되더라도 온전하게 유지되었다. 이러한 데이터들은 AGT-dsRNA 작용제가 발사르탄 및 캅토프릴과 유사한 항고혈압 효과를 유발한다는 것을 입증한다. 이론으로 결부시키지 않으면서, dsRNA 작용제 + 발사르탄을 조합할 때에만 안지오텐신 II 수준이 붕괴되어 혈압의 상승작용적 감소를 야기한다는 것이 제안된다.
혈액 및 신장 AngI 및 AngII 수준에 대한 다양한 처리의 효과를 처리 4주 후에 조사하였다. 도 4a 내지 도 4c는 발사르탄 및 캅토프릴을 단독으로 또는 조합하여 처리하는 것이 비히클 대조에 비해 AngI의 혈액 수준을 유의하게 증가시켰다는 것을 나타낸다(도 4a). 단독의 dsRNA 작용제는 AngI의 혈액 수준을 유의하게 변경시키지 않았지만, 발사르탄과 dsRNA 작용제의 조합은 비히클 대조 및 단독의 dsRNA 작용제로의 처리에 비해 혈액 AngI를 유의하게 감소시켰다. 단독의 발사르탄은 비히클 대조에 비해 혈액 AngII를 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 4b). 발사르탄과 dsRNA 작용제의 조합은 비히클 대조에 비해 혈액 AngII를 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 변화는 캅토프릴 및 캅토프릴 + 발사르탄 처리 동물에서 AngII/AngI 비율의 유의한 감소를 야기하였다. 캅토프릴 및 발사르탄에 대한 데이터는 이들의 작용 기전과 일치하는 반면, 단독의 dsRNA에 대한 데이터는 혈액에서 AngII/I에 대한 적은 영향을 지시한다.
도 5a 내지 도 5c는 dsRNA 작용제가 신장 AngII에 대한 명백한 영향 없이 신장 AngI를 감소시켜 신장 AngII/I 비율의 상향조절을 야기한다는 것을 나타낸다. 도 5a는 각각의 발사르탄 및 캅토프릴이 신장 AngI를 유의하게 증가시킨 반면, 작용제의 조합이 AngI 수준에 대한 유의한 영향을 갖지 않았다는 것을 나타낸다. 신장 AngI는 dsRNA 작용제 및 dsRNA 작용제와 발사르탄의 조합에 의해 유의하게 감소되었다. 더욱이, 조합 처리는 단독의 dsRNA 작용제로의 처리에 비해 신장 AngI 수준을 유의하게 감소시켰다. 도 5b는 캅토프릴, 즉, 발사르탄 또는 dsRNA 작용제 단독을 제외한 임의의 단일요법으로의 처리 후 신장 AngII의 유의한 변화가 없다는 것을 나타낸다. 그러나, 캅토프릴과 발사르탄의 조합 및 발사르탄과 dsRNA 작용제의 조합은 신장 Ang II를 유의하게 감소시키는 것으로 입증되었다. 캅토프릴 및 발사르탄에 대한 데이터는 이들의 작용 기전과 일치하는 반면, 단독의 dsRNA에 대한 데이터는 신장에서 AngII/I에 대한 분명한 영향을 거의 지시하지 않았다. 신장 AngII/AngI 비율은 단독의 AGT dsRNA 작용제 투여 후 4-배 증가되었다(도 5c). 반대로, 발사르탄, 캅토프릴, 및 발사르탄 + 캅토프릴 조합의 처리 후 Ang II/Ang I 비율의 70% 이상 감소가 보였다. 발사르탄 + AGT dsRNA 작용제로의 처리 후 AngII/AngI 비율의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 신장 AngII의 증가는 신장 피질 또는 수질에서 신장 안지오텐신 수준 또는 ACE mRNA 발현 변경의 결과가 아닌 것으로 입증되었다. 도 6a 내지 도 6c는 하나를 제외한 모든 처리 조건 하에 신장에서 AT1a 수용체, AT1b 수용체, 또는 ACE mRNA 수준의 유의한 변화가 없다는 것을 나타낸다. 캅토프릴로의 처리는 신장 수질에서 AT1b 수용체 수준의 유의한 증가를 유발하였다. 신장 기능에 대한 치료 요법의 효과를 또한 평가하였다. 사구체 여과율(GFR), 나트륨배설증가 및 단백뇨의 변화는 관찰되지 않았다. 이는 이러한 처리들이 신장 기능을 손상시키지 않았다는 것을 지시한다.
