KR20190065235A - 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제 - Google Patents

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Abstract

천연물 유래의 유효성분을 포함하는, 고활성인 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제를 제공한다. 본 발명은, 아교를 유효성분으로서 포함하는, 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제이다.

Description

피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제
본 발명은, 아교를 유효성분으로서 포함하는, 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제에 관한 것이다.
피부는 생체의 최외곽에 위치하는 기관이며, 생체방어, 감각, 체온조절 및 배설 작용 등의 중요한 생리기능을 담당하고 있다. 또한, 이러한 기능은, 피부의 주구성인 표피나 섬유아세포뿐만 아니라, 지선(脂腺)(피지선) 등의 피부 부속기관에 의해 조절되고 있다. 즉, 표피, 진피 및 지선 등의 기능을 통합적으로 조절하고, 그리고 유지하는 것이 피부의 구조적 및 기능적 장벽의 구축에 필수적인 것으로 여겨진다.
지선으로부터 분비되는 피지의 주성분은, 지선 세포에서 합성되는 트라이아실글리세롤이며, 그 밖에 왁스 에스터, 스쿠알렌 등의 지선 특유의 지질이 포함되어 있다. 지선으로부터 배출된 피지는, 피부로부터의 수분증산을 억제시켜서 피부의 항상성을 유지하는 것 이외에, 피지 중의 트라이아실글리세롤이 분해되어서 생기는 유리 지방산의 존재에 의해서 표피를 저pH로 유지시키고, 약산성의 지질막이 유해물질에 대한 완충 작용이나 생체방어기능도 담당하고 있다. 따라서, 피지 합성이나 생산이 불충분하다면, 생체방어기구가 충분히 기능할 수 없고, 또한 알레르기 증상의 증가 악화 등도 유발할지도 모른다.
피지 생산 촉진 성분으로서, 안정성이 높은 천연물 유래의 유효성분의 개발이 요구되고 있다. 특허문헌 1에는, 발아 브로콜리 유래 성분을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 피지 생산 촉진제에 관한 발명이 기재되어 있다.
히알루론산(HA)은, 콜라겐, 엘라스틴 등의 단백질과 함께 세포외 매트릭스를 구성하는, 글리코사미노글리칸의 일종이다. 히알루론산은 보수력이 우수하므로, 피부의 보습에 기여하고 있는 것으로 여겨지고 있다.
피부 조직에 있어서의 히알루론산의 생산은, 주로 섬유아세포가 담당하고 있는 것으로 여겨지고 있다. 히알루론산은, 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민을 구성 단위로 하고, 생체 내에 있어서는 히알루론산 합성효소(HAS)에 의해 합성되어, 히알루로니다제 등의 분해효소에 의해서 분해된다. 한편, 연령 증가에 의해 섬유아세포의 증식 능력이 저하되거나 히알루론산 합성능력이 저하되거나 하면, 피부 조직 중의 히알루론산량은 저하된다. 이것에 의해, 피부의 보습성이나 탄력성이 손상되어, 연령 증가에 따른 주름의 발생이나 피부 거칠음의 원인이 되고 있는 것으로 여겨지고 있다.
히알루론산 생산 촉진 성분으로서, 안정성이 높은 천연물 유래의 유효성분의 개발이 요구되고 있다. 특허문헌 2에는, 콜라겐 펩타이드의 히알루론산 생산 촉진제에 관한 발명이 기재되어 있다.
JP 2009-114152 A JP 2014-210766 A
본 발명은, 상기 사정을 감안해서 이루어진 것으로, 천연물 유래의 유효성분을 포함하는, 고활성인 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 문제를 해결하기 위하여, 예의 연구를 행한 결과, 아교를 유효성분으로서 포함하는 제제에 의해서 상기 과제가 해결되는 것을 찾아내어, 본 발명의 완성에 이르렀다.
도 1은, 아교(진공), 스프레이 아교, 어류 유래 펩타이드(펩타이드 FPC), 돼지 유래 펩타이드(PRA-PC) 또는 변성 콜라겐(젤라틴)을 포함하는 배지에서 3일마다 처리를 해서 6일간 배양한 햄스터 지선세포에 있어서의, 세포 내의 트라이아실글리세롤(TG)량을 나타낸다(도면 중, "＊＊"(p < 0.01) 및 "＊＊＊"(p < 0.001)은 대조군(Cont)에 대하여 통계적으로 유의한 것을 나타낸다).
