ES2967713T3 - Composiciones de ARNi de angiotensinógeno (AGT) y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Composiciones de ARNi de angiotensinógeno (AGT) y métodos de uso de las mismas Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a agentes de ARNi, por ejemplo, agentes de ARN bicatenario (ARNds), dirigidos al gen AGT. La invención también se refiere a métodos para usar dichos agentes de ARNi para inhibir la expresión de un gen AGT y a métodos para prevenir y tratar un trastorno asociado a AGT, por ejemplo, presión arterial alta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de ARNi de angiotensinógeno (AGT) y métodos de uso de las mismas
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud está relacionada con la solicitud provisional de los EE. UU. n.° 62/671.094, presentada el 14 de mayo de 2018, la solicitud provisional de los EE. UU. n.° 62/727.141, presentada el 5 de septiembre de 2018, y la solicitud provisional de los EE. UU. n.° 62/816.996, presentada el 12 de marzo de 2019.
Antecedentes
El sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) desempeña una función crucial en la regulación de la presión arterial. La cascada del SRAA comienza con la liberación de angiotensinógeno del hígado y renina por las células yuxtaglomerulares del riñón a la circulación. La secreción de renina es estimulada por varios factores, incluida la carga de Na+ en el túbulo distal, estimulación p-simpática o perfusión renal reducida. La renina activa en el plasma escinde el angiotensinógeno (producido por el hígado) en angiotensina I, que, a continuación, se convierte mediante la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) en circulación y expresada localmente en angiotensina II. La mayoría de los efectos de la angiotensina II sobre el SRAA se ejercen mediante su unión a los receptores de la angiotensina II de tipo 1 (AT<1>R), lo que lleva a la vasoconstricción arterial, efectos tubulares y glomerulares, tales como una mayor reabsorción de Na+ o la modulación de la tasa de filtración glomerular. Además, junto con otros estímulos tales como la corticotropina, la hormona antidiurética, catecolaminas, la endotelina, la serotonina y niveles de Mg2+ y K+, La estimulación de AT<1>R conduce a la liberación de aldosterona que, a su vez, promueve la secreción de Na+ y K+ en el túbulo contorneado distal renal.
La desregulación del SRAA que conduce a, por ejemplo, producción excesiva de angiotensina II o estimulación de AT<1>R produce hipertensión, lo que puede provocar, p. ej., aumento del estrés oxidativo, fomento de la inflamación, hipertrofia y fibrosis en el corazón, los riñones y las arterias, y dar lugar a, p. ej., fibrosis ventricular izquierda, remodelación arterial y glomeruloesclerosis.
La hipertensión es la enfermedad controlable más prevalente en los países desarrollados, con entre un 20 y un 50 % de la población adulta afectada. La hipertensión es un factor de riesgo importante para diversas enfermedades, trastornos y afecciones, tales como esperanza de vida más corta, nefropatía crónica, ictus, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, aneurismas (p. ej., aneurisma aórtico), arteriopatía periférica, daño cardíaco (p. ej., agrandamiento o hipertrofia del corazón) y otras enfermedades cardiovasculares, trastornos o afecciones relacionados. Además, se ha mostrado que la hipertensión es un importante factor de riesgo para la morbilidad y la mortalidad cardiovasculares que supone o contribuye al 62 % de todos los ictus y el 49 % de todos los casos de cardiopatías. En 2017, se desarrollaron cambios en las pautas de diagnóstico, prevención y tratamiento de la hipertensión, estableciendo objetivos para una presión arterial aún más baja para disminuir adicionalmente el riesgo de aparición de enfermedades y trastornos asociados con la hipertensión (véase, p. ej., Reboussinet al.Systematic Review for the 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. JAm Coll Cardiol. 7 de noviembre de 2017. pii: S0735-1097(17)41517-8. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.004; y Wheltonet al.(2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. JAm Coll Cardiol. 7 de noviembre de 2017. pii: S0735-1097(17)41519-1. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.006). El documento WO 2015/179724 describe moléculas de ARN bicatenario que inhiben la expresión del angiotensinógeno.
A pesar de la cantidad de medicamentos antihipertensivos disponibles para tratar la hipertensión, más de dos tercios de los sujetos no están controlados con un agente antihipertensivo y requieren dos o más agentes antihipertensivos seleccionados de diferentes clases de fármacos. Esto reduce aún más el número de sujetos con presión arterial controlada, ya que se reduce el cumplimiento y los efectos secundarios aumentan con el aumento del número de medicamentos.
Sumario de la divulgación
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones según la invención se presentan en los siguientes párrafos numerados:
(1). Un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), o una sal del mismo, para inhibir la expresión del angiotensinógeno (AGT), en donde el agente de ARNbc, o una sal del mismo, comprende una hebra de sentido y una hebra de antisentido que forman una región bicatenaria, en donde la hebra de sentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3' (SEQ ID NO: 482) y la hebra de antisentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3' (SEQ ID NO: 666),
en donde a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, G, C y U, respectivamente; Af, Gf, Cf y Uf son 2'-fluoro A, G, C y U, respectivamente; s es un enlace de fosforotioato; y (Tgn) es un isómero S del ácido nucleico de timidina-glicol (g Na ), y que comprende además un ligando que es un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc).
(2). El agente de ARNbc, o una sal del mismo, del párrafo 1, en donde el ligando es:
(i) conjugado con el extremo 3' de la hebra de sentido del agente de ARNbc, o una sal del mismo; y/o (ii) un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc) que es
en donde además, opcionalmente, el agente de ARNbc, o una sal del mismo, se conjuga con el ligando como se muestra en el si uiente esquema
y, en donde X es O o S; o
(iv) uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado monovalente, bivalente o trivalente.
(3) . Una célula aislada que contiene el agente de ARNbc, o una sal del mismo, del párrafo 1 o 2.
(4) . Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen que codifica AGT que comprende el agente de ARNbc, o una sal del mismo, del párrafo 1 o 2.
(5) . Una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNbc, o una sal del mismo, del párrafo 1 o 2, y una formulación lipídica.
(6) . Un métodoin vitropara inhibir la expresión de un gen de AGT en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con el agente de ARNbc, o una sal del mismo, del párrafo 1 o 2 o la composición farmacéutica del párrafo 4 o 5, inhibiendo de este modo la expresión del gen de AGT en la célula.
(7) . El agente de ARNbc, o una sal del mismo, del párrafo 1 o 2 o la composición farmacéutica del párrafo 4 o 5 para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al AGT.
(8) . El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso del párrafo 7, en donde al sujeto se le ha diagnosticado un trastorno asociado al AGT,
opcionalmente en donde el trastorno asociado al AGT se selecciona del grupo que consiste en presión arterial elevada, hipertensión, hipertensión inconstante, hipertensión primaria, hipertensión secundaria, hipertensión sistólica o diastólica aislada, hipertensión asociada al embarazo, hipertensión diabética, hipertensión resistente, hipertensión refractaria, hipertensión paroxística, hipertensión renovascular, hipertensión de Goldblatt, hipertensión asociada con baja actividad de renina plasmática o concentración de renina plasmática, hipertensión ocular, glaucoma, hipertensión pulmonar, hipertensión portal, hipertensión venosa sistémica, hipertensión sistólica, hipertensión lábil; cardiopatía hipertensiva, nefropatía hipertensiva, ateroesclerosis, arteriesclerosis, vasculopatía, nefropatía diabética, retinopatía diabética, insuficiencia cardíaca crónica, miocardiopatía, miopatía cardíaca diabética, glomeruloesclerosis, coartación aórtica, aneurisma aórtico, fibrosis ventricular, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, angina de pecho, ictus, nefropatía, insuficiencia renal, esclerosis sistémica, restricción del crecimiento intrauterino (RCIU), restricción del crecimiento fetal, obesidad, esteatosis hepática/hígado graso, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), esteatosis hepática no alcohólica (EHNA); intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 2 (diabetes no insulinodependiente) y síndrome metabólico.
(9) . El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso del párrafo 7 u 8, en donde el contacto de la célula con el agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica inhibe la expresión de AGT en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %.
(10) . El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso de uno cualquiera de los párrafos 7-9, en donde el sujeto:
(i) tiene una presión arterial sistólica de al menos 130 mm Hg o una presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg;
(ii) tiene una presión arterial sistólica de al menos 140 mm Hg y una presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg;
(iii) es humano; y/o
(iv) es parte de un grupo susceptible a la sensibilidad a la sal, tiene sobrepeso, es obeso o está embarazada.
(11) . El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso de uno cualquiera de los párrafos 7-10, en donde el agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y/o por vía subcutánea; y/o se administra al sujeto un agente terapéutico adicional para el tratamiento de la hipertensión, opcionalmente en donde el agente terapéutico adicional:
(a) se selecciona del grupo que consiste en un diurético, un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA), un antagonista del receptor de la angiotensina II, un beta-bloqueante, un vasodilatador, un bloqueador de los canales de calcio, un antagonista de la aldosterona, un agonista de alfa2, un inhibidor de la renina, un alfa-bloqueante, un agente adrenérgico de acción periférica, un agonista parcial selectivo del receptor D1, un antagonista alfa-adrenérgico no selectivo, un producto sintético, un agente antimineralocorticoide esteroideo, un inhibidor de la neprilisina y del receptor de la angiotensina (INRA), Entresto®, sacubitrilo/valsartán; o un antagonista del receptor de endotelina (ERA), sitaxentán, ambrisentán, atrasentán, BQ-123, zibotentán, bosentán, macitentán y tezosentán; o una combinación de cualquiera de los anteriores; y un agente terapéutico para la hipertensión formulado como una combinación de agentes; o (b) comprende un antagonista del receptor de la angiotensina II, en donde además, opcionalmente, el antagonista del receptor de la angiotensina II se selecciona del grupo que consiste en losartán, valsartán, olmesartán, eprosartán y azilsartán.
(12) . Un kit que comprende el agente de ARNbc, o una sal del mismo, del párrafo 1 o 2 o la composición farmacéutica del párrafo 4 o 5.
La presente divulgación proporciona composiciones de ARNi que afectan a la escisión mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen que codifica el angiotensinógeno (AGT). El AGT puede estar dentro de una célula, p. ej., una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto humano.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del angiotensinógeno (AGT), en donde el agente de ARNbc comprende una hebra de sentido y una hebra de antisentido que forman una región bicatenaria, en donde la hebra de sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de uno cualquiera de los nucleótidos 635-658, 636-658, 642-667, 642-664, 645-667, 1248-1273, 1248-1272, 1248-1270, 1250-1272, 1251-1273, 1580-1602, 1584-1606, 1587-1609, 1601-1623, 1881-1903, 2074-2097, 2074-2096, 2075-2097, 2080-2102, 2272-2294, 2276-2298, 2281-2304, 2281-2303 o 2282 2304 de la SEQ ID NO:1 y la hebra de antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.
En ciertas opciones, la hebra de sentido comprende al menos 21 nucleótidos contiguos de uno cualquiera de los nucleótidos 635-658, 636-658, 642-667, 642-664, 645-667, 1248-1273, 1248-1272, 1248-1270, 1250-1272, 1251 1273, 1580-1602, 1584-1606, 1587-1609, 1601-1623, 1881-1903, 2074-2097, 2074-2096, 2075-2097, 2080-2102, 2272-2294, 2276-2298, 2281-2304, 2281-2303 o 2282-2304 de la SEQ ID NO: 1. En ciertas opciones, la hebra de antisentido comprende al menos 21 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.
En ciertas opciones, la hebra de antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la hebra de antisentido de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD 85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD 85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385. En ciertas opciones, la hebra de sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la hebra de sentido de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703,
AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD 85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD 85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385. En ciertas opciones, las hebras de sentido y antisentido comprenden secuencias de nucleótidos de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD 85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD 85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD 85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385.
En ciertas opciones, la hebra de antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la hebra de antisentido de AD-85481 (5'-UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA-3' (SEQ ID NO: 9)). En ciertas opciones, la hebra de sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de las secuencias de nucleótidos de la hebra de sentido de AD-85481 (5'-GUCAUCCACAAUGAGAGUACA-3' (SEQ ID NO: 10)). En ciertas opciones, las hebras de sentido y antisentido comprenden las secuencias de nucleótidos de las hebras de sentido y antisentido de AD-85481 (5'-UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-GUCAUCCACAAUGAGAGUACA-3'
(SEQ ID NO: 10)).
En ciertas opciones, el agente de ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado. En ciertas opciones, sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra de sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra de antisentido comprenden una modificación. En ciertas opciones, todos los nucleótidos de la hebra de sentido y todos los nucleótidos de la hebra de antisentido comprenden una modificación. En ciertas opciones, al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo de un desoxinucleótido, un nucleótido de desoxitimina (dT) 3'-terminal, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido con restricción conformacional, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforoamidato, un nucleótido de base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato, un nucleótido que comprende un mimético de 5'-fosfato, un nucleótido de desestabilización térmica, un nucleótido modificado con glicol (GNA) y un nucleótido modificado con 2-O-(N-metilacetamida); y combinaciones de los mismos. En ciertas opciones, las modificaciones en los nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-alquilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo, GNA y combinaciones de los mismos. En ciertas opciones, las modificaciones en los nucleótidos son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro. En ciertas opciones, al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido modificado con glicol (GNA) y un nucleótido modificado con 2-O-(N-metilacetamida); y combinaciones de los mismos. En ciertas opciones, al menos una de las modificaciones de nucleótidos es una modificación de nucleótidos de desestabilización térmica. En ciertas opciones, la modificación de nucleótidos de desestabilización térmica se selecciona del grupo que consiste en una modificación abásica; un emparejamiento incorrecto con el nucleótido opuesto en la doble cadena; y una modificación del azúcar desestabilizadora, una modificación de 2'-desoxi, un nucleótido acíclico, un ácido nucleico desbloqueado (UNA) y un ácido nucleico de glicerol (GNA)
En ciertas opciones, la región bicatenaria tiene entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. En ciertas opciones, la región bicatenaria tiene 21 nucleótidos de longitud. En ciertas opciones, cada hebra del agente de ARNbc tiene de forma independiente no más de 30 nucleótidos de longitud. En ciertas opciones, al menos una hebra del agente de ARNbc comprende un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o al menos 2 nucleótidos.
En ciertas opciones, el agente de ARNbc comprende además un ligando. En ciertas opciones, el ligando se conjuga con el extremo 3' de la hebra de sentido del agente de ARNbc. En ciertas opciones, el ligando es un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc), p. ej., en donde el ligando es
En ciertas opciones, el agente de ARNbc se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
y, en donde X es O o S, p. ej., en donde X es O.
En ciertas opciones, la divulgación proporciona un agente de ARNbc, en donde la hebra de antisentido comprende una región de complementariedad con un ARNm que codifica el AGT humano, en donde la región de complementariedad comprende al menos 19 nucleótidos de una de las secuencias de hebra de antisentido de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385. En ciertas opciones, la hebra de antisentido comprende una región de complementariedad con un ARNm que codifica el AGT humano, en donde la región de complementariedad comprende una cualquiera de las secuencias de hebra de antisentido de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385. En ciertas opciones, la región de complementariedad consiste en una cualquiera de las secuencias de hebra de antisentido de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385.
En ciertas opciones, la divulgación proporciona un agente de ARNbc, en donde la hebra de antisentido comprende la secuencia de nucleótidos químicamente modificada de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385.
En ciertas opciones, la divulgación proporciona un agente de ARNbc, en donde la hebra de antisentido comprende la secuencia de nucleótidos químicamente modificada de la doble cadena AD-85481 (5'-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3' (SEQ ID NO: 11)) en donde a, c, g y u son 2'-O-metiladenosina-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato y 2'-O-metiluridina-3'-fosfato, respectivamente; Af, Cf, Gf y
Uf son 2'-O-fluoroadenosina-3'-fosfato, 2'-O-fluorocitidina-3'-fosfato, 2'-O-fluoroguanosina-3'-fosfato y 2'-O-fluorouridina-3'-fosfato, respectivamente; dT es una desoxitimina; s es un enlace de fosforotioato; y (Tgn) es el isómero
S del ácido nucleico de timidina-glicol (GNA).
En ciertas opciones, la divulgación proporciona un agente de ARNbc, en donde la hebra de antisentido y la hebra de sentido comprenden las secuencias de nucleótidos químicamente modificadas de una doble cadena seleccionada del grupo que consiste en AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 y AD-133385.
En ciertas opciones, la divulgación proporciona un agente de ARNbc, en donde la hebra de antisentido y la hebra de sentido comprenden las secuencias de nucleótidos químicamente modificadas de la doble cadena AD-85481 (5'-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3' (SEQ ID<n>O: 11) y 5'-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3' (SEQ ID NO: 12)) en donde a, c, g y u son 2'-O-metiladenosina-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato y
2'-O-metiluridina-3'-fosfato, respectivamente; Af, Cf, Gf y Uf son 2'-O-fluoroadenosina-3'-fosfato, 2'-O-fluorocitidina-3'-fosfato, 2'-O-fluoroguanosina-3'-fosfato y 2'-O-fluorouridina-3'-fosfato, respectivamente; dT es una desoxitimina; s es un enlace de fosforotioato; y (Tgn) es el isómero S del ácido nucleico de timidina-glicol (GNA); y en donde el extremo
3' de la hebra de sentido está opcionalmente conjugado con un ligando de N-[tris(GalNAc-alquil)-amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol (L96).
En ciertas opciones, la divulgación proporciona un agente de ARNbc, en donde la hebra de antisentido y la hebra de sentido consisten en las secuencias de nucleótidos químicamente modificadas de la doble cadena AD-85481 (5'-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3' (SEQ ID NO: 11) y 5'-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3' (SEQ ID NO: 12)), en donde el extremo 3' de la hebra de sentido está conjugado con un ligando de N-[tris(GalNAc-alquil)-amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol (L96), en donde a, c, g y u son 2'-O-metiladenosina-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato y 2'-O-metiluridina-3'-fosfato, respectivamente; Af, Cf, Gf y Uf son 2'-O-fluoroadenosina-3'-fosfato, 2'-O-fluorocitidina-3'-fosfato, 2'-O-fluoroguanosina-3'-fosfato y 2'-O-fluorouridina-3'-fosfato, respectivamente;
dT es una desoxitimina; s es un enlace de fosforotioato; y (Tgn) es el isómero S del ácido nucleico de timidina-glicol (GNA).
En ciertas opciones, la región bicatenaria del agente de ARNbc tiene aproximadamente 19-30 pares de nucleótidos de longitud, aproximadamente 19-25 pares de nucleótidos de longitud, aproximadamente 23-27 pares de nucleótidos de longitud, aproximadamente 19-23 pares de nucleótidos de longitud, aproximadamente 21-23 pares de nucleótidos de longitud.
En ciertas opciones, cada hebra del agente de ARNbc tiene de forma independiente entre 19 y 30 nucleótidos de longitud.
En ciertas opciones, el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado monovalente, bivalente o trivalente.
En ciertas opciones, el agente de ARNbc comprende además al menos un enlace internucleotídico de fosforotioato o metilfosfonato. En ciertas opciones, el enlace internucleotídico de fosforotioato o metilfosfonato se encuentra en el extremo 3' de una cadena. En ciertas opciones, la hebra es la hebra de antisentido. En ciertas opciones, la hebra es la hebra de sentido. En ciertas opciones, el enlace internucleotídico de fosforotioato o metilfosfonato se encuentra en el extremo 5' de una cadena. En ciertas opciones, la hebra es la hebra de antisentido. En ciertas opciones, la hebra es la hebra de sentido. En ciertas opciones, el enlace internucleotídico de fosforotioato o metilfosfonato se encuentra en los extremos 5' y 3' de una cadena. En ciertas opciones, la hebra es la hebra de antisentido.
En ciertas opciones, el agente de ARNbc en la posición 1 del extremo 5' de la hebra de antisentido de la doble cadena comprende un par de bases que es un par de bases AU.
En ciertas opciones, el agente de ARNbc comprende una hebra de sentido que tiene un total de 21 nucleótidos y una hebra de antisentido que tiene un total de 23 nucleótidos.
En un aspecto, la divulgación proporciona una célula que contiene el agente de ARNbc de la divulgación.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen que codifica el AGT que comprende el agente de ARNbc de la divulgación. En ciertas opciones, la composición farmacéutica comprende el agente de ARNbc y una formulación lipídica.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para inhibir la expresión de un gen de AGT en una célula, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto la célula con el agente de ARNbc o una composición farmacéutica de la divulgación; y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen de AGT, inhibiendo de este modo la expresión del gen de AGT en la célula.
En ciertas opciones, la célula está en un sujeto. En ciertas opciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas opciones, al sujeto se le ha diagnosticado un trastorno asociado al AGT.
En ciertas opciones, el trastorno asociado al AGT se selecciona entre presión arterial alta, hipertensión, hipertensión inconstante, hipertensión primaria, hipertensión secundaria, hipertensión sistólica o diastólica aislada, hipertensión asociada al embarazo, hipertensión diabética, hipertensión resistente, hipertensión refractaria, hipertensión paroxística, hipertensión renovascular, hipertensión de Goldblatt, hipertensión ocular, glaucoma, hipertensión pulmonar, hipertensión portal, hipertensión venosa sistémica, hipertensión sistólica, hipertensión lábil; cardiopatía hipertensiva, nefropatía hipertensiva, ateroesclerosis, arteriesclerosis, vasculopatía, nefropatía diabética, retinopatía diabética, insuficiencia cardíaca crónica, miocardiopatía, miopatía cardíaca diabética, glomeruloesclerosis, coartación aórtica, aneurisma aórtico, fibrosis ventricular, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, angina de pecho, ictus, nefropatía, insuficiencia renal, esclerosis sistémica, restricción del crecimiento intrauterino (RCIU), restricción del crecimiento fetal, obesidad, esteatosis hepática/hígado graso, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), esteatosis hepática no alcohólica (EHNA); intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 2 (diabetes no insulinodependiente) y síndrome metabólico.
En ciertas opciones, el sujeto tiene una presión arterial sistólica de al menos 130 mm Hg o una presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg. En ciertas opciones, el sujeto tiene una presión arterial sistólica de al menos 140 mm Hg y una presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg. En ciertas opciones, el sujeto es parte de un grupo susceptible a la sensibilidad a la sal, tiene sobrepeso, es obeso o está embarazada.
En ciertas opciones, el contacto de la célula con el agente de ARNbc inhibe la expresión de AGT en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % (p. ej., en comparación con el nivel de expresión de AGT antes de poner en contacto por primera vez la célula con el agente de ARNbc; p. ej., antes de la administración de una primera dosis del agente de ARNbc al sujeto). En ciertas opciones, la inhibición de la expresión de AGT disminuye el nivel de proteína AGT en una muestra de suero del sujeto en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %, p. ej., en comparación con el nivel de expresión de AGT antes de poner en contacto por primera vez la célula con el agente de ARNbc.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar un trastorno asociado al AGT en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el agente de ARNbc o la composición farmacéutica de la divulgación, tratando de este modo el trastorno asociado al AGT en el sujeto. En ciertas opciones, el sujeto tiene una presión arterial sistólica de al menos 130 mm Hg o una presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg. En ciertas opciones, el sujeto tiene una presión arterial sistólica de al menos 140 mm Hg y presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg. En ciertas opciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas opciones, el sujeto es parte de un grupo susceptible a la sensibilidad a la sal, tiene sobrepeso, es obeso o está embarazada.
En ciertas opciones de la divulgación, el agente de ARNbc se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg. En ciertas opciones, el agente de ARNbc se administra al sujeto por vía subcutánea. En ciertas opciones, se mide el nivel de AGT en el sujeto. En ciertas opciones, el nivel de AGT en el sujeto es un nivel de proteína AGT en una muestra(s) de sangre, muestra(s) de suero o muestra(s) de orina del sujeto.
En ciertas opciones, se administra al sujeto un agente terapéutico adicional para el tratamiento de la hipertensión. En ciertas opciones, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un diurético, un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA), un antagonista del receptor de la angiotensina II, un beta-bloqueante, un vasodilatador, un bloqueador de los canales de calcio, un antagonista de la aldosterona, un agonista de alfa2, un inhibidor de la renina, un alfa-bloqueante, un agente adrenérgico de acción periférica, un agonista parcial selectivo del receptor D1, un antagonista alfa-adrenérgico no selectivo, un producto sintético y un agente antimineralocorticoide esteroideo; o una combinación de cualquiera de los anteriores, y un agente terapéutico para la hipertensión formulado como una combinación de agentes. En ciertas opciones, el agente terapéutico adicional comprende un antagonista del receptor de la angiotensina II, p. ej., losartán, valsartán, olmesartán, eprosartán y azilsartán. En ciertas opciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la neprilisina y del receptor de la angiotensina (INRA), p. ej., Entresto®, sacubitrilo/valsartán; o un antagonista del receptor de endotelina (ERA), p. ej., sitaxentán, ambrisentán, atrasentán, BQ-123, zibotentán, bosentán, macitentán y tezosentán.
La divulgación también proporciona usos de los agentes de ARNbc y las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento para el tratamiento de un trastorno asociado al AGT. En ciertas opciones, los usos incluyen cualquiera de los métodos proporcionados por la divulgación.
La divulgación proporciona kits que comprenden un agente de ARNbc de la divulgación. En ciertas opciones, la divulgación proporciona kits para practicar un método de la divulgación.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es un gráfico que muestra los niveles de proteína AGT en suero en macacos cangrejeros (n = 3 por grupo) tratados con una dosis única de 3 mg/kg de los ARNip indicados. Los niveles de AGT se muestran como porcentaje del nivel de AGT antes del tratamiento.
La figura 1B es un gráfico que muestra los niveles de proteína AGT en suero en macacos cangrejeros (n = 3 por grupo) tratados con una única dosis de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 3 mg/kg de AD-85481 o AD-67327 el día 1. Los niveles de AGT se muestran como porcentaje del nivel de AGT antes del tratamiento.
La figura 1C es un gráfico que muestra los niveles de proteína AGT en suero en macacos cangrejeros (n = 3 por grupo) a los que se administró una dosis de 1 mg/kg de AD-85481 o AD-67327 una vez cada cuatro semanas durante tres dosis. Los niveles de AGT se muestran como porcentaje del nivel de AGT antes del tratamiento. Las figuras 2A-2G muestran los resultados de diversos parámetros en un estudio de ratas con hipertensión espontánea (n=9 por grupo) tratadas con un vehículo, valsartán (31 mg/kg/día), un ARNip-AGT específico de rata (10 mg/kg cada 2 semanas), captopril (100 mg/kg/día), valsartán y captopril, o valsartán y ARNip-AGT.
La figura 2A muestra los niveles de AGT en plasma al inicio (barras lisas) y al final (barras punteadas) del estudio (a las cuatro semanas).
La figura 2B muestra las lecturas diarias de presión arterial en comparación con el valor inicial.
La figura 2C es un gráfico que muestra los cocientes del peso del corazón:longitud tibial.
La figura 2D es un gráfico que muestra el nivel de actividad de la renina en plasma al inicio (barras lisas) y al final (barras punteadas) del estudio (a las cuatro semanas).
La figura 2E es un gráfico del peso del corazón:longitud tibial representado frente a la presión arterial media (PAM) en mm Hg.
La figura 2F es un gráfico del tamaño de los cardiomiocitos.
La figura 2G es un gráfico de los niveles de la prohormona N-terminal del péptido natriurético de tipo b (proNT-PNB).
La figura 3 es un gráfico que muestra los niveles de AGT en orina en el estudio de ratas con hipertensión espontánea.
La figura 4A es un gráfico que muestra el nivel de Ang I en sangre en el estudio de ratas con hipertensión espontánea.
La figura 4B es un gráfico que muestra el nivel de Ang II en sangre en el estudio de ratas con hipertensión espontánea.
La figura 4C es un gráfico que muestra el cociente entre Ang II en sangre y Ang I en sangre en el estudio de ratas con hipertensión espontánea.
La figura 5A es un gráfico que muestra el nivel de Ang I renal en el estudio de ratas con hipertensión espontánea. La figura 5B es un gráfico que muestra el nivel de Ang II renal en el estudio de ratas con hipertensión espontánea. La figura 5C es un gráfico que muestra el cociente entre Ang II renal y Ang I renal en el estudio de ratas con hipertensión espontánea.
La figura 6A es un gráfico que muestra el nivel del receptor de la angiotensina 1a en la corteza y la médula del riñón en el estudio de hipertensión espontánea en ratas.
La figura 6B es un gráfico que muestra el nivel del receptor de la angiotensina 1b en la corteza y la médula del riñón en el estudio de hipertensión espontánea en ratas.
La figura 6C es un gráfico que muestra el nivel de ECA en la corteza y la médula del riñón en el estudio de hipertensión espontánea en ratas.
La figura 7 es un gráfico que muestra el volumen urinario al inicio y 4 semanas después del inicio del tratamiento en el estudio de hipertensión espontánea en ratas.
La figura 8A es un gráfico que muestra los pesos corporales promedio de ratones con obesidad inducida por una dieta rica en grasas (OID) o ratones alimentados con comida normal (n = 5 por grupo) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS.
La figura 8B es un gráfico que muestra los pesos terminales del hígado, del tejido adiposo y muscular (n = 5 por grupo) de ratones con obesidad inducida por dieta alta en grasas (DIO) o ratones alimentados con comida normal tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS.
La figura 9A es un gráfico que muestra los cambios en los niveles de glucosa en plasma (mg/dl) en ratones con obesidad inducida por dieta alta en grasas (DIO) o ratones alimentados con comida normal (n = 5 por grupo) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS la semana 0 antes de la primera dosis de tratamiento.
La figura 9B es un gráfico que muestra los niveles de glucosa en plasma (mg/dl) en ratones con obesidad inducida por dieta alta en grasas (DIO) o ratones alimentados con comida normal (n = 5 por grupo) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS la semana 6 del experimento.
La figura 9C es un gráfico que muestra los niveles de glucosa en plasma (mg/dl) en ratones con obesidad inducida por dieta alta en grasas (DIO) o ratones alimentados con comida normal (n = 5 por grupo) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS la semana 12 del experimento.
La figura 10A es un gráfico que muestra los pesos corporales promedio de ratones alimentados con alto contenido de grasa y fructosa (HF HFr) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS o ratones alimentados con comida normal (LFD).
La figura 10B es un gráfico que muestra el aumento de peso acumulado promedio de ratones alimentados con alto contenido de grasa y fructosa (HF HFr) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS o ratones alimentados con comida normal (LFD).
Las figuras 11A-11C son gráficos que muestran enzimas hepáticas en suero en ratones alimentados con alto contenido de grasa y fructosa (HF HFr) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS o ratones alimentados con comida normal (LFD) la semana 20 del experimento.
La figura 11A es un gráfico que muestra los niveles de alanina transaminasa (ALT) en ratones alimentados con alto contenido de grasa y fructosa (HF HFr) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS o ratones alimentados con comida normal (LFD).
La figura 11B es un gráfico que muestra los niveles de aspartato transaminasa (AST) en ratones alimentados con alto contenido de grasa y alto contenido de fructosa (HF HFr) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS o ratones alimentados con comida normal (LFD).
La figura 11C es un gráfico que muestra los niveles de glutamato deshidrogenasa (GLDH) en ratones alimentados con alto contenido de grasa y fructosa (HF HFr) tratados con un agente de ARNbc de AGT o PBS o ratones alimentados con comida normal (LFD).
Descripción detallada de la divulgación
La presente divulgación proporciona composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen de AGT. El gen puede estar dentro de una célula, p. ej., una célula dentro de un sujeto, tal como un ser humano. El uso de estos ARNi permite la degradación selectiva de los ARNm del gen correspondiente (gen de AGT) en mamíferos.
Los ARNi de la divulgación se han diseñados para dirigirse al gen de AGT humano, incluidas partes del gen que se conservan en los ortólogos de AGT de otras especies de mamíferos. Sin pretender quedar limitados a teoría alguna, se cree que una combinación o subcombinación de las propiedades anteriores y los sitios diana específicos o las modificaciones específicas en estos ARNi confieren a los ARNi de la divulgación mejor eficacia, estabilidad, potencia, durabilidad y seguridad.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona métodos para tratar y prevenir un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión, mediante composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen de AGT.
