KR20180088830A - 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 방법 - Google Patents

낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 방법 Download PDF

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수강 메디컬 사이언스 앤드 테크놀로지 (수조우) 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 방법에 관한 것으로, 배아 초기 체외 배양액, 즉 낭배 배양액으로부터 검출된 배아 유래 유리 DNA를 검출하여, 미량 DNA를 균일하게 전체 게놈 증폭시킨 다음, 2세대 시퀀싱 등 방법으로 증폭 후의 DNA 산물을 분석함으로써, 배아의 염색체 상황, 즉 염색체의 전체 또는 국부의 이수체가 나타나는지의 여부를 판단한다. 본 발명은 낭배 배양액과 같은 체외 수정 조작 과정에서 배아 체외 배양 단계의 폐기물을 검출 샘플로 선택하고, 이러한 비침투적 비침습적인 방법은 통상적인 난할구 생검 또는 낭배 영양막 세포 생검에서 샘플링할 때의 배아에 대한 세포 손상을 방지하였을 뿐만 아니라, 임상에 별도의 문제를 주지 않으면서, 샘플링 조작이 단순화되어, 안전성, 신뢰성 및 편리성이 더욱 높다.

Description

낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 방법
본 발명은 생물 의학과 분자 세포 생물학 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체의 상태를 검측하고 분석하는 방법에 관한 것이다.
시험관 아기 기술은 불임에 대항하는 강력한 기술로서, 이의 기술 과정은 먼저 모친으로부터 복수개의 난자(통상적으로 8 ~ 15개)를 얻고, 다음 부친의 정자로 난자와 체외 수정하는 것이며, 수정란을 체외 배양액에서 5일 동안 배양할 경우, 배아는 약 80 ~ 100개의 세포로 조성된 낭상 구조, 즉 낭배이고, 2 ~ 3개의 낭배를 모친 자궁에 넣은 후, 이상적인 경우, 자궁에 넣은 낭배는 1개 내지 3개가 정상적인 임신 주기로 성공적으로 발육하여 출산된다. 그러나 여러 가지 원인으로 인해, 낭배를 자궁에 넣음으로부터 태아의 출생까지의 성공률은 단지 40 % 정도로 높지 않고, 모친 자체의 건강 원인 외에, 수정란 품질이 낭배 발육 실패의 주요 원인 중의 하나이다.
수정란의 염색체는 모체의 난자와 부체의 정자로부터 유래되고, 임의의 한쪽의 염색체 이상은 모두 수정란의 염색체 이상을 초래한다. 정상적인 수정란, 각각의 배아 세포 및 태아, 유아 내지 성인의 각각의 세포 내에는 모두 44가닥, 즉 22쌍 상염색체(이배체라고 지칭함)와 두 가닥의 성염색체(남성은 XY이고, 여성은 XX임)가 있다. 이상적인 경우, 임의의 염색체의 전부 또는 국부에 모두 이배체보다 많거나 적은 경우가 나타날 수 있는 것을 이수체 이상이라고 하고, 이수체 이상은 가장 흔한 배아 발육 실패를 초래하는 염색체 이상 형식이다. 통상적인 시험관 아기 기술에서, 현미경 하에서 형태를 관찰하는 것만으로 복수개(통상적으로 8 ~ 15개)의 배아에서 2 ~ 3개의 상대적으로 "정상적인" 것을 모친의 자궁에 넣는다. 그러나 현미경 하에서의 형태 정상은 염색체가 정상적인지의 여부를 반영하지 못하고, 형태 정상을 잘못 선택하여 염색체 이상의 배아 모친 자궁에 넣어 수많은 시험관 아기의 임신 실패를 야기하였다.
근래, 사람들은 체외에서 배양된 배아의 염색체 상태를 검출하여, 염색체가 정상인 배아를 선별하여 모친 자궁에 넣는 배아 착상전 유전학 검사(Preimplantation Genetic Screen, PGS)라고 총칭하는 일부 기술을 구축함으로써 임신 성공률을 향상시켰다. 연구에 따르면, PGS를 통해 자궁에 넣은 시험관 아기 조작은 성공률을 60 % 이상으로 향상시킬 수 있고, 여러 가지 PGS 방법으로 면역 형광 검출(FISH), 칩 검출, 2세대 시퀀싱 검출 등을 포함한다. 상기 여러 가지 검출에 수요되는 샘플은 모두 체외에서 배양된 배아에서 수집한 하나 내지 여러 가지 세포이고, 이러한 소량의 세포를 검출하여 전체 배아의 염색체가 정상적인지의 여부를 반영한다.