실험 동안 소변량 및 소변 나트륨을 모니터링하였다. 발사르탄 + dsRNA 작용제, 발사르탄 + 캅토프릴 및 단독의 캅토프릴로의 처리는 기준과 4주 사이에 그룹내 소변량의 유의한 증가를 야기하였다(도 7). 4주째 그룹 전체에 걸친 소변량의 비교는 다른 모든 그룹에 비해 캅토프릴 처리 동물에서 소변 배출량의 유의한 증가를 나타냈다. 발사르탄 + dsRNA 작용제로의 처리는 단독의 발사르탄 또는 비히클로의 처리에 비해 4주째에 소변 배출량의 유의한 증가를 야기하였다. 실험 동안 그룹 전체에 걸쳐 또는 그룹 내에서 소변 나트륨의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
이러한 데이터들에 의해서, ACEi와 ARB 둘 다 동안 감소된 신장 Ang II/I 비율은 신장 ACE가 Ang II를 생성하고 조직 Ang II가 AT1R-내재화 Ang II를 나타내는 것을 확인시켜준다는 것이 입증된다(van Esch et al., Cardiovasc Res 2010 86(3):401-409). 또한, 간-표적화 AGT siRNA 처리 후 신장 Ang I의 감소는 신장 Ang 생성이 간 AGT에 의존한다는 것을 입증한다. 소변 AGT가 부분적으로 신장-유래일지라도, 이러한 신장 AGT는 앞서 시사된 바와 같이 신장 Ang 생성에 기여하지 않는다(Matsusaka et al., JASN 2012 23: 1181-1189). AGT dsRNA 처리 후 신장 Ang II/I 비율의 증가는 신장 Ang II 수준이 온전하게 유지되게 하는데, 이는 AT1b 수용체 상향조절의 부재에서도 Ang II 내재화가 향상되었음을 시사한다. 이러한 개념과 일치하여, 추가 ARB 노출은 신장 Ang II를 거의 없앴다. 간-특이적 AGT dsRNA 작용제로의 처리는 기존 RAS 차단제와 조합되는 경우 동맥압을 상승작용적으로 감소시키고, 신장 기능에 대한 명백한 부정적인 영향 없이 신장 Ang 생성을 감소시켰다.
실시예 6. 고염 래트 모델에서 AGT dsRNA로의 고혈압 치료
데옥시코르티코스테론 아세테이트(DOCA)-염 래트 모델은 고염 수준의 맥락에서 고혈압에 대해 잘 확립된 모델이며, 중추 및 말초 신경계에 대한 영향으로 인해 신경성 고혈압의 모델로 여겨진다(Basting T & Lazartigues E, Cur Hypertension Rep 2017).
도착하면, 스프래그-다우리 래트가 7일 동안 순응할 수 있게 하였다. 이어서, 텔레메트리 송신기를 이소플루란 마취 하에 래트에서 복부 대동맥에 복부내로 이식하였다. 래트가 이러한 절차로부터 10일 동안 회복되게 하였다. 그 이후로부터 계속, 혈압, 심박수 및 기타 고혈압 지표를 7 주 기간에 걸쳐 텔레메트리에 의해 측정하였다. 처음 4주 동안, 동물에게 200 mg의 DOCA 펠릿을 피하 이식하고, 만성 기준으로 식수(자유급식)에 0.9% 염을 제공하여 고혈압을 유도하였다. 고혈압이 시작되는 이러한 기간 후에, 3-주 처리 기간이 개시되었다. 래트를 하기로 처리하였다:
1) 비히클;
2) 발사르탄, 식수에 31 mg/kg/일 첨가;
3) AGT dsRNA 작용제, 2주 마다 1회 10 mg/kg, 피하;
4) 스피로놀락톤, 50 mg/kg/일, 피하; 조합으로, AGT dsRNA 작용제, 2주 마다 1회 10 mg/kg, 피하, 및 발사르탄, 식수에 31 mg/kg/일 첨가;
5) AGT dsRNA 작용제, 2주 마다 1회 10 mg/kg, 피하, 및 스피로노락톤, 50 mg/kg/일, 피하;
6) 발사르탄, 식수에 31 mg/kg/일 첨가, 및 스피로락톤, 50 mg/kg/일, 피하; 또는
7) AGT dsRNA 작용제, 2주 마다 1회 30 mg/kg, 피하. 또한, 식수에 DOCA 및 염이 제공되지 않은 래트의 한 그룹은 처리의 효과를 평가하기 위해 혈압을 정상화하는 대조군으로서 작용하였다.
