KR20190124756A - 경구 단백질 전달을 위한 수단 및 방법 - Google Patents

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로빈 판뤼헤네
브람 라우켄스
안나 데피커르
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브이아이비 브이지더블유
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Abstract

본 발명은 숙주 세포에서 재조합 단백질 생산 분야에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 경구 단백질 전달 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합 단백질을 분비하는 재조합 숙주의 배양 배지를 포함하는 경구 약학 제제를 제공한다. 최종 경구 약학 제제는 위장 및/또는 구강 질병의 치료에 유용하다. 추가적으로 경구 약학 제제는 예방 및 백신 목적에 유용하다.

Description

경구 단백질 전달을 위한 수단 및 방법
본 발명은 숙주 세포 예컨대 효모 세포에서 재조합 단백질 생산 분야에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 경구 단백질 전달 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합 폴리펩티드를 분비하는 재조합 숙주의 배양 배지를 포함하는 경구 약학 제제를 제공한다.
항체를 포함한, 억제제, 리간드, 효소, 또는 호르몬을 포함하는, 펩티드 또는 단백질은 다양한 세포 기능을 조절한다. 그러므로, 그들은 생리학적 또는 병리학적 과정을 조절하여 인간 질병을 치료하거나 또는 예방하기 위한 클리닉에서 유용하다. 소형 분자 약물과 대조적으로, 그들 표적에 대한 펩티드 또는 단백질의 높은 선택성은 숙주 세포에 대한 부작용 및 독성을 감소시킬 수 있다. 치료적 목적을 위한 단백질 또는 펩티드의 사용은 암, 대사 장애, 위장 질환, 구강 질환, 신경퇴행성 및 감염성 질환의 치료에서 계속적으로 증가될 것으로 기대된다. 현재, 단백질 약물은 포유동물, 식물, 효모 또는 박테리아 세포 배양 시스템을 사용하여 대량으로 제조된다. 이들 발현된 단백질은 추출해서 정제해야 하므로, 값비싸고 복잡한 과정 및 저온 저장 및 수송을 필요로 한다. 일반적으로 생물제제는 특히 만성 병태의 경우에, 효과적이지만 환자에게는 바람직하지 않은 정맥내 또는 피하 주사로 전달된다. 단백질 약물의 주사가능한 형태는 종종 투여를 위해 건강 관리사가 필요하여, 빈번한 병원 방문과 환자 순응도 감소를 초래한다. 다른 전달 경로 예컨대 경피, 비내, 흡입 및 경구 투여가 검토 중이지만, 경구 전달이 일반적으로 가장 바람직한 경로로 간주된다. 수십년간의 노력에도 불구하고, 펩티드, 단백질 및 항체 약물의 경구 전달은 이러한 단백질의 소수만이 시장에 나와있어서, 주요한 약학적 도전으로 남아있다. 이것은 생물제제가 지난 10년간 360억 달러에서 1,630억 달러로 가치가 세배로 증가되는 제약 시장의 급속 성장 부문이었기 때문에 특히 실망스럽다. 따라서, 환자에게는 편리하지만, 이러한 투여 경로를 대형-분자 약물에 대해서는 도전으로 만드는 많은 기술적 장벽이 존재한다. 확실히 가장 중요한 도전은 위 및 장에서 약물의 효소적 및 pH-의존적 분해이다. 또한, 이들 화합물의 고유한 불안정성 및 위장 (GI)관의 내막을 형성하는 상피 세포의 낮은 투과성이 있다. 몇몇 기술이 대형 분자의 경구 전달을 촉진시키기 위해 개발되었다. 폴리에틸렌 글리콜,　항체 Fc 도메인 또는 인간 혈청 알부민과 같은 부착 분자는 순환 동안 혈청에서 펩티드 안정성을 증가시킨다. 또한, 펩티드 약물은 혈청 프로테아제 및 펩티다제로부터 보호되도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 N-말단 아세틸화, C-말단 아미드화, 비천연 아미노산의 사용, 및 디술피드 결합을 통한 고리화를 포함한다. 또한, 효소 억제제의 개발, 흡수 또는 투과 증강제의 사용, 캡슐 내 폴리펩티드의 제제, 소화관 내막에 부착되는 점착성 중합체의 도포 및 제제 내 담체 분자의 도입에서 일부 개선이 일어났다. 이들 기술에도 불구하고 단백질 및 펩티드는 전형적으로 입으로 섭취시 2% 미만의 극도로 낮은 생체이용률을 갖는다. 최근에 우리는 식물 종자 생산된 항체가 위도에서 생존하고 장에서 생물학적으로 활성이 있다는 것을 확인하였다 (WO2014033313 및 [Virdi V. et al (2013) PNAS, 110, 29, 11809-11814] 참조). 식물 생산 시스템은 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있지만, 장황하고 값비싼 규제 절차로 인해서 그들이 식용 백신을 생산하기 위한 최선의 선택일 수는 없다. 더 많은 양의 재조합 단백질을 생성시킬 수 있는 저급 진핵생물 유기체가 보다 바람직하다. 경구적으로 전달할 수 있는 치료 단백질의 생산을 위해 저급 진핵생물 숙주 예컨대 효모를 사용하는 것이 유리하다. 저급 진핵생물 세포는 치료 단백질의 전달에 대해 기술되어 있지만 오직 치료적 단백질을 생산할 수 있는 완전한 재조합 세포로서의 전달이었다 (예를 들어, [Zhang et al. (2012) BMC Biotechnology 12:97] 및 WO2007039586 참조). 재조합 효모 자체 대신에 분비된 폴리펩티드를 포함하는 배양 배지만을 사용할 수 있는 것이 바람직하다. 보다 더 바람직하게 배양 배지로부터 치료적 폴리펩티드를 정제하지 않고 배양 배지 그 자체로 사용하는 것이 중요하다.
본 발명에서 우리는 놀랍게도, 배지가 치료적 폴리펩티드를 포함하고 그 배지를 투과 화합물의 농도를 감소시키기 위해 막분리 과정으로 처리한, 재조합 효모의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 경구 전달 제제로서 사용할 수 있다는 것을 보여준다. 치료적 폴리펩티드를 포함하는 분말 건조 배양 배지 (동결건조 또는 분무 건조를 통해 수득)는 놀랍게도 소화관 내에서 분해로부터 보호된다는 것을 보여준다. 뿐만 아니라, 또한 분말 건조 제제는 또한 소화관내에서 이의 생물학적 활성을 유지한다는 것을 보여준다.
제1 양상에서 본 발명은 경구 허용 매트릭스 및 재조합 숙주 유래 배양 배지의 혼합물을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 이 배양 배지에서 가용성 투과 화합물의 농도는 막분리 과정으로 감소되었고, 상기 숙주는 상기 배양 배지로 분비되는 외생성 폴리펩티드를 생산한다.
또 다른 특별한 양상에서 본 발명은 재조합 효모 유래 배양 배지를 포함하는 제제를 제공하고, 상기 효모는 상기 배양 배지로 분비되는 외생성 폴리펩티드를 생산한다.
제2 양상에서 본 발명은 제1 양상에 따른 제제를 제공하고, 여기서 상기 제제의 수분 함량 및 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 가용성 분자는 상기 제제의 제조 이전에 막 분리 과정으로 상기 배양 배지를 농축시킴으로써 감소된다.
제3 양상에서 본 발명은 제1 양상에 따른 제제를 제공하고 여기서 수분 함량 및 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 가용성 분자는 상기 제제를 제조하기 전에 상기 배양 배지를 건조시킴으로써 감소된다.
제4 양상에서 본 발명은 제1 양상에 따른 제제를 제공하고 여기서 상기 제제의 수분 함량 및 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 가용성 분자는 상기 제제를 건조함으로써 감소된다.
제5 양상에서 본 발명은 재조합 숙주의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 숙주는 상기 배양 배지로 분비되는 외생성 폴리펩티드를 생산한다.
제6 양상에서 본 발명은 제5 양상에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 상기 재조합 숙주는 효모이다.
제7 양상에서 본 발명은 제5 및 제6 양상에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 외생성 폴리펩티드는 Fc 도메인에 융합된다.
제8 양상에서, 본 발명은 제7 양상에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 상기 Fc 도메인은 IgA Fc 도메인이다.
제9 양상에서, 본 발명은 제5 내지 제8 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 상기 외생성 펩티드는 예방적 또는 치료적 펩티드이거나 또는 상기 외생성 펩티드는 백신이거나 또는 백신의 일부를 형성한다.
제10 양상에서, 본 발명은 재조합 숙주에 외생성인 폴리펩티드를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 제제는 재조합 숙주의 배양 배지로 상기 폴리펩티드의 분비 이후에 상기 배양 배지의 건조를 통해 수득된다.
제11 양상에서, 본 발명은 Fc 도메인과의 융합 폴리펩티드를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 제제는 상기 융합 폴리펩티드를 재조합 숙주의 배양 배지로 생산한 후에 상기 배양 배지를 건조하여 수득된다.
제12 양상에서, 본 발명은 제10 또는 제11 양상에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 상기 재조합 숙주는 원핵생물 숙주, 식물 세포 또는 진균 세포 특히 사상 진균이다.
제13 양상에서, 본 발명은 제10 또는 제11 양상에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 상기 재조합 숙주는 효모 세포이다.
제14 양상에서, 본 발명은 제5 내지 제13 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 상기 건조 단계는 분무 건조에 의해 수행된다.
제15 양상에서, 본 발명은 제5 내지 제13 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공하고 여기서 상기 건조 단계는 동결건조에 의해 수행된다.
제16 양상에서, 본 발명은 효모 세포를 더 포함하는 제5 양상 내지 제13 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제17 양상에서, 본 발명은 단백질 풍부 음식물을 더 포함하는 제5 내지 제13 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제18 양상에서, 본 발명은 약물로서 사용을 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제19 양상에서, 본 발명은 위장 질환을 치료하기 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제20 양상에서, 본 발명은 구강 질환을 치료하는데 사용을 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제21 양상에서, 본 발명은 예방적 생성물로서 사용을 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제22 양상에서, 본 발명은 백신으로서 사용을 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제23 양상에서, 본 발명은 기능성 식품으로서 사용을 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제23 양상에서, 본 발명은 의약 식품으로서 사용을 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제24 양상에서, 본 발명은 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 포함하는 식품을 제공한다.
제25 양상에서, 본 발명은 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공하고, 여기서 폴리펩티드는 IL22 IgAFc-융합체이다.
제27 양상에서, 본 발명은 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제 및 약학 부형제를 포함하는 경구 약학 제제를 제공한다.
제28 양상에서, 본 발명은 약물로서 사용을 위한 제5 내지 제17 양상 중 어느 하나에 따른 건조 제제를 제공한다.
제29 양상에서, 본 발명은 약물로서 사용을 위한 제27 양상에 따른 경구 약학 제제를 제공한다.
도 1: FaeG 고정된 ELISA 셋업을 통해 고도로 발현하는 피키아 (Pichia) 클론 (A) 및 대두 종자 (B)의 스크리닝 및 선별. 패널 'C' 및 'D'는 각각 피키아 VHH-IgAFc 함유 상청액 및 대두 VHH-IgAFc 발현 종자 추출물의 대표적인 면역블롯을 도시한다.
도 2: 피키아 및 종자 생산 항체의 기능적 등가성을 비교하기 위한 ELISA 기반 적정의 전형적인 예. 이러한 대표적인 도면에서, 점선으로 표시된 피키아 생산된 V2A 항체 (피키아-V2A)는 실선 표시된 상이한 농도의 아라비돕시스 (Arabidopsis) 생산 V2A (At-V2A)와 비교된다.
도 3: 피키아 및 대두 생산 VHH-IgA는 자돈에서 ETEC 감염을 예방한다. 실험의 개략도 (A); 접종 후 F4-ETEC의 발산량 (B); 항-F4-ETEC 혈청 IgM (C), IgG (D) 및 IgA (E) 역가를 도시하는 혈청전환.
도 4: 패널 A. 실시예 3의 실험 셋업, 패널 B. 6일까지 4개의 상이한 그룹에 대한 분변 그램 당 F4+ ETEC 박테리아의 발산량, C. 4개의 상이한 그룹에 속하는 개별 자돈에 대한 항-ETEC IgG의 혈청 역가, D. 4개의 상이한 그룹에 속하는 개별 자돈에 대한 항-ETEC IgA의 혈청 역가.
도 5: 코마가타엘라 파피 (Komagataella phaffi) (이전에 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)로 알려짐)에서 생산된 GAP 프로모터 구동된 V2IgAFc-융합체 발현의 환원 SDS-PAGE 분석. 패널 A) C-말단 his 태그된 V2IgAFc는 Ni-IMAC 정제되었고 1 ㎍의 재조합 단백질을 PNGase F로 처리 (우측 레인) 또는 미처리 (좌측 레인)하였다; 패널 B) 코마가타엘라 파피 생산 V2IgAFc의 미정제 상청액을 PNGase F로 처리 (우측 레인) 또는 미처리 (좌측 레인)하였다. PNGase F 처리 시, 분자량은 대략 38 kDa으로 강력하게 감소되었는데, 미글리코실화된 분자의 이론적 분자량에 해당된다. 단일 N-글리코실화 부위 상에 존재하는 과만노실 구조는 단백질의 분자량에 30 kDa을 초과하게 첨가된다.
도 6: V2IgAFc 분자는 메탄올-유도성 AOXI 프로모터 (메탄올에서 배양)보다는 항상성 GAP 프로모터 (글루코스에서 배양)로부터 코마가타엘라 파피에서 생산될 때 글리코실화 수준이 증가된다. GAP-프로모터 생산된 단백질의 평균 MW는 대략 70 kDa인데 반해서, 비글리코실화 V2IgAFc 단백질에 대한 예상 MW는 38.4 kDa이다.
본 발명은 특정한 실시형태에 대해서 일정 도면을 참조하여 설명될 것이지만 그에 의해서가 아니라 오직 청구항에 의해서만 제한된다. 청구항의 임의의 참조 표시는 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 물론, 반드시 모든 양상 또는 장점이 본 발명의 임의의 특정한 실시형태에 따라 달성될 필요는 없다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어 당업자는 본 발명이 본 명세서에서 교시하거나 또는 시사하는 바와 같은 다른 양상 또는 장점을 반드시 달성하지 않고 본 명세서에 교시된 바와 같은 하나의 장점 또는 장점들의 그룹을 달성하거나 또는 최적화하는 방식으로 구체화되거나 또는 수행될 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다.
그 특성 및 장점과 함께, 구성 및 작업 방법에 관한 본 발명은 첨부된 도면과 함께 검토시 하기의 상세한 설명을 참조하여 최고로 이해될 것이다. 본 발명의 양상 및 장점은 이하 본 명세서에 기술된 실시형태(들)를 참조하여 분명해지고 명확해질 것이다. "하나의 실시형태" 또는 "일 실시형태"에 대한 본 명세서 전반에서의 언급은 실시형태와 함께 기술된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반의 다양한 부분에서 "하나의 실시형태에서" 또는 "일 실시형태에서"의 어구의 출현은 그럴 수 있더라도, 반드시 모두 동일한 실시형태를 언급하는 것은 아니다. 유사하게, 본 발명의 예시적인 실시형태의 설명에서, 본 발명의 다양한 특성은 때때로 본 개시 내용을 간소화하고 하나 이상의 본 발명의 다양한 양상의 이해를 돕기 위한 목적으로 단일 실시형태, 도면, 또는 이의 설명과 함께 그룹화된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 개시 내용의 방법은 청구된 방법이 각 청구항에서 명백하게 언급하는 것 이상의 특성을 요구하는 의도를 반영하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 그보다는 하기의 청구항이 반영하는 대로, 본 발명의 양상은 단일한 앞서 개시된 실시형태의 모든 특성보다 적다.