Los ARNi de la divulgación incluyen una cadena de ARN (la hebra de antisentido) que tiene una región que tiene una longitud de hasta aproximadamente 30 nucleótidos o menos, p. ej., 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21 28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud, región que es sustancialmente complementaria de al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen de AGT.
En ciertas opciones, una o ambas hebras de los agentes de iARN bicatenarios de la divulgación tienen una longitud de hasta 66 nucleótidos, p. ej., 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleótidos de longitud, con una región de al menos 19 nucleótidos contiguos que es sustancialmente complementaria de al menos una parte de un transcrito de ARNm de un gen de AGT. En algunas opciones, tales agentes de ARNi que tienen hebras de antisentido de mayor longitud pueden incluir preferiblemente una segunda cadena de ARN (la hebra de sentido) de 20-60 nucleótidos de longitud en donde las hebras de sentido y antisentido forman una doble cadena de 18-30 nucleótidos contiguos.
El uso de los ARNi de la divulgación permite la degradación selectiva de los ARNm del gen correspondiente (gen de AGT) en mamíferos. Mediante ensayosin vitroein vivo,los presentes inventores han demostrado que los ARNi dirigidos a un gen de AGT pueden mediar en la iARN, lo que da lugar a una inhibición significativa de la expresión de AGT. La inhibición de la expresión de AGT en dicho sujeto evitará o tratará el desarrollo de un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión. Por lo tanto, los métodos y composiciones que incluyen estos ARNi son útiles para prevenir y tratar a un sujeto susceptible o al que se ha diagnosticado un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión. Los métodos y composiciones del presente documento son útiles para reducir el nivel de AGT en un sujeto.
La siguiente descripción detallada describe cómo preparar y usar composiciones que contienen ARNi para inhibir la expresión de un gen de AGT así como composiciones, usos y métodos para tratar a sujetos que se beneficiarían de la reducción de la expresión de un gen de a Gt , p. ej., sujetos susceptibles o a los que se ha diagnosticado un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión.
I. Definiciones
Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, en primer lugar, se definen determinados términos. Además, cabe señalar que siempre que se cite un valor o intervalo de valores de un parámetro, se pretende que los valores e intervalos intermedios a los valores citados también formen parte de la presente divulgación.
En el presente documento, los artículos "un" y "uno(a)" se usan para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento, p. ej., una pluralidad de elementos.
La expresión "que incluye" se utiliza en el presente documento para expresar, y se utiliza indistintamente con, la expresión "que incluye, aunque no de forma limitativa".
El término "o" se utiliza en el presente documento para expresar, y se utiliza indistintamente con, la expresión "y/o", salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, por "hebra de sentido o hebra de antisentido" se entiende "hebra de sentido o hebra de antisentido o hebra de sentido y hebra de antisentido".
El término "aproximadamente" se utiliza en el presente documento para expresar dentro de los intervalos típicos de tolerancias en la técnica. Por ejemplo, "aproximadamente" puede entenderse como aproximadamente 2 desviaciones estándar de la media. En ciertas opciones, aproximadamente significa ±10 %. En ciertas opciones, aproximadamente significa ±5 %. Cuando está presente aproximadamente antes de una serie de números o un intervalo, se entiende que "aproximadamente" puede modificar cada uno de los números de la serie o intervalo.
Se entiende que la expresión "al menos" delante de un número o serie de números incluye el número adyacente a la expresión "al menos", y todos los números o elementos integrantes posteriores que podrían incluirse de forma lógica, como se desprende del contexto. Por ejemplo, el número de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico debe ser un elemento integrante. Por ejemplo, "al menos 19 nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de 21 nucleótidos" significa que 19, 20 o 21 nucleótidos tienen la propiedad indicada. Cuando está presente al menos antes de una serie de números o un intervalo, se entiende que "al menos" puede modificar cada uno de los números de la serie o intervalo.
Como se utiliza en el presente documento, se entiende por "no más de" o "menos de" el valor adyacente a la expresión y los valores o elementos integrantes inferiores lógicos, como resulte lógico por el contexto, hasta cero. Por ejemplo, una doble cadena con un saliente de "no más de 2 nucleótidos" tiene un saliente de 2, 1 o 0 nucleótidos. Cuando está presente "no más de" antes de una serie de números o un intervalo, se entiende que "no más de" puede modificar cada uno de los números de la serie o intervalo. Como se utiliza en el presente documento, los intervalos incluyen tanto el límite superior como el inferior.
En caso de conflicto entre una secuencia y su sitio indicado en un transcrito u otra secuencia, la secuencia de nucleótidos citada en la memoria descriptiva tiene prioridad.
Como se utiliza en el presente documento, "angiotensinógeno", utilizado indistintamente con el término "AGT", se refiere al gen y polipéptido bien conocidos, conocido también en la técnica como inhibidor de la serpina peptidasa, clado A, miembro 8; antiproteinasa alfa-1; antitripsina; SERPINA8; angiotensina I; serpina A8; angiotensina II; angiotensinógeno antiproteinasa alfa-1; antitripsina; pre-angiotensinógeno 2; ANHU; inhibidor de la serina proteinasa; e inhibidor de la cisteína proteinasa.
El término "AGT" incluye AGT humano, cuya secuencia de aminoácidos y codificante completa se pueden encontrar, por ejemplo, en el n.° de referencia de GenBank GI: 188595658 (NM_000029.3; SEQ ID NO: 1); AGT deMacaca fascicularis,cuya secuencia de aminoácidos y codificante completa se pueden encontrar, por ejemplo, en el n.° de referencia de GenBank GI: 90075391 (AB170313.1: SEQ ID<n>O: 3); AGT de ratón(Mus musculus),cuya secuencia de aminoácidos y codificante completa se pueden encontrar, por ejemplo, en el n.° de referencia de GenBank GI: 113461997 (NM_007428.3; SEQ iD NO: 5); y AGT de rata(Rattus norvegicus)AGT, cuya secuencia de aminoácidos y codificante completa, por ejemplo, se pueden encontrar en por ejemplo, el n.° de referencia de GenBank GI:51036672 (NM_134432; SEQ ID NO: 7).
Están disponibles ejemplos adicionales de secuencias de ARNm de AGT utilizando bases de datos disponibles públicamente, p. ej., GenBank, UniProt, OMIM y el sitio web del proyecto del genoma deMacaca.
El término "AGT", como se utiliza en el presente documento, también se refiere a variaciones naturales de la secuencia de ADN del gen de AGT, tales como un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen de AGT. Se pueden encontrar SNP ilustrativos en la base de datos dbSNP disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp-_ref.cgi?geneld=183. Los ejemplos no limitativos de variaciones de secuencia dentro del gen de AGT incluyen, por ejemplo, los descritos en la patente de los EE. UU. n.° 5.589.584. Por ejemplo, las variaciones de secuencia dentro del gen de AGT pueden incluir como C ^ T en la posición -532 (en relación con el sitio de inicio de la transcripción); G ^ A en la posición -386; G ^ A en la posición -218; C ^ T en la posición -18; G ^ A y A ^ C en las posiciones -6 y -10; C ^ T en la posición 10 (sin traducir); C ^ T en la posición 521 (T174M); T^-C en la posición 597 (P199P); T^-C en la posición 704 (M235T; véanse también, p. ej., Reference SNP (refSNP) Cluster Report: rs699, disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP); A^-G en la posición 743 (Y248C); C ^ T en la posición 813 (N271N); G ^ A en la posición 1017 (L339L); C ^ A en la posición 1075 (L359M); y/o G ^ A en la posición 1162 (V388M).
Como se utiliza en el presente documento, "secuencia diana" se refiere a una parte contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARN formada durante la transcripción de un gen de AGT, incluido el ARNm que es producto del procesamiento del ARN de un producto de transcripción primario. La parte diana de la secuencia será al menos lo suficientemente larga como para servir como sustrato para la escisión dirigida por ARNi en o cerca de esa parte de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de AGT.
En una opción, la secuencia diana está dentro de la región codificante de proteínas de AGT.
La secuencia diana puede tener una longitud de aproximadamente 19-36 nucleótidos, p. ej., preferiblemente una longitud de aproximadamente 19-30 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia diana puede tener entre 19 y 30 nucleótidos, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21,21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud. También se contempla que formen parte de la divulgación intervalos y longitudes intermedios a los intervalos y longitudes mencionados anteriormente.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cadena que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia utilizando la nomenclatura de nucleótidos convencional.
"G", "C", "A", "T", y "U" generalmente representan un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina, timidina y uracilo como base, respectivamente. Sin embargo, se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" también puede referirse a un nucleótido modificado, como se detalla más adelante, o un resto de reemplazo sustituto (véase, p. ej., la tabla 2). El experto sabe muy bien que la guanina, la citosina, la adenina y el uracilo se pueden reemplazar por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de formación de pares de bases de un oligonucleótido que comprenda un nucleótido que porte dicho resto de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como base puede emparejarse con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina se pueden reemplazar en las secuencias de nucleótidos del ARNbc presentadas en la divulgación por un nucleótido que contenga, por ejemplo, inosina. En otro ejemplo, la adenina y la citosina en cualquier parte del oligonucleótido se pueden reemplazar con guanina y uracilo, respectivamente, para formar el par de bases oscilante G-U con el ARNm diana. Las secuencias que contienen dichos restos de reemplazo son adecuadas para las composiciones y los métodos presentados en la divulgación.
Los términos "ARNi", "agente de iARN", "agente de ARNi", "agente de interferencia de ARN" como se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren a un agente que contiene ARN, tal como se define ese término en el presente documento, y que media en la escisión dirigida de un transcrito de ARN a través de una vía del complejo silenciador inducido por<a>R<n>(RISC). El ARNi dirige la degradación específica de secuencia del ARNm mediante un proceso conocido como interferencia de ARN (iARN). El ARNi modula, p. ej., inhibe, la expresión de un gen de AGT en una célula, p. ej., una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto mamífero.
En una opción, un agente de ARNi de la divulgación incluye un ARN monocatenario que interactúa con una secuencia de ARN diana, p. ej., una secuencia de ARNm diana de a Gt , para dirigir la escisión del ARN diana. Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que el ARN bicatenario largo introducido en las células se descompone en ARNip mediante una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharpetal.(2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, una enzima de tipo ribonucleasa III, procesa el ARNbc a ARN de interferencia cortos de 19-23 pares de bases con salientes característicos de dos bases en 3' (Bernstein,et al.,(2001) Nature 409:363). A continuación, los ARNip se incorporan a un complejo silenciador inducido por ARN (RISC), donde una o más helicasas desenrollan la doble cadena de ARNip, permitiendo que la hebra de antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen,et al.,(2001) Cell 107:309). Al unirse al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir,et al.,(2001) Genes Dev. 15:188). Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere a un ARN monocatenario (ARNip) generado dentro de una célula y que promueve la formación de un complejo RISC para efectuar el silenciamiento del gen diana, es decir, un gen de AGT. En consecuencia, el término "ARNip" también se usa en el presente documento para referirse a un ARNi como se ha descrito anteriormente.
En ciertas opciones, el agente de iARN puede ser un ARNip monocatenario (iARNmc) que se introduce en una célula u organismo para inhibir un ARNm diana. Los agentes de iARN monocatenarios se unen a la endonucleasa RISC, Argonaute 2, que, a continuación, escinde el ARNm diana. Los ARNip monocatenarios generalmente tienen entre 15 y 30 nucleótidos y están modificados químicamente. El diseño y las pruebas de ARNip monocatenarios se describen en la patente de los EE. UU. n.° 8.101.348 y en Limaet al.,(2012) Cell 150:883-894. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos de antisentido descritas en el presente documento se puede utilizar como un ARNip monocatenario como se describe en el presente documento o modificado químicamente mediante los métodos descritos en Limaet al.,(2012) Cell 150:883-894.
En ciertas opciones, un "ARNi" para usar en las composiciones, los usos y los métodos de la divulgación es un ARN bicatenario y se denomina en el presente documento "agente de ARN bicatenario", "molécula de ARN bicatenario (ARNbc)", "agente de ARNbc" o "ARNbc". El término "ARNbc" se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura bicatenaria que comprende dos cadenas de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, que se indica que tienen orientaciones "sentido" y "antisentido" con respecto a un ARN diana, es decir, un gen de AGT. En algunas opciones de la divulgación, un ARN bicatenario (ARNbc) desencadena la degradación de un ARN diana, p. ej., un ARNm, a través de un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional denominado en el presente documento interferencia de ARN o iARN.
En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra de una molécula de ARNbc son ribonucleótidos, pero, como se describe en detalle en el presente documento, cada una o ambas hebras también pueden incluir uno o más que no son ribonucleótidos, p. ej., un desoxirribonucleótido o un nucleótido modificado. Además, como se usa en esta memoria descriptiva, un "ARNi" puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas; un ARNi puede incluir modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que tiene, de forma independiente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleotídico modificado o una nucleobase modificada, o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, la expresión nucleótido modificado abarca sustituciones, adiciones o eliminaciones de, p. ej., un grupo funcional o átomo, en los enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o bases nitrogenadas. Las modificaciones adecuadas para usar en los agentes de la divulgación incluyen todos los tipos de modificaciones divulgadas en el presente documento o conocidas en la técnica. Cualquier modificación de este tipo, como se usan en una molécula de tipo ARNip, está abarcada por "ARNi" o "agente de iARN" a los efectos de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones.
La región bicatenaria puede tener cualquier longitud que permita la degradación específica de un ARN diana deseado a través de una ruta de RISC y puede tener una longitud de entre aproximadamente 19 y 36 pares de bases, p. ej., aproximadamente 19-30 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 pares de bases de longitud, tal como aproximadamente 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21,21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 pares de bases de longitud. También se contempla que formen parte de la divulgación intervalos y longitudes intermedios a los intervalos y longitudes mencionados anteriormente.
Las dos hebras que forman la estructura bicatenaria pueden ser partes diferentes de una molécula de ARN más grande o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos hebras son parte de una molécula más grande y, por lo tanto, están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura bicatenaria, la cadena de ARN conectora se conoce como "bucle en horquilla". Un bucle en horquilla puede comprender al menos un nucleótido desapareado. En algunas opciones, el bucle en horquilla puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 23 o más nucleótidos desapareados. En algunas opciones, el bucle en horquilla puede tener 10 o menos nucleótidos. En algunas opciones, el bucle en horquilla puede tener 8 o menos nucleótidos desapareados. En algunas opciones, el bucle en horquilla puede tener entre 4 y 10 nucleótidos desapareados. En algunas opciones, el bucle en horquilla puede tener entre 4 y 8 nucleótidos.
Cuando las dos hebras sustancialmente complementarias de un ARNbc están compuestas por moléculas de ARN separadas, no es necesario que esas moléculas estén conectadas covalentemente, pero pueden estarlo. Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios distintos de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura bicatenaria, la estructura de conexión se denomina "conector". Las cadenas de ARN pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la cadena más corta del ARNbc menos cualquier saliente que esté presente en la doble cadena. Además de la estructura bicatenaria, un iARN puede comprender salientes de uno o más nucleótidos.
En ciertas opciones, un agente de ARNi de la divulgación es un ARNbc, cada hebra del cual comprende entre 19 y 23 nucleótidos, que interactúa con una secuencia de ARN diana, p. ej., un gen de AGT, para dirigir la escisión del ARN diana.
En algunas opciones, un ARNi de la divulgación es un ARNbc de entre 24 y 30 nucleótidos que interactúa con una secuencia de ARN diana, p. ej., una secuencia de ARNm diana de AGT, para dirigir la escisión del ARN diana.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "saliente nucleotídico" se refiere a al menos un nucleótido desapareado que sobresale de la estructura bicatenaria de un ARNi bicatenario. Por ejemplo, cuando un extremo 3' de una hebra de un ARNbc se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa, hay un saliente nucleotídico. Un ARNbc puede comprender un saliente de al menos un nucleótido; como alternativa el saliente puede comprender al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos o más. Un saliente nucleotídico puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, incluido un desoxinucleótido/nucleósido. Los salientes pueden estar en la hebra de sentido, la hebra de antisentido o cualquier combinación de las mismas. Asimismo, los nucleótidos de un saliente pueden estar presentes en el extremo 5', extremo 3' o ambos extremos de una hebra de sentido o antisentido de un ARNbc.
En ciertas opciones, la hebra de antisentido de un ARNbc tiene un saliente de entre 1 y 10 nucleótidos, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, en el extremo 3' o en el extremo 5'. En ciertas opciones, el saliente de la hebra de sentido o la hebra de antisentido, o ambas, puede incluir longitudes ampliadas de más de 10 nucleótidos, p. ej., 1-30 nucleótidos, 2-30 nucleótidos, 10-30 nucleótidos, 10-25 nucleótidos, 10-20 nucleótidos o 10-15 nucleótidos de longitud. En ciertas opciones, hay un saliente ampliado en la hebra de sentido de la doble cadena. En ciertas opciones, está presente un saliente ampliado en el extremo 3' de la hebra de sentido de la doble cadena. En ciertas opciones, está presente un saliente ampliado en el extremo 5' de la hebra de sentido de la doble cadena. En ciertas opciones, hay un saliente ampliado en la hebra de antisentido de la doble cadena. En ciertas opciones, está presente un saliente ampliado en el extremo 3' de la hebra de antisentido de la doble cadena. En ciertas opciones, está presente un saliente ampliado en el extremo 5' de la hebra de antisentido de la doble cadena. En ciertas opciones, uno o más de los nucleótidos en el saliente ampliado se reemplazan con un nucleósido tiofosfato. En ciertas opciones, el saliente incluye una parte autocomplementaria de modo que el saliente es capaz de formar una estructura en horquilla que es estable en condiciones fisiológicas.
"Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos desapareados en ese extremo del agente de ARN bicatenario, es decir, no hay un saliente nucleotídico. Un agente de ARN bicatenario de "extremos romos" es bicatenario en toda su longitud, es decir, no hay salientes nucleotídicos en ninguno de los extremos de la molécula. Los agentes de iARN de la divulgación incluyen agentes de iARN sin saliente nucleotídico en un extremo (es decir, agentes con un saliente y un extremo romo) o sin salientes nucleotídicos en ninguno de los extremos. En la mayoría de los casos, dicha molécula será bicatenaria en toda su longitud.
La expresión "hebra de antisentido" o "hebra guía" se refiere a la hebra de un ARNi, p. ej., un ARNbc, que incluye una región que es sustancialmente complementaria de una secuencia diana, p. ej., un ARNm de AGT. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región de complementariedad" se refiere a la región de la hebra de antisentido que es sustancialmente complementaria de una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, p. ej., una secuencia de nucleótidos de AGT, como se define en el presente documento. Cuando la región de complementariedad no es completamente complementaria de la secuencia diana, los emparejamientos incorrectos pueden estar en las regiones internas o terminales de la molécula. En general, los emparejamientos incorrectos más tolerados se encuentran en las regiones terminales, p. ej., a una distancia de 5, 4 o 3 nucleótidos del extremo 5' o 3' del ARNi. En algunas opciones, un agente de ARN bicatenario de la divulgación incluye un emparejamiento incorrecto de nucleótidos en la hebra de antisentido. En algunas opciones, un agente de ARN bicatenario de la divulgación incluye un emparejamiento incorrecto de nucleótidos en la hebra de sentido. En algunas opciones, el emparejamiento incorrecto de nucleótidos está, por ejemplo, a una distancia de 5, 4, 3 nucleótidos del extremo 3' del ARNi. En otra opción, el emparejamiento incorrecto de nucleótidos está, por ejemplo, en el nucleótido 3'-terminal del ARNi.
La expresión "hebra de sentido" o "hebra pasajera", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cadena de un ARNi que incluye una región que es sustancialmente complementaria de una región de la hebra de antisentido como se define esa expresión en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, "prácticamente todos los nucleótidos están modificados" están modificados en gran medida, pero no en su totalidad, y no pueden incluir más de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos sin modificar.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región de escisión" se refiere a una región que está situada inmediatamente adyacente al sitio de escisión. El sitio de escisión es el sitio de la diana en el que se produce la escisión. En algunas opciones, la región de escisión comprende tres bases en uno de los extremos del sitio de escisión, e inmediatamente adyacentes a él. En algunas opciones, la región de escisión comprende dos bases en uno de los extremos del sitio de escisión, e inmediatamente adyacentes a él. En algunas opciones, el sitio de escisión se encuentra específicamente en el sitio al que se unen los nucleótidos 10 y 11 de la hebra de antisentido y la región de escisión comprende los nucleótidos 11, 12 y 13.
Como se utiliza en el presente documento, y salvo que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridar y formar una estructura bicatenaria en ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, tal como entenderá la persona experta. Tales condiciones pueden, por ejemplo, ser condiciones rigurosas, donde estas condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50 °C o 70 °C durante 12-16 horas seguido de lavado (véase, p. ej., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook,et al.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes que pueden encontrarse dentro de un organismo, pueden ser aplicables. El experto en la materia podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias complementarias dentro de un ARNi, p. ej., dentro de un ARNbc como se describe en el presente documento, incluyen la formación de pares de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos en toda la longitud de una o ambas secuencias de nucleótidos. Estas secuencias pueden denominarse "completamente complementarias" entre sí en el presente documento. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 5, 4, 3 o 2 pares de bases emparejadas incorrectamente tras la hibridación para formar una doble cadena de hasta 30 pares de bases, mientras se conserva la capacidad de hibridar en las condiciones más relevantes para su aplicación final, p. ej., inhibición de la expresión genética a través de una vía de RISC. Sin embargo, cuando se diseñan dos oligonucleótidos para formar, tras la hibridación, uno o más salientes monocatenarios, tales salientes no se considerarán emparejamientos incorrectos a la hora de determinar la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria del oligonucleótido más corto, todavía se puede denominar "totalmente complementario" para los fines descritos en el presente documento.
Las secuencias "complementarias", como se utiliza en el presente documento, también pueden incluir, o estar formadas totalmente a partir de, pares de bases distintos de los de Watson-Crick o pares de bases formados a partir de nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridar. Dichos pares de bases distintos de los de Watson-Crick incluyen, pero sin limitación, pares de bases oscilantes G:U o de Hoogstein.
Las expresiones "complementario", "totalmente complementario" y "sustancialmente complementario" en el presente documento se pueden utilizar con respecto a la compatibilidad de bases entre la hebra de sentido y la hebra de antisentido de un ARNbc, o entre la hebra de antisentido de un agente de ARN bicatenario y una secuencia diana, como se entenderá por el contexto de su uso.
Como se utiliza en el presente documento, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario de al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario de una parte contigua del ARNm de interés (p. ej., un ARNm que codifica un gen de AGT). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario de al menos una parte de un ARNm de AGT si la secuencia es sustancialmente complementaria de una parte ininterrumpida de un ARNm que codifica un gen de AGT.
En consecuencia, en algunas opciones, los polinucleótidos de hebra de sentido y los polinucleótidos antisentido divulgados en el presente documento son completamente complementarios de la secuencia de AGT diana. En otras opciones, los polinucleótidos de hebra de sentido o los polinucleótidos antisentido divulgados en el presente documento son sustancialmente complementarios de la secuencia de AGT diana y comprenden una secuencia de nucleótidos contigua que es al menos 80 % complementaria en toda su longitud de la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO:1 y 2, o un fragmento de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 2, tal como al menos 90 % o 95 % complementaria; o 100 % complementaria.
En consecuencia, en algunas opciones, los polinucleótidos de hebra de antisentido divulgados en el presente documento son completamente complementarios de la secuencia de AGT diana. En otras opciones, los polinucleótidos de hebra de antisentido divulgados en el presente documento son sustancialmente complementarios de la secuencia de AGT diana y comprenden una secuencia de nucleótidos contigua que es al menos aproximadamente 90 % complementaria en toda su longitud de la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la SEQ ID NO: 1, tal como aproximadamente 90% o aproximadamente 95%, complementaria. En ciertas opciones, el fragmento de la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo de nucleótidos 632-658, 635-658, 636-658, 1248-1273, 1248-1270, 1250-1272, 1251-1273, 1580-1602, 1584-1606, 1587-1609, 1601-1623, 1881-1903, 2074 2097, 2074-2096, 2075-2097, 2080-2102, 2272-2294, 2276-2298, 2281-2304, 2281-2303 o 2282-2304 de la SEQ ID NO: 1. En opciones preferidas, la doble cadena no consta de la hebra de sentido que consiste en uscsucccAfcCfUfUfuucuucuaauL96 (SEQ ID NO: 13) y la hebra de antisentido que consiste en asUfsuagAfagaaaagGfuGfggagascsu (SEQ ID NO: 14).
En algunas opciones, un ARNi de la divulgación incluye una hebra de antisentido que es sustancialmente complementaria de la secuencia de AGT diana y comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es al menos aproximadamente 90 % complementaria en toda su longitud de la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las hebras de sentido en la tabla 3, la tabla 5 o la tabla 6 o un fragmento de una cualquiera de las hebras de sentido en la tabla 3, la tabla 5 o la tabla 6, tal como aproximadamente 90%, 95% o 100% complementaria.
En algunas opciones, un ARNi de la divulgación incluye una hebra de sentido que es sustancialmente complementaria de un polinucleótido antisentido que, a su vez, es complementario de una secuencia de AGT diana y en donde el polinucleótido de hebra de sentido comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es al menos aproximadamente 90 % complementaria en toda su longitud de la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las hebras de antisentido en la tabla 3, 5 o 6, o un fragmento de una cualquiera de las hebras de antisentido en la tabla 3 o 5, tal como aproximadamente 90 %, 95 % o 100 %.
En ciertas opciones, las hebras de sentido y antisentido en la tabla 3 o la tabla 5 se seleccionan de las dobles cadenas AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637 y AD-85655.
En general, un "ARNi" incluye ribonucleótidos con modificaciones químicas. Tales modificaciones pueden incluir todos los tipos de modificaciones desveladas en el presente documento o conocidas en la técnica. Cualquier modificación de este tipo, como se usa en una molécula de ARNbc, está abarcada por "ARNi" a los efectos de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones.
En un aspecto de la divulgación, un agente para usar en los métodos y las composiciones de la divulgación es una molécula oligonucleotídica antisentido monocatenaria que inhibe un ARNm diana a través de un mecanismo de inhibición antisentido. La molécula oligonucleotídica antisentido monocatenaria es complementaria de una secuencia dentro del ARNm diana. Los oligonucleótidos antisentido monocatenarios pueden inhibir la traducción de manera estequiométrica mediante la formación de pares de bases con el ARNm y obstruyendo físicamente la maquinaria de traducción, véase Dias, N.et al.,(2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. La molécula oligonucleotídica antisentido monocatenaria puede tener entre aproximadamente 14 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y tener una secuencia que es complementaria de una secuencia diana. Por ejemplo, la molécula oligonucleotídica antisentido monocatenaria puede comprender una secuencia que tiene al menos aproximadamente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una cualquiera de las secuencias antisentido descritas en el presente documento.
La expresión "poner en contacto una célula con un ARNi", tal como un ARNbc, como se utiliza en el presente documento, incluye poner en contacto una célula por cualquier medio posible. Poner en contacto una célula con un ARNi incluye poner en contacto una célulain vitrocon el<a>R<ní>o poner en contacto una célulain vivocon el ARNi. El contacto puede realizarse directa o indirectamente. Por lo tanto, por ejemplo, el individuo que realiza el método puede poner el ARNi en contacto físico con la célula o, como alternativa, el ARNi puede ponerse en una situación que permita o provoque que posteriormente entre en contacto con la célula.
El contacto con una célulain vitrose puede realizar, por ejemplo, incubando la célula con el ARNi. El contacto con una célulain vivose puede realizar, por ejemplo, inyectando el ARNi en o cerca del tejido donde se encuentra la célula o inyectando el ARNi en otra área, p. ej., el torrente sanguíneo o el espacio subcutáneo, de manera que el agente llegue posteriormente al tejido donde se encuentra la célula con la que se va a poner en contacto. Por ejemplo, el ARNi puede contener o estar acoplado a un ligando, p. ej., GalNAc, que dirige el ARNi a un sitio de interés, p. ej., el hígado. También son posibles combinaciones de métodos de contactoin vitroein vivo.Por ejemplo, también se puede poner en contacto una célulain vitrocon un ARNi y posteriormente trasplantarse a un sujeto.
En ciertas opciones, poner en contacto una célula con un ARNi incluye "introducir" o "suministrar el ARNi a la célula" facilitando o efectuando la captación o absorción en la célula. La absorción o captación de un ARNi puede producirse mediante difusión sin ayuda o procesos celulares activos, o mediante agentes o dispositivos auxiliares. La introducción de un ARNi en una célula puede serin vitrooin vivo.Por ejemplo, para introducciónin vivo,el ARNi puede inyectarse en una localización tisular o administrarse sistémicamente. La introducciónin vitroen una célula incluye métodos conocidos en la técnica tales como electroporación y lipofección. Otros enfoques adicionales se describen en el presente documento a continuación o se conocen en la técnica.
La expresión "nanopartícula lipídica" o "NPL" es una vesícula que comprende una capa lipídica que encapsula una molécula farmacéuticamente activa, tal como una molécula de ácido nucleico, p. ej., un<a>R<ní>o un plásmido a partir del cual se transcribe un ARNi. Las NPL se describen en, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. n.° 6.858.225, 6.815.432, 8.158.601 y 8.058.069.
Como se utiliza en el presente documento, un "sujeto" es un animal, tal como un mamífero, incluido un primate (tal como un ser humano, un primate no humano, p. ej., un mono y un chimpancé), un mamífero no primate (tal como una vaca, un cerdo, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, una cobaya, un gato, un perro, una rata o un ratón) o un pájaro que exprese el gen diana, ya sea de forma endógena o heteróloga. En una opción, el sujeto es un ser humano, tal como un ser humano tratado o evaluado por una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción de la expresión de AGT; un ser humano en riesgo de sufrir una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción de la expresión de AGT; un ser humano que tiene una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción de la expresión de AGT; o ser humano tratado por una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción de la expresión de AGT como se describe en el presente documento. Los criterios de diagnóstico para un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión, se proporcionan a continuación. En algunas opciones, el sujeto es una mujer. En otras opciones, el sujeto es un hombre. En ciertas opciones, el sujeto es parte de un grupo susceptible a la sensibilidad a la sal, p. ej., negro o adulto mayor (>65 años de edad). En ciertas opciones, el sujeto tiene sobrepeso u obesidad, p. ej., un sujeto que padece obesidad central. En ciertas opciones, el sujeto es sedentario. En ciertas opciones, el sujeto está embarazado.
Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a un resultado beneficioso o deseado, tal como reducir al menos un signo o síntoma de un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión en un sujeto. El tratamiento también incluye una reducción de uno o más signos o síntomas asociados con la expresión indeseada de AGT, p. ej., activación del receptor de la angiotensina II de tipo 1 (AT<1>R) (p. ej., hipertensión, nefropatía crónica, ictus, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, aneurismas, arteriopatía periférica, cardiopatía, aumento del estrés oxidativo, p. ej., aumento de la formación de superóxido, inflamación, vasoconstricción, retención de sodio y agua, pérdida de potasio y magnesio, supresión de renina, hipertrofia de los miocitos y del músculo liso, aumento de la síntesis de colágeno, estimulación de fibrosis vascular, miocárdica y renal, aumento de la frecuencia y la fuerza de las contracciones cardíacas, alteración de la frecuencia cardíaca, p. ej., aumento de la arritmia, estimulación del inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI1), activación del sistema nervioso simpático y aumento de la secreción de endotelina), síntomas de hipertensión asociada al embarazo (p. ej., preeclampsia y eclampsia), incluidos, pero sin limitación, restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) o restricción del crecimiento fetal, síntomas asociados con la hipertensión maligna, síntomas asociados con el hiperaldosteronismo; disminución del alcance de la activación de AT<1>R indeseada; estabilización (es decir, ausencia de empeoramiento) del estado de activación crónica de AT<1>R; alivio o atenuación de la activación indeseada de AT<1>R (p. ej., hipertensión, nefropatía crónica, ictus, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, aneurismas, arteriopatía periférica, cardiopatía, aumento del estrés oxidativo, p. ej., aumento de la formación de superóxido, inflamación, vasoconstricción, retención de sodio y agua, pérdida de potasio y magnesio, supresión de renina, hipertrofia de los miocitos y del músculo liso, aumento de la síntesis de colágeno, estimulación de fibrosis vascular, miocárdica y renal, aumento de la frecuencia y la fuerza de las contracciones cardíacas, alteración de la frecuencia cardíaca, p. ej., aumento de la arritmia, estimulación del inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI1), activación del sistema nervioso simpático y aumento de la secreción de endotelina) ya sea detectable o indetectable. Los trastornos asociados al AGT también pueden incluir obesidad, esteatosis hepática/hígado graso, p. ej., esteatohepatitis no alcohólica (ENA) y esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 2 (diabetes no insulinodependiente) y síndrome metabólico. En ciertas opciones, la hipertensión incluye hipertensión asociada con baja actividad de renina plasmática o concentración de renina plasmática. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada en ausencia de tratamiento.