실시예 7. 식이 유발 비만(DIO)의 고지방 식이 공급 마우스 모델에서 AGT dsRNA 작용제로의 비만 처리
16-주령된 고지방 공급(HFF) 비만 마우스(식이-유발 비만(DIO)) 및 정상-체중 대조군 동물을 구입하고, 이들의 각각의 고지방 식이(지방으로서 칼로리의 60%) 또는 일반 사료를 유지하였다. 순응 후, 동물들을 다음 네 개의 그룹으로 나누었다: 정상 체중 + PBS; 정상 체중 + AGT dsRNA; DIO + PBS; 및 DIO + AGT dsRNA(n = 5/그룹). 동물들은 0주째부터 시작하여 12주 동안 격주로 10 mg/kg의 마우스-특이적 dsRNA 또는 PBS를 받았다. 동물들의 체중을 재고, 격주로 혈액을 얻었다. 혈청 AGT 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 공복 포도당 내성 검사를 투여 전, 첫 투여 후 6주째, 및 첫 투여 후 12주째에 수행하였다. 연구 종료 시 기관 중량을 측정하였다.
AGT dsRNA 작용제의 투여는 dsRNA 작용제의 첫 투여 후 2주째를 첫 시점으로 시작하여 AGT dsRNA 작용제 처리군 전체에 걸쳐 약 93%의 지속적인 녹다운으로 고지방 동물과 정상 사료 동물 둘 다에서 AGT를 사일런싱하는 데 효과적이었다.
AGT dsRNA 작용제로의 처리는, 첫 투여 후 2주째에 시작하여 DIO 마우스에서 이원 반복 측정 ANOVA에 의해 측정하는 경우, PBS 처리 DIO 마우스에 비해 체중 증가를 유의하게 감소시키는 데 효과적이었고, 연구 내내 유지되었다(도 8a). 시작 체중을 비교하는 분석에서, DIO + AGT dsRNA 그룹은 마지막 시점까지 시작 체중에 비해 체중 증가가 없었다. 최종 시점 이전에, 마우스는 시작 체중에 비해 체중이 줄었거나(2주, 4주, 6주), 체중 차이가 없었다(8주, 10주). 연구 10주 및 12주까지 PBS 및 AGT dsRNA 작용제 사료 공급 마우스 간에 유의한 체중 차이가 관찰되지 않았다.
지방 침착 위치에 대한 AGT dsRNA 작용제로의 처리 효과를 평가하기 위해 연구 종료 시 기관 중량을 측정하였다. AGT dsRNA 작용제 처리 DIO 마우스의 간 중량은 PBS 처리 DIO 마우스보다 유의하게 더 낮았다(도 8b). AGT dsRNA 작용제와 PBS 처리 정상 사료 공급 마우스 간에 간 중량의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 지방 조직(정소상체) 중량은 DIO + PBS보다 DIO + AGT siRNA 그룹에서 통계적으로 더 높은 반면, 정상-체중 동물의 경우 사실 그 반대였다. 네 개의 그룹 모두에서 종아리 근육 중량은 유의한 차이가 없었다.
포도당 내성 검사를 표준 프로토콜을 이용하여 0주(투여 전), 6주 및 12주에 수행하였다. 알파TRAK®2 혈당계(Abbott Animal Health)를 사용하여 투여 전, 볼루스 복강내 포도당 용량 투여 후 30분, 60분, 90분 및 120분에 혈당을 측정하였다. 결과는 도 9a 내지 도 9c에 나타나 있다. 0주째에, DIO는 사료 공급 대조군에 비해 감소된 포도당 내성을 가졌다. 6주째까지, AGT dsRNA 작용제 처리 DIO 마우스와 PBS 처리 DIO 마우스 간의 시험 후 다중 비교에서 유의한 차이가 관찰되었다. 12주째에, 값이 혈당계 한계치를 초과하는 한 마리의 DIO + PBS 동물을 제외하고, AGT dsRNA 작용제 처리 DIO 마우스와 PBS 처리 DIO 마우스 간에 유의한 차이가 계속 있었다. 또한, DIO + AGT siRNA 그룹으로부터의 데이터는 6주째 또는 12주째에 대조군(AGT dsRNA 작용제 처리 또는 PBS 처리 사료 공급 마우스)과 다르지 않았다.