구체적으로, 체외에서 5일 동안 배양한 수정란을 낭배기까지 발육시키면 배아 영양막 세포(trophoblast)를 추출할 수 있다. 일반적으로 조작은 현미경 하에서 모세 유리관을 사용하여 하나 내지 복수개의 영양막 세포를 흡수하여 세포를 용해시키고, 그 중의 미량의 DNA를 방출하며, 미량의 DNA를 전체 게놈 증폭시킨 후, 핵산 칩 또는 2세대 시퀀싱 등 방법으로 세포의 염색체 상태를 검출한다(공개일자가 2015년 6월 17일인 발명 특허 출원 CN104711362A를 참조). 이론적으로, 흡수한 복수개의 세포 중의 염색체 상태는 배아의 기타 세포와 일치하고, 이러한 복수개의 세포를 검출하면 상기 배아의 염색체 상태가 정상적인지의 여부를 알 수 있다. 일반적으로, 이때 복수개의 영양막 세포를 흡수하여도 배아 발육에 좋지 않은 영향을 미치지 않을 것이며, 태어난 아기의 건강 상태를 볼 때, 이 조작은 실질적으로 건강에 영향을 미치지 않는다. 하지만, 상기 기술의 출현 시간이 비교적 짧으므로(불과 몇 년), 사람의 평생 건강에 장기적인 영향을 미치는지의 여부는 여전히 관찰하여야 한다.
이 외에, 사람들은 먼저 할강액에서 유리된 DNA를 얻고, 즉 마이크로머니퓰레이터(micromanipulator) 하에서 미소천자 기술을 사용하여, 무균의 바늘로 흡수하여 할강액 유리 DNA를 얻는 할강액을 이용한 배아 품질 검출 방법을 연구 개발하였다(공개일자가 2015년 3월 25일인 발명 특허 출원 CN104450923A; 및 정기 간행물 문헌 Luca Gianaroli, M. Cristina Magli, Alessandra Pomante, et al. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility, 2014, 102(6):1692-1698.를 참조). 그러나, 할강액은 할강 중의 액체이고, 할강액을 얻기 위하여 낭배에 구멍을 뚫거나 천자하여야 하며, 이의 개입은 여전히 배아에 대하여 불가피한 손상을 초래할 수 있다.
상기 내용을 종합해보면, 선행 기술에 존재하는 주요 단점은 하기와 같다.
1. 세포를 샘플링할 때 배아 조작 기술에 대한 요구가 비교적 높고, 만약 조작이 실패하면, 거친 조작으로 인해 배아가 심각하게 손상되며, 손상이 너무 심각하면 배아 발육이 중지될 수 있다.
2. 양호한 조작을 하더라도, 세포 샘플링할 때 불가피하게 배아에 대하여 세포 손실과 경미한 손상을 야기한다. 비록 세포 손실과 경미한 손상이 배아 발육과 출생 후 건강에 좋지 않은 영향을 미친다는 증거는 없지만, 상기 기술이 출현된 시간이 비교적 짧으므로(불과 몇 년), 사람의 평생 건강에 장기적인 영향이 있는지의 여부는 여전히 관찰하여야 한다.
3. 일부의 경우, 샘플링한 복수개의 세포의 염색체 상태는 배아에서 기타 세포의 염색체의 상태와 상이한 경우, 검출 결과의 오류를 초래한다.
따라서, 배아 자체를 손상시키지 않지만, 배아 염색체 상황에 대하여 검출할 수 있는 비침투성 기술 수단은 건강에 미치는 영향 위험성을 제거하고, 배아 검출의 안전성을 확보하는 현실적인 수요이다.