El término "menor" en el contexto del nivel de expresión del gen de AGT o de producción de proteína agt en un sujeto, o un marcador o síntoma de enfermedad se refiere a una disminución estadísticamente significativa de dicho nivel. La disminución puede ser de, por ejemplo, al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o inferior al nivel de detección para el método de detección en una célula o tejido relevante, p. ej., una célula hepática, u otra muestra objeto, p. ej., sangre o suero procedente de la misma, orina.
Como se utiliza en el presente documento, "prevención" o "prevenir", cuando se usan en referencia a una enfermedad o un trastorno, que se beneficiaría de una reducción de la expresión de un gen de AGT o de la producción de proteína agt, p. ej., en un sujeto susceptible a un trastorno asociado al AGT debido a, p. ej., envejecimiento, factores genéticos, cambios hormonales, alimentación y estilo de vida sedentario. En ciertas opciones, la enfermedad o trastorno es, p. ej., un síntoma de activación indeseada de AT<1>R, tal como hipertensión, nefropatía crónica, ictus, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, aneurismas, arteriopatía periférica, cardiopatía, aumento del estrés oxidativo, p. ej., aumento de la formación de superóxido, inflamación, vasoconstricción, retención de sodio y agua, pérdida de potasio y magnesio, supresión de renina, hipertrofia de los miocitos y del músculo liso, aumento de la síntesis de colágeno, estimulación de fibrosis vascular, miocárdica y renal, aumento de la frecuencia y la fuerza de las contracciones cardíacas, alteración de la frecuencia cardíaca, p. ej., aumento de la arritmia, estimulación del inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI1), activación del sistema nervioso simpático y aumento de la secreción de endotelina. Los trastornos asociados al AGT también pueden incluir obesidad, esteatosis hepática/hígado graso, p. ej., esteatohepatitis no alcohólica (ENA) y esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 2 (diabetes no insulinodependiente) y síndrome metabólico. En ciertas opciones, la hipertensión incluye hipertensión asociada con baja actividad de renina plasmática o concentración de renina plasmática. La probabilidad de desarrollar, p. ej., hipertensión, se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o más factores de riesgo de hipertensión no desarrolla hipertensión o desarrolla hipertensión con menos gravedad en relación con una población que tiene los mismos factores de riesgo y no recibe el tratamiento como se describe en el presente documento. No contraer un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión, o un retardo de meses o años en el tiempo que se tarda en contraer la hipertensión se considera una prevención eficaz. La prevención puede requerir la administración de más de una dosis del agente de ARNi.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "enfermedad asociada al angiotensinógeno" o "enfermedad asociada al AGT" es una enfermedad o un trastorno causado por, o asociado con, la activación del sistema reninaangiotensina-aldosterona (SRAA), o una enfermedad o un trastorno cuyos síntomas o progresión responden a la inactivación del SRAA. La expresión "enfermedad asociada al angiotensinógeno" incluye una enfermedad, un trastorno o una afección que se beneficiaría de la reducción de la expresión del AGT. Estas enfermedades suelen estar asociadas con la presión arterial alta. Los ejemplos no limitantes de enfermedades asociadas al angiotensinógeno incluyen hipertensión, p. ej., hipertensión inconstante (también conocida como prehipertensión), hipertensión primaria (también conocida como hipertensión esencial o hipertensión idiopática), hipertensión secundaria (también conocida como hipertensión no esencial), hipertensión sistólica o diastólica aislada, hipertensión asociada al embarazo (p. ej., preeclampsia, eclampsia y preeclampsia puerperal), hipertensión diabética, hipertensión resistente, hipertensión refractaria, hipertensión paroxística, hipertensión renovascular (también conocida como hipertensión renal), hipertensión de Goldblatt, hipertensión ocular, glaucoma, hipertensión pulmonar, hipertensión portal, hipertensión venosa sistémica, hipertensión sistólica, hipertensión lábil; cardiopatía hipertensiva, nefropatía hipertensiva, ateroesclerosis, arterioesclerosis, vasculopatía (incluida la enfermedad vascular periférica), nefropatía diabética, retinopatía diabética, insuficiencia cardíaca crónica, miocardiopatía, miopatía cardíaca diabética, glomeruloesclerosis, coartación aórtica, aneurisma aórtico, fibrosis ventricular, apnea del sueño, insuficiencia cardíaca (p. ej., disfunción sistólica ventricular izquierda), infarto de miocardio, angina de pecho, ictus, nefropatía, p. ej., nefropatía crónica o nefropatía diabética opcionalmente en el contexto del embarazo, insuficiencia renal, p. ej., insuficiencia renal crónica y esclerosis sistémica (p. ej., crisis renal por esclerodermia). En ciertas opciones, la enfermedad asociada al AGT incluye restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) o restricción del crecimiento fetal. En ciertas opciones, los trastornos asociados al AGT también incluyen obesidad, esteatosis hepática/hígado graso, p. ej., esteatohepatitis no alcohólica (ENA) y esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 2 (diabetes no insulinodependiente) y síndrome metabólico. En ciertas opciones, la hipertensión incluye hipertensión asociada con baja actividad de renina plasmática o concentración de renina plasmática.
Los umbrales de presión arterial alta y las etapas de la hipertensión se analizan en detalle a continuación.
En una opción, una enfermedad asociada al angiotensinógeno es la hipertensión primaria. La "hipertensión primaria" es el resultado de causas ambientales o genéticas (p. ej., como resultado de una causa médica subyacente que no resulta evidente).
En una opción, una enfermedad asociada al angiotensinógeno es la hipertensión secundaria. La "hipertensión secundaria" tiene un trastorno subyacente identificable que puede tener múltiples etiologías, incluyendo causas renales, vasculares y endocrinas, p. ej., enfermedad del parénquima renal (p. ej., riñones poliquísticos, enfermedad glomerular o intersticial), enfermedad vascular renal (p. ej., estenosis de las arterias renales, displasia fibromuscular), trastornos endocrinos (p. ej., exceso de adrenocorticoesteroides o mineralocorticoides, feocromocitoma, hipertiroidismo o hipotiroidismo, exceso de hormona del crecimiento, hiperparatiroidismo), coartación aórtica o uso de anticonceptivos orales.
En una opción, una enfermedad asociada al angiotensinógeno es la hipertensión asociada al embarazo, p. ej., hipertensión crónica del embarazo, hipertensión gestacional, preeclampsia, eclampsia, preeclampsia superpuesta a hipertensión crónica, síndrome HELLP e hipertensión gestacional (también conocida como hipertensión transitoria del embarazo, hipertensión crónica identificada en la segunda mitad del embarazo e hipertensión inducida por el embarazo (HIE)). A continuación se proporcionan los criterios de diagnóstico para la hipertensión asociada al embarazo.
En una opción, una enfermedad asociada al angiotensinógeno es la hipertensión resistente. La "hipertensión resistente" es la presión arterial que se mantiene por encima del objetivo (p. ej., por encima de 130 mm Hg sistólica o por encima de 90 diastólica) a pesar del uso concomitante de tres agentes antihipertensivos de diferentes clases, uno de los cuales es un diurético tiacídico. También se considera que los sujetos cuya presión arterial está controlada con cuatro o más medicamentos tienen hipertensión resistente.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad profilácticamente eficaz" también incluye una cantidad de un agente de iARN que produce algún efecto deseado con una relación entre beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. El ARNi empleado en los métodos de la presente divulgación se puede administrar en una cantidad suficiente para producir una relación entre beneficio/riesgo razonable aplicable a dicho tratamiento.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a los compuestos, materiales, composiciones o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de sujetos humanos y animales sin producir demasiada toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción entre beneficio/riesgo razonable.
La expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en el presente documento se refiere a un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, adyuvante de fabricación (p. ej., lubricante, talco magnesio, estearato de calcio o zinc o ácido estérico) o un material encapsulante disolvente, implicado en portar o transportar el compuesto de la invención de un órgano o parte del organismo a otro órgano o parte del organismo. Cada transportador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser nocivo para el sujeto que se trate. Dichos transportadores son conocidos en la técnica. Los transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen transportadores para administración mediante inyección.
El término "muestra", como se utiliza en el presente documento, incluye un grupo de líquidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como líquidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Los ejemplos de líquidos biológicos incluyen sangre, suero y líquidos serosos, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquidos oculares, linfa, orina, saliva y similares. Las muestras tisulares pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras pueden proceder de órganos particulares, partes de órganos o líquidos o células dentro de esos órganos. En ciertas opciones, las muestras pueden proceder del hígado (p. ej., hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado, tales como, p. ej., hepatocitos). En algunas opciones, una "muestra procedente de un sujeto" se refiere a orina obtenida del sujeto. Una "muestra procedente de un sujeto" puede referirse a sangre o suero o plasma procedente de sangre del sujeto.
I. ARNi de la divulgación
La presente divulgación proporciona ARNi que inhiben la expresión de un gen de AGT. En opciones preferidas, el ARNi incluye moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen de AGT en una célula, tal como una célula dentro de un sujeto, p. ej., un mamífero, tal como un ser humano susceptible a desarrollar un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión. El agente de iARNbc incluye una hebra de antisentido que tiene una región de complementariedad que es complementaria de al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen de AGT. La región de complementariedad tiene entre 19 y 30 nucleótidos de longitud (p. ej., aproximadamente 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 o 19 nucleótidos de longitud). Al entrar en contacto con una célula que expresa el gen de AGT, el ARNi inhibe la expresión del gen de AGT (p. ej., un gen de AGT de ser humano, de primate, de animal no primate o de rata) en al menos aproximadamente un 50 % según lo analizado mediante, por ejemplo, un método basado en PCR o ADN ramificado (ADNr), o mediante un método basado en proteínas, tal como mediante análisis de inmunofluorescencia, usando, por ejemplo, transferencia de Western o técnicas de citometría de flujo. En opciones preferidas, la inhibición de la expresión se determina mediante el método de qPCR proporcionado en los ejemplos, especialmente en el ejemplo 2 con el ARNip a una concentración de 10 nM en una línea celular de organismo adecuada proporcionada en el mismo. En opciones preferidas, la inhibición de la expresiónin vivose determina mediante la atenuación del gen humano en un roedor que expresa el gen humano, p. ej., un ratón o un ratón infectado por VAA que expresa el gen diana humano, p. ej., cuando se administra una dosis única de 3 mg/kg en el punto mínimo de la expresión del ARN. La expresión de ARN en el hígado se determina mediante los métodos de PCR proporcionados en el ejemplo 2.
Un ARNbc incluye dos hebras de ARN que son complementarias y se hibridan para formar una estructura bicatenaria en las condiciones en las que se utilizará el ARNbc. Una hebra de un ARNbc (la hebra de antisentido) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria y, en general, completamente complementaria, de una secuencia diana. La secuencia diana puede proceder de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen de AGT. La otra hebra (la hebra de sentido) incluye una región que es complementaria de la hebra de antisentido, de modo que las dos hebras se hibriden y formen una estructura bicatenaria cuando se combinen en las condiciones adecuadas. Como se describe en otro sitio en el presente documento y como se conoce en la técnica, las secuencias complementarias de un ARNbc también pueden estar contenidas como regiones autocomplementarias de una única molécula de ácido nucleico, en lugar de estar en oligonucleótidos separados.
En general, la estructura bicatenaria tiene una longitud de 19 a 30 pares de bases. De manera análoga, la región de complementariedad con la secuencia diana tiene una longitud de 19 a 30 nucleótidos.
En algunas opciones, el ARNbc tiene una longitud de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nucleótidos o de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 nucleótidos. En general, el ARNbc es lo suficientemente largo como para servir como sustrato para la enzima Dicer. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que los ARNbc de más de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud pueden servir como sustratos para Dicer. Como también reconocerá el experto habitual, la región de un ARN diana de escisión será con mayor frecuencia parte de una molécula de ARN mayor, a menudo una molécula de ARNm. Cuando sea relevante, una "parte" de una diana de ARNm es una secuencia contigua de una diana de ARNm de longitud suficiente para permitirle ser un sustrato para la escisión dirigida por iARN (es decir, escisión a través de una vía de RISC).
Un experto en la técnica también reconocerá que la región bicatenaria es una parte funcional primaria de un ARNbc, p. ej., una región bicatenaria de aproximadamente 19 a aproximadamente 30 pares de bases, p. ej., aproximadamente 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20 25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 pares de bases. Por lo tanto, en una opción, en la medida en que se procese a una doble cadena funcional, de, p. ej., 15-30 pares de bases, que se dirija a un ARN deseado para su escisión, una molécula de ARN o un complejo de moléculas de ARN que tenga una región bicatenaria de más de 30 pares de bases es un ARNbc. Por lo tanto, un experto habitual reconocerá que, en una opción, un miARN es un ARNbc. En otra opción, un ARNbc no es un miARN natural. En otra opción, un agente de ARNi útil para dirigirse a la expresión del gen de AGT no se genera en la célula diana mediante la escisión de un ARNbc mayor.
Un ARNbc como se describe en el presente documento puede incluir además uno o más salientes nucleotídicos monocatenarios, p. ej., de 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, 1, 2, 3 o 4 nucleótidos. Los ARNbc que tienen al menos un saliente nucleotídico pueden tener propiedades inhibidoras superiores en relación con sus homólogos de extremos romos. Un saliente nucleotídico puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, incluido un desoxinucleótido/nucleósido. Los salientes pueden estar en la hebra de sentido, la hebra de antisentido o cualquier combinación de las mismas. Asimismo, los nucleótidos de un saliente pueden estar presentes en el extremo 5', el extremo 3' o ambos extremos de una hebra de sentido o antisentido de un ARNbc.
Un ARNbc se puede sintetizar por los métodos habituales conocidos en la técnica. Los compuestos de iARN bicatenario de la divulgación se pueden preparar usando un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, las hebras individuales de la molécula de ARN bicatenario se preparan por separado. A continuación, se hibridan las hebras componentes. Las hebras individuales del compuesto de ARNip se pueden preparar mediante síntesis orgánica en fase de solución, en fase sólida o en ambas. La síntesis orgánica ofrece la ventaja de que las cadenas oligonucleotídicas que comprenden nucleótidos no naturales o modificados se pueden preparar fácilmente. De manera análoga, los oligonucleótidos monocatenarios de la divulgación se pueden preparar usando síntesis orgánica en fase de solución, en fase sólida o en ambas.
En un aspecto, un ARNbc de la divulgación incluye al menos dos secuencias de nucleótidos, una secuencia de sentido y una secuencia de antisentido. La hebra de sentido se selecciona del grupo de secuencias proporcionadas en las tablas 3, 5 y 6 y la hebra de antisentido correspondiente de la hebra de sentido se selecciona del grupo de secuencias de las tablas 3, 5 y 6. En este aspecto, una de las dos secuencias es complementaria de la otra de las dos secuencias, siendo una de las secuencias sustancialmente complementaria de una secuencia de un ARNm generado en la expresión de un gen de AGT. Así pues, en este aspecto, un ARNbc incluirá dos oligonucleótidos, donde un oligonucleótido se describe como la hebra de sentido en la tabla 5 o 6 y el segundo oligonucleótido se describe como la hebra de antisentido correspondiente de la hebra de sentido en la tabla 3, 5 o 6. En ciertas opciones, las secuencias sustancialmente complementarias del ARNbc están contenidas en oligonucleótidos separados. En otras opciones, las secuencias sustancialmente complementarias del ARNbc están contenidas en un único oligonucleótido. En ciertas opciones, la hebra de sentido o antisentido de la tabla 3 o 5 se selecciona de AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637 y AD-85655.
Se entenderá que, aunque las secuencias de la tabla 3 no se describen como secuencias modificadas o conjugadas, el ARN del ARNi de la divulgación, p. ej., un ARNbc de la divulgación, puede comprender una cualquiera de las secuencias expuestas en la tabla 3, o las secuencias de la tabla 5 o 6 que están modificadas, o las secuencias de la tabla 5 o 6 que están conjugadas. En otras palabras, la divulgación abarca ARNbc de las tablas 3, 5 y 6 sin modificar, sin conjugar, modificados o conjugados, como se describe en el presente documento.
El experto sabe muy bien que los ARNbc que tienen una estructura bicatenaria de aproximadamente 20 a 23 pares de bases, p. ej., 21 pares de bases, han sido considerados particularmente eficaces para inducir la interferencia por ARN (Elbashiret al.,EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han descubierto que también pueden ser eficaces estructuras bicatenarias de ARN más cortas o más largas (Chu y Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kimet al.(2005) Nat Biotech 23:222-226). En las opciones descritas anteriormente, en virtud de la naturaleza de las secuencias oligonucleotídicas proporcionadas en una cualquiera de las tablas 3, 5 y 6, los ARNbc descritos en el presente documento pueden incluir al menos una hebra de una longitud mínima de 21 nucleótidos. Puede esperarse razonablemente que las dobles cadenas más cortas que tengan una de las secuencias de las tablas 3, 5 y 6 menos solo unos pocos nucleótidos en uno o ambos extremos puedan ser igualmente eficaces en comparación con los ARNbc descritos anteriormente. Por tanto, los ARNbc que tienen una secuencia de al menos 19, 20 o más nucleótidos contiguos procedentes de una de las secuencias de las tablas 3, 5 y 6, y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión de un gen de AGT en no más de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25 o 30 % de inhibición de un ARNbc que comprende la secuencia completa, se contemplan como dentro del alcance de la presente divulgación.
Además, los ARN proporcionados en las tablas 3, 5 y 6 identifican uno o varios sitios en un transcrito de AGT que son susceptibles a la escisión mediada por RISC. Así pues, la presente divulgación presenta además ARNi que se dirigen al interior de uno de estos sitios. Como se utiliza en el presente documento, se dice que un ARNi se dirige al interior de un sitio particular de un transcrito de ARN si el ARNi promueve la escisión del transcrito en cualquier lugar dentro de ese sitio particular. Dicho ARNi incluirá generalmente al menos aproximadamente 19 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en las tablas 3, 5 y 6 acopladas a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen de AGT.
II. ARNi modificados de la divulgación
En ciertas opciones, el ARN del ARNi de la divulgación, p. ej., un ARNbc, no está modificado y no comprende, p. ej., modificaciones químicas ni conjugaciones conocidas en la técnica y descritas en el presente documento. En otras opciones, el ARN de un ARNi de la divulgación, p. ej., un ARNbc, está modificado químicamente para mejorar la estabilidad u otras características beneficiosas. En ciertas opciones de la divulgación, sustancialmente todos los nucleótidos de un ARNi de la divulgación están modificados. En otras opciones de la divulgación, todos los nucleótidos de un ARNi o sustancialmente todos los nucleótidos de un ARNi están modificados, es decir, no están presentes más de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos sin modificar en una cadena del ARNi.
Los ácidos nucleicos presentados en la divulgación se pueden sintetizar o modificar mediante métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L.et al.(Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE. UU. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de los extremos, p. ej., modificaciones del extremo 5' (fosforilación, conjugación, enlaces invertidos) o modificaciones del extremo 3' (conjugación, nucleótidos de ADN, enlaces invertidos, etc.); modificaciones de bases, p. ej., reemplazo con bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras o bases que se emparejan con un repertorio ampliado de miembros de unión, eliminación de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas; modificaciones del azúcar (p. ej., en la posición 2' o en la posición 4') o reemplazo del azúcar; o modificaciones de la cadena principal, incluida la modificación o el reemplazo de los enlaces fosfodiéster. Los ejemplos específicos de compuestos de ARNi útiles en las opciones descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, ARN que contienen cadenas principales modificadas o que no tienen enlaces internucleosídicos naturales. Los ARN que tienen cadenas principales modificadas incluyen, entre otros, los que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. Para los fines de esta memoria descriptiva, y como a veces se indica en la técnica, los ARN modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosídica también se pueden considerar oligonucleósidos. En algunas opciones, un ARNi modificado tendrá un átomo de fósforo en su cadena principal intemudeosídica.
Las cadenas principales de ARN modificado incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilo y otros alquil fosfonatos incluidos fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluidos 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos con enlaces 2'-5' de estos y los que tienen una polaridad invertida, en donde los pares de unidades nucleosídicas adyacentes tienen enlaces 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres.
Las patentes de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero sin limitación, las patentes de los EE. UU. n.° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243 5.177.195 5.188.897 5.264.423 5.276.019 5.278.302 5.286.717 5.321.131 5.399.676 5.405.939 5.453.496 5.455.233 5.466.677 5.476.925 5.519.126 5.536.821 5.541.316 5.550.111 5.563.253 5.571.799 5.587.361 5.625.050 6.028.188 6.124.445 6.160.109 6.169.170 6.172.209 6.239.265 6.277.603 6.326.199 6.346.614 6.444.423 6.531.590 6.534.639 6.608.035 6.683.167 6.858.715 6.867.294 6.878.805 7.015.315 7.041.816 7.273.933; 7.321.029; y la patente de los EE. UU. RE39464.
Las cadenas principales de ARN modificado que no incluyen un átomo de fósforo en ellas tienen cadenas principales que se forman mediante enlaces internucleosídicos alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomos mixtos y de alquilo o cicloalquilo o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estas incluyen las que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilen formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen componentes mixtos de N, O, S y CH<2>.
Las patentes de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero sin limitación, las patentes de los EE. UU. n.° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
Se contemplan miméticos de ARN adecuados para su uso en los ARNi proporcionados en el presente documento, en los que tanto el azúcar como el enlace internucleósido, es decir, la cadena principal, de las unidades nucleotídicas se reemplazan con nuevos grupos. Las unidades de bases se mantienen para hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico adecuado. Uno de dichos compuestos oligoméricos en los que un mimético de ARN que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación se denomina ácido nucleico peptídico (ANP). En compuestos de ANP, la cadena principal de azúcar de un ARN se reemplaza con una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de aza nitrógeno de la parte de amida de la cadena principal. Las patentes de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de dichos compuestos de ANP incluyen, pero sin limitación, las patentes de los EE. UU. n.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Se describen compuestos de ANP adicionales adecuados para su uso en los ARNi de la divulgación, por ejemplo, en Nielsenet al.,Science, 1991, 254, 1497-1500.
Algunas opciones presentadas en la divulgación incluyen ARN con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales de heteroátomos y, en particular, --CH<2>--NH--CH<2>-, -C H<2>—N(CH<3>)--O--CH<2>-- [conocido como cadena principal de metileno (metilimino) o MMI], --CH<2>--O--N(CH<3>)--CH<2>--, --CH<2>-N(CH<3>)--N(CH<3>)--CH<2>-- y -N(CH<3>)-C H<2>-C H<2>- [en donde la cadena principal de fosfodiéster nativo se representa como --O--P--O--CH<2>--] de la patente de los EE. UU. n.° 5.489.677 antes mencionada y las cadenas principales de amida de la patente de los EE. UU. n.° 5.602.240 antes mencionada. En algunas opciones, los ARN presentados en el presente documento tienen estructuras de cadena principal de morfolino de la patente de los EE.UU. n.° 5.034.506.
Los ARN modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNi, p. ej., ARNbc, presentados en el presente documento pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C<1>a C<1 0>, o alquenilo C<2>a C<1 0>y alquinilo sustituidos o sin sustituir. Las modificaciones adecuadas ilustrativas incluyen O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otras opciones, los ARNbc incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo C<1>a C<1 0>inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH<3>, OCN, Cl, Br, CN, CF<3>, OCF<3>, SOCH<3>, SO<2>CH<3>, ONO<2>, NO<2>, N<3>, NH<2>, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunas opciones, la modificación incluye un 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martinet al.,Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ilustrativa es 2'dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH<2>)<2>ON(CH<3>)<2>, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los siguientes ejemplos en el presente documento, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2. Otras modificaciones ilustrativas incluyen: nucleótidos 5'-Me-2'-F, nucleótidos 5'-Me-2'-OMe, 5'-Me-2'-desoxinucleótidos, (isómeros tanto R como S en estas tres familias); 2'-alcoxialquilo; y 2'-NMA (N-metilacetamida).
Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-flúor (2'-F). También pueden producirse modificaciones similares en otras posiciones en el ARN de un ARNi, en particular, la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en ARNbc con enlaces 2'-5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los ARNi también pueden tener miméticos de azúcar, tales como restos de ciclobutilo, en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes representativas de los EE. UU. que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero sin limitación, las patentes de los EE. UU. n.° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920, algunas de las cuales son de propiedad común con la presente solicitud.
Un ARNi también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente "bases"). Como se utiliza en el presente documento, las nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las bases purínicas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como la desoxitimina (dT), 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras nucleobases incluyen las divulgadas en las patentes de los EE. UU. n.° 3.687.808, las divulgadas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; las divulgadas en "The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering", páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, las divulgadas en Englischet al.,Angewandte Chemie, edición internacional, 1991, 30, 613, y las divulgadas en Sanghvi, Y S., capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos presentados en la divulgación. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de la doble cadena de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs. 276-278) y son sustituciones de bases ilustrativas, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-O-metoxietilo.
Las patentes de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero sin limitación, las patentes de los EE. UU. mencionadas anteriormente n.° 3.687.808, 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; y 7.495.088.
El ARN de un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un resto de ribosa modificado en el que el resto de ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Esta estructura "bloquea" efectivamente la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha mostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNip aumenta la estabilidad del ARNip en el suero y reduce los efectos no deseados (Elmen, J.et al.,(2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR.et al.,(2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A.et al.,(2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
En algunas opciones, el ARN de un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más restos de azúcar bicíclico. Un "azúcar bicíclico" es un anillo de furanosilo modificado mediante la unión de dos átomos. Un "nucleósido bicíclico" ("BNA") es un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando de este modo un sistema de anillos bicíclico. En ciertas opciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar. Por lo tanto, en algunas opciones, un agente de la divulgación puede incluir uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un resto de ribosa modificado en el que el resto de ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. En otras palabras, un LNA es un nucleótido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH<2>-O-<2>'. Esta estructura "bloquea" efectivamente la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha mostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNip aumenta la estabilidad del ARNip en el suero y reduce los efectos no deseados (Elmen, J.et al.,(2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR.et al.,(2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A.et al.,(2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos para uso en los polinucleótidos de la divulgación incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas opciones, los agentes polinucleotídicos antisentido de la divulgación incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puentes de 4' a 2' incluyen, pero sin limitación, 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CHa)-O-2' (también denominado "etilo restringido" o "cEt") y 4'-CH(CH2OCHa)-O-2' (y análogos de los mismos; véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 7.399.845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos del mismo; véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 8.278.283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo; véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 8.278.425); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (véase, p. ej., la publicación de patente de los EE. UU. n.° 2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo Cl-C12 o un grupo protector (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 7.427.672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase, p. ej., Chattopadhyayaet al.,J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos del mismo; véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 8.278.426).
Las patentes de los EE. UU y publicaciones de patentes de los EE. UU representativas adicionales que enseñan la preparación de nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados incluyen, pero sin limitación, las siguientes: las patentes de los EE. UU. n.° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.034.133; 7.084.125; 7.399.845; 7.427.672; 7.569.686; 7.741.457; 8.022.193; 8.030.467; 8.278.425; 8.278.426; 8.278.283; el documento US 2008/0039618; y el documento US 2009/0012281.
Cualquiera de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcares estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase el documento WO 99/14226).
El ARN de un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más nucleótidos de etilo restringidos. Como se utiliza en el presente documento, un "nucleótido de etilo restringido" o "cEt" es un ácido nucleico bloqueado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En una opción, un nucleótido de etilo restringido está en la conformación S denominada en el presente documento "S-cEt".
Un ARNi de la divulgación también puede incluir uno o más "nucleótidos conformacionalmente restringidos" ("CRN"). Los CRN son análogos de nucleótidos con un conector que conecta los carbonos C2' y C4' de la ribosa o los carbonos C3 y -C5' de la ribosa. Los CRN bloquean el anillo de ribosa en una conformación estable y aumentan la afinidad de hibridación con el ARNm. El conector tiene una longitud suficiente para colocar el oxígeno en una posición óptima para lograr estabilidad y afinidad, lo que da lugar a un menor fruncimiento del anillo de ribosa.
Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de algunos de los CRN mencionados anteriormente incluyen, pero sin limitación, la publicación de patente de los EE. UU. n.° 2013/0190383; y la publicación PCT WO 2013/036868.
En algunas opciones, un ARNi de la divulgación comprende uno o más monómeros que son nucleótidos UNA (ácido nucleico desbloqueado). UNA es ácido nucleico desbloqueado, en donde se ha eliminado cualquiera de los enlaces del azúcar, formando un resto de "azúcar'' desbloqueado. En un ejemplo, el UNA también abarca un monómero en el que se han eliminado los enlaces entre C1'-C4' (es decir, el enlace covalente carbono-oxígeno-carbono entre los carbonos C1' y C4'). En otro ejemplo, se ha eliminado el enlace C2'-C3' (es decir, el enlace covalente carbono-carbono entre los carbonos C2' y C3') del azúcar (véase Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) y Fluiteret al.,Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039).
Las publicaciones de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de UNA incluyen, pero sin limitación, la patente de los EE. UU. n.° 8.314.227; y las publicaciones de patentes de los EE. UU. n.° 2013/0096289; 2013/0011922; y 2011/0313020.
Las modificaciones potencialmente estabilizadoras de los extremos de las moléculas de ARN pueden incluir N-(acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoiluridina-3"-fosfato, base invertida dT(idT) y otras. La divulgación de esta modificación se puede encontrar en la publicación PCT n.° WO 2011/005861.
Otras modificaciones de los nucleótidos de un ARNi de la divulgación incluyen un fosfato 5' o un mimético de fosfato 5', p. ej., un fosfato o un mimético de fosfato 5'-terminal en la hebra de antisentido de un ARNi. Se divulgan miméticos de fosfato adecuados en, por ejemplo, la publicación de patente de los EE. UU. n.° 2012/0157511.
A. ARNi modificados que comprenden motivos de la divulgación
En determinados aspectos de la divulgación, los agentes de ARN bicatenario de la divulgación incluyen agentes con modificaciones químicas como se divulga, por ejemplo, en el documento WO2013/075035. El documento WO2013/075035 proporciona motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una hebra de sentido o antisentido de un agente de iARNbc, en particular en el sitio de escisión o cerca de él. En algunas opciones, la hebra de sentido y la hebra de antisentido del agente de iARNbc pueden, por lo demás, modificarse completamente. La introducción de estos motivos interrumpe el patrón de modificación, si está presente, de la hebra de sentido o antisentido. El agente de iARNbc puede conjugarse opcionalmente con un ligando derivado de GalNAc, por ejemplo, en la hebra de sentido.
Más específicamente, cuando la hebra de sentido y la hebra de antisentido del agente de ARN bicatenario están completamente modificadas para tener uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de al menos una cadena de un agente de iARNbc, se ha observado actividad silenciadora génica del agente de iARNbc.
En consecuencia, la divulgación proporciona agentes de ARN bicatenario capaces de inhibir la expresión de un gen diana (es decir, gen de AGT)in vivo.El agente de iARN comprende una hebra de sentido y una hebra de antisentido. Cada hebra del agente de iARN puede ser de, por ejemplo, 17-30 nucleótidos de longitud, 25-30 nucleótidos de longitud, 27-30 nucleótidos de longitud, 19-25 nucleótidos de longitud, 19-23 nucleótidos de longitud, 19-21 nucleótidos de longitud, 21-25 nucleótidos de longitud o 21-23 nucleótidos de longitud.