실시예 8. 고지방 고과당 마우스 모델에서 AGT dsRNA 작용제로의 NASH 처리
NASH 및 대사 장애의 징후를 치료하는 AGT siRNA의 효능을 입증하기 위해 NASH의 고지방 고과당(HF HFr) 공급 마우스 모델(본원에 참조로 포함되는, Softic et al. J Clin Invest 127 (11):4059-4074, 2017)을 이용하였다.
NASH를 유도하거나 표준 사료 또는 물 식이를 공급하기 위해 Jackson Laboratories로부터 얻은 6주령 내지 8주령된 C57BL/6 수컷 마우스에게 AGT dsRNA 작용제 또는 PSB(대조군)로의 처리 전 12주 동안 지방 + 물 중 30% 과당(Hf Hfr 식이)로서 칼로리의 60%를 함유하는 고지방 식이를 공급하였다. 음식과 물을 자유 급식으로 제공하였다. 12주째에 시작하여, HF HFr 공급 마우스에게 총 4회 용량으로 격주로 AGT에 표적화된 10 mg/kg 용량의 dsRNA 작용제를 피하로 투여하였다. 최종 투여 2주 후에(20주째에), 간을 채취하고, RNA를 단리하고, 전술된 방법을 이용하여 RT-qPCR에 의해 간에서 AGT 녹다운을 측정하였다. PBS 처리 HF HFr 공급 마우스에 비해 AGT dsRNA 작용제 처리 Hf Hfr 공급 마우스에서 간 AGT mRNA의 93% 감소가 관찰되었다.
예상된 바와 같이, 체중(도 10a), 누적 체중 증가(도 10b), 및 말기 간 체중은 모든 시점에 사료 공급 마우스에 비해 HF HFr 공급 대조군 마우스에서 유의하게 더 높았다. HF HFr 마우스에서 AGT dsRNA 작용제로의 처리는 12주째부터 20주째까지 체중을 감소시켰는데, 이는 대조 처리 마우스에 비해 말기 체중의 유의한 감소를 초래했다(p = 0.0023). 말기 간 체중의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
HF HFr 모델에서 dsRNA 작용제의 효과를 알아내기 위해 혈청 및 간 지질 및 포도당, 및 혈청 인슐린을 평가하였다. 20주째에, 혈청 트리글리세라이드 및 포도당 수준은 세 개의 그룹(정상 사료, HF HFr dsRNA, HF HFr 대조군) 모두에 걸쳐 실질적으로 동일했다. 예상된 바와 같이, 혈청 콜레스테롤 및 인슐린 수준은 HF Hfr 그룹 둘 다에서 대략 동일했고, 사료 공급 그룹에서 유의하게 더 높았다. AGT dsRNA 작용제로의 처리는 혈청 비-에스테르화 지방산(NEFA)을 유의하게 감소시키는 것으로 입증되었다(p = 0.01). 간에서, 콜레스테롤은 정상 사료 대조군에 비해 HF HFr 그룹 둘 다에서 상승했지만, 다시, AGT dsRNA 작용제로의 처리 후 유의한 감소가 관찰되지 않았다. 간 트리글리세라이드(p = 0.017) 및 유리 지방산(p = 0.001)의 유의한 감소가 대조 처리군에 비해 AGT dsRNA 작용제 처리군에서 관찰되었다. AGT dsRNA 처리군에서 지질 산화의 지표인 티오바르비투르산(TBA)의 감소를 향하는 가능한 경향이 보였다.
간 손상은 사료 공급 마우스에 비해 대조 처리 Hf Hfr 마우스에서 혈청 알라닌 아미노트랜스페라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스페라제(AST) 및 글루타메이트 데하이드로게나제(GLDH) 수준의 유의한 증가에 의해 지시되었다. AGT dsRNA 작용제로의 처리는 대조 처리 HF HFr 마우스에 비해 감소된 AST(도 11b) 및 GLDH(도 11c)를 향한 경향과 함께 ALT(p = 0.01)(도 11a)의 유의한 감소를 초래하였다.