도 2는, 인슐린(양성 대조), 아교(진공) 또는 스프레이 아교를 포함하는 배지에서 3일마다 처리를 해서 6일간 배양한 햄스터 지선세포의, 오일 레드 O 염색 화상이다.
도 3은, 아교(진공) 또는 스프레이 아교를 포함하는 배지에서 인간 표피 세포를 24시간 배양한 후에 있어서의, 배지 중의 히알루론산(HA)량을 나타낸다(도면 중, "＊"(p < 0.05) 및 "＊＊＊"(p < 0.001)은 대조군(Cont)에 대하여 통계적으로 유의한 것, 및 "#"(p < 0.05), "##"(p < 0.01) 및 "###"(p < 0.001)은 IL-1α처리 세포에 대하여 통계적으로 유의한 것을 나타낸다).
도 4는, 아교(진공) 또는 스프레이 아교를 포함하는 배지에서 24시간 배양한 인간 표피 세포에 있어서의, 히알루론산 합성효소-2(HAS-2) mRNA의 상대발현량을 나타낸다(도면 중, "＊"(p < 0.05)은 대조군(Cont)에 대하여 유의한 것, 및 "##"(p < 0.01)은 IL-1α처리 세포에 대하여 통계적으로 유의한 것을 나타낸다).
도 5는, 아교(진공) 또는 스프레이 아교를 첨가한 신선 배지 중의 히알루론산(HA)량(도 5A), 및 히알루로니다제 존재 하 또는 비존재 하에서 전처리한 스프레이 아교를 첨가한 배지 중의 히알루론산(HA)량(도 5B)을 나타낸다.
도 6은, 히알루로니다제 존재 하 또는 비존재 하에서 전처리한 스프레이 아교를 포함하는 배지에서 24시간 배양한 인간 표피 세포에 있어서의, HAS-2 mRNA의 상대발현량을 나타낸다(도면 중, "＊"(p < 0.05) 및 "＊＊"(p < 0.01)은 대조군(Cont)에 대하여 통계적으로 유의한 것을 나타낸다).
도 7은, 스프레이 아교를 포함하는 배지에서 인간 표피 세포를 24시간 배양 후, 자외선(UVB, 0.6kJ/㎡)을 조사하고, 더욱 24시간 배양한 후에 있어서의, 배지 중의 히알루론산(HA)량을 나타낸다(도면 중, "＊＊＊"(p < 0.001)은 자외선 미조사(None)에 대하여 통계적으로 유의한 것, 및 "###"(p < 0.001)은 대조군(Cont)에 대하여 통계적으로 유의한 것을 나타낸다).
이하, 본 발명의 실시형태를 설명한다. 또, 본 발명은, 이하의 실시형태만으로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 범위를 나타내는 "X 내지 Y"는 "X 이상 Y 이하"를 의미한다. 또한, 특기하지 않는 한, 조작 및 물성 등의 측정은 실온(20 내지 25℃)/상대습도 40 내지 50% RH의 조건에서 행한다.
본 발명의 일 형태는 아교를 유효성분으로서 포함하는 피지량 증가제이다. 해당 형태의 다른 측면은, 피지량 증가제의 제조에 있어서의 아교의 사용에 관한 것이다. 해당 형태의 새로운 측면은 피지량 증가를 위한 아교에 관한 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 아교를 유효성분으로서 포함하는, 히알루론산 생산 촉진제이다. 해당 형태의 다른 측면은, 히알루론산 생산 촉진제의 제조에 있어서의 아교의 사용에 관한 것이다. 해당 형태의 새로운 측면은, 히알루론산 생산 촉진을 위한 아교에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 천연물 유래의 유효성분을 포함하는, 고활성인 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제를 제공할 수 있다.