La hebra de sentido y la hebra de antisentido normalmente forman un ARN bicatenario ("ARNbc"), también denominado en el presente documento "agente de iARNbc". La región bicatenaria de un agente de iARNbc puede ser, por ejemplo, la región bicatenaria que puede tener 27-30 pares de nucleótidos de longitud, 19-25 pares de nucleótidos de longitud, 19-23 pares de nucleótidos de longitud, 19-21 pares de nucleótidos de longitud, 21-25 pares nucleótidos de longitud o 21-23 pares de nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, la región bicatenaria se selecciona entre 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 27 nucleótidos de longitud.
En ciertas opciones, el agente de iARNbc puede contener una o más regiones salientes o grupos de protección en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos de una o ambas hebras. El saliente puede tener, de forma independiente, 1-6 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 2-6 nucleótidos de longitud, 1-5 nucleótidos de longitud, 2-5 nucleótidos de longitud, 1-4 nucleótidos de longitud, 2-4 nucleótidos de longitud, 1-3 nucleótidos de longitud, 2-3 nucleótidos de longitud o 1-2 nucleótidos de longitud. En ciertas opciones, las regiones salientes pueden incluir regiones salientes ampliadas como se ha proporcionado anteriormente. Los salientes pueden ser el resultado de que una hebra sea más larga que la otra o el resultado de que dos hebras de la misma longitud estén escalonadas. El saliente puede formar un emparejamiento incorrecto con el ARNm diana o puede ser complementario de las secuencias genéticas a las que se dirige o puede ser otra secuencia. También se pueden unir la primera y la segunda hebra, p. ej., por bases adicionales para formar una horquilla o por otros conectores que no son bases.
En ciertas opciones, los nucleótidos en la región saliente del agente de iARNbc pueden ser cada uno de forma independiente un nucleótido modificado o sin modificar que incluye, pero sin limitación, modificado en el azúcar en 2', tal como, 2'-F, 2'-O-metilo, timidina (T), 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2'-O-metoxieti 1-5-metilcitidina (m5Ceo) y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, TT puede ser una secuencia saliente para cualquiera de los extremos de cualquier hebra. El saliente puede formar un emparejamiento incorrecto con el ARNm diana o puede ser complementario de las secuencias genéticas a las que se dirige o puede ser otra secuencia.
Los salientes en 5' o 3' en la hebra de sentido, la hebra de antisentido o ambas cadenas del agente de iARNbc pueden estar fosforilados. En algunas opciones, la región o las regiones salientes contienen dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre los dos nucleótidos, donde los dos nucleótidos pueden ser iguales o diferentes. En algunas opciones, el saliente está presente en el extremo 3' de la hebra de sentido, hebra de antisentido o ambas hebras. En algunas opciones, este saliente en 3' está presente en la hebra de antisentido. En algunas opciones, este saliente en 3' está presente en la hebra de sentido.
El agente de iARNbc puede contener solo un saliente, lo que puede reforzar la actividad de interferencia del iARN, sin afectar su estabilidad general. Por ejemplo, el saliente monocatenario puede estar ubicado en el extremo 3' de la hebra de sentido o, como alternativa, el extremo 3' de la hebra de antisentido. El iARN también puede tener un extremo romo, ubicado en el extremo 5' de la hebra de antisentido (o el extremo 3' de la hebra de sentido) o viceversa. En general, la hebra de antisentido del agente de iARNbc tiene un saliente nucleotídico en el extremo 3' y el extremo 5' es romo. Aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, el extremo romo asimétrico en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el saliente del extremo 3' de la hebra de antisentido favorecen la carga de la hebra guía en el proceso de RISC.
En ciertas opciones, el agente de iARNbc es un oligómero de extremos romos doble de 19 nucleótidos de longitud, en donde la hebra de sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 7, 8, 9 desde el extremo 5'. La hebra de antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 desde el extremo 5'.
En otras opciones, el agente de iARNbc es un oligómero de extremos romos doble de 20 nucleótidos de longitud, en donde la hebra de sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 8, 9, 10 desde el extremo 5'. La hebra de antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 desde el extremo 5'.
En todavía otras opciones, el agente de iARNbc es un oligómero de extremos romos doble de 21 nucleótidos de longitud, en donde la hebra de sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 desde el extremo 5'. La hebra de antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 desde el extremo 5'.
En ciertas opciones, el agente de iARNbc comprende una hebra de sentido de 21 nucleótidos y una hebra de antisentido de 23 nucleótidos, en donde la hebra de sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 desde el extremo 5'; la hebra de antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 desde el extremo 5', en donde un extremo del agente de iARN es romo, mientras que el otro extremo comprende un saliente de 2 nucleótidos. Preferiblemente, el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la hebra de antisentido.
Cuando el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la hebra de antisentido, puede haber dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos salientes y el tercer nucleótido es un nucleótido emparejado junto al nucleótido saliente. En una opción, el agente de iARN tiene además dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5' de la hebra de sentido como en el extremo 5' de la hebra de antisentido. En ciertas opciones, cada nucleótido en la hebra de sentido y la hebra de antisentido del agente de iARNbc, incluidos los nucleótidos que forman parte de los motivos, son nucleótidos modificados. En determinadas opciones, cada residuo se modifica de forma independiente con un 2'-O-metilo o 3'-fluoro, p. ej., en un motivo alternante. Opcionalmente, el agente de iARNbc comprende además un ligando (preferiblemente GalNAcs).
En ciertas opciones, el agente de iARNbc comprende una hebra de sentido y una de antisentido, en donde la hebra de sentido tiene una longitud de 25-30 residuos de nucleótidos, en donde a partir del nucleótido 5' terminal (posición 1), las posiciones 1 a 23 de la primera hebra comprenden al menos 8 ribonucleótidos; la hebra de antisentido tiene una longitud de 36-66 residuos de nucleótidos y, a partir del nucleótido 3' terminal, comprende al menos 8 ribonucleótidos en las posiciones emparejadas con las posiciones 1-23 de la hebra de sentido para formar una doble cadena; en donde al menos el nucleótido 3' terminal de la hebra de antisentido no está emparejado con la hebra de sentido y hasta 6 nucleótidos 3' terminales consecutivos no están emparejados con la hebra de sentido, formando de este modo un saliente monocatenario 3' de 1-6 nucleótidos; en donde el extremo 5' de la hebra de antisentido comprende 10-30 nucleótidos consecutivos que no están emparejados con la hebra de sentido, formando de este modo un saliente 5' monocatenario de 10-30 nucleótidos; en donde al menos los nucleótidos 5' terminales y 3' terminales de la hebra de sentido forman pares de bases con nucleótidos de la hebra de antisentido cuando las hebras de sentido y antisentido están alineadas para una máxima complementariedad, formando de este modo una región sustancialmente bicatenaria entre las hebras de sentido y antisentido; y la hebra de antisentido es suficientemente complementaria de un ARN diana a lo largo de al menos 19 ribonucleótidos de longitud de la hebra de antisentido para reducir la expresión del gen diana cuando el ácido nucleico bicatenario se introduce en una célula de mamífero; y en donde la hebra de sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos, donde al menos uno de los motivos aparece en el sitio de escisión o cerca de él. La hebra de antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión o cerca de él.
En ciertas opciones, el agente de iARNbc comprende hebras de sentido y antisentido, en donde el agente de iARNbc comprende una primera hebra que tiene una longitud que es de al menos 25 y como máximo 29 nucleótidos y una segunda hebras que tiene una longitud que es como máximo de 30 nucleótidos con al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en la posición 11, 12, 13 desde el extremo 5'; en donde el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra forman un extremo romo y la segunda hebra es 1-4 nucleótidos más larga en su extremo 3' que la primera hebra, en donde la región bicatenaria tiene al menos 25 nucleótidos de longitud y la segunda hebra es suficientemente complementaria de un ARNm diana a lo largo de al menos 19 nucleótidos de la longitud de la segunda hebra para reducir la expresión del gen diana cuando el agente de iARN se introduce en una célula de mamífero, y en donde la escisión por Dicer del agente de iARNbc da lugar preferentemente a un ARNip que comprende el extremo 3' de la segunda hebra, reduciendo de este modo la expresión del gen diana en el mamífero. Opcionalmente, el agente de iARNbc comprende además un ligando.
En ciertas opciones, la hebra de sentido del agente de iARNbc contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos aparece en el sitio de escisión en la hebra de sentido.
En ciertas opciones, la hebra de antisentido del agente de iARNbc también puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos aparece en o cerca del sitio de escisión en la hebra de antisentido.
Para un agente de iARNbc que tiene una región bicatenaria de 19-23 nucleótidos de longitud, el sitio de escisión de la hebra de antisentido suele estar alrededor de las posiciones 10, 11 y 12 desde el extremo 5'. Por lo tanto, los motivos de tres modificaciones idénticas pueden producirse en las posiciones 9, 10, 11; las posiciones 10, 11, 12; las posiciones 11, 12, 13; las posiciones 12, 13, 14; o las posiciones 13, 14, 15 de la hebra de antisentido, comenzando el conteo a partir del primer nucleótido del extremo 5' de la hebra de antisentido o comenzando el conteo a partir del primer nucleótido emparejado dentro de la región bicatenaria desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. El sitio de escisión en la hebra de antisentido también puede cambiar según la longitud de la región bicatenaria del agente de iARNbc desde el extremo 5'.
La hebra de sentido del agente de iARNbc puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la cadena; y la hebra de antisentido puede tener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de la cadena. Cuando la hebra de sentido y la hebra de antisentido forman una doble cadena de ARNbc, la hebra de sentido y la hebra de antisentido pueden estar alineadas de tal manera que un motivo de los tres nucleótidos en la hebra de sentido y un motivo de los tres nucleótidos en la hebra de antisentido tengan un solapamiento de al menos un nucleótido, es decir, al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra de sentido forma un par de bases con al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra de antisentido. Como alternativa, pueden solapar al menos dos nucleótidos o pueden solapar los tres nucleótidos.
En algunas opciones, la hebra de sentido del agente de iARNbc puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El primer motivo puede aparecer en o cerca del sitio de escisión de la hebra y los otros motivos pueden ser una modificación del flanco. El término "modificación del flanco" en el presente documento se refiere a un motivo que aparece en otra parte de la hebra que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión de la misma hebra. La modificación del flanco es adyacente al primer motivo o está separada por al menos uno o más nucleótidos. Cuando los motivos están inmediatamente adyacentes entre sí, entonces las químicas de los motivos son distintas entre sí y cuando los motivos están separados por uno o más nucleótidos, entonces las químicas pueden ser iguales o diferentes. Pueden estar presentes dos o más modificaciones del flanco. Por ejemplo, cuando están presentes dos modificaciones del flanco, cada modificación del flanco puede producirse en un extremo con respecto al primer motivo que está en o cerca del sitio de escisión o en cualquier lado del motivo principal.
Como la hebra de sentido, la hebra de antisentido del agente de iARNbc puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, apareciendo al menos uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Esta hebra de antisentido también puede contener una o más modificaciones del flanco en una alineación similar a las modificaciones del flanco que pueden estar presentes en la hebra de sentido.
En algunas opciones, la modificación del flanco en la hebra de sentido o la hebra de antisentido del agente de iARNbc normalmente no incluye los primeros uno o dos nucleótidos terminales en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos de la hebra.
En otras opciones, la modificación del flanco en la hebra de sentido o la hebra de antisentido del agente de iARNbc normalmente no incluye los primeros uno o dos nucleótidos emparejados dentro de la región bicatenaria en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos de la hebra.
Cuando la hebra de sentido y la hebra de antisentido del agente de iARNbc contienen cada una al menos una modificación del flanco, las modificaciones del flanco pueden caer en el mismo extremo de la región bicatenaria y tener un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos.
Cuando la hebra de sentido y la hebra de antisentido del agente de iARNbc contienen cada una al menos dos modificaciones del flanco, la hebra de sentido y la hebra de antisentido pueden alinearse de tal manera que dos modificaciones, una de cada hebra, queden en un extremo de la región bicatenaria, que tiene un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones, una de cada hebra queden en el otro extremo de la región bicatenaria, que tiene un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones de una hebra queden en cada lado del motivo principal, que tiene un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos en la región bicatenaria.
En algunas opciones, cada nucleótido en la hebra de sentido y hebra de antisentido del agente de iARNbc, incluidos los nucleótidos que forman parte de los motivos, pueden modificarse. Cada nucleótido puede modificarse con la misma o diferente modificación, que puede incluir una o más alteraciones de uno o ambos oxígenos de fosfato no conectores o de uno o más de los oxígenos de fosfato conectores; alteraciones de un constituyente del azúcar ribosa, p. ej., del 2'-hidroxilo en el azúcar ribosa; reemplazo completo del resto de fosfato con conectores "desfosfo"; modificación o reemplazo de una base natural; y reemplazo o modificación de la cadena principal de ribosa-fosfato.
Como los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades, muchas de las modificaciones se producen en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, p. ej., una modificación de una base, un resto fosfato o un O no conector de un resto de fosfato. En algunos casos, la modificación se producirá en todas las posiciones objeto del ácido nucleico, pero en muchos casos no. A modo de ejemplo, una modificación solo puede producirse en una posición terminal en 3' o 5', puede producirse solo en una región terminal, p. ej., en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una hebra. Una modificación puede producirse en una región bicatenaria, una región monocatenaria o en ambas. Una modificación puede producirse solo en la región bicatenaria de un ARN o puede producirse solo en una región monocatenaria de un ARN. Por ejemplo, una modificación con fosforotioato en una posición O no conectora puede producirse solo en uno o en ambos extremos, puede producirse solo en una región terminal, p. ej., en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de un cadena, o puede producirse en regiones bicatenarias y/o monocatenarias, en particular en los extremos. El extremo 5' o los extremos pueden estar fosforilados.
Es posible, p. ej., mejorar la estabilidad, incluir bases particulares en los salientes o incluir nucleótidos modificados o sustitutos de nucleótidos, en salientes monocatenarios, p. ej., en un saliente en 5' o 3' o en ambos. Por ejemplo, puede ser deseable incluir nucleótidos de purina en los salientes. En algunas opciones, todas o algunas de las bases en un saliente en 3' o 5' pueden modificarse, p. ej., con una modificación descrita en el presente documento. Las modificaciones pueden incluir, p. ej., el uso de modificaciones en la posición 2' del azúcar ribosa con modificaciones que se conocen en la técnica, p. ej., el uso de desoxirribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro (2'-F) o 2'-O-metilo modificado en lugar del riboazúcar de la nucleobase, y modificaciones en el grupo fosfato, p. ej., modificaciones con fosforotioato. No es necesario que los salientes sean homólogos de la secuencia diana.
En algunas opciones, cada residuo de la hebra de sentido y la hebra de antisentido se modifica de forma independiente con LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo o 2'-fluoro. Las hebras pueden contener más de una modificación. En una opción, cada residuo de la hebra de sentido y la hebra de antisentido se modifica de forma independiente con 2'-O-metilo o 2'-fluoro.
Normalmente están presentes al menos dos modificaciones diferentes en la hebra de sentido y en la hebra de antisentido. Esas dos modificaciones pueden ser las modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro, u otras.
En ciertas opciones, el Na o Nb comprenden modificaciones de un patrón alternante. La expresión "motivo alternante" como se utiliza en el presente documento se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, produciéndose cada modificación en nucleótidos alternantes de una cadena. El nucleótido alternante puede referirse a uno de cada dos nucleótidos o uno de cada tres nucleótidos, o un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada uno un tipo de modificación del nucleótido, el motivo alternante puede ser "A<b>ABABABA<b>A<b>...", "AABBAABBAABB...", "AABAABAABAAB...", "AAABAAABAAAB...", "AAABBBAAABBB..." o "ABCABCABCABC...", etc.
El tipo de modificaciones contenidas en el motivo alternante puede ser igual o diferente. Por ejemplo, si A, B, C, D representan cada uno un tipo de modificación en el nucleótido, el patrón alternante, es decir, modificaciones cada dos nucleótidos, puede ser igual, pero cada una de la hebra de sentido o la hebra de antisentido pueden seleccionarse entre varias posibilidades de modificaciones dentro del motivo alternante, tal como "ABABAB...", "ACACAC..." "BDBDBD..." o "CDCDCD...", etc.
En algunas opciones, el agente de iARNbc de la divulgación comprende el patrón de modificación para el motivo alternante en la hebra de sentido que está desplazado con respecto al patrón de modificación para el motivo alternante en la hebra de antisentido. El desplazamiento puede ser tal que el grupo modificado de nucleótidos de la hebra de sentido corresponda a un grupo modificado de manera diferente de nucleótidos de la hebra de antisentido y viceversa. Por ejemplo, cuando la hebra de sentido se empareja con la hebra de antisentido en la doble cadena de ARNbc, el motivo alternante en la hebra de sentido puede comenzar con "ABABAB" de 5' a 3' de la hebra y el motivo alternante en la hebra de antisentido puede comenzar con "BABABA" de 5' a 3' de la hebra dentro de la región bicatenaria. Como otro ejemplo, el motivo alternante en la hebra de sentido puede comenzar con "AABBAABB" de 5' a 3' de la hebra y el motivo alternante en la hebra de antisentido puede comenzar con "BBAABBAA" de 5' a 3' de la hebra dentro de la región bicatenaria, de modo que hay un cambio completo o parcial de los patrones de modificación entre la hebra de sentido y la hebra de antisentido.
En algunas opciones, el agente de iARNbc comprende el patrón del motivo alternante de modificación 2'-O-metilo y modificación 2'-F en la hebra de sentido que inicialmente tiene un desplazamiento con respecto al patrón del motivo alternante de modificación 2'-O-metilo y modificación 2'-F en la hebra de antisentido inicialmente, es decir, el nucleótido modificado con 2'-O-metilo en de la hebra de sentido forma pares de bases con un nucleótido modificado con 2'-F en la hebra de antisentido y viceversa. La posición 1 de la hebra de sentido puede comenzar con la modificación 2'-F y la posición 1 de la hebra de antisentido puede comenzar con la modificación 2'-O-metilo.
La introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la hebra de sentido o hebra de antisentido interrumpe el patrón de modificación inicial presente en la hebra de sentido o hebra de antisentido. Esta interrupción del patrón de modificación de la hebra de sentido o antisentido mediante la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la hebra de sentido o antisentido puede mejorar la actividad silenciadora génica contra el gen diana.
En algunas opciones, cuando se introduce en cualquiera de las hebras el motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, la modificación del nucleótido junto al motivo es una modificación diferente a la modificación del motivo. Por ejemplo, la parte de la secuencia que contiene el motivo es "...NaYYYNb...", donde "Y" representa la modificación del motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos y "Na" y Nb" representan una modificación del nucleótido junto al motivo "YYY" que es diferente a la modificación de Y, y donde Na y Nb pueden ser modificaciones iguales o diferentes. Como alternativa, Na o Nb puede estar presentes o ausentes cuando hay una modificación del flanco presente.
El ARNi puede comprender además al menos un enlace intemudeotídico fosforotioato o metilfosfonato. La modificación del enlace intemudeotídico fosforotioato o metilfosfonato puede producirse en cualquier nucleótido de la hebra de sentido, hebra antisentido o ambas hebras en cualquier posición de la hebra. Por ejemplo, la modificación del enlace internucleotídico puede producirse en todos los nucleótidos de la hebra de sentido o antisentido; cada modificación del enlace internucleotídico puede producirse en un patrón alternante en la hebra de sentido o la hebra de antisentido; o la hebra de sentido o la hebra de antisentido puede contener ambas modificaciones del enlace internucleotídico en un patrón alternante. El patrón alternante de la modificación del enlace internucleotídico en la hebra de sentido puede ser igual o diferente de la hebra de antisentido, y el patrón alternante de la modificación del enlace internucleotídico en la hebra de sentido puede tener un desplazamiento con respecto al patrón alternante de la modificación del enlace internucleotídico en la hebra de antisentido. En una opción, un agente de ARNi bicatenario comprende 6-8 enlaces internucleotídicos de fosforotioato. En algunas opciones, la hebra de antisentido comprende dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 5' y dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 3', y la hebra de sentido comprende al menos dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 5' o en el extremo 3'.
En algunas opciones, el agente de iARNbc comprende una modificación del enlace internucleotídico de fosforotioato o metilfosfonato en la región saliente. Por ejemplo, la región saliente puede contener dos nucleótidos que tienen un enlace internucleotídico de fosforotioato o metilfosfonato entre los dos nucleótidos. También se pueden realizar modificaciones de enlaces internucleotídicos para unir los nucleótidos salientes con los nucleótidos emparejados terminales dentro de la región bicatenaria. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o todos los nucleótidos salientes pueden estar unidos a través de un enlace internucleotídico de fosforotioato o metilfosfonato y, opcionalmente, puede haber enlaces internucleotídicos de fosforotioato o metilfosfonato adicionales que unen el nucleótido saliente con un nucleótido emparejado que está junto al nucleótido saliente. Por ejemplo, puede haber al menos dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los que dos de los tres nucleótidos son nucleótidos salientes y el tercero es un nucleótido emparejado junto al nucleótido saliente. Estos tres nucleótidos terminales pueden estar en el extremo 3' de la hebra de antisentido, el extremo 3' de la hebra de sentido, el extremo 5' de la hebra de antisentido o el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En algunas opciones, el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la hebra de antisentido y hay dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos salientes y el tercer nucleótido es un nucleótido emparejado junto al nucleótido saliente. Opcionalmente, el agente de iARNbc puede tener además dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5' de la hebra de sentido como en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En una opción, el agente de iARNbc comprende emparejamientos incorrectos con la diana, dentro de la doble cadena o combinaciones de los mismos. El emparejamiento incorrecto puede producirse en la región saliente o en la región bicatenaria. El par de bases puede clasificarse según su propensión a promover la disociación o la fusión (p. ej., según la energía libre de asociación o disociación de un emparejamiento particular, el enfoque más sencillo es examinar los pares individualmente, aunque también se puede utilizar el siguiente vecino o un análisis similar). Con respecto a la promoción de la disociación: se prefiere A:U a G:C; se prefiere G:U a G:C; y se prefiere I:C a G:C (I=inosina). Se prefieren los emparejamientos incorrectos, p. ej., emparejamientos no canónicos o distintos de los canónicos (como se describe en otra parte del presente documento) a los emparejamientos canónicos (A:T, A:U, G:C); y se prefieren los emparejamientos que incluyen una base universal a los emparejamientos canónicos.
En ciertas opciones, el agente de iARNbc comprende al menos uno de los primeros 1, 2, 3, 4 o 5 pares de bases dentro de las regiones bicatenarias del extremo 5' de la hebra de antisentido seleccionada de forma independiente del grupo de: A:U, G:U, I:C y pares con emparejamientos incorrectos, p. ej., emparejamientos no canónicos o distintos de los canónicos o emparejamientos que incluyen una base universal, para promover la disociación de la hebra de antisentido en el extremo 5' de la doble cadena.
En ciertas opciones, el nucleótido en la posición 1 dentro de la región bicatenaria del extremo 5' en la hebra de antisentido se selecciona de A, dA, dU, U y dT. Como alternativa, al menos uno de los primeros 1, 2 o 3 pares de bases dentro de la región bicatenaria desde el extremo 5' de la hebra de antisentido es un par de bases AU. Por ejemplo, el primer par de bases dentro de la región bicatenaria desde el extremo 5' de la hebra de antisentido es un par de bases AU.
En otras opciones, el nucleótido en el extremo 3' de la hebra de sentido es desoxitimina (dT) o el nucleótido en el extremo 3' de la hebra de antisentido es desoxitimina (dT). Por ejemplo, hay una secuencia corta de nucleótidos de desoxitimina, por ejemplo, dos nucleótidos dT en el extremo 3' de la hebra de sentido, de antisentido o ambas hebras.
En ciertas opciones, la secuencia de la hebra de sentido puede representarse mediante la fórmula (I):
5' np-Na-(XXX)iNb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3' (I)
en donde:
i y j son cada uno de forma independiente 0 o 1;
p y q son cada uno de forma independiente 0-6;
cada Na representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de manera diferente; cada Nb representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np y nq representa de forma independiente un nucleótido saliente;
en donde Nb e Y no tienen la misma modificación; y
XXX, YYY y ZZZ representan cada uno de forma independiente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. Preferiblemente, YYY son todos nucleótidos modificados con 2'-F.
En algunas opciones, el Na o Nb comprende modificaciones de patrón alternante.
En algunas opciones, el motivo YYY aparece en o cerca del sitio de escisión de la hebra de sentido. Por ejemplo, cuando el agente de iARNbc tiene una región bicatenaria de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo YYY puede aparecer en el sitio de escisión o en sus proximidades (p. ej.; puede aparecer en las posiciones 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12; u 11, 12, 13) de la hebra de sentido, comenzando el conteo a partir del primer nucleótido, desde el extremo 5'; u, opcionalmente, comenzando el conteo en el primer nucleótido emparejado dentro de la región bicatenaria, desde el extremo 5'.
En una opción, i es 1 y j es 0, o i es 0 y j es 1, o tanto i como j son 1. Por tanto, la hebra de sentido se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ic);
o
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Id).
Cuando la hebra de sentido está representada por la fórmula (Ib), Nb representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra de sentido está representada como la fórmula (Ic), Nb representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra de sentido está representada como la fórmula (Id), cada Nb representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Preferiblemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Cada Na puede representar de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X, Y y Z pueden ser iguales o diferentes entre sí.
En otras opciones, i es 0 y j es 0, y la hebra de sentido puede representarse mediante la fórmula:
5' np-Na-YYY-Na-nq3' (Ia).
Cuando la hebra de sentido está representada por la fórmula (Ia), cada Na puede representar de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
En una opción, la secuencia de la hebra de antisentido del iARN puede representarse mediante la fórmula (II):
5' nq'.Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')1-N'a-np'3' (II)
en donde:
k y 1 son cada uno de forma independiente 0 o 1;
p' y q' son cada uno de forma independiente 0-6;
cada Na' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de manera diferente; cada Nb' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np' y nq' representa de forma independiente un nucleótido saliente;
en donde Nb' e Y' no tienen la misma modificación; y
X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno de forma independiente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En algunas opciones, el Na' o Nb' comprende modificaciones de patrón alternante.
El motivo Y'Y'Y' aparece en o cerca del sitio de escisión de la hebra de antisentido. Por ejemplo, cuando el agente de iARNbc tiene una región bicatenaria de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo Y'Y'Y' puede aparecer en las posiciones 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; o 13, 14, 15 de la hebra de antisentido, comenzando el conteo a partir del primer nucleótido, desde el extremo 5'; u, opcionalmente, comenzando el conteo en el primer nucleótido emparejado dentro de la región bicatenaria, desde el extremo 5'. Preferiblemente, el motivo Y'Y'Y' aparece en las posiciones 11, 12, 13.
En ciertas opciones, el motivo Y'Y'Y' son todos nucleótidos modificados con 2'-OMe.
En ciertas opciones, k es 1 y 1 es 0, o k es 0 y 1 es 1, o tanto k como 1 son 1.
Por tanto, la hebra de antisentido se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb);
5' nq,-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc);
o
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np' 3' (IId)
Cuando la hebra de antisentido está representada por la fórmula (IIb), Nb' representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra de antisentido se representa como fórmula (IIc), Nb' representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra de antisentido se representa como fórmula (IId), cada Nb' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Preferiblemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En otras opciones, k es 0 y 1 es 0 y la hebra de antisentido puede representarse mediante la fórmula:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'- Na'-nq' 3' (la).
Cuando la hebra de antisentido se representa como fórmula (Ila), cada Na' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de X', Y' y Z' pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cada nucleótido de la hebra de sentido y de la hebra de antisentido puede modificarse de forma independiente con LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-hidroxilo o 2'-fluoro. Por ejemplo, cada nucleótido de la hebra de sentido y la hebra de antisentido se modifica de forma independiente con 2'-O-metilo o 2'-fluoro. Cada X, Y, Z, X', Y' y Z', en particular, puede representar una modificación con 2'-O-metilo o una modificación con 2'-fluoro.
En algunas opciones, la hebra de sentido del agente de iARNbc puede contener el motivo YYY que aparece en las posiciones 9, 10 y 11 de la hebra cuando la región bicatenaria tiene 21 nt, comenzando el conteo a partir del primer nucleótido desde el extremo 5' u, opcionalmente, comenzando el conteo en el primer nucleótido emparejado dentro de la región bicatenaria, desde el extremo 5'; e Y representa la modificación con 2'-F. La hebra sentido puede contener adicionalmente motivos XXX o motivos ZZZ como modificaciones del flanco en el extremo opuesto de la región bicatenaria; y XXX y ZZZ representan cada uno de forma independiente una modificación con 2'-OMe o una modificación con 2'-F.
En algunas opciones, la hebra de antisentido puede contener el motivo Y'Y'Y' que aparece en las posiciones 11, 12, 13 de la hebra, comenzando el conteo a partir del primer nucleótido desde el extremo 5' u, opcionalmente, comenzando el conteo en el primer nucleótido emparejado dentro de la región bicatenaria, desde el extremo 5'; e Y' representa modificación con 2'-O-metilo. La hebra de antisentido puede contener adicionalmente un motivo X'X'X' o motivos Z'Z'Z' como modificaciones del flanco en el extremo opuesto de la región bicatenaria; y X'X'X' y Z'Z'Z' representan cada uno de forma independiente una modificación con 2'-OMe o una modificación con 2'-F.
La hebra de sentido representada por una cualquiera de las fórmulas anteriores (Ia), (Ib), (Ic) y (Id) forma una doble cadena con una hebra de antisentido representada por una cualquiera de las fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) y (IId), respectivamente.
En consecuencia, los agentes de iARNbc para usar en los métodos de la divulgación pueden comprender una hebra de sentido y una hebra de antisentido, teniendo cada hebra entre 14 y 30 nucleótidos, la doble cadena de ARNi representada por la fórmula (III):
sentido: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)r Na-nq 3'
antisentido: 3' np-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')<1>-Na-nq' 5'
(III)
en donde:
i, j, k y 1 son cada uno de forma independiente 0 o 1;
p, p', q y q' son cada uno de forma independiente 0-6;
cada Na y Na representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de manera diferente; cada Nby Nb' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
donde cada np', np, nq' y nq, cada uno de los cuales puede o no estar presente, representa de forma independiente un nucleótido saliente; y
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno de forma independiente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una opción, i es 0 y j es 0; o i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 0; o tanto i como j son 1. En otra opción, k es 0 y 1 es 0; o k es 1 y 1 es 0; k es 0 y 1 es 1; o tanto k como 1 son 0; o tanto k como 1 son 1.
Las combinaciones ilustrativas de la hebra de sentido y la hebra de antisentido que forman una doble cadena de ARNi incluyen las siguientes fórmulas:
5'np - Na -Y Y Y -Na-nq 3'
3'np-Na-Y'Y'Y' -Na'nq' 5' (Mía)
5'np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3'
3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5' (IIIb)
5' np-Na-X X X -Nb-Y Y Y - Na-nq 3'
3'np -Na -X'X'X'-Nb -Y'Y'Y'-Na -nq 5' (IIIc)
5'np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb-Z Z Z -Na-nq 3'
3'np -Na -X'X'X'-Nb -Y'Y'Y'-Nb -Z'Z'Z'-Na-nq 5' (IIId)
Cuando el agente de iARNbc está representado por la fórmula (IIIa), cada Na representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARNbc está representado por la fórmula (IIIb), cada Na representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 1-10, 1-7, 1-5 o 1-4 nucleótidos modificados. Cada Na representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARNbc está representado como la fórmula (IIIc), cada Nb, Nb' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARNbc está representado como la fórmula (IIId), cada Nb, Nb' representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na, Na representa de forma independiente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de Na, Na', Nb y Nb' comprende de forma independiente modificaciones del patrón alternante.
Cada uno de X, Y y Z en las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cuando el agente de iARNbc está representado por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y'. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes; o los tres nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes.
Cuando el agente de iARNbc está representado por la fórmula (IIIb) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z'. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes; o los tres nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes.
