KR20180095674A - 대사 저항성 펜플루라민 유사체 및 그 사용 방법 - Google Patents

대사 저항성 펜플루라민 유사체 및 그 사용 방법 Download PDF

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Abstract

대사-저항성 펜플루라민 유사체가 제공된다. 본 펜플루라민 유사체는 다양한 질환의 치료에 사용된다. 예를 들어, 필요로 하는 대상체에게 펜플루라민 유사체를 투여함으로써 간질을 치료하는 방법이 제공된다. 또한 필요로 하는 대상체의 식욕을 억제하는 방법이 제공된다. 본 방법의 실행에서 사용을 위한 약학적 조성물이 또한 제공된다.

Description

대사 저항성 펜플루라민 유사체 및 그 사용 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
35 U.S.C. § 119 (e)에 따라, 본 출원은 2015년 12월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/271,168에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 일반적으로 암페타민 약물 펜플루라민과 구조적으로 관련이 있는 화합물 및 신경학적으로 관련된 질환의 치료에서의 그것의 사용의 분야에 관한 것이다.
펜플루라민은 비만을 치료하기 위한 식욕 억제제로서 한때 널리 처방된 암페타민 약물이다. 펜플루라민은 D-암페타민의 정신운동 자극제 및 남용 가능성이 없고 뉴런으로부터 5-HT를 방출하기 위해 5-하이드록시트립타민 (세로토닌, 5-HT) 수송물질과 상호작용한다. 펜플루라민은 드라베 증후군(Dravet Syndrome), 또는 희귀성 및 악성 간질 증후군인, 유아기 중증 근간대성 간질(severe myoclonic 간질)의 치료시 항경련성 활성에 대하여 조사되었다. 이러한 유형의 간질은 이전에 건강한 아동에서 조기에 발생한다.
펜플루라민을 이용한 식욕억제 치료는 심장 섬유증(cardiac fibrosis)을 포함한, 심장 판막질환(cardiac valvulopathy) 및 폐 고혈압증(pulmonary hypertension)의 발병과 연관성이 있으며, 이는 전 세계적인 시장으로부터 펜플루라민의 회수로 이어졌다. 펜플루라민의 주요 대사산물인 노르펜플루라민과 5-HT2B 수용체의 상호작용은 심장 판막 비대증(heart valve hypertrophy)과 관련이 있다. 간질의 치료시, 펜플루라민의 공지된 심혈관계의 위험이 유익한 항경련성 활성과 비교 검토된다.
대사-저항성 펜플루라민 유사체가 제공된다. 대상 펜플루라민 유사체는 다양한 질환의 치료에 사용된다. 예를 들어, 필요로 하는 대상체에게 펜플루라민 유사체를 투여함으로써 간질을 치료하는 방법이 제공된다. 또한 필요로 하는 대상체의 식욕을 억제하는 방법이 제공된다. 대상 방법의 실행에서 사용을 위한 약학적 조성물이 또한 제공된다.
본 발명의 이들 및 그 밖의 목적, 이점, 및 특징은 하기 더 충분히 설명된 바와 같이 대사-저항성 펜플루라민 유사체 및 이것을 사용하는 방법에 대한 상세한 설명을 읽으면 당업자에게 분명해질 것이다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물을 지칭한다. 예시적인 포유류는 인간, 가축 (예로서, 개, 고양이, 등), 농경용 가축 (예로서, 소, 양, 돼지, 말, 등) 또는 실험 동물 (예로서, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 등)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다. "환자"는 인간 및 비-인간 대상체, 특히 포유동물 대상체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는", 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 것에 관하여 예방적일 수도 있고 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유에 관하여 치료적일 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료", "치료적", 또는 "요법"이 반드시 질환 또는 상태의 전체적인 치유 또는 폐지를 의미하는 것은 아니다. 어느 정도로 질환 또는 상태의 임의의 원치 않는 징후 또는 증상의 경감이 치료 및/또는 요법으로 간주될 수 있다. 또한, 치료는 환자의 웰빙 또는 외모에 대한 전반적인 느낌을 악화시킬 수도 있는 작용을 포함할 수도 있다. "치료"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 포유동물, 특히 인간의 질환의 어떠한 치료도 커버하고, 다음을 포함한다: (a) 질환에 취약할 수도 있지만 그것에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환의 발병 예방; (b) 질환의 억제, 즉, 발병의 저지 및 (c) 질환의 완화, 즉, 질환의 퇴행 유발.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 pKa는 산의 산 해리 상수 (Ka)의 음의 알고리즘 (p)을 지칭하고, 같은 농도의 산 및 그것의 컨쥬게이트 기본형이 용액 내에 존재하는 pH 값과 동일하다.
"알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자 및 예컨대 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 가진, 1가 포화 지방족 하이드로카르빌 기를 지칭한다. 이 용어는, 예로서, 메틸 (CH3-), 에틸 (CH3CH2-), n-프로필 (CH3CH2CH2-), 아이소프로필 ((CH3)2CH-), n-부틸 (CH3CH2CH2CH2-), 아이소부틸 ((CH3)2CHCH2-), sec-부틸 ((CH3)(CH3CH2)CH-), t-부틸 ((CH3)3C-), n-펜틸 (CH3CH2CH2CH2CH2-), 및 네오펜틸 ((CH3)3CCH2-)과 같은 선형 및 분지형 하이드로카르빌 기를 포함한다.
용어 "치환된 알킬"은 본원에서 한정된 바와 같이 알킬 사슬에서 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자, 예컨대 -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (여기서 n은 0 내지 2이다), -NR- (여기서 R은 수소 또는 알킬이다)로 선택적으로 치환되고 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로사이클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 나이트로, -SO-알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴, 및 -NRaRb (여기서 R' 및 R"는 같거나 다를 수도 있고 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로환식으로부터 선택된다)로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체를 가진 알킬 기를 지칭한다.
"아실"은 기 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알케닐-C(O)-, 치환된 알케닐-C(O)-, 알키닐-C(O)-, 치환된 알키닐-C(O)-, 사이클로알킬-C(O)-, 치환된 사이클로알킬-C(O)-, 사이클로알케닐-C(O)-, 치환된 사이클로알케닐-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로사이클릴-C(O)-, 및 치환된 헤테로사이클릴-C(O)-을 지칭하며, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로환식, 및 치환된 헤테로환식은 본원에서 한정된 바와 같다. 예를 들어, 아실은 "아세틸" 기 CH3C(O)-를 포함한다.
용어 "아실옥시"는 기 알킬-C(O)O-, 치환된 알킬-C(O)O-, 사이클로알킬-C(O)O-, 치환된 사이클로알킬-C(O)O-, 아릴-C(O)O-, 헤테로아릴-C(O)O-, 및 헤테로사이클릴-C(O)O-를 지칭하며, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로사이클릴은 본원에서 한정된 바와 같다.
"아릴" 또는 "Ar"은 단일 고리 (예컨대 페닐 기에 존재함) 또는 다수의 축합 고리를 가진 고리계 (이러한 방향족 고리계의 예는 나프틸, 안트릴 및 인다닐을 포함한다)를 가진 6 내지 18개의 탄소 원자의 1가 방향족 탄소환식 기를 지칭하며, 이 축합 고리는 방향족이거나 아닐 수도 있으며, 단 부착점은 방향족 고리의 원자를 통한다. 이 용어는, 예로서, 페닐 및 나프틸을 포함한다. 아릴 치환체에 대한 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 이러한 아릴 기는 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알케닐, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알카릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카르복실, 카르복실알킬, 시아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴 및 트라이할로메틸로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있다.
"헤테로아릴"은 고리 내에서 1 내지 15개의 탄소 원자, 예컨대 1 내지 10개의 탄소 원자 및 산소, 질소, 및 황으로 구성된 기로부터 선택된 1 내지 10개의 헤테로원자의 방향족 기를 지칭한다. 이러한 헤테로아릴 기는 단일 고리 (예컨대 피리디닐, 이미다졸릴 또는 퓨릴) 또는 고리계 내에서예를 들어, 인돌리지닐, 퀴놀리닐, 벤조푸란, 벤즈이미다졸릴 또는 벤조티에닐과 같은 기에서와 같이) 다수의 축합 고리를 가질 수 있으며, 고리계 내에서 적어도 하나의 고리는 방향족이며, 단 부착점은 방향족 고리의 원자를 통한다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 선택적으로 산화되어 N-산화물 (N→O), 설피닐, 또는 설포닐 모이어티를 제공한다. 이 용어는, 예로서, 피리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐, 및 푸라닐을 포함한다. 헤테로아릴 치환체에 대한 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 이러한 기는 아실옥시, 하이드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알케닐, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알카릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카르복실, 카르복실알킬, 시아노, 할로겐, 나이트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴, 및 트라이할로메틸로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체, 또는 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있다.
"헤테로환", "헤테로환식", "헤테로사이클로알킬", 및 "헤테로사이클릴"은 단일 고리 또는 접합 가교 및 스파이로 고리계를 포함한 다수의 축합 고리를 갖고 1 내지 10개의 헤테로 원자를 포함한 3 내지 20개의 고리 원자를 가진 포화 또는 불포화 기를 지칭한다. 이들 고리 원자는 질소, 황, 또는 산소로 구성된 군으로부터 선택되는데, 접합 고리계에서, 고리 중 하나 이상은 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴일 수 있으며, 단 부착점은 비-방향족 고리를 통한다. 특정 구체예에서, 헤테로환 기의 질소 및/또는 황 원자(들)는 선택적으로 산화되어 N-산화물, -S(O)-, 또는 -SO2- 모이어티를 제공한다.
헤테로환 및 헤테로아릴의 예는 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 아이소인돌, 인돌, 다이하이드로인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 아이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린, 펜안트리딘, 아크리딘, 펜안트롤린, 아이소티아졸, 페나진, 아이속사졸, 펜옥사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈이미드, 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라하이드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐 (티아모르폴리닐로도 불림), 1,1-다이옥소티오모르폴리닐, 피페리디닐, 피롤리딘, 테트라하이드로푸라닐, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 개시된 것에 더하여, 용어 "치환된"은 또한, 명시된 기 또는 라디칼을 변형시키는데 사용될 때, 하기 한정된 바와 같이 명시된 기 또는 라디칼의 하나 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 같거나 상이한 치환기로 대체된다는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 개개의 용어에 관하여 개시된 기에 더하여, 명시된 기 또는 라디칼의 포화 탄소 원자 상에서 하나 이상의 수소를 치환하기 위한 치환기 (단일 탄소 상에서 임의의 두 개의 수소가 =O, =NR70, =N-OR70, =N2 또는 =S로 대체될 수 있다)는, 달리 명시되지 않는 한, -R60, 할로, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R70, -SO2O-M+, -SO2OR70, -OSO2R70, -OSO2O-M+, -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70) 2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O-M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, 여기서 R60은 선택적으로 치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 R70은 독립적으로 수소 또는 R60이고; 각각의 R80은 독립적으로 R70이거나 또는 대안으로, 두 개의 R80은, 그것들이 결합되는 질소 원자와 함께 취해지면, O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택된 같거나 상이한 추가적인 헤테로원자 중 1 내지 4개를 선택적으로 포함할 수도 있는 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬을 형성하며, 이것들 중 N은 -H 또는 C1-C3 알킬 치환을 가질 수도 있고; 각각의 M+는 순(net) 단일 양전하를 가진 반대 이온이다. 각각의 M+는 독립적으로, 예를 들어, 알칼리 이온, 예컨대 K+, Na+, Li+; 암모늄 이온, 예컨대 +N(R60)4; 또는 알칼리 토류 이온, 예컨대 [Ca2+]0.5, [Mg2+]0.5, 또는 [Ba2+]0.5일 수도 있다 ("아래 첨자 0.5는 이러한 2가 알칼리 토류 이온에 대한 반대 이온 중 하나가 본 발명의 화합물의 이온화된 형태이고 다른 하나는 클로라이드와 같은 전형적인 반대 이온일 수 있거나, 또는 본원에서 개시된 두 개의 이온화된 화합물이 이러한 2가 알칼리 토류 이온에 대한 반대 이온의 역할을 할 수 있거나, 또는 두 배로 이온화된 화합물이 이러한 2가 알칼리 토류 이온에 대한 반대 이온의 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다). 구체적인 예로서, -NR80R80은 -NH2, -NH-알킬, N-피롤리디닐, N-피페라지닐, 4N-메틸-피페라진-1-일 및 N-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 개시된 것에 더하여, "치환된" 알켄, 알킨, 아릴 및 헤테로아릴 기의 불포화 탄소 원자 상에서 수소에 대한 치환기는, 달리 명시되지 않는 한, -R60, 할로, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -SO2R70, -SO3 -M+, -SO3R70, -OSO2R70, -OSO3 -M+, -OSO3R70, -PO3 -2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -CO2 -M+, -CO2R70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OCO2 -M+, -OCO2R70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80인데, 여기서 R60, R70, R80 및 M+는 앞서 한정된 바와 같으며, 단 치환된 알켄 또는 알킨의 경우에 치환체는 -O-M+, -OR70, -SR70, 또는 -S-M+이 아니다.
본원에서 개개의 용어에 관하여 개시된 기에 더하여, "치환된" 헤테로알킬 및 사이클로헤테로알킬 기의 질소 원자 상에서 수소에 대한 치환기는, 달리 명시되지 않는 한, -R60, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트라이할로메틸, -CF3, -CN, -NO, -NO2, -S(O)2R70, -S(O)2O-M+, -S(O)2OR70, -OS(O)2R70, -OS(O)2O-M+, -OS(O)2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)(OR70), -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70C(O)OR70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, 여기서 R60, R70, R80 및 M+는 앞서 한정된 바와 같다.
본원에서 개시된 것에 더하여, 특정 구체예에서, 치환되는 기는 1, 2, 3, 또는 4개의 치환체, 1, 2, 또는 3개의 치환체, 1 또는 2개의 치환체, 또는 1개의 치환체를 가진다.