아교는 일본약방외 생약규격에 게재되는 생약이며, 말과의 동물인 당나귀(Equus asinus L.)의 가죽의 추출물이다. 아교에는 보혈, 지혈 등의 작용이 있다고 일컬어지고 있고, 미백화장품의 유효성분으로서의 이용이 검토되고 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 이용되는 "아교"에는, 당나귀의 가죽의 열수추출물(전출물(煎出物): 즉, 달여낸 것)을 더욱 정제한 정제물, 임의의 분해효소 등으로 처리한 효소 처리물 등의 가공품도, 목적하는 효과가 얻어지는 한에 있어서, 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서는, 히알루론산 생산 촉진제에 유효성분으로서 포함되는 아교는, 히알루로니다제 처리물이다. 아교의 히알루로니다제 처리물로서는, 후술하는 방법에 의해 당나귀의 가죽으로부터 얻어진 추출물을, 필요에 따라서 임의의 용매에서 임의의 농도, 예를 들면 0.01 내지 1000㎎/㎖, 바람직하게는 0.5 내지 50㎎/㎖가 되도록 용해시키고, 히알루로니다제에 의해 히알루론산을 효소분해하는 것에 의해 얻어진다. 이러한 용매로서는, 물, pH 5 내지 8 정도의 인산 완충액, 아세트산 완충액, HEPES 등의 굿 버퍼(good buffer) 등의 완충액, 생리식염수 등을 이용하면 된다. 히알루로니다제의 첨가량은 추출물의 양에 따라 임의로 조정할 수 있지만, 예를 들면 10 내지 1000 TRU/㎖가 되는 농도이다. 히알루로니다제 처리의 반응 온도나 시간도 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 30 내지 45℃에서 1 내지 100시간 정도, 바람직하게는 10 내지 30시간이다. 반응 후에는 가열 등에 의해 효소의 실활 처리를 행하는 것이 바람직하다. 그 후, 필요에 따라서 후술하는 수단에 의해 분쇄, 건조시킴으로써, 히알루로니다제 처리물로서의 아교를 수득할 수 있다. 히알루로니다제 처리물에 포함되는 히알루론산량은, 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA법 등의 종래 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "유효성분으로서 포함한다"란, 피지량 증가제 또는 히알루론산 생산 촉진제로서 유효한 정도로 포함하는 것을 의미하고, 제약상 허용되는 담체 등의 그 밖의 성분을 포함하는 것은 금지되지 않는다.
본 발명에 따른 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제의 제조 방법은, 본 발명의 목적하는 효과가 달성되는 한에 있어서 특별히 제한되지 않는다. 이하, 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제의 바람직한 제조 방법에 대해서 설명한다.
피지량 증가제는, 진공건조에 의해 당나귀(Equus asinus L.)의 가죽의 열수추출물의 건조물을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 일 실시형태에서는, 당나귀(Equus asinus L.)의 가죽의 열수추출물을 수득하는 단계, 및 진공건조에 의해 상기 열수추출물의 건조물을 수득하는 단계를 포함하는, 피지량 증가제의 제조 방법이 제공된다. 이러한 제조 방법에 의해 제조된 피지량 증가제는, 피지량 증가 효과에 특히 우수한 것이 된다.
또한, 히알루론산 생산 촉진제는, 스프레이 건조에 의해 당나귀(Equus asinus L.)의 가죽의 열수추출물의 건조물을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 다른 실시형태에서는, 당나귀(Equus asinus L.)의 가죽의 열수추출물을 수득하는 것, 및 스프레이 건조에 의해 상기 열수추출물의 건조물을 수득하는 것을 포함하는, 히알루론산 생산 촉진제의 제조 방법이 제공된다. 이러한 제조 방법에 의해 제조된 히알루론산 생산 촉진제는, 히알루론산 생산 촉진 효과가 특히 우수한 것으로 된다.
상기 피지량 증가제나 히알루론산 생산 촉진제의 제조에 있어서의 열수추출의 조건은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 당나귀의 가죽 1g에 대하여 3 내지 10㎖, 바람직하게는 3 내지 5㎖가 되는 양의 열수 중에서 행한다. 추출 온도(열수의 온도)는, 예를 들면 70 내지 100℃, 바람직하게는 90 내지 100℃이다. 추출 시간도 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 5 내지 12시간, 바람직하게는 6 내지 12시간이다. 추출은 복수회 행해도 된다. 이러한 수법에 의해 조제한 추출액을, 필요에 따라서 원심농축기 등을 이용해서 농축해도 된다. 농축 시에는, 증기압을 높여서 농축을 촉진시킬 목적으로, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 아이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올 등의 저급 알코올 등을 추출액에 임의로 첨가해도 된다.