단수 명사를 언급시 부정 관사 또는 정관사 예를 들어, "한" 또는 "하나", "그"가 사용되는 경우에, 이것은 다른 것을 특별히 명시하지 않으면 그 명사의 복수를 포함한다. 용어 "포함하는"이 본 명세서의 설명 및 청구항에서 사용되는 경우에, 다른 요소 또는 단계를 배제하는 것이 아니다. 뿐만 아니라, 설명 및 청구항에서 용어 제1, 제2, 제3 등은 유사한 요소 간에 구별을 위해 사용되고 반드시 순차적이거나 또는 연대기적인 순서를 설명하기 위한 것이 아니다. 그렇게 사용되는 용어는 적절한 상황 하에서 상호교환가능하고 본 명세서에 기술된 발명의 실시형태는 본 명세서에 기술되거나 또는 예시된 것 이외의 다른 순서로 작동될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 용어 또는 정의는 오로지 본 발명의 이해를 돕기위해 제공된다. 본 명세서에서 특별히 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어는 본 발명의 당업자에게 동일한 의미를 갖는다. 전문가는 특히 당분야의 정의 및 용어에 대해서 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)]; 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016)]을 따른다. 본 명세서에서 제공되는 정의는 당업자가 이해하는 것보다 적은 범주를 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.
양, 시간 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 "약"은 명시된 값으로부터 ± 20% 또는 ± 10%, 보다 바람직하게 ± 5%, 보다 더 바람직하게 ± 1%, 및 여전히 더 바람직하게 ± 0.1%의 변동을, 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하는데 적절하다면 포괄하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "뉴클레오티드 서열", "DNA 서열", "DNA 엘리먼트(들)", 또는 "핵산 분자(들)"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차 구조만을 언급한다. 따라서, 이 용어는 이중-가닥 및 단일-가닥 DNA, 및 RNA를 포함한다. 또한 기지 유형의 변형, 예를 들어, 유사체에 의한 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 "캡" 치환, 메틸화를 포함한다. "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치될 때 mRNA로 전사되고/되거나 폴리펩티드로 번역되는 뉴클레오티드 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단에 번역 출발 코돈 및 3'-말단에 번역 중지 코돈으로 결정된다. "코딩 서열"은 제한없이 mRNA, cDNA, 재조합 뉴클레오티드 서열 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있는 한편, 인트론이 역시 일정한 상황 하에서 존재할 수 있다. "오르쏘로그"는 종 분화를 통해서 기원된 상이한 유기체 유래 유전자이고, 또한 공통 조상 유전자로부터 유래된다.
용어 "조절 엘리먼트", "제어 서열" 및 "프로모터" 또는 "유전자의 프로모터 영역"은 모두 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 그들이 결찰되는 서열의 발현을 실시할 수 있는 기능성 DNA 서열 유닛인 조절 핵산 서열을 의미하기 위해 광범위한 문맥에서 적용될 수 있다. 용어 "프로모터"는 전형적으로 유전자의 전사 출발로부터 상류에 위치되는 핵산 제어 서열을 의미하거나, 또는 코딩 서열에 작동적으로 연결되고, 적절하게 유도되는 조건 하에 가능하게 위치될 때, 이의 서열의 인식 및 RNA 중합효소 및 다른 단백질의 결합을 통해서 상기 코딩 서열의 전사를 촉진하기에 충분하다. 상기 언급된 용어들은 고전적인 진핵생물 게놈 유전자로부터 유래하는 전사 조절 서열 (CCAAT 박스 서열이 존재하거나 또는 부재하는, 정확한 전사 개시에 필요한 TATA 박스 포함) 및 발생 및/또는 외부 자극에 대응하거나 또는 조직-특이적 방식으로 유전자 발현을 변경하는 추가의 조절 엘리먼트 (즉, 상류 활성화 서열, 인핸서 및 사일렌서)를 포괄한다. 또한 이 용어에는 고전적인 원핵생물 유전자의 전사 조절 서열이 포함되는데, 이러한 경우에는 -35 박스 서열 및/또는 -10 박스 전사 조절 서열이 포함될 수 있다. 용어 "조절 엘리먼트"는 또한 세포, 조직 또는 장기에서 핵산 분자의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나 또는 증강시키는 합성 융합 분자 또는 유도체를 포괄한다.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 합성 유사체를 언급하기 위해 본 명세서에서 더욱 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성 비천연 발생 아미노산, 에컨대 상응하는 천연 발생 아미노산의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 비롯하여, 천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 또한 이 용어는 폴리펩티드의 번역 후 변형, 예컨대 글리코실화, 인산화 및 아세틸화를 포함한다. "재조합 폴리펩티드"란 재조합 기술을 사용하여, 즉 재조합 또는 합성 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해서 만들어진 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특별한 유전자 또는 특별한 유전자들 또는 특별한 유전자 구성체의 전사를 의미한다. 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특히 유전자 또는 유전자들 또는 유전자 구성체의 구조적 RNA (rRNA, tRNA) 또는 mRNA로의 전사로서, 후자는 단백질로의 후속 번역이 있거나 또는 없는 것을 의미한다. 이 과정은 DNA의 전사 및 최종 mRNA 생성물의 프로세싱을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 숙주 세포", "조작된 세포", "발현 숙주 세포", "발현 숙주 시스템", "발현 시스템" 또는 단순히 "숙주 세포"는 재조합 벡터 및/또는 키메라 유전자 구성체가 도입된 세포를 의미하고자 한다. 이러한 용어들은 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 의미하고자 한다는 것을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 일정한 변형이 다음 세대에서 발생될 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는 배양으로 성장시킨 단리된 세포 또는 세포주일 수 있고, 세포는 원핵생물 세포, 진핵생물 세포 예컨대 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포 예컨대 사상 진균일 수 있으며, 바람직하게 세포는 재조합 효모 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "내생성"은 유기체, 조직 또는 세포 내에서 기원하는 물질 (예를 들어, 유전자)을 의미한다. 유사하게, 본 명세서에서 사용되는 "외생성"은 유기체, 조직 또는 세포의 외부에서 기원하지만, 그 유기체, 조직 또는 세포 내에 존재하는 (그리고 전형적으로 활성화될 수 있는) 임의의 물질이다.
위장 (GI)관은 폴리펩티드에게 적대적인 환경인데 영양분을 분해하고 병원체를 불활성화시키도록 진화적으로 최적화되었기 때문이다. 위의 높은 산성 pH는 단백질의 양성자첨가 및 그들의 언폴딩을 초래하여, 단백질-분해 효소가 인식하는 보다 많은 모티프들을 노출시킨다. 위장 내 효소 (펩신), 소장 내 효소 (예를 들어, 키모트립신, 아미노펩티다제 및 카복시펩티다제) 및 췌장 및 담즙에서 생산되는 효소는 단백질을 보다 작은 단편 및 단일 유닛으로 절단시킨다. 치료적 활성 폴리펩티드 (예를 들어, 백신 성분의 예방적, 치료적)는 또한 이들 과정에 의해 영향을 받기 때문에, 특히 음식물의 존재 하에서, 이들 분해 과정에서 살아남을 분율이 일반적으로 낮고 가변적이다. 또한, 폴리펩티드 약물이 전신 구획에 도달하기 위해서는 음식물과 박테리아 항원의 진입을 방지하도록 디자인된 다수의 장벽을 극복하는 것이 필요하다. 상피 세포층에 접근하기 위해, 폴리펩티드는 먼저 장 상피를 덮고 있는 점액층을 통해 확산되는 것이 필요하다. 이러한 상피는 상피 세포를 밀봉하는 치밀 이음부가 600 Da보다 작은 이온 및 소형 분자로 세포사이의 수송(즉, 세포 간 통로)을 제한하므로, 또 다른 중요한 장벽이다. 또한, 세포로 통하는 이 통로는 내강에서 발현되는 세포내이입 수용체 (예를 들어, 비타민 B12 수용체, 트랜스페린 수용체)에 의해 매개되므로, 약물 전달에서 이용하기 위해서 개별 리간드와의 접합을 필요로 한다. 전신 구획과의 또 다른 접근 지점은 내강 항원을 샘플채취하여 낮은 마이크로미터 범위로 특정한 기질을 흡수할 수 있는 페이어 팻치의 식균작용성 M-세포이다. 그러나, 소화관 상피 내 M-세포의 비율은 작고 종들 사이에서 상당히 가변적이어서, 동물 데이타를 기반으로 인간에서 흡수를 예측하는 것을 복잡하게 만든다. 상기 약술한 난관들을 고려하면, 경구 전달을 위해 미국 식약청 (FDA)이 단지 하기의 6종의 생물거대분자만을 승인한 것이 놀랍지만은 않다: 2종의 국소 및 2종의 전신 전달 펩티드, 1종의 국소 전달 비펩티드 거대고리, 및 1종의 국소 전달 단백질 혼합물 (Moroz E. et al (2016) Advanced Drug Delivery Reviews 101, 108-121). 그러나, 단백질, 펩티드 및 핵산의 몇몇 경구 도포 제제가 현재 임상 평가 중이다. 종종, 이들 제제는 적어도 하나의 하기 부형제를 함유한다: 약물 분해를 방지하기 위한 장용성 제피 및/또는 프로테아제 억제제 및 거대분자의 세포사이 수송을 할 수 있는 투과 증강제. 기계론적으로, 흡수 증강은 치밀 이음부 또는 원형질막을 기계적으로 파괴시키고, 점액 점도를 낮추고, 치밀 이음부-조절 신호전달 경로를 조절하여 획득될 수 있다. 임상 개발 중인 생물거대분자의 경구 전달을 위한 추가의 전략은 캐리어-매개 트랜스사이토시스, 및 GI 표적으로 국소 전달을 이용하는, 구강 전달을 포함한다. 현재 승인된 경구 약물 및 임상 후보물의 압도적인 다수는 <　1000　Da의 분자량을 나타낸다. 이 한계치 이상에서, 생체이용률-증강 부형제의 낮은 생체이용률, 개체간 및 개체내 가변성, 식효, 및 장기간 안전성 문제가 거의 90년간의 시행 착오 이후에 지식의 명백한 진보에도 불구하고 경구 전달의 중요한 도전으로 남아있다.
본 발명은 치료적 단백질의 현행 경구 전달의 단점에 대한 분명한 해결책을 제공한다. 본 발명에서 우리는 놀랍게도 배양 배지에 치료적 단백질을 분비하는 재조합 효모의 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 포함하는 배양 배지를 건조하여 수득된 건조 제제가 건조 제제의 경구 전달에 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. 놀랍게도 이 제제는 위장관 내에서 단백질가수분해 및 분해로부터 보호받을 뿐만 아니라 건조 제제에 존재하는 치료적 단백질이 또한 놀랍게도 생물학적으로 활성이 있다. 특정한 기전 또는 작용에 본 발명을 국한하려는 것은 아니나 우리는 적어도 하나의 기전은 효모의 세포외 배지가 소화관 내에서 치료적 단백질의 단백질가수분해를 방지 (또는 지연)시키는 치료적 단백질 주변의 보호막으로서 작용하는 것이라고 여기고 있다. 이것은 치료적 단백질이 식물 종자에서 발현되는 상황과는 상이한데, 여기서 건조 종자 매트릭스는 분해로부터 치료적 단백질을 보호한다 (WO2014033313 참조). 또 다른 가능한 기전은 글리코실화된 치료적 단백질이 (재조합 효모 숙주에서 그것을 발현시키는 성질에 의해서) 오직 (고) 만노스 당 구조로만 이루어진다는 것이다. 이들 부피 큰 고-만노스 구조는 또한 소화관내에서 단백질가수분해적 분해로부터 치료적 펩티드를 보호할 수 있다. 도 5는 재조합 단백질이 본 발명의 예에서 사용되는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 생산된 V2A-IgAFc 융합체 상에 존재하는 부피 큰 고-만노스 글리코실화를 도시한다. 우리 발견의 주요 장점은 치료적 단백질의 정제가 필요없다는 것으로서 이와 같은 배지를 포함하는 제제 또는 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수 거대분자 (효모 생산된 자체 단백질 포함)를 포함하는 건조 제제 및 배양 배지에 존재하는 치료적 단백질이 경구 약학 생성물로서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 이들 장점은 하기 실시형태에서 약술된다.
특별한 실시형태에서 본 발명은 재조합 숙주 세포의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 숙주 세포는 상기 재조합 숙주 세포의 성장 배지 (또는 배양 배지)로 분비되는 외생성 단백질을 생산한다. 재조합 숙주 세포는 원핵생물 숙주 (예를 들어, 락토코커스 (Lactococcus), 바실러스 (Bacillus) 및 다른 박테리아 숙주), 진핵생물 숙주 예컨대 식물 세포, 동물 세포, 진핵 세포 특히 사상 진균 세포 및 효모 세포일 수 있다. 폴리펩티드는 치료적 펩티드, 예방적 펩티드 또는 백신 조성물에서 사용될 수 있는 펩티드일 수 있다.
다른 특별한 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 효모는 배양 배지로 분비되는 외생성 단백질을 생산한다. "배양 배지"는 효모 세포가 없는 발효 액체 배지 (전형적으로 고밀도 효모 발효 액체 배지)를 의미한다. "배양 배지"는 또한 당분야에서 "성장 배지"로도 알려져 있다. 예를 들어 원심분리 후 심층 여과, 원심분리 후 필터-보조 개량 심층 여과 및 또한 미세여과 기술과 같은 발효 액체 배지로부터 효모를 분리하기 위한 하류 프로세싱 (발효 액체 배지 정화 기술이라고도 함)에 몇몇 선택안이 존재한다.
발효 액체 배지는 매우 복잡한 폐액 또는 액체라는 것은 분명하다. 기본적으로, 발효 액체 배지는 효모가 성장하고, 번식하며 또한 치료적으로 관련된 폴리펩티드를 분비하는 영양소의 바다이다. 발효 액체 배지는 전형적으로 발효 영양 성분 예컨대 효모 펩톤 (효모 추출물 포함), 효모 자기분해물 및 불활성 효모를 함유한다. 이들 생성물의 함량은 B-비타민, 뉴클레오티드, 미네랄, 알파-아미노 질소 함량 및 다른 생활성 화합물에 따라 다양하다.
가용성 투과 성분의 농도를 감소시키고 유지된 화합물 (여기서는 관심 재조합 폴리펩티드)의 농도를 더 증가시키는데 사용될 수 있는 몇몇 막 분리 과정 (막 포어 크기가 다양함)은 당업자에게 공지되어 있다. 역삼투압 또는 초여과는 압력 구배를 통해 구동되는 막 분리 과정으로서, 막이 용액의 다른 성분으로부터 용매를 분리시킨다. 막 원심분리는 일반적으로 직교류이다. 역삼투압의 경우, 막 포어 크기가 매우 작아서 오직 매우 소량의 매우 작은 분자량의 용질 (예를 들어, 100 MW 컷오프)만이 막을 통해 통과될 수 있게 한다. 한외여과는 압력 구배를 통해 구동되는, 다른 막 분리 과정으로서, 막은 그들의 용매화된 크기 및 구조의 함수에 따라서 액체의 용해되고 분산된 성분들을 분별시킨다. 막 원심분리는 일반적으로 직교류이다. 한외여과에서, 막 포어 크기는 역삼투압 과정보다는 커서 일부 성분이 물과 함께 포어를 통해 통과될 수 있게 한다. 이것은 10,000 MW 컷오프를 사용하는 분리/분별 과정이다. 투석여과는 미세-분자 투과가능한 필터를 사용하여 그들의 분자 크기를 기반으로 용액의 성분 (염, 소형 단백질, 용매 등과 같은 투과성 분자)의 제거 또는 분리를 포함하는 다른 유형의 한외여과이다. 단백질 정제 및 분별 과정에서 통상적으로 사용되는 또 다른 과정은 성장 배지에 고농도의 염을 첨가하는 것이다. 단백질은 높은 이온 강도에서 그들 가용성이 두드러지게 상이하므로, "탈염"은 성장 배지에 존재하는 단백질의 정제 및 농축을 보조하기 위한 매우 유용한 과정이다. 암모늄 술페이트는 수용액 중에서 암모늄 및 술페이트로 해리되는 높은 가용성의 무기 염이다. 암모늄 술페이트는 이것이 고도로 가용성이고, 단백질 구조를 안정화시키고 비교적 낮은 밀도를 갖고 비교적 저렴하기 때문에 침전제로서 특히 유용하다.