상기 한정된 모든 치환된 기에서, 치환체를 그 자체로 추가의 치환체로 한정함으로써 유도된 폴리머 (예로서, 자체가 치환된 아릴 기로 치환된 치환체로서 치환된 아릴 기를 가진 치환된 아릴이 치환된 아릴 기로 또 치환된 것, 등)는 본원에서 포함되는 것으로 의도되지 않는다. 이러한 경우에, 이러한 치환의 최대 개수는 세 개이다. 예를 들어, 본원에서 구체적으로 고려되는 치환된 아릴 기의 일련의 치환은 치환된 아릴-(치환된 아릴)-치환된 아릴로 제한된다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서 명확하게 한정되지 않은 치환체의 명명법은 작용기의 말단 부분에 이어서 부착점에 인접한 작용기를 명명함으로써 유도된다. 예를 들어, 치환체 "아릴알킬옥시카르보닐"은 기 (아릴)-(알킬)-O-C(O)-를 지칭한다.
하나 이상의 치환체를 함유한, 본원에서 개시된 기 중 임의의 것에 관해서는, 물론, 이러한 기는 입체구조적으로 비현실적이고 및/또는 합성에 의해 실현 불가능한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 함유하지 않는다. 이에 더하여, 대상 화합물은 이들 화합물의 치환으로부터 발생한 모든 입체화학적 이성질체를 포함한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 포유동물과 같은 환자에게 투여가 허용된 염 (주어진 투약 체계에 대하여 허용 가능한 포유류 안전성을 가진 반대 이온을 가지고 있는 염)을 의미한다. 이러한 염은 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기 염기 및 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기 산으로부터 유래될 수 있다."약학적으로 허용 가능한 염"은 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 지칭하며, 이 염은 업계에 널리 공지되어 있는 다양한 유기 및 무기 반대 이온으로부터 유래되고, 단지 예로서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄, 등; 및 분자가 염기성 작용기를 함유할 때에는, 유기산 또는 무기산의 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포르메이트, 타르트레이트, 베실레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말레에이트, 옥살레이트, 등을 포함한다.
용어 "그것의 염"은 산의 양성자가 양이온, 예컨대 금속 양이온 또는 유기 양이온 등에 의해 대체될 때 형성된 화합물을 의미한다. 적용 가능한 경우, 염은 약학적으로 허용 가능한 염이지만, 환자에게 투여를 위한 것으로 의도된 것이 아닌 중간체 화합물의 염에는 필요하지 않다. 예로서, 화합물의 염은 염의 음이온성 구성요소로서 무기산 또는 유기산의 컨쥬게이트 염기와 함께, 화합물이 무기산 또는 유기산에 의해 양성자화되어 양이온을 형성하는 것을 포함한다.
"용매 화합물"은 용질의 분자 또는 이온과 용매 분자의 조합에 의해 형성된 복합체를 지칭한다. 용매는 유기 화합물, 무기 화합물, 또는 둘 다의 혼합물일 수 있다. 용매의 몇 가지 예는 메탄올, N,N-다이메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 다이메틸설폭시드, 및 물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 용매가 물일 때, 형성된 용매 화합물은 수화물이다.
"입체이성질체" 및 "입체이성질체들"은 원자 연결성이 같지만 공간에서 원자 배열이 상이한 화합물을 지칭한다. 입체이성질체는 씨스(cis)-트랜스(trans) 이성질체, E 및 Z 이성질체, 거울상체, 및 부분입체이성질체를 포함한다.
"호변체"는 단지 원자의 전자 결합 및/또는 양성자의 위치만 다른 분자의 대안의 형태, 예컨대 에놀-케토 및 이민-에나민 호변체, 또는 -N=C(H)-NH- 고리 원자 배열을 함유하는 헤테로아릴 기의 호변체 형태, 예컨대 피라졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 트리아졸, 및 테트라졸을 지칭한다. 당업자는 그 밖의 호변체 고리 원자 배열이 가능하다는 것을 인식할 것이다.
용어 "또는 그것의 염 또는 용매 화합물 또는 입체이성질체"는 대상 화합물의 입체이성질체의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매 화합물과 같이, 염, 용매 화합물 및 입체이성질체의 모든 순열을 포함하도록 의도되는 것으로 인정될 것이다.
"약학적 유효량" 및 "치료적 유효량"은 명시된 장애 또는 질환 또는 그 증상 중 하나 이상을 치료하고 및/또는 질환 또는 장애의 발병을 예방하기에 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 종양형성성 증식성 장애에 관하여, 약학적 또는 치료적 유효량은, 다른 것들 중에서도, 종양을 줄어들게 하거나 종양의 성장 속도를 감소시키기에 충분한 양을 포함한다.
상세한 설명
화합물 및 방법이 기술되기 전에, 본 발명이 기술된 특정 화합물 및 방법에 제한되지 않으며, 물론, 달라질 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 의도가 없음을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 및 하한 사이에서, 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한, 하한의 단위의 10분의 1에 대한 각각의 사이 값이 또한 구체적으로 개시된다. 언급된 범위 내에서 임의의 언급된 값 또는 사이 값과 상기 언급된 범위 내에서 임의의 다른 언급된 값 또는 사이 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 발명 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 또는 제외될 수도 있으며, 두 한계 중 하나, 또는 둘 다가 더 작은 범위에 포함되거나 또는 둘 다 포함되지 않는 각각의 범위는 또한, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계를 조건으로, 본 발명 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위는 또한 본 발명에 포함된다.
달리 한정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 몇 가지 잠재적이고 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 간행물이 관련하여 인용된 방법 및/또는 재료를 개시 및 기술하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 본 개시물은 모순이 존재하는 정도까지는 포함된 간행물의 어떠한 개시물을 대체하는 것으로 이해된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 분명하게 나타나지 않는 한 단수형 "하나의(a)", "하나의(an)", 및 "그(the)"는 복수의 지시대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 지시대상은 복수의 이러한 화합물을 포함하고 "방법"에 대한 지시대상은 당업자에게 공지되어 있는 하나 이상의 방법 및 이것의 동등물, 등에 대한 지시대상을 포함한다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 입장으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개일은 실제 공개일과 상이할 수도 있으며 이것은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수도 있다.
대사-저항성 펜플루라민 유사체
본 개시물은 전신성 대사에 저항성인 펜플루라민의 구조적 및/또는 기능적 유사체에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "펜플루라민 유사체"는 펜플루라민의 구조적 및/또는 기능적 유사체를 지칭한다. 펜플루라민의 기능적 유사체가 반드시 구조적 유사체일 필요는 없다. 명확하게 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이 펜플루라민 유사체는 기능적 및 구조적 유사체 둘 다를 포함한다. 어떤 경우에, 대상 펜플루라민 유사체는 생체 내에서 탈에틸화된 노르펜플루라민 유사체로의 대사에 대하여 저항성이다.
펜플루라민은 증가된 심장 질환 사건으로 인해 약물 시장에서 회수된 효과적인 식욕 억제제이다. 펜플루라민은 생체 내에서 노르펜플루라민으로 대사된다. 이러한 대사는 하기 도시된 바와 같이 노르펜플루라민을 생산하기 위한 N-에틸 기의 분열을 포함한다.
Figure pct00001
탈에틸화된 노르펜플루라민 대사산물은 폐 고혈압증 증가 및 대동맥 판막증(aortic valvular disease)과 같은 부작용을 유발하는 바람직하지 않은 생물학적 활성을 가질 수 있다.
본 개시물은 이러한 바람직하지 않은 대사에 대하여 안정화된 화합물을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대사-저항성"은 화합물의 의도된 약리학적 효과를 감소시키는 펜플루라민의 대사 경로 중 임의의 것에 대한 펜플루라민의 안정성을 지칭한다. 대상 화합물이 저항성일 수 있는 관심있는 한 대사 경로는 간의 P450 효소(들)를 통해 일어날 수 있는 탈에틸화이다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 대사적으로 안정한 것으로 불린다.
노르펜플루라민으로의 대사
펜플루라민은 간의 사이토크롬 P450 효소와 같은 효소를 대사시킴으로써 생체 내에서 노르펜플루라민으로 대사된다. 펜플루라민을 노르펜플루라민으로 전환시키는 인간 간의 효소는 CYP1A2, CYP2B6, 및 CYP2D6을 포함하고; CYP2C9, CYP2C19, 및 CYP3A4가 또한 역할을 한다.
펜플루라민 유사체
본 개시물의 양태는, 예로서, 대사 효소의 작용을 통해 (예로서, 본원에서 기술된 바와 같음), N-탈알킬화에 대하여 저항성인 펜플루라민의 유사체를 포함한다. 일부 구체에에서, 펜플루라민 유사체는 사이토크롬 P450 효소에 대하여 저항성이다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2, CYP2B6, CYP3A4 및 CYP2C9로부터 선택된 P450 효소에 대하여 저항성이다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 CYP1A2, CYP2B6 및 CYP2D6으로부터 선택된 P450 효소에 대하여 저항성이다. 어떤 경우에, 대상 펜플루라민 유사체는 생체 내에서 1차 아민으로의 탈알킬화에 대하여 안정화된 2차, 3차 또는 4차 아미노 기를 포함한다.
어떤 경우에, 유사체는 불소화된 화합물, 예로서, 하나 이상의 불소 치환체를 포함하는 펜플루라민 유사체이다. 어떤 경우에, 유사체는 펜플루라민의 아민 질소에 인접한 위치(들)에서 불소 치환체를 포함한다. "~에 인접한"은 알파, 베타 또는 감마에 위치한 탄소 원자 위치에서 아민 질소로의 치환을 의미한다. 일부 구체에에서, 펜플루라민 유사체는 화합물에 사이토크롬 P450 효소에 대한 저항성을 부여하는 하나 이상의 추가적인 비-불소 치환체를 더 포함한다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 화합물에 CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2, CYP2B6 CYP3A4 및 CYP2C9로부터 선택된 P450 효소에 대한 저항성을 부여하는 하나 이상의 추가적인 비-불소 치환체를 더 포함한다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 화합물에 CYP1A2, CYP2B6 및 CYP2D6으로부터 선택된 P450 효소에 대한 저항성을 부여하는 하나 이상의 추가적인 비-불소 치환체를 더 포함한다. 어떤 경우에는, 유사체는 화합물에 CYP2D6 대사에 대한 저항성을 부여하는 하나 이상의 추가적인 비-불소 치환체를 더 포함한다.
일반적으로, pKa의 변화는 P450 효소 (예로서, CYP2D6) 기질 결합에 대하여 두드러진 효과를 가질 수 있다. 더 염기성인 아민 기를 포함하는 P450 효소 기질은 더 높은 친화도 및 촉매 효율로 회합된다. 본 개시물은 아미노 기의 pKa가 펜플루라민의 아민 기에 비해 더 낮은 (즉, 더 낮은 염기도) 불소 치환된 유사체를 제공한다.
이에 더하여, 대사 효소, 예컨대 P450 효소에서 높은 친유성의 치환체는 높은 친화도 및 촉매 효율로 회합될 수 있다. 어떤 경우에는, P450 효소는 CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2, CYP2B6 CYP3A4 및 CYP2C9로부터 선택된다. 본 개시물은 펜플루라민에 존재하지 않는 하나 이상의 친수성 치환체를 포함하는 펜플루라민의 치환된 유사체를 제공하며 이것은 화합물에 바람직한 감소된 친유성을 부여한다.
관심있는 생물학적 활성 화합물의 중수소화는 약동학 (PK), 약역학 (PD), 및/또는 독성 프로파일이 개선된 유사체를 생산할 수 있다. 일부 구체에에서, 관심있는 펜플루라민 유사체는 아민 질소 원자에 인접한 어떠한 편리한 위치에서도 (예로서, 본원에서 기술된 바와 같음) 중수소 치환체를 포함한다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 2개 이상의 중수소 치환체, 예컨대 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 중수소 치환체를 포함한다. 어떤 경우에, 중수소 치환체는 화합물 상의 아미노 N 원자에 인접한 탄소 원자, 예로서, 알파-탄소 원자 상에 위치한다. 어떤 경우에, 둘 이상의 중수소 치환체가 아미노 질소에 인접한 같은 탄소 원자 상에 위치한다.
대상 펜플루라민 유사체에 포함될 수 있는, 관심있는 그 밖의 변형은, 예로서, 등배전자(isosteric) 또는 등전자(isoelectronic) 기로의 펜플루라민의 -CF3 아릴 치환체의 대체, 및 4차 아미노 기의 도입을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 어떤 경우에, 펜플루라민은 -SF5 아릴 치환체를 포함한다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 아민 질소가 4차 아민, 즉, 양전하를 띈 암모늄 기인 N-알킬화된 유사체이다. 일부 구체에에서, 유사체는 N-메틸화된 아민 기를 포함한다.
본 개시물의 양태는 대사 효소로의 화합물의 결합을 입체구조적으로 방해하는 아미노 N 원자 상의 추가적인 치환체를 포함하는 펜플루라민 유사체를 포함한다. 입체구조적으로 부피가 큰 기를 제공하기 위해 임의의 편리한 치환체가 대상 화합물의 N 원자에서 포함될 수도 있다. 어떤 경우에, 관심있는 N-치환체는 N-알킬 또는 N-치환된 알킬 기이다. 어떤 경우에, N-치환체는 N-아릴, N-헤테로아릴, N-치환된 아릴 또는 N-치환된 헤테로아릴 기이다. 관심있는 치환체는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, tert-부틸, 트라이플루오로메틸, 페닐, 벤질 및 치환된 벤질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체에에서, 유사체는 N-t-부틸 기를 포함한다.
일부 구체에에서, 펜플루라민 유사체는 다음 식 (I)을 가지는 화합물 또는 이것의 염이다:
Figure pct00002
상기 식에서:
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 수소, 할로겐, X1, X2, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 제2 R1-R7 기와 함께 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며 여기서 R2 및 R5, R2 및 R4, R1 및 R5, R6 및 R7, 및/또는 R3 및 R6은 순환 방식으로 결합되고;
X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
m은 0-4이고;
n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
식 (I)의 일부 구체예에서, R2 및 R5는 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 식 (I)의 일부 구체예에서, R2 및 R4는 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 식 (I)의 일부 구체예에서, R1 및 R5는 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 식 (I)의 일부 구체예에서, R6 및 R7은 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 식 (I)의 일부 구체예에서, R3 및 R6은 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다.
일부 구체에에서, 펜플루라민 유사체는 식 (II)를 가지는 화합물 또는 이것의 염이다:
Figure pct00003
상기 식에서:
R1은 알킬, 치환된 알킬 (예로서, CF3) 또는 SF5이고;
R2, R3, R4 및 R5는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 R2 및 R5 또는 R2 및 R4는 선택적으로 순환 방식으로 결합되고;
X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다. 식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, R2 및 R4는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택된다.