조직병리학 및 NAS 스코어에 의해 간 손상을 또한 평가하였다. 예상된 바와 같이, HF HFr 식이는 유의한 지방증, 벌룬 변성, 및 소엽성 염증을 유발하여, 사료 공급 마우스에 비해 전체 NAS 점수의 증가를 야기하였다. AGT dsRNA 작용제로의 처리는 소엽성 염증의 감소를 향한 경향과 함께 벌룬 변성(p = 0.04)의 유의한 감소를 야기하여, 대조 처리 HF HFr 공급 동물에 비해 AGT dsRNA 작용제 처리 HF HFr 공급 동물에서 전체 NAS 스코어의 유의한 감소를 야기하였다(p = 0.01).
이러한 데이터들은 AGT dsRNA 작용제로의 처리가 NASH의 징후 일부를 개선하는 데 효과적이라는 것을 입증한다. 특히, AGT dsRNA 작용제로의 처리는 ALT의 유의한 감소 및 AST 및 GLDH의 약간 감소와 함께 체중 및 간 손상 효소를 감소시키는 데 효과적이었다. 소엽 염증 및 벌룬 스코어의 감소가 또한 관찰되어 전체 NAS 스코어의 감소를 야기하였다.
등가물
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 구현예 및 방법에 대한 다수 등가물을 알거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구항의 범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANGIOTENSINOGEN (AGT) IRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 121301-08620 <150> 62/816,996 <151> 2019-03-12 <150> 62/727,141 <151> 2018-09-05 <150> 62/671,094 <151> 2018-05-14 <160> 960 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2587 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atcccatgag cgggcagcag ggtcagaagt ggcccccgtg ttgcctaagc aagactctcc 60 cctgccctct gccctctgca cctccggcct gcatgtccct gtggcctctt gggggtacat 120 ctcccggggc tgggtcagaa ggcctgggtg gttggcctca ggctgtcaca cacctaggga 180 gatgctcccg tttctgggaa ccttggcccc gactcctgca aacttcggta aatgtgtaac 240 tcgaccctgc accggctcac tctgttcagc agtgaaactc tgcatcgatc actaagactt 300 cctggaagag gtcccagcgt gagtgtcgct tctggcatct gtccttctgg ccagcctgtg 360 gtctggccaa gtgatgtaac cctcctctcc agcctgtgca caggcagcct gggaacagct 420 ccatccccac ccctcagcta taaatagggc atcgtgaccc ggccggggga agaagctgcc 480 gttgttctgg gtactacagc agaagggtat gcggaagcga gcaccccagt ctgagatggc 540 tcctgccggt gtgagcctga gggccaccat 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tcacagcctg catgaacctg tcaatcttct cagcagcgac ttccaggtct gtgaagtcca 1080 gagagcgtgg gaggaccaca ggggcataga gagccaggcc ctgcacaaac ggctgcttca 1140 ggtgcagatc tggggctgtg aagagaccca ccactgtgga caacagcagc tgggactggc 1200 cgtcagccct gccctgggcc accagcaggc cctgtacagc ctgcagggca gagaggacct 1260 tgtgcgcatc cagccgggag gtgcagttct tgtccttcca agggacgccc aggattgcct 1320 gtagcctgtc ggctgtgtgg tccaacgctc ccaggtagag agaggccagg gtgccaaaga 1380 cagccgttgg ggagaggatg gtggccccat ggaccacgcc ccatagctca ctgtgcatgc 1440 catatatacg gaagcccaag aagttggcca gcatcccgac catcgcggct ctcaacttgt 1500 cctcggtgtc gagttttgcg gcaaccagca ctagctggtc ctgcagggcc ttttcatcca 1560 caggagacgt cttggcctgt atcggaacag gtgtgaaggt gggatctttg ggcttcccag 1620 catcggcctt tgccagctgc tcacaggtac tctcattgtg gatgacgagg tggaaggggt 1680 gtatgtacac ccggtcacct gtggccaggc cagcccaggc caggaggcag aggatggtgg 1740 ccctcaggct cacgctggca ggagccatct cggactgggg tgctcgcttc tgcataccct 1800 tctgctgtag tacccagaac aatggcagct tctt 1834 <210> 5 <211> 1856 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 gatagctgtg cttgtctagg ttggcgctga aggatacaca gaagcaaatg cacagatcgg 60 agatgactcc cacgggggca ggcctgaagg ccaccatctt ctgcatcttg acctgggtca 120 gcctgacggc tggggaccgc gtatacatcc accccttcca tctcctttac cacaacaaga 180 gcacctgcgc ccagctggag aaccccagtg tggagacact cccagagtca acgttcgagc 240 ctgtgcccat tcaggccaag acctcccctg tgaatgagaa gaccctgcat gatcagctcg 300 tgctggccgc cgagaagcta gaggatgagg accggaagcg ggctgcccag gtcgcaatga 360 tcgccaactt cgtgggcttc cgcatgtaca agatgctgaa tgaggcagga agtggggcca 420 gtggggccat cctctcacca ccagctctct ttggcaccct ggtctctttc taccttggat 480 ccttagatcc cacggccagc cagctgcaga cgctgctgga tgtccctgtg aaggagggag 540 actgcacctc ccgactagat ggacacaagg tcctcgctgc cctgcgggcc attcagggct 600 tgctggtcac ccagggtggg agcagcagcc agacacccct gctacagtcc attgtggtgg 660 ggctcttcac tgctccaggc tttcgtctaa agcactcatt tgttcagagc ctggctctct 720 ttacccctgc cctcttccca cgctctctgg atttatccac tgacccagtt cttgccactg 780 agaaaatcaa caggttcata aaggctgtga cagggtggaa gatgaacttg ccactggagg 840 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Claims (78)