그러므로, 또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 진균의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 진균은 상기 배양 배지로 분비되는 Fc 도메인에 융합된 외생성 폴리펩티드를 생산한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 진균의 배양 배지에 존재하는 10 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 진균은 상기 배양 배지로 분비되는 Fc 도메인에 융합된 외생성 폴리펩티드를 생산한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 진균의 배양 배지에 존재하는 15 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 진균은 상기 배양 배지로 분비되는 Fc 도메인에 융합된 외생성 폴리펩티드를 생산한다.
특별한 실시형태에서, 건조 제제 내 Fc 도메인은 IgA Fc 도메인이다.
특별한 실시형태에서 건조 제제 내 외생성 펩티드는 예방적 또는 치료적 펩티드이거나 또는 상기 외생성 펩티드는 백신이거나 또는 백신의 일부를 형성한다.
이의 기술적 및 구조적 특성 관점에서 본 발명의 건조 제제를 정의하는 것은 어렵기 때문에 이들 제제는 제제"에 의해 수득될 수 있는" 바와 같이 청구항에서 보다 적절히 정의된다고 여겨진다. 그러므로 다른 실시형태에서 본 발명은 효모에 외생성인 단백질을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 이 제제는 재조합 효모의 배양 배지로 상기 단백질을 분비시킨 후 상기 배양 배지를 건조하여 수득된다. 또 다른 실시형태에서 본 발명은 효모에 외생성인 치료적 단백질을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 이 제제는 상기 치료적 단백질을 재조합 효모의 배양 배지로 분비시킨 후 상기 배양 배지를 건조하여 수득된다. 또 다른 실시형태에서 본 발명은 효모에 외생성인 예방적 단백질을 포함하는 건조 제제를 제공하고 이 제제는 상기 예방적 단백질을 재조합 효모의 배양 배지로 분비시킨 후 상기 배양 배지를 건조시켜 수득된다. 또 다른 실시형태에서 본 발명은 효모에 외생성인 백신의 일부를 형성하는 단백질을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 이 제제는 상기 단백질을 재조합 효모의 배양 배지로 분비시킨 후 상기 배양 배지를 건조시켜 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 재조합 진균 숙주, 예컨대 사상 진균 또는 효모 세포의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 경구 허용 매트릭스에 첨가한 후, 얻어진 혼합물을 건조시켜 수득된 건조 제제를 제공하고, 상기 배양 배지는 상기 재조합 숙주에 외생성인 분비된 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 숙주의 배양 배지 및 경구 허용 매트릭스의 혼합물을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 숙주는 상기 배양 배지로 분비되는 외생성 폴리펩티드를 생산한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 숙주의 배양 배지 및 경구 허용 매트릭스의 혼합물을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 숙주는 상기 배양 배지로 분비되는 외생성 폴리펩티드를 생산하고 상기 제제의 수분 함량은 상기 제제를 제조하기 전에 상기 배양 배지를 농축시켜 감소된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 숙주의 배양 배지 및 경구 허용 매트릭스의 혼합물을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 숙주는 상기 배양 배지로 분비되는 외생성 폴리펩티드를 생산하고 상기 제제의 수분 함량은 상기 제제를 제조하기 전에 상기 배양 배지를 건조시켜 감소된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 숙주의 배양 배지 및 경구 허용 매트릭스의 혼합물을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 숙주는 상기 배양 배지로 분비되는 외생성 폴리펩티드를 생산하고 상기 제제의 수분 함량은 상기 제제를 건조시켜 감소된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 상기 재조합 숙주에 외생성인 분비된 폴리펩티드를 포함하는 재조합 숙주의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 경구 허용 매트릭스에 첨가한 후, 얻어진 혼합물을 건조하여 수득된 건조 제제를 제공한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 진균 세포 예컨대 재조합 사상 숙주 또는 재조합 효모 세포의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 경구 허용 매트릭스에 첨가한 후, 얻어진 혼합물을 건조하여 얻어지는 건조 제제를 제공하고, 상기 배양 배지는 상기 재조합 진균 세포에 외생성인 분비된 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 재조합 진균 세포 예컨대 재조합 사상 숙주 또는 재조합 효모 세포의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 경구 허용 매트릭스에 첨가한 후, 얻어진 혼합물을 건조하여 수득된 건조 제제를 제공하고, 상기 배양 배지는 상기 재조합 진균 세포에 외생성인 분비된 폴리펩티드를 포함하고, 상기 건조는 분무 건조에 의해 수행된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 진균 세포 예컨대 재조합 사상 숙주 또는 재조합 효모 세포의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대 분자를 경구 허용 매트릭스에 첨가한 후, 얻어진 혼합물을 건조하여 수득된 건조 제제를 제공하고, 상기 배양 배지는 상기 재조합 진균 세포에 외생성인 분비된 폴리펩티드를 포함하고, 상기 건조는 동결건조에 의해 수행된다.
본 명세서에서 정의된 "경구 허용 매트릭스"는 예를 들어 전분, 말토덱스트린, 두유 단백질, 셀룰로스, 펙틴 및 구아르 검과 같은 담체로서 식품 산업에서 사용되는 생성물이다. 특정한 실시형태에서, 경구 허용 매트릭스는 식용 매트릭스이다. 다른 특정한 실시형태에서, 경구 허용 매트릭스는 가용성 식품-등급 영양분 또는 가용성 식품-등급 매트릭스 또는 가용성 식품-등급 물질이다.
건조 제제
많은 예에서, 캡슐, 정제 및 박막으로 이의 전환을 촉진하는, 분말 형태의 건조 단백질을 갖는 것이 유리하다. 단백질 용액을 건조 분말 형태로 전환시키기 위한 수많은 건조 방법이 당분야에서 이용가능하다. 대부분의 건조 방법은 승화 예컨대 동결 건조 또는 증발 예컨대 분무 건조 및 유동층 건조 또는 침전 예컨대 초임계 유체 기술에 의한 용매의 제거를 포함한다. 이들 방법 중에서 분무 건조 및 동결 건조가 가장 일반적으로 사용되는 단백질 용액의 건조의 산업적 방법이다. 동결건조 (냉동 건조와 동일 용어)는 바이오의약품으로부터 수분을 제거하기 위한 하나의 처리 방법이고 이들 제품의 안정성, 내온성 및 저장 수명을 증가시킬 수 있다. 동결건조가 산업 내에서 충분히 확립되어 있지만, 생산 설비 내에서 상당한 공간을 차지하는 값비싼 장비를 요구한다. 동결건조는 또한 완료하는데 수일이 걸릴 수 있고, 분말 제품을 필요로 하는 제조사는 그 과정에 과립화 단계를 도입시켜야 한다. 따라서, 동결건조는 재조합 효모를 제거한 후에 효모 발효 액체 배지를 동결건조하여 건조 제제를 수득하는데 사용될 수 있다.
따라서 또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 단백질은 상기 배양 배지에 존재하고, 이 방법은 동결건조에 의해 상기 배양 배지를 건조시키는 단계를 포함한다.
분무 건조는 바이오의약품을 보존하기 위한 대안적인 기술이고 액상 제제를 단일 단계에서 건조 분말로 전환시키는 과정이다. 전형적으로 이 과정은 먼저 용액을 미세 액적으로 원자화시키고 나서 따뜻한 가스를 사용해 대형 챔버 내에서 급속하게 건조시켜서 수행된다. 최종 건조 입자는 사이클론으로 수집된다. 분무 건조는 바이오의약품을 원자화 단계 동안 전단 응력에 노출시키는데, 이것은 불안정한 바이오의약 화합물 예컨대 단백질을 탈안정화시킬 수 있다. 복합 생물학적 분자는 그들이 높은 전단 응력에 민감하기 때문에 분무 건조하는 것이 보다 어렵다. 접하게 되는 전단 응력의 양은 오토마이저의 유형 및 사용되는 원자화 압력에 따라 좌우된다. 전단 응력을 최소화하고 복잡한 바이오의약품을 처리할 수 있게 하는, 20 psig 미만의 비교적 낮은 압력에서 작동할 수 있는 음속 노즐이 편리하게 사용된다. 분무 건조는 광범위하게 다양한 바이오의약품 예컨대 단백질, 효소, 항체, 바이러스 및 박테리아에 대해 수행되었다. 그 과정은 물을 제거하고 바이오의약품의 이동도를 제한하여서, 그 결과로 분해율을 상당히 저하시킨다. 따라서, 분무 건조는 재조합 효모를 제거한 후에 효모 발효 액체 배지를 분무 건조하여 건조 제제를 수득하는데 사용될 수 있다.
따라서 또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 단백질은 상기 배양 배지에 존재하고 이 방법은 상기 배양 배지를 분무 건조에 의해 건조하는 단계를 포함한다.
특정한 실시형태에서 디사카라이드 또는 계면활성제가 분무 건조를 수행하기 전에 배양 배지에 첨가된다. 디사카라이드 및 계면활성제는 응집을 방지한다고 설명되어 있고 (Broadhead J. et al (1993) J. Pharm. Pharmacol. 46 (6) 458-467), 추가적으로 단백질-충전력의 저장능을 개선시킨다고 설명된다 (Adler M and Lee G (1999) J. Pharm. Sci. 88, 199-208).
또 다른 실시형태에서 트레할로스 및/또는 솔비톨이 분무 건조를 수행하기 전에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 30 중량% 솔비톨의 존재는 분무 건조 동안 약학 단백질의 응집을 실질적으로 감소시키고 또한 건조 저장 안정성을 개선시킨다고 설명되고 (Maury M. et al. (2005) Eur. J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 59, 251-261), 유사한 효과가 트레할로스에 대해서도 기술되어 있다.
따라서 특정한 실시형태에서 초음파 점도 감소는 분무 건조 과정을 수행하기 전에 적용된다. 초음파 점도 감소는 용액의 더 높은 입자 충전을 가능하게 하여, 증발시켜야만 하는 액체의 부피 감소를 야기시킨다. 초음파 점도 감소는 감소되는 에너지 소비 및 더 높은 수율을 야기시킨다.
건조 분무는 장비, 설비, 및 유틸리티와 관련하여 저비용에서 보다 확장가능하다. 뿐만 아니라, 분무 건조를 위한 사이클 시간은 일 단위 대신 시간 단위이므로, 작업 비용이 동결건조에 비해 더 저렴할 수 있다.
식품
또 다른 실시형태에서 본 발명은 앞서 본 명세서에 기술된 바와 같은 건조 제제를 포함하는 식품을 제공한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 앞서 본 명세서에 기술된 바와 같은 건조 제제를 포함하는 식품을 제공하고, 여기서 식품은 기능성 식품이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 앞서 본 명세서에 기술된 바와 같은 건조 제제를 포함하는 식품을 제공하고, 여기서 식품은 의약 식품이다.
몇몇 식품은 본 발명에 따라서 제조될 수 있다. 식품의 비제한적인 목록은 식사 대용품, 수프류, 국수류, 아이스크림류, 소스류, 드레싱류, 스프레드류, 스낵류, 씨리얼, 음료, 빵, 비스켓, 기타 베이커리 제품, 스위츠, 바, 초코렛, 츄잉검, 유제품, 및 식이 제품을 포함한다. 후자의 제품 및 그들의 제조 방법의 논의는 US8105592 (20 페이지, 62번째 줄부터 시작하여 페이지 23의 35번째 줄)에 제시되어 있다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물을 제공하고, 여기서 IgAFc 단백질과 융합된 단백질은 예방적 또는 치료적 단백질 또는 백신 성분이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물을 제공하고, 여기서 IgAFc와 융합된 단백질은 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물을 제공하고, 여기서 IgAFc와 융합된 단백질은 VHH 도메인이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물을 제공하고, 여기서 IgAFc와 융합된 단백질은 VHH 도메인이고 VHH 도메인은 인공적으로 도입된 N-글리코실화 부위를 함유한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 N-글리칸 및/또는 O-글리칸으로 변형된 진균 생산된 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물을 제공하고, 이 당단백질 분자량의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 이상은 상기 N-글리칸 또는 O-글리칸에 의해 기여된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 N-글리칸 및/또는 O-글리칸에 의해 변형된 진균 생산된 IgAFc-융합체 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물을 제공하고, 이 당단백질 분자량은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 이상이 상기 N-글리칸 또는 O-글리칸에 의해 기여된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 N-글리칸 및/또는 O-글리칸으로 변형된 진균 생산된 IgAFc-융합체 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물을 제공하고, 이 당단백질 분자량의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 이상은 상기 N-글리칸 또는 O-글리칸에 의해 기여되고, IgAFc와 융합된 단백질은 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
현저하게, 과만노실 구조로 주로 이루어진 N-글리코실 구조는 재조합적으로 효모에서 생산된 IgAFc-융합체 단백질에 50% 초과의 분자량를 첨가한다. 이것은 도 5에서 증명된다 (글리코실화된 V2A-IgAFc 융합체 및 탈글리코실화된 V2A-IgAFc 융합체 단백질 간 차이를 참조). 또한 두드러지게, IgAFc 융합체 단백질이 효모에서 항상성 GAP 프로모터의 제어 하에서 생산될 때가 IgAFc 융합체 단백질이 메탄올 옥시다제 유도성 프로모터 (AOX 프로모터)의 제어 하에서 생산될 때보다 과글리코실화가 훨씬 더 풍부하다 (도 6 참조).
또 다른 실시형태에서 본 발명은 경구 투여 용도를 위한 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 제공한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 경구 투여 용도를 위한 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 제공하고 여기서 IgAFc와 융합된 단백질은 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 경구 투여 용도를 위한 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 제공하고 IgAFc와 융합된 단백질은 VHH 도메인이다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 경구 투여 용도를 위한 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 제공하고, 여기서 IgAFc와 융합된 단백질은 VHH 도메인이고 VHH 도메인은 인공적으로 도입된 N-글리코실화 부위를 함유한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 경구 투여 용도를 위한 N-글리칸 및/또는 O-글리칸으로 변형된 진균 생산된 단백질을 제공하고 이 당단백질 분자량의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 이상은 상기 N-글리칸 또는 O-글리칸에 의해 기여된다.
특정한 기전에 본 발명을 제한하려는 것은 아니나 우리는 재조합 (융합체) 단백질 상의 진균 세포에 의해 생산되는 과만노실화된 글리칸 구조가 소화관 내에서 재조합 단백질을 보호하므로 이러한 과만노실화된 재조합 단백질이 경구 전달에 적합하다고 믿는다.