식 (II)의 일부 구체예에서, R2 및 R5는 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 식 (II)의 일부 구체예에서, R2 및 R4는 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 어떤 경우에는, R2는 순환 방식으로 R5에 결합되어, 예로서, 포화되거나 포화되지 않은 5, 6 또는 7-원 탄소환식 또는 헤테로환식 고리를 형성한다. 식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, R5는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 치환된 알콕시, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 어떤 경우에는, R5는 순환 방식으로 R2에 결합되어, 예로서, 포화되거나 포화되지 않은 5, 6 또는 7-원 탄소환식 또는 헤테로환식 고리를 형성한다. 식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, 각각의 R3는 수소, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, n은 1이다. 식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, n은 2이다. 식 (I)의 일부 구체예에서, R3는 H이다. 식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, R3는 H이다. 어떤 경우에, R3는 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴로부터 선택된다. 어떤 경우에, R3는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, tert-부틸, 트라이플루오로메틸, 페닐, 벤질 및 치환된 벤질로부터 선택된다. 식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, R3는 t-부틸이고 n은 1이다.
식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 다음 식 (III)를 가진다:
Figure pct00004
상기 식에서 X1-X7은 각각 독립적으로 H, D 또는 F이고, R1, R3 및 R4는 식 (I)의 구체예 중 어느 것에서 한정된 바와 같다. 식 (III)의 일부 구체예에서, R3는 수소, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 식 (III)의 일부 구체예에서, R3는 H이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, R3는 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴로부터 선택된다. 어떤 경우에, R3는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, tert-부틸, 트라이플루오로메틸, 페닐, 벤질 및 치환된 벤질로부터 선택된다. 식 (III)의 일부 구체예에서, R3는 t-부틸이다.
식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7은 각각 독립적으로 H 또는 F이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 하나는 F이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 두 개는 F이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 세 개는 F이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 네 개는 F이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 다섯 개는 F이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 여섯 개는 F이다.
식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7은 각각 독립적으로 H 또는 D이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 하나는 D이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 두 개는 D이다. 식 (II)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 세 개는 D이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 네 개는 D이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 다섯 개는 D이다. 식 (III)의 일부 구체예에서, X1-X7 중 적어도 여섯 개는 D이다.
식 (I)-(II)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (IV)를 가진다:
Figure pct00005
상기 식에서 X8-X10 및 각각의 X는 독립적으로 H, D 또는 F이며, 단 적어도 하나의 X8-X10 또는 X는 F이다. 식 (IV)의 일부 구체예에서, 각각의 X는 F이다. 식 (IV)의 일부 구체예에서, 각각의 X는 D이다. 식 (IV)의 일부 구체예에서, 각각의 X는 H이다. 식 (IV)의 일부 구체예에서, 각각의 X는 F이다. 식 (IV)의 일부 구체예에서, X8은 F이다. 식 (IV)의 일부 구체예에서, X9 및 X10은 각각 F이다.
식 (IV)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 다음 구조 중 하나를 가진다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
식 (I)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (IVa)-(IVc) 중 하나를 가진다:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
상기 식에서 X11, X12 및 각각의 X는 독립적으로 H, D 또는 F이고;
R11-R16은 각각 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, 각각의 X는 F이다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, X11은 F이고 X12는 H이다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, X11은 F이고 X12는 F이다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, X11은 F이고 X12는 D이다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, X11은 D이고 X12는 D이다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, R11은 치환된 알킬이다 (예로서, 본원에서 기술된 바와 같음). 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, R12는 치환된 알킬이다 (예로서, 본원에서 기술된 바와 같음). 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, R13는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, tert-부틸, 트라이플루오로메틸, 페닐, 벤질 및 치환된 벤질로부터 선택된다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, R13는 tert-부틸이다. 식 (IVa)-(IVc)의 일부 구체예에서, R15 및 R16은 각각 알킬, 예컨대 메틸이다.
식 (I)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (V)를 가진다:
Figure pct00016
상기 식에서 R1, R3, R5, R6, R7 및 m은 상기 한정된 바와 같고, p는 0, 1 또는 2이고, R8 및 R9는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R8 및 R9는 순환 방식으로 결합되어 선택적으로 더 치환된 5 또는 6-원 사이클로알킬, 헤테로환, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며, 여기서 점선은 단일 또는 이중 공유 결합을 나타낸다.
식 (V)의 일부 구체예에서, R8 및 R9는 순환 방식으로 결합되지 않는다. 식 (V)의 일부 구체예에서, p는 0이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, p는 1이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, p는 2이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 알킬 에스터, 치환된 알킬 에스터, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R7은 수소, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬카르보닐옥시, 또는 치환된 알킬 카르보닐옥시이고; R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬; m은 0-4이고; p는 0 또는 1이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, R6는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, R6는 페닐 또는 치환된 페닐이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, R6는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다.
식 (V)의 일부 구체예에서, R8 및 R9는 순환 방식으로 결합되고 함께 아릴 또는 치환된 아릴 고리, 예로서, 축합 벤젠 고리를 형성한다. 식 (V)의 일부 구체예에서, R6은 수소, 플루오로 또는 중양자이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, R6은 수소이다.
식 (V)의 일부 구체예에서, R8 및 R9는 순환 방식으로 결합되고 함께 아릴 또는 치환된 아릴 고리를 형성하며, R8 및 R5는 또한 순환 방식으로 결합되고 함께 6-원 탄소환 고리, 예로서, 부분적으로 불포화된 축합 고리를 형성한다. 어떤 경우에, 화합물은 축합 탄소환식 및 헤테로환식 고리의 4-고리계를 포함한다. 식 (V)의 일부 구체예에서, R6은 수소, 플루오로 또는 중수소이다. 식 (V)의 일부 구체예에서, R6은 수소이다.
식 (V)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (VI)를 가진다:
Figure pct00017
상기 식에서 R1, R3, R7, 및 m은 상기 한정된 바와 같고, p는 0, 1 또는 2이다.
식 (VI)의 일부 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 알킬 에스터, 치환된 알킬 에스터, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R7은 수소, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬카르보닐옥시, 또는 치환된 알킬 카르보닐옥시이고; R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이고; 각각의 m은 0-4이고; p는 0 또는 1이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R7은 수소 또는 하이드록시이고; R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이고; 각각의 m은 0, 1 또는 2이고; p는 0 또는 1이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, R7은 수소 또는 하이드록시이고; R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이고; 각각의 m은 0이고; p는 0 또는 1이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, R7은 수소이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, R7은 하이드록시이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, R3는 수소이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, R3는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, p는 0이다. 식 (VI)의 특정 구체예에서, p는 1이다.
식 (VI)의 특정 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 다음 구조 중 하나 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
또는
Figure pct00021
.
식 (V)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (VII) 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00022
.
식 (VII)의 특정 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R7은 수소 또는 하이드록시이고; R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이고; 각각의 m은 0, 1 또는 2이다. 식 (VII)의 특정 구체예에서, R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이고; 각각의 m은 0이다. 식 (VII)의 특정 구체예에서, R3는 수소이다. 식 (VII)의 특정 구체예에서, R3는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (VII)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0이다.
식 (VII)의 특정 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00023
어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는아포모르핀 또는 이것의 구조적 유사체 또는 유도체이다. 관심있는 아포모르핀 구조적 유사체 및 유도체는 Holick, 등의 EP1496915에서 기술된 상기 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 N-프로필노르아포모르핀이다.
식 (I)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (VIII)을 가진다:
Figure pct00024
상기 식에서 R1-R4, R6, R7 및 m은 상기 한정된 바와 같다.
식 (VIII)의 특정 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; m은 0, 1 또는 2이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R3는 수소이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R3는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, m은 0이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, m은 1이고 R1은 4-치환체이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R7은 수소이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R2는 수소이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R4는 수소이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R4는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R6는 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환 또는 치환된 헤테로환이다. 식 (VIII)의 특정 구체예에서, R6 및 R7은 순환 방식으로 결합되어 하나 이상의 R1으로 선택적으로 치환된 4, 5 또는 6-원 사이클로알킬 고리를 형성한다.
식 (I) 및 (VIII)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (IX)을 가진다:
Figure pct00025
상기 식에서 R1, R3, R4, 및 각각의 m은 상기 한정된 바와 같다.
식 (IX)의 특정 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 m은 0, 1 또는 2이다. 식 (IX)의 특정 구체예에서, R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (IX)의 특정 구체예에서, R3는 수소이다. 식 (IX)의 특정 구체예에서, R3는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (IX)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0 또는 1이다. 식 (IX)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0 또는 1이고 R1은 4-치환체이다. 식 (IX)의 특정 구체예에서, R4는 수소이다. 식 (IX)의 특정 구체예에서, R4는 알킬 또는 치환된 알킬이다.
특정 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 데스벤라팍신 또는 이것의 구조적 유사체 또는 유도체이다. 특정 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 데스벤라팍신 또는 O-데스메틸벤라팍신이다. 식 (VII)의 특정 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00026
식 (I) 및 (VIII)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (X)을 가진다:
Figure pct00027
상기 식에서 R1-R4, 및 각각의 m은 상기 한정된 바와 같고, q는 0, 1 또는 2이다.