Cuando el agente de iARNbc se representa como la fórmula (IIIc) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X'. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes; o los tres nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes.
En ciertas opciones, la modificación del nucleótido Y es diferente de la modificación del nucleótido Y', la modificación del nucleótido Z es diferente de la modificación del nucleótido Z' o la modificación del nucleótido X es diferente de la modificación del nucleótido X'.
En ciertas opciones, cuando el agente de iARNbc está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones Na son modificaciones con 2'-O-metilo o 2'-fluoro. En otras opciones, cuando el agente de iARN está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones Na son modificaciones con 2'-O-metilo o 2'-fluoro y np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato. En todavía otras opciones, cuando el agente de iARN está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones Na son modificaciones con 2'-O-metilo o 2'-fluoro, np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino a través de enlace fosforotioato y la hebra de sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente (descrito a continuación). En otras opciones, cuando el agente de iARN está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones Na son modificaciones con 2'-O-metilo o 2'-fluoro, np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino a través de enlace fosforotioato, la hebra de sentido comprende al menos un enlace fosforotioato y la hebra de sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente.
En algunas opciones, cuando el agente de iARNbc está representado por la fórmula (IIIa), las modificaciones Na son modificaciones con 2'-O-metilo o 2'-fluoro, np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino a través de enlace fosforotioato, la hebra de sentido comprende al menos un enlace fosforotioato y la hebra de sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente.
En algunas opciones, el agente de iARNbc es un multímero que contiene al menos dos dobles cadenas representadas por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), en donde las dobles cadenas están conectadas mediante un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada una de las dobles cadenas puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada una de las dobles cadenas puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En algunas opciones, el agente de iARNbc es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dobles cadenas representadas por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), en donde las dobles cadenas están conectadas mediante un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada una de las dobles cadenas puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada una de las dobles cadenas puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En una opción, dos agentes de iARNbc representados por al menos una de las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) están ligados entre sí en el extremo 5' y en uno o ambos de los extremos 3' y, opcionalmente, están conjugados con un ligando. Cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En ciertas opciones, un agente de iARN de la divulgación puede contener un número bajo de nucleótidos que contengan una modificación 2'-fluoro, p. ej., 10 o menos nucleótidos con modificación 2'-fluoro. Por ejemplo, el agente de iARN puede contener 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro. En una opción específica, el agente de iARN de la divulgación contiene 10 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro, p. ej., 4 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro en la hebra de sentido y 6 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro en la hebra de antisentido. En otra opción específica, el agente de iARN de la divulgación contiene 6 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro, p. ej., 4 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro en la hebra de sentido y 2 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro en la hebra de antisentido.
En otras opciones, un agente de iARN de la divulgación puede contener un número ultrabajo de nucleótidos que contengan una modificación 2'-fluoro, p. ej., 2 o menos nucleótidos que contengan una modificación 2'-fluoro. Por ejemplo, el agente de iARN puede contener 2, 1 o 0 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro. En una opción específica, el agente de iARN puede contener 2 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro, p. ej., 0 nucleótidos con una modificación 2-fluoro en la hebra de sentido y 2 nucleótidos con una modificación 2'-fluoro en la hebra de antisentido.
Diversas publicaciones describen ARNi multiméricos que pueden usarse en los métodos de la divulgación. Dichas publicaciones incluyen WO2007/091269, la patente de los EE. UU. n.° 7.858.769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 y WO2011/031520.
Como se describe con mayor detalle a continuación, el ARNi que contiene conjugaciones de uno o más restos de carbohidratos con un ARNi puede optimizar una o más propiedades del ARNi. En muchos casos, el resto de carbohidrato se unirá a una subunidad modificada del ARNi. Por ejemplo, el azúcar ribosa de una o más subunidades de ribonucleótidos de un ARNi se puede reemplazar con otro resto, p. ej., un vehículo distinto de carbohidrato (preferiblemente cíclico) al que está unido un ligando de carbohidrato. Una subunidad de ribonucleótido en la que el azúcar ribosa de la subunidad ha sido reemplazado de esta manera se denomina en el presente documento subunidad de modificación de reemplazo de ribosa (SMRR). Un transportador cíclico puede ser un sistema de anillo carbocíclico, es decir, todos los átomos del anillo son átomos de carbono, o un sistema de anillo heterocíclico, es decir, uno o más átomos del anillo pueden ser un heteroátomo, p. ej., nitrógeno, oxígeno, azufre. El transportador cíclico puede ser un sistema de anillo monocíclico, o puede contener dos o más anillos, p. ej., anillos fusionados. El transportador cíclico puede ser un sistema de anillo completamente saturado o puede contener uno o más dobles enlaces.
El ligando puede estar unido al polinucleótido a través de un transportador. Los transportadores incluyen (i) al menos un "punto de unión de la cadena principal", preferiblemente dos "puntos de unión de la cadena principal" y (ii) al menos un "punto de unión de anclaje". Un "punto de unión de la cadena principal" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo funcional, p. ej., un grupo hidroxilo, o, en general, un enlace disponible y que es adecuado para la incorporación del transportador a la cadena principal, p. ej., la cadena principal de fosfato o fosfato modificado, p. ej., que contiene azufre, de un ácido ribonucleico. Un "punto de unión de anclaje" (TAP) en algunas opciones se refiere a un átomo del anillo constituyente del transportador cíclico, p. ej., un átomo de carbono o un heteroátomo (distinto de un átomo que proporciona un punto de unión a la cadena principal), que conecta un resto seleccionado. El resto puede ser, p. ej., un carbohidrato, p. ej., monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido. Opcionalmente, el resto seleccionado está conectado mediante un anclaje intermedio al transportador cíclico. Por lo tanto, el transportador cíclico incluirá a menudo un grupo funcional, p. ej., un grupo amino, o en general, proporcionará un enlace, que sea adecuado para la incorporación o el anclaje de otra entidad química, p. ej., un ligando al anillo constituyente.
El ARNi puede conjugarse con un ligando a través de un transportador, en donde el transportador puede ser un grupo cíclico o un grupo acíclico; preferiblemente, el grupo cíclico se selecciona de pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, [1,3]dioxolano, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y decalina; preferiblemente, el grupo acíclico es una cadena principal de serinol o una cadena principal de dietanolamina.
En otra opción de la divulgación, un agente de ARNi comprende una hebra de sentido y una hebra de antisentido, teniendo cada hebra entre 14 y 40 nucleótidos. El agente de iARN puede estar representado por la fórmula (L):
En la fórmula (L), B1, B2, B3, B1', B2', B3' y B4' son cada uno de forma independiente un nucleótido que contiene una modificación seleccionada del grupo que consiste en 2'-O-alquilo, alcoxi sustituido en 2', alquilo sustituido en 2', 2'-halo, ENA y BNA/LNA. En una opción, B1, B2, B3, B1', B2', b 3' y B4' contienen cada uno modificaciones 2'-OMe. En una opción, B1, B2, B3, B1', B2', B3' y B4' contienen cada uno modificaciones 2'-OMe o 2'-F. En una opción, al menos uno de B1, B2, B3, B1', B2', B3' y B4' contienen una modificación 2'-ON-metilacetamido (2-O-NMA).
C1 es un nucleótido de desestabilización térmica situado en un sitio opuesto a la región semilla de la hebra de antisentido (es decir, en las posiciones 2-8 del extremo 5' de la hebra de antisentido). Por ejemplo, C1 está en una posición de la hebra de sentido que se empareja con un nucleótido en las posiciones 2-8 del extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, C1 está en la posición 15 desde el extremo 5' de la hebra de sentido. El nucleótido C1 lleva la modificación de desestabilización térmica que puede incluir una modificación abásica; emparejamiento incorrecto con el nucleótido opuesto en la doble cadena; y modificación del azúcar tal como modificación 2'-desoxi o un nucleótido acíclico, p. ej., ácidos nucleicos desbloqueados (UNA) o ácido nucleico de glicerol (GNA). En una opción, C1 tiene una modificación de desestabilización térmica seleccionada del grupo que consiste en: i) emparejamiento incorrecto con el nucleótido opuesto en la hebra de antisentido; ii) modificación abásica seleccionada del grupo que consiste en:
y iii) modificación de azúcar seleccionada del grupo que consiste en:
en donde B es una nucleobase modificada o sin modificar, R1 y R2 son de forma independiente H, halógeno, OR3 o alquilo; y R3 es H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar. En una opción, la modificación térmicamente desestabilizadora en C1 es un emparejamiento incorrecto seleccionado del grupo que consiste en G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T y U:T; y, opcionalmente, al menos una nucleobase en el par de emparejamiento incorrecto es una nucleobase 2'-desoxi. En un ejemplo, la modificación de desestabilización térmica en C1 es GNA o
T1, T1', T2' y T3' representan cada uno de forma independiente un nucleótido que comprende una modificación que proporciona al nucleótido un volumen estérico que es menor o igual al volumen estérico de una modificación 2'-OMe. Un volumen estérico se refiere a la suma de los efectos estéricos de una modificación. Los expertos en la técnica conocen métodos para determinar los efectos estéricos de una modificación de un nucleótido. La modificación puede ser en la posición 2' de un azúcar ribosa del nucleótido o una modificación a un nucleótido sin ribosa, nucleótido acíclico o la cadena principal del nucleótido que es similar o equivalente a la posición 2' del azúcar ribosa, y proporciona al nucleótido un volumen estérico que es menor o igual al volumen estérico de una modificación 2'-OMe. Por ejemplo, T1, T1', T2' y T3' se seleccionan cada uno de forma independiente ADN, ARN, LNA, 2'-F y 2'-F-5'-metilo. En una opción, T1 es ADN. En una opción, T1' es ADN, ARN o LNA. En una opción, T2' es ADN o ARN. En una opción, T3' es A<d>N o ARN.
n1, n3 y q1 tienen de forma independiente entre 4 y 15 nucleótidos de longitud.
n5, q3 y q7 tienen de forma independiente 1-6 nucleótidos de longitud.
n4, q2 y q6 tienen de forma independiente 1-3 nucleótidos de longitud; como alternativa, n4 es 0.
q5 tiene de forma independiente 0-10 nucleótidos de longitud.
n2 y q4 tienen de forma independiente 0-3 nucleótidos de longitud.
Como alternativa, n4 tiene 0-3 nucleótidos de longitud.
En una opción, n4 puede ser 0. En un ejemplo, n4 es 0, y q2 y q6 son 1. En otro ejemplo, n4 es 0, y q2 y q6 son 1, con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18 23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, n4, q2 y q6 son cada uno 1.
En una opción, n2, n4, q2, q4 y q6 son cada uno 1.
En una opción, C1 está en la posición 14-17 del extremo 5' de la hebra de sentido, cuando la hebra de sentido tiene 19-22 nucleótidos de longitud y n4 es 1. En una opción, C1 está en la posición 15 del extremo 5' de la hebra de sentido
En una opción, T3' comienza en la posición 2 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T3' está en la posición 2 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q6 es igual a 1.
En una opción, T1' comienza en la posición 14 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T1' está en la posición 14 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q2 es igual a 1.
En una opción ilustrativa, T3' comienza en la posición 2 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y T1' comienza en la posición 14 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T3' comienza en la posición 2 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q6 es igual a 1 y T1' comienza en la posición 14 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q2 es igual a 1.
En una opción, T1' y T3' están separados por 11 nucleótidos de longitud (es decir, sin contar los nucleótidos T1' y T3').
En una opción, T1' está en la posición 14 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T1' está en la posición 14 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q2 es igual a 1 y la modificación en la posición 2' o posiciones en una no ribosa, acíclica o cadena principal que proporciona menos volumen estérico que una ribosa 2'-OMe.
En una opción, T3' está en la posición 2 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T3' está en la posición 2 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q6 es igual a 1 y la modificación en la posición 2' o posiciones en una no ribosa, acíclica o cadena principal que proporciona un volumen estérico inferior que o igual a una ribosa 2'-OMe.
En una opción, T1 está en el sitio de escisión de la hebra de sentido. En un ejemplo, T1 está en la posición 11 desde el extremo 5' de la hebra de sentido, cuando la hebra de sentido tiene 19-22 nucleótidos de longitud y n2 es 1. En una opción ilustrativa, T1 está en el sitio de escisión de la hebra de sentido en la posición 11 desde el extremo 5' de la hebra de sentido, cuando la hebra de sentido tiene 19-22 nucleótidos de longitud y n2 es 1,
En una opción, T2' comienza en la posición 6 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T2' está en las posiciones 6-10 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q4 es 1.
En una opción ilustrativa, T1 está en el sitio de escisión de la hebra de sentido, por ejemplo, en la posición 11 desde el extremo 5' de la hebra de sentido, cuando la hebra de sentido tiene 19-22 nucleótidos de longitud y n2es 1; T1' está en la posición 14 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q2 es igual a 1 y la modificación a T1' está en la posición 2' de un azúcar ribosa o en posiciones en una no ribosa, acíclica o cadena principal que proporciona menos volumen estérico que una ribosa 2'-OMe; T2' está en las posiciones 6-10 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q4 es 1; y T3' está en la posición 2 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q6 es igual a 1 y la modificación a T3' está en la posición 2' o en posiciones en una no ribosa, acíclica o cadena principal que proporciona un volumen estérico inferior que o igual a una ribosa 2'-OMe.
En una opción, T2' comienza en la posición 8 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T2' comienza en la posición 8 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q4 es 2.
En una opción, T2' comienza en la posición 9 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido. En un ejemplo, T2' está en la posición 9 desde el extremo 5' de la hebra de antisentido y q4 es 1.
En una opción, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 1, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 6, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 1, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 6, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18 23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B<2>es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18 23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 6, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 7, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 6, T1 es 2'F, n2 es 3, B<2>es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 7, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18 23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 1, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 6, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B<2>es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 1, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 6, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18 23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 5, T2' es 2'-F, q4 es 1, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; opcionalmente con al menos 2 TT adicionales en el extremo 3' de la hebra de antisentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 5, T2' es 2'-F, q4 es 1, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; opcionalmente con al menos 2 TT adicionales en el extremo 3' de la hebra de antisentido; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace intemudeotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace intemudeotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5').
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido).
El agente de iARN puede comprender un grupo que contiene fósforo en el extremo 5' de la hebra de sentido o antisentido. El grupo que contiene fósforo en el extremo 5' puede ser fosfato del extremo 5' (5'-P), fosforotioato del extremo 5' (5'-PS), fosforoditioato del extremo 5' (5'-PS2), vinilfosfonato del extremo 5' (5'-VP), metilfosfonato del extremo 5' (MePhos) o 5'-desoxi-5'-C-malonilo
Cuando el grupo que contiene fósforo en el extremo 5' es vinilfosfonato del extremo 5' (5'-VP), el 5'-VP puede ser el isómero 5'-E-VP (es decir,trans-fosfatode vinilo,
isómero 5'-Z-VP (es decir,cis-fosfatode vinilo,
o mezclas de los mismos.
En una opción, el agente de iARN comprende un grupo que contiene fósforo en el extremo 5' de la hebra de sentido. En una opción, el agente de iARN comprende un grupo que contiene fósforo en el extremo 5' de la hebra de antisentido. En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-P. En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-P en la hebra de antisentido.
En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-PS. En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-PS en la hebra de antisentido.
En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-VP. En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-VP en la hebra de antisentido. En una opción, el agente de iARN comprende una 5'-E-VP en la hebra de antisentido. En una opción, el agente de iARN comprende una 5'-Z-VP en la hebra de antisentido.
En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-PS2. En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-PS2 en la hebra de antisentido.
En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-PS2. En una opción, el agente de iARN comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo en la hebra de antisentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de<ía>R<n>también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de<ía>R<n>también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de<ía>R<n>también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de ía Rn también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de ARNbc también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b 4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace intemudeotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace intemudeotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos. En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de ARN iARNbc también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de<ía>R<n>también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de<ía>R<n>también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de<ía>R<n>también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de ía Rn también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1. El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1,<b>4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-P.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b 4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1,<b>4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-VP. El 5'-VP puede ser 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b 4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS2.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b 4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace intemudeotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace intemudeotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-P y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-P está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo
3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de ía Rn también comprende un 5'-PS y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo
3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-VP (p. ej., un 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos) y un ligando de direccionamiento.
En una opción, el 5'-VP está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS2 y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS2 está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-desoxi-5'-C-malonilo está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3,
B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7,
T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-P y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-P está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3,
B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7,
T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-PS y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3,
B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7,
T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace intemudeotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-VP (p. ej., un 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos) y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-V<p>está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3,
B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7,
T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-PS2 y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS2 está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3,
B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7,
T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-OMe y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5') y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5'). El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-desoxi-5'-C-malonilo está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-P y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-P está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo
3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo
3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-VP (p. ej., un 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos) y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-VP está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, 2'-OMe, n5 es B1' es 2'-OMe B3' es 2'-OM 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo
5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS2 y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS2 está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, T2' es 2'-F, q4 es 2, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 5, T3' es 2'-F, q6 es 1, B4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-desoxi-5'-C-malonilo está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1,<b>4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-P y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-P está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b 4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1,<b>4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-VP (p. ej., un 5'-E-VP, 5'-Z-VP o combinación de los mismos) y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-VP está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1, b 4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-PS2 y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-PS2 está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción, B1 es 2'-OMe o 2'-F, n1 es 8, T1 es 2'F, n2 es 3, B2 es 2'-OMe, n3 es 7, n4 es 0, B3 es 2'-OMe, n5 es 3, B1' es 2'-OMe o 2'-F, q1 es 9, T1' es 2'-F, q2 es 1, B2' es 2'-OMe o 2'-F, q3 es 4, q4 es 0, B3' es 2'-OMe o 2'-F, q5 es 7, T3' es 2'-F, q6 es 1,<b>4' es 2'-F y q7 es 1; con dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de la posición 1-5 de la hebra de sentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de sentido) y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones del enlace internucleotídico de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra de antisentido (contando desde el extremo 5' de la hebra de antisentido). El agente de iARN también comprende un 5'-desoxi-5'-C-malonilo y un ligando de direccionamiento. En una opción, el 5'-desoxi-5'-C-malonilo está en el extremo 5' de la hebra de antisentido y el ligando de direccionamiento está en el extremo 3' de la hebra de sentido.
En una opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente; y
(iii) modificaciones 2'-F en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9 a 11, 13, 17, 19 y 21 y modificaciones 2'-OMe en las posiciones 2, 4,<6>,<8>, 12, 14 a 16, 18 y 20 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11 a 13, 15, 17, 19, 21 y 23 y modificaciones 2'F en las posiciones 2, 4,<6>a<8>, 10, 14, 16, 18, 20 y 22 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<2 1>y<2 2>y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de ARNbc tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-F en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9 a 11, 13, 15, 17, 19 y 21 y modificaciones 2'-OMe en las posiciones 2, 4,<6>,<8>, 12, 14,<1 6>, 18 y 20 (contando desde el extremo 5'); y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 13, 15, 17, 19 y 21 a 23 y modificaciones 2'F en las posiciones 2, 4,<6>,<8>, 10, 14, 16, 18 y 20 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1 a<6>,<8>, 10 y 12 a 21, modificaciones 2'-F en las posiciones 7 y 9 y un desoxinucleótido (p. ej., dT) en la posición 11 (contando desde el extremo 5'); y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene: (i)
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 a 23 y modificaciones 2'-F en las posiciones 2, 4 a<6>,<8>, 10, 12, 14, 16 y 18 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1 a<6>,<8>, 10, 12, 14 y 16 a 21 y modificaciones 2'-F en las posiciones 7, 9, 11, 13 y 15; y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 y 21 a 23 y modificaciones 2'-F en las posiciones 2 a 4,<6>,<8>, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1 a 9 y 12 a 21 y modificaciones 2'-F en las posiciones 10 y 11; y (iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11 a 13, 15, 17, 19 y 21 a 23 y modificaciones 2'-F en las posiciones 2, 4,<6>,<8>, 10, 14, 16, 18 y 20 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-F en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9 a 11 y 13 y modificaciones 2'-OMe en las posiciones 2, 4,<6>,<8>, 12 y 14 a 21; y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3, 5 a 7, 9, 11 a 13, 15, 17 a 19 y 21 a 23 y modificaciones 2'-F en las posiciones 2, 4, 8, 10, 14, 16 y 20 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos 1 y 2, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de 21 nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 15, 17 y 19 a 21 y modificaciones 2'-F en las posiciones 3, 5, 7, 9 a 11, 13, 16 y 18; y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos 1 y 2 y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 25 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 4, 6, 7, 9, 11 a 13, 15, 17 y 19 a 23, modificaciones 2'-F en las posiciones 2, 3, 5, 8, 10, 14, 16 y 18 y desoxinucleótidos (p. ej., dT) en las posiciones 24 y 25 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos 1 y 2, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de cuatro nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de 21 nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1 a 6, 8 y 12 a 21 y modificaciones 2'-F en las posiciones 7 y 9 a 11; y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos 1 y 2 y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3 a 5, 7, 8, 10 a 13, 15 y 17 a 23 y modificaciones 2'-F en las posiciones 2, 6, 9, 14 y 16 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos 1 y 2, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1 a<6>,<8>y 12 a 21 y modificaciones 2'-F en las posiciones 7 y 9 a<1 1>; y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de 23 nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3 a 5, 7, 10 a 13, 15 y 17 a 23 y modificaciones 2'-F en las posiciones 2,<6>,<8>, 9, 14 y 16 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 21 y 22 y entre las posiciones de nucleótidos 22 y 23 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En otra opción particular, un agente de iARN de la presente divulgación comprende:
(a) una hebra de sentido que tiene:
(i) una longitud de 19 nucleótidos;
(ii) un ligando de ASGPR unido al extremo 3', en donde dicho ligando de ASGPR comprende tres derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado trivalente;
(iii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1 a 4,<6>y 10 a 19 y modificaciones 2'-F en las posiciones 5 y 7 a 9; y
(iv) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>y entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3 (contando desde el extremo 5');
y
(b) una hebra de antisentido que tiene:
(i) una longitud de<2 1>nucleótidos;
(ii) modificaciones 2'-OMe en las posiciones 1, 3 a 5, 7, 10 a 13, 15 y 17 a 21 y modificaciones 2'-F en las posiciones 2,<6>,<8>, 9, 14 y 16 (contando desde el extremo 5'); y
(iii) enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre las posiciones de nucleótidos<1>y<2>, entre las posiciones de nucleótidos 2 y 3, entre las posiciones de nucleótidos 19 y 20 y entre las posiciones de nucleótidos 20 y 21 (contando desde el extremo 5');
en donde los agentes de iARN tienen un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de antisentido y un extremo romo en el extremo 5' de la hebra de antisentido.
En ciertas opciones, el ARNi para usar en los métodos de la divulgación es un agente seleccionado de los agentes enumerados en la tabla 3, tabla 5 o tabla<6>. Estos agentes pueden comprender además un ligando.
III. ARNi conjugados con ligandos
Otra modificación del ARN de un ARNi de la divulgación implica ligar químicamente al ARNi uno o más ligandos, restos o conjugados que potencien la actividad, la distribución celular o la captación celular del ARNi, p. ej., en una célula. Dichos restos incluyen, pero sin limitación, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsingeret al.,Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989,<8 6>: 6553-6556). En otras opciones, el ligando es ácido cólico (Manoharanet al.,Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), un tioéter, p. ej., beril-S-tritiltiol (Manoharanet al.,Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharanet al.,Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauseret al.,Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaraset al.,EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanovet al.,FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuket al.,Biochimie, 1993, 75:49-54), un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato de trietilamonio (Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Sheaet al.,Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharanet al.,Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) o ácido adamantanoacético (Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), un resto de palmitilo (Mishraet al.,Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237) o un resto de octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol (Crookeet al.,J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
En ciertas opciones, un ligando altera la distribución, el direccionamiento o la vida útil de un agente de ARNi al que se incorpora. En opciones preferidas, un ligando proporciona una mejor afinidad por una diana seleccionada, p. ej., molécula, célula o tipo celular, compartimento, p. ej., un compartimento celular u orgánico, tejido, órgano o región del cuerpo, como, p. ej., en comparación con una especie que carece de dicho ligando. Los ligandos preferidos no participan en el emparejamiento bicatenario en un ácido nucleico bicatenario.
Los ligandos pueden incluir una sustancia de origen natural, tal como una proteína (p. ej., seroalbúmina humana (SAH), lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); hidrato de carbono (p. ej., un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, p. ej., un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido que es una polilisina (<p>L<l>), ácido poli L-aspártico, ácido poli L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicólido), copolímero de diviniléter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, dendrímero de poliamina, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, p. ej., un agente de direccionamiento a células o tejidos, p. ej., una lectina, glucoproteína, lípido o proteína, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula de riñón. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glucoproteína, proteína A tensioactiva, hidrato de carbono de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glucosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina o un péptido RGD o mimético de péptido RGD. En ciertas opciones, el ligando es una galactosa multivalente, p. ej., una N-acetil-galactosamina.
Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes intercalantes (p. ej., acridinas), reticulantes (p. ej., psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (p. ej., fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (p. ej., EDTA), moléculas lipófilas, p. ej., colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados peptídicos (p. ej., péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ej., PEG-40K), MPEG, [MPE<g>]<2>, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p. ej., biotina), facilitadores del transporte/absorción (p. ej., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (p. ej., imidazol, bisimidazol, histamina, grupos de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, p. ej., glucoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando o anticuerpos, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula hepática. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, hidratos de carbono, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina manosa multivalente o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de MAP cinasa p38 o un activador de NF-kB.
El ligando puede ser una sustancia, p. ej., un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, p. ej., mediante la alteración de los microtúbulos, microfilamentos o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxol, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, jasplakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida a, indanocina o mioservina.
En algunas opciones, un ligando unido a un ARNi como se describe en el presente documento actúa como un modulador farmacocinético (modulador FC). Los moduladores FC incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores FC ilustrativos incluyen, pero sin limitación, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicérido, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina. También se sabe que los oligonucleótidos que comprenden varios enlaces fosforotioato se unen a las proteínas séricas, por lo tanto, oligonucleótidos cortos, p. ej., oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples enlaces fosforotioato en la cadena principal también son susceptibles a la presente divulgación como ligandos (p. ej., como ligandos moduladores FC). Además, los aptámeros que se unen a componentes séricos (p. ej., proteínas séricas) también son adecuados para su uso como ligandos moduladores de PK en las opciones descritas en el presente documento.
Los ARNi conjugados con ligando de la divulgación se pueden sintetizar mediante el uso de un oligonucleótido que porta un grupo funcional reactivo colgante, tal como el derivado de la unión de una molécula conectora al oligonucleótido (descrito a continuación). Este oligonucleótido reactivo puede hacerse reaccionar directamente con ligandos disponibles en el mercado, ligandos que se sintetizan portando cualquiera de diversos grupos protectores o ligandos que tienen un resto conector unido a ellos.
Los oligonucleótidos usados en los conjugados de la presente divulgación pueden prepararse de manera conveniente y rutinaria mediante la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. Varios proveedores venden equipos para dicha síntesis, incluidos, por ejemplo, Applied Biosystems® (Foster City, Calif.). Adicionalmente o como alternativa se puede emplear cualquier otro medio para dicha síntesis que se conozca en la técnica. También es conocido el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados.
En los ARNi conjugados con ligando y nucleósidos ligados de secuencia específica portadores de molécula-ligando de la presente divulgación, los oligonucleótidos y oligonucleósidos pueden ensamblarse en un sintetizador de ADN adecuado mediante precursores de nucleótidos o nucleósidos convencionales, o precursores conjugados de nucleótidos o nucleósidos que ya llevan el resto conector, precursores conjugados de nucleósido o de nucleótidoligando que ya llevan la molécula de ligando, o elementos básicos que llevan ligando distinto de nucleósido.
Cuando se utilizan precursores de conjugados de nucleótidos que ya llevan un resto conector, normalmente se completa la síntesis de los nucleósidos ligados de secuencia específica y, a continuación, la molécula de ligando reacciona con el resto conectar para formar el oligonucleótido conjugado con ligando. En algunas opciones, los oligonucleótidos o nucleósidos ligados de la presente divulgación se sintetizan mediante un sintetizador automático usando fosforamiditas procedentes de conjugados de ligando-nucleósido además de las fosforamiditas convencionales y fosforamiditas no convencionales que están disponibles en el mercado y se usan de manera rutinaria en la síntesis de oligonucleótidos.
A. Conjugados lipídicos
En ciertas opciones, el ligando o conjugado es un lípido o una molécula de base lipídica. Dicho lípido o molécula de base lipídica se une preferiblemente a una proteína sérica, p. ej., seroalbúmina humana (SAH). Un ligando de unión a la SAH permite la distribución del conjugado a un tejido diana, p. ej., un tejido diana no renal del cuerpo. Por ejemplo, el tejido diana puede ser el hígado, incluidas las células parenquimatosas del hígado. También se pueden utilizar como ligandos otras moléculas que pueden unirse a la SAH. Por ejemplo, se puede utilizar naproxeno o aspirina. Un lípido o ligando de base lipídica puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte hacia una célula o membrana celular diana o (c) puede usarse para ajustar la unión a una proteína sérica, p. ej., SAH.
Se puede utilizar un ligando de base lipídica para inhibir, p. ej., controlar la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o un ligando de base lipídica que se une a la SAH con más fuerza tendrá menos probabilidades de dirigirse al riñón y, por lo tanto, será menos probable que se elimine del cuerpo. Se puede utilizar un lípido o un ligando de base lipídica que se una a SAH con menos fuerza para dirigir el conjugado al riñón.
En ciertas opciones, el ligando de base lipídica se une a SAH. Preferiblemente, se une a SAH con una afinidad suficiente para que el conjugado se distribuya preferiblemente en un tejido no renal. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión del ligando a SAH no pueda revertirse.
En otras opciones, el ligando de base lipídica se une débilmente a SAH o no se une en absoluto, de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente en el riñón. También se pueden usar otros restos que se dirigen a células renales en lugar de, o además de, el ligando de base lipídica.
En otro aspecto, el ligando es un resto, p. ej., una vitamina, que es captada por una célula diana, p. ej., una célula proliferativa. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación celular indeseada, p. ej., de tipo maligno o no maligno, p. ej., células cancerosas. Las vitaminas ilustrativas incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas ilustrativas incluyen la vitamina B, p. ej., ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por las células diana, tales como las células del hígado. También se incluyen SAH y lipoproteínas de baja densidad (LDL).
B. Agentes de permeación celular
En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente ilustrativo es un péptido tal como tat o antennopedia. Si el agente es un péptido, puede estar modificado, incluidos un peptidilmimético, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos y uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferiblemente un agente helicoidal alfa, que tiene preferiblemente una fase lipófila y otra lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o un peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en el presente documento oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a la de un péptido natural. La unión de péptidos y peptidomiméticos a agentes de ARNi puede afectar a la distribución farmacocinética del ARNi, tal como por ejemplo mejorando el reconocimiento y la absorción celular. El péptido o resto peptidomimético puede tener una longitud de aproximadamente 5-50 aminoácidos, p. ej., aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.
Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (p. ej., compuesto principalmente por Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un péptido dendrímero, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS). Un péptido ilustrativo que contiene MTS hidrófoba es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVA<l>L<p>AVLLA<l>L<a>P (SEQ ID NO: 15). Un análogo de RFGF (p. ej., la secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:16) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto de direccionamiento. El resto peptídico puede ser un péptido de "suministro", que puede transportar grandes moléculas polares, incluidos péptidos, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha descubierto que las secuencias de la proteína Tat del VIH (GRKKRRQRRRRPPQ (SEQ ID NO: 17) y la proteína Antennapedia deDrosophila(RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ iD NO: 18) son capaces de actuar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede estar codificado por una secuencia aleatoria de ADN, tal como un péptido identificado a partir de una biblioteca de presentación de fagos o una biblioteca combinatoria de una perla, un compuesto (OBOC) (Lamet al.,Nature, 354:82-84, 1991). Son ejemplos de un péptido o peptidomimético anclado a un agente de ARNbc a través de una unidad monomérica incorporada con fines de direccionamiento celular es un péptido de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) o mimético de RGD. La longitud de un resto peptídico puede variar entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o dirigir las propiedades conformacionales. Se puede utilizar cualquiera de las modificaciones estructurales que se describen a continuación.
