KR20190092314A - 마황 엑기스, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로부터 얻어진 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물과 그 제법 및 용도 - Google Patents
마황 엑기스, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스로부터 얻어진 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물과 그 제법 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 유래의 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물과 그 제법 및 이것을 함유하는 의약 조성물의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract : EFE) 유래의 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물 및 그 제조 방법, 그리고 그 추출 분획물을 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물은 항암약, 항전이약, 동통 억제약, 그리고 항인플루엔자 바이러스약으로서 유용하다.
탄닌은, 식물의 줄기, 껍질, 잎, 열매 등으로부터 추출되는 천연물로, 단백질이나 염기성 화합물 등과 결합하여 난용성으로 하는 성질을 갖는 폴리페놀을 말한다. 일상의 식품, 기호품, 공업용 등으로 사용되는 식물에 함유되어 있다. 탄닌에는, 산이나 효소가 존재할 때 가수 분해되기 쉬운 가수 분해형 탄닌과, 축합이 진행되는 축합형 탄닌이 있다. 가수 분해형 탄닌은 비교적 저분자인 것도 일조하여, 생약 등 많은 식물 재료로부터 단리, 구조 결정이 진행되어, 여러 가지 타입의 것이 알려져 있다. 한편, 축합형 탄닌은 명확하게는 동정되어 있지 않았다. 1989년, Weinges 는 무색의 식물 추출물을 산으로 가열하였을 때에 안토시아니딘을 발생시키는 물질을 프로안토시아니딘이라고 명명하였다. 그리고 구성 성분이 플라반3-올 또는 플라반3,4-디올로 복수의 연결된 플라보노이드 단위로 이루어지는 것을 밝혔다. 종래, 축합형 탄닌이라고 불리고 있던 많은 과실 성분의 실체가 프로안토시아니딘인 것이 밝혀졌고, 프로안토시아니딘에 관한 연구가 많이 이루어져, 프로펠라르고니딘 (Propelargonidin), 프로시아니딘 (Procyanidin), 프로델피니딘 (Prodelphinidin), 프로귀보르티니딘 (Proguibourtinidin), 프로피세티니딘 (Profisetinidin), 프로로비네티니딘 (Prorobinetinidin), 프로테라카시딘 (Proteracacidin), 프로멜라카시딘 (Promelacacidin), 프로아피게니니딘 (Proapigeninidin), 프로루테오리니딘 (Proluteolinidin) 등의 화학 구조 및 약리 작용이 밝혀져 있다. 즉, 프로안토시아니딘은, 각종 식물 중에 존재하는 축합 또는 중합된 탄닌으로, 플라반3-올 또는 플라반3,4-디올을 구성 단위로 하여 축중합된 화합물군이다.
프로안토시아니딘의 화학 구조는, 일반적으로, 플라반3-올 또는 플라반3,4-디올을 구성 유닛으로 하여 4β 위치 → 6 위치, 4β 위치 → 8 위치, 4β 위치 → 8 위치·2β 위치 → O → 7 위치 등의 결합 양식에 의해 중합된 2 량체 이상의 중합체이다 (비특허문헌 1, 2). 결합 양식의 차이로부터 여러 종류로 분류되어 있다. 그 하나는, 2 이상의 플라반3-올 구조가 4β 위치 → 8 위치 또는 4β 위치 → 6 위치를 개재하여 결합되어 있는 프로안토시아니딘 B 타입, 다른 하나는 플라반3-올 구조가 4β 위치 → 8 위치 및 2β 위치 → O → 7 위치 또는 4β 위치 → 6 위치 및 2β 위치 → O → 7 위치의 결합이 적어도 1 개 지점에 존재하는 프로안토시아니딘 A 타입이다 (도 1 참조).
축합형 탄닌은 가수 분해형 탄닌에 비해 분자량의 폭이 넓고, 분자량이 큰 것으로는 약 20,000 에 이른다 (비특허문헌 3).
프로안토시아니딘은 다양한 생리 활성을 나타내는 것이 알려져 있으며, 항 종양, 항염증, 항노화, 항산화, 항알레르기, 항균, 육모 등의 활성이 보고되어 있지만 (비특허문헌 4, 5), 이들 생리 활성과 프로안토시아니딘의 중합도수의 구조 활성 상관에 관해서는, 모두 명확하게 되어 있는 것은 아니다 (특허문헌 1). 특허문헌 2 에서는, 프로시아니딘 A 타입 및 프로시아니딘 B 타입 (카테콜 타입만) 의 단량체 단위의 결합이 C-4, C-8 위치에서 발생하는 구조식이 나타나 있다. 특허문헌 3 에서는, 프로안토시아니딘 A 타입의 중합체, 그리고 프로안토시아니딘 B 타입 (피로갈롤 타입, 카테콜 타입, 단량체 단위의 결합이 C-4, C- 8 위치에서 발생한다) 의 축합체·중합체의 간섬유화 억제 효과가 나타나 있다. 특허문헌 4 에서는, 프로안토시아니딘 B (피로갈롤 타입, 카테콜 타입) 단량체 단위의 결합이 C-4, C-6, C-8 위치에서 발생하여, 프로안토시아니딘을 형성하고, 이것이 우레아제 저해 작용을 갖는 것을 보고하고 있다.
프로안토시아니딘을 함유하는 식물에는, 예를 들어, 사과, 블루베리, 엘더베리, 포도, 스트로베리, 레드커런트, 카우베리, 구스베리, 크랜베리, 서몬베리, 빌베리, 카시스, 체리, 허클베리, 블랙베리, 플럼, 홀틀베리, 보이젠베리, 멀베리, 라즈베리, 로건베리, 감, 소나무, 떡갈나무, 양매, 보리, 밀, 대두, 흑대두, 카카오, 팥, 칠엽수, 피너츠, 은행나무잎, 녹차, 대황, 마황, 양매피 등이 알려져 있다 (특허문헌 5, 6).
마황은 마황과 식물 Ephedra sinica Stapf, Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer 또는 Ephedra equisetina Bunge (Ephedraceae) 의 지상경이다. 마황은 예로부터 사용되어 온 가장 중요한 생약이다. 마황은 일본 약국방에 의해 총 알칼로이드 (에페드린 및 슈도에페드린) 를 0.7 ％ 이상 함유한다고 규정되고, 마황의 약리 작용의 대부분은 에페드린 알칼로이드에서 유래한다고 생각되어 왔다 (비특허문헌 6). 한편, 마황의 부작용인 동계 (動悸), 혈압 상승, 불면, 배뇨 장애 등은, 에페드린 알칼로이드의 중추 신경 및 교감 신경 자극 작용에 의해 발생하지만, 마황의 주작용과 부작용을 분리하는 것은 곤란하다고 생각되어, 마황의 부작용을 없애기 위해, 마황으로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한다는 발상은, 지금까지 없었다.
본 발명자들은, 지금까지의 연구로부터, 마황의 비알칼로이드 획분에 간 세포 증식 인자 (HGF) 수용체 c-Met 키나아제 저해 작용을 통한 항암 항전이 작용이 있는 것을 알아내고, 또한 마황의 비알칼로이드 획분으로부터 헤르바세틴 (Herbacetin) 배당체를 분리하고, 비당 부분의 Herbacetin 에 c-Met 키나아제 저해 작용을 포함하는 멀티키나아제 저해 작용이 있는 것을 밝혔내었다. 그 중에서도, Herbacetin 의 TrkA (NGF 수용체) 저해 작용은 강하고, NGF-TrkA 시그널 저해를 통한 동통 억제 작용을 갖는 것도 알아내었다 (특허문헌 7, 8). 이들 결과로부터, 마황의 약리 작용의 일부는 에페드린 알칼로이드에 의존하지 않고, 따라서 마황으로부터 부작용 성분을 제거할 수 있는 것이 시사되었다. 그래서 마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한 EFE 를 제조한 바 (비특허문헌 7) (특허문헌 9), 동통 억제 작용, 항인플루엔자 바이러스 작용을 포함하는 몇 가지 약리 작용을 갖는 것이나 (특허문헌 9) (비특허문헌 8), 불면, 동계, 흥분 등의 부작용이 소실되어 있는 것이 밝혀졌다 (비특허문헌 9). 그러나, 마황 엑기스는 물론, EFE 는 여러 가지 성분을 함유하고 있기 때문에, 통상적으로 복용 가능한 분량이 제한 요인이 되므로, 보다 유효성이 기대되는 고역가의 투여를 할 수 없었다.