식 (X)의 특정 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 m은 0, 1 또는 2이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, R2는 수소이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, R3는 수소, 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, R3는 수소이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, R3는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0 또는 1이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0 또는 1이고 R1은 4-치환체이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, R4는 수소이다. 식 (X)의 특정 구체예에서, R4는 알킬 또는 치환된 알킬이다.
식 (X)의 일부 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 식 (XIa) 또는 (XIb)를 가진다:
Figure pct00028
Figure pct00029
식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고; m은 0, 1 또는 2이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, 각각의 R1은 할로겐, CF3, SF5 및 하이드록시로부터 독립적으로 선택되고; m은 0 또는 1이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, R2는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, R2는 수소이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, R3는 수소이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, R3는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0 또는 1이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, 각각의 m은 0 또는 1이고 R1은 4-치환체이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, R4는 수소이다. 식 (XIa)-(XIb)의 특정 구체예에서, R4는 알킬 또는 치환된 알킬이다.
어떤 경우에는, 펜플루라민 유사체는 시부트라민 또는 이것의 구조적 유사체 또는 유도체이다. 관심있는 시부트라민 구조적 유사체 및 유도체는 dides메틸 시부트라민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 식 (XIb)의 특정 구체예에서, 펜플루라민 유사체는 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00030
펜플루라민 화합물의 제조
펜플루라민의 임의의 편리한 제조 방법은 대상 화합물의 제조에 맞춰 조정될 수 있다. 대상 펜플루라민 유사체의 제조에 사용을 위해 조정될 수 있는 관심있는 예시적인 방법이 하기 기술된다.
펜플루라민은 많은 방법으로 합성되었으며, 일부는 중간물 1-(3-트라이플루오로메틸)페닐-프로판-2-온의 합성을 통해 이루어진다. 이 미국 특허 번호 3,198,833은 3-트라이플루오로메틸페닐아세토니트릴 또는 상응하는 알콜에서부터 시작한 이 케톤의 일부 합성을 기술한다.
펜플루라민은, 예로서, 헝가리 특허 HU T055343에서 기술된 바와 같이 아민을 이용한 환원적 아미노화를 통해 1-(3-트라이플루오로메틸)페닐-프로판-2-온으로부터 얻을 수 있다.
미국 특허 5,811,586은 펜플루라민의 합성시 1-(3-트라이플루오로메틸)페닐-프로판-2-온 중간물을 제조하는 공정을 기술하며 제1 구리염 및, 선택적으로 염기의 촉매량의 존재 하에서 3-트라이플루오로메틸아닐린의 다이아조늄 염을 극성 용매 중의 아이소프로페닐 아세테이트와 반응시키는 단계 및 바이설파이트 복합체 또는 진공 하에서의 증류를 통해 조 생성물을 정제하는 단계를 포함한다.
사용 방법
상기 기술된 화합물은 다양한 방법으로 이용될 수도 있다. 상기 요약된 바와 같이, 방법의 양태는 관심있는 질환 또는 상태를 치료하거나 예방하기 위해 필요로 하는 대상체에게 펜플루라민 유사체 (예로서, 본원에서 기술된 바와 같이 펜플루라민의 구조적 또는 기능적 유사체)의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. "치료적 유효량"은 원하는 생물학적 효과 (예로서, 간질의 치료 또는 예방)를 유도하기에 충분한 화합물의 농도를 의미한다. 관심있는 질환 및 상태는 간질, 드라베 증후군을 포함한, 특히 난치성인 형태의 간질, 레녹스 가스토 증후군(Lennox Gastaut syndrome) 및 두스 증후군(Doose syndrome), 신경 관련 질환, 비만 및 비만 관련 질환을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체에에서, 대상 발명은 신경 관련 질환을 치료하기 위해 대상체에게 대상 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 관심있는 신경 관련 질환은 간질, 및 유아의 중증 근간대성 간질 (드라베 증후군), 레녹스-가스토 증후군 및 두스 증후군을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다. 어떤 경우에는, 대상체는 드라베 증후군을 앓고 있다. 특정 구체예에서, 화합물은 약학적 조제물로서 투여된다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태에 따르면, 상기 환자에게 펜플루라민 유사체의 유효 용량을 투여하여 환자의 뇌에서 하나 이상의 5-HT 수용체를 자극하는 방법이 제공되며, 상기 하나 이상의 5-HT 수용체는 다른 것들 중에서도 5-HT1, 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1C, 5-HT1D, 5-HT1E, 5-HT1F, 5-HT2, 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT5A, 5-HT5B 5-HT6, 및 5-HT7 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 발명의 이 양태의 특정 구체예에서, 환자는 드라베 증후군으로 진단되었다.
본 발명의 구체예에서, 펜플루라민 유사체의 임의의 유효 용량이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 약 10 mg/kg/일 미만의 1일 용량이 이용되며, 예컨대 약 9 mg/kg/일, 약 8 mg/kg/일, 약 7 mg/kg/일, 약 6 mg/kg/일, 약 5 mg/kg/일, 약 4 mg/kg/일, 약 3 mg/kg/일, 약 2 mg/kg/일, 약 1 mg/kg/일, 약 0.9 mg/kg/일, 약 0.8 mg/kg/일, 약 0.7 mg/kg/일, 약 0.6 mg/kg/일, 또는 약 0.5 mg/kg/일이 이용된다. 어떤 경우에, 약 1 mg/kg/일 내지 약 10 mg/kg/일, 예컨대 약 2 mg/kg/일 내지 약 10 mg/kg/일, 약 3 mg/kg/일 내지 약 10 mg/kg/일, 약 4 mg/kg/일 내지 약 10 mg/kg/일, 또는 약 5 mg/kg/일 내지 약 10 mg/kg/일의 1일 용량이 이용된다. 어떤 경우에, 약 0.5 mg/kg/일 내지 약 1.0 mg/kg/일의 1일 용량이 이용된다. 특정 구체예에서, 약 1.0 mg/kg/일 미만의 1일 용량이 이용된다. 어떤 경우에, 바람직한 용량은 약 0.5 미만 내지 약 0.01 mg/kg/일이다.
상기 지시된 바와 같이 투약량은 환자의 체중을 기반으로 한다. 하지만, 편의상 투약량이 1 mg, 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 또는 50 mg과 같은 양으로 조정될 수도 있다. 일반적으로 특정 환자에게 효과적인 최소 용량이 사용되어야 한다.
본 발명의 방법에서 투여되는 펜플루라민 유사체의 용량은, 제한되는 것은 아니지만, 경구 투약 형태, 예컨대 경구 분해 타블렛을 포함한 타블렛, 캡슐, 로젠지, 경구용 용액 또는 시럽, 경구용 에멀젼, 경구용 겔, 경구용 필름, 구강 액체, 예로서 현탁용 분말, 등; 주사용 투약 형태; 경피성 투약 형태, 예컨대 경피성 패치, 연고, 크림; 흡입 투약 형태; 및/또는 비강으로, 직장으로, 질로 투여되는 투약 형태를 포함한 어떠한 약학적으로 허용 가능한 투약 형태로도 조제될 수 있다. 이러한 투약 형태는 1일 1회 투여, 또는 1일 다회수 투여 (예로서 하루에 2, 3 또는 4회 투여) 용으로 조제될 수 있다.
대상 화합물의 투여는 전신 또는 국소적일 수도 있다. 특정 구체예에서, 포유동물로의 투여는 대상 화합물의 전신적 방출 (예를 들어, 혈류로)을 초래할 것이다. 투여 방법은 장내 경로, 예컨대 경구, 볼, 혀밑, 및 직장; 국부적 투여, 예컨대 경피 및 피내; 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 적합한 비경구 경로는 피하 주사 바늘 또는 카테터(catheter)를 통한 주사, 예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내, 복강 내, 동맥 내, 심실 내, 경막 내, 및 전안방 내 주사 및 비-주사 경로, 예컨대 질 내 직장, 또는 비강 투여를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상 화합물 및 조성물은 경구로 투여된다. 특정 구체예에서, 화합물을 처리가 필요한 구역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있다. 일부 구체에에서, 대상 화합물의 투여 방법은 비경구 투여이다. 이것은, 예를 들어, 수술 중에 국소적 투입, 예로서, 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부적 도포, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수도 있는데, 상기 이식물은 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 재료로 이루어져 있으며, 실라스틱 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함한다.
일부 구체에에서, 대상 방법은 비만을 치료하기 위해 대상체에게 대상 화합물의 식욕 억제량을 투여하는 단계를 포함한다. 비만을 치료하기 위한 어떠한 편리한 방법도 대상 펜플루라민 유사체와 함께 사용을 위해 조정될 수 있다. 본원에서 기술된 약학적 조성물 중 어느 것도 비만 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 조합 요법은 대상 화합물 및 하나 이상의 추가적인 작용제를 함유하는 단일 약학적 투약 제제의 투여; 뿐만 아니라 대상 화합물 및 그 자체로 별도의 약학적 투약 제제인 하나 이상의 추가적인 작용제(들)의 투여를 포함한다. 예를 들어, 대상 화합물 및 식욕 억제 활성으로 활성인 추가적인 작용제 (예로서, 펜터민 또는 토피라메이트)는 조합된 제제와 같이 단일 투약 조성물로 함께 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 각각의 작용제가 별도의 투약 제제로 투여될 수 있다. 별도의 투약 제제가 사용되는 경우, 대상 화합물 및 하나 이상의 추가적인 작용제는 동시에, 또는 별도로 시차를 두고, 예로서, 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 구체에에서, 방법은 대상 펜플루라민 유사체, 항간질제와 함께 대상체에게 동시-투여하는 단계를 더 포함한다. 동시-투여 방법에 사용되는 관심있는 항간질제는 아세타졸아미드, 카르바마제핀, 클로바잠, 클로나제팜, 에슬리카르바제핀 아세테이트, 에토숙시미드, 가바펜틴, 라코사미드, 라모트리진, 레베티라세탐, 니트라제팜, 옥스카르바제핀, 페람파넬, 피라세탐, 페노바비탈, 페니토인, 프레가발린, 프리미돈, 레티가빈, 루핀아미드, 나트륨 발프로에이트, 스티리펜톨, 티아가빈, 토피라메이트, 비가바트린 및 조니사미드를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체에에서, 대상 방법은 샘플과 대상 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관 내 방법이다. 이들 방법에서 이용될 수 있는 프로토콜은 다수이며, 제한되는 것은 아니지만, 뉴런 세포로부터의 세로토닌 방출 검정, 무세포 검정, 결합 검정 (예로서, 5HT2B 수용체 결합 검정); 세포 표현형이 측정되는 세포 검정, 예로서, 유전자 발현 검정; 및 관심있는 상태 (예로서, 드라베 증후군, 레녹스-가스토 증후군 또는 두스 증후군)에 대한 특정 동물 모델을 수반하는 검정을 포함한다.
약학적 조제물
또한 약학적 조제물이 제공된다. 약학적 조제물은 약학적으로 허용 가능한 비히클(vehicle)에 존재하는 화합물 (단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 활성제의 존재 하에서)을 포함하는 조성물이다. 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 포유류, 예컨대 인간에서의 사용에 대하여 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 그 밖의 일반적으로 인정되는 약전에 나열된 것을 의미한다. 용어 "비히클"은 포유동물로의 투여를 위해 본 발명의 화합물이 함께 조제되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 담체를 지칭한다.
부형제의 선택은 부분적으로는 특정 화합물에 의해, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 다양한 적합한 제제가 존재한다.
본 발명의 방법에 이용되는 펜플루라민 유사체의 투약 형태는 약학적 제제 분야의 당업자에게 공지된 방식으로 펜플루라민 유사체와 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 보조제, 등을 조합함으로써 제조될 수 있다.
예로서, 펜플루라민 유사체는 통상적인 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제 (즉, 비히클)와 혼합되어 수용액, 타블렛, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은, 특정 구체예에서는, 약 0.1 중량% 내지 약 90 중량%의 활성 화합물, 및 더 일반적으로는 약 1 중량% 내지 약 30 중량%의 활성 화합물을 함유한다. 약학적 조성물은 일반적인 담체 및 부형제, 예컨대 가용화제, 등장화제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정화제, 보존제, 착색제, 희석제, 완충제, 계면활성제, 보습제, 방향제 및 붕해제을 함유할 수도 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 옥수수 전분, 젤라틴, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 미정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 이칼슘 포스페이트, 염화나트륨, 알긴산, 식물성 또는 그 밖의 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세리드, 고급 지방족 산 또는 프로필렌 글리콜의 에스터, 옥수수 전분, 감자 전분, 아카시아, 트래거캔스, 젤라틴, 글리세린, 소르비톨, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 스테아르산을 포함한다. 본 발명의 제제에 일반적으로 사용되는 붕해제는 크로스카멜로스, 미정질 셀룰로스, 옥수수 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 알긴산을 포함한다. 화합물은 그것들을 수용매 또는 비수용매, 예컨대 식물성 또는 그 밖의 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세리드, 고급 지방족 산 또는 프로필렌 글리콜의 에스터에; 그리고 필요한 경우, 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장화제, 현탁화제, 에멀젼화제, 안정화제 및 보존제와 함께 용해시키거나, 현탁화하거나 또는 에멀젼화하여 주사용 조제물로 조제될 수 있다.
일부 구체에에서, 경구 투여에 적합한 제제는 (a) 액체 용액, 예컨대 물, 또는 식염수와 같은 희석제에 용해된 화합물의 유효량; (b) 고체 또는 과립으로서, 각각 활성 성분의 미리 결정된 양을 함유하는 캡슐, 사세 또는 타블렛; (c) 적절한 액체 중의 현탁액; 및 (d) 적합한 에멀젼을 포함할 수 있다. 타블렛 형태는 락토스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 미정질 셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 및 그 밖의 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 방향제, 및 약리학적 호환성 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 방향제, 보통은 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스 중의 활성 성분, 뿐만 아니라 불활성 염기, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 중의 활성 성분을 포함하는 향정, 또는 활성 성분 외에도, 본원에서 기술된 이러한 부형제를 함유하는 수크로스 및 아카시아, 에멀젼, 겔, 등을 포함할 수 있다.
어떤 경우에, 경구 투여용 화합물이 조제된다. 어떤 경우에, 경구용 약학적 제제에 대하여, 적합한 부형제는 만니톨, 락토스, 글루코스, 수크로스, 전분, 셀룰로스, 젤라틴, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 및/또는 마그네슘 카보네이트와 같은 약학적 등급의 담체를 포함한다. 경구용 액체 제제의 사용을 위해, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 또는 시럽으로 제조될 수도 있으며, 수성 담체, 예를 들어, 수성 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올, 바람직하게는 물 또는 정상 식염수 중에서 수화에 적합한 고체 또는 액체 형태로 공급된다. 필요한 경우, 조성물은 또한 습윤제, 에멀젼화제, 또는 완충제와 같은 소량의 비-독성 보조 물질을 함유할 수도 있다.