본 발명의 목적은, 상기 선행 기술의 결점에 대하여, 배아에 어떠한 손상도 입히지 않고, 조작이 간단하며, 안전성 및 신뢰성이 더욱 높은, 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 실현하기 위하여, 본 발명은, 수정란을 단일 정자 주사 방법으로 획득하여 3일의 난할구 시기까지 배양한 후, 새로 제조한 낭배 배양 미세 점적에 옮겨 낭배 배양하고, 이때 탈락된 과립 세포 및 수정되지 않은 정자의 오염을 제거하기 위하여 3일째에 무조건 액체를 교환하여야 하며;
형성된 낭배의 배아를 흡수하여 새로운 낭배 배양액에 옮기거나 유리화 냉동 보존 과정에 진입시키며, 약 1 μl 내지 500 μl의 나머지 원 포배 배양액, 바람직하게는 10 μl 내지 200 μl가 배아 착상전 유전학 검사를 위해 수집하여야 하는 샘플인 낭배 배양액을 획득하는 단계(1);
단계(1)에서 얻은 원 포배 배양액을 용해물에 옮겨 원심분리시킨 후, 샘플이 다음 단계의 전체 게놈 증폭 단계로 진입하는 낭배 배양액을 수집하는 단계(2);
단계(2)에서 얻은 낭배 배양액과 용해물의 혼합물에 리아제를 넣어 균일하게 혼합한 후 부화시켜 리아제를 불활성화시키고, 용해 산물을 취하여 PCR 반응 튜브에 넣어 게놈 증폭 반응시키는 낭배 배양액에서 미량 DNA의 전체 게놈 증폭 단계(3); 및
2세대 시퀀싱, 핵산 칩 또는 면역 형광 검출로 분석하는 전체 게놈 증폭 후의 DNA 산물을 분석하여 배아의 염색체 상태의 정상 여부를 검증하는 단계(4)를 포함하는 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 방법을 제공한다.
하나의 바람직한 예에 있어서, 액체 교환 2 ~ 3일 후, 형성된 낭배의 배아를 흡수하여 새로 제조된 낭배 배양액에 옮기거나 유리화 냉동 보존 과정에 진입시키며, 약 1 μl 내지 500 μl의 나머지 원 포배 배양액, 바람직하게는 10 μl 내지 200 μl가 바로 배아 착상전 유전학 검사를 위해 수집하여야 하는 샘플이다.
여기서, 단계(2)에서 용해물의 성분은 25 ~ 45 mM의 PH가 7.0 ~ 8.0인 Tris-Cl, 0.5 ~ 3 mM의 EDTA, 10 ~ 25 mM의 KCl 및 농도가 0.05 ~ 5 %인 세제이고, 상기 세제는 Triton X-100, Triton X-114, 트윈 20, NP40과 SDS 중의 하나 또는 여러 가지이다. 바람직하게, 용해물의 성분은 40 mM의 PH가 7.2인 Tris-Cl, 1 mM의 EDTA, 15 mM의 KCl 및 3 %의 Triton X-100이다.
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 단계(3)에서 사용된 프라이머는 NG프라이머, NT프라이머 및 증폭 프라이머를 포함하고,
여기서, 상기 NG프라이머와 NT프라이머는 5’말단에서 3’말단까지의 보편적 서열과 가변 서열을 포함하고, 상기 보편적 서열은 G, A, C와 T 네 가지 염기 중의 세 가지 또는 두 가지로 조성되며, 상기 보편적 서열이 상이할 경우 G와 C를 포함하고;
상기 NG프라이머의 가변 서열은 (N)nGGG, (N)xGTGG(N)y, 또는 이들의 조합으로부터 선택되지만; 상기 NT프라이머의 가변 서열은 (N)nTTT, (N)mTNTNG, 또는 이들의 조합으로부터 선택되며; 여기서, N은 임의의 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이고, 각 n은 독립적으로 3 ~ 17인 양의 정수로부터 선택되며, 각 m은 독립적으로 3 ~ 15인 양의 정수로부터 선택되고, x와 y는 각각 독립적으로 3 ~ 13인 양의 정수로부터 선택되지만;
상기 증폭 프라이머는 상기 보편적 서열을 포함하되 상기 가변 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 한다.
단계(3)에서의 리아제는 프로테아제K, 퀴아젠프로테아제(Qiagen Protease), 펩신(pepsin), 파파인(papain), 트립신(trypsin) 및 리소자임(Lysozyme) 중의 하나 또는 여러 가지로부터 선택되고, 상기 리아제의 농도는 1 ~ 25 μg/ml이며, 바람직하게는 20 μg/ml이고; 단계(3)에서 부화 온도는 30 ~ 60 ℃이고, 부화 시간은 1분 내지 12시간이며, 불활성화 온도는 75 ~ 95 ℃이고, 불활성화 시간은 1 ~ 15분이며; 바람직하게, 부화 온도는 40 ℃이고, 부화 시간은 3시간이며, 불활성화 온도는 90 ℃이고, 불활성화 시간은 5분이다.