또한, 열수추출물에는, 임의로, 종래 공지의 부형제 등의 제제화를 위한 첨가제를 첨가해도 된다. 부형제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 유당, 자당, 포도당, 셀룰로스, 만니톨과 같은 당류나 당알코올; 밀 전분, 감자 전분, 옥수수 전분 등의 전분; 사이클로덱스트린 등의 덱스트린; 카복시메틸셀룰로스(CMC), 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 등의 셀룰로스 유도체; 폴리비닐피롤리돈 등의 합성 고분자화합물 등을 예시할 수 있다. 또한, 올리브유, 대두유, 면실유, 카카오 지방, 스쿠왈란, 셸락, 세탄올, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리글리세린 지방산 에스터, 자당지방산 에스터, 레시틴 등의 친유성 성분을, 제제화를 위한 첨가제로서 추출액에 첨가해도 된다. 상기 첨가제의 양은, 열수추출물에 대하여, 예를 들면 0.1 내지 5중량%가 되는 양이다.
상기한 바와 같이 조제한 열수추출물을, 바람직하게는 이하의 수법에 의해 건조를 행한다.
소정의 바람직한 실시형태에서는, 열수추출물의 건조는, 진공건조에 의해 행한다. 진공건조의 조건은, 예를 들어, 0.1 내지 1㎪, 바람직하게는 0.5 내지 0.8㎪에서 행한다. 건조 시의 온도는, 예를 들면 80 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 85℃이다. 또한, 건조 시간은, 예를 들어, 수분함량이 4 내지 8중량%, 바람직하게는 4 내지 6중량%가 되는 시간이다. 진공건조는, 피지량 증가제의 제조에 있어서 특히 바람직하게 이용된다.
다른 바람직한 실시형태에서는, 열수추출물의 건조는, 스프레이 건조에 의해 행한다. 스프레이 건조에 의해 건조할 경우는, 건조 입구온도(흡기온도)가 예를 들면 120 내지 190℃, 바람직하게는 140 내지 170℃에서 행한다. 또한, 스프레이 건조 시의 건조 출구온도(배기 온도)는, 예를 들면 70 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 90℃에서 행한다. 스프레이 건조 후의 수분함량은, 예를 들면 4 내지 8중량%이며, 바람직하게는 4 내지 6중량%이다. 스프레이 건조는, 히알루론산 생산 촉진제의 제조에 있어서 특히 바람직하게 이용할 수 있다.
건조물은, 임의로, 해머밀, 제트밀, 핀밀, 비즈밀, 매스콜로이더, 믹서, 호모지나이저 등의 공지의 수단에 의해, 분쇄를 행해도 된다.
건조물의 평균 입자직경(분쇄를 행할 경우는, 분쇄 후의 평균 입자직경)은, 예를 들면 120 내지 2000㎛이며, 바람직하게는 180 내지 1500㎛이다. 또, 해당 평균 입지직경은 입도분석기에 의해 측정한 값이다. 체 등에 의해, 목적하는 입경의 분획 부분을 회수해도 된다.
본 발명에 따른 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제는, 유효성분인 아교를, 약학적으로 허용되는 다른 성분과 함께 제제화해도 된다. 약학적으로 허용되는 다른 성분으로서는, 예를 들어, 상기 부형제 이외에, 담체, 희석제, 증량제, 유화제, 증점제, 붕괴제, 용해 보조제, 안정화제, 보존제, 완충제, 활택제, 결착제, pH 조정제, 자외선흡수제, 등장화제, 산화 방지제, 방부제, 계면활성제, 착색제, 향료, 감미료 등을 예시할 수 있다. 제형도 특별히 제한되지 않고, 경구 또는 비경구의 임의의 형태로 제제화될 수 있지만, 예를 들어, 정제, 환제, 산제, 과립제, 미립제, 용액제, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁액제, 유제, 시럽제, 주사제, 외용제(예를 들어, 연고, 크림제, 겔, 분무제, 첩부제, 로션 등), 좌제 등을 예시할 수 있다. 투여 경로도 특별히 제한되지 않고, 경구, 경장경비, 경피투여, 주사 투여(예를 들어, 정맥내 투여, 피하투여, 근육투여, 복강내 투여 등) 등을 포함하는 모든 투여 경로를 이용할 수 있다. 그 밖에, 세안료, 샴푸, 린스, 화장료 등의 형태여도 된다. 제제 중의 유효성분의 함량은, 예를 들어, 0.01 내지 90중량%이며, 바람직하게는 1 내지 10중량%이다.