한편, 마황 유래의 저분자의 프로안토시아니딘 A 타입 혹은 프로안토시아니딘 B 타입 (피로갈롤 타입, 카테콜 타입) 의 중합된 프로안토시아니딘은 이미 보고되어 있다 (비특허문헌 10, 11, 12). 또한 최근, 마황의 70 ％ 아세톤 추출액으로부터, 프로안토시아니딘 A 타입 및 프로안토시아니딘 B 타입의 양방이 중합된 올리고머가 단리되었다 (비특허문헌 13).
마황 유래의 프로안토시아니딘 함유액을, 분획 분자량이 5000 이하인 한외 여과막 및/또는 식염 배제율이 30 ％ 이하인 역침투막으로 처리한 후, 분획 분자량이 500 ∼ 5000 인 획분을 분취하는 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘의 제조법이 알려져 있다 (특허문헌 6).
그러나 지금까지, 중량 평균 분자량이 20,000 을 초과하는 고분자 탄닌에 관한 보고는 없다.
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마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한 EFE 의 제조 방법이 확립되어, c-Met 키나아제 저해 작용을 통한 항암 작용·항전이 작용, 동통 억제 작용, 및 항인플루엔자 바이러스 작용을 갖고, 에페드린 알칼로이드에 의한 부작용을 배제한 의약품을 제공할 수 있게 되었다. 그러나, 마황 엑기스는 물론, EFE 는 여러 가지 성분을 함유하고 있기 때문에, 통상적으로 복용 가능한 분량이 제한 요인이 되므로, 보다 유효성이 기대되는 고역가의 투여를 할 수 없었다. 마황 엑기스 혹은 EFE 중의 c-Met 키나아제 저해 작용을 통한 항암 작용·항전이 작용, 동통 억제 작용, 및 항인플루엔자 바이러스 작용을 갖는 활성 성분을 정밀 조사한 결과, 마황의 유효성 성분의 하나로서 Herbacetin 배당체를 알아내었지만, 약효가 높지 않기 때문에, 의약품으로서 최적이지 않았다.
본 발명은, 마황 엑기스 혹은 EFE 로부터, c-Met 키나아제 저해 작용을 통한 항암 작용·항전이 작용, 동통 억제 작용, 및 항인플루엔자 바이러스 작용을 갖는 신규 활성 성분을 밝히고, 그 성분의 제조 방법을 확립함으로써, 고역가의 투여가 가능하고, 또한, 활성 성분 이외의 성분에 의한 부작용 발현 리스크가 배제된 의약품을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명에 관한 연구 과정에서, 활성 성분의 신규 효능 효과 (c-Met 발현량의 저하 작용 및 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 인산화 저해 작용과 EGFR 발현량의 저하 작용을 통한 항암 작용) 를 알아내었기 때문에, 본 활성 성분의 용도로서 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 마황 엑기스 혹은 EFE 를 물/n-부탄올로 추출한 수 가용부를, 방향족계 합성 흡착제 Diaion HP-20 칼럼을 사용하여 물, 20 ％ ∼ 100 ％ 메탄올 (MeOH) 로 용출시켜 분획하고, 20 ％ 메탄올 이상의 용출부에 대하여 분석한 결과, 이 화학 구조가 프로시아니딘 A 타입, 및 프로시아니딘 B 타입 (피로갈롤 타입 및 카테콜 타입) 의 C-4, C-6, C-8 위치에서 중합되는 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자인 것을 알아내었다.
또한, 얻어지는 성분군의 구조를 밝히고, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물에 c-Met 키나아제 저해 작용, c-Met 인산화 저해 작용, c-Met 발현량의 저하 작용을 통한 항암·항전이 작용, 동통 억제 작용, EGFR 의 인산화 저해 작용 및 EGFR 발현량의 저하 작용을 통한 항암 작용, 그리고 항인플루엔자 바이러스 작용이 존재하는 것을 발견하여, 본원 발명을 완성하였다.
즉, 본원 발명은 이하의 것을 제공하는 것이다.
[청구항 1]
마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 유래의 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물로서, 상기 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 30 ％ 이상 함유하는 추출 분획물.
[청구항 2]
고분자 축합형 탄닌이, 익스텐션 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올이 주로 프로안토시아니딘 B 타입으로 축합되고, 그 일부에 프로안토시아니딘 A 타입의 축합형 탄닌 유닛을 함유하고, 또한 터미널 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올을 주로 함유하고, 피로갈롤 타입과 카테콜 타입을 약 5 : 1 로 함유하는, 청구항 1 에 기재된 추출 분획물.
[청구항 3]
마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 의 수용성 획분을 칼럼 크로마토그래피에 의해, 물과 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 알코올과의 혼합 용매를 사용하여, 알코올 농도를 높게 하면서 순차적으로 용출시키고, 얻어지는 각 분획의 분자량을 측정하여, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 얻는 것으로 이루어지는, 청구항 1 에 기재된 추출 분획물의 제조 방법.
[청구항 4]
청구항 1 또는 2 에 기재된 추출 분획물을 함유하는 의약 조성물.
[청구항 5]
동통 억제약인, 청구항 4 에 기재된 의약 조성물.
[청구항 6]
c-Met 를 발현하는 암에 대한 항암·항전이약인, 청구항 4 에 기재된 의약 조성물.
[청구항 7]
EGFR 을 발현하는 암에 대한 항암약인, 청구항 4 에 기재된 의약 조성물.
[청구항 8]
항인플루엔자 바이러스약인, 청구항 4 에 기재된 의약 조성물.
[청구항 9]
청구항 1 에 기재된 추출 분획물을 사용하는, 고분자 축합형 탄닌을 활성 성분으로서 함유하는 의약 조성물의 함량 측정법.
본 발명에 의해, 마황 엑기스 유래, 또는 EFE 유래의 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 제공하는 것이 가능해져, 동통 억제 작용, c-Met 를 발현하는 암의 항암·항전이약, EGFR 을 발현하는 암의 항암약, 및 항인플루엔자 바이러스 작용을 갖는 고역가로 투여 가능한 의약품을 제공할 수 있다. 본 발명의 추출 분획물은, 고분자 획분 (중량 평균 분자량 45,000 이상) 의 프로안토시아니딘 A 타입 및 프로안토시아니딘 B 타입의 중합된 프로안토시아니딘 (축합형 탄닌, 고분자 폴리페놀) 이다.
본 발명에 의해, 고역가의 투여가 가능하고, 또한, 활성 성분 이외의 성분에 의한 부작용 발현 리스크가 배제된 의약품을 제공하는 것이 가능해진다.
도 1 은 프로안토시아니딘 A 타입 및 프로안토시아니딘 B 타입의 구조 및 그 구성 유닛의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2 는 마황 엑기스 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물을 HPLC 칼럼으로 분석한 HPLC 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 3 은 마황 엑기스 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물의 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 나타내는 도면이다.
도 4 는 EFE 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물을 HPLC 칼럼으로 분석한 HPLC 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 5 는 EFE 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물의 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 나타내는 도면이다.
도 6 은 마황 엑기스 유래의 물 엑기스-30 ％ MeOH 분획물, 및 40 ％ MeOH 분획물의 고분자 획분의 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 나타내는 도면이다.
도 7 은 물 엑기스의 20 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, 및 MeOH 분획물의 GPC 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 물 엑기스의 40 ％ MeOH 분획물에 대하여, 플로로글루시놀 분해를 실시한 결과 얻어진 분해 생성물인, 카테킨 (catechin), 에피카테킨 (epicatechin), 갈로카테킨 (gallocatechin), 에피카테킨-(4 → 2)-플로로글루신올 (epicatechin-(4 → 2)-phloroglucinol), 갈로카테킨-(4 → 2)-플로로글루신올 (gallocatechin-(4 → 2)-phloroglucinol), 프로델피니딘 A-타입-(4' → 2)-플로로글루신올 (prodelphinidin A-type-(4' → 2)-phloroglucinol) 의 구조를 나타내는 도면이다.