본 발명의 특정 제제는 액체 형태로 되어 있다. 액체는 용액 또는 현탁액일 수도 있고 경구용 용액 또는 시럽일 수도 있으며 이것은 주어진 부피의 용액에서 얻어지는 밀리그램의 양에 관하여 눈금이 매겨진 피펫으로 병에 포함된다. 액체 용액은 어린 아이에 맞춰 용액을 조정할 수 있게 만들며 이것은 0.5 mg 내지 15 mg 및 0.5 밀리그램 증분 사이의 임의의 양으로 어디에든 투여되며 따라서 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mg, 등으로 투여될 수 있다.
액체 조성물은 일반적으로 현탁화제, 보존제, 계면활성제, 습윤제, 방향제 또는 착색제가 들어있는 적합한 액체 담체(들), 예를 들어, 에탄올, 글리세린, 소르비톨, 비-수성 용매, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 오일 또는 물 중의 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 현탁액 또는 용액으로 구성될 것이다. 대안으로, 액체 제제는 복원 가능한 분말로 제조될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 충분한 개시 및 기술내용을 제공하기 위해 제시되고, 발명자들이 본 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것이 아니며 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내려는 것은 아니다. 사용된 수치 (예로서 양, 온도, 등.)에 관하여 정확도를 보장하려는 노력이 이루어지고 있지만 약간의 실험적 오차 및 편차가 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그에 가깝다.
실시예 1
1-(3-트라이플루오로메틸)페닐-프로판-2-온의 제조
물 35 mL 및 37% (w/w) 수성 염산 45 g을 교반기 및 적하 깔때기가 장착된 플라스크에 넣는다. 얼음 수조를 이용하여 섭씨 10도로 냉각시킨 후 m-트라이플루오로메틸아닐린 24.25 그램 (0.151 몰)을 추가한 다음, 섭씨 5도에서, 물 150 ml 중 아질산나트륨 12.43 g (0.180 몰)을 함유하는 수용액을 천천히 추가한다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 다음 반응 온도를 섭씨 30도로 유지하면서 30분 동안 물 90 ml, 염화 제1 구리 1.35 g (0.014 몰), 염화 제2 구리 이수화물 2.30 g (0.013 몰), 아세톤 50 ml, 나트륨 아세테이트 삼수화물 40.8 g (0.300 몰) 및 아이소프로페닐 아세테이트 23 g (0.230 몰)으로 만들어진 혼합물에 붓는다. 추가로 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 섭씨 20도로 만들고, 메틸렌 클로라이드 50 ml를 추가하여 두 층을 분리한다.
수층을 제거하는 한편 오일이 얻어질 때까지 유기층을 진공 하에서 농축하며 이것을 실온에서 12시간 동안 교반하면서 나트륨 메타바이설파이트 35 g, 물 70 ml 및 헵탄 150 ml로 처리한다. 현탁액을 여과하고, 바이설파이트 복합체를 필터 상에서 헵탄 50 ml로 세척한 다음 메틸렌 클로라이드 100 ml 및 수산화나트륨의 10% (w/v) 수용액 150 ml로 만들어진 2상 혼합물에서 현탁시킨다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후 층을 분리하고, 수상을 제거하는 한편, 유기층을 물로 세척하고 진공하에서 증발시켜 순수한 케톤을 제공한다.
실시예 2
간질의 제브라피시 모델을 사용하여 유사체의 활성을 검정하는 방법
scn1Lab 돌연변이 (scn1Lab+/-)에 대하여 이형접합성인 제브라피시 배아 (다니오 레리오(Danio rerio))를 Tupfel 긴 지느러미 야생형 (WT scn1Lab+/+)과 역교배시킨다. 성체 제브라피시를 표준 양식 조건 하에서 28.0℃에서 14/10시간 명/암 주기로 사육한다. 자연 산란을 통해 수정란을 수거한다. 마취된 물고기 (트리케인 0.02%)의 지느러미를 잘라 PCR로 유전자형을 분석한다. 유전자형 분석 후, 샘플을 정제하고 (MinElute PCR Purification Kit) LGC Genomics에 의해 시퀀싱한다. 연령-일치된 Tupfel 긴 지느러미 야생형 유생을 대조군 (WT scn1Lab+/+)으로 사용한다. 이들 배아 및 유생을 28.0℃의 인큐베이터 내에서 배아 배지 (Danieaus; 1.5 mM HEPES, pH 7.6, 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgSO4, 및 0.18 mM Ca(NO3)2)에서 14/10시간 명/암 주기로 유지한다.
동형접합성 scn1Lab-/- 돌연변이 및 대조군 WT scn1Lab+/+의 운동성 활성을 평가하기 위해서, 4 내지 8 dpf의 제브라피시 유생을 배아 배지 100 μL의 96-웰 플레이트에 배치한다. 매일 유생을 30분 동안 습관화(habituation)시킨 후 10분 동안 (100초 통합 간격) 자동화 추적 디바이스 (ZebraBoxTM 장치; Viewpoint, Lyon, France)에서 추적한다. 모든 레코딩을 낮 시간 주기 동안에 동시에 수행한다. 많은 움직임의 총 거리를 레코딩하고 ZebraLabTM 소프트웨어 (Viewpoint, Lyon, France)를 사용하여 정량화한다. 조건 당 적어도 24마리의 유생을 이용한 적어도 세 번의 독립적인 실험으로부터 데이터를 수집한다.
간질 모양 활성을 7 dpf의 제브라피시 유생 전뇌에서 오픈-필드(open-field) 레코딩으로 측정한다. 유리 전극을 전뇌로 위치시키기 위해 동형접합성 scn1Lab-/- 돌연변이 및 대조군 WT scn1Lab+/+를 2% 저융해점 아가로스 (Invitrogen)에 임베딩한다. 이 유리 전극을 124 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 1.25 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3 및 10 mM 글루코스로 제조된 인공 뇌척수액 (aCSF)으로 채우고 (저항 1-5 MΩ) 고-임피던스(impedance) 증폭기에 연결한다. 그 후에, 레코딩을 10 μs의 샘플링 간격으로 전류 클램프(clamp) 방식, 전류 클램프(clamp) 방식, 1 kHz에서 여과된 저주파, 0.1 Hz에서 여과된 고주파, 디지털 게인(digital gain) 10으로 수행한다 (MultiClamp 700B 증폭기, Digidata 1440A 디지털화 장치, 둘 다 Axon instruments, USA). 단일 레코딩을 10분 동안 수행한다. 간질 모양 활성을 이전에 기술된 바와 같이 돌발적 발작의 기간에 따라 정량화한다 (Orellana-Paucar et al, 2012). Clampfit 10.2 소프트웨어 (Molecular Devices Corporation, USA)의 도움으로 전기도를 분석한다. 진폭이 배경 노이즈(noise)를 세 배 초과하고 50밀리초 (ms)보다 더 오래 지속될 때 자발적 간질 모양 이벤트가 고려된다. 이 임계치는 야생형 ZF 유생에서 간질 모양 이벤트의 덜 빈번한 관찰 때문에 선택되며 기간은 50 ms보다 더 짧다.
유사체 (아고니스트(agonist)) 및 안타고니스트(antagonist)를 상이한 5-HTsubtype 수용체에 대한 높고 선택적인 그것들의 친화도 (나노몰 범위의 Ki), 및 그것들의 logP 값 (즉 >1, 제브라피시 유생에서 양호한 생체이용가능성을 나타낼 것으로 예상됨 (Milan, 2003))을 기반으로 하여 선택할 수 있다. 화합물을 다이메틸설폭시드 (DMSO, 99.9% 분광학 등급, Acros Organics)에 용해시키고 배아 배지에 희석하여 0.1% w/v의 최종 DMSO 농도를 달성하며, 이것은 또한 비히클 대조군 (VHC)의 역할을 한다.
각 화합물의 최대 허용 농도 (MTC)를 평가하기 위해서, 6 dpf-나이의 WT scn1Lab+/+ 제브라피시 유생을 96-웰 플레이트 (조직 배양 플레이트, 평평한 바닥, FALCON®, USA)에서 표준 양식 조건 하에 28℃에서 14/10시간 명/암 주기로 상이한 농도의 화합물 또는 VHC와 함께 인큐베이션한다 (배지는 매일 보충됨). 각각의 유생을 독성의 다음 징후에 대하여 48시간 주기 동안에 현미경 하에서 개별적으로 체크한다: 꼬리의 가벼운 터치에 대한 터치 반응의 감소 또는 무반응, 자세 손실, 체형 변형, 부종, 심박동수 또는 순환의 변화 및 사망. 최대 허용 농도 (MTC)를 샘플에 노출 48시간 내에 12마리의 제브라피시 유생 중 12마리에서 독성의 징후가 관찰되지 않는 최고 농도로서 한정한다. MTC (표 1 및 2)를 작업 전반에 걸쳐 사용한다.
Scn1Lab-/- 돌연변이 및 WT scn1Lab +/+ 유생을 같은 플레이트에 배열하고 수정 후 6일 (dpf)에 96-웰 플레이트의 개개의 웰에 펜플루라민 유사체 (MTC로) 또는 VHC를 처리한다. 28℃에서 14/10시간 명/암 주기로 인큐베이션 및 30분 챔버 습관화 후 6 및 7 dpf 유생을 암 조건 하에서 10분 (100초 통합 간격) 동안 운동성 활성에 대하여 추적한다. 1.5시간의 인큐베이션 시간은 또한 짧은 처리 (6 dpf)로 불린다. 또한 이들 유생을 22시간 초과의 인큐베이션 (7 dpf), 즉 긴 처리 후에 분석한다. 전체 운동성 활성을 파라미터 lardist를 사용하여 정량화하고 cm 단위로 플롯팅한다. 어떤 경우에, 데이터를 처리 조건 당 적어도 9마리의 유생을 이용한 두 번 (5-HT1B-, 5-HT1F-, 5-HT3-, 5-HT4-, 5-HT5A-, 5-HT6-아고니스트 및 5-HT1B- 및 5-HT7-안타고니스트를 제외한 모든 안타고니스트) 또는 세 번 (펜플루라민 화합물s, 5-HT1A-, 5-HT1D-, 5-HT1E-, 5-HT2A-, 5-HT2B-, 및 5-HT2C-아고니스트)의 독립적인 실험으로부터 함께 수집한다.
상기 기술된 바와 같이, 간질 모양 활성을 7 dpf의 제브라피시 유생 전뇌에서 오픈-필드 레코딩으로 측정한다. Scn1Lab-/- 돌연변이 및 WT scn1Lab +/+ 유생을 6 dpf에서 최소 22시간 (긴 처리) 동안 펜플루라민 (25 μM), 이전 검정에서 운동성-감소 활성을 나타낸 기능적 유사체 (5-HT5A-아고니스트 제외) (하기 참조) (MTC), 음성 대조군 (3.125 μM 5-HT2B-아고니스트) 또는 VHC와 함께 인큐베이션한다. 실험 조건 당 적어도 8마리의 scn1Lab-/- 돌연변이 유생으로부터 7 dpf 유생의 레코딩이 이루어진다. 처리된 WT scn1Lab+/+ 유생에 대해서는, 야생형 유생에서 간질 모양 활성의 부족한 관찰로 인해, 조건 당 적어도 5마리를 분석한다. 상이한 처리 조건에 대한 전자 사진 레코딩을 정량화한다.
7 dpf-나이 제브라피시 유생의 머리를 사용하여 존재하는 신경 전달 물질 도파민, 노르아드레날린 및 세로토닌의 양을 결정한다. 튜브 당 여섯 개의 머리를 얼음 위에서 100 μl 0.1 M 산화 방지 버퍼 (비타민 C 함유)에서 1분 동안 균질화한다. 균질액을 4℃에서 15 000 g로 15분 동안 원심분리한다. 상층액 (70 μl)을 멸균 튜브로 옮겨서 분석할 때까지 -80℃에 저장한다.
신경 전달 물질 결정은 소구경 LC-ECD 방법 (Sophie Sarre, Katrien Thorre, Ilse Smolders, 1997)을 기반으로 한다. 크로마토그래피 시스템은 LC Packings/Dionex (Amsterdam, The Netherlands)의 FAMOS 마이크로 자동 샘플 채취기, Gilson의 307 피스톤 펌프 (Villiers-le-Bel, France), Dionex의 DEGASYS DG-1210 탈기기 및 Antec (Zoeterwoude, The Netherlands)의 μ-VT03 유동 셀 (0.7 mm 유리상 탄소 작업 전극, Ag/AgCl 기준 전극, 25 μm 스페이서)이 장착된 DECADE II 전기화학 검출기로 구성된다. 이동상은 pH 5.5의 87% V/V 수성 버퍼 용액 (100 mM 나트륨 아세테이트 삼수화물, 20 mM 시트르산 일수화물, 2 mM 나트륨 데칸설포네이트, 0.5 mM 이나트륨 에데테이트) 및 13% V/V 아세토니트릴의 혼합물이다. 이 이동상을 60 μL/min의 유속으로 주입한다. 자동 샘플 채취기 트레이의 온도를 15℃로 설정하고 주사 부피는 10 μL이다. Bioanalytical Systems (West Lafayette, Indiana, United States)의 소구경 UniJet C8 컬럼 (100 x 1.0 mm, 5 μm)을 정지상으로 사용한다. 분리 및 검출 온도를 35℃에서 수행하고, +450 mV vs Ag/AgCl의 검출 전위를 갖는다. 데이터 획득을 Data Apex (Prague, The Czech Republic)의 Clarity 크로마토그래피 소프트웨어 버젼 3.0.2으로 수행한다. 신경 전달 물질의 양 (nmol 단위)을 여섯 개의 머리의 총 질량을 기반으로 계산한다.
통계 분석을 GraphPad Prism 5 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 수행한다. 유생 운동성 활성을 One-way ANOVA에 이어서, 던네트 다중 비교 테스트(Dunnett's multiple comparison test)를 사용하여 평가한다. 값을 평균±표준 편차 (SD)로 표현한다. LFP 측정값 (전자 사진 뇌 활성)을 만-휘트니 테스트(Mann-Whitney test)로 분석한다. 처리군과 동등한 대조군 (scn1Lab-/- 돌연변이 또는 WT scn1Lab+/+) 간의 통계적으로 유의한 차이 (p<0.05)는 제브라피시 유생의 운동성 또는 전자 사진 뇌 활성의 감소 또는 증가를 나타내는 것으로 간주된다. scn1Lab-/- 돌연변이의 신경 전달 물질의 양을 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)에 의해 WT scn1Lab+/+ 유생과 비교하는데 모든 데이터가 정규성 테스트 (다고스티노 & 피어슨 옴니버스 정규성 테스트(D'Agostino & Pearson omnibus normality test))를 통과했기 때문이다.
실시예 3
드라베 증후군의 제브라피시 모델에서 표현형-기반 항경련제 스크리닝
본 개시물에 의해 제공되는 화합물을 고처리량 돌연변이 제브라피시 스크리닝 검정을 사용하여 시험관 내 항경련 활성에 대하여 평가한다. 다음 방법은 대상 펜플루라민 유사체를 평가하는데 있어서의 사용을 위해 조정될 수 있다.
동물: Scn1A
제브라피시를 표준 14:10 h 명/암 광주기 하에서 광- 및 온도-제어된 양식 시설에서 유지한다. 성체 이형접합성 scn1Lab± 돌연변이 제브라피시를 1.5 L 탱크에서 탱크 당 5-12마리의 물고기의 밀도로 사육하고 1일 2회 먹이를 준다 (건조 플레이크(flake) 및/또는 생 브라인 쉬림프(brine shrimp)로 보충된 플레이크). 다음 조건을 유지하도록 물의 질을 지속적으로 모니터링한다: 온도, 28-30℃; pH 7.4-8.0; 전도율, 690-710 mS/cm. 제브라피시 배아를 둥근 페트리 디쉬 (카탈로그 #FB0875712, Fisher Scientific) 내에서 역삼투-증류수 중 0.03% Instant Ocean (Aquarium Systems, Inc.) 및 000002% 메틸렌 블루로 구성된 "배아 배지"에서 유지한다.
유생 제브라피시 클러치(clutch)를 야생형 (WT; TL 계통) 또는 적어도 10 세대 동안 TL 야생형에 역교배된 scn1Lab (didys552) 이형접합성 동물로부터 번식시켰다. 널리 분산된 멜라노솜을 가지며 수정 후 3 d (dpf; 도 1b)이 지나면 눈에 띄게 어둡게 보이는 동형접합성 돌연변이 (n 6544), 또는 WT 유생 (n=71)을 5 또는 6 dpf에서 모든 실험에 사용하였다. 배아 및 유생을 플라스틱 페트리 디쉬 (90 mm 직경, 20 mm 깊이)에서 키우고 밀도를 디쉬 당 60으로 제한한다. 3 내지 7 dpf의 유생은 식별 가능한 성 염색체가 없다. 관리 및 유지 프로토콜은 필요조건을 준수한다 [Guide for the Care and Use of Animals (ebrary Inc., 2011)에서 약술되고 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인됨 (프로토콜 #AN108659-01D)].
테스트 작용제: 스크리닝을 위한 화합물은 10 mM DMSO 용액으로서 제공된다. 운동성 또는 전기생리학 연구를 위한 테스트 작용제를 배아 배지에 용해시키고 100 M의 초기 농도에서 테스트하며, 최종 DMSO 농도는 2%이다. 모든 약물 스크리닝 연구에서, 화합물을 암호화하고 화합물의 성질을 모르는 조사자에 의해 실험이 수행된다. 0.5 내지 1 mM의 약물 농도를 전기생리학 검정에 사용하여 아가-임베딩된 유생에서 더 제한된 확산을 설명한다.
발작 모니터링
제브라피시 유생을 배아 배지를 함유한, 투명하고 평평한 바닥의 96-웰 마이크로플레이트 (카탈로그 #260836, Fisher Scientific)의 1개의 웰에 개별적으로 배치한다. 운동성의 변화를 연구하기 위해서, 마이크로플레이트를 밀폐된 동작-추적 디바이스 내에 배치하고 실온에서 10-15분 동안 암 조건에 순응시킨다. 10분의 레코딩 시기에 웰 당 한 마리의 물고기에 대한 운동성 플롯을 EthoVision XT 소프트웨어 (DanioVision, Noldus Information Technology)를 실행시키는 DanioVision 시스템을 사용하여 얻는다; 백그라운드보다 더 어두운 물체를 확인하기 위해 임계치 검출 설정을 각 실험에 최적화시킨다. 발작 스코어링(scoring)을 다음 3-스테이지 스케일을 사용하여 수행한다 (Baraban et al., 2005): 스테이지 0, 없거나 매우 적은 유영 활성; 스테이지 I, 유영 활성의 증가되고, 짧은 발작; 스테이지 II, 빠른 "소용돌이-모양"의 선회 유영 행동; 및 스테이지 III, 발작성 전신 근경련(clonus)-유사 경련, 및 짧은 자세 손실. WT 물고기는 보통 스테이지 0 또는 I에서 스코어링한다. 플롯을 이동한 거리 (밀리미터 단위) 및 평균 속도 (초 당 밀리미터 단위)에 대하여 분석한다. 이전에 보고된 바와 같이 (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), 속도 변화는 발작 행동의 더 민감한 검정이다.