용어 "단일 가변 도메인"과 동등한 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" ("ISVD"로 축약)은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인 상에 존재하고, 그에 의해 형성되는 분자를 정의한다. 이것은 "통상의" 면역글로불린 또는 그들 단편과 별도로 면역글로불린 단일 가변 도메인을 설정하고, 여기서 2개의 면역글로불린 도메인, 특히 2개의 가변 도메인은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로, 통상의 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이러한 경우에, VH 및 VL 둘 모두의 상보성 결정 영역 (CDR)은 항원 결합 부위에 기여하게 될 것이고, 다시 말해서, 총 6개 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여될 것이다.
상기 정의의 관점에서, 통상의 4-사슬 항체 (예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당분야에 공지됨) 또는 이러한 통상의 4-사슬 항체로부터 유래된 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 예컨대 디술피드 연결된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 디아바디 (모두 당분야에 공지됨)의 항원-결합 도메인은 이 경우에, 항원의 개별 에피토프와의 결합이 정상적으로 하나의 (단일) 면역글로불린 도메인에 의해서가 아니라, 개별 항원의 에피토프에 공동으로 결합하는 (회합된) 면역글로불린 도메인 예컨대 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍, 즉 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 발생되므로, 보통은 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 간주되지 않는다.
대조적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가적인 면역글로불린 가변 도메인과 쌍형성하지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 도메인은 단일 VH/VHH 또는 VL 도메인에 의해 형성된다. 그런 이유로, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 항원 결합 부위는 3개 이하의 CDR에 의해 형성된다.
이와 같이, 단일 가변 도메인은 단일 항원 결합 유닛을 형성할 수 있는 한 경쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어, VL-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어, VH-서열 또는 VHH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다 (즉, 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 유닛을 형성하기 위해 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요 없도록, 단일 가변 도메인으로 본질적으로 이루어진 기능적 항원 결합 유닛).
본 발명의 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어, VH-서열)이고; 보다 특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 통상의 4-사슬 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열일 수 있거나 또는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열일 수 있다.
예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 (단일) 도메인 항체 (또는 (단일) 도메인 항체로서 사용에 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb (또는 dAb로서 사용에 적합한 아미노산 서열) 또는 나노바디 (본 명세서에 정의된 바와 같고, 제한없이 VHH 포함); 다른 단일 가변 도메인, 또는 이의 어느 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다.
특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Nanobody® (본 명세서에 정의된 바와 같음) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. [주: Nanobody®, Nanobodies® 및 Nanoclone®은 Ablynx N.V.의 등록 상표임] 나노바디에 대한 일반 설명은, 하기 추가 설명을 비롯하여, 본 명세서에 인용된 종래 기술, 예컨대 WO 08/020079 (페이지 16)에 기술된 것들을 참조한다.
VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 "중쇄 항체"의 (즉, "경쇄가 없는 항체"의; Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363: 446-448) 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로서 본래 기술되었다. 용어 "VHH 도메인"은 이들 가변 도메인을 통상의 4-사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인 (본 명세서에서 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"이라고 함) 및 통상의 4-사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인 (본 명세서에서 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"이라고 함)과 구별하기 위해서 선택되었다. VHH 및 나노바디의 추가 설명을 위해서, Muyldermans의 리뷰 문헌 (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)을 비롯하여, 일반 배경 기술로서 언급된 하기 특허 출원을 참조한다: Vrije Universiteit Brussel의 WO 94/04678, WO 95/04079 및 WO 96/34103; Unilever의 WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 및 WO 02/48193; Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)의 WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 및 WO 03/055527; Algonomics N.V. 및 Ablynx N.V.의 WO 03/050531; National Research Council of Canada의 WO 01/90190; Institute of Antibodies의 WO 03/025020 (= EP 1433793)를 비롯하여; Ablynx N.V.의 WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 및 WO 06/122825, 및 Ablynx N.V.에 의한 추가의 공개된 특허 출원. 또한 이들 출원에 언급된 추가의 선행 기술, 및 특히 국제 공개 특허 출원 WO 06/040153의 페이지 41-43에 언급된 참조 목록을 참조하고, 그 목록 및 참조 문헌을 본 명세서에 참조로 편입시킨다. 이들 참조 문헌에 기술된 바와 같이, 나노바디 (특히 VHH 서열 및 특히 인간화된 나노바디)는 특히 프레임워크 서열 중 하나 이상에 하나 이상의 "홀마크 잔기"의 존재를 특징으로 할 수 있다. 나노바디의 인간화 및/또는 낙타화를 비롯하여, 다른 변형, 부분 또는 단편, 유도체 또는 "나노바디 융합체", 다가 구성체 (링커 서열의 일부 비제한적인 예를 포함) 및 나노바디의 반감기를 증가시키기 위한 상이한 변형 및 그들 제조를 포함한, 나노바디의 추가 설명은 예를 들어, WO 08/101985 및 WO 08/142164에서 확인할 수 있다. 나노바디의 추가의 일반 설명은, 본 명세서에 인용된 선행 기술, 예컨대, 예를 들어 WO 08/020079 (페이지 16)에 기술된 것을 참조한다.
"Dabs", "Domain Antibodies", 및 "dAbs" (용어 "Domain Antibodies" 및 "dAbs"는 GlaxoSmithKline group of companies의 상표명으로서 사용됨)로도 알려진, "도메인 항체"는 예를 들어, EP 0368684, Ward 등 (Nature 341: 544-546, 1989), Holt 등 (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) 및 WO 03/002609를 비롯하여 예를 들어 WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 및 Domantis Ltd의 다른 공개된 특허 출원에 기술되어 있다. 도메인 항체는 본질적으로 비낙타화 포유동물, 특히 인간 4-사슬 항체의 VH 또는 VL 도메인에 상응한다. 단일 항원 결합 도메인으로서 에피토프에 결합하기 위해서, 즉, 개별적으로 VL 또는 VH 도메인과 쌍형성하지 않고, 이러한 항원 결합 특성을 위한 특별한 선택은 예를 들어 인간 단일 VH 또는 VL 도메인 서열의 라이브러리를 사용하는 것이 요구된다. 도메인 항체는 VHH 처럼, 대략 13 내지 대략 16 kDa의 분자량을 갖고, 완전한 인간 서열로부터 유래되면, 예를 들어, 인간에서 치료적 사용을 위해 인간화를 필요로 하지 않는다.
또한 단일 가변 도메인은 상어의 일정 종으로부터 유래될 수 있다는 것을 이해한다 (예를 들어, 소위 "IgNAR 도메인", 예를 들어 WO 05/18629 참조).
따라서, 본 발명의 의미에서, 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인"은 인간 이외의 공급원, 바람직하게 낙타과, 바람직하게 낙타과 중쇄 항체로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 그들은 이전에 기술된 바와 같이 인간화될 수 있다. 게다가, 이 용어는 예를 들어, Davies 및 Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996), 그리고 Riechmann 및 Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)가 기술한 바와 같이, "낙타화"시킨, 비낙타과 공급원, 예를 들어 마우스 또는 인간으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 단백질은 상기 배양 배지에 존재하고, 방법은
i) 단백질을 포함하는 재조합 효모를 배양시키고 상기 단백질이 배양 배지로 분비될 수 있게 하는 단계,
ii) 재조합 효모 세포를 배양 배지로부터 분리시키는 단계,
iii) 막 분리 과정으로 상기 배양 배지를 농축시키는 단계, 및
iv) 상기 농축된 배양 배지를 건조시키는 단계
를 포함한다.
재조합 효모를 생성시키기 위한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 간략하게, 재조합 단백질을 코딩하는 키메라 유전자를 포함하는 발현 벡터는 재조합 효모에 존재한다. 발현 벡터는 게놈으로 통합될 수 있거나 또는 재조합 효모에서 자체적으로 복제될 수 있다. 숙주 염색체에 통합되는 벡터는 선택의 부재 하에서 그들의 유사분열 안정성 때문에 가장 광범위하게 사용된다. 그러나, 에피솜 발현 벡터가 일부 효모 시스템을 위해 존재한다. 발현 벡터는 전형적으로 강력한 효모 프로모터/종결인자 및 효모 선별 마커 카세트를 함유한다. 대부분의 효모 벡터는 클로닝을 용이하게 하기 위해서 이. 콜라이 (E. coli)에서 증식 및 증폭될 수 있고 이와 같이 또한 이. 콜라이 복제 기원 및 암피실린 선별 마커를 함유할 수 있다. 　마지막으로, 많은 효모 발현 벡터는 이종성 단백질을 세포로부터 분비되게 효율적으로 유도하는 효율적인 분비 리더의 하류 유전자 (예를 들어, 메이팅 인자 또는 Ost1 서열의 것 (Fitzgerald I & Glick BS (2014) Microbial cell factories 13, 1))를 임의로 클로닝하는 능력을 포함한다. 키메라 유전자는 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 유전자에 작동적으로 커플링된 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 커플링된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 항상성 프로모터일 수 있거나 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 발효 액체 배지를 포함하는 건조 제제를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 단백질은 상기 배양 배지에 존재하며, 방법은
i) 단백질을 포함하는 재조합 효모를 배양시키고 상기 치료적 단백질이 배양 배지로 분비될 수 있게 하는 단계,
ii) 상기 발효 액체 배지 (재조합 효모 및 배양 배지 포함)를 건조시키는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 효모 세포를 더 포함하는 본 발명의 건조 제제를 제공한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 비-재조합 효모 세포를 더 포함하는 본 발명의 건조 제제를 제공한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지로서, 상기 배양 배지에 외생성 단백질이 존재하는 것인 배양 배지 및 비-재조합 효모 세포를 포함하는 건조 제제를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
i) 외생성 단백질을 포함하는 재조합 효모를 배양시키고 상기 단백질이 배양 배지로 분비될 수 있게 하는 단계,
ii) 재조합 효모 세포를 배양 배지로부터 분리시키는 단계,
iii) 막 분리 과정으로 상기 배양 배지를 농축시키는 단계,
iv) 비-재조합 효모 세포를 배양 배지에 첨가시키는 단계,
v) 상기 배양 배지를 건조시키는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지로서, 상기 배양 배지에 외생성 단백질이 존재하는 것인 배양 배지 및 비-재조합 효모 세포를 포함하는 건조 제제를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
i) 외생성 단백질을 포함하는 재조합 효모를 배양시키고 상기 외생성 단백질이 배양 배지로 분비될 수 있게 하는 단계,
ii) 재조합 효모 세포를 배양 배지로부터 분리시키는 단계,
iii) 상기 배양 배지를 건조시키는 단계,
iv) 비-재조합 효모 세포의 건조 제제를 단계 iii)에서 수득된 건조된 배양 배지에 첨가하는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 효모 발효 액체 배지에 존재하는 단백질과 상이한 단백질 풍부 제제를 더 포함하는 본 발명의 건조 제제를 제공한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지로서 상기 배양 배지에 외생성 단백질이 존재하는 것인 배양 배지 및 효모 발효 액체 배지에 존재하는 단백질과 상이한 단백질 풍부 제제를 포함하는 건조 제제를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
i) 외생성 단백질을 포함하는 재조합 효모를 배양시키고 상기 단백질이 배양 배지로 분비될 수 있게 하는 단계,
ii) 재조합 효모 세포를 배양 배지로부터 분리시키는 단계,
iii) 단백질 풍부 제제를 배양 배지에 첨가시키는 단계,
iv) 상기 배양 배지를 건조시키는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지로서, 상기 배양 배지에 치료적 단백질이 존재하는 것인 배양 배지 및 비-재조합 효모 세포를 포함하는 건조 제제를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은
i) 치료적 단백질을 포함하는 재조합 효모를 배양시키고 상기 치료적 단백질이 배양 배지로 분비될 수 있게 하는 단계,
ii) 재조합 효모 세포를 배양 배지로부터 분리시키는 단계,
iii) 상기 배양 배지를 건조시키는 단계,
iv) 단백질 풍부 제제의 건조 제제를 단계 iii)에서 수득된 건조 배양 배지에 첨가하는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 효모는 배양 배지로 분비되는 외생성 Fc 융합체 단백질을 생산한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 재조합 효모의 배양 배지를 포함하는 건조 제제를 제공하고, 상기 효모는 배양 배지로 분비되는 외생성 Fc 융합체 단백질을 생산하고 상기 Fc 도메인은 IgA Fc 도메인이다.
이의 기술적 특성 관점에서 본 발명의 건조 제제를 구조적으로 설명하는 어려움 때문에, "의해 수득가능한" 청구 형식으로 건조 제제를 정의하는 것이 보다 적절하다. 그러므로 다른 실시형태에서 본 발명은 Fc 도메인 및 폴리펩티드 사이에 외생성 융합체 단백질을 포함하는 건조 제제를 제공하고, 제제는 상기 외생성 단백질을 재조합 효모의 배양 배지로 분비시킨 후 상기 배양 배지를 건조시켜 수득된다.
Fc 융합체 단백질
Fc 영역 (단편 결정화가능한 영역)은 Fc 수용체라고 불리는 세포 표면 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 면역글로불린의 꼬리 영역이다. 특히 고려되는 실시형태에 따라서, Fc 융합체 단백질 내 Fc 영역은 면역글로불린 G (IgG) 이소타입 유래의 Fc 영역이다. 이것은 임의의 IgG 서브클래스 (인간의 경우 IgG1, 2, 3, 4)일 수 있다. IgG의 경우, IgA 및 IgD 이소타입처럼, Fc 영역이 항체의 2개 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 유래된, 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성된다. 다른 실시형태에서, 융합체 단백질의 Fc 부분은 IgA 항체로부터 유래된다. 본 명세서에서 사용되는 "Fc 융합체 단백질"은 융합체 단백질로서, Fc 영역이 단백질 또는 펩티드에 융합된 것이다. Fc 함유 단백질의 특정 클래스는 항원에 결합할 수 있는 Fc 함유 단백질이다. 예로는 항체, 또는 융합체 단백질로서 Fc 영역이 결합 모이어티에 연결된 것이 있다 (예를 들어, 나노바디, Fab 영역, F(ab')2 영역). 또한, 본 발명은 인간 서열에 제한되지 않는다. 예를 들어, Fc 영역은 마우스, 또는 낙타과, 레서스 원숭이, 개, 소, 기니 피그, 양, 돼지, 염소, 말, 래트, 토끼, 소, 또는 임의의 다른 포유동물의 것이 가능하다. Fc 영역이 비-포유동물 (예를 들어, 닭)에서 유래되는 것도 가능하다. 특별한 예에서, 결합 모이어티는 비-항체 스캐폴드일 수 있다. 비-항체 스캐폴드는 광범위하게 2개의 구조적 클래스로 나뉘는데, 즉 도메인-크기 화합물 (6-20 kDa 분자량) 및 제한 펩티드 (2-4 kDa)이다. 도메인-크기 스캐폴드는 아피바디, 아필린, 안티칼린, 아트리머, DARPins, FN3 스캐폴드 (예를 들어, 아드넥틴 및 센티린), 피모머, 쿠니츠 도메인, 프로넥틴 및 OBodies를 포함하는 한편, 아비머, 이환식 펩티드 및 Cys-노트는 펩티드-관련이다 (종합 리뷰를 위해 [Vazquez-Lombardi R et al (2015) Drug Discovery Today 20, 10, 1271] 참조).
약학 제제
특별한 실시형태에서, 본 발명의 건조 제제는 장용성 또는 지연 방출 제피를 더 포함할 수 있는 고형 경구 약학 제형을 생성시키는 임의의 이용가능한 연질 또는 경질 캡슐 기술에 의해 캡슐화될 수 있다.
또 다른 양상에서 건조 제제는 에멀션을 수득하기 위해 액체에 용해될 수 있다 (Moreira TC et al (2016) Colloids Surf B. Biointerface 143: 399-405). 따라서 특정한 양상에서 약학 제제는 액체이다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 10% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 9% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서, 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 8% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 7% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 6% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 5% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 4% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 3% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 2% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 1% (w/w) 미만의 물을 포함한다. 일 양상에서 본 발명에 따른 약학 제제는 액체이고 0% (w/w) 미만의 물을 포함한다.