도 9 는 마황 엑기스를 물로 용해시킨 것으로부터 얻어지는 n-헥산 엑기스, 아세트산에틸 엑기스, n-부탄올 엑기스, 물 엑기스의 c-Met 키나아제 저해 작용을, c-Met 의 키나아제 도메인의 재조합 단백질과 합성 기질 펩티드를 사용한 인비트로 에세이에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은 마황 엑기스를 물로 용해시킨 것으로부터 얻어지는 n-헥산 엑기스, 아세트산에틸 엑기스, n-부탄올 엑기스, 물 엑기스의 암 세포의 운동능 저해 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, c-Met 키나아제 저해 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는 마황 엑기스 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, 암 세포의 운동능 억제 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은 EFE 및 EFE 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, 마우스를 사용한 포르말린 유발 동통에 대한 억제 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는 EFE 및 EFE 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, c-Met 의 발현 및 티로신인산화, EGFR 의 발현과 티로신인산화에 대한 저해 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는 EFE 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 40 ％ MeOH 분획물의, 관절염 모델 마우스에 대한 동통 억제 작용을 나타내는 도면이다.
도 16 은 고분자 축합형 탄닌 표준 물질 용액의 GPC 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는 마황 엑기스 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물을 HPLC 칼럼으로 분석한 HPLC 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 3 은 마황 엑기스 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물의 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 나타내는 도면이다.
도 4 는 EFE 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물을 HPLC 칼럼으로 분석한 HPLC 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 5 는 EFE 유래의 물 엑기스의 H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물의 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 나타내는 도면이다.
도 6 은 마황 엑기스 유래의 물 엑기스-30 ％ MeOH 분획물, 및 40 ％ MeOH 분획물의 고분자 획분의 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 나타내는 도면이다.
도 7 은 물 엑기스의 20 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, 및 MeOH 분획물의 GPC 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 물 엑기스의 40 ％ MeOH 분획물에 대하여, 플로로글루시놀 분해를 실시한 결과 얻어진 분해 생성물인, 카테킨 (catechin), 에피카테킨 (epicatechin), 갈로카테킨 (gallocatechin), 에피카테킨-(4 → 2)-플로로글루신올 (epicatechin-(4 → 2)-phloroglucinol), 갈로카테킨-(4 → 2)-플로로글루신올 (gallocatechin-(4 → 2)-phloroglucinol), 프로델피니딘 A-타입-(4' → 2)-플로로글루신올 (prodelphinidin A-type-(4' → 2)-phloroglucinol) 의 구조를 나타내는 도면이다.
도 9 는 마황 엑기스를 물로 용해시킨 것으로부터 얻어지는 n-헥산 엑기스, 아세트산에틸 엑기스, n-부탄올 엑기스, 물 엑기스의 c-Met 키나아제 저해 작용을, c-Met 의 키나아제 도메인의 재조합 단백질과 합성 기질 펩티드를 사용한 인비트로 에세이에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은 마황 엑기스를 물로 용해시킨 것으로부터 얻어지는 n-헥산 엑기스, 아세트산에틸 엑기스, n-부탄올 엑기스, 물 엑기스의 암 세포의 운동능 저해 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, c-Met 키나아제 저해 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는 마황 엑기스 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 10 ％ MeOH 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, 암 세포의 운동능 억제 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은 EFE 및 EFE 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, 마우스를 사용한 포르말린 유발 동통에 대한 억제 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는 EFE 및 EFE 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 대하여, c-Met 의 발현 및 티로신인산화, EGFR 의 발현과 티로신인산화에 대한 저해 작용을 시험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는 EFE 유래의 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하여 얻어지는, H2O 분획물, 40 ％ MeOH 분획물의, 관절염 모델 마우스에 대한 동통 억제 작용을 나타내는 도면이다.
도 16 은 고분자 축합형 탄닌 표준 물질 용액의 GPC 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 일 양태로서, 마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 유래의 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 제공한다.
본 발명의 추출 분획물을 얻기 위한 원료로서 사용되는 마황 엑기스는, 일본 약국방의 마황의 열수 추출물이다. 또는, 마황 엑기스로부터 에페드린 알칼로이드를 제거한 EFE 이다 (특허문헌 9). EFE 는, 마황 엑기스로부터 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 에페드린을 제거하고, 농축 건조를 거침으로써 얻을 수 있다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 마황 엑기스를 원료로서 사용한 경우도, EFE 를 원료로서 사용한 경우도, 동일하게 본 발명의 추출 분획물을 얻을 수 있다.
본 발명의 추출 분획물은, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 것을 특징으로 한다. 중량 평균 분자량은 GPC 용 표준 폴리스티렌을 표준 물질로 하여 환산한 중량 평균 분자량이다. 본 발명의 추출 분획물은, 중량 평균 분자량 45,000 이상의, 프로안토시아니딘 A 타입 및 프로안토시아니딘 B 타입의 중합된 프로안토시아니딘 (축합형 탄닌, 고분자 폴리페놀) 이다.
본 발명의 추출 분획물은, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 40 ％ 이상 함유한다.
본 발명의 추출 분획물에 함유되는 고분자 축합형 탄닌은, 익스텐션 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올이 주로 프로안토시아니딘 B 타입으로 축합되고, 그 일부에 프로안토시아니딘 A 타입의 축합형 탄닌 유닛을 함유하고, 또한 터미널 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올을 주로 함유하고, 피로갈롤 타입과 카테콜 타입을 약 5 : 1 로 함유한다 (도 1 참조).
본 발명은 다른 일 양태로서, 마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 의 수용성 획분을 칼럼 크로마토그래피에 의해, 물과 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 알코올과의 혼합 용매를 사용하여, 알코올 농도를 높이면서 순차적으로 용출시키고, 얻어지는 각 분획의 분자량을 측정하여, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 얻는 것으로 이루어지는, 본 발명의 추출 분획물의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로는, 마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 를 물에 용해시킨 것을, 극성이 낮은 유기 용매부터 극성이 높은 유기 용매를 사용하여 순차적으로 분배하고, 얻어지는 물 엑기스를 칼럼 크로마토그래피에 의해, 물과 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 알코올과의 혼합 용매를 사용하여, 알코올 농도를 높이면서 순차적으로 용출시키고, 얻어지는 각 분획의 분자량을 측정하여, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 얻는다.
극성이 낮은 유기 용매의 예로는, 헥산, 디에틸에테르, 아세트산에틸 등을 들 수 있고, 극성이 높은 유기 용매의 예로는, n-부탄올, 에탄올, 메탄올, 물 등을 들 수 있다. 분획에 사용하는 칼럼 크로마토그래피에서는, Diaion HP-20 등의 스티렌-디비닐벤젠계 합성 흡착제 혹은 그 밖의 방향족계 합성 흡착제를 사용할 수 있다. 각 분획의 분자량 측정은, 점도법, 겔 침투 크로마토그래피 (GPC), 질량분석법, 삼투압법 등을 사용할 수 있다. 본원 실시예에서는, GPC 용 표준 폴리스티렌을 표준 물질로 하는 GPC 에 의해 중량 평균 분자량을 구하였다.
구체적으로는, 마황 엑기스 또는 EFE 를 물로 용해시킨 것을, 아세트산에틸, 수 포화 n-부탄올로 순차적으로 분배하여, 아세트산에틸 엑기스, n-부탄올 엑기스, 및 물 엑기스의 각 분배 엑기스를 얻는다. 얻어진 각 분배 엑기스 중, 물 엑기스에 활성이 확인되었으므로, 활성이 확인된 물 엑기스에 대하여, 다시 Diaion HP-20 칼럼 크로마토그래피 (5.5 × 40 ㎝, 미츠비시 화학) 를 사용하여, H2O → 20 ％ MeOH → 40 ％ MeOH → MeOH 의 순서로 순차적으로 용출시켜 분획하여, H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물의 각 분획물을 얻는다. 각 분획물의 활성을 측정한 결과, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 c-Met 키나아제 저해 작용, 인산화 저해 작용, 발현량의 저하 작용, 암 세포의 운동능 억제 작용, EGFR 의 인산화 저해 작용, 발현량의 저하 작용, 동통 억제 작용, 항인플루엔자 바이러스 작용이 있는 것을 알 수 있었다. 또, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물은, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌이었다.