Un péptido RGD para usar en las composiciones y métodos de la divulgación puede ser lineal o cíclico y puede estar modificado, p. ej., glucosilado o metilado, para facilitar su direccionamiento a un tejido o tejidos específicos. Los péptidos y peptidiomiméticos que contienen RGD pueden incluir D-aminoácidos, así como miméticos sintéticos de RGD. Además del RGD, se pueden utilizar otros restos que se dirijan al ligando de integrina. Los conjugados preferidos de este ligando se dirigen a PECAM-1 o VEGF.
Un "péptido de permeación celular" es capaz de penetrar en una célula, p. ej., una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido de permeación de células microbianas puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (p. ej., LL-37 o Ceropin P1), un péptido que contiene enlaces disulfuro (p. ej., a-defensina, p-defensina o bactenecina) o un péptido que contiene solo uno o dos aminoácidos dominantes (p. ej., PR-39 o indolicidina). Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (SLN). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfipático bipartito, tal como MPG, que deriva del dominio peptídico de fusión de la gp41 del VIH-1 y el<s>L<n>del antígeno T grande de SV40 (Simeoniet al.,Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
C. Conjugados de hidratos de carbono
En algunas opciones de las composiciones y métodos de la divulgación, un ARNi comprende además un hidrato de carbono. El ARNi conjugado con hidratos de carbono es ventajoso para el suministroin vivode ácidos nucleicos, así como composiciones adecuadas para el uso terapéuticoin vivo,como se describe en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, "hidrato de carbono" se refiere a un compuesto que es un hidrato de carbono en sí mismo, formado por una o más unidades de monosacárido que tienen al menos 6 átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene como parte del mismo un resto de hidrato de carbono formado por una o más unidades de monosacárido, cada una de las cuales tiene al menos seis átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Los hidratos de carbono representativos incluyen los azúcares (mono-, di-, tri y oligosacáridos que contienen aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8 o 9 unidades de monosacáridos) y polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa y gomas de polisacáridos. Los monosacáridos específicos incluyen azúcares C5 y superiores (p. ej., C5, C6, C7 o C8); los di y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades de monosacáridos (p. ej., C5, C6, C7 o C8).
En ciertas opciones, un conjugado de hidrato de carbono para usar en las composiciones y métodos de la divulgación es un monosacárido.
En una opción, un conjugado de hidrato de carbono para usar en las composiciones y métodos de la divulgación se selecciona del grupo que consiste en:
Formula IX
,
en donde Y es O o S y n es 3-6 (fórmula XXIV);
en donde Y es O o S y n es 3-6 (fórmula XXV);
en donde X es O o S (fórmula XXVII);
En otra opción, un conjugado de hidrato de carbono para usar en las composiciones y métodos de la divulgación es un monosacárido. En una opción, el monosacárido es una N-acetilgalactosamina, tal como
Otro conjugado de hidrato de carbono representativo para usar en las opciones descritas en el presente documento incluye, pero sin limitación,
En ciertas opciones de la divulgación, la GalNAc o el derivado de GalNAc está unido a un agente de ARNi de la divulgación a través de un conector monovalente. En algunas opciones, la GalNAc o el derivado de GalNAc está unido a un agente de ARNi de la divulgación a través de un conector bivalente. En otras opciones más de la divulgación, la GalNAc o el derivado de GalNAc está unido a un agente de ARNi de la divulgación a través de un conector trivalente.
En una opción, los agentes de iARN bicatenario de la divulgación comprenden una GalNAc o un derivado de GalNAc unido al agente de ARNi, p. ej., el extremo 5' de la hebra de sentido de un agente de ARNbc o el extremo 5' de una o ambas hebras de sentido de un agente de iARN de direccionamiento doble como se describe en el presente documento. En otra opción, los agentes de iARN bicatenarios de la divulgación comprenden una pluralidad de (p. ej., 2, 3, 4, 5 o 6) GalNAc o derivados de GalNAc, cada uno unido de forma independiente a una pluralidad de nucleótidos del agente de iARN bicatenario a través de una pluralidad de conectores monovalentes.
En algunas opciones, por ejemplo, cuando las dos hebras de un agente de ARNi de la divulgación son parte de una molécula mayor conectada por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma un bucle en forma de horquilla que comprende una pluralidad de nucleótidos desapareados, cada nucleótido desapareado dentro del bucle de horquilla puede comprender de forma independiente una GalNAc o un derivado de GalNAc unido a través de un conector monovalente.
En algunas opciones, el conjugado de hidrato de carbono comprende además uno o más ligandos adicionales como se ha descrito anteriormente, tales como, pero sin limitación, un modulador FC o un péptido de permeación celular.
Los conjugados y conectores de hidratos de carbono adicionales adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen los descritos en las publicaciones PCT n.° WO 2014/179620 y WO 2014/179627.
D. Conectores
En algunas opciones, el conjugado o ligando descrito en el presente documento se puede unir a un oligonucleótido de ARNi con diversos conectores que pueden ser escindibles o no escindibles.
La expresión "conectar" o "grupo conectar" significa un resto orgánico que conecta dos partes de un compuesto, p. ej., une covalentemente dos partes de un compuesto. Los conectores comprenden normalmente un enlace directo o un átomo, tal como oxígeno o azufre, una unidad, tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO<2>, SO<2>NH o una cadena de átomos, tal como, pero sin limitación, alquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, alquinilo sustituido o sin sustituir, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo, heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclilalquenilo, heterociclilalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilalquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenilarilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquinilo, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenilheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterociclilalquilo, alquilheterociclilalquenilo, alquilhererociclilalquinilo, alquenilheterociclilalquilo, alquenilheterociclilalquenilo, alquenilheterociclilalquinilo, alquinilheterociclilalquilo, alquinilheterociclilalquenilo, alquinilheterociclilalquinilo, alquilarilo, alquenilarilo, alquinilarilo, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo, alquinilheteroarilo, cuyos uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por O, S, S(O), SO<2>, N(R8), C(O), arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir o heterociclilo sustituido o sin sustituir; donde R8 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido. En una opción, el conector tiene aproximadamente 1-24 átomos, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6 18, 7-18, 8-18, 7-17, 8-17, 6-16, 7-17 u 8-16 átomos.
Un grupo conector escindible es aquel que es suficientemente estable fuera de la célula, pero que al entrar en una célula diana se escinde para liberar las dos partes que el conector mantiene unidas. En una opción preferida, el grupo conector escindible se escinde al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o más, o al menos 100 veces más rápido en una célula diana o en una primera condición de referencia (que puede, p. ej., seleccionarse para imitar o representar condiciones intracelulares) que en la sangre de un sujeto o en una segunda condición de referencia (que puede, p. ej., seleccionarse para imitar o representar condiciones halladas en la sangre o el suero).
Los grupos conectores escindibles son susceptibles a los agentes de escisión, p. ej., el pH, el potencial redox o la presencia de moléculas degradantes. En general, los agentes de escisión son más frecuentes o se encuentran a niveles o actividades más altos dentro de las células que en el suero o la sangre. Los ejemplos de dichos agentes degradantes incluyen: agentes redox que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad de sustrato, incluidos, p. ej., enzimas oxidativas o reductoras o agentes reductores, tales como mercaptanos, presentes en las células, que pueden degradar un grupo conector escindible por redox mediante reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un ambiente ácido, p. ej., los que producen un pH de cinco o menos; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo conector escindible por ácido al actuar como un ácido general, peptidasas (que pueden ser específicas de sustrato) y fosfatasas.
Un grupo conector escindible, tal como un enlace disulfuro, puede ser susceptible al pH. El pH del suero humano es 7,4, mientras que el pH intracelular promedio es ligeramente más bajo, oscilando entre aproximadamente 7,1 y 7,3. Los endosomas tienen un pH más ácido, en el intervalo de 5,5-6,0, y los lisosomas tienen un pH aún más ácido, alrededor de 5,0. Algunos conectores tendrán un grupo conector escindible que se escinde a un pH preferido, liberando de este modo un lípido catiónico del ligando dentro de la célula o en el compartimento deseado de la célula.
Un conector puede incluir un grupo conector escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo conector escindible incorporado en un conector puede depender de la célula a la que se dirige. Por ejemplo, un ligando dirigido al hígado puede unirse a un lípido catiónico a través de un conector que incluye un grupo éster. Los hepatocitos son ricos en esterasas y, por lo tanto, el conector se escindirá con más eficiencia en estos que en los tipos de células que no son ricas en esterasas. Otros tipos de células ricas en esterasas incluyen células del pulmón, de la corteza renal y del testículo.
Se pueden utilizar conectores que contienen enlaces peptídicos cuando se dirigen a tipos de células ricas en peptidasas, tales como hepatocitos y sinoviocitos.
En general, la idoneidad de un grupo conector escindible candidato se puede evaluar probando la capacidad de un agente (o condición) degradante para escindir el grupo conector candidato. También será deseable probar el grupo conector escindible candidato para determinar la capacidad de resistir a la escisión en la sangre o cuando está en contacto con otro tejido no diana. Por lo tanto, se puede determinar la susceptibilidad relativa a la escisión entre una primera y una segunda condición, donde la primera se selecciona para que sea indicativa de la escisión en una célula diana y la segunda se selecciona para que sea indicativa de la escisión en otros tejidos o líquidos biológicos, p. ej., sangre o suero. Las evaluaciones se pueden llevar a cabo en sistemas sin células, en células, en cultivo celular, en cultivo de órganos o tejidos o en animales enteros. Puede resultar útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones sin células o de cultivo y confirmar mediante evaluaciones adicionales en animales enteros. En opciones preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces más rápido en la célula (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre o el suero (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones extracelulares).
i. Grupos conectores escindibles por redox
En ciertas opciones, un grupo conector escindible es un grupo conector escindible por redox que se escinde tras reducción u oxidación. Un ejemplo de un grupo conector escindible en condiciones reductoras es un grupo conector disulfuro (-S-S-). Para determinar si un grupo conector escindible candidato es un "grupo conector escindible en condiciones reductoras" adecuado, o, por ejemplo, es adecuado para usar con un resto de ARNi particular y un agente de direccionamiento particular, se pueden consultar los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un candidato puede evaluarse mediante incubación con ditiotreitol (DTT) u otro agente reductor mediante reactivos conocidos en la técnica, que imitan la velocidad de escisión que se observaría en una célula, p. ej., una célula diana. Los candidatos también pueden evaluarse en condiciones que se seleccionan para imitar las condiciones de la sangre o del suero. En una, los compuestos candidatos se escinden como máximo aproximadamente un 10 % en la sangre. En otras opciones, los compuestos candidatos útiles se degradan al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones extracelulares). La velocidad de escisión de los compuestos candidatos se puede determinar mediante ensayos de cinética enzimática convencionales en condiciones elegidas para imitar los medios intracelulares y en comparación con las condiciones elegidas para imitar los medios extracelulares.
ii. Grupos conectores escindibles basados en fosfatos
En otras opciones, un conector escindible comprende un grupo conector escindible basado en fosfatos. Un grupo conector escindible basado en fosfatos se escinde mediante agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de un agente que escinde grupos fosfato en las células son enzimas tales como las fosfatasas en las células. Son ejemplos de grupos conectores basados en fosfatos -O-P(O)(ORk)-O-, -OP(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -OP(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. Son opciones preferidas -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -OP(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S- y -O-P(S)(H)-S-. Una opción preferida es -O-P(O)(OH)-O-. Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
iii. Grupos conectores escindibles por ácido
En otras opciones, un conector escindible comprende un grupo conector escindible por ácido. Un grupo conector escindible por ácido es un grupo conector que se escinde en condiciones ácidas. En opciones preferidas, los grupos conectores escindibles con ácido se escinden en un ambiente ácido con un pH de aproximadamente 6,5 o inferior (p. ej., aproximadamente 6,0, 5,5, 5,0 o inferior) o mediante agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, los orgánulos específicos de pH bajo, tales como endosomas y lisosomas pueden proporcionar un entorno de escisión para grupos conectores escindibles por ácido. Los ejemplos de grupos conectores escindibles por ácido incluyen, pero sin limitación, hidrazonas, ésteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles por ácido pueden tener la fórmula general -C=NN-, C(O)O u -OC(O). Una opción preferida es cuando el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, grupo alquilo sustituido o grupo alquilo terciario tal como dimetilpentilo o t-butilo. Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
iv. Grupos conectores basados en ésteres
En otras opciones, un conector escindible comprende un grupo conector escindible basado en ésteres. Un grupo conector escindible basado en ésteres es escindido por enzimas tales como esterasas y amidasas en las células. Los ejemplos de grupos conectores escindibles basados en ésteres incluyen, pero sin limitación, ésteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno. Los grupos conectores escindibles por éster tienen la fórmula general -C(O)O- o -OC(O)-. Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
v. Grupos de escisión basados en péptidos
En todavía otras opciones, un conector escindible comprende un grupo conector escindible basado en péptidos. Un grupo conector escindible basado en péptidos es escindido por enzimas tales como peptidasas y proteasas en las células. Los grupos conectores escindibles basados en péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para producir oligopéptidos (p. ej., dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos. Los grupos escindibles basados en péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-). El grupo amida se puede formar entre cualquier alquileno, alquenileno o alquinileno. Un enlace peptídico es un tipo especial de enlace amida que se forma entre aminoácidos para producir péptidos y proteínas. El grupo de escisión basado en péptidos generalmente se limita al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos que producen péptidos y proteínas y no incluye el grupo funcional amida completo. Los grupos conectores escindibles basados en péptidos tienen la fórmula general -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
En algunas opciones, un ARNi de la divulgación se conjuga con un hidrato de carbono a través de un conector. Los ejemplos no limitantes de conjugados de hidratos de carbono de ARNi con conectores de las composiciones y métodos de la divulgación incluyen, pero sin limitación,
(Formula XLI),
cuando uno de X o Y es un oligonucleótido, el otro es hidrógeno.
En ciertas opciones de las composiciones y métodos de la divulgación, un ligando es uno o más derivados de "GalNAc" (N-acetilgalactosamina) unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente.
En una opción, un ARNbc de la divulgación se conjuga con un conector ramificado bivalente o trivalente seleccionado del grupo de estructuras mostradas en cualquiera de fórmula (XLV) - (XLVI):
Fórmula XXXXV Fórmula XLVI
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan de forma independiente en cada caso 0-20 y en donde la unidad repetitiva puede ser la misma o diferente;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C están cada uno de forma independiente en cada caso ausentes, CO, NH, O, S, OC(O), NH<c>(<o>), C<h>2, CH2N<h>o CH2O;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C están de forma independiente en cada caso ausentes, alquileno, alquileno sustituido en donde uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por uno o más de O, S, S(O), SO<2>, N(RN), C(R')=C(R"), CeC o C(O);
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C están cada uno de forma independiente en cada caso ausentes, NH, O,
o heterociclilo;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando; es decir, cada uno de forma independiente en cada caso un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido; y Ra es H o una cadena lateral de aminoácido. Los derivados de GalNAc de conjugación trivalentes son particularmente útiles para su uso con agentes de iARN para inhibir la expresión de un gen diana, tales como los de fórmula (XLIX):
en donde L5A, L5B y L5C representan un monosacárido, tal como un derivado de GalNAc.
Los ejemplos de grupos conectores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que conjugan con derivados de GalNAc incluyen, pero sin limitación, las estructuras enumeradas anteriormente como fórmulas II, VII, XI, X y XIII. Las patentes de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de conjugados de ARN incluyen, pero sin limitación, las patentes de los EE. UU. n.° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928; 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; y 8.106.022.
No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén modificadas de manera uniforme y, de hecho, se pueden incorporar más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un ARNi. La presente divulgación también incluye compuestos de ARNi que son compuestos quiméricos.
Los compuestos de ARNi "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de la presente divulgación, son compuestos de ARNi, preferiblemente agentes de iARNbc, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNbc. Estos ARNi normalmente contienen al menos una región en donde el ARN está modificado para conferir al ARNi una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular o aumento de la afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Una región adicional del ARNi puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de una doble cadena de ARN:ADN. La activación de la RNasa H, por lo tanto, produce la escisión de la diana de ARN, mejorando de este modo en gran medida la eficiencia de la inhibición de la expresión génica por ARNi. Por consiguiente, a menudo se pueden obtener resultados similares con ARNi más cortos cuando se utilizan ARNbc quiméricos, en comparación con los fosforotioato desoxi ARNbc que se hibridan con la misma región diana. La escisión de la diana de ARN se puede detectar de forma rutinaria mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en este campo.
En ciertos casos, el ARN de un ARNi puede ser modificado por un grupo que no es ligando. Se han conjugado varias moléculas que no son ligandos con ARNi para mejorar la actividad, la distribución celular o la captación celular del ARNi, y los procedimientos para realizar dichas conjugaciones están disponibles en la bibliografía científica. Dichos restos no ligandos han incluido restos lipídicos, tales como el colesterol (Kubo, T.et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsingeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), el ácido cólico (Manoharanet al.,Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharanet al.,Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharanet al.,Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauseret al.,Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaraset al.,EMBO J., 1991, 10:111; Kabanovet al.,FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuket al.,Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Sheaet al.,Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharanet al.,Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) o ácido adamantanoacético (Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un resto palmitilo (Mishraet al.,Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229) o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crookeet al.,J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Anteriormente se han enumerado patentes de los EE. UU. representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados de ARN. Los protocolos de conjugación clásicos implican la síntesis de ARN que portan un aminoconector en una o más posiciones de la secuencia. A continuación, el grupo amino se hace reaccionar con la molécula que se está conjugando mediante reactivos de activación o acoplamiento adecuados. La reacción de conjugación se puede realizar con el ARN todavía unido al soporte sólido o después de la escisión del ARN, en fase de solución. La purificación del conjugado de ARN mediante HPLC normalmente produce el conjugado puro.
IV. Suministro de un ARNi de la divulgación
El suministro de un ARNi de la divulgación a una célula, p. ej., una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto humano (p. ej., un sujeto que lo necesite, tal como un sujeto susceptible o al que se le ha diagnosticado un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión) se puede lograr de varias maneras diferentes. Por ejemplo, el suministro se puede realizar poniendo en contacto una célula con un ARNi de la divulgación ya seain vitrooin vivo.El suministroin vivotambién se puede realizar directamente administrando una composición que comprende un ARNi, p. ej., un ARNbc, a un sujeto. Como alternativa, el suministroin vivose puede realizar indirectamente administrando uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del ARNi. Estas alternativas se analizan más adelante.
En general, cualquier método para administrar una molécula de ácido nucleico(in vitrooin vivo)se puede adaptar para su uso con un ARNi de la divulgación (véase, por ejemplo, Akhtar S. y Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol.
2(5):139-144 y el documento WO94/02595). Para el suministroin vivo,los factores a considerar para suministrar una molécula de ARNi incluyen, por ejemplo, la estabilidad biológica de la molécula suministrada, la prevención de los efectos inespecíficos y la acumulación de la molécula suministrada en el tejido diana. La interferencia de ARN también ha tenido éxito con el suministro local al SNC mediante inyección directa (Dorn, G.,et al.(2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH.,et al(2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H.,et al(2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT.,et al(2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER.,et al(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y.,et al(2005) J. Neurophysiol. 93:594-602). La modificación del ARN o del vehículo farmacéutico también puede permitir dirigir el ARNi al tejido diana y evitar efectos inespecíficos indeseables. Las moléculas de ARNi pueden modificarse mediante conjugación química con grupos lipófilos tales como el colesterol para mejorar la captación celular y prevenir la degradación. Por ejemplo, se inyectó de forma sistémica en ratones un ARNi dirigido contra ApoB conjugado con un resto de colesterol lipófilo y esto provocó la atenuación del ARNm de apoB tanto en el hígado como en el yeyuno (Soutschek, J.,et al(2004) Nature 432:173-178).
En una opción alternativa, el ARNi se puede suministrar mediante sistemas de suministro de fármacos tales como una nanopartícula, un dendrímero, un polímero, liposomas o un sistema de suministro catiónico. Los sistemas de suministro catiónicos con carga positiva facilitan la unión de una molécula de ARNi (con carga negativa) y también mejoran las interacciones en la membrana celular con cargada negativa para permitir la captación eficiente de un ARNi por la célula. Los lípidos catiónicos, dendrímeros o polímeros pueden unirse a un ARNi o inducirse a formar una vesícula o micela (véase, p. ej., Kim SH,et al(2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encierra un ARNi. La formación de vesículas o micelas previene aún más la degradación del ARNi cuando se administra por vía sistémica. Los métodos para preparar y administrar complejos de ARN catiónico están dentro de las capacidades de un experto en la técnica (véase, p. ej., Sorensen, DR,et al(2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN,et al(2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, ASet al(2007) J. Hypertens. 25:197-205). Algunos ejemplos no limitantes de sistemas de suministro de fármacos útiles para el suministro sistémico de ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, DR.,et al(2003), citado anteriormente; Verma, UN,et al2003, citado anteriormente), "partículas lipídicas sólidas de ácido nucleico" (Zimmermann, TS,et al(2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY,et al(2005) Cancer Gene Ther.
12:321-328; Pal, A,et al(2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimina (Bonnet ME,et al(2008) Pharm. Res. Epub 16 de agosto antes de impresión; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) y poliamidoaminas (Tomalia, DA,et al(2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H.,et al(1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). En algunas opciones, un ARNi forma un complejo con ciclodextrina para administración sistémica. Se pueden encontrar métodos para la administración y las composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas en la patente de los EE. UU. n.° 7.427.605.
A. ARNi codificados por vectores de la divulgación
El ARNi dirigido al gen de AGT se puede expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, p. ej., Couture, A,et al.,TlG. (1996), 12:5-10; Skillern, A,et al.,publicación internacional PCT n.° WO 00/22113, Conrad, publicación internacional P<c>T n.° WO 00/22114 y Conrad, patente de los EE. UU. n.° 6.054.299). La expresión puede ser transitoria (entre horas y semanas) o sostenida (de semanas a meses o más), dependiendo de la construcción específica utilizada y del tejido o tipo de célula diana. Estos transgenes pueden introducirse como una construcción lineal, un plásmido circular o un vector vírico, que puede ser un vector integrador o no integrador. El transgén también puede construirse para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
Los sistemas de vectores víricos que se pueden utilizar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, incluyendo, pero sin limitación, vectores lentivíricos, virus de la leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adenoasociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores de SV 40; (f) vectores del virus del polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores del virus de la viruela, tales como unOrthopoxvirus,p. ej., vectores del virus vaccinia, oAvipoxvirus,p. ej., viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de auxiliar ogutless.Los virus de replicación defectuosa también pueden ser ventajosos. Diferentes vectores se incorporarán o no al genoma de las células. Las construcciones pueden incluir secuencias víricas para transfección, si se desea. Como alternativa, la construcción se puede incorporar en vectores con capacidad de replicación episómica, p. ej., vectores EPV y EBV. Las construcciones para la expresión recombinante de un ARNi generalmente requerirán elementos reguladores, p. ej., promotores, potenciadores, etc., para garantizar la expresión del ARNip en las células diana. En la técnica se conocen otros aspectos a considerar para vectores y construcciones.
V. Composiciones farmacéuticas de la divulgación
La presente divulgación también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los ARNi de la divulgación. En una opción, se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que contienen un ARNi, como se describe en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ARNi son útiles para prevenir o tratar un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión. Dichas composiciones farmacéuticas se formulan basándose en el modo de administración. Un ejemplo son las composiciones que se formulan para administración sistémica por administración parenteral, p. ej., administración subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.). Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden administrar en dosis suficientes para inhibir la expresión de un gen de AGT.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden administrar en dosis suficientes para inhibir la expresión de un gen de AGT. En general, una dosis adecuada de un ARNi de la divulgación estará en el intervalo entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 200,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, generalmente en el intervalo entre aproximadamente 1 y 50 mg por kilogramo de peso corporal al día. Normalmente, una dosis adecuada de un ARNi de la divulgación estará en el intervalo entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 5,0 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 0,3 mg/kg y aproximadamente 3,0 mg/kg. Un régimen de dosis repetidas puede incluir la administración de una cantidad terapéutica de ARNi de forma regular, tal como cada mes, una vez cada 3-6 meses o una vez al año. En ciertas opciones, el ARNi se administra entre aproximadamente una vez al mes y aproximadamente una vez cada seis meses.
Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar con menos frecuencia. La duración del tratamiento se puede determinar según la gravedad de la enfermedad.
En otras opciones, una dosis única de las composiciones farmacéuticas puede ser duradera, de modo que las dosis se administren en intervalos no superiores a 1, 2, 3 o 4 meses. En algunas opciones de la divulgación, se administra una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la divulgación aproximadamente una vez al mes. En otras opciones de la divulgación, se administra una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la divulgación trimestralmente (es decir, aproximadamente cada tres meses). En otras opciones de la divulgación, se administra una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la divulgación dos veces al año (es decir, aproximadamente una vez cada seis meses).
El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo requeridos para tratar eficazmente a un sujeto, incluidos, pero sin limitación, las mutaciones presentes en el sujeto, los tratamientos anteriores, el estado de salud general o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Por otra parte, el tratamiento de un sujeto con una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz, según sea adecuado, de una composición puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos.
El ARNi puede suministrarse de manera que se dirija a un tejido particular (p. ej., hepatocitos).
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de diversos componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos preformados, sólidos de autoemulsión y semisólidos de autoemulsión. Las formulaciones incluyen las que se dirigen al hígado.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación, que pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria, pueden prepararse según las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con los vehículos o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima los principios activos con vehículos líquidos.
A. Formulaciones adicionales
i. Emulsiones
Las composiciones de la presente divulgación se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotículas que generalmente superan los 0,1 |jm de diámetro (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchiet al.,en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de agua en aceite (ag/ac) o de aceite en agua (ac/ag). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa como gotículas diminutas en una fase oleosa a granel, la composición resultante se denomina emulsión de agua en aceite (ag/ac). Como alternativa, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa como gotículas diminutas en una fase acuosa a granel, la composición resultante se denomina emulsión de aceite en agua (ac/ag). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas y el fármaco activo que puede estar presente como una solución en la fase acuosa, la fase oleosa o por sí solo como una fase separada. También pueden estar presentes excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizantes, colorantes y antioxidantes en las emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que constan de más de dos fases, tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (ac/ag/ac) y agua en aceite en agua (ag/ac/ag). Estas formulaciones complejas proporcionan con frecuencia ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples no ofrecen. Las emulsiones múltiples en las que las gotículas de aceite individuales de una emulsión ac/ag encierran gotículas de agua constituyen una emulsión ag/ac/ag. De manera análoga, un sistema de gotículas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizadas en una fase oleosa continua proporciona una emulsión de ac/ag/ac.
Las emulsiones se caracterizan por tener poca o ninguna estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión está bien dispersada en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma mediante emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Otros medios para estabilizar las emulsiones implican el uso de emulsionantes que pueden incorporarse en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar en términos generales en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes naturales, bases de absorción y sólidos finamente dispersos (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV., Popovich NG., y Ansel HC.,<2 0>O<4>, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y han sido revisados en la bibliografía (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199). Los tensioactivos son normalmente anfifílicos y comprenden una porción hidrófila y otra hidrófoba. La relación entre la naturaleza hidrófila e hidrófoba del tensioactivo se ha denominado equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa para clasificar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos se pueden clasificar en diferentes clases según la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónico, aniónico, catiónico y anfótero (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich N<g>., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285).
En las formulaciones de emulsión también se incluye una gran variedad de materiales no emulsionantes y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estas incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
La aplicación de formulaciones en emulsión a través de las vías dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su fabricación se han revisado en la bibliografía (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
ii. Microemulsiones
En una opción de la presente divulgación, las composiciones de ARNi y los ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfífilo, que es una única solución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una solución tensioactiva acuosa y añadiendo después una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, también se han descrito microemulsiones como termodinámicamente estables, dispersiones isotrópicamente claras de dos líquidos inmiscibles que están estabilizados por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215).
iii. Micropartículas
Un ARNi de la divulgación puede incorporarse en una partícula, p. ej., una micropartícula. Las micropartículas se pueden producir mediante secado por pulverización, pero también pueden producirse mediante otros métodos, incluida la liofilización, evaporación, secado por lecho fluido, secado al vacío o una combinación de estas técnicas.
iv. Potenciadores de la penetración
En una opción, la presente divulgación emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar la administración eficiente de ácidos nucleicos, en particular ARNi, a la piel de los animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto en forma ionizada como no ionizada. Sin embargo, habitualmente, solo los fármacos lipófilos o liposolubles atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana que se va a cruzar se trata con un potenciador de la penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también mejoran la permeabilidad de los fármacos lipófilos.
Los potenciadores de la penetración se pueden clasificar en una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (véase, p. ej., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Leeet al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de las clases de potenciadores de la penetración mencionadas anteriormente y su uso en la fabricación de composiciones farmacéuticas y administración de agentes farmacéuticos se conocen bien en la técnica.
v.Excipientes
A diferencia de un compuesto transportador, un "transportador farmacéutico" o "excipiente" es un disolvente, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacéuticamente aceptable farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la forma planificada de administración, para proporcionar el volumen deseado, consistencia, etc., cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Dichos agentes son bien conocidos en la técnica.
vi. Otros componentes
Las composiciones de la presente divulgación pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, antipruriginosos, estípticos, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente divulgación, tales como tintes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente divulgación. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclarse con agentes coadyuvantes, p. ej., lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes o sustancias aromáticas y similares que no interactúan perjudicialmente con el ácido o los ácidos nucleicos de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
En algunas opciones, las composiciones farmacéuticas presentadas en la divulgación incluyen (a) uno o más ARNi y (b) uno o más agentes que actúan mediante un mecanismo distinto del ARNi y que son útiles en el tratamiento de un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión.
La toxicidad y la eficacia profiláctica de dichos compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis profilácticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren compuestos que muestren elevados índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y de estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis para su uso en seres humanos. La dosis de las composiciones presentadas en el presente documento en la divulgación se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50, preferiblemente una DE80 o DE90, con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos presentados en la divulgación, la dosis profilácticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración plasmática en circulación del compuesto o, cuando sea adecuado, del producto polipeptídico de una secuencia diana (p. ej., logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) o niveles más altos de inhibición según se determina en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.
Además de su administración, como se ha analizado anteriormente, los ARNi presentados en la divulgación se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos usados para la prevención o el tratamiento de un trastorno asociado al AGT, p. ej., hipertensión. En cualquier caso, el médico administrador puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de ARNi en función de los resultados observados usando medidas convencionales de eficacia conocidas en la técnica o descritas en el presente documento.
VI. Métodos para inhibir la expresión del AGT
La presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la expresión de un gen de AGT en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto una célula con un agente de ARNi, p. ej., agente de ARN bicatenario, en una cantidad eficaz para inhibir la expresión del AGT en la célula, inhibiendo de este modo la expresión del AGT en la célula.
El contacto de una célula con un ARNi, p. ej., un agente de ARN bicatenario, se puede realizarin vitrooin vivo.El contacto de una célulain vivocon el ARNi incluye poner en contacto una célula o un grupo de células en un sujeto, p. ej., un sujeto humano, con el ARNi. También son posibles combinaciones de métodos de contacto con una célulain vitroein vivo.El contacto con una célula puede ser directo o indirecto, como se ha analizado anteriormente. Asimismo, se puede lograr el contacto con una célula a través de un ligando de direccionamiento, incluido cualquier ligando descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En opciones preferidas, el ligando de direccionamiento es un resto de hidrato de carbono, p. ej., un ligando de GalNAc, o cualquier otro ligando que dirija el agente de ARNi a un sitio de interés.
El término "inhibir", como se utiliza en el presente documento, se usa indistintamente con "reducir", "silenciar", "regular a la baja", "suprimir" y otras expresiones similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
Se entiende que la expresión "inhibir la expresión de un AGT" se refiere a la inhibición de la expresión de cualquier gen de AGT (tal como, p. ej., un gen de a Gt de ratón, un gen de AGT de rata, un gen de AGT de mono o un gen de AGT humano) así como variantes o mutantes de un gen de AGT. Por lo tanto, el gen de AGT puede ser un gen de AGT natural, un gen de AGT mutante o un gen de AGT transgénico en el contexto de una célula, grupo de células u organismo manipulados genéticamente.