  1. 안지오텐시노젠(angiotensinogen: AGT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(double stranded ribonucleic acid: dsRNA) 작용제로서, dsRNA 작용제가 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 635 내지 658, 636 내지 658, 642 내지 667, 642 내지 664, 645 내지 667, 1248 내지 1273, 1248 내지 1272, 1248 내지 1270, 1250 내지 1272, 1251 내지 1273, 1580 내지 1602, 1584 내지 1606, 1587 내지 1609, 1601 내지 1623, 1881 내지 1903, 2074 내지 2097, 2074 내지 2096, 2075 내지 2097, 2080 내지 2102, 2272 내지 2294, 2276 내지 2298, 2281 내지 2304, 2281 내지 2303, 또는 2282 내지 2304의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이중 가닥 리보 핵산(dsRNA) 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 635 내지 658, 636 내지 658, 642 내지 667, 642 내지 664, 645 내지 667, 1248 내지 1273, 1248 내지 1272, 1248 내지 1270, 1250 내지 1272, 1251 내지 1273, 1580 내지 1602, 1584 내지 1606, 1587 내지 1609, 1601 내지 1623, 1881 내지 1903, 2074 내지 2097, 2074 내지 2096, 2075 내지 2097, 2080 내지 2102, 2272 내지 2294, 2276 내지 2298, 2281 내지 2304, 2281 내지 2303, 또는 2282 내지 2304의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 적어도 21 연속 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 작용제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 21 연속 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA.
  4. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 작용제.
  5. 제4항에 있어서, 센스 가닥이 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 적어도 19 연속 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 작용제.
  6. 제1항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥이 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 dsRNA 작용제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 작용제가 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 작용제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 모든 센스 가닥의 뉴클레오티드 및 실질적으로 모든 안티센스 가닥의 뉴클레오티드가 변형을 포함하는 dsRNA 작용제.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 센스 가닥의 뉴클레오티드 및 모든 안티센스 가닥의 뉴클레오티드가 변형을 포함하는 dsRNA 작용제.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠김 뉴클레오티드, 비잠김 뉴클레오티드, 형태가 제약된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오티드, 2'-하이드록실-변형 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오티드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드, 열적 탈안정화 뉴클레오티드, 글리콜 변형 뉴클레오티드(glycol modified nucleotide: GNA), 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오티드; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 dsRNA 작용제.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드에 대한 변형이 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-하이드록실, 및 GNA; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 dsRNA 작용제.
  12. 제11항에 있어서, 뉴클레오티드에 대한 변형이 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형인 dsRNA 작용제.
  13. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 데옥시-뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 글리콜 변형 뉴클레오티드(GNA), 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오티드; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 dsRNA.
  14. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드에 대한 변형 중 적어도 하나가 열적 탈안정화 뉴클레오티드 변형인 dsRNA.