따라서, 본원 발명의 추출 분획물은, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물을 단독으로, 또는 임의의 조합으로 사용함으로써 조제할 수 있는 것이 분명해졌다. 이들 결과로부터, 효율이 양호한 조제 방법으로는, 상기 서술하는 물 엑기스를 100 ％ MeOH 로 추출하여, 100 ％ MeOH 분획물을 다시 Sephadex LH-20 칼럼 등에 통과시켜 고분자 획분을 얻음으로써 조제할 수도 있다.
본 발명은 다른 일 양태로서, 상기 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 동통 억제약, 항암·항전이약, 및 항인플루엔자 바이러스약으로서 유용하다. 또, 본 발명의 의약 조성물은, 마황 엑기스를 원료로 하여 사용한 경우도, EFE 를 원료로 하여 사용한 경우도, 동일하게 유효한 약리 작용을 나타낸다.
본 발명에 관련된 동통 억제약, 항암·항전이약, 항인플루엔자 바이러스약은, 예를 들어, 정제, 과립제, 세립제, 캡슐제 등과 같은 경구 투여의 제제, 경구 투여에 적합한 여러 가지의 액체 제제, 또는 주사제와 같은 비경구 투여용 제제로 하는 것이 가능하다. 경구 투여가 바람직하다.
경구 투여의 제제의 경우, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 제제 담체와 함께 정제, 과립제, 세립제, 캡슐제 등의 형태로 제제화하여 얻어진다.
제제 담체로는, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 및 가소제 등을 사용할 수 있다. 부형제로는, 예를 들어, 백당, 염화나트륨, 만니톨, 젖당, 포도당, 전분, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다. 결합제로는, 예를 들어, 물, 에탄올, 프로판올, 포도당액, 전분액, 젤라틴액 등을 사용할 수 있다. 붕괴제로는, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 건조 전분, 탄산수소나트륨 등을 사용할 수 있다. 활택제로는, 예를 들어, 정제 탤크, 스테아르산염, 붕산말, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 가소제로는, 예를 들어, 글리세린 지방산 에스테르, 디옥틸프탈레이트, 디부틸프탈레이트, 피마자유 등을 사용할 수 있다.
상기 경구 투여의 제제화의 경우, 수용성 고분자 및 계면 활성제 등의 분산제를 사용할 수도 있다. 수용성 고분자로는, 예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등을 사용할 수 있다. 계면 활성제로는, 예를 들어, 라우릴황산나트륨, 라우릴황산마그네슘 등을 사용할 수 있다.
정제를 조제하려면, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을, 상기 제제 담체를 사용하여 통상적인 방법에 의해 정제로 한다. 과립제 또는 세립제는, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물에 상기 제제 담체를 첨가하고, 유동층 조립, 고속 교반 조립, 교반 유동층 조립, 원심 유동 조립, 압출 조립 등으로 과립화함으로써 조제할 수 있다. 캡슐제는, 불활성인 의약 충전제 또는 희석제와 함께 혼합하여 조제하고, 경젤라틴 캡슐 또는 연캡슐에 채운다.
경구 액체 제제는, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물과, 감미료 (예를 들어, 자당), 보존제 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 착색료, 향료 등을 혼합하여 조제한다.
주사용 제제는, 예를 들어, 액제, 유탁액, 또는 현탁액의 형태로 조제되고, 혈액에 대해 등장 (等張) 이 된다. 액체, 유탁액 또는 현탁액의 형태의 제제는, 예를 들어, 수성 매체, 에틸알코올, 프로필렌글리콜, 에톡시화 이소스테아릴알코올 등을 사용하여 조제된다.
주사용 제제에 있어서, 당기술 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 첨가제를 적절히 사용할 수 있으며, 예를 들어, 등장화제, 안정화제, 완충제, 보존제, 킬레이트제, 항산화제 등을 사용할 수 있다. 등장화제로는, 예를 들어, 포도당, 소르비톨, 만니톨 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 예를 들어 아황산나트륨 등을 들 수 있다. 완충제로는, 예를 들어, 붕산 완충제, 인산 완충제, 시트르산 완충제 등을 들 수 있다. 보존제로는, 예를 들어, 파라옥시벤조산에스테르, 벤질알코올 등을 들 수 있다. 킬레이트제로는, 예를 들어, 에데트산나트륨, 시트르산나트륨 등을 들 수 있다. 항산화제로는, 예를 들어, 아황산나트륨, 아황산수소나트륨 등을 들 수 있다.
본 발명의 동통 억제약, 항암·항전이약, 항인플루엔자 바이러스약의 투여량으로는, 예를 들어, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을, 1 회의 투여에 대해 체중 1 ㎏ 당 0.5 ㎎ 내지 500 ㎎, 바람직하게는 10 ㎎ 내지 200 ㎎ 의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 의약 조성물은 이들 투여량으로 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 다른 일 양태로서, 본 발명의 추출 분획물을 사용하는, 고분자 축합형 탄닌을 활성 성분으로 하는 의약 조성물의 관리 방법의 하나로서 함량 측정법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명에서 나타낸 고분자 축합형 탄닌의 분자량의 해석에 사용한 GPC 분석을 사용하여, 함량 미지의 시료 및 고분자 축합형 탄닌 표준 물질에 대하여, 각각 고분자 축합형 탄닌의 피크 면적을 구하고, 피크 면적의 상대값으로부터 시료 중의 고분자 축합형 탄닌 함량을 산출할 수 있다. 또, 이 함량 측정법은, 마황 엑기스나 EFE 중의 고분자 축합형 탄닌 함량을 측정하는 것도 가능하여, 고분자 축합형 탄닌이 활성 성분으로 하는 약효, 즉, 동통 억제약, 항암·항전이약, 및 항인플루엔자 바이러스약으로서 제조할 때의 관리 방법의 하나로서 사용할 수 있다.
실시예
본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않는다. 여러 가지의 변경, 수식이 당업자에게는 가능하고, 이들의 변경, 수식도 본 발명에 포함된다.
(실시예 1) 마황 엑기스 또는 EFE 의 분획, 분석
마황 엑기스 (300 g) 를 물 (5 ℓ) 로 용해시킨 것을, n-헥산 (4 ℓ), 아세트산에틸 (12 ℓ), 수 포화 n-부탄올 (12 ℓ) 로 순차적으로 분배하여, n-헥산 엑기스 (92.3 ㎎), 아세트산에틸 엑기스 (13.2 g), n-부탄올 엑기스 (65.7 g), 물 엑기스 (161.1 g) 를 얻었다. 마황 엑기스 유래의 얻어진 각 분배 엑기스에 대하여, c-Met 키나아제 저해 활성, 암 세포의 운동 억제 활성을 구하였다. 그 결과, n-부탄올 및 물 엑기스에 활성이 확인되었다.
수량 (收量) 이 많고, 활성이 확인된 물 엑기스 (90 g) 에 대하여, 다시 Diaion HP-20 칼럼 크로마토그래피 (5.5 × 40 ㎝, 미츠비시 화학) 를 사용하여, H2O → 10 ％ MeOH → 20 ％ MeOH → 30 ％ MeOH → 40 ％ MeOH → 50 ％ MeOH → MeOH 의 순서로 순차적으로 용출시켜 분획하여, H2O 분획물 (47.9 g), 10 ％ MeOH 분획물 (2.5 g), 20 ％ MeOH 분획물 (2.6 g), 30 ％ MeOH 분획물 (7.0 g), 40 ％ MeOH 분획물 (11.5 g), 50 ％ MeOH 분획물 (5.1 g), MeOH 분획물 (2.6 g) 의 각 분획물을 얻었다. 얻어진 각 분획물에 대하여, c-Met 키나아제 저해 활성, 암 세포의 운동 억제 활성 시험을 실시한 결과, 특히 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 이어서 50 ％ MeOH 분획물에 강한 활성이 확인되었다.