"Inhibir la expresión de un gen de AGT" incluye cualquier nivel de inhibición de un gen de AGT, p. ej., al menos supresión parcial de la expresión de un gen de AGT. La expresión del gen de AGT se puede evaluar basándose en el nivel, o el cambio del nivel, de cualquier variable asociada con la expresión del gen de AGT, p. ej., el nivel de ARNm de AGT o el nivel de proteína AGT. Este nivel puede evaluarse en una célula individual o en un grupo de células, incluidos, por ejemplo, una muestra procedente de un sujeto. Se entiende que el AGT se expresa predominantemente en el hígado, pero también en el cerebro, la vesícula biliar, el corazón y el riñón, y está presente en la circulación.
La inhibición puede evaluarse mediante una disminución en un nivel absoluto o relativo de una o más variables asociadas con la expresión del AGT en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utilice en la técnica, p. ej., un nivel inicial previo a la dosis o un nivel determinado a partir de un sujeto similar, célula o muestra que no está tratada o se trata con un control (tal como, p. ej., control de solo tampón o control de agente inactivo).
En algunas opciones de los métodos de la divulgación, la expresión de un gen de AGT se inhibe al menos en un 50 %, 55 %, 60 %,<6 5>%, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o por debajo del nivel de detección del ensayo. En opciones preferidas, la expresión de un gen de AGT se inhibe al menos en un 70 %. Se entiende además que la inhibición de la expresión del AGT en ciertos tejidos, p. ej., en el hígado, sin una inhibición significativa de la expresión en otros tejidos, p. ej., cerebro, puede ser deseable. En opciones preferidas, el nivel de expresión se determina usando el método de ensayo proporcionado en el ejemplo 2 con una concentración de ARNip 10 nM en la línea celular de especie correspondiente apropiada.
En ciertas opciones, la inhibición de la expresiónin vivose determina mediante la atenuación del gen humano en un roedor que expresa el gen humano, p. ej., un ratón infectado por AAV que expresa el gen diana humano (es decir, AGT), p. ej., cuando se administra una dosis única de 3 mg/kg en el punto mínimo de la expresión del ARN. También se puede determinar la atenuación de la expresión de un gen endógeno en un sistema modelo animal, p. ej., después de la administración de una dosis única de 3 mg/kg en el punto mínimo de la expresión del ARN. Dichos sistemas son útiles cuando la secuencia de ácido nucleico del gen humano y el gen modelo animal están lo suficientemente cerca como para que el ARNi humano proporcione una atenuación eficaz del gen modelo animal. La expresión de ARN en el hígado se determina mediante los métodos de PCR proporcionados en el ejemplo 2.
La inhibición de la expresión de un gen de AGT puede manifestarse por una reducción de la cantidad de ARNm expresado por una primera célula o grupo de células (dichas células pueden estar presentes, por ejemplo, en una muestra procedente de un sujeto) en el que se transcribe un gen de a Gt y que se ha tratado o se han tratado (p. ej., poniendo en contacto la célula o células con un ARNi de la divulgación, o administrando un ARNi de la divulgación a un sujeto en el que las células están o estuvieron presentes) de manera que se inhibe la expresión de un gen de AGT, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no se ha tratado o no se han tratado de esa manera (células de control sin tratar con un ARNi o sin tratar con un ARNi dirigido al gen de interés). En opciones preferidas, la inhibición se evalúa mediante el método proporcionado en el ejemplo 2 usando una concentración de ARNip 10 nM en la línea celular de la misma especie y expresando el nivel de ARNm en las células tratadas como un porcentaje del nivel de ARNm en las células de control, mediante la siguiente fórmula:
(ARNm en células de control) — (ARNm en células tratadas)
(ARNm en células de control)
En otras opciones, la inhibición de la expresión de un gen de AGT puede evaluarse con respecto a una reducción de un parámetro que está funcionalmente ligado a la expresión del gen de AGT, p. ej., el nivel de proteína AGT en sangre o suero de un sujeto. El silenciamiento del gen de AGT se puede determinar en cualquier célula que exprese AGT, ya sea endógeno o heterólogo a partir de una construcción de expresión, y mediante cualquier ensayo conocido en la técnica.
La inhibición de la expresión de una proteína AGT puede manifestarse por una reducción en el nivel de la proteína AGT que es expresada por una célula o grupo de células o en una muestra del sujeto (p. ej., el nivel de proteína en una muestra de sangre procedente de un sujeto). Como se ha explicado anteriormente, para la evaluación de la supresión del ARNm, la inhibición de los niveles de expresión de proteínas en una célula o grupo de células tratadas puede expresarse de manera similar como un porcentaje del nivel de proteína en una célula o grupo de células de control, o el cambio en el nivel de proteína en una muestra objeto, p. ej., sangre o suero procedente de la misma.
Una célula de control, un grupo de células o una muestra objeto que puede usarse para evaluar la inhibición de la expresión de un gen de AGT incluye una célula, grupo de células o muestra objeto que aún no se ha puesto en contacto con un agente de ARNi de la divulgación. Por ejemplo, la célula de control, grupo de células o muestra objeto puede proceder de un sujeto individual (p. ej., un sujeto humano o animal) antes del tratamiento del sujeto con un agente de ARNi o un control de población adecuadamente emparejado.
El nivel de ARNm de AGT que es expresado por una célula o grupo de células se puede determinar usando cualquier método conocido en la técnica para evaluar la expresión de ARNm. En una opción, el nivel de expresión de AGT en una muestra se determina detectando un polinucleótido transcrito, o parte del mismo, p. ej., ARNm del gen de AGT. El ARN se puede extraer de las células utilizando técnicas de extracción de ARN incluidas, por ejemplo, el uso de extracción con isotiocianato de fenol/guanidina ácido (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparación de ARN RNeasy™ (Qiagen®) o PAXgene™ (PreAnalytix™, Suiza). Los formatos de ensayo típicos que utilizan hibridación de ácido ribonucleico incluyen ensayos de ejecución nuclear, RT-PCR, ensayos de protección de RNasa, transferencia de Northern, hibridaciónin situy análisis de micromatrices.
En algunas opciones, el nivel de expresión de AGT se determina utilizando una sonda de ácido nucleico. El término "sonda", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier molécula que es capaz de unirse selectivamente a un AGT específico. Las sondas pueden ser sintetizadas por un experto en la materia, o proceder de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas se pueden diseñar de manera específica para ser marcadas. Los ejemplos de moléculas que se pueden utilizar como sondas incluyen, pero sin limitación, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas.
El ARNm aislado se puede usar en ensayos de hibridación o de amplificación que incluyen, pero sin limitación, análisis de Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y matriz de sondas. Un método para la determinación de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se pueda hibridar con ARNm de AGT. En una opción, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, dejando correr el ARNm sobre un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm desde el gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En una opción alternativa, la o las sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la o las sondas, por ejemplo, en una matriz de microplaca de genes Affymetrix®. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm conocidos para su uso en la determinación del nivel de ARNm de AGT.
Un método alternativo para determinar el nivel de expresión del AGT en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico o transcriptasa inversa (para preparar ADNc) de, por ejemplo, ARNm en la muestra, p. ej., mediante RT-PCR (la realización experimental expuesta en Mullis, 1987, patente de los EE. UU. n.° 4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicación de secuencia autónoma (Guatelliet al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 ), sistema de amplificación transcripcional (Kwohet al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), replicasa Q-beta (Lizardiet al.(1988) Bio/Technology 6:1197), replicación en círculo rodante (Lizardiet al.,patente de los EE. UU n.° 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos. En aspectos particulares de la divulgación, el nivel de expresión de AGT se determina mediante RT-PCR fluorogénica cuantitativa (es decir, el sistema TaqMan™). En opciones preferidas, el nivel de expresión se determina mediante el método proporcionado en el ejemplo 2 usando una concentración de ARNip de 10 nM en la línea celular de especie coincidente.
Los niveles de expresión del ARNm de AGT se pueden controlar usando una membrana de transferencia (tal como las usadas en análisis de hibridación tales como Northern, Southern, por puntos y similares) o micropocillos, tubos de muestras, geles, perlas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos unidos). Véanse, las patentes de los<e>E. UU. n.° 5.770.722, 5.874.219, 5.744.305, 5.677.195 y 5.445.934. La determinación de la expresión de AGT también puede comprender el uso de sondas de ácido nucleico en solución.
En opciones preferidas, el nivel de expresión del ARNm se evalúa mediante ensayos de ADN ramificado (ADNr) o PCR en tiempo real (qPCR). El uso de estos métodos se describe e ilustra en los ejemplos presentados en el presente documento. En opciones preferidas, el nivel de expresión se determina mediante el método proporcionado en el ejemplo 2 usando una concentración de ARNip de 10 nM en la línea celular de especie coincidente.
El nivel de expresión de la proteína AGT se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica para medir los niveles de proteína. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión, reacciones de precipitina líquida o en gel, espectroscopia de absorción, ensayos colorimétricos, ensayos espectrofotométricos, citometría de flujo, inmunodifusión (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, transferencia de Western, radioinmunoensayo (RIA), ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, ensayos de electroquimioluminiscencia y similares.
En algunas opciones, la eficacia de los métodos de la divulgación se evalúa mediante una disminución del nivel de ARNm o proteína de AGT (p. ej., en una biopsia de hígado).
En algunas opciones de los métodos de la divulgación, el ARNi se administra a un sujeto de manera que el ARNi se suministre a un sitio específico dentro del sujeto. La inhibición de la expresión de AGT se puede evaluar usando mediciones del nivel o el cambio del nivel de ARNm de AGT o proteína agt en una muestra procedente de líquido o tejido del sitio específico dentro del sujeto (p. ej., hígado o sangre).
Como se utilizan en el presente documento, se entiende que los términos detectar o determinar un nivel de un analito significan realizar las etapas para determinar si un material, p. ej., proteína, ARN, está presente. Como se utilizan en el presente documento, los métodos de detección o determinación incluyen la detección o determinación de un nivel de analito que está por debajo del nivel de detección para el método utilizado.
VII. Métodos profilácticos y de tratamiento de la divulgación
La presente divulgación también proporciona métodos para usar un ARNi de la divulgación o una composición que contiene un ARNi de la divulgación para inhibir la expresión de AGT, previniendo o tratando de este modo un trastorno asociado al AGT, p. ej., alta presión arterial, p. ej., hipertensión.
En los métodos de la divulgación, la célula puede ponerse en contacto con el ARNip.in vitrooin vivo,es decir, la célula puede estar dentro de un sujeto.
Una célula adecuada para el tratamiento con los métodos de la divulgación puede ser cualquier célula que exprese un gen de AGT, p. ej., una célula hepática, una célula cerebral, una célula de la vesícula biliar, una célula cardíaca o una célula renal, pero preferiblemente una célula hepática. Una célula adecuada para usar en los métodos de la divulgación puede ser una célula de mamífero, p. ej., una célula de primate (tal como una célula humana, incluida una célula humana en un animal no humano quimérico, o una célula de primate no humano, p. ej., una célula de mono o una célula de chimpancé) o una célula que no es de primate. En ciertas opciones, la célula es una célula humana, p. ej., una célula hepática humana. En los métodos de la divulgación, la expresión de AGT se inhibe en la célula en al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95, o hasta un nivel por debajo del nivel de detección del ensayo.
Los métodosin vivode la divulgación pueden incluir administrar a un sujeto una composición que contiene un ARNi, donde el ARNi incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria de al menos una parte de un transcrito de ARN del gen de AGT del mamífero al que se va a administrar el agente de ARNi. La composición se puede administrar mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluidos, pero sin limitación, las vías oral, intraperitoneal o parenteral, incluida la administración intracraneal (p. ej., intraventricular, intraparenquimatosa e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, por las vías respiratorias (aerosol), nasal, rectal y tópica (incluidas bucal y sublingual). En ciertas opciones, las composiciones se administran mediante infusión o inyección intravenosa. En ciertas opciones, las composiciones se administran mediante inyección subcutánea. En ciertas opciones, las composiciones se administran mediante inyección intramuscular.
En un aspecto, la presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la expresión de un gen de AGT en un mamífero. Los métodos incluyen administrar al mamífero una composición que comprende un ARNbc que se dirige a un gen de AGT en una célula del mamífero y mantener el mamífero durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen de AGT, inhibiendo de este modo la expresión del gen de AGT en la célula. La reducción en la expresión génica se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica y mediante métodos, p. ej., qRT-PCR, descritos en el presente documento, p. ej., en el ejemplo 2. La reducción de la producción de proteínas se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica, p. ej., ELISA. En ciertas opciones, una muestra de biopsia de hígado por punción sirve como material tisular para controlar la reducción de la expresión del gen o proteína de AGT. En otras opciones, una muestra de sangre sirve como muestra para controlar la reducción de la expresión de la proteína agt.
La presente divulgación proporciona además métodos de tratamiento en un sujeto que lo necesite, p. ej., un sujeto al que se ha diagnosticado hipertensión.
La presente divulgación proporciona además métodos de profilaxis en un sujeto que la necesite. Los métodos de tratamiento de la divulgación incluyen administrar un ARNi de la divulgación a un sujeto, p. ej., un sujeto que se beneficiaría de una reducción de la expresión de AGT, en una cantidad profilácticamente eficaz de un ARNi dirigido a un gen de AGT o una composición farmacéutica que comprende un ARNi dirigido a un gen de AGT.
Un ARNi de la divulgación puede administrarse como un "ARNi libre". Se administra un ARNi libre en ausencia de una composición farmacéutica. El ARNi desnudo puede estar en una solución de tampón adecuada. La solución de tampón puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de los mismos. En una opción, la solución de tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS). El pH y la osmolalidad de la solución de tampón que contiene el ARNip se pueden ajustar para que esta sea adecuada para su administración a un sujeto.
Como alternativa, un ARNi de la divulgación puede administrarse como una composición farmacéutica, tal como una formulación liposómica de ARNbc.
Los sujetos que se beneficiarían de una inhibición de la expresión del gen de AGT son sujetos susceptibles o a los que se ha diagnosticado hipertensión.
En una opción, el método incluye administrar una composición presentada en el presente documento de manera que disminuya la expresión del gen de AGT diana, tal como durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 1-6, 1-3 o 3-6 meses por dosis. En ciertas opciones, la composición se administra una vez cada 3-6 meses.
Preferiblemente, los ARNi útiles para los métodos y composiciones presentados en el presente documento se dirigen específicamente a los ARN (primarios o procesados) del gen de<a>G<t>diana. Las composiciones y los métodos para inhibir la expresión de estos genes mediante ARNi se pueden preparar y realizar como se describe en el presente documento.
La administración del ARNi según los métodos de la divulgación puede dar lugar a la prevención o el tratamiento de un trastorno asociado al AGT, p. ej., alta presión arterial, p. ej., hipertensión. A continuación, se proporcionan los criterios de diagnóstico para diversos tipos de presión arterial alta.
A los sujetos se les puede administrar una cantidad terapéutica de ARNi, tal como entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 200 mg/kg.
El ARNi se administra preferiblemente por vía subcutánea, es decir, mediante inyección subcutánea. Se pueden usar una o más inyecciones para suministrar la dosis deseada de ARNi a un sujeto. Las inyecciones se pueden repetir durante un periodo de tiempo.
La administración puede repetirse periódicamente. En ciertas opciones, después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar con menos frecuencia. Un régimen de dosis repetidas puede incluir la administración de una cantidad terapéutica de ARNi de forma regular, tal como entre una vez al mes y una vez al año. En ciertas opciones, el ARNi se administra entre aproximadamente una vez al mes y aproximadamente una vez cada tres meses o entre aproximadamente una vez cada tres meses y aproximadamente una vez cada seis meses.
VIII. Criterios de diagnóstico, factores de riesgo y tratamientos para la hipertensión
Recientemente se han revisado las directrices prácticas para la prevención y el tratamiento de la hipertensión. Se han publicado informes exhaustivos en Reboussinet al.(Systematic Review for the 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 7 de noviembre de 2017. pii: S0735-1097(17)41517-8. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.004.) y Wheltonet al.(2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 7 de noviembre de 2017. pii: S0735-1097(17)41519-1. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.006.). A continuación, se proporcionan algunos aspectos destacados de las nuevas directrices. Sin embargo, se debe entender que las directrices proporcionan el conocimiento de los expertos en la técnica sobre los criterios de diagnóstico y seguimiento y el tratamiento de la hipertensión en el momento de la presentación de esta solicitud.
A. Criterios de diagnóstico
Aunque existe una asociación continua entre una presión arterial más alta y un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular, es útil clasificar los niveles de presión arterial para la toma de decisiones clínicas y de salud pública. La presión arterial se puede clasificar en 4 niveles según la presión arterial promedio medida en un entorno de atención sanitaria (presiones de consulta): normal, elevada e hipertensión de grado 1 o 2, como se muestra en la siguiente tabla (de Wheltonet al.,2017).
La presión arterial indica la presión arterial basada en un promedio de >2 lecturas cuidadosas obtenidas en >2 ocasiones. Se detallan las mejores prácticas para obtener lecturas cuidadosas de la presión arterial en Wheltonet al.,2017 y son conocidas en la técnica.
Esta clasificación difiere de la recomendada previamente en el informe JNC 7 (Chobanianet al.;the National High Blood Pressure Education Program Coordinating Committee. Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Hypertension. 2003;42:1206-52) con la hipertensión de grado 1 definida ahora como una presión arterial sistólica (PAS) de 130-139 o una presión arterial diastólica (PAD) de 80-89 mm Hg, y con la hipertensión de grado 2 en el presente documento correspondientes a los grados 1 y 2 del informe JNC 7. El fundamento de esta clasificación se basa en datos observacionales relacionados con la asociación entre PAS/PAD y el riesgo de enfermedad cardiovascular, ensayos clínicos aleatorios de modificación del estilo de vida para reducir la presión arterial y ensayos clínicos aleatorios de tratamiento con medicamentos antihipertensores para prevenir enfermedades cardiovasculares.
El mayor riesgo de enfermedad cardiovascular entre los adultos con hipertensión de grado 2 está bien establecido. Un número cada vez mayor de estudios individuales y metanálisis de datos observacionales han informado de un gradiente de riesgo de enfermedad cardiovascular progresivamente mayor que va de una presión arterial normal a una presión arterial elevada y a hipertensión de grado 1. En muchos de estos metanálisis, los cocientes de riesgos para cardiopatía coronaria e ictus estuvieron entre 1,1 y 1,5 para la comparación de PAS/PAD de 120-129/80-84 mm Hg frente a <120/80 mm Hg y entre 1,5 y 2,0 para la comparación de PAS/PAD de 130-139/85-89 mm Hg frente a <120/80 mm Hg. Este gradiente de riesgo fue uniforme en todos los subgrupos definidos por sexo y raza/etnia. Se atenuó el aumento relativo del riesgo de enfermedad cardiovascular asociado con una presión arterial mayor, pero aún estaba presente entre los adultos mayores. Se recomienda una modificación del estilo de vida y tratamiento antihipertensor farmacológico para personas con presión arterial elevada e hipertensión de grados 1 y 2. Se puede obtener un beneficio clínico al reducir la etapa de presión arterial elevada, incluso si la presión arterial no se normaliza con un tratamiento.
B. Factores de riesgo
La hipertensión es una enfermedad compleja que resulta de una combinación de factores incluidos, pero sin limitación, genética, estilo de vida, dieta y factores de riesgo secundarios. La hipertensión también puede estar asociada con el embarazo. Se entiende que debido a la naturaleza compleja de la hipertensión, pueden ser necesarias múltiples intervenciones para el tratamiento de la hipertensión. Por otra parte, las intervenciones no farmacológicas, incluidas la modificación de la dieta y el estilo de vida, pueden ser útiles para la prevención y el tratamiento de la hipertensión. Además, una intervención puede proporcionar un beneficio clínico sin normalizar completamente la presión arterial en un individuo.
1. Factores de riesgo genéticos
Se han identificado varias formas monogénicas de hipertensión, tales como el aldosteronismo remediable con glucocorticoides, el síndrome de Liddle, el síndrome de Gordon y otros en los que mutaciones de un solo gen explican completamente la fisiopatología de la hipertensión, estos trastornos son poco habituales. La tabulación actual de variantes genéticas conocidas que contribuyen a la presión arterial y la hipertensión incluye más de 25 mutaciones raras y 120 polimorfismos de un solo nucleótido. Sin embargo, aunque los factores genéticos pueden contribuir a la hipertensión en algunos individuos, se estima que la variación genética representa solo alrededor del 3,5 % de la variabilidad de la presión arterial.
2. Dieta y consumo de alcohol
Los factores de riesgo ambientales y de estilo de vida comunes que conducen a la hipertensión incluyen una mala alimentación, actividad física insuficiente y consumo excesivo de alcohol. Estos factores pueden llevar a que una persona tenga sobrepeso u obesidad, lo que aumenta aún más la probabilidad de desarrollar o exacerbar la hipertensión. La presión arterial elevada se correlaciona aún más fuertemente con un mayor índice cintura-cadera u otras medidas de distribución central de la grasa. La obesidad a una edad temprana y la obesidad continua están fuertemente correlacionadas con la hipertensión en etapas posteriores de la vida. Alcanzar un peso normal puede reducir el riesgo de desarrollar presión arterial alta al de una persona que nunca ha sido obesa.
El consumo de sodio, potasio, magnesio y calcio también pueden tener un efecto significativo sobre la presión arterial. El consumo de sodio se correlaciona de forma directa con la presión arterial y representa gran parte del aumento de la presión arterial relacionado con la edad. Ciertos grupos son más sensibles al aumento del consumo de sodio que otros, incluidos los adultos negros y ancianos (> 65 años) y los que tienen un nivel más alto de presión arterial o comorbilidades tales como nefropatía crónica, diabetes mellitus o síndrome metabólico. En conjunto, estos grupos constituyen más de la mitad de todos los adultos estadounidenses. La sensibilidad a la sal puede ser un marcador de mayor enfermedad cardiovascular y mortalidad por todas las causas, con independencia de la presión arterial. En la actualidad, las técnicas para reconocer la sensibilidad a la sal no son prácticas en un entorno clínico. Por lo tanto, la sensibilidad a la sal se considera mejor como una característica de grupo.
El consumo de potasio está inversamente relacionado con la presión arterial y el ictus, y un nivel más alto de potasio parece mitigar el efecto del sodio sobre la presión arterial. Una relación más baja de sodio y potasio se asocia con una presión arterial más baja que la observada para los niveles correspondientes de sodio o potasio por sí solos. Se ha hecho una observación similar con respecto al riesgo de enfermedad cardiovascular.
El consumo de alcohol se ha asociado durante mucho tiempo con la presión arterial alta. En los Estados Unidos, se ha estimado que el consumo de alcohol representa aproximadamente el 10 % de la carga poblacional de hipertensión, siendo la carga mayor en hombres que en mujeres.
Se entiende que los cambios en la dieta o el consumo de alcohol pueden ser un aspecto de la prevención o el tratamiento de la hipertensión.
3. Actividad física
Existe una correlación inversa bien establecida entre la actividad física/forma física y los niveles de presión arterial. Se ha demostrado que incluso niveles modestos de actividad física son beneficiosos para disminuir la hipertensión.
Se entiende que un aumento de la actividad física puede ser un aspecto de la prevención o el tratamiento de la hipertensión.
4. Factores de riesgo secundarios
La hipertensión secundaria puede ser la causa de una elevación grave de la presión arterial, hipertensión farmacológicamente resistente, aparición repentina de hipertensión, aumento de la presión arterial en pacientes con hipertensión previamente controlada con terapia farmacológica, aparición de hipertensión diastólica en adultos mayores y daño a órganos diana desproporcionado con respecto a la duración o gravedad de la hipertensión. Aunque se debe sospechar hipertensión secundaria en pacientes más jóvenes (<30 años) con presión arterial elevada, no es raro que la hipertensión primaria se manifieste a una edad más temprana, especialmente en personas de raza negra, y algunas formas de hipertensión secundaria, tales como la enfermedad renovascular, son más comunes en edades más avanzadas (>65 años). Muchas de las causas de la hipertensión secundaria están fuertemente asociadas con hallazgos clínicos o grupos de hallazgos que sugieren un trastorno específico. En estos casos, el tratamiento de la afección subyacente puede resolver las manifestaciones de presión arterial elevada sin administrar agentes normalmente utilizados para el tratamiento de la hipertensión.
5. Embarazo
El embarazo es un factor de riesgo para presión arterial alta y la presión arterial alta durante el embarazo es un factor de riesgo para enfermedad cardiovascular e hipertensión en el futuro. En 2013, el Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología (ACOG) publicó un informe sobre la hipertensión asociada al embarazo (American College of Obstetricians and Gynecologists, Task Force on Hypertension in Pregnancy. Hypertension in pregnancy. Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists' Task Force on Hypertension in Pregnancy. Obstet Gynecol.
2013;122:1122-31). A continuación se presentan algunos aspectos destacados del Informe. Sin embargo, se debe entender que el informe proporciona el conocimiento de los expertos en la técnica sobre los criterios de diagnóstico y seguimiento y el tratamiento de la hipertensión en el embarazo en el momento de la presentación de esta solicitud.
Los criterios de diagnóstico para la preeclampsia se proporcionan en la siguiente tabla (de la tabla 1 del informe del ACOG, 2013).
El control de la presión arterial durante el embarazo se complica por el hecho de que muchos agentes antihipertensores utilizados habitualmente, incluidos inhibidores de la ECA y los BRA, están contraindicados durante el embarazo debido al posible daño al feto. El objetivo del tratamiento antihipertensor durante el embarazo incluye la prevención de la hipertensión grave y la posibilidad de prolongar la gestación para permitir que el feto madure más antes del parto. Una revisión del tratamiento de la hipertensión grave asociada al embarazo no encontró pruebas suficientes para recomendar agentes específicos; en su lugar, se recomendó experiencia clínica en este entorno (Duley L, Meher S, Jones L. Drugs for treatment of very high blood pressure during pregnancy. Cochrane Database Syst Rev.
2013;7:CD001449.).
C. Tratamientos
El tratamiento de la hipertensión arterial es complejo ya que frecuentemente se presenta con otras comorbilidades, incluyendo con frecuencia la función renal reducida, para la que el sujeto también puede estar recibiendo tratamiento. Los facultativos que tratan a adultos con presión arterial alta deben centrarse en la salud general del paciente, con especial énfasis en reducir el riesgo de futuros resultados adversos de enfermedades cardiovasculares. Todos los factores de riesgo del paciente deben gestionarse de manera integrada con un conjunto amplio de estrategias farmacológicas y no farmacológicas. A medida que aumentan la presión arterial del paciente y el riesgo de futuros acontecimientos cardiovasculares, se debe intensificar el control de la presión arterial.
Mientras que el tratamiento de la presión arterial alta con medicamentos reductores de la presión arterial basándose únicamente en el nivel de presión arterial se considera rentable, el uso de una combinación de riesgo absoluto de enfermedad cardiovascular y nivel de presión arterial para guiar dicho tratamiento es más eficiente y rentable para reducir el riesgo de enfermedad cardiovascular que el uso solo del nivel de presión arterial. Muchos pacientes que comenzaron con un solo agente necesitarán posteriormente >2 medicamentos de diferentes clases farmacológicas para alcanzar sus objetivos de presión arterial. Es importante el conocimiento de los mecanismos de acción farmacológicos de cada agente. La farmacoterapia con actividad complementaria, donde se utiliza un segundo agente antihipertensor para bloquear las respuestas compensatorias al agente inicial o afectar a un mecanismo hipertensor diferente, puede dar lugar a una reducción aditiva de la presión arterial. Por ejemplo, los diuréticos tiazídicos pueden estimular el sistema renina-angiotensina-aldosterona. Al añadir un inhibidor de la ECA o un BRA a la tiazida, se puede obtener un efecto reductor aditivo de la presión arterial. El uso de terapia combinada también puede mejorar el cumplimiento. Se encuentran disponibles varias combinaciones de fármacos antihipertensores de 2 y 3 dosis fijas, con mecanismos de acción complementarios entre los componentes.
A continuación se proporciona la tabla 18 de Wheltonet al.2017 que enumera de fármacos antihipertensores orales. Se proporcionan clases de agentes terapéuticos para el tratamiento de la presión arterial alta y fármacos que se encuentran dentro de esas clases. También se proporcionan intervalos de dosis, frecuencias y comentarios.
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Ejemplos
Ejemplo 1. Síntesis de ARNi
Fuente de reactivos
Cuando la fuente de un reactivo no se proporcione específicamente en el presente documento, dicho reactivo se puede obtener de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular con un estándar de calidad/pureza para su aplicación en biología molecular.
Diseño de ARNip
Un conjunto de ARNip dirigidos al gen de AGT humano (humano: NCBI refseqID NM_000029.3; NCBI GeneID: 183) se diseñó mediantescriptspersonalizados de R y Python. El ARNm humano Nm_000029 REFSEQ, versión 3, tiene una longitud de 2587 bases.
En la tabla 3 se muestra una lista detallada de las secuencias de nucleótidos de las hebras de sentido y antisentido de AGT sin modificar. En la tabla 5 se muestra una lista detallada de las secuencias de nucleótidos de las hebras de sentido y antisentido de AGT modificadas.
Síntesis de ARNip
Los ARNip se sintetizaron y se hibridaron utilizando métodos rutinarios conocidos en la técnica.
Ejemplo 2. Métodos de detección in vitro
Cultivo celular y transfecciones de 384 pocilios
Se cultivaron células Hep3b (ATCC, Manassas, VA) hasta casi la confluencia a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 % en Medio Esencial Mínimo de Eagle (Gibco) complementado con FBS al 10 % (ATCC) antes de ser liberado de la placa mediante tripsinización.
La transfección se realizó añadiendo 4,9 pl de Opti-MEM más 0,1 pl de Lipofectamine RNAiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA. cat n.° 13778-150) a 5 pl de cada doble cadena de ARNip en un pocillo individual en una placa de 384 pocillos. A continuación, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, se añadieron a la mezcla de ARNip 50 pl de medio de cultivo completo que contenía 5000 células Hep3b. Las células se incubaron durante 24 horas antes de la purificación del ARN. Se realizaron experimentos de dosis única a una concentración de doble cadena final de 10 nM y 0,1 nM, y se realizaron experimentos de respuesta a la dosis utilizando una dilución en serie de ocho puntos y seis veces en el intervalo de 10 nM a 37,5 fM.
En la publicación PCT n.° WO 2015/179724 se describen agentes de ARNbc adicionales dirigidos a un ARNm de AGT.Aislamiento de ARN total mediante el kit de aislamiento de ARNm DYNABEADS (Invitrogen™,parte n.°: 610-12)Las células se lisaron en 75 pl de tampón de lisis/unión que contenía 3 pl de perlas por pocillo y se mezclaron durante 10 minutos en un agitador electrostático. Las etapas de lavado se automatizaron en un Biotek EL406, mediante un soporte de placa magnética. Las perlas se lavaron (en 90 pl) una vez en tampón A, una vez en tampón B y dos veces en tampón E, con etapas de aspiración intermedias. Tras una última aspiración, se añadieron 10 pl de mezcla RT completa a cada pocillo, como se describe a continuación.
Síntesis de ADNc mediante el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad ABI (Applied Biosystems, Foster City. CA, Cat n.° 4368813):
Se añadió a cada pocillo, por reacción, una mezcla maestra de 1 pl de tampón 10X, 0,4 pl de dNTP 25X, 1 pl de cebadores aleatorios, 0,5 pl de transcriptasa inversa, 0,5 pl de inhibidor de RNasa y 6,6 pl de H<2>O. Las placas se sellaron, se agitaron durante 10 minutos en un agitador electrostático y después se incubaron a 37 °C durante 2 horas. Después de esto, las placas se agitaron a 80 °C durante 8 minutos.