피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제의 최적인 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별, 증상, 투여 방법 등에 따라서 다르지만, 예를 들어, 1회의 투여에 있어서 1kg 체중당, 0.1㎍ 내지 1000㎎의 비율로, 바람직하게는 10㎍ 내지 50㎎의 비율로, 1일당 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 고체 형태, 반고체 형태, 액상, 현탁 액상, 겔 형태, 풀 형태, 분말 형태, 과립 형태 등, 공지의 형태의 식품에 유효성분을 배합해서 투여해도 된다.
본 발명에 따른 피지량 증가제 및 히알루론산 생산 촉진제가 투여되는 대상은, 인간 또는 비인간 동물의 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 모르모트, 소, 돼지, 개, 말, 고양이, 염소, 양을 포함하는 포유동물, 조류이지만, 바람직하게는 인간이다.
실시예
본 발명의 효과를, 이하의 실시예 및 비교예를 이용해서 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위가 이하의 실시예만으로 제한되는 것은 아니다.
<제조예 1: 아교(진공)>
당나귀의 가죽을 물로서 세정한 후에 면도하고, 당나귀의 가죽 50g에 대하여 200㎖의 열수(95℃) 중에서 8시간 추출했다. 열수추출은 3회 반복했다. 추출액을 필터로 여과한 후, 합쳐서, 100㎖의 추출액에 대하여 0.2㎖의 0.4중량% 에탄올 수용액, 0.2g의 자당, 및 0.2g의 대두유를 첨가하고, 원심농축기에서 2 내지 3배 정도까지 농축하고, 당나귀의 가죽의 열수추출물을 얻었다. 그 후, 95℃에서 30분간 가열 살균한 열수추출물을 진공건조기(기종명 BVD205, 원저우진방사(
Figure pct00001
) 제품, 진공도 0.6㎪, 건조 온도 85℃)에서 수분함량 5.5중량%까지 건조시켰다. 건조물을 분쇄기에서 입경 1000㎛ 이하로 분쇄하고, 시료(아교(진공))로 하였다.
<제조예 2: 스프레이 아교>
상기와 마찬가지로 가열 살균한 열수추출물을, 스프레이 건조 장치(기종명LPG-200, 허난신고사(
Figure pct00002
) 제품, 건조 입구온도(흡기온도) 150℃, 건조 출구온도(배기 온도) 85℃)에서 건조시키고, 평균 입자직경 500㎛, 수분함량 4.5중량%의 건조물로 하여, 시료(스프레이 아교)를 얻었다. 또, 평균 입자직경은 입도 분석기에서 측정했다.
<실시예 1: 피지량 증가제>
상기의 제조예 1 및 2에서 조제한 시료를 이용해서, 피지량 증가 효과를 검증했다.
(실험 방법)
햄스터 지선세포를, 아교(진공)(0.5 내지 5㎎/㎖), 스프레이 아교(0.5 내지 5㎎/㎖), 인슐린(10nM, 양성 대조), 어류 유래 펩타이드(펩타이드 FPC, 주식회사 닛피(Nippi)로부터 구입)(0.5 내지 5㎎/㎖), 돼지 유래 펩타이드(PRA-PC, 주식회사 닛피로부터 구입)(0.5 내지 5㎎/㎖) 또는 변성 콜라겐(젤라틴, BD 바이오사이언스(BD bioscience)사)(0.5 내지 1㎎/㎖)의 존재 하에서 3일마다 배지 교환을 행하고, 6일간 배양했다. 한편, 햄스터 지선세포의 배양은, 문헌[J Invest Dermatol 2001:117:965-970]에 기재된 방법에 따라서, SEB 배지(둘베코 개변 이글 배지/햄F12(1:1(v/v))(인비트로젠사), 6%(v/v) 열변성 우태아혈청(JRH바이오사이언스사), 2%(v/v) 인간 혈청(ICN 바이오케미컬사), 0.68mM L-글루타민(인비트로젠사))을 이용해서, 시료의 최종 농도가 상기로 되도록 배지에 첨가하고, 37℃에서 행하였다. 또, 세포의 배양은 CO2 인큐베이터(5%(v/v) CO2) 내에서 행하였다.