그래서, 물 엑기스의 각 분획물의 함유 성분에 대하여 비교할 목적으로, HPLC 분석을 실시하였다. HPLC 조건은 이하와 같다.
칼럼 : L-column ODS (2.1 I.D. × 150 ㎜) (화학 물질 평가 연구 기구),
칼럼 온도 : 40 ℃,
유속 : 0.3 ㎖/분,
측정 파장 : 200 - 400 ㎚,
이동상 : (A) 0.1 ％ 포름산-증류수 및 (B) 0.1 ％ 포름산-아세토니트릴〔농도 구배 조건 (B in A) : 0 → 30 분 (0 → 50 ％), 30 → 35 분 (50 → 85 ％), 35 → 40 분 (85 ％), 40 → 50 분 (85 → 90 ％), 50 → 55 분 (90 → 100 ％), 55 → 60 분 (100 ％)〕.
그 결과, H2O 분획물 및 10 ％ MeOH 분획물 이외의 획분에 축합형 탄닌 올리고머에 특징적인 브로드 피크가 관찰되었다 (도 2).
또, 각 분획물에 대하여 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 실시하였다. NMR 의 조건은, 측정 용매로서 MeOH-d4 : D2O (1 : 1) 를 사용하고, 장치는 Brucker AVANCE500 (Bruker BioSpin) 을 사용하였다. 그 결과, H2O 분획물 및 10 ％ MeOH 분획물 이외의 획분에 플라반3-올 골격에 대응하는 시그널이 공통적으로 관찰되고, 활성에 기여하고 있는 획분은 축합형 탄닌 (프로안토시아니딘) 올리고머 획분인 것이 확인되었다. 강한 활성을 나타낸 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물은 특히 강한 시그널을 확인하였다. 또, 어느 분획물도, 스펙트럼 해석에 기초하여, 프로안토시아니딘 A 타입을 포함하는 구조를 갖는 것, 또한 카테콜 타입의 시그널 강도가 작은 것으로부터, 피로갈롤 타입이 많은 것이 시사되었다 (도 3).
동일하게, EFE (400 g) 를 물 (5 ℓ) 로 용해시킨 것을, 아세트산에틸 (10 ℓ), 수 포화 n-부탄올 (10 ℓ) 로 순차적으로 분배하여, 아세트산에틸 엑기스 (7.3 g), n-부탄올 엑기스 (85.0 g), 물 엑기스 (311.0 g) 를 얻었다. EFE 유래의 얻어진 각 분배 엑기스에 대하여, 동통 시험을 실시하였다. 그 결과, 물 엑기스에 활성이 확인되었다. 활성이 확인된 물 엑기스 (290 g) 에 대하여, 다시 Diaion HP-20 칼럼 크로마토그래피 (5.5 × 40 ㎝, 미츠비시 화학) 를 사용하여, H2O→ 20 ％ MeOH → 40 ％ MeOH → MeOH 의 순서로 순차적으로 용출시켜 분획하여, H2O 분획물 (190.6 g), 20 ％ MeOH 분획물 (35.9 g), 40 ％ MeOH 분획물 (41.7 g), MeOH 분획물 (13.9 g) 의 각 분획물을 얻었다. 얻어진 각 분획물에 대하여, 동통 시험을 실시한 결과, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 활성이 확인되었다.
그래서, 물 엑기스의 각 분획물의 함유 성분에 대하여 비교할 목적으로, 동일하게 HPLC 분석을 실시하였다. 그 결과, 활성이 확인된 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 축합형 탄닌 올리고머에 특징적인 브로드 피크가 관찰되었다 (도 4).
또, 각 분획물에 대하여 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 실시한 결과, 활성이 확인된 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 플라반3-올 골격에 대응하는 시그널이 공통적으로 관찰되고, 마황 엑기스 유래의 활성 획분과 동일한 축합형 탄닌 (프로안토시아니딘) 올리고머 획분인 것이 확인되었다 (도 5).
또한, 본 실시예에 있어서의 c-Met 키나아제 저해 활성은 실시예 5 및 7 에 기재된 방법, 암 세포의 운동 억제 활성은 실시예 6 및 8 에 기재된 방법, 동통 시험은 실시예 9 에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.
(실시예 2) 활성 획분의 분자량 분석
활성에 기여하고 있는 획분이 축합형 탄닌 (프로안토시아니딘) 올리고머 획분인 것이 확인되었기 때문에, 다시 활성 획분을 한외 여과에 의해 분자량에 의한 분획을 실시하였다. 마황 엑기스 유래의 물 엑기스-40 ％ MeOH 분획물의 20 ％ MeOH 불용부를, Vivaspin 500 (GE Healthcare : 3, 5, 10, 30, 50, 100 KDa) 을 사용하여, 11400 x g, 10 분간 원심 분리하여, 7 획분〔＜3 KDa (수량 약 10 ％), 3 ∼ 5 KDa (약 4 ％), 5 ∼ 10 KDa (약 5 ％), 10 ∼ 30 KDa (약 6 ％), 30 ∼ 50 KDa (약 2 ％), 50 ∼100 KDa (약 3 ％), ＞ 100 KDa (약 70 ％)〕을 얻었다. 각 획분에 대하여, c-Met 키나아제 저해 작용의 시험을 실시한 결과, ＞ 100 KDa 의 고분자 획분 (마황 엑기스 고분자 획분) 에 활성이 확인되었다. 이 고분자 획분에 대하여 13C-NMR 에 의한 구조 해석을 실시한 결과, 동일한 축합형 탄닌 (프로안토시아니딘) 올리고머 획분인 것이 확인되었다. 또한, 물 엑기스-30 ％ MeOH 분획물의 ＞ 100 KDa 의 고분자 획분에 대해서도 13C-NMR (측정 용매로서 아세톤-d6 : D2O (1 : 1)) 에 의한 구조 해석을 실시한 결과, 동일한 스펙트럼이 관찰되었다 (도 6).
활성 획분 (마황 엑기스 고분자 획분, EFE 유래 물 엑기스-20 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, MeOH 분획물) 에 대하여 GPC 분석을 실시하였다. GPC 용 표준 폴리스티렌을 표준 물질로 하여, 이하의 조건에서 분석하였다.
칼럼 : TSK-gel Super AW4000 (6.0 I.D. × 150 ㎜) (토소),
칼럼 온도 : 30 ℃,
유속 : 0.3 ㎖/분,
측정 파장 : 280 ㎚,
이동상 : N,N-디메틸포름아미드 ＋ 3M 포름산암모늄 (0.5 ％)
분석한 결과, 어느 분획물에 있어서도, 유지 시간 7.5 ∼ 8.5 분에 피크 톱을 나타내는 고분자 영역의 피크가 관찰되었다 (도 7). Chromato-PRO-GPC 를 사용하여 데이터 처리를 실시하고, 각 분획물의 중량 평균 분자량을 산출한 결과, 마황 엑기스 고분자 획분 : 94372, 20 ％ MeOH 분획물 : 113279, 40 ％ MeOH 분획물 : 59042, MeOH 분획물 : 45004 (GPC 용 표준 폴리스티렌을 표준 물질로 하여 환산한 중량 평균 분자량으로, 모두 3 회 측정한 값의 평균값) 였다.
(실시예 3) 부분 구조의 해석
활성 획분의 하나인 마황 엑기스 유래 물 엑기스-40 ％ MeOH 분획물에 대하여, 플로로글루시놀 분해를 실시하였다. 그 결과, 카테킨, 에피카테킨, 갈로카테킨, 에피카테킨-(4 → 2)-플로로글루신올, 갈로카테킨-(4 → 2)-플로로글루신올, 프로델피니딘 A-타입-(4' → 2)-플로로글루신올을 분해 생성물로서 확인하였다 (도 8).