PCR en tiempo real:
Se añadieron 2 pl de ADNc a una mezcla maestra que contenía 0,5 pl de sonda GAPDH TaqMan humana (4326317E), 0,5 pl de AGT humano (Hs00174854m1), 2 pl de agua sin nucleasas y 5 pl de mezcla maestra de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat n.° 04887301001) por pocillo en placas de 384 pocillos (Roche cat n.° 04887301001). La Pc R en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en tiempo real LightCycler480 (Roche).
Para calcular el factor de cambio relativo, los datos se analizaron utilizando el método AACt y se normalizaron con respecto a ensayos realizados con células transfectadas con AD-1955 10 nM o células con transfecciones simuladas. Los CI<5 0>se calcularon utilizando un modelo de ajuste de 4 parámetros mediante XLFit y se normalizaron con respecto a células transfectadas con AD-1955 o se transfectaron de forma simulada. Las hebras de sentido y antisentido de AD-1955 son: sentido: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 19) y antisentido UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 20). Los resultados de la selección se muestran en la tabla 4.
Tabla 2. Abreviaturas de monómeros nucleotídicos utilizados en la representación de secuencias de ácidos nucleicos. Se entenderá que estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están unidos entre sí por enlaces 5'-3'-fosfodiéster.
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AGT de 10 nM 01 nM en células He 3B
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Ejemplo 3. Detección in vivo de dobles cadenas de ARNbc en ratones transducidos con AAV que expresa AGT humano
Para expresar el angiotensinógeno humano, primero se transdujeron ratones C57/BL6 con un vector AAV (virus adenoasociado) que expresaba el transcrito de AGT humano. Después de al menos dos semanas tras la introducción del AAV, se obtuvo sangre de los ratones para determinar los niveles basales de AGT humano en circulación y, a continuación, los animales recibieron una única dosis subcutánea de 3 mg/kg de uno de un subconjunto de agentes de ARNbc proporcionados en las tablas 5 y 6 (N=3 por grupo). Se obtuvo sangre de los animales de nuevo catorce días después de la dosis del agente de ARNbc. Los niveles de AGT humano se cuantificaron utilizando un ELISA específico para angiotensinógeno humano, según el protocolo del fabricante (IBL America n.° 27412). Los datos se expresaron como porcentaje del valor basal y se presentaron como la media más desviación típica. Se seleccionaron determinadas dobles cadenas de ARNbc para su análisis posterior.
Tabla 7. Ex loración de dosis individual de AGT de 3 m /k en ratón transducido con AAV con AGT humano
continuaciónT
Ejemplo 4. Detección in vivo de doble cadena de ARNbc en macacos cangrejeros
Las dobles cadenas de interés, identificadas a partir de los estudios con ratones anteriores, se evaluaron en macaco cangrejero. Los animales (N=3 por grupo) recibieron una única dosis subcutánea de 3 mg/kg de un agente de ARNbc (AD-85481, AD-126306, AD-126307, AD-126308 o AD-133362) el día 1. La sangre se obtuvo los días -6, 1, 4, 8, 15, 22, 29, 32, 35, 43, 57, 71, 85 y 99 después de la dosis. Los niveles de AGT en circulación se cuantificaron utilizando un ELISA específico para angiotensinógeno humano (y con reactividad cruzada con macaco cangrejero), según el protocolo del fabricante (IBL America n.° 27412). Los datos se expresaron como porcentaje del valor basal y se presentaron como la media más/menos desviación típica. Los resultados se muestran en la figura 1A. Las diferencias aparentes entre AD-85481, AD-126306 y AD-133362 se encuentran dentro del intervalo de variabilidad típica entre estudios en primates no humanos.
Se realizaron estudios de dosis y efecto para evaluar la actividad de AD-67327 y AD-85481. Aunque los experimentos se realizaron por separado, los métodos utilizados fueron esencialmente los mismos y los resultados se presentan juntos en la figura 1B. Los macacos cangrejeros recibieron una única dosis subcutánea de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 3 mg/kg de agente de ARNbc el día 1. Se obtuvo sangre los días -6, 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 y 78 después de la dosis de AD-67327 y los días -6, 1, 4, 8, 15, 22, 29, 32, 35, 43, 57, 71, 85 y 99 después de la dosis de AD-85481. Los niveles de AGT en circulación se cuantificaron utilizando un ELISA específico para angiotensinógeno humano (y con reactividad cruzada con macaco cangrejero), según el protocolo del fabricante (IBL America n.° 27412). Los datos se expresaron como porcentaje del valor basal y se presentaron como la media más desviación típica. Los resultados se muestran en la figura 1B. Estos datos demuestran una mejora de aproximadamente 3 veces en la eficacia y duración de AD-85481 frente a AD-67327.
Se realizaron estudios de dosis múltiples para determinar la potencia y durabilidad de AD-67327 y AD-85481. Aunque los experimentos se realizaron por separado, los métodos utilizados fueron esencialmente los mismos y los resultados se presentan juntos en la figura 1C. A los macacos cangrejeros se les administró por vía subcutánea una dosis de 1 mg/kg de<a>D-67327 o AD-85481 una vez cada cuatro semanas durante tres semanas (dosis cada 4 semanas) (días 1,29 y 57 después de la primera dosis). Se obtuvo sangre para evaluar el AGT en circulación los días -6, 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 y 78 después de la primera dosis de AD-67327 y los días -8, 1, 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 57, 64, 71, 85, 99 después de la primera dosis de AD-85481. Estos datos demuestran un aumento de la potencia y durabilidad del silenciamiento de la diana mediante AD-85481 en comparación con AD-67327.
Ejemplo 5. Tratamiento de la hipertensión con un ARNbc de AGT en un modelo de rata con hipertensión espontánea
Se diseñó un ARNbc específico de rata para probar el efecto de la atenuación de AGT en un modelo de rata con hipertensión espontánea. A ratas hipertensión espontánea (N=9 por grupo) se les administró por vía subcutánea una dosis de 10 mg/kg del ARNbc de<a>G<t>específico para ratas una vez cada 2 semanas (10 mg/kg cada dos semanas) o dosis orales diarias del BRA valsartán (31 mg/kg/día) o dosis orales diarias del inhibidor de la ECA captopril (100 mg/kg/día). También se evaluaron combinaciones seleccionadas (el agente de ARNbc específico de rata más valsartán o captopril más valsartán), dosificadas como se ha indicado anteriormente. La presión arterial media se midió mediante telemetría durante un periodo de 4 semanas. Después de cuatro semanas de tratamiento, los animales se anestesiaron mediante inyección i.p. de pentobarbital y se extrajo sangre de la vena porta hepática para medir el AGT plasmático, renina plasmática, angiotensina II plasmática, aldosterona plasmática, K+ plasmático y actividad de renina plasmática. También se obtuvieron el peso del corazón y la longitud de la tibia (para la normalización del peso del corazón).
El tratamiento con el agente de ARNbc específico para ratas redujo los niveles de AGT en plasma en más del 98 % cuando se administró solo o en combinación con valsartán en relación con los niveles previos al tratamiento (figura 2A). También se demostró que el tratamiento con la combinación de valsartán y captopril disminuye significativamente los niveles de AGT en suero. Todos los tratamientos aumentaron el nivel de renina, y el mayor aumento se produjo en animales tratados con una combinación de valsartán y el agente de ARNbc, seguido de un aumento sustancial en el grupo tratado con el agente de ARNbc solo. Se encontró que solo el tratamiento combinado con valsartán y el agente ARNbc redujo los niveles de angiotensina II en circulación. Se observó una tendencia hacia una reducción del AGT en orina después del tratamiento con el agente de ARNbc, lo que sugiere que los niveles de proteína AGT en el riñón no se inhiben significativamente con el tratamiento con el agente de ARNbc (figura 3). Se encontró que solo la combinación de valsartán y el agente de ARNbc redujo significativamente el AGT urinario. Ningún tratamiento alteró los niveles de aldosterona. El K+ en plasma tendió a aumentar en todos los grupos, alcanzando significación solo en el grupo de tratamiento combinado de valsartán más ARNip.
La figura 2B muestra los niveles medios de presión arterial medidos por telemetría durante todo el experimento y representados gráficamente en relación con los niveles iniciales de presión arterial. Todos los tratamientos provocaron una disminución estadísticamente significativa de la presión arterial en comparación con los animales sin tratar. Las comparaciones estadísticas (p<0,05) se anotan en relación con el valor inicial (#) o valsartán más captopril ($). El tratamiento con valsartán más el agente de ARNbc específico de rata fue significativamente mejor que el tratamiento con captopril más valsartán para reducir la presión arterial media.
La figura 2C muestra los pesos de los corazones normalizados con respecto a las longitudes de las tibias para proporcionar una medida de la hipertrofia cardíaca. El tratamiento con valsartán más captopril y valsartán más el agente de ARNbc fue eficaz para reducir la hipertrofia cardíaca en relación con el control (p<0,05), y el valsartán más el agente de ARNbc también redujo la hipertrofia cardíaca en relación con valsartán más captopril (p<0,05). La figura 2E muestra los mismos datos que un diagrama de dispersión del peso del corazón con respecto a la longitud de la tibia frente a PAM. Se observa una relación lineal entre la hipertrofia cardíaca y la PAM, proporcionando valsartán más el agente de ARNbc la mayor reducción de la hipertrofia cardíaca. El tamaño de los cardiomiocitos se redujo en relación con el vehículo en todos los grupos excepto en valsartán (figura 2F), mientras que el proNT-PNB se redujo en el grupo de captopril más valsartán y se observó una tendencia a la reducción en el grupo de valsartán más ARNbc (figura 2G).
La figura 2D muestra la actividad relativa de renina en el nivel a las 4 semanas en relación con el valor inicial. La actividad de renina plasmática (ARP), que refleja una reducción de la señalización de angiotensina, indica un claro aumento de ARP con el tratamiento con el agente de ARNbc (p<0,05 en relación tanto con el grupo inicial como con el de control, tanto para el agente de ARNbc solo como para valsartán más ARNip). El ensayo de<a>R<p>mide la actividad de la renina cuantificando la cantidad de angiotensina I producida por la renina en una muestra de sangre, en presencia de exceso de angiotensinógeno. Estos datos demuestran una reducción de la señalización de angiotensina II después del tratamiento con el agente de AGT-ARNbc y que el efecto aumenta con el tratamiento conjunto con valsartán. Debido a la regulación positiva, la angiotensina II en circulación permanece intacta incluso cuando los niveles de AGT están casi completamente atenuados. Estos datos demuestran que el agente de AGT-ARNbc causa un efecto antihipertensor similar al de valsartán y captopril. Sin quedar ligados a teoría alguna, se propone que solo cuando se combina el agente de ARNbc más valsartán los niveles de angiotensina II colapsan, lo que da lugar a una disminución sinérgica de la presión arterial.
Se investigó el efecto de diversos tratamientos sobre los niveles sanguíneos y renales de AngI y AngII después de cuatro semanas de tratamiento. Las figuras 4A-4C muestran que el tratamiento con valsartán y captopril, ya sea solos o en combinación, aumentaron significativamente los niveles sanguíneos de AngI en comparación con el control de vehículo (figura 4A). El agente de ARNbc por sí solo no alteró significativamente los niveles sanguíneos de AngI, pero la combinación de valsartán con el agente de ARNbc disminuyó significativamente la AngI en sangre en comparación con el control del vehículo y el tratamiento con el agente de ARNbc solo. Se encontró que valsartán solo aumenta significativamente la AngII en sangre en comparación con el control con vehículo (figura 4B). Se descubrió que la combinación de valsartán con el agente de ARNbc disminuye significativamente la AngII en sangre en comparación con el control de vehículo. Estos cambios dieron lugar a una disminución significativa del cociente de AngII/AngI en los animales tratados con captopril y captopril valsartán. Los datos de captopril y valsartán son coherentes con sus mecanismos de acción, mientras que los datos del ARNbc solo indican poco efecto sobre la AngII/I en la sangre.
Las figuras 5A-5C muestran que el agente de ARNbc redujo la AngI renal sin efecto aparente sobre la AngII renal, lo que dio lugar a un cociente de AngII/I renal regulado positivamente. La figura 5A muestra que tanto valsartán como captopril aumentaron significativamente la AngI renal, mientras que la combinación de los agentes no tuvo un efecto significativo sobre el nivel de AngI. La AngI renal disminuyó significativamente con el agente de ARNbc y la combinación del agente de ARNbc con valsartán. Por otra parte, el tratamiento combinado redujo significativamente el nivel de AngI renal en comparación con el tratamiento con el agente de ARNbc solo. La figura 5B no muestra cambios significativos en la AngII renal después del tratamiento con cualquiera de las monoterapias excepto captopril, es decir, valsartán o el agente de ARNbc solo. Sin embargo, se demostró que la combinación de captopril y valsartán y la combinación de valsartán y el agente de ARNbc reducen significativamente la Ang II renal. Los datos de captopril y valsartán son coherentes con sus mecanismos de acción, mientras que los datos del ARNbc solo indican poco efecto aparente sobre la AngII en los riñones. El cociente de AngII/AngI renal aumentó 4 veces después de la administración del agente de ARNbc de AGT solo (figura 5C). Por el contrario, se observó una disminución de más del 70 % en el cociente de Ang II/Ang I después del tratamiento con valsartán, captopril y la combinación de valsartán captopril. No se observaron cambios significativos en el cociente de AngII/AngI después del tratamiento con valsartán el agente de ARNbc de AGT. Se demostró que el aumento de la AngII renal no es el resultado de alteraciones en los niveles del receptor de angiotensina renal o de la expresión del ARNm de la ECA en la corteza o la médula renal. Las figuras 6A-6C no muestran cambios significativos en nivel de ARNm del receptor AT1a, receptor AT1b o ECA en el riñón en ninguna condición de tratamiento excepto una. El tratamiento con captopril provocó un aumento significativo del nivel del receptor AT1b en la médula renal. También se evaluó el efecto de los regímenes de tratamiento sobre la función renal. No se observaron cambios en la tasa de filtración glomerular (TFG), natriuresis y albuminuria. Esto indica que estos tratamientos no afectaron a la función renal.
Durante el experimento se controlaron el volumen urinario y el sodio urinario. El tratamiento con agente de valsartán ARNbc, valsartán captopril y solo captopril provocaron un aumento significativo en el volumen urinario dentro de los grupos entre el inicio y las 4 semanas (figura 7). La comparación del volumen urinario entre los grupos a las 4 semanas mostró un aumento significativo de la producción de orina en los animales tratados con captopril en comparación con todos los demás grupos. El tratamiento con valsartán ARNbc dio lugar a un aumento significativo de la producción de orina a las 4 semanas en comparación con el tratamiento con valsartán solo o vehículo. No se observaron cambios significativos en el sodio urinario entre los grupos o dentro de ellos durante el experimento.
Estos datos demuestran que el cociente reducido de Ang II/I renal durante la IECA y el BRA confirma que la ECA renal genera Ang II y que la Ang II tisular representa la Ang II internalizada por AT1R (van Eschet al.,Cardiovasc Res 2010 86(3):401-409). Además, la reducción de la Ang I renal después del tratamiento con ARNip de AGT dirigido al hígado demuestra que la generación de Ang renal depende del<a>G<t>hepático. Aunque el AGT urinario procede en parte del riñón, este AGT renal no contribuye a la generación de Ang renal, como se ha sugerido antes (Matsusakaet al.,JASN 2012 23: 1181-1189). El aumento del cociente de Ang II/I renal después del tratamiento con ARNbc de AGT, que permite que los niveles renales de Ang II permanezcan intactos, indica una mayor internalización de Ang II, aunque en ausencia de regulación positiva del receptor AT1b. De acuerdo con este concepto, la exposición aditiva a los BRA prácticamente eliminó la Ang II renal. El tratamiento con el agente de ARNbc de AGT específico del hígado reduce sinérgicamente la presión arterial cuando se combina con bloqueadores RAS existentes y reduce la producción de Ang renal, sin efectos negativos aparentes sobre la función renal.
Ejemplo 6. Tratamiento de la hipertensión con un ARNbc de AGT en un modelo de rata con alto contenido de sal
El modelo de rata con sal y acetato de desoxicorticosterona (DOCA) es un modelo bien establecido para la hipertensión en el contexto de altos niveles de sal y se considera un modelo de hipertensión neurogénica debido al efecto sobre los sistemas nerviosos central y periférico (Basting T & Lazartigues E, Cur Hypertension Rep 2017).
A la llegada, se permite que ratas Sprague-Dawley se aclimaten durante 7 días. Posteriormente, se implantan transmisores de telemetría por vía intraabdominal, en la aorta abdominal, en ratas bajo anestesia con isoflurano. Se permite que las ratas se recuperen de este procedimiento durante 10 días. Desde entonces, la presión arterial, la frecuencia cardíaca y otros indicadores de hipertensión se miden mediante telemetría durante un periodo de 7 semanas. Durante las primeras 4 semanas, a los animales se les implanta por vía subcutánea un gránulo de DOCA de 200 mg y reciben sal al 0,9 % en el agua para beber (a voluntad) de forma crónica para inducir la hipertensión. Después de este periodo durante el cual comienza la hipertensión, se inicia un periodo de tratamiento de 3 semanas. Las ratas se tratan con
1) vehículo;
2) valsartán, 31 mg/kg/día añadidos al agua para beber;
3) un agente de ARNbc de AGT, 10 mg/kg una vez cada dos semanas, por vía subcutánea;
4) espironolactona, 50 mg/kg/día, por vía subcutánea; una combinación de un agente de ARNbc de AGT, 10 mg/kg una vez cada dos semanas, por vía subcutánea, y valsartán, 31 mg/kg/día añadidos al agua para beber;
5) un agente de ARNbc de AGT, 10 mg/kg una vez cada dos semanas, por vía subcutánea, y espironolactona, 50 mg/kg/día, por vía subcutánea;
6) valsartán, 31 mg/kg/día añadidos al agua para beber, y espironolactona, 50 mg/kg/día, por vía subcutánea; o 7) un agente de ARNbc de AGT, 30 mg/kg una vez cada dos semanas, por vía subcutánea. Además, un grupo de ratas que no reciben DOCA ni sal en el agua para beber sirve como control para evaluar el efecto de los tratamientos para normalizar la presión arterial.
Ejemplo 7. Tratamiento de la obesidad con un agente de ARNbc de AGT en un modelo de obesidad inducida por dieta (OID) en ratones alimentados con alto contenido de grasas
Se adquirieron ratones obesos (obesidad inducida por dieta (OID)) de dieciséis semanas de edad alimentados con alto contenido de grasas (HFF) y animales de control de peso normal y se mantuvieron con su respectiva dieta rica en grasas (60 % de calorías en forma de grasa) o comida normal. Después de la aclimatación, los animales se dividieron en tres grupos: Peso normal PBS; Peso normal ARNbc de AGT; OID PBS; y OID ARNbc de AGT (n=5/grupo). Los animales recibieron 10 mg/kg de ARNbc específico de ratón o PBS cada dos semanas durante 12 semanas a partir de la semana 0. Los animales se pesaron y se obtuvo sangre cada dos semanas. Los niveles séricos de AGT se determinaron mediante ELISA. Se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en ayunas antes de la dosis, a las 6 semanas después de la primera dosis y a las doce semanas después de la primera dosis. Los pesos de los órganos se determinaron al final del estudio.
La administración del agente de ARNbc de AGT fue eficaz para silenciar el AGT tanto en animales con alimentación normal como con alto contenido de grasa, con una atenuación sostenida de aproximadamente el 93 % en todos los grupos de tratamiento con el agente de ARNbc de AGT a partir del primer momento, dos semanas después de la primera administración del agente de ARNbc.
El tratamiento con el agente de ARNbc de fue eficaz para disminuir significativamente el aumento de peso en comparación con los ratones OID tratados con PBS, según lo determinado mediante ANOVA bidireccional de mediciones repetidas en los ratones OID, comenzando dos semanas después de la primera dosis y manteniéndose durante todo el estudio (figura 8A). En un análisis que compara los pesos iniciales, el grupo de OID+ARNbc de AGT no aumentó de peso en relación con el peso inicial hasta el último momento. Antes del momento final, los ratones perdieron peso en relación con el peso inicial (semanas 2, 4, 6) o no hubo diferencias en el peso (semanas 8, 10). No se observó ninguna diferencia significativa en el peso entre los ratones alimentados con pienso con PBS y agente de ARNbc de AGT hasta las semanas 10 y 12 del estudio.
El peso de los órganos se determinó al final del estudio para evaluar el efecto del tratamiento con el agente de ARNbc de AGT sobre la ubicación del depósito de grasa. Los pesos de los hígados de los ratones OID tratados con el agente de ARNbc de AGT fueron significativamente más bajos que los de los ratones OID tratados con PBS (figura 8B). No se observó ninguna diferencia significativa en el peso de los hígados entre los ratones alimentados con comida normal tratados con el agente de ARNbc de AGT y tratados con PBS. El peso del tejido adiposo (epidídimo) fue estadísticamente mayor en el grupo de OID+ARNip de AGT que en el grupo de OID+PBS, mientras que sucedió lo contrario con los animales de peso normal. No hubo diferencias significativas en el peso de los músculos de la pantorrilla en los cuatro grupos.
Las pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron en la semana 0 (predosis), semana 6 y semana 12 usando un protocolo convencional. Se midió la glucosa en sangre antes de la dosis, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la administración de la dosis de glucosa intraperitoneal en embolada utilizando un glucómetro AlphaTRAK®2 (Abbott Animal Health). Los resultados se muestran en las figuras 9A-9C. En la semana 0, los ratones OID tenían una menor tolerancia a la glucosa en comparación con los controles alimentados con pienso. A las seis semanas, se observó una diferencia significativa en múltiples comparaciones posteriores a la prueba entre los ratones OID tratados con el agente de ARNbc de AGT y los ratones OID tratados con PBS. A las doce semanas, y excluyendo un animal OID+PBS cuyos valores estaban por encima del límite del glucómetro, continuó habiendo una diferencia significativa entre los ratones OID tratados con el agente de ARNbc de AGT y los ratones OID tratados con PBS. Además, los datos del grupo de OID+ARNip de AGT no fueron diferentes de los de ninguno de los grupos de control (ratones alimentados con pienso tratados con el agente de ARNbc de AGT o PBS) a las seis o doce semanas.
Ejemplo 8. Tratamiento de ENA con un agente de ARNbc de AGT en un modelo de ratón con alto contenido de grasa y fructosa
Se utilizó un modelo de ENA de ratón alimentado con alto contenido de grasa y fructosa (HF HFr) (Softicet al.J Clin Invest 127 (11):4059-4074, 2017) para demostrar la eficacia del ARNip de<a>G<t>para tratar la ENA y los signos de trastorno metabólico.
Se alimentaron ratones macho C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad obtenidos de Jackson Laboratories con una dieta rica en grasas que contenía un 60 % de calorías en forma de grasa más un 30 % de fructosa en agua (dieta Hf Hfr) durante 12 semanas antes del tratamiento con un agente de ARNbc de AGT o PBS (control) para inducir ENA o alimentados con una dieta convencional de comida y agua. El alimento y el agua se proporcionaron a voluntad. A partir de la semana 12, a ratones alimentados con HF HFr se les administró por vía subcutánea una dosis de 10 mg/kg de un agente de ARNbc dirigido a AGT cada dos semanas para un total de cuatro dosis. Dos semanas después de la dosis final (en la semana 20), se recogieron los hígados, se aisló el ARN y se determinó la atenuación de AGT en el hígado mediante RT-qPCR utilizando el método descrito anteriormente. Se observó una disminución del 93 % en el ARNm de AGT hepático en los ratones alimentados con Hf Hfr tratados con el agente de ARNbc de AGT en comparación con los ratones alimentados con HF HFr tratados con PBS.
Como se esperaba, el peso corporal (figura 10A), el aumento de peso acumulado (figura 10B) y el peso del hígado terminal fueron significativamente mayores en los ratones de control alimentados con HF HFr en comparación con los ratones alimentados con comida en todos los momentos. El tratamiento con el agente de ARNbc de AGT en los ratones HF HFr hizo que perdieran peso desde la semana 12 hasta la semana 20, lo que dio lugar a una disminución significativa en el peso corporal terminal en comparación con los ratones tratados con control (p = 0,0023). No se observaron diferencias significativas en el peso del hígado terminal.
Se evaluaron los lípidos y la glucosa séricos y hepáticos y la insulina sérica para determinar el efecto del agente de ARNbc en el modelo HF HFr. En la semana 20, los niveles séricos de triglicéridos y glucosa fueron sustancialmente los mismos en los tres grupos (comida normal, ARNbc HF HFr, control HF HFr). Los niveles séricos de colesterol e insulina fueron aproximadamente los mismos en ambos grupos de HF Hfr y significativamente más altos que en el grupo alimentado con pienso, como se esperaba. Se demostró que el tratamiento con el agente de ARNbc de AGT disminuye significativamente los ácidos grasos no esterificados (AGNE) en suero (p = 0,01). En el hígado, el colesterol estaba elevado en ambos grupos de HF HFr en comparación con el control de comida normal, pero, de nuevo, no se observó una disminución significativa después del tratamiento con el agente de ARNbc de AGT. Se observó una disminución significativa en los triglicéridos hepáticos (p = 0,017) y los ácidos grasos libres (p = 0,001) en el grupo tratado con el agente de ARNbc de AGT en comparación con el grupo tratado con control. En el grupo tratado con ARNbc de AGT, se vio una posible tendencia hacia la disminución del ácido tiobarbitúrico (TBA), un indicador de oxidación de lípidos.
La lesión hepática estuvo indicada por un aumento significativo de los niveles séricos de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y glutamato deshidrogenasa (GLDH) en los ratones Hf Hfr tratados con control en comparación con los ratones alimentados con pienso. El tratamiento con el agente de ARNbc de AGT dio lugar a una disminución significativa de ALT (p = 0,01) (figura 11A) con una tendencia hacia una disminución de AST (figura 11B) y GLDH (figura 11C) en comparación con los ratones HF HFr tratados con control.
La lesión hepática también se evaluó mediante histopatología y puntuaciones de NAS. Como se esperaba, la dieta HF HFr indujo una esteatosis significativa, degeneración vacuolar e inflamación lobular que da lugar a un aumento en la puntuación general de NAS en comparación con los ratones alimentados con pienso. El tratamiento con el agente de ARNbc de AGT dio lugar a una disminución significativa en la degeneración vacuolar (p = 0,04) con una tendencia hacia una disminución de la inflamación lobular que dio lugar a una disminución significativa de la puntuación general de NAS (p = 0,01) en los animales alimentados con HF Hfr tratados con agente de ARNbc de a Gt en comparación con los animales alimentados con HF HFr tratados con control.
Estos datos demuestran que el tratamiento con el agente de ARNbc de AGT es eficaz para mejorar algunos de los signos de ENA. De manera destacable, el tratamiento con el agente de ARNbc de AGT fue eficaz para reducir el peso y las enzimas de daño hepático, con una reducción significativa de ALT y una ligera reducción de AST y GLDH. También se observaron reducciones en las puntuaciones de inflamación lobular y degeneración vacuolar, lo que redujo la puntuación general de NAS.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), o una sal del mismo, para inhibir la expresión del angiotensinógeno (AGT), en donde el agente de ARNbc, o una sal del mismo, comprende una hebra de sentido y una hebra de antisentido que forman una región bicatenaria, en donde la hebra de sentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3' (SEQ ID NO: 482) y la hebra de antisentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3' (SEQ ID NO: 666), en donde a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, G, C y U, respectivamente; Af, Gf, Cf y Uf son 2'-fluoro A, G, C y U, respectivamente; s es un enlace de fosforotioato; y (Tgn) es un isómero S del ácido nucleico de timidina-glicol (g Na ), y que comprende además un ligando que es un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc).
  2. 2. El agente de ARNbc, o una sal del mismo, de la reivindicación 1, en donde el ligando es: (i) conjugado con el extremo 3' de la hebra de sentido del agente de ARNbc, o una sal del mismo; y/o (ii) un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc) que es
    en donde además, opcionalmente, el agente de ARNbc, o una sal del mismo, se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
    y en donde X es O o S; o (iv) uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado monovalente, bivalente o trivalente.
  3. 3. Una célula aislada que contiene el agente de ARNbc, o una sal del mismo, de la reivindicación 1 o 2.
  4. 4. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen que codifica AGT que comprende el agente de ARNbc, o una sal del mismo, de la reivindicación 1 o 2.
  5. 5. Una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNbc, o una sal del mismo, de la reivindicación 1 o 2, y una formulación lipídica.
  6. 6. Un métodoin vitropara inhibir la expresión de un gen de AGT en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con el agente de ARNbc, o una sal del mismo, de la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de la reivindicación 4 o 5, inhibiendo de este modo la expresión del gen de AGT en la célula.
  7. 7. El agente de ARNbc, o una sal del mismo, de la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de la reivindicación 4 o 5 para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al AGT.
  8. 8. El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, en donde al sujeto se le ha diagnosticado un trastorno asociado al AGT, opcionalmente en donde el trastorno asociado al AGT se selecciona del grupo que consiste en presión arterial elevada, hipertensión, hipertensión inconstante, hipertensión primaria, hipertensión secundaria, hipertensión sistólica o diastólica aislada, hipertensión asociada al embarazo, hipertensión diabética, hipertensión resistente, hipertensión refractaria, hipertensión paroxística, hipertensión renovascular, hipertensión de Goldblatt, hipertensión asociada con baja actividad de renina plasmática o concentración de renina plasmática, hipertensión ocular, glaucoma, hipertensión pulmonar, hipertensión portal, hipertensión venosa sistémica, hipertensión sistólica, hipertensión lábil; cardiopatía hipertensiva, nefropatía hipertensiva, ateroesclerosis, arteriesclerosis, vasculopatía, nefropatía diabética, retinopatía diabética, insuficiencia cardíaca crónica, miocardiopatía, miopatía cardíaca diabética, glomeruloesclerosis, coartación aórtica, aneurisma aórtico, fibrosis ventricular, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, angina de pecho, ictus, nefropatía, insuficiencia renal, esclerosis sistémica, restricción del crecimiento intrauterino (RCIU), restricción del crecimiento fetal, obesidad, esteatosis hepática/hígado graso, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), esteatosis hepática no alcohólica (EHNA); intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 2 (diabetes no insulinodependiente) y síndrome metabólico.
  9. 9. El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7 u 8, en donde el contacto de la célula con el agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica inhibe la expresión de AGT en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %.
  10. 10. El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el sujeto: (i) tiene una presión arterial sistólica de al menos 130 mm Hg o una presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg; (ii) tiene una presión arterial sistólica de al menos 140 mm Hg y una presión arterial diastólica de al menos 80 mm Hg; (iii) es humano; y/o (iv) es parte de un grupo susceptible a la sensibilidad a la sal, tiene sobrepeso, es obeso o está embarazada.
  11. 11. El agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde el agente de ARNbc se administra al sujeto en una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y/o en donde el agente de ARNbc, o una sal del mismo, o la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea; y/o en donde se administra al sujeto un agente terapéutico adicional para el tratamiento de la hipertensión, opcionalmente en donde el agente terapéutico adicional: (a) se selecciona del grupo que consiste en un diurético, un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA), un antagonista del receptor de la angiotensina II, un beta-bloqueante, un vasodilatador, un bloqueador de los canales de calcio, un antagonista de la aldosterona, un agonista de alfa2, un inhibidor de la renina, un alfabloqueante, un agente adrenérgico de acción periférica, un agonista parcial selectivo del receptor D1, un antagonista alfa-adrenérgico no selectivo, un producto sintético, un agente antimineralocorticoide esteroideo, un inhibidor de la neprilisina y del receptor de la angiotensina (INRA), Entresto®, sacubitrilo/valsartán; o un antagonista del receptor de endotelina (ERA), sitaxentán, ambrisentán, atrasentán, BQ-123, zibotentán, bosentán, macitentán y tezosentán; o una combinación de cualquiera de los anteriores; y un agente terapéutico para la hipertensión formulado como una combinación de agentes; o (b) comprende un antagonista del receptor de la angiotensina II, en donde además, opcionalmente, el antagonista del receptor de la angiotensina II se selecciona del grupo que consiste en losartán, valsartán, olmesartán, eprosartán y azilsartán.
  12. 12. Un kit que comprende el agente de ARNbc, o una sal del mismo, de la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de la reivindicación 4 o 5.
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