본 발명의 일정 양상에서, 약학 제제는 약학 제제에 통상적으로 존재하는 추가의 부형제를 포함할 수 있고, 이러한 부형제의 예는 제한없이 항산화제, 항미셍물제, 효소 억제제, 안정화제, 보존제, 풍미제, 감미제 및 본 명세서에 참조로 편입된 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al., Eds., 7th Edition, Pharmaceutical Press (2012)]에 기술된 바와 같은 다른 성분을 포함한다.
이들 추가의 부형제는 총 약학 제제의 약 0.05-5 중량%의 양으로 존재할 수 있다. 항산화제, 항미셍물제, 효소 억제제, 안정화제 또는 보존제는 전형적으로 총 약학 제제의 최대 약 0.05-1 중량%로 제공된다. 감미제 또는 풍미제는 전형적으로 총 약학 제제의 최대 약 2.5 중량% 또는 5 중량%로 제공된다.
본 발명에 따른 경구 약학 제제는 고형 제형으로서 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 경구 약학 제제는 고형 제형으로 제제화될 수 있고 캡슐, 정제, 당의정, 알약, 로젠지, 분말 및 과립으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 경구 약학 제제는 다미립자 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 경구 약학 제제는 다미립자 제형으로서 제제화될 수 있고 펠렛, 미세입자, 나노입자, 연질 또는 경질 캡슐 내 액상 또는 반고형 충전 제제, 장용성 제피 연질-경질 캡슐로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 양상에서 경구 약학 제제는 하나 이상의 제피 예컨대 장용성 제피로 제조될 수 있거나 또는 당분야에 충분히 공지된 방법에 따라서 지연 방출 제제로서 제제화될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명에 따른 약학 제제는 약물의 제조를 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "계면활성제"는 표면 및 계면, 예컨대 제한없이 액체 대 공기, 액체 대 액체, 액체 대 용기 또는 액체 대 임의 고체에서 흡수될 수 있는, 임의의 물질, 특히 세제를 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "약물", "치료적", "약제" 또는 "의약"은 예방적, 치료적 또는 백신 용도로 사용될 수 있는, 약학 제제에서 사용되는 활성 성분을 의미하고 따라서 또한 본 특허 출원에서 "거대 분자 치료제" 또는 "치료적 거대분자" 또는 "예방적 거대분자" 또는 "백신 거대분자"로서 정의되는 것을 의미한다.
예방/치료/백신
폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 건조 제제는 명백하게 펩티드의 성질에 의존적으로, 다양한 질환에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어 펩티드가 치료적 펩티드인 경우라면 몇몇 질환은 제한없이 신경퇴행성 장애, 암, 조직학적 장애, 면역학적 장애, 심장 장애, 간 장애, 호흡기 장애, 흡수불량 장애, 당뇨병, 바이러스 감염, 진균 감염, 박테리아 감염, 안구 질환, 희귀 대사 장애 및 고혈압을 포함한다.
특별한 실시형태에서 본 발명은 위장 장애의 치료에서 사용을 위한 본 발명의 건조 제제를 제공한다. 위장 장애의 비제한적인 예는 과민성 장 증후군, 변비, 치핵 (예를 들어, 내치핵), 치열, 게실 질환, 대장 용종, 대장암, 감염성 대장염, 궤양성 대장염, 크론 질환, 허혈성 대장염, 방사선 대장염 및 장 점막염을 포함한다.
또 다른 특별한 실시형태에서 본 발명은 구강 (또는 입) 장애 예컨대 구순 포진, 구내염, 아구창, 백반증, 구갈, 치은, 구취, 충치, 치주염 (예를 들어, 치은염), 구강 칸디다증, 경구 헤르페스 심플렉스 바이러스 감염, 경구 인간 파필로마바이러스 감염, 재발성 혓바늘, 구강 및 인두 암 및 경구 점막염의 치료에서 사용을 위한 본 발명의 건조 제제를 제공한다.
본 발명의 건조 제제에 존재하는 치료적 단백질은 단일클론 항체, 성장 인자, 인터루킨 등을 포함한다. 다른 양상에서 외생성 폴리펩티드는 백신 목적에 사용될 수 있다. 특히 외생성 폴리펩티드는 백신으로서 단독으로 사용될 수 있거나 또는 백신 조성물의 일부를 형성할 수 있다.
재조합 효모
특별한 실시형태에서 본 발명의 건조 제제를 제조하는데 사용되는 재조합 효모는 GRAS 상태를 획득한 효모 종이다. GRAS는 안전한 것으로 일반적으로 간주된다 (Generally Regarded as Safe)는 것을 의미한다. GRAS 상태를 갖는 효모는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 및 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)와 같은 효모를 포함한다. 재조합 효모에서 치료적 단백질의 생산은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 효모 피키아 파스토리스의 경우 예를 들어 [Julien C (2006) BioProcess International, January, p. 22-31]의 리뷰, 사카로마이세스 세레비지아에의 경우 예를 들어 [Nielsen J (2013) Bioengineered 4:4, 207-211]의 리뷰, 한세눌라 폴리모르파의 경우 [Cox H. et al (2000) Yeast, Volume 16, 13, pp. 1191-1203]의 리뷰, 클루이베로마이세스 락티스의 경우 [van Ooyen AJJ et al (2006) FEM Yeast Res 6, 381-392]의 리뷰 및 야로위아 리폴리티카의 경우 [Madzak C et al (2004) J. Biotechnol. 109(1-2):63-81]의 리뷰가 있다.
특정한 실시형태, 특별한 구성을 비롯하여 재료 및/또는 분자가 본 발명에 따른 조작된 재조합 효모 세포 및 방법에 대해 기술되었지만, 형태 및 상세 사항에 다양한 변화 또는 변형이 본 발명의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예는 특정한 실시형태를 보다 잘 예시하기 위해 제공되며, 그들은 출원을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원은 오직 청구항에 의해서만 제한된다.
실시예
1. 경구 전달된 피키아 생산 단량체 VHH-IgAFc 융합체는 자돈에서 F4-ETEC 감염을 예방하는데 유효한다
아라비돕시스 종자에서 이전에 생성시키고 평가된 V2A 및 V3A라고 명명된, 단량체 VHH-IgAFc-융합체 (Virdi et al (2013) 110, 29, 11809-11814 참조)를 이제 또한 효모 피키아 파스토리스 및 대두 종자에서 생산하였다. 간략하게, 라마 중쇄-단독 항체 (VHH)를 F4+ ETEC 섬모에 대해서 생성시켰다. 선택된 F4+ ETEC VHH를 돼지 IgAb의 코돈-최적화된 부분 상에 그라프트시켰다. 최종 VHH-IgAFc 융합체는 V2A 및 V3A로 명명한다. 기능성 VHH-IgAFc 융합체의 발현도는 F4-ETEC 첨단 부착 항원-FaeG 코팅된 웰에 의한 ELISA를 사용해 평가되었고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 항-돼지 IgA로 검출하였다. 도 1은 피키아 클론 (도 1A 참조) 또는 대두 종자 스톡 (도 1B 참조)의 스크리닝의 전형적인 예를 도시한다. 20개의 개별 콜로니를 각각의 피키아 생산 항체 V2A 및 V3A에 대해 스크리닝하였다. 유사하게, 10-12개 종자는 각각의 형질전환된 대두 사건으로부터 스크리닝되었다. 이러한 5개 사건은 각각 V2A 및 V3A에 대해 스크리닝되었다. 고발현 종자 스톡은 유지시켰고, 그 일부를 또한 T3 동형접합 종자 스톡을 발생시키는데 사용하였다. 대두 생산된 V2A 및 V3A의 발현도는 종자 무게의 약 0.2%로 계산되었고, 아라비돕시스 종자에서의 발현도와 유사하였다. 분비된 피키아 V2A 및 V3A의 발현도는 100 mg/L 정도로 높았다 (쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 분석). 그러나, ELISA 기반 기능 분석은 1 mL의 피키아 상청액이 1 mL의 대두 또는 아라비돕시스 종자 추출물 (5 mg의 종자)과 등가였음 보여주었다 (도 2 참조). 피키아 생산된 VHH-IgAFc의 정량은 이러한 ELISA 셋업에서 피키아 글리칸을 통한 발산으로 인해 방해받은 듯 하다. 실제로, 피키아 상청액 (도 2C 참조) 및 대두 종자 추출물 (도 1D 참조)의 면역블롯 분석은 차등적 글리코실화의 분명한 홀마크를 보여준다. 피키아 VHH-IgAFc는 50 kDa (∼52 k Da) 보다 높게 이동한데 반해 대두 생산된 VHH-IgAFc는 50 kDa (∼48 kDa) 미만이었다 (도 1, C-D 참조)
피키아 및 대두 생산된 VHH-IgAFc 융합체는 자돈에서 ETEC 감염을 예방한다
V2A 및 V3A의 피키아 및 대두 종자 생산 VHH-IgAFc 항체 칵테일 (용량 5 mg/돼지/일)의 생체내 효능은 자돈 사료-접종 실험으로 평가되었다. 이전에 생성된 아라비돕시스 생산 단량체 VHH-IgAFc (Virdi et al., 2013) PNAS 110, 29, 11809-11814 참조)가 기준 (아라비돕시스-그룹)으로서 제공된 한편, 항체를 함유하지 않는 사료 (아마 사료, 도 3A)는 음성 대조군으로서 제공되었다. 6마리의 F4-ETEC 혈청반응 음성 및 F4-수용체 (F4R) 유전자형 양성 자돈이 10일의 기간 동안 실험 사료를 제공받는 각각의 그룹에 존재한다. 3일째에 모든 자돈은 연속 2일 (0일 및 1일) 동안 1010 F4-ETEC 박테리아가 접종되었고 감염의 최종 효과는 14일까지 접종 균주의 일일 발산량의 분석을 통해서 모니터링되었다 (도 3B). 자돈은 14일에 안락사시켰고, 이 시점에 공장, 회장 및 맹장의 내용물 중 F4-ETEC 박테리아를 또한 결정하였다 (표 1).
표 1: 각 자돈에 대한 분변 그램 당 분변 중 F4-ETEC의 발산량 (Log10)
Figure pct00001
비고: 사후 관찰은 아라비돕시스-그룹의 자돈-18이 소장의 극도의 감돈과 제대-탈장을 가져서 폐색성 통로가 초래된 것을 밝혀주었다. 그런 이유로 자돈-18의 데이타는 발산량 그래프 (도 3B) 또는 통계 분석에 포함되지 않는다 (그 데이타는 표 1에 기록함).
또한 안락사 이후에, 장 융모의 장세포를 사용하여 수행된 F4-ETEC 부착 어세이는 250 μm의 세포 표면 당 결합된 41 내지 85 박테리아를 보여주어서, 높은 수의 F4-수용체 (F4R)의 표현형적 발현이 이중으로 입증되었다. 그런 이유로 자돈-18을 제외하고, 모든 자돈의 데이타는 단량체 VHH-IgAFc의 효능을 평가하기 위해 사용되었다.
발산 데이타는 피키아, 아라비돕시스 또는 대두 종자에서 생산된 단량체 VHH-IgAFc V2A 및 V3A 칵테일의 1일 당 5 mg/돼지의 용량이 ETEC 감염을 성공적으로 예방하였다는 것을 밝혀주었다. VHH-IgAFc 제공 그룹은 유의하게 낮은 발산량을 가졌다 (도 3B, 표 1 참조). 이들 3개 그룹에서 최고 평균 발산량은 각각 대두, 피키아 및 아라비돕시스 그룹에 대해 분변 그램 당 4.5 (log10), 3.7 (log10) 및 4 (log10) 박테리아로 2일에 기록되었다. 이들 3개 그룹에서 발산량은 다음 날에 1 log 만큼 하락하였다. 각각 대두, 피키아 및 아라비돕시스 그룹에서, 분변 그램 당 2.6 (log10), 2 (log10) 및 2,7 (log10) 박테리아로 5일에 평균 발산량에 도달하였다. 이들 그룹에서 발산량은 그 이후에 낮게 유지되어 이들 3개 그룹의 일부 자돈의 경우에 검출가능한 수준 이하 (분변 그램 당 2 (log10) 박테리아)로 유지되었다. 대조적으로, 사료 중에 항체를 받지 않은 자돈 그룹 (대조군-그룹)은 접종된 박테리아의 높은 역가의 지속적인 발산량을 가져고, 3일부터 6일까지 분변 그램 당 평균 6.3 (Log 10) 이상의 박테리아에서, 그 이후 7일 (분변 그램 당 5.3 (log10) 박테리아) 및 8일 (분변 그램 당 3.3 (log10) 박테리아)에 감소되어 9일까지 검출 수준 이하로 하락되었다. 높고 지속적인 발산량은 접종된 균주가 대조군 그룹에서 효과적으로 감염을 고착시킬 수 있고 소장에서 성공적으로 군락화될 수 있다는 것을 의미한다. 반면, 아라비돕시스-그룹, 피키아-그룹 및 대두-그룹의 사료 내 VHH-IgAFc 항체를 제공받은 자돈은 모두가 접종 직후에 F4-ETEC의 신속한 하락을 보였다. 이것은 이들 사료 중 단량체 VHH-IgAFc가 F4-ETEC가 장세포에 부착하여, 군락화되고 감염을 고착시키는 것을 예방한다는 것을 보여준다. 이것은 항-F4-ETEC 혈청전환에 의해 더욱 확증된다 (도 3C 참조). 피키아, 대두 및 아라비돕시스 그룹의 대부분의 자돈은 면역계에 대한 F4-ETEC 병원체의 제한된 노출로 인해 낮은 면역 반응이 증가되었는데 반해, 대조군 그룹의 항-F4-ETEC 혈청 IgG, IgM 및 IgA 수준의 평균 역가는 7일까지 꾸준히 증가되어 14일까지 계속 상승되었다.
발산 및 혈청전환 결과는 아라비돕시스, 대두 또는 피키아에서 생산된, 동일한 비율의 VHH-IgAFc 항체-V2A 및 V3A로 구성된, F4-ETEC에 대한 단량체 VHH-IgAFc 제제의 5 mg 용량의 사료내 전달이 효력있다는 것을 분명하게 입증한다. 뿐만 아니라, 피키아 생산된 항체의 경우에, 생체내 효능 결과는 분비된 VHH-IgAFc를 보유하는 배지의 프로세싱 및 제제가 위 징후를 위해 사료-기반 피키아 생산된 분자를 안정적으로 도입시켜 경구로 전달하는데 적합하다는 것을 적당하게 확증한다.
실시예 1의 재료 및 방법
VHH-IgAFc의 발현
아라비돕시스: 단량체 V2A-IgAFc 및 V3A-IgAFc 융합체를 발현하는 이전에 공개된 아라비돕시스주 (Virdi et al. (2013) PNAS 110, 29, 11809-11814)를 온실에서 규모확장하여, ∼100 그램의 V2A-IgAFc 및 V3A-IgAFc 생산 종자를 재배하였고, 접종 실험에서 아라비돕시스-그룹에 대한 항체 함유 사료를 배합하였다.