따라서, 익스텐션 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올이 주로 B 타입으로 축합되고, 그 일부에 A 타입의 축합형 탄닌 유닛을 함유하고, 또한 터미널 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올을 주로 함유하는 것이 분명해졌다. 또, 피로갈롤 타입과 카테콜 타입의 대략의 존재비를 티올 분해한 유닛을 HPLC 분석으로 산출한 결과, 대략 5 : 1 이었다 (도 1 참조).
(실시예 4) EFE 유래의 추출 분획물 중의 고분자 축합형 탄닌의 함유량
축합형 탄닌 올리고머 획분은, Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피로 함수 아세톤 (아세톤-물 (7 : 3)) 용출에 의해 분획된다는 보고가 있다 (비특허문헌 14). 본 방법에 따라, 70 ％ 아세톤 (아세톤-물 (7 : 3)) 용출부를 고분자 축합형 탄닌 획분으로 하고, 활성 획분 (EFE 유래 물 엑기스-20 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, MeOH 분획물) 중의 고분자 축합형 탄닌량을 추측하였다. 그 결과, 20 ％ MeOH 분획물에 약 32 ％, 40 ％ MeOH 분획물에 약 45 ％, MeOH 분획물에 약 43 ％ 였다.
(실시예 5) 마황 엑기스 분배 엑기스의 c-Met 키나아제 저해 작용
마황 엑기스를 물로 용해시킨 것을 n-헥산, 아세트산에틸, 수 포화 n-부탄올로 순차적으로 분배하여, 얻어진 각 분획물 (n-헥산 엑기스, 아세트산에틸 엑기스, n-부탄올 엑기스, 물 엑기스) 의 c-Met 키나아제 저해 작용을 c-Met 의 키나아제 도메인의 재조합 단백질과 합성 기질 펩티드를 사용한 인비트로 에세이에 의해 조사하였다.
에세이 조건은, 이하와 같다. 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM DTT, 7 mM MgCl2, 10 μM ATP 에 4 nM 재조합 c-Met 키나아제 도메인, 0.2 ㎍/㎖ Poly (Glu4, Tyr1) 및 각 분획을 5 ㎍/㎖ 가 되는 용액을 조제하고, 실온에서 1 시간 인큐베이트하였다. 반응 정지 후, ADP-Glo 시약을 사용하여 ADP 량에 의존한 루미놀 발광 강도를 루미노미터 (퍼킨엘머사, EnSpire) 로 측정하고, c-Met 키나아제 활성을 산출하였다. 그 결과, n-부탄올 엑기스 및 물 엑기스에 키나아제 저해 작용이 있는 것이 분명해졌다 (도 9).
(실시예 6) 마황 엑기스의 분배 엑기스의 암 세포의 운동능 저해 작용
마황 엑기스를 물에 용해시킨 것을 n-헥산, 아세트산에틸, 수 포화 n-부탄올로 순차적으로 분배하여, 얻어진 각 분획물 (n-헥산 엑기스, 아세트산에틸 엑기스, n-부탄올 엑기스, 물 엑기스), 암 세포의 운동능 저해 작용을, 트랜스웰을 사용한 시험에 의해 평가하였다. 에세이에는, c-Met 를 발현하고 있고, HGF 에 의해 운동능이 유도되는 고전이성 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포를 사용하였다.
에세이 조건은, 이하와 같다. MDA-MB-231 세포 (5 × 104 세포/웰) 를 Vehicle (2.5 ％ EtOH-DMEM) 혹은 25 ㎍/㎖ 의 각 분배 엑기스를 용해시킨 2.5 ％ EtOH-DMEM 에 현탁하고, 상부 웰에 첨가하였다. 하부 웰은 콜라겐 코트한 24 웰 플레이트를 사용하였다. 하부 웰에는, 50 ng/㎖ HGF-DMEM 을 600 ㎕ 첨가하였다. 24 시간 배양 후에, 하부 웰로 이동한 세포 수를 현미경하에 측정하여, 운동능의 지표로 하였다. 그 결과, n-부탄올 엑기스, 물 엑기스에 암 세포의 운동능 억제 작용이 있는 것이 분명해졌다 (도 10).
(실시예 7) 물 엑기스의 Diaion HP-20 칼럼 분획물의 c-Met 키나아제 저해 작용
실시예 9 의 동통 시험의 결과로부터, 경구 투여에 의해 약리 작용을 나타내는 분배 엑기스는 물 엑기스이고, n-부탄올 엑기스의 경구 투여는 약리 작용을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다. 그래서, 마황 엑기스의 분배로 얻어진 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하고, H2O, 10 ％ MeOH, 20 ％ MeOH, 30 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, 50 ％ MeOH, MeOH 로 순차적으로 용출시킨 분획물을 얻었다. 각 분획물에 대하여 c-Met 의 키나아제 도메인의 재조합 단백질과 합성 기질 펩티드를 사용한 인비트로 에세이에 의해 조사하였다.
에세이 조건은, 이하와 같다. 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM DTT, 7 mM MgCl2, 10 μM ATP 에 4 nM 재조합 c-Met 키나아제 도메인, 0.2 ㎍/㎖ Poly (Glu4, Tyr1) 및 각 분획을 5 ㎍/㎖ 가 되는 용액을 조제하고, 실온에서 1 시간 인큐베이트하였다. 반응 정지 후, ADP-Glo 시약을 사용하여 ADP 량에 의존한 루미놀 발광 강도를 루미노미터 (퍼킨엘머사, EnSpire) 로 측정하고, c-Met 키나아제 활성을 산출하였다. 그 결과, Diaion HP-20 칼럼의 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물 및 MeOH 분획물에 c-Met 키나아제 저해 작용이 있는 것이 분명해졌다 (도 11).
(실시예 8) 물 엑기스의 Diaion HP-20 칼럼 분획물의 암 세포의 운동능 억제 작용
실시예 9 의 동통 시험의 결과로부터, 경구 투여에 의해 약리 작용을 나타내는 분배 엑기스는 물 엑기스이고, n-부탄올 엑기스의 경구 투여는 약리 작용을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다. 그래서, 마황 엑기스의 분배로 얻어진 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼에 첨가하고, H2O, 10 ％ MeOH, 20 ％ MeOH, 30 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, 50 ％ MeOH, MeOH 로 순차적으로 용출시킨 획분을 얻었다. 각 획분에 대하여 HGF 에 의해 유도되는 암 세포의 운동능의 억제 작용을 해석하였다.
에세이 조건은, 이하와 같다. MDA-MB-231 세포 (5 × 104 세포/웰) 를 Vehicle (DMEM) 혹은 10 ㎍/㎖ 의 각 획분을 용해시킨 DMEM 에 현탁하고, 상부 웰에 첨가하였다. 하부 웰은 콜라겐 코트한 24 웰 플레이트를 사용하였다. 하부 웰에는, 50 ng/㎖ HGF-DMEM 을 600 ㎕ 첨가하였다. 24 시간 배양 후에, 하부 웰로 이동한 세포 수를 현미경하에 측정하여, 운동능의 지표로 하였다. 그 결과, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 및 50 ％ MeOH 분획물은, HGF 에 의해 유도되는 운동능을 강하게 억제하는 것이 분명해졌다 (도 12).
(실시예 9) 마우스를 사용한 포르말린 유발 동통에 대한 억제 작용 (포르말린 시험)
EFE 의 각 분배 엑기스 및 물 엑기스의 Diaion HP-20 칼럼 분획물에 대하여, 포르말린 유발 동통에 대한 억제 작용을 조사하였다.