단계(3)에서 진행되는 PCR 반응 경우의 PCR 반응 튜브에는 증폭 혼합액, 0.5 ~ 20 %의 PCR억제물 길항제, 5 ~ 20 mM의 dNTP, 5 ~ 100 μM의 NG와 NT프라이머, 50 ~ 200 μM의 증폭 프라이머, 0.5 ~ 10단위의 핵산 중합 효소가 함유되고, 상기 PCR억제물 길항제는 DMSO, 베타인(Betaine), 포름아미드(Formamide), 글리세린(glycerin) 및 알부민(albumin) 중의 하나 또는 여러 가지로부터 선택되며, 상기 핵산 중합 효소는 Phi29 DNA중합 효소, Bst DNA 중합 효소, Vent 중합 효소, Deep Vent 중합 효소, Klenow Fragment DNA 중합 효소I, MMLV 역전사 효소, AMV역전사 효소, HIV역전사 효소, Phusion® 최고 충실도 DNA 중합 효소, Taq 중합 효소, 대장균(E.coli) DNA중합 효소, LongAmp Taq DNA중합 효소 및 OneTaq DNA중합 효소 중의 하나 또는 여러 가지로부터 선택된다.
상기 증폭 혼합액의 성분은 10 ~ 25 mM의 Tris-HCl, 5 ~ 25 mM의 (NH4)2SO4, 5 ~ 30 mM의 KCl, 0.5 ~ 5 mM의 MgSO4, 0.1 ~ 20 %의 DMSO 및 0.05 ~ 5 %의 Triton X-100이다. 바람직하게, 상기 증폭 혼합액의 성분은 15 mM의 Tris-HCl, 15 mM의 (NH4)2SO4, 20 mM의 KCl, 1 mM의 MgSO4, 5 %의 DMSO 및 2 %의 Triton X-100이다.
상기 NG와 NT프라이머는 5’말단에서 3’말단까지의 보편적 서열과 가변 서열을 포함하고, 상기 보편적 서열은 G, A, C와 T 네 가지 염기 중의 세 가지 또는 두 가지로 조성되며, 상기 보편적 서열이 상이할 경우 G와 C를 포함하고; 상기 증폭 프라이머는 상기 보편적 서열을 포함하되 상기 가변 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 한다. 상기 가변 서열은, (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG, (N)xGTGG(N)y로부터 선택되고, 여기서, N은 임의의 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이며, n은 3 ~ 17인 양의 정수로부터 선택되고, m은 3 ~ 15인 양의 정수로부터 선택되며, x와 y는 각각 3 ~ 13인 양의 정수로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 NG와 NT프라이머는 SEQ ID NO: 1 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN], SEQ ID NO: 2 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG], SEQ ID NO: 3 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT], SEQ ID NO: 4 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG] 또는 SEQ ID NO: 5 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]의 서열을 포함하고, 여기서, N은 임의의 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이며; 상기 증폭 프라이머는 5’에서 3’까지 SEQ ID NO: 6 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]의 서열을 구비한다.
단계(3)에서 전체 게놈 증폭의 열순환 과정은,
1) 90 ~ 98 ℃ 사이의 제1 변성 온도에서 5 ~ 20초 동안 반응시키고;
(2) 5 ~ 15 ℃ 사이의 제 1 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키며, 15 ~ 25 ℃ 사이의 제2 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키고, 25 ~ 35 ℃ 사이의 제3 어닐링 온도에서 30 ~ 80초 동안 반응시키며, 35 ~ 45 ℃ 사이의 제4 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키고, 45 ~ 55 ℃ 사이의 제5 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키며;
(3) 55 ~ 80 ℃ 사이의 제1 연신 온도에서 10 ~ 150분 동안 반응시키고;
(4) 90 ~ 98 ℃ 사이의 제2 변성 온도에서 5 ~ 30초 동안 반응시키며;
(5) 45 ~ 70 ℃ 사이의 제6 어닐링 온도에서 10 ~ 30초 동안 반응시키고;
(6) 60 ~ 80 ℃ 사이의 제2 연신 온도에서 1 ~ 10분 동안 반응시키며;
(7) 단계(4)부터 단계(6)까지 5개 내지 50개 순환을 반복하고;
(8) 60 ~ 80 ℃ 사이의 온도 하에서 계속하여 1 ~ 10분 동안 연신 반응시키며;
9) 증폭 후의 산물을 0 ~ 5 ℃의 온도 하에서 냉장 보존한다.