배양 후, 세포 내에 축적한 트라이아실글리세롤(TG)을 아쿠아오토카이노스 TG-II(주식회사 카이노스)에 의해 측정했다. 별도, TG의 축적량의 측정에 이용한 세포 용해물 중의 DNA량을, 문헌[Anal Biochem 1982：162：338-344．(Johnson-Wint B, Hollis S．A rapid in situ deoxyribonucleic acid assay for determining cell number in culture and tissue. Anal Biochem．1982：122(2)：338-344)에 기재된 방법에 의해서 구하고, 단위 DNA 당량당의 세포내 TG량을 산출하였다.
(결과)
도 1에 나타낸 바와 같이, 아교(진공)(0.5 내지 5㎎/㎖) 및 스프레이 아교(0.5 내지 5㎎/㎖)는, 농도 의존적으로 TG합성을 촉진했다. 또한, 아교에 의한 TG 합성 촉진 작용은 스프레이 아교보다도 아교(진공) 쪽이 강했다.
한편, 어류 혹은 돼지 유래 펩타이드, 또는 변성 콜라겐(젤라틴)에는, TG 합성 촉진 작용은 확인되지 않았다(도 1). 따라서, 아교에 의한 TG 합성 촉진은, 콜라겐 펩타이드나 변성 콜라겐과는 다른 성분에 의한 작용인 것으로 추측된다.
배양 후의 햄스터 지선세포를, 오일 레드 O에 의해 세포 내에 축적한 중성지방을 염색했다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 아교(진공)(0.5 내지 5㎎/㎖) 및 스프레이 아교(0.5 내지 5㎎/㎖)로 처리한 햄스터 지선세포에 있어서, 오일 레드 O 염색 양성의 세포수가 아교의 농도 의존적으로 증가했다.
<실시예 2: 히알루론산 생산 촉진제>
상기 제조예 1 및 2에서 조제한 시료를 이용해서, 히알루론산 생산 촉진 효과를 검증했다.
(실험 방법)
정상 인간 표피 각화 세포(신생아 유래, 쿠라보사(クラボウ社))를 24웰 플레이트에서 컨플루언트까지 배양 후, 아교(진공)(0.1 내지 1㎎/㎖) 또는 스프레이 아교(0.5 내지 5㎎/㎖)의 존재 하에서 24시간 배양했다. 또, 인간 표피 세포의 배양에는, HuMedia-KG2 배지(쿠라보사)를 이용해서, CO2 인큐베이터(5%(v/v) CO2) 내에서 37℃에서 행하였다. 또한, 자외선 조사 시험은, 세포에 UVB(313㎚, Toshiba FL 20S 형광 램프, 0.6kJ/㎡)를 조사한 후에, 스프레이 아교(5㎎/㎖) 존재 하에서 24시간 배양했다.
배양 후의 배지를 회수하고, Hyaluronic Acid ELISA Assay 키트(Biotech Trading Partners사)에 의해 배지에 포함되는 히알루론산(HA) 함량을 측정했다.
배양 후에 회수한 세포로부터, ISOGEN(주식회사 닛폰진)을 이용해서 RNA를 추출했다. 얻어진 RNA를 시료로서, 정량 PCR법(측정 기기명: Thermal Cycler DiceTM Real Tｉmｅ System, 다카라바이오 주식회사)에 의해 히알루론산 합성효소-2(HAS-2) mRNA의 발현량을 측정했다. 한편, 정량 PCR법에 의한 mRNA의 측정에는, 측정 시약으로서 Prime Script RT reagent kit(다카라 바이오 주식회사), 2x QuantiTect SYBER Green PCR master Mix(퀴아겐사)를 이용해서 행하였다. HAS-2 mRNA의 발현량은, 내부 표준 유전자의 글리세르알데하이드 3-인산 데하이드로게나제(Dehydrogenase)의 발현량에 의해 보정한 상대값으로서 산출했다.