4 주령의 웅성 ddY 마우스를 반입 후, 1 주간 이상 순화시킨 것을 1 군 4 ∼ 8 마리 사용하였다. 실험 개시일에 체중 측정을 실시하여, 각 군에서 거의 동일해지도록 컨트롤군, EFE 투여군, 각 획분 투여군 (7 군) 으로 나누었다. EFE 및 각 획분은 10 ％ DMSO (DMSO : Saline = 1 : 9) 를 첨가하고, 초음파로 용해시켰다. 컨트롤군은 10 ％ DMSO 를 경구 투여하였다. EFE 군은 700 ㎎/㎏ EFE 를 경구 투여하였다. 각 획분군은, EFE 700 ㎎/㎏ 에 대한 각 획분의 중량 수율로부터 산출한 양을 경구 투여하였다. 각 시료 투여 6 시간 후에 2.5 ％ 포르말린 용액 10 ㎕ 를 왼쪽 뒷발바닥부에 피내 투여하였다. 투여 후 신속하게 마우스를 원기둥 아크릴 케이지 (높이 20 ㎝ × 직경 10 ㎝) 에 넣고, 45 분간 비디오 촬영하였다. 동통 관련 행동은 투여 직후부터 5 분 후까지 발생하는 제 1 상과 10 분 후부터 45 분 후까지 발생하는 제 2 상을 대상으로 하여, 처치한 발을 핥는 행동 시간을 계측하였다. 통계학적 해석은 컨트롤군과 피험 물질 투여군의 동통 행동 시간을 Dunnett's tests 로 실시하고, 유의 수준은 5 ％ 로 하였다.
결과를 도 13 에 나타낸다. 제 1 상에 대해서는, 시료 투여군은 동통 관련 행동에 영향을 미치지 않은 것으로부터, 침해 수용성 동통에 대한 동통 억제 작용은 없는 것으로 생각되었다. 한편, 제 2 상에 대해서는, EFE 군, 물 엑기스 군, 20 ％ MeOH 분획물군, 40 ％ MeOH 분획물군, MeOH 분획물군에 있어서, 컨트롤 군보다 동통 관련 행동이 감소하여, 염증성 동통에 대한 억제 작용을 갖는 것을 알 수 있었다. 물 엑기스군은 EFE 군에서도 적은 투여량으로 강한 동통 억제 작용을 나타낸 것으로부터, 동통 억제 작용은 물 엑기스에 농축되어 있는 것, 즉, 비활성이 현격히 높아져 있는 것이 분명해졌다. 한편, in vitro 의 활성 평가에서 약효가 있었던 n-부탄올 엑기스는, in vivo 에서는 약효를 나타내지 않았다.
다음으로 이 물 엑기스를 Diaion HP-20 칼럼으로 분획하였다. 실시예 7 및 8 로부터, 20 ％ MeOH 분획물, 30 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, 50 ％ MeOH 분획물, 및 MeOH 분획물에 c-Met 키나아제 저해 작용 및 운동능 억제 작용이 있는 것이 분명해졌다. 그래서, 동물 시험용으로 각 획분의 회수량을 올리기 위해, 물 엑기스를 Diaion HP-20 에 의해, H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물로 분리하였다. 그 결과, H2O 분획물에는 동통 억제 작용은 없고, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 활성이 있는 것이 분명해졌다. 이상으로부터, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물은, 염증성 동통에 대한 진통 작용을 갖는 것을 알 수 있었다.
(실시예 10) c-Met의 발현과 c-Met 티로신인산화, 및 EGFR 의 발현과 EGFR 티로신인산화에 대한 작용
EFE 유래의 물 엑기스의 Diaion HP-20 칼럼 분획물에 대하여, c-Met 및 EGFR 을 과잉 발현하고 있는 인간 비소세포 폐암 유래 H1993 세포를 사용하여, c-Met 및 EGFR 에 대한 작용을 해석하였다.
각 분획물은 10 ％ DMSO-RPMI1640 배지에서 용해시켜, 2 ∼4 ㎎/㎖ 의 농도의 Stock solution 으로 한 후, RPMI 배지에서 희석하여 사용하였다. 배지에 함유되는 DMSO 의 최종 농도는 0.125 ％ 였다. H1993 세포에 100 ㎍/㎖ EFE, 50 ㎍/㎖ H2O 분획물, 25 ㎍/㎖ 20 ％ MeOH 분획물, 25 ㎍/㎖ 40 ％ MeOH 분획물, 혹은 25 ㎍/㎖ MeOH 분획물을 첨가하여 4 시간 인큐베이션한 후, 세포를 용해시키고, 원심 분리한 상청을 사용하여, 웨스턴 블로팅 (Western-blotting) 을 실시하였다. 결과를 도 14 에 나타낸다.
또한, H1993 세포는, c-Met 및 EGFR 을 과잉 발현하고 있기 때문에, HGF 나 EGF 의 자극이 없더라도, 자기 인산화에 의해 수용체가 인산화되어 있다.
(1) c-Met 에 대한 작용 :
H2O 분획물은, c-Met 의 발현량 및 인산화에 영향을 미치지 않았다. 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물은, c-Met 발현량을 저하시키고, 인산화를 저해하였다. 이들의 작용은, 40 ％ MeOH 분획물이 가장 높고, EFE 와 거의 동일한 정도의 작용을 나타내었다. 따라서, c-Met 에 대한 작용은, H2O 분획물에는 없고, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 있는 것이 분명해졌다. 이것은, (실시예 9) 의 동통 시험의 결과와 거의 일치하고 있었다.
(2) EGFR 에 대한 작용 :
H2O 분획물은, EGFR 의 발현량 및 인산화에 영향을 미치지 않았다. 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물은, EGFR 의 인산화를 저해하였다. 한편, EGFR 의 발현량은, EFE 와 40 ％ MeOH 분획물에 의해 저하되었다. 그러나, 20 ％ MeOH 분획물 및 MeOH 분획물은, EGFR 의 발현량을 약간 저하시키는 정도였다.
이들 결과로부터, EGFR 의 인산화 저해 작용은, H2O 분획물에는 없고, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 있는 것이 분명해지고, 실시예 9의 동통 시험의 결과 및 상기 (1) 의 c-Met 에 대한 작용과 거의 일치하고 있었다. 한편, EGFR 의 발현량을 저하시키는 작용은, 40 ％ MeOH 분획물에 있는 것을 알 수 있었다.
일본의 암 사망 원인 1 위인 폐암에 있어서, 분자 표적 치료약인 EGFR 티로신키나아제 저해제 (EGFR-TKI) 가 현저하게 효과가 있는 타입은, 생존 기간이 연장되었지만, 수년간 내성을 획득하여 재연되는 것이 문제가 되고 있고, 내성 획득의 원인의 하나로 c-Met 과잉 발현이 보고되어 있다 (야노 세이지, 실험 의학, 29, 203-208, 2011). c-Met 과잉 발현이 원인인 EGFR-TKI 내성의 경우, c-Met 저해제와 EGFR-TKI 의 병용이 유효한 것으로 생각되고 있지만, c－Met 저해제는 의약품화의 목표가 세워져 있지 않다.
20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물은, 폐암 세포가 과잉 발현되어 있는 c-Met 및 EGFR 의 인산화를 저해하는 것으로부터, c-Met 과잉 발현이 원인인 EGFR-TKI 내성 폐암 환자의 치료에 유용할 수 있다. 또한, 40 ％ MeOH 분획물은, 과잉 발현되어 있는 c-Met 및 EGFR 의 인산화 저해 작용뿐만 아니라, 그것의 발현량을 저하시키기 때문에, 보다 유효성이 높은 분자 표적 치료약이 될 수 있다.
(실시예 11) 관절염 모델 마우스에 대한 동통 억제 작용
실시예 10 으로부터 40 ％ MeOH 분획물의 약효가 가장 높고, 실시예 9 - 10 으로부터 H2O 분획물에는 약효가 없는 것이 분명해졌다. 그래서, 이들 분획물의 관절염 모델 마우스에 대한 진통 효과를 in vivo 로 비교 검토하였다. 결과를 도 15 에 나타낸다.