대두: 각각 항체 V2A 및 V3A에 대한 VHH-IgAFc 융합체 유전자를 보유하는 플라스미드 pEV2A및 pEV3A (Virdi et al. (2013) PNAS 110, 29, 11809-11814)는 Gateway® 클로닝 사용 설명서 (Invitrogen)에 따라서, herbicide Basta®를 사용하는 형질전환체의 선별을 위한 포스피노트리신 내성을 부여하는 유전자를 보유하는 pGW43 다중부위 게이트웨이 카세트 (Karimi et al. (2002) Trends Plant Sci 7, 193-195)에 재조합시켰다. 최종 발현 벡터는 pMXV2A 및 pMXV3A로 명명하였고, 그 다음에 아이오와 스테이트 유니버시티의 식물 형질전환 설비를 통해서 문헌 [Paz MM et al. (2006) Plant Cell Rep. 25, 206-213]에 기술된 방법에 따라 외식편으로서 자엽을 사용해 대두 식물 (cultivar Williams 82)의 형질전환을 위한 아그로박테리움 (Agrobacterium) 균주 EHA101에 도입시켰다. VHH-IgAFc 항체의 발현은 형질전환 사건의 T2 종자에서, 항원- FaeGac (F4-ETEC의 첨단 부착) 코팅된 웰 (Virdi et al (2013) PNAS 110, 29, 11809-11814)을 사용한 ELISA를 통해 평가하였고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 다클론 항-돼지 IgA (AbD Serotech; AA140P)로 검출하였다. 높은 양의 항체를 발현하는 사건 유래의 10 내지 20개 종자는 T2 식물을 성장시키기 위해 유지시키는 한편 나머지 종자를 사용하여 자돈 사료-접종 평가를 위한 대두 생산 VHH-IgAFc 보유-식이를 배합하였다.
피키아: VHH-IgAFc V2A 및 V3A에 대한 VHH-IgAFc 융합체 유전자는 [De Meyer T. et al. (2015) Plant Biotechnol J 13, 938-947]에서 VHH-IgG에 대해 이전에 기술된, 프라이머 세트 Alfa-V2 (CTCTCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCAGGTGCAGCTGC) 및 IgA-NotI (CCTCTTGAGCGGCCGCCCTTTAGTAGCATATGCCTTCTG)을 사용해 PCR-증폭되었다. 이들 프라이머는 제한효소 부위 AvaI 및 NotI을 보유하며, 이것을 통해서 항체 유전자를 pPpT4_Alpha_S 발현 벡터 내 알파-메이팅 인자와 인프레임으로 클로닝시켰다 (Naatsaari L. et al., (2012) PLoS ONE 7, e39720). 개별 발현 벡터는 효소 PmeI를 사용해 선형화시켰고 전기천공을 통해서 피키아 파스토리스에 도입되었다 (Jacobs PP et al. (2009) Nat Protoc. 4, 58-70). 양성 피키아 콜로니는 100 ㎍/mL의 Zeocin® 및 300 ㎍/mL의 블라스티시딘이 플레이팅된 YPD 한천 상에서 선별하였다. 20개의 개별 콜로니의 발현은 24-웰 시스템의, 2 mL BMGY (1% 호모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 인산칼륨, 1.34% YNB, 1% 글리세롤, pH 6.0) 액체 배양으로 분석하였다. 성장 48시간 후에, 액체 배지는 BMMY (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM 인산칼륨, 1.34% YNB, pH 5.7)로 교체하였고 ∼12시간 마다 1% 메탄올을 섞어 주었다. 전형적으로, 분비된 VHH-IgAFc 항체를 함유하는 배지는 BMMY 배지에서 48시간의 유도 이후에 회수하였다. 발현도는 FaeG 코팅된 웰을 사용하는 ELISA를 통해 평가하였다. 발현이 높은 클론을 동정하였고 글리세롤-스톡을 만들었다.
자돈 접종 실험
자돈 접종 실험은 벨기에 소재, 겐트 유니버시티의 수의학부의 동물 관리 및 윤리 위원회의 승인으로, 동물 복지에 관한 벨기에 법률에 따라서 수행되었다 (윤리적 문서 번호 EC2015/47). 피키아 및 대두 생산된 단량체-IgA를 사용한 실험의 경우 자돈 (벨기에 랜드레이스 X 영국 랜드레이스)은 벨기에, 멜 소재 ILVO ((Institute for Agricultural and Fisheries Research)의 농장에서 백신 미접종 모돈으로부터 태어났다. 혈액 샘플은 2-3주령 자돈으로부터 채혈하여 혈청 중 항-ETEC 항체의 수준을 모니터링하였다 (ILVO의 생명 윤리 위원회 승인, 문서 번호-2016/267). F4-ETEC에 대한 자돈의 혈청반응 음성, 및 F4-ETEC 수용체 (F4R)의 존재와 상호관련있는, MUC-13 PCR (Goetstouwers et al (2014) PLoS One 9, e105013)을 통해 결정된, MUC-13 유전자 (동형접합 및 이형접합 우성))에 대한 양성이 선택되었다. 각 실험 그룹은 6마리 자돈으로 이루어졌다. 이유 후에 자돈을 학부 돈사로 데리고 와서 그들 한배새끼, 유전자형 및 체중을 기준으로 사육 그룹으로 적절하게 임의추출하였다. 각 그룹의 평균 출발 체중은 7.2 kg이었다. 접종은 이전에 기술된 대로 수행되었다 (Virdi et al (2013) Proc Nat Acad Sci USA. 110, 29, 11809-11814). 간략하게, 자돈은 30분 동안 중탄산염 완충액으로 위 pH의 중화 이후에, 진정 상태 하에서 위내 삽관을 통해, 1010 F4-ETEC 박테리아 (균주- GIS26Rstrep)를 연일 접종하였다. 접종 제1일은 시간선에서 0일로 간주된다. 항체 함유 사료를 접종 전 3일에 시작하여, 10일의 기간동안 투여하였다 (도 3, A). 분변 샘플은 접종일로부터 12일까지 그리고 안락사 당일에 채취하여, 스트렙토마신 (1 mg/mL) 선별에 의해 혈액 한천 플레이트 상에서 F4-ETEC 접종 균주 GIS26Rstrep 의 발산량을 모니터링하였다. 혈액 샘플은 -1일, 7일 및 14일에 F4-ETEC 특이적 IgG, IgA 및 IgM 역가를 모니터링하기 위해서 채혈하였다. 동물에 대한 특별한 변형, 샘플 채취 및 조작은 도 3A에 개략적으로 표시되어 있다.
사료 제조:
종자 생산된 항체의 경우에, 정확하게 칭량된 개별 종자 (대두 또는 아라비돕시스)를 파쇄한 후 완전한 균질성을 보장하기 위해서 먼저 적은 부피로 농축된 프리믹스를 만들고 그 이후에 더 많은 돼지 사료로 희석하여 실험 사료를 제조하는 2 단계로 기본 돼지 사료와 혼합하였다 (표 2). 종자는 나이프-밀 (Retsch Grindomix GM200)을 사용해 분쇄시켰는데 그 전에 종자와 분쇄 챔버를 드라이 아이스로 냉각시켰다. 각 실험 전반에서 모든 그룹의 비례 영양을 유지시키기 위해, 아마 종자를 사용해 아라비돕시스 종자를 대체하였다 (표 2). 유사하게, 추가의 대두 단백질을 채우기 위해서, 야생형 대두 종자가 IgA-생산 대두 종자와 동일한 비율로 대두-IgA 그룹 이외의 다른 그룹에 첨가되었다 (표 2).
표 2: 사료 배합물. 별표 (*)는 각 생산 뱃치의 동결 건조 슬러리 (여과, 완충제 교환된 피키아 배지 및 자돈 사료로 제조)의 4개 뱃치로부터 모은 건조 피키아 믹스의 총 중량을 의미한다. 총 사료 내 포함 백분율은 괄호에 표시된다.
Figure pct00002
피키아:
ELISA-기반 동등성 시험 (도 2)에 따라서, 1 mL의 피키아 추출물이 1 mL의 추출 완충액에 가용화시킨 5 mg의 VHH-IgAFc-생산 아라비돕시스 종자 분말과 등가였다. 이 비율을 기반으로, 10일 동안, 6마리 자돈을 위한 5 mg 피키아 생산 VHH-IgAFc 용량을 위한, 필요량의 30 L의 피키아 배지를 생산하였다. 30 L의 피키아 배양은 상기 기술된 바와 같은 표준 발현 프로토콜 (BMGY 배지에서 48시간 성장 후 BMMY 배지에서 48시간의 유도)에 따라서, 7.5 L의 4개 뱃치를 매주 작업으로 만들었다. 각 작업 종료 시에, 배양 배지를 원심분리를 통해 회수하였고, 세포 무함유 상청액을 투석여과를 통해 2 - 1.5 L로 농축시켰고 그 이후에 5 kDa OmegaTM centramate 필터 카세트에 맞춰진 CentramateTM 500 S 접선 유동 여과 시스템 (Pall Life Science)을 사용하여, 18.75 mM NaCl과 인산나트륨 완충액 (pH 6)으로 완충액 교환하였다. 각각의 4개 뱃치의 종료시에 수득된, 피키아 생산 VHH-IgAFc를 함유하는 최종 ∼2-1.5 L 단백질 용액에, 동일 무게의 시판 돼지 사료를 첨가하였고 임의의 거품 발생을 피하기 위해 핸드-헬드 패들을 사용해 혼합하였으며, 슬러리를 47시간 동안 동결 건조를 사용해 동결건조시켰다 (Epsilon 2-10 D LSC- Martin-Christ, Germany). 피키아 프리믹스라고 하는, 4개 뱃치의 최종 건조 분말은 총 5.368 Kg이었고, 이어서 이것을 돼지 사료와 혼합하여 18 Kg의 최종 피키아 생산 VHH-IgAFc 보유 사료를 생성시켰다 (표 2).
통계 분석:
SAS (윈도우 7용 SAS 시스템의 버전 9.4 64bit. Copyright ⓒ 2002-2012 SAS Institute Inc. Cary, NC, USA, www.sas.com)로부터의 혼합 절차를 사용하여 1일부터 10일까지 매일 측정된 log10 형질전환 박테리아 계측치를 모델화하는데 선형 혼합 모델을 사용하였다. 박테리아 발산량에 대한 검출 한계치가 분변 그램 당 2 (Log10)이었으므로, 결손 데이타는 박테리아가 검출되지 않았을 때 1.9 (log10)의 값에 귀속시켰다. 잔차의 변량-공변량 매트릭스에 대한 몇몇 구조가 포화 평균 모델을 기반으로 검정되었다 (즉, 모든 독립 변수를 범주형 변수로 간주하고 모든 상호작용 효과를 포함). 비구조화, 혼합 대칭, 자기회귀 및 밴디드 토플리츠의 몇몇 구조가 검정되었다. 최고 구조는 AIC 값을 기반으로 선택되었다. 모델의 고정 효과 부분은 사료 그룹과 일수의 주요 효과 및 그들 상호작용 항을 포함하였다. 고정 효과의 검정을 위한 분모 자유도를 계산하기 위해 켄워드-로저 (Kenward-Roger) 근사값이 SAS에서 실현되는 대로 적용되었다. 부분 F-검정이 매일 plm 절차를 사용해 계산되었다. 부분 F-검정이 5%의 유의한 수준에서 유의한 날들에, 쌍별 비교를 수행하였다. 통계적 유의성은 왈드 (Wald) 검정으로 계산하였고 각 날에 터키 (Tukey) 방법을 사용해 다중 비교를 위해 조정하였다. 잔여 진단은 신중하게 조사되었다.
2. 피키아 파스토리스에서 생산된 인간 IL-22와 IgAFc 융합체의 평가
재료:
재조합 쥐과 TNF (mTNF)는 이. 콜라이에서 인-하우스로 생산하였고 9.46 Х 107 IU/mg)의 비활성을 가졌다.
동물:
A20 조건부 넉아웃 마우스 (A20IEC-KO)는 Geert van Loo 교수로부터 얻었다. A20IEC-KO 마우스는 장 상피 세포 (IEC)에서 A20이 결핍되어 있다 (Vereecke, L. et al. (2010) J. of Experimental Medicine 207, 1513-1523). 실험을 위해서, 오직 암컷 8-12주령 마우스만을 사용하였다. 마우스는 VIB 감염 연구 센터 (IRC)에서 특이적 병원체-무함유 시설의 개별 환기 케이지에서 사육하였다. 마우스에 대한 모든 실험은 기관, 국가 및 유럽 동물 법령에 따라서 수행하였다. 동물 프로토콜은 겐트 유니버시티의 윤리 위원회가 승인하였다.
사료:
표준 분말 마우스 사료 (ssniff®R/M-H Complete feed - Maintenance)를 Bio-Service (The Netherlands)에서 구매하였다. IL-22 함유 사료를 제조하기 위해서, 각각의 개별 IL-22 형태를 함유하는 배양 상청액을 투석여과를 통해서 농축시켰고 이후에 5 kDa OmegaTM centramate 필터 카세트에 맞춰진 CentramateTM 500 S 접선 유동 여과 시스템 (Pall Life Science)을 사용하여 18.75 mM NaCl과 인산나트륨 완충액 (pH 6)으로 완충액 교환하였다. 각각의 형태의 경우에, 농축물로 생활성을 결정하였고 각 형태의 부피는 농축물 mL 당 동일한 양의 생활성을 얻도록 설정되었다. 사료와 혼합하기 위해서, 동일한 무게의 표준 분말 설치류 사료를 IL-22 함유 농축물에 첨가하여 혼합하였다. 이후에, 슬러리를 47시간 동안 냉동 건조 (Epsilon 2-10 D LSC- Martin-Christ, Germany)를 통해서 동결건조시켰다. 이후에 최종 건조 분말을 피키아 설치류 프리믹스라고 한다.
시험관내 시험:
생산 배지 중에서 상이한 IL-22 형태의 생활성을 시험하기 위해서, 배지를 샘플채취하였고 생물-어세이를 수행하기 전에 멸균 PBS로 희석하였다. 건조 사료 중에서 상이한 IL-22 형태의 생활성의 유지를 시험하기 위해서, 사료를 1:1 (v/v)로 PBS에 용해시켰다. 다음으로 슬러리를 13.000 g에서 원심분리시켰다. 상부 수층을 새로운 튜브로 옮기고 저-단백질 결합 0.22 μm 시린지 필터 (Millipore)를 사용해 필터 멸균하였다. 이어서 여과물은 생물-어세이를 수행하기 전에 멸균 PBS에 희석하였다.
인간 Colo-205 결장 암종 세포를 ATCC (American Type Culture Collection)에 주문하여 데이타시트에 제공된 가이드라인에 따라 배양하였다. 간략하게, 세포주는 37℃, 5% CO2 에서 10% 태아 소 혈청 (FBS)가 보충된 RPMI1640 (Gibco)에서 반부착성 세포로서 배양하였다. 계대를 위해서, 현탁 성장된 세포를 수집하였고 부착성 세포는 표준 조직 배양 절차에 따라 트립신 처리하였다.
Colo-205 어세이를 사용하여 IL-22의 생물활성을 결정하기 위해서, 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 3.0 Х 105 세포/mL (100 ㎕/웰)로 접종하였다. 세포를 IL-22 함유 분획의 희석 연속물로 세포를 자극하기 전 24시간 동안 적응시켰다. 모든 자극은 밤새 진행되게 하였다. 대조군으로서, 상업적으로 입수가능한 재조합 hIL-22 (담체-무함유) 생산 이. 콜라이 (BioLegend)의 희석 연속물을 사용하였다. 다음 날에, 플레이트를 400 g, 10분, 4℃로 원심분리시켰고 상청액을 수집하였다. 상청액은 hIL-10 DuoSet ELISA (R&D systems)를 사용하여 IL-10에 대해 어세이되었다. 데이타는 GraphPad Prism 6에서 분석하였다. 비활성은 EC50 를 결정하기 위해 사용된 용량-반응 곡선을 기반으로 결정하였다.