(결과)
도 3에 나타낸 바와 같이, 아교(진공)(0.1 내지 1㎎/㎖) 및 스프레이 아교(0.5 내지 5㎎/㎖)는, 농도 의존적으로 HA 생산을 촉진했다. 아교에 의한 HA 생산 촉진 효과는, 보다 생체에 가까운 IL-1α(10ng/㎖) 존재 하에서도 확인되며, 아교(진공)보다도 스프레이 아교 쪽이 히알루론산 분비량은 많았다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 스프레이 아교에 의해, 인간 표피 세포에 있어서의 HAS-2 mRNA의 발현이 촉진되었다. 따라서, 아교에 의한 HA 생산의 촉진의 한가지 원인으로서는, HAS-2 mRNA의 발현 증가를 개재해서 행해지는 것으로 추측된다.
아교는 당나귀의 가죽의 열수추출물(전출물)이기 때문에, 히알루론산을 함유한다. 아교(진공) 또는 스프레이 아교를 용해시킨 신선 배지에도 HA가 존재하고 있었다(도 5A). 도 3 및 도 4에 있어서의 효과가 아교에 내재하는 HA에 의한 것인지를 검토하기 위해서, 스프레이 아교용액(5㎎/㎖, 50mM 아세트산/0.15M NaCl(pH 6)로 용해)을 히알루로니다제(100 TRU/㎖)에서 37℃에서 하룻밤 효소 처리했다. 효소 처리 후, 100℃의 비등수욕에 있어서 30분간 가열해서 효소를 실활시켰다. 히알루로니다제 처리한 스프레이 아교용액에서는, HA는 검출되지 않았다(도 5B). 또, 대조군으로서는, 히알루로니다제 용액 대신에 동일 용량의 용매(dH2O) 또는 버퍼(50mM 아세트산/0.15M NaCl(pH 6))를 첨가해서 마찬가지로 처리하고, HA를 측정했다(도 5B).
전술한 바와 같이 조제한 스프레이 아교의 히알루로니다제 처리물을 포함하는 배지에서, 인간 표피 세포를 24시간 배양했다. 배양 후의 인간 표피 세포에 있어서의 HAS-2 mRNA의 발현량을 측정했다. 그 결과, 히알루로니다제 처리물도, HAS-2 mRNA의 발현 촉진 작용을 지니고 있었다(도 6).
자외선 조사에 의해 손상를 입힌 인간 표피 세포에 대한 아교의 효과를 확인했다(도 7). UVB(0.6kJ/㎡) 조사에 의해 HA 생산량이 저하했지만, 스프레이 아교처리에 의해 HA 생산이 촉진되었다.
본 출원은, 2016년 7월 21일자로 출원된 일본국 특허 출원 제2016-143382호에 의거하고 있고, 그 개시 내용은, 참조에 의해 전체로서 인용되어 있다.

Claims (5)

  1. 아교를 유효성분으로서 포함하는, 피지량 증가제.
  2. 피지량 증가제의 제조 방법으로서,
    당나귀(Equus asinus L.)의 가죽의 열수추출물을 수득하는 단계, 및
    진공건조에 의해 상기 열수추출물의 건조물을 수득하는 단계를 포함하는, 피지량 증가제의 제조 방법.
  3. 아교를 유효성분으로서 포함하는, 히알루론산 생산 촉진제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아교가 히알루로니다제 처리물인, 히알루론산 생산 촉진제.
  5. 히알루론산 생산 촉진제의 제조 방법으로서,
    당나귀(Equus asinus L.)의 가죽의 열수추출물을 수득하는 단계, 및
    스프레이 건조에 의해 상기 열수추출물의 건조물을 수득하는 단계를 포함하는, 히알루론산 생산 촉진제의 제조 방법.
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