발작 행동의 베이스라인 레코딩을 상기 기술된 바와 같이 배아 배지에 잠긴 돌연변이로부터 얻는다; 그 다음에 테스트 화합물의 용액 변화 및 15-30분의 평형화 기간에 따라 제2 운동성 플롯을 얻는다. 양의 히트(hit) 지정 기준은 다음과 같다: (1) 44%의 평균 속도 감소 (예로서, 대조군 추적 연구에서 측정된 시험 간 가변성에 기초한 값; 도 1c); 및 (2) 테스트 물고기 중 적어도 50%에 대하여 운동성 플롯의 스테이지 0 또는 스테이지 I 발작 행동으로의 감소. 운동성 검정에서 "양의 히트"로 분류된 각각의 테스트 화합물을 입체현미경 상에서의 직접적인 시각화 하에서 물고기가 외부 자극에 반응한 움직임 및 60분 약물 노출 후 가시적인 심장박동에 기초하여 살아있다는 것을 확인한다.
독성 (또는 사망률)을 테스트 물고기 중 적어도 50%에서 가시적인 심장박동 또는 외부 자극에 반응한 움직임이 없는 것으로 한정한다. 과잉민감성을 화합물이 테스트 물고기 중 적어도 50%에서 유영 속도 및/또는 스테이지 III 발작 활성의 44% 증가를 유발하는 것으로 한정한다. 1차 운동성 스크리닝에서 확인된 히트를 선택하고 다시 상기 기술된 방법을 사용하여 재스크리닝한다. 그 다음에 두 번의 운동성 검정에서 성공적이고, 제브라피시의 두 개의 독립적인 클러치에서 독성으로 분류되지 않은 선택 화합물 스톡(stock)을 전기생리학 검정에서 더 테스트한다.
전기생리학 검정: 제브라피시 유생을 붕가로톡신 (1 mg/ml)으로 잠시 마비시키고 1.2% 아가로스에 고정한다; 자기장 레코딩을 전뇌 구조로부터 얻는다. 간질 모양 이벤트를 Clampfit (Molecular Devices)에서 사후 확인하고 베이스라인 노이즈 수준보다 세 배 및 기간이 500 ms를 초과하는 다중-극파(multi-spike) 또는 다극파(polyspike) 상향 및 하향 막 편향으로 한정한다. 전기생리학 실험 중에 제브라피시 유생을 CCD 카메라 및 모니터가 장착된 Olympus BX51WI 업라이트형(upright) 현미경에서 직접적인 시각화에 의한 혈류 및 심장박동의 존재 (또는 부재)에 대하여 지속적으로 모니터링한다.
데이터 분석
데이터를 달리 언급되지 않는 한 평균 및 SEM으로 제공한다. 대응표본 통계적 유의성을, 달리 언급되지 않는 한, 적절하게 스튜던트 양방향 독립표본 t 테스트(Student's two-tailed unpaired t test), ANOVA, 또는 만-휘트니 순위 합계 테스트(Mann-Whitney rank sum test)를 이용하여 결정한다. 달리 나타나지 않는 한, 결과는 p 0.05에서 유의한 것으로 간주된다.
실시예 4
항경련 활성에 대한 다중-전극 배열 스크리닝
테스트 작용제를 미처리 야생형 및 DS KO 마우스로부터 채취한 해마 뇌 슬라이스 (CA1, CA3, 치아 이랑(dentate gyrus))의 주요 영역에 걸친 다중-전극 배열 레코딩 (MEA)을 사용하여 질환을 반영하는 것으로 확인된 전기생리학적 파라미터에 대한 효과를 측정함으로써 치료적 표적으로 평가한다.
조직 제조: 수컷 및 암컷 129S 야생형 및 DS KO 마우스를 경추 탈구에 의해 인도적으로 살해한다. 동물 당 하나 이하의 슬라이스를 사용하여 임의의 한 가지 실험 조건을 조사한다. 뇌를 신속하게 (<2분) 제거하여 (mM) NaCl 124, KCl 3, KH2PO4 1.25, NaHCO3 36, MgSO4·6H2O 1, d-글루코스 10 및 CaCl2 2를 포함하는, 냉각되고, 카르복시화된 (95% O2:5% CO2) 인공 뇌척수액 (aCSF)에 배치한다. 통상적인 해마 가로 슬라이스 (Egert et al., 2002a)를 Campden Vibroslice/M 조직 슬라이서 (Campden Instruments, Loughborough, UK)를 사용하여 450m의 두께로 잘라서 레코딩을 시작하기 전에 실온의 aCSF에서 적어도 1 h 동안 둔다.
간질 모양 활성의 무 Mg2+ 유도를 위해서, MgSO4·6H2O를 aCSF로부터 치환하지 않고 제외시킨다. 표준 또는 무 Mg2+ aCSF를 해부 및 레코딩 내내 농축된 스톡의 이전에 제조된 앨리쿼트로부터 레코딩하는 동안에 추가된 양성 대조군, 테스트 작용제 및 비히클과 함께 적절하게 사용한다. 앨리쿼트를 제조 후 즉시 얼리고 사용 전에 개별적으로 녹인다. 모든 시약 및 약물을 Sigma-Aldrich (Poole, UK)로부터 얻는다. 양의 대조군 및 테스트 작용제를 1000Х 작용 농도로 DMSO에 용해시키고 aCSF에 통합 전에 사용할 때까지 -20℃에 저장한다; 최대 DMSO 수조 농도는 0.1% 2.2이다.
MEA 레코딩: 각각의 해마 슬라이스에 걸친 전기적 활성을 MEA (200μm 간격 및 100 μm 레코딩 반지름을 갖는 각각 30μ 직경의 59개의 전극, 도 1A; Multi Channel Systems, GmbH, Reutlingen, Germany)를 사용하여 모니터링하고 레코딩한다.
레코딩 전에, MEA를 5% (w/v) Terg-A-Zyme (Cole-Palmer, London, UK), 메탄올 및 마지막으로 증류수로 세척한다.
슬라이스를 메탄올 중의 도포 (~4l) 및 증발된 셀룰로스 질산염 용액 (0.24%, w/v, Protran Nitrocellulose Transfer Membranss; Schleicher & Schuell Bioscience Inc., NH, USA; Ma et al., 2008)을 사용하여 MEA에 부착시킨다. MEA 상의 슬라이스 위치를 Nikon TS-51 현미경 (Nikon, Japan) 상에서 Х4의 배율로 관찰하여 확인하며, 슬라이스의 이미지 및 전극 위치는 Mikro-Okular 카메라 (Meade Instruments Corp., CA, USA; 도 1A)를 통해 PC에 수집된다. 부착되면, 슬라이스를 카르복시화된 aCSF (~2ml/min)로 지속적으로 관류한다. 시냅스에 의해 매개된 LFP 구성요소의 양호한 분리를 제공하고 슬라이스 생존 시간을 최대화하기 위해 슬라이스를 21℃로 유지한다. 슬라이스 상의 MEA 전극을 통해 전압 펄스 (200s 양극 펄스, ±0.5-3.0 V)를 가하여 지역장 전위를 유발함으로써 슬라이스 생존력 및 MEA 전극과의 접촉을 평가한다.
각각의 작용제에 대하여, 조건 당 및 각각이 조직 유형 (돌연변이 및 야생형)에 따라 12-15번의 레코딩이 이루어진다. 신호를 120-채널 이중 헤드스테이지(headstage) 증폭기 (MEA60 System, Multi Channel Systems GmbH, Reutlingen, Germany)에 의해 증폭시키고 모두 60개의 채널에서 채널 당 최소 10 kHz에서 샘플을 동시에 채취한다. 오프라인(offline) 분석을 위한 데이터를 모니터링하고 레코딩하기 위해 데이터 획득은 MC Rack 소프트웨어 (Multi Channel Systems GmbH, Reutlingen, Germany)를 사용하여 PC로 이루어진다.
데이터 분석: 데이터 분석을 Matlab 6.5 및 7.0.4에 대한 자체(in-house) 스크립트 (Mathworks, Natick, MA, USA; 저자의 요청에 따라 이용 가능한, 이 연구 전반에 걸쳐 사용된 Matlab 스크립트)를 사용하여 수행한다. Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, USA) 및 MC DataTool (Multi Channel Systems GmbH, Reutlingen, Germany)을 또한 데이터를 가공하고 제공하는데 사용한다.
원 데이터를 2 Hz 고주파 2차 주문 Butterworth 필터를 사용하여 여과하여 수조 관류와 관련된 매우 낮은 주파수의 인공물을 제거한다. 대조군 실험 중에 버스트(burst) 진폭 및 주파수의 변화를 자체 Matlab 7.0.4 스크립트를 사용하여 평가한다. 데이터를 10 kHz 내지 500 Hz에서 다운샘플링 (downsample)하는 반면에, 단일 Matlab 스크립트는 실험 내에서 각각의 버스트의 피크 진폭 (V) 및 피크가 발생한 시간 (s)을 반환한다. 이들 데이터를 진폭 및 주파수의 대표적인 플롯에 사용한다.
추가적으로, 평균 진폭을 관심있는 시간 직전의 10개의 버스트의 피크 진폭을 사용하여 10분 간격으로 계산한다. 같은 10개의 버스트를 또한 사용하여 다음과 같이 주파수를 계산한다: 주파수 = 10/(최종 버스트 시간-최초 버스트 시간). 상이한 전극 및 슬라이스로부티 이러한 유형의 데이터를 수집할 때, 각 전극 레코딩의 최초 버스트를 0 s에서 발생한 것으로 간주한다; 후속 버스트를 같은 양만큼 상쇄시킨다. 이는 상이한 공급원의 레코딩 간의 비교가능성을 개선하였다. 진폭 및 주파수 변화를 평가하는 대조군 실험에서, 평균 진폭 및 주파수 값을 버스트가 시작한 후 30분에 계산된 값에 대하여 표준화한다.
버스트 전파 경로를 Matlab 6.5에서 MEATools (Egert et al., 2002b)의 자체 개조물을 사용하여 샘플링 지점 당 한 프레임 (10 kHz)에서 원 데이터 파일로부터 등고선 플롯을 구성함으로써 결정하고 JPEG 이미지 포맷으로 내보내기 전에 5 지점 Savitzky-Golay 필터를 사용하여 삽입한다. 개개의 JPEG를 나중에 저속 재생을 위해 Photolapse (http://home.hccnet.nl/s.vd.palen/photolapsedlc.html)를 사용하여 결합시키고 AVI 애니메이션으로 전환한다. 버스트 시작 부위, 종료 부위 및 결과의 전파 경로를 결정한 후, 버스트 시작 (CA3) 및 종료 (CA1) 부위에 가장 가까운 전극 위치에서 버스트 피크가 발생하는 시간을 MC Rack에서 확인한다. 시작에서 종료까지의 거리를 ImageJ (Abramoff et al., 2004)를 사용하여 계산하고 이렇게 하여 시간 및 거리 값으로부터 유래된 전파 속도를 계산한다. 평균 전파 속도는 수집된 데이터로부터 유도된다.
분광 사진을 20ms 창 이동, 8192 고속 푸리에 변환 (fast Fourier transform; FFT) 주파수 분할 및 250 Hz에서의 주파수 컷-오프를 사용하여 Neuroexplorer 4.045 (NexTechnologies, Littleton, MA, USA)로 생산한다. 분광 사진을 파워 스펙트럼 밀도 (dB)의 로그로서 스펙트럼 출력의 표현에 의한 비교를 위해 표준화한다. 파워 스펙트럼 밀도 값을 250 Hz의 주파수 컷-오프를 갖는 2048 FFT 주파수 분할을 사용하는 Neuroexplorer를 사용하여 생산한다. 대표적인 파워 스펙트럼 밀도 플롯을 주파수 범위 0-50 Hz에 대하여 나타내고 5 지점 가우스(Gaussian) 필터를 사용하여 평탄화한다. 하지만, 평탄화되지 않은 전체 주파수 범위를 항경련 약물의 부재 및 존재 하에서 총 힘 변화의 정량화에 사용한다. 간질 모양 및 항경련제 처리된 상태에서 동일한 기간 (≥150 s)의 데이터 세트를 파워 스펙트럼의 구성 및 후속 정량화에 사용한다.
항경련제의 존재 하에서 총 힘의 변화를 각 전극에 대한 100M4-AP의 존재 또는 Mg2+의 부재 하에서 총 힘의 퍼센트로 표현한다. 그 다음에 개개의 전극의 퍼센트 값을 평균을 계산하기 전에 해마 영역 (CA1, CA3 및 치아 이랑 (DG))으로서 수집한다. >1 슬라이스 조제물의 ≥4 전극의 데이터를 각 영역에 대하여 분석한다. 항경련제가 추가된 실험에서, 100M 4-AP 또는 무 Mg2+ aCSF의 적용에 의해 먼저 버스팅을 유도하고; 버스팅을 시작한 후 30분에, 페노바비탈 또는 펠바메이트를 적용한다. 따라서 버스트 주파수, 진폭 및 기간의 차이를 약물 적용 전 10개의 버스트 (버스팅이 시작한 후 30분에)와 약물이 적용된 후 30분에 10개의 버스트 사이에서 평가한다. AED 적용 후 30분 중 마지막 5분에서 버스트가 기록되지 않은 경우, 버스팅이 폐지된 것으로 간주된다. 이 경우에, 연속적인 슬라이스 생존력 및 MEA와의 접촉의 충실도를 상기 기술된 바와 같이 전극 자극을 통한 자기장 전위의 환기에 의해 확인한다.
모델들 간의 주파수 및 대기시간의 모든 표준화된 데이터 및 비교에 관하여 통계적 유의성을 비모수 만-휘트니 U-테스트에 의해 결정한다. 전파 속도에 대한 항경련 약물 효과의 유의성을
양방향 대응표본 스튜던트 t-테스트를 사용하여 테스트한다. p=0.05는 모든 경우에 유의한 것으로 간주된다. 모든 데이터를 평균±S.E.M로서 제공하고 각 해마 영역 (DG, CA3, CA1)에 대한 데이터를 제공한다.
실시예 5
생존 연구
야생형 및 Scn1a-/- 돌연변이 넉-아웃(knock-out) 마우스를 사용하여 후보 치료제에 대한 용량-반응 곡선을 생성한다.
동물의 처리: 129S 야생형 마우스 (대조군) 및 129S Scn1a 넉-아웃 마우스 ("DS KO 마우스")를 Jackson Laboratory (MMRRC Stock No: 37107-JAX)로부터 얻는다. 모든 동물 과정은 모든 적용 가능한 동물 복지 규제를 따른다.
대략 같은 수의 수컷 및 암컷을 가진 10-12마리의 동물의 군을 비히클, 양성 대조군, 또는 테스트 작용제로 처리한다. 동물이 희생될 때까지 P8로부터 0900 및 1600시간에 1일 2회 0.08ml 주사 부피를 피하로 주사한다. 주사 부위를 다음 순서로 교대한다: 왼쪽 어깨, 오른쪽 어깨, 왼쪽 엉덩이, 오른쪽 엉덩이. 투약 농도를 조정하여 일정한 부피의 투여를 유지한다.
처리 후, 동물을 수학적 모델에서 요구되는 바와 같이 이유기 후 2일 (P23/24) 또는 더 일찍 희생된다. 그 다음에 동물을 콜모고로프-스미르노프 복지 스코어링 (Kolmogorov-Smirnov welfare scoring; 군들간 비교) (Massey, F. J. "The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit." Journal of the American Statistical Association. Vol. 46, No. 253, 1951, pp. 68-78) 및 맨틀-콕스(Mantel-Cox) 또는 게한-브레슬로우-윌콕슨(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 치사율 테스트 (전자에 대하여, Mantel N., "Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration" Cancer Chemother Rep. 1966 PMID: 5910392 참조)를 사용하여 평가한다. 얻어진 데이터를 통계분석하고 (하기 참조) 중간값, IQR 및 max/min (% 치사율 제외)으로 나타낸다.
실시예 6
유도성 만능 줄기 세포 피질 뉴런을 사용하여 드라베 증후군 환자에 대한 잠재적 치료제로서 화합물의 평가
단독으로 및 그 밖의 일반적으로 사용되는 항경련제와의 조합으로, 관심있는 화합물의 치료적 효능을 펜플루라민에 대한 공지된 반응자인 드라베 증후군 환자로부터 유래된 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC) 피질 뉴런을 사용하여 평가한다. 테스트 작용제에 대하여 얻어진 결과를 펜플루라민에 대하여 얻어진 결과와 비교한다. 다음 방법을 대상 펜플루라민 유사체를 평가하는데 사용을 위해 조정할 수 있다.
A. 재료 및 방법
피질 뉴런으로의 인간 iPSC의 분화
펜플루라민에 대하여 반응하는 것으로 알려져 있는 드라베 증후군 환자로부터 취해진 iPSC 세포를 피질 피라미드-유사 뉴런 및 피질 개재뉴런으로 분화시킨다.
피질 피라미드-유사 뉴런의 생성
iPSC를 먼저 아큐타제 또는 0.5 mM EDTA (Lonza)를 이용하여 단일 세포로 분리한 다음, 젤라틴-코팅된 디쉬에서 10 μM ROCK 억제자가 들어있는 hESC 배지에서 1 h 동안 평판배양한다. 그 다음에 현탁된 iPSC를 Matrigel-코팅된 12-웰 플레이트에서 10 ng/ml FGF2가 들어있는 MEF 조건 hESC 배지에서 재평판배양한다. 95% 밀집도에서, 배지를 1 μM 도르소포르핀 및 10 μM SB431542가 보충된 3N 배지로 교체한다. 세포를 8-11 d 동안 배양하고, 신경 유도를 "신경 로제트(rosette)"의 출현에 의해 모니터링한다. 신경상피 세포를 디스파제 또는 5 mM EDTA로 분리시키고 Matrigelcoated 플레이트에서 20 ng/ml FGF2가 들어있는 3N 배지에 재평편배양한다. 2-4 d 후, FGF2를 회수하여 분화를 촉진시킨다. 배양물을 아큐타제로 계대배양하고, 설치류 전뇌 교세포 또는 인간 iPS 유래 교세포와 함께 분주된 60 mm Matrigel-코팅된 플레이트에서 3N 배지에서 5 Х105로 편판배양한 다음 최대 100 d 동안 유지하며 격일마다 배지를 교체한다.
피질 개재뉴런의 생성
iPSC 배양체 (EB)를 신경상피 시트가 형성될 때까지, TGF-β 억제자가 들어있는, 상기 기술된 것과 유사한 신경 유도 배지에서 평판배양한다. 그 타음에 신경상피 시트를 고농도의 Pur을 사용하여 내측 신경절 분출 (MGE)-유사 전구세포로 패턴화하고 MGE-유사 전구세포를 GABAergic 개재뉴런으로 분화시킨다. GABAergic 개재뉴런의 거의 순수한 집단 (90%)을 생성하고, 배양 7주 후 GABA에 대한 면역세포화학법을 수행함으로써 확인한다.
전체 세포에서 전압-개폐식 나트륨 전류 및 활동 전위 발화의 측정
전체 세포에서 전압-개폐식 나트륨 전류 및 활동 전위 발화에 대하여, 단독으로 및 공지된 AED의 존재 하에서, 관심있는 화합물의 효과를 전체 세포 전압 및 전류 클램프 레코딩을 사용하여 측정한다. 첫 번째 단계로서, 나트륨 전류에 대한 테스트 화합물의 증가하는 농도의 효과를 전압-클램프 하에서 측정한다. 유발되고 자발적인 활동 전위 발화에 대한 테스트 화합물의 효과를 전류 클램프 하에서 측정한다.
전압- 또는 전류-클램프 실험 동안에 약물의 관류
테스트 화합물 (10 μM 내지 1 mM의 최종 농도) 또는 비히클 (나트륨 전류 레코딩 용액 또는 ACSF)을 기저 나트륨 전류 수준 또는 활동 전위 발화의 레코딩 후 뉴런으로 관류시킨다. 그 다음에 급성 및 장기간 약물 적용의 효과를 측정한다.
표시된 최종 농도로 드라베 증후군에 대하여 흔히 처방되는 다음 AED의 존재 및 부재 하에서, 관심있는 화합물의 증가하는 농도에 반응하여 전압-민감성 나트륨 전류 및 활동 전위 발화의 변화를 평가할 수 있다: 토피라메이트 (200 μM), 스티리펜톨 (100 μM), 발프로산 (250 μM), 및 클로바잠 (3 μM).
전압-클램프 레코딩