실험 동물은, 자성 Balb/c 의 9 주령을 사용하였다. 마우스를 반입하여 1 주간 정도 훈화시킨 후, 오른쪽 뒷발 발바닥에 Complete Freud's Adjuvant (CFA) 5 ㎎/㎖ 를 10 ㎕ 접종하고, 7 일간 사육한 마우스를 관절염 모델 마우스로 하였다. CFA 접종 7 일째의 마우스는 다리 관절이 유의하게 종창 (腫脹) 되고, 기계 자극에 대한 감수성이 가장 높아져 있기 때문이다. 10 ％ DMSO 용액에 용해시킨 390 ㎎/㎏ H2O 분획물, 혹은 190 ㎎/㎏ 40 ％ MeOH 분획물을 관절염 모델 마우스에 경구 투여하였다. Control 군은, 정상 마우스에 vehicle (10 ％ DMSO 용액) 을 투여하고, Vehicle 군은, 관절염 모델 마우스에 vehicle 을 투여하였다. 시험약 투여 6 시간 후에, 오른쪽 다리의 von Frey test 를 실시하고, up-down 법을 사용하여 50 ％ 반응 임계값 (50 ％ paw withdrawal threshold : 50 ％ PWT) 을 산출하였다 (S. R. Chapman et al, Journal of Neuroscience Method 53 (1994) 55-63). 통계 해석은, 일원 배치 분산 분석 후 Tukey 의 다중 비교 검정법으로 실시하였다. 해석 소프트는, Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 을 사용하고, 통계적으로 유의 수준 p ＜ 0.05 를 유의차 있음으로 판단하였다.
40 ％ MeOH 분획물의 경구 투여에 의해, 50 ％ PWT 가 vehicle 군과 비교하여 유의하게 증가하고, 기계 자극에 대한 감수성이 저하되어 있었다. 한편, H2O 분획물의 경구 투여에서는, 50 ％ PWT 가 vehicle 군과 거의 동일하고, 기계 자극에 대한 감수성이 높은 상태였다. 이들 결과로부터, 40 ％ MeOH 분획물은, 관절염 모델 마우스에 대해 동통 억제 작용을 나타내지만, H2O 분획물에는 동통 억제 작용이 없는 것이 분명해졌다.
(실시예 12) 항인플루엔자 바이러스 작용
실시예 9 의 포르말린 시험의 결과로부터, EFE 의 물 엑기스를 Diaion HP-20 으로 분획한, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 동통 억제 작용이 있는 것을 알 수 있었던 것으로부터, 이들 획분의 항인플루엔자 바이러스 작용을 측정하였다. 이 측정 방법은, 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 MDCK 세포가 용해되는 것을 이용하여, 50 ％ 의 세포가 생존하는 시료 농도로 항인플루엔자 바이러스 작용을 평가한다. 또, 세포 독성이 아니라, 항인플루엔자 바이러스 작용을 측정하고 있는 것을 확인하기 위해, 세포 생존율이 50 ％ 가 되는 농도도 동시에 측정하였다.
각 시료에 대하여, 각각 10 ％ FBS-MEM 으로 25 ㎍/㎖ 의 용액으로 조제하고, 또한 10 단계의 2 배 희석 계열을 제조하여, 시료 용액으로 하였다. 인플루엔자 바이러스 (A/WSN/33 (H1N1) 주) 를 함유하는 액을 10 ％ FBS-MEM 으로 1000 TCID50/㎖ 에 희석하여, 인플루엔자 바이러스액으로 하였다. MDCK 세포를 10 ％ FBS-MEM 으로 현탁하고, 96 구멍 배양 플레이트의 각 웰당, 3 × 104 개/100 ㎕ 로 파종하였다. 24 시간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 시료 용액 100 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 추가로 100 ㎕ 의 인플루엔자 바이러스액 혹은 10 ％ FBS-MEM 을 첨가하였다. 72 시간 배양한 후, 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 마이크로플레이트 리더로 각 웰의 560 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 첨가한 시료 농도와 세포 생존율의 곡선에 대하여 4 파라미터 로지스틱 해석을 실시하여, 인플루엔자 바이러스 첨가군으로부터 50 ％ 저해 농도 (IC50 값), 비인플루엔자 바이러스 첨가군으로부터 50 ％ 세포 장애 농도 (CC50 값) 를 각각 구하였다 (표 1).
각 시료의 IC50 값은, CC50 값보다 저농도였던 것으로부터, 항인플루엔자 바이러스 작용이 측정되어 있는 것이 확인되었다. 또, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물의 IC50 값은, EFE 의 IC50 값과 동일한 정도였던 것으로부터, EFE 의 항인플루엔자 바이러스 작용을 나타내는 활성 성분은, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물에 존재하는 것이 분명해졌다.
(실시예 13) 고분자 축합형 탄닌 표준 물질의 조제
실시예 1 에서 얻은 물 엑기스-40 ％ MeOH 분획물에 대하여, 다시 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피 (GE Healthcare) 를 사용하여 정제하였다. 칼럼을 50 ％ MeOH 로 세정 후, 70 ％ 아세톤으로 용출시켜, 고분자 축합형 탄닌을 얻었다. 용출액을 농축, 동결 건조시킨 후, 약 100 ㎎ 을 정밀하게 재어 (100.0 ㎎), 50 ％ 디메틸포름아미드 용액 10 ㎖ 를 정확하게 첨가하고, 완전히 용해시켰다. 이 용액에 대하여, 실시예 2 에서 나타낸 GPC 분석한 결과, 중량 평균 분자량은 85642 이고, 저분자량역에 피크는 확인되지 않았다 (도 16). 이 용액 약 1 ㎖ 를 바이알에 나눠 붓고, 고분자 축합형 탄닌 표준 물질 용액 (10.0 ㎎/㎖) 으로 하였다.
(실시예 14) GPC 를 사용한 고분자 축합형 탄닌 함량의 측정
실시예 2 에서 나타낸 GPC 를 사용한 분자량 분석법 및 실시예 13 에서 나타낸 고분자 축합형 탄닌 표준 물질을 사용하여, 마황 엑기스의 고분자 축합형 탄닌 함량을 측정하였다.
마황 엑기스 3 로트에 대하여, 각각 10.00 ㎎/㎖ 가 되도록 50 ％ 디메틸포름아미드 용액에 용해시켜 시료 용액으로 하였다. 각 시료 용액 및 고분자 축합형 탄닌 표준 물질 용액 (10.0 ㎎/㎖) 에 대하여, 실시예 2 에서 나타낸 조건에서 GPC 분석하였다. 시료 도입 후 5 ∼ 10 분의 고분자 축합형 탄닌의 피크 면적에 대하여, 다음 식에 의해 시료 1 ㎖ 중의 고분자 축합형 탄닌 함량을 구하였다 (표 2).
시료 용액 1 ㎖ 중의 고분자 축합형 탄닌의 양 (㎎) ＝ AT/AS × 10.00
AT : 시료의 피크 면적
AS : 표준 물질의 피크 면적
10.00 : 표준 물질 용액 1 ㎖ 중의 고분자 축합형 탄닌의 양 (㎎)
Claims (9)
- 마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 유래의 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물로서, 상기 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 30 ％ 이상 함유하는 추출 분획물.
- 제 1 항에 있어서,
고분자 축합형 탄닌이, 익스텐션 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올이 주로 프로안토시아니딘 B 타입으로 축합되고, 그 일부에 프로안토시아니딘 A 타입의 축합형 탄닌 유닛을 함유하고, 또한 터미널 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반3-올을 주로 함유하고, 피로갈롤 타입과 카테콜 타입을 약 5 : 1 로 함유하는, 추출 분획물. - 마황 엑기스 유래, 또는 에페드린 알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 의 수용성 획분을 칼럼 크로마토그래피에 의해, 물과 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 알코올과의 혼합 용매를 사용하여, 알코올 농도를 높이면서 순차적으로 용출시키고, 얻어지는 각 분획의 분자량을 측정하여, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 고분자 축합형 탄닌을 함유하는 추출 분획물을 얻는 것으로 이루어지는 제 1 항에 기재된 추출 분획물의 제조 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 추출 분획물을 함유하는 의약 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
동통 억제약인, 의약 조성물. - 제 4 항에 있어서,
c-Met 를 발현하는 암에 대한 항암·항전이약인, 의약 조성물. - 제 4 항에 있어서,
EGFR 을 발현하는 암에 대한 항암약인, 의약 조성물. - 제 4 항에 있어서,
항인플루엔자 바이러스약인, 의약 조성물. - 제 1 항에 기재된 추출 분획물을 사용하는, 고분자 축합형 탄닌을 활성 성분으로서 함유하는 의약 조성물의 함량 측정법.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2019131536A (ja) | 2019-08-08 |
| JP2023052160A (ja) | 2023-04-11 |
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