  15. 제14항에 있어서, 열적 탈안정화 뉴클레오티드 변형이 무염기 변형; 듀플렉스에서 대항하는 뉴클레오티드와의 미스매치; 및 탈안정화 당 변형, 2'-데옥시 변형, 비사이클릭 뉴클레오티드, 비잠김 핵산(unlocked nucleic acid: UNA), 및 글리세롤 핵산(GNA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 dsRNA.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이가 19 내지 21 뉴클레오티드인 dsRNA 작용제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이가 21 뉴클레오티드인 dsRNA 작용제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각 가닥의 길이가 독립적으로 30 뉴클레오티드 이하인 dsRNA 작용제.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 1 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는 dsRNA 작용제.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 2 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는 dsRNA 작용제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드를 추가로 포함하는 dsRNA 작용제.
  22. 제21항에 있어서, 리간드가 dsRNA 작용제의 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이션되는 dsRNA 작용제.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 리간드가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체인 dsRNA 작용제.
  24. 제23항에 있어서, 리간드가 하기 화합물인 dsRNA 작용제.
    Figure pct00117
  25. 제24항에 있어서, dsRNA 작용제가 하기 화학식에 나타낸 바와 같은 리간드에 컨쥬게이션되는 dsRNA 작용제:
    Figure pct00118

    (식 중, X는 O 또는 S이다).
  26. 제25항에 있어서, X가 O인 dsRNA 작용제.
  27. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 인간 AGT를 인코딩하는 mRNA에 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 적어도 19 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 작용제.
  28. 제27항에 있어서, 안티센스 가닥이 인간 AGT를 인코딩하는 mRNA에 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 dsRNA 작용제.
  29. 제28항에 있어서, 상보성 영역이 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 하나로 이루어지는 dsRNA 작용제.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 화학적 변형 뉴클레오티드 서열을 포함하는 dsRNA 작용제.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374, 및 AD-133385로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 화학적 변형 뉴클레오티드 서열을 포함하는 dsRNA 작용제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이가 19 내지 30 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 작용제.
  33. 제32항에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이가 19 내지 25 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 작용제.
  34. 제32항에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이가 23 내지 27 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 작용제.
  35. 제32항에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이가 19 내지 23 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 작용제.
  36. 제32항에 있어서, 이중 가닥 영역의 길이가 21 내지 23 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 작용제.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 각 가닥의 길이가 독립적으로 19 내지 30 뉴클레오티드인 dsRNA 작용제.
  38. 제21항에 있어서, 리간드가 1가, 2가, 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체인 dsRNA 작용제.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 포함하는 dsRNA 작용제.
  40. 제39항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합이 하나의 가닥의 3'-말단에 있는 dsRNA 작용제.
  41. 제40항에 있어서, 가닥이 안티센스 가닥인 dsRNA 작용제.
  42. 제40항에 있어서, 가닥이 센스 가닥인 dsRNA 작용제.
  43. 제39항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합이 하나의 가닥의 5'-말단에 있는 dsRNA 작용제.
  44. 제43항에 있어서, 가닥이 안티센스 가닥인 dsRNA 작용제.
  45. 제43항에 있어서, 가닥이 센스 가닥인 dsRNA 작용제.
  46. 제39항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합이 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단에 모두 있는 dsRNA 작용제.
  47. 제46항에 있어서, 가닥이 안티센스 가닥인 dsRNA 작용제.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 염기쌍이 AU 염기쌍인 dsRNA 작용제.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 총 21 뉴클레오티드를 가지며 안티센스 가닥이 총 23 뉴클레오티드를 가지는 dsRNA 작용제.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제를 함유하는 세포.
  51. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제를 포함하는 AGT를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물.
  52. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 및 지질 제형을 포함하는 약학적 조성물.
  53. 세포에서 AGT 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제51항 또는 제52항의 약학적 조성물을 세포와 접촉시켜 세포에서 AGT 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 세포가 대상체 내에 있는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 대상체가 AGT-연관 장애로 진단받은 방법.