실험 모델:
IL-22의 보호 효과를 시험하기 위해서, C57BL/6 A20IEC-KO 마우스 (그룹 당 n=8)는 20 ㎍, 10 ㎍, 5 ㎍, 1 ㎍ 당량의 각각의 IL-22 형태를 함유하는 10 mL/kg의 액체 식이 (200 ㎕와 등가량) 또는 대조군으로서 IL-22가 없는 당량의 사료를 위관영양시켰다.
실험적 대장염을 유도시키기 위해서, 위관영양 후 1시간에 마우스에게 250 ㎍/ kg의 치사량 이하 용량의 mTNF를 복강내 (i.p.) 투여하였다. 대조군 마우스 (모의군)은 당량 부피의 0.9% NaCl을 i.p 주사하였다. 체온 및 생존은 매 시간 모니터링하였다. 병행 실험으로, 마우스는 조직학적 분석 및 캐스파제 활성 어세이를 위해 4시간 후에 안락사시켰다.
조직학:
사후, 전체 결장을 맹장에서부터 항문까지 제거하였고, 결장 길이를 염증에 대한 마커로서 측정하였다. 측정 후에, 장의 일부를 제거하여 4% 파라포름알데히드 (PFA)에 고정시켰다. 파라핀 포매 및 절단 후에, 조직은 조직학적 검사를 위해 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 아폽토시스는 TUNEL 염색을 위해 원위치 세포 사멸 검출 키트 (Roche)를 사용하여 형광 현미경을 통해 분석하였다.
혈청 분석:
혈청 프로염증성 사이토카인 IL-6 및 MCP-1은 각각 마우스 IL-6 DuoSet ELISA 키트 (R&D Systems) 및 마우스 CCL2/JE/MCP-1 DuoSet ELISA 키트 (R&D Systems)를 사용하여 혈청에서 결정하였다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성 (ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 활성 (AST)은 Hitachi 747 분석기 (Diagnostica, Boehringer Mannheim) 상에서 통상의 광도측정 시험으로 분석하였다.
결과:
모의 처리된 A20IEC-KO 마우스는 고통에 대한 임의의 표현형적 징후를 보이지 않았다. 대조적으로, TNF-주사를 받은 마우스는 주사후 2시간 만에 저체온증 및 중증 설사를 포함한, TNF 독성의 명확한 징후를 보인다. 또한, TNF의 주사 후 5시간 내지 9시간 사이에, 마우스는 폐사되기 시작한다. IL-22 함유 사료 (IL-22 IgAFc 또는 IL-22)만을 위내 치료받은 마우스는 경미한 체온 감소를 보이고 설사가 발생되지 않는다. 게다가, 임의의 IL-22 형태로 치료된 마우스는 TNF-접종 후 폐사되지 않는다.
조직학적으로, 오직 TNF로 처치되고 IL-22를 받지 않은 마우스는 창자움-융모 구조의 거의 완전한 소실 및 광범위한 상피 손상을 특징으로 하는, 회장 및 공장에 심각한 손상을 갖는다. 대조적으로, 임의의 IL-22 형태를 받은 마우스는 임의 손상 징후를 보이지 않아서, 분명하게 장벽 무결성을 유지한다. 세포 수준에서, TUNEL 염색은 IL-22 치료 후 부재하는 반면, TNF-단독 처치된 마우스에서, 이미 탈착되어 장 내강에서 발견되는 세포뿐만 아니라 아폽토시스 세포가 융모의 상피 내층에도 매우 풍부하다.
우리는 프로염증성 사이토카인 IL-6 및 MCP-1을 측정하여 전신 효과를 더욱 평가한다. 둘 모두의 수준은 대조군 마우스 및 IL-22 형태를 받는 마우스의 경우에 비슷한데 반해서, TNF-단독 처치되고 IL-22를 받지 않은 마우스는 Il-6 및 MCP-1 수준이 증가되었다. 또한, 우리는 TNF가 또한 간 생리에 영향을 미친다고 보고되었기 때문에 간 트랜스아미나제 수준 (AST 및 ALT)을 역시 평가한다. 실제로, TNF로 처치된 마우스는 혈청 중 AST 및 ALT의 수준이 증가된데 반해서 IL-22 처치된 마우스는 이를 보이지 않는다.
실시예 2의 재료 및 방법
균주, 배지 및 시약
에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) (이. 콜라이) MC1061 또는 DH5α를 표준 분자 생물학 조작을 위해 사용하였다. 플라스미드 전파를 위해서, 이. 콜라이는 적절한 항생제: 50 ㎍/mL 카르베니실린 (Duchefa Biochemie), 50 ㎍/mL 카나마이신 (Sigma Aldrich), 50 ㎍/mL 하이그로마이신 B (Duchefa Biochemie) 또는 50 ㎍/mL Zeocin® (Life Technologies)가 보충된 LB 액체 배지 (0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤, 및 0.5% NaCl)에서 배양하였다. 모든 PCR 반응은 Phusion 고신뢰성 중합효소 (NEB)를 사용하여 수행하였다. PCR 시약 예컨대 dNTP 및 프라이머는 각각 Promega 및 IDT에서 주문하였다.
피키아 파스토리스 NRRL-Y 11430 균주 (코마가타엘라 파피와 동의어)는 A. Glieder (Technische Universitat Graz, Austria)로부터 제공받았다. 이 균주를 야생형이라고 한다. 효모 배양은 액체 YPD (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% D-포도당) 또는 고체 YPD-한천 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% D-포도당, 2% 한천)에서 성장되었고, 적절한 항생제: 100 ㎍/mL Zeocin®, 500 ㎍/mL 제네티신/G418 (Life Technologies) 또는 300 ㎍/mL 하이그로마이신 B를 사용하여 선별하였다. 박토 효모 추출물, 박토 트립톤, 박토 펩톤, 박토 한천 및 YNB (Yeast Nitrogen Base)는 Difco (Beckton Dickinson)에서 구매하였다.
단백질 발현을 위해서, 배양물을 BMGY (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM KH2PO4/K2HPO4, 1.34% YNB, 1% 글리세롤, pH 5.5) 중에 진탕 인큐베이터 (28℃, 225 rpm)에서 성장시켰다. 단백질 발현의 유도를 위해서, 세포를 1% MeOH를 함유하는 BMMY (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100 mM KH2PO4/K2HPO4, 1.34% YNB, pH 5.5)로 전환시켰다. 유도를 유지시키고 증발을 보상하기 위해서, 배양물은 8-12시간 마다 1% MeOH을 섞어주었다. 유도 종료 시에, 배양물은 원심분리 (1.500 g, 4℃, 10분)를 통해서 회수하였다. 샘플은 즉시 분석하거나 또는 -20℃에 저장 전에 액체 질소에서 스냅-냉동시켰다.
hIL-22 발현 벡터의 구축
성숙한 인간 인터루킨-22 (hIL-22, UniProtKB 수탁번호 Q9GZX6, 잔기 34-179)의 오픈 리딩 프레임은 Genscript의 전매 알고리즘을 사용하여 피. 파스토리스에서 발현을 위해 코돈 최적화시켰고 합성적으로 주문하였다. hIL-22 코딩 서열은 EA-반복부를 포함하지 않고, pKai61EA-yEGFP 발현 벡터에 에스. 세레비지아에 α-메이팅 인자와 인프레임으로 클로닝하였다 (Schoonooghe S et al (2009) BMC Biotechnology 9, 70). 최종 발현 벡터 pKai-hIL22는 강력한 메탄올-유도성 AOX1 프로모터의 제어 하에 hIL-22 이식유전자를 함유하고 박테리아 및 효모 둘 모두에서 선별을 위해 Zeocin® 내성 마커를 갖는다.
대안적인 분리 신호로서, 에스. 세레비지아에 Ost1 서열 (Fitzgerald I and Glick BS (2014) Microbial cell factories 13, 1)은 프라이머 Ost1SaccharopAOX1Fw 및 Ost1SaccharoRv를 사용하여 에스. 세레비지아에 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다.
hIL-22-hIgA_Fc-6xHis 발현 벡터의 구축
모든 구성체는 모듈식 클로닝 전략 (MoClo)을 적용하는 것을 사용하여 클로닝하였다. 이 시스템은 에스. 세레비지아에 (Lee ME et al (2015) ACS Synth Biol 4, 975-986)를 위해 개발되었지만 피키아에서 사용을 위해 인-하우스에서 개조하였다. 간략하게, MoClo 시스템은 바람직한 구성체의 개별 '파트'를 서브클로닝하기 위해 표준화된 진입 벡터를 사용하였다. 이들 벡터 내 각 파트는 별개의 II형 제한효소 부위가 측접된다. 단일 반응으로 진입 벡터를 모으고 연속 제한 효소 분해 및 T4 결찰 반응을 수행하여, 상용성 말단을 갖는 파트는 원형 플라스미드로 조립되어 결찰될 수 있게 하여 최종 발현 벡터를 산출한다. 모든 진입 벡터는 등몰량 (∼20 펨토몰)의 증폭된 단편 및 MoClo 진입 벡터 pYTK001 또는 합성되었지만 동일한 벡터 pPTK081를 모아서 생성시켰다. 표준 모듈식 클로닝 ("MoClo") 프로토콜을 사용하였고 II형 제한 효소 BsmBI (1U;NEB), T4 리가제 (1U;NEB) 및 10x T4 리가제 완충액 (NEB)을 모은 서열에 첨가하는 것을 특징으로 한다. 2분 동안 42℃ 및 5분 동안 16℃의 24회 사이클을 PCR 사이클러에서 수행하였고, 그 다음으로 10분 동안 50℃에서 최종 분해 단계 및 추가 10분 동안 80℃에서 열 변성 단계를 후속한 후에, 무기한으로 12℃에서 유지시킨다. 최종 벡터를 이. 콜라이 MC1061 컴피턴트 세포에 도입시킨 후 LB 클로람페니콜 배지 상에 플레이팅하였다. pYTK001/pPTK081 수령 진입 벡터는 GFP 드롭아웃 카세트를 특징으로 하므로, 녹색-흰색 스크리닝은 녹색 거짓 양성 클론으로부터 (올바른) 플라스미드를 함유하는 콜로니를 구별할 수 있게 하였다. 플라스미드를 단리하였고 관심 서열은 프라이머 PP001 및 PP002를 사용하여, 생어 (Sanger) 서열분석을 통해 검증하였다.
IgA의 불변 도메인과 hIL-22 융합체 구성체 (PAOX1-hIL-22-hIgA_Fc-6xHis)를 조작하기 위해서, α-MF/Ost1/pre-hIL-22 서열은 MoClo 시스템과 상용성인 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭되었다. hIgA 서열에 hIL-22 서열의 N-말단 융합체를 만들기 위해서, 완전한 α-MF-hIL-22 CDS, Ost1-hIL-22 CDS 및 pre-hIL-22 CDS는 MoClo 시스템 내에서 3a 파트 또는 N-말단 태그로서 간주되었다. 유사하게, IgA의 불변 도메인 (인간, 마우스 및 돼지)은 관심 유전자 또는 3b 파트로 간주하였다.
α-MF-hIL-22, Ost1-hIL-22 또는 pre-hIL-22를 보유하는 MoClo 진입 벡터는 모두 주형으로서 상기에 언급된 pPpT4_Alpha_S 발현 벡터를 사용하여, 초기 PCR 증폭을 통해 생성되었다. α-MF-hIL-22 및 pre-hIL-22 서열 둘 모두는 프라이머 IL-22forentryfw 및 IL-22forentryrv를 사용하여 증폭시킨 한편 Ost1-hIL-22 서열은 프라이머 IL-22ost1forentryfw 및 IL-22forentryrv를 사용하여 증폭시켰다. PCR 단편을 BsmBI 제한효소 분해 및 T4 결찰을 통해서 pYTK001/pPTK081에 도입시켰다.
인간 IgA (호모 사피언스 (Homo sapiens), UniproKB: P01877) 및 마우스 IgA (무스 무스쿨러스 (Mus musculus), UniprotKB: P01878)의 Fc 영역의 서열은 피. 파스토리스에서 발현을 위해 코돈 최적화되었고 IDT에서 gBlocks로서 합성으로 주문하였다. 다음으로 인간 및 마우스 IgA gBlocks는 프라이머 IgAforentryfw 및 IgAforentryrv 또는 IgAmouseforentryfw 및 IgAmouseforentryrv를 사용하여 증폭시켜서, 모듈식 클로닝을 가능하게 하였다. 돼지 IgA (수스 스크로파 (Sus scrofa), UniprotKB: K7ZRK0)의 Fc 영역은 프라이머 IgApigforentryfwcorrect 및 IgApigforentryrvnew를 사용하여 이전에 생성된 EV2A 벡터로부터 증폭되었다 (Virdi V et al (2013) PNAS 110, 11809). 모든 IgA 서열은 MoClo 시스템의 '파트 3b'로서 pYTK001/pPTK081 벡터에 클로닝하였다.
다음으로 진입 벡터는 MoClo 시스템을 사용하여 발현 벡터를 생성시키기 위해 사용되었다. 각각의 발현 벡터는 등몰량 (∼20 펨토몰)의 하기 파트 (Addgene에서 입수가능하거나 또는 입수가능할것임)를 모아서 생성시켰다:
파트 1 조립 연결인자: CONLS
파트 2 프로모터: PAOX1/PCAT1
파트 3a N-말단 태그: α-MF-prepro/α-MF-pre/Ost1 - hIL-22
파트 3b 관심 유전자: hIgA/mIgA/pIgA
파트 4a C-말단 태그: 6xHis/6xHis-HDEL
파트 4b 말단인자: AOX1TT
파트 5 조립 연결인자 CONRE
파트 6 효모 마커 스터퍼 (제오신 내성이 박테리아 및 진균 둘 모두에서 작용하므로)
파트 7 다양한 부분 스터퍼
파트 8 이. 콜라이 마커 + ORI ZeoR + ColE1
실시예 2에서 사용된 프라이머:
Figure pct00003
Figure pct00004
3. 피키아 생산 VHH-IgA-Fc 융합체의 상이한 건조 과정에 의한 식용 제제들의 생체 내 효능 비교
경구 및 위 안정성은 VHH-IgAFc와 같은 생물치료제가 위장관 내에서 유효하기 위해 다른 무엇보다도 중요하다. (분자 수준에서) 항체를 둘러싼 매트릭스 및 건조 과정은 소화관 내에서 분해되어 비효과적으로 되는 것으로부터 VHH-IgAFc 항체를 보호하는데서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 여기서 우리는 F4-ETEC 감염을 청소하는데서, 사료 매트릭스 (실시예 1 참조)와 함께 동결건조되거나 또는 사료 매트릭스없이 동결 건조된, 차별적으로 건조된 피키아 생산 VHH-IgAFc의 생체내 효능에 대한 효과를 평가하는데 착수하였다. 또한, 우리는 열을 포함한 대안적인 원리를 기반으로, 분무 건조 과정을 평가하고, 여기서는 말토덱스트린이 매트릭스/담체로서 사용되었다. 피키아 생산 항-F4-ETEC VHH-IgAFc (V2A 및 V3A)의 3가지 차별적으로 처리된 사료 제제는 자돈 당 1일 0.5 L의 발효물 또는 5 mg VHH-IgAFc/일/자돈과 당량인, 동일 용량으로 구성되었다. 제4 그룹은 사료에 VHH-IgAFc 항체 없이 투여받았고, 음성 대조군으로서 제공되었다. 24마리의 F4-ETEC 혈청반응 음성 및 F4-ETEC 감염에 대한 감수성과 상관있는, muc-13 유전자 검사 양성 자돈을 선택하여, 이유하였고, 각각 6마리 자돈의 4개 그룹으로 사육하였다. 이들 자돈은 고형식에 적응되도록 하였고, 그 이후에 그들이 그룹 특이적 실험 사료를 접하게 하였다 (도 4A 참조). 실험 사료는 10일 동안 제공되었고, 제3일 경에 모든 자돈은 연속 2일 (0일 및 1일) 동안 1010 F4-ETEC 박테리아를 접종받았다. 사료 제제에 반응하는, 감염의 최종 효과는 12일까지 날마다 발산된 접종 균주의 콜로니 형성 유닛 (CFU)을 분변에서 분석하여 모니터링하였다 (도 4B 및 표 3 참조).