전압-클램프 레코딩을 앞서 기술된 바와 같이 수행한다. Brackenbury et. al, Abnormal neuronal patterning occurs during early postnatal brain development of Scn1b-null mice and precedes hyperexcitability. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(3):1089-94. PMCID: 3549092 참조.
RT (21-22℃)에서 120 NaCl, 1 BaCl2, 2 MgCl2, 0.2 CdCl2, 1 CaCl, 10 HEPES, 20 TEA-Cl 및 10 글루코스 (mM 단위)를 함유하는 세포 내 용액 (CsOH로 pH 7.35, 오스몰 농도: 300 - 305 mOsM)의 존재 하에 단일 뉴런 (이극성 또는 피라미드)의 절연 나트륨 전류를 기록한다. Sutter P-97 puller (Sutter Instrument Co.)를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세관 (Warner Instrument Corp.)으로부터 가열 연마된 패치 피펫을 생성하고 1 NaCl, 177 N-메틸-D-글루카민, 10 EGTA, 2 MgCl2, 40 HEPES, 및 25 포스포크레아틴-트리스 (mM 단위)를 함유하는 세포 내 용액 (H2SO4로 pH 7.2)으로 채운다. 배양 배지를 세포 내 레코딩 용액으로 대체하고 세포가 들어있는 디쉬를 레코딩 설정에 배치한 후 10-120분 내에 레코딩을 수행한다. 수집된 실험 데이터는 전류-전압 관계, 전류 밀도, 활성화의 전압-의존성, 비활성화의 전압-의존성, 및 비활성화로부터의 회복을 포함한다.
전류 클램프 레코딩
전류 클램프 레코딩을 Liu et. al, Dravet syndrome patient-유래 neurons suggest a novel epilepsy mechanism. Ann Neurol. 2013;74(1):128-39. PMCID: 3775921에서 기술된 바와 같이 수행한다.
iPSC-유래 뉴런에서 활동 전위의 전류-클램프 레코딩을 위해, 패치 피펫을 135, K-글루코네이트; 4, NaCl; 0.5, CaCl4; 10, HEPES; 5, EGTA, 2, Mg-ATP 및 0.4, GTP (pH 7.3, KOH로 조정됨) (mM 단위)로 구성된 세포 내 용액으로 채운다. iPSC 뉴런을 115, NaCl; 2.5, KCl; 1, MgCl2; 1.25, KH2PO4; 26, NaHCO3; 2, CaCl; 10 HEPES 및 10, D-글루코스 (pH 7.4, NaOH로 조정됨) (mM 단위)로 구성된 용액에 담근다. 개개의 활동 전위를 0.02 nA-증가에서 일정한 활동 전위가 생성될 때까지 임계치 아래의 수준에서 시작하는 일련의 1 ms 탈분극 전류의 주입에 의해 안정막 전위로부터 유도한다. 제1 활동 전위의 개시에 필요한 최소 전류를 임계치 전류로 정의한다. 1500 ms 탈분극 전류 (0.02 nA)의 주입에 의해 안정 수준의 유지 전위로부터 반복되는 스파이크 발화를 유도한다. 자발적 발화를 안정막 전위로 유지되는 뉴런으로부터 기록한다.
정량적 데이터를 평균 및 SEM으로 제공한다. 쌍별 통계적 유의성을 적절하게 스튜던트 양방향 대응표본/독립표본 t-테스트, 또는 또는 만-휘트니 순위 합계 테스트를 이용하여 결정한다. ANOVA에 이어서 튜키 사후 분석(Tukey post-hoc analysis)을 사용하여 다중 분석한다. 결과는 P < 0.05에서 유의한 것으로 간주된다.
iPSC 피질 뉴런 클러스터의 자발적 활동 전위 발화의 측정
MEA 레코딩 동안에 약물의 투여:
증가하는 농도의 테스트 화합물 및 비히클을 기저 활성 수준의 레코딩 후 인간 iPSC 뉴런을 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰의 배지에 추가한다 (조건 당 대상체 당 6개 웰, 플레이트 당 하나의 대조군 및 하나의 드라베 대상체가 들어있음). 각 웰은 자발적 활동 전위의 세포 외 기록을 위해 8개의 전극을 함유한다. 1시간 기간 동안 15분 마다 5분 동안 레코딩하고, 뉴런 분화의 제5-7 주 동안의 3주에 걸쳐 매주 반복한다. 모든 실험을 2배수로 수행한다.
MEA 레코딩
대조군 및 드라베 증후군 인간 iPSC-유래 뉴런을 웰 당 8개의 전극을 함유하는, Axion 96-웰 MEA 칩에서 배양한다. 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅하고 신경전구세포를 1.3 Х 106 세포/ml의 밀도로 분주한다. MEA 시스템에 의해 검출되는 세포 외 전기 신호를 내장 Axion 증폭기 및 샘플 채취 소프트웨어를 사용하여 증폭시키고, 폐쇄된 시스템은 세포를 섭씨 37도로 유지하고 장기적인 레코딩을 위해 5% CO2 환경을 유지시킨다. 활동 전위 분석을 NeuroExplorer 소프트웨어를 사용하여 수행한다. 웰 당 및 전극 당 스파이크 비율, 버스팅 비율, 동시 방전의 정도 (즉, 다수의 전극에서 동시에 발생함) 및 지역장 전위의 형태를 결정한다.
첨부된 청구범위에도 불구하고, 본원에서 제시된 개시내용은 또한 다음 조항에 의해 한정된다:
조항 1. 간질 또는 신경 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 식 (I)의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료적 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법:
Figure pct00031
상기 식에서:
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 수소, 할로겐, X1, X2, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 제2 R1-R7 기와 함께 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며 여기서 R2 및 R5, R2 및 R4, R1 및 R5, R6 및 R7, 및/또는 R3 및 R6은 순환 방식으로 결합되고;
X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
m은 0-4이고;
n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
조항 2. 조항 1의 방법으로서, 화합물은 식 (II)를 가지는 화합물 또는 이것의 염이다:
Figure pct00032
상기 식에서:
R1은 알킬, 치환된 알킬 (예로서, CF3) 또는 SF5이고;
R2, R3, R4 및 R5는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 R2 및 R5 또는 R2 및 R4는 선택적으로 순환 방식으로 결합되고;
X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
조항 3. 조항 1 또는 2의 방법으로서, 화합물은 식 (III)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00033
상기 식에서 X1-X7은 각각 독립적으로 H, D 또는 F이고, R1, R3 및 R4는 식 (I)의 구체예 중 어느 것에서 한정된 바와 같다.
조항 4. 조항 1 또는 2의 방법으로서, 화합물은 식 (IV)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00034
상기 식에서 X8-X10 및 각각의 X는 독립적으로 H, D 또는 F이며, 단 적어도 하나의 X8-X10 또는 X는 F이다.
조항 5. 조항 4의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 중 하나를 가지는 화합물이다:
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
.
조항 6. 조항 1, 2 및 4 중 어느 하나의 방법으로서, 화합물은 식 (IVa)-(IVc) 중 하나를 가지는 화합물이다:
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
상기 식에서 X11, X12 및 각각의 X는 독립적으로 H, D 또는 F이고;
R11-R16은 각각 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
조항 7. 조항 1의 방법으로서, 화합물은 식 (V)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00045
상기 식에서 R1, R3, R5, R6, R7 및 m은 상기 한정된 바와 같고, p는 0, 1 또는 2이고, R8 및 R9는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R8 및 R9는 순환 방식으로 결합되어 선택적으로 더 치환된 5 또는 6-원 사이클로알킬, 헤테로환, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며, 여기서 점선은 단일 또는 이중 공유 결합을 나타낸다.
조항 8. 조항 7의 방법으로서, 화합물은 식 (VI)을 가지는 화합물이다:
Figure pct00046
R1, R3, R7, 및 m은 상기 한정된 바와 같고, p는 0, 1 또는 2이다.
조항 9. 조항 8의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 중 하나를 가지는 화합물 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염이다:
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
또는
Figure pct00050
.
조항 10. 조항 7의 방법으로서, 화합물은 식 (VII)을 가지는 화합물 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염이다:
Figure pct00051
.
조항 11. 조항 10의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00052
조항 12. 조항 1의 방법으로서, 화합물은 식 (VIII)을 가지는 화합물이다:
Figure pct00053
상기 식에서 R1-R4, R6, R7 및 m은 상기 한정된 바와 같다.
조항 13. 조항 12의 방법으로서, 화합물은 식 (IX)을 가지는 화합물이다:
Figure pct00054
상기 식에서 R1, R3, R4, 및 각각의 m은 상기 한정된 바와 같다.
조항 14. 조항 13의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00055
.
조항 15. 조항 12의 방법으로서, 화합물은 식 (X)을 가지는 화합물이다:
Figure pct00056
상기 식에서 R1- R4, 및 각각의 m은 상기 한정된 바와 같고, q는 0, 1 또는 2이다.
조항 16. 조항 15의 방법으로서, 화합물은 식 (XIa) 또는 (XIb)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00057
Figure pct00058
조항 17. 조항 16의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00059
조항 18. 조항 7의 방법으로서, 대상체에게 항간질제를 동시-투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
조항 19. 대상체의 식욕을 억제하는 방법으로서, 필요로 하는 대상체에게 식 (I)의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염의 식욕 억제량을 투여하는 단계를 포함하는 방법:
Figure pct00060
상기 식에서:
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 수소, 할로겐, X1, X2, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 제2 R1-R7 기와 함께 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며 여기서 R2 및 R5, R2 및 R4, R1 및 R5, R6 및 R7, 및/또는 R3 및 R6은 순환 방식으로 결합되고;
X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
m은 0-4이고;
n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
조항 20. 조항 19의 방법으로서, 화합물은 식 (II)을 가지는 화합물 또는 이것의 염이다:
Figure pct00061
상기 식에서:
R1은 알킬, 치환된 알킬 (예로서, CF3) 또는 SF5이고;
R2, R3, R4 및 R5는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 R2 및 R5 또는 R2 및 R4는 선택적으로 순환 방식으로 결합되고;
X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
조항 21. 조항 19 또는 20의 방법으로서, 화합물은 식 (III)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00062
상기 식에서 X1-X7은 각각 독립적으로 H, D 또는 F이고, R1, R3 및 R4는 식 (I)의 구체예 중 어느 것에서 한정된 바와 같다.
조항 22. 조항 19 또는 20의 방법으로서, 화합물은 식 (IV)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00063
상기 식에서 X8-X10 및 각각의 X는 독립적으로 H, D 또는 F이며, 단 적어도 하나의 X8-X10 또는 X는 F이다.
조항 23. 조항 22의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 중 하나를 가지는 화합물이다:
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
.
조항 24. 조항 19, 20 및 22 중 어느 하나의 의 방법으로서, 화합물은 식 (IVa)-(IVc) 중 하나를 가지는 화합물이다:
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
상기 식에서 X11, X12 및 각각의 X는 독립적으로 H, D 또는 F이고;
R11-R16은 각각 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
조항 25. 조항 19의 방법으로서, 화합물은 식 (V)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00074
상기 식에서 R1, R3, R5, R6, R7 및 m은 상기 한정된 바와 같고, p는 0, 1 또는 2이고, R8 및 R9는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R8 및 R9는 순환 방식으로 결합되어 선택적으로 더 치환된 5 또는 6-원 사이클로알킬, 헤테로환, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며,
여기서 점선은 단일 또는 이중 공유 결합을 나타낸다.
조항 26. 조항 25의 방법으로서, 화합물은 식 (VI)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00075
상기 식에서 R1, R3, R7, 및 m은 상기 한정된 바와 같고, p는 0, 1 또는 2이다.
조항 27. 조항 25의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 중 하나를 가지는 화합물 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염이다:
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
또는
Figure pct00079
조항 28. 조항 27의 방법으로서, 화합물은 식 (VII)을 가지는 화합물 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염이다:
Figure pct00080
조항 29. 조항 28의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00081
조항 30. 조항 19의 방법으로서, 화합물은 식 (VIII)을 가지는 화합물이다:
Figure pct00082
상기 식에서 R1-R4, R6, R7 및 m은 상기 한정된 바와 같다.
조항 31. 조항 30의 방법으로서, 화합물은 식 (IX)을 가지는 화합물이다:
Figure pct00083
상기 식에서 R1, R3, R4, 및 각각의 m은 상기 한정된 바와 같다.
조항 32. 조항 31의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00084
조항 33. 조항 30의 방법으로서, 화합물은 식 (X)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00085
상기 식에서 R1-R4, 및 각각의 m은 상기 한정된 바와 같고, q는 0, 1 또는 2이다.
조항 34. 조항 33의 방법으로서, 화합물은 식 (XIa) 또는 (XIb)를 가지는 화합물이다:
Figure pct00086
Figure pct00087
조항 35. 조항 34의 방법으로서, 화합물은 다음 구조 또는 이것의 프로드러그, 또는 이것의 입체이성질체, 또는 이것의 염을 가진다:
Figure pct00088
.
상기 언급된 것들은 단지 본 발명의 원칙을 예시한다. 당업자들이 본원에서 명확하게 기술되거나 도시된 것은 아니지만, 본 발명의 원칙을 구현하고 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있다는 것이 인정될 것이다. 또한, 본원에서 나열된 모든 예 및 조건 언어는 원칙적으로는 독자들이 본 발명의 원칙 및 해당 분야를 발전시키는데 발명자들이 기여한 개념을 이해하는 것을 도우려는 의도이고, 이렇게 구체적으로 나열된 예 및 조건에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 본원에서 본 발명의 원칙, 양태, 및 구체예, 뿐만 아니라 특정 실시예를 나열하는 모든 진술은 이것들의 구조적 및 기능적 동등물 모두를 포함하도록 의도된다. 추가적으로, 이러한 동등물은 현재 공지되어 있는 동등물 및 미래에 개발될 동등물, 즉, 구조에 관계없이 같은 기능을 수행하는, 개발될 어떠한 요소를 포함하는 것으로 의도된다. 그러므로, 본 발명의 범위는 본원에서 도시되고 기술된 예시적인 구체예로 제한하려는 것은 아니다. 대신에, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구현된다.