  57. 제56항에 있어서, AGT-연관 장애가 고혈압, 고혈압증, 경계성 고혈압, 원발성 고혈압, 속발성 고혈압 고립성 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신-관련 고혈압, 당뇨병 고혈압, 저항 고혈압, 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 골드블라트 고혈압, 저 혈장 레닌 활성 또는 혈장 레닌 농도와 관련된 고혈압, 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정성 고혈압; 고혈압성 심장 질환, 고혈압성 신병증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 혈관병증, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 망막병증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨병성 심근병증, 사구체경화증, 대동맥 협착, 대동맥류, 심실 섬유증, 심부전, 심근경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질환, 신부전, 전신 경화증, 자궁내 성장 제한(intrauterine growth restriction: IUGR), 태아 성장 제한, 비만, 간 지방증/지방간, 비알코올성 지방간염(non-alcoholic Steatohepatitis: NASH), 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD); 포도당 불내성, 2형 당뇨병(비-인슐린 의존성 당뇨병), 및 대사 증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  58. 제56항에 있어서, 대상체가 적어도 130 mm Hg의 수축기 혈압 또는 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 가지는 방법.
  59. 제56항에 있어서, 대상체가 적어도 140 mm Hg의 수축기 혈압 및 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 가지는 방법.
  60. 제56항에 있어서, 대상체가 염 민감성에 취약한 그룹의 일부이거나, 과체중이거나, 비만이거나, 임신 중인 방법.
  61. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 작용제와 세포를 접촉시키는 것이 AGT의 발현을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 억제하는 방법.
  62. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, AGT의 발현을 억제하는 것이 대상체의 혈청 중 AGT 단백질 수준을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 감소시키는 방법.
  63. 대상체에서 AGT-연관 장애를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제51항 또는 제52항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체에서 AGT-연관 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 대상체가 적어도 130 mm Hg의 수축기 혈압 또는 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 가지는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 대상체가 적어도 140 mm Hg의 수축기 혈압 및 적어도 80 mm Hg의 이완기 혈압을 가지는 방법.
  66. 제63항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  67. 제63항에 있어서, 대상체가 염 민감성에 취약한 그룹의 일부이거나, 과체중이거나, 비만이거나, 임신 중인 방법.
  68. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 작용제가 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되는 방법.
  69. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 작용제가 대상체에게 피하로 투여되는 방법.
  70. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 표본(들)에서 AGT의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 대상체 샘플(들)에서 AGT의 수준이 혈액 표본(들), 혈청 표본(들), 또는 소변 표본(들)에서 AGT 단백질 수준인 방법.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 고혈압의 치료를 위한 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 추가 치료제가 이뇨제, 안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme: ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제(angiotensin II receptor antagonist), 베타-차단제(beta-blocker), 혈관확장제(vasodialator), 칼슘 통로 차단제(calcium channel blocker), 알도스테론 길항제(aldosterone antagonist), 알파2-효능제(alpha2-agonist), 레닌 억제제(renin inhibitor), 알파-차단제(alpha-blocker), 말초 작용 아드레날린성 작용제(peripheral acting adrenergic agent), 선택적 D1 수용체 부분 효능제(selective D1 receptor partial agonist), 비선택적 알파-아드레날린성 길항제(nonselective alpha-adrenergic antagonist), 합성제, 스테로이드성 항염류코르티코이드 작용제(steroidal antimineralocorticoid agent), 안지오텐신 수용체-네프릴리신 억제제(angiotensin receptor-neprilysin inhibitor: ARNi), 엔트레스토®(Entresto®), 사쿠비트릴(sacubitril)/발사르탄(valsartan); 또는 엔도텔린 수용체 길항제(endothelin receptor antagonist: ERA), 시탁센탄(sitaxentan), 암브리센탄(ambrisentan), 아트라센탄(atrasentan), BQ-123, 지보텐탄(zibotentan), 보센탄(bosentan), 마시텐탄(macitentan), 및 테조센탄(tezosentan); 임의의 상기 물질들의 조합; 및 작용제들의 조합으로서 제형화된 고혈압 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  74. 제72항에 있어서, 추가 치료제가 안지오텐신 II 수용체 길항제를 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 안지오텐신 II 수용체 길항제가 로사르탄(losartan), 발사르탄, 올메사르탄(olmesartan), 에프로사르탄(eprosartan), 및 아질사르탄(azilsartan)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  76. AGT-연관 장애의 치료를 위한 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제51항 또는 제52항의 약학적 조성물의 용도.
  77. 제54항 내지 제75항 중 어느 한 항의 방법에서 제76항의 용도.
  78. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제51항 또는 제52항의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
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