표 3: 각 자돈에 대한 분변 그램 당 F4-ETEC (Log10) CFU 의 일일 발산량
Figure pct00005
주: log (10) CFU 검출 한계는 2이고, 대시 기호 (-)는 박테리아가 검출되지 않았음을 표시한다.
주: 자돈 2 및 자돈 9는 사후 검사 동안 발견된 거대한 위궤양으로 인해 각각 -5일 및 2일에 폐사하였다.
음성 대조군 그룹의 모든 자돈은 1일 및 2일의 높은 CFU의 F4-ETEC를 발산하였고, 그 발산량은 3일까지 자돈의 적어도 절반에서 유지되었다. 항체 수용 그룹에서 전체 발산량은 낮았다. 도 4B는 6일까지 각 그룹의 평균 발산량 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 도시하고, F4-ETEC 감염을 예방하는, 3종의 피키아 생산되고 차별적으로 처리된 VHH-IgA-Fc 융합체 함유 식이의 효능 경향을 반영한다. 이들 데이타는 동결 건조 과정의 돼지 사료로서 또는 분무 건조의 말토덱스트린으로서의 매트릭스가 생체내에서 더 높은 효능에 기여한다는 것을 보여준다. 혈청 항-ETEC IgG (도 4C 참조) 및 IgA (도 4D 참조) 수준은 사료 매트릭스 제제상에서 동결-건조를 수용한 그룹에서 최저였고, 이는 발산 결과를 확증해 준다. 전체적으로, 변이는 혈청전환을 그룹 내에서 관찰된 개별 자돈이다, (도 4C 및 4D의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냄).
실시예 3의 재료 및 방법
피키아 생산 VHH-IgA-Fc 기반 사료 제제
실시예 1, 접종 실험에서 적용된 항-ETEC VHH-IgAFc의 효율적인 용량은 약 5 mg VHH-IgAFc 또는 보다 적절하게, 1일 자돈 당 0.5 L의 진탕 플라스크 성장된 배양물로부터의 건조 생성물을 보유하는 사료 제제였다. 이 용량은 동일 부분의 2종 항-F4-ETEC VHH-IgAFc 즉, V2A 및 V3A로 구성되었다 (Virdi et al (2013) 110, 29, 11809-11814 참조). 피키아 생산 VHH-IgAFc를 수용하는 18마리 자돈 (각 3개 그룹에 6마리씩)을 위한 유사한 용량을 제조하기 위해서, 45 L의 각각 V2A 및 V3A (총 90 L) 발현 피키아 배양물을 진탕-플라스크에서 성장시켰다. 이것은 하기 표 5에 요약한 대로 6개 뱃치로 생산하였다 (5일의 긴 과정 동안, 실시예 1에서 처럼, BMGY 배지에서 48시간 성장 후 BMMY 배지에서 48시간의 유도). 따라서 주 당 15L 배양 뱃치를 생산하였다. 각 작업의 종료 시에, 배양 배지는 원심분리를 통해서 회수하였다. 세포 무함유 상청액은 투석여과를 통해서 1 L로 농축시켰고 이후에 5 kDa OmegaTM centramate 필터 카세트가 맞춰진 CentramateTM 500 S 접선 유동 여과 시스템 (Pall Life Science)을 사용하여 인산나트륨 완충액 (20 mM Na2HPO4, 18.75 mM NaCl, pH 6)으로 완충액 교환하였다. 각각 6개 뱃치의 종료시에 수득된, 투석유물이라고 하는 피키아 생산된 VHH-IgAFc를 함유하는 최종 1 L의 투석유물 단백질 용액 (표 4)을 하기와 같이 3가지 특별한 방식으로 건조하였다.
표 4: 개별 실험 사료를 제제화하기 위한, 피키아 생산된 VHH-IgA-Fc의 각 배치의 건조 과정
Figure pct00006
방식 1: 매트릭스와 동결 건조 (실시예 1과 유사): VHH-IgAFc V2A (뱃치 1, 표 5) 또는 V3A (뱃치 2, 표 4)를 보유하는 1리터의 투석유물을 임의의 거품 형성을 피하기 위해 핸드 헬드 패들을 사용하여 1 킬로그램의 시판 자돈 사료 (공급처: Van Huffel, 9850 Poesele (Nevele) Belgium)와 혼합하였고, 슬러리를 동결 건조기 (Epsilon 2-10 D LSC- Martin-Christ, Germany)를 사용하여 47시간 동안 동결건조시켰다. 각각 VHH-IgA-Fc V2A 및 V3A를 함유하는 2개의 동결 건조 뱃치 (대략 각각 1 kg)의 각각의 최종 건조 분말을 돼지 사료와 혼합하여 18 kg의 최종 피키아 생산된 매트릭스 상에서 동결 건조된 VHH-IgAFc 보유 사료를 얻었다 (표 4).
방식 2: 매트릭스없이 동결 건조: VHH-IgAFc V2A (뱃치 3) 또는 V3A (뱃치 4)를 보유하는 1 리터의 투석유물을 동결 건조기 (Epsilon 2-10 D LSC- Martin-Christ, Germany)를 사용하여 47시간 동안 동결건조시켰다. 각각 VHH-IgAFc V2A 및 V3A를 함유하는 2개의 동결 건조 뱃치 (각각 ∼30 그램)의 최종 건조 분말을 돼지 사료와 함께 혼합하여 18 Kg의 최종 피키아 생산된 매트릭스없이 동결 건조된 VHH-IgAFc 보유 사료를 얻었다 (표 4).
방식 3: 분무 건조: VHH-IgAFc V3A (뱃치 5, 표 4)를 보유하는 1 리터의 투석유물 및 VHH-IgAFc V2A (뱃치 6, 표 5)를 보유하는 다른 1 리터의 투석유물을 2.5 kg의 말토덱스트린을 함유하는 23 L의 인산나트륨 완충액 (20 mM Na2HPO4, 18.75 mM NaCl, pH 6)과 혼합하였다. 총 25 L의 액체는 5-7분 동안 산업적 블렌더를 사용해 완전히 혼합한 후, 분무-건조기에 공급하였으며, 매개변수는 공급 액체의 45℃ 예열, 및 170℃의 입구 공기 온도로 설정되었다. 건조 과정 동안, 평균 출구 공기 온도는 약 80℃였고, 일정한 액체 펌핑 속도를 유지하였다. 대략 2.3 kg의 건조된 V2A 및 V3A 보유 분말을 회수하였고, 돼지 사료와 함께 혼합하여 18 Kg의 최종 피키아 생산되고 분무-건조된 VHH-IgAFc 보유 사료를 얻었다 (표 4).
인산염 완충 염수에 가용화시키고 ELISA로 평가시, 사료 상에서 동결 건조 (V2A 뱃치 1, V3A 뱃치 2), 매트릭스없이 동결 건조 (V2A 뱃치 3, V3A 뱃치 4) 및 말토덱스트린과 분무 건조 (V3A + V2A, 뱃치 5 및 뱃치 6)의 각각의 차별적인 건조 과정 작업으로부터의 건조된 VHH-IgAFc (표 5 참조)는 고정된 F4-FaeG 항원과의 결합으로서 기능적 활성인 것으로 관찰되었다.
대조군 사료는 임의의 항원이 없는 18 kg의 기본 사료를 포함하였다. 각각의 18 Kg의 사료 제제를 그룹 당 일일 사료 허용량으로서, 각각 1.8 Kg의 10개 백으로 나누어서, -3일부터 7일까지 자돈을 위한 사료통에 공급하였다 (도 4A).
자돈 접종 실험:
자돈 접종 실험은 벨기에 소재, 겐트 유니버시티의 수의학부의 동물 관리 및 윤리 위원회의 승인으로, 동물 복지에 관한 벨기에 법률에 따라서 수행되었다 (윤리적 문서 번호 EC2017/122). 자돈 (품종: 잡종)은 벨기에, 멜 소재, ILVO의 농장에서 사육되었다 (윤리적 문서 번호 2017/306). 5마리의 초산 모돈은 낮은 유즙 면역을 보장하도로록 F4-ETEC에 대한 부스터 백신은 그만 두었다. 이들 모돈으로부터 태어난 자돈은 F4-ETEC 감염으로부터 보호하기 위해서 생후 격일로, 3회 항생제 (듀파목스 0.1 ml/자돈)를 투여받았다. 또한, 항-F4-ETEC 혈청 역가를 평가하고 F4-ETEC 수용체의 존재와 상관있는 MUC13 유전자형 분석 어세이 (Goetstouwers et al (2014) PLoS One 9, e105013)를 위해서, 생후 15일에 이들 자돈으로부터 혈액을 채혈하였다. 24마리의 혈청반응 음성 및 MUC13 F4-ETEC 감수성 유전자형에 대한 동형접합을 선택하고, 이유하였으며, 접종 실험을 위해 겐트 유니버시티, 수의학과의 돈사로 수송하였다. 자돈은 그들 한배 새끼, 유전자형 및 체중을 기반으로 사육 그룹으로 적절하게 임의추출하였다. 각 그룹의 평균 출발 체중은 8.5 Kg이었다. 자돈은 -12일 및 -11일에 근육내로 항생제-듀파목스 (0.6 ml/자돈)를 투여받았고; 한편 바이트릴 (0.25 ml/자돈)은 이동 후 박테리아 감염의 우발 사태를 방지하기 위해 -8일, -7일 및 -6일에 투여되었다. 이전에 기술된 대로 접종을 수행하였다 (Virdi et al (2013) Proc Nat Acad Sci USA. 110, 29, 11809-11814). 간략하게, 자돈은 60 ml의 중탄산염 완충액 (증류수 중 1.4% NaHCO3 w/v)으로 위 pH의 중화 후, 진정 (1 ml 아자페론, Stressnill® Janssen Animal Health) 하에 위내 삽관을 통해서, 1010 F4-ETEC 박테리아 (균주- GIS26Rstrep)를 연일 접종시켰다. 접종 제1일을 시간선에서 0일로 간주한다 (도 4A). 항체를 함유하는 사료는 접종 전 3일에 시작하여, 10일의 기간 동안 투여되었다 (도 4A). 분변 샘플을 접종일로부터 12일까지 채취하여 스트렙토마이신 선별 (1 mg/ml)을 통해 혈액 한천 플레이트 상에서, F4-ETEC 접종된 균주 GIS26Rstrep 의 발산량을 모니터링하였다. 혈액 샘플을 채취하여 -15일 (이유일), -4일, 7일에 F4-ETEC 특이적 IgG, 및 IgA 역가를 모니터링하였다. 동물에 대한 특별한 샘플 채취 및 조작은 개략적으로 도 4A에 도시되어 있다.
<110> VIB VZW UNIVERSITEIT GENT <120> MEANS AND METHODS FOR ORAL PROTEIN DELIVERY <130> NiCa/DRY/579 <150> EP 1715847.1 <151> 2017-02-28 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ctctctcgag aagagagagg ccgaagctca ggtgcagctg c 41 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cctcttgagc ggccgccctt tagtagcata tgccttctg 39 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gcatcgtctc atcggtctca tatgagattc ccatctattt tcaccgct 48 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 atgccgtctc aggtctcaag aaccaataca agcgttacgc agagaca 47 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcatcgtctc atcggtctca ttctgtgccg tgcccggtgc cg 42 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atgccgtctc aggtctcagg atccatagca ggtgccatcc acttccgcca 50 <210> 7 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 atgcggccgc ttatcacaac tcgtcgtgaa tacaagcgtt acgcagagac at 52 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 acaactaatt attgaaagaa ttccgaaacg atgaggcagg tttggttctc 50 <210> 9 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 atccagacga caatgagaag aaattggagc agcagaagac acgttgaaaa aac 53 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cgtttcggaa ttctttcaat aattagt 27 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gctccaattt cttctcattg tcgt 24 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 agccaatgca gaggaggc 18 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gcatcgtctc atcggtctca ttctgtgccg tgcccggtgc cg 42 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 atgccgtctc aggtctcagg atccatagca ggtgccatcc acttccgcca 50 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gcatcgtctc atcggtctca tatgagattc ccatctattt tcaccgct 48 <210> 16 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 atgccgtctc aggtctcaag aaccaataca agcgttacgc agagaca 47 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gcatcgtctc atcggtctca tatgaggcag gtttggttct cttgg 45 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gcatcgtctc atcggtctca ttcttgttct ggtccaacac caccaccacc 50 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 atgccgtctc aggtctcagg atccatagca aataccgtcg ccctcactca taatcacaga 60 60 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ctcagatcca tgtcctcagt gct 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gaggcagaag gcatatgcta c 21 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 atgccgtctc aggtctcagg atccgtagca tatgccttct gcctc 45 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gcatcgtctc atcggtctca ttctgatcca tgtcctcagt gctgc 45

Claims (17)

  1. 재조합 진균의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자를 포함하는 건조 제제로서, 상기 진균은 상기 배양 배지로 분비되는 Fc 도메인에 융합된 외생성 폴리펩티드를 생산하는 것인 건조 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgA Fc 도메인인 건조 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Fc 도메인에 융합된 외생성 펩티드는 예방적 또는 치료적 펩티드이거나 또는 상기 외생성 펩티드는 백신이거나 또는 백신의 일부를 형성하는 것인 건조 제제.
  4. 재조합 진균 숙주 예컨대 사상 진균 또는 효모 세포의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대 분자를 경구 허용 매트릭스에 첨가한 후에, 얻어진 혼합물을 건조하여 수득되는 건조 제제로서, 상기 배양 배지는 상기 재조합 숙주에 외생성인 분비된 폴리펩티드를 포함하는 것인 건조 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 외생성 폴리펩티드는 Fc 도메인, 특히 IgA Fc 도메인에 융합되는 것인 건조 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 건조는 재조합 진균 세포의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자 및 또는 경구 허용 매트릭스를 분무 건조하여 수행되는 것인 건조 제제.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 건조는 재조합 숙주의 배양 배지에 존재하는 5 kDa을 초과하는 다수의 거대분자 및 경구 허용 매트릭스의 동결건조에 의해 수행되는 것인 건조 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 사용을 위한 것인 건조 제제.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 건조 제제 및 약학 부형제를 포함하는 경구 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 위장 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인 건조 제제 또는 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 구강 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인 건조 제제 또는 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한 것인 건조 제제 또는 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 건조 제제를 포함하는 식품.
  14. 제13항에 있어서, 기능성 또는 의약 식품인 식품.
  15. 제1항 내지 제7항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 IL22 IgA Fc-융합체인 건조 제제 또는 약학 조성물.
  16. 진균 생산된 IgAFc 융합체 단백질을 포함하는 경구 약학 조성물로서, IgAFc와 융합된 단백질은 면역글로불린 단일 가변 도메인인 경구 약학 조성물.
  17. 경구 투여로 사용을 위한 N-글리칸 및/또는 O-글리칸으로 변형된 진균 생산된 단백질로서, 당단백질 분자량의 적어도 30%는 상기 N-글리칸 또는 O-글리칸이 기여하는 것인 진균 생산된 단백질.
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