Claims (11)

  1. 식 (II)의 대사-저항성 펜플루라민 유사체 화합물 또는 이것의 염:
    Figure pct00089

    상기 식에서:
    R1은 CF3 또는 SF5이고;
    R2, R3, R4, 및 R5는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 R2 및 R5 또는 R2 및 R4는 선택적으로 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
    X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
    n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
  2. 제1 항에 있어서, 식 (III)를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00090

    상기 식에서 X6-X7은 각각 독립적으로 H, D 또는 F이다.
  3. 제1 항에 있어서, 식 (IV)를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00091

    상기 식에서 X8-X10 및 각각의 X는 독립적으로 H, D 또는 F이며, 단 적어도 하나의 X8-X10 또는 X는 F이다.
  4. 제1 항에 있어서, 다음 구조 중 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00092
    Figure pct00093

    Figure pct00094
    Figure pct00095
    Figure pct00096

    Figure pct00097
    Figure pct00098
    .
  5. 제1 항에 있어서, 식 (IVa)-(IVc) 중 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00099
    Figure pct00100
    Figure pct00101

    상기 식에서 각각의 X는 각각 독립적으로 H, D 또는 F이고;
    R11-R16은 각각 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이다.
  6. 식 (I)을 가지는 화합물 또는 이것의 약학적 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물:
    Figure pct00102

    상기 식에서:
    R1은 CF3 또는 SF5이고;
    R2, R3, R4 및 R5는 수소, 할로겐, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되며, R2 및 R5 또는 R2 및 R4는 선택적으로 순환 방식으로 함께 결합되어 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
    X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
    n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
  7. 간질 또는 신경 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 필요로 하는 환자에게 식 (I)의 대사-저항성 펜플루라민 유사체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00103

    상기 식에서:
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 수소, 할로겐, X1, X2, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 제2 R1-R7 기와 함께 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며, R2 및 R5, R2 및 R4, R1 및 R5, R6 및 R7, 및/또는 R3 및 R6은 순환 방식으로 결합되고;
    X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
    m은 0-4이고;
    n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
  8. 제7 항에 있어서, 화합물은 제1 항 내지 제5 항 중 하나에 따르는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7 항에 있어서, 대상체에게 항간질제를 동시-투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 대상체의 식욕을 억제하는 방법으로서, 필요로 하는 대상체에게 식 (I)의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염의 식욕 억제량을 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00104

    상기 식에서:
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 수소, 할로겐, X1, X2, 알콕시, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로환, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 헤테로환으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 제2 R1-R7 기와 함께 선택적으로 치환된 사이클로알킬 고리, 헤테로환 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며 R2 및 R5, R2 및 R4, R1 및 R5, R6 및 R7, 및/또는 R3 및 R6은 순환 방식으로 결합되고;
    X1-X5는 각각 독립적으로 H, D, F, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
    m은 0-4이고;
    n은 1 또는 2이며, 여기서 n이 2일 때 질소는 양전하를 띈다.
  11. 제10 항에 있어서, 화합물은 제1 항 내지 제5 항 중 하나에 따르는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
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