바람직하게, 단계(3)에서 전체 게놈 증폭의 열순환 과정은,
(1) 95 ℃의 제1 변성 온도 하에서 10초 동안 반응시키고;
(2) 10 ℃의 제 1 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키며, 20 ℃의 제2 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키고, 30 ℃의 제3 어닐링 온도 하에서 60초 동안 반응시키며, 40 ℃의 제4 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키고, 50 ℃의 제5 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키며;
(3) 62 ℃의 제1 연신 온도 하에서 90분 동안 반응시키고;
(4) 95 ℃의 제2 변성 온도 하에서 20초 동안 반응시키며;
(5) 59 ℃의 제6 어닐링 온도하에서 20초 동안 반응시키고;
(6) 72 ℃의 제2 연신 온도 하에서 3분 동안 반응시키며;
(7) 단계(4)부터 단계(6)까지 10개 내지 30개 순환을 반복하고;
(8) 72 ℃의 온도 하에서 계속하여 5분 동안 연신 반응시키며;
(9) 증폭 후의 산물을 4 ℃의 온도 하에서 냉장 보존한다.
상기 단계(9)에서 얻은 증폭 산물을 Illumina Hiseq, Miseq, Life Technology PGM, 프로톤 시퀀서(Proton sequencer)의 기술 요구, 통상적인 라이브러리 구축, 시퀀싱, 데이터 분석 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 단계에 따라, 샘플 게놈 중 각 염색체와 염색체 국부의 복제 개수를 검출한다. 정상 염색체 및 염색체 국부의 복제 개수는 2이다. 복제 개수가 2(예를 들어 ≥2.5)보다 크거나 2보다 작을 경우(예를 들어 ≤1.8), 모두 복제 개수 이상에 속하고, 이는 염색체의 이상을 의미한다. 이러한 정상 또는 이상적인 검출 결과는 배양액 유래 배아의 염색체 정상 또는 이상을 대표한다. 만약 염색체 이상의 배아를 모체에 이식하면 배아의 착상이 실패되어, 유산 등 불량한 후과를 초래한다. 염색체가 정상인 배아를 모체에 이식하여야만 임신에 성공할 기회가 비교적 높다.
본 발명은 배아 초기 배양액(낭배 배양액)으로부터 배아 유래 유리 DNA를 검출하여, 상기 배아의 염색체 상황(염색체의 전체 또는 국부의 이수체 출연 여부)을 판단한다. 배아는 초기 체외 배양 발육 과정에서 낭배 배양액에 극소량(약 몇십 피코그램)의 DNA을 방출하기 때문에, 이러한 미량의 DNA를 이용하여 염색체 이수체를 검출하려면, 먼저 DNA를 대폭 균일하게 증폭시켜야 한다. 그러나, 낭배 배양액의 체적은 약 30 μl이므로, 배양액 중의 배아 유래 DNA는 고도로 희석되고 동시에 배아 배양액 성분이 복잡하며 그 중 일부 성분은 DNA의 증폭에 억제 작용을 한다. 본 발명에서의 기술적 해결수단은 상기 다양한 기술적 과제를 극복하여, 성공적으로 낭배 배양액 중 배아 염색체 이수체를 검출하는 기술 방법을 구축하였다.
따라서, 선행 기술 대비, 본 발명은 통상적인 PGS 검출 샘플링 방법에 의해 야기된 세포 손실과 손상을 방지하고, PGS 샘플링 조작을 단순화하며; 이 외에, 낭배 배양액은 본래 시험관 아기의 조작 과정에서의 배아 체외 배양 단계의 폐기물이기 때문에, 본 발명 기술은 이러한 폐기물을 검출함으로써, 임상에 거의 어려움을 주지 않고 대응되는 배아 염색체 상태에 대한 평가를 실현하였다.
다른 한편, 본 발명은,
(i) NG프라이머와 NT프라이머는 5’말단에서 3’말단까지의 보편적 서열과 가변 서열을 포함하고, 상기 보편적 서열은 G, A, C와 T 네 가지 염기 중의 세 가지 또는 두 가지로 조성되며, 상기 보편적 서열은 상이할 경우 G와 C를 포함하고;
상기 NG프라이머의 가변 서열은 (N)nGGG, (N)xGTGG(N)y, 또는 이들의 조합으로부터 선택되되; 상기 NT프라이머의 가변 서열은 (N)nTTT, (N)mTNTNG, 또는 이들의 조합으로부터 선택되며; 여기서, N은 임의의 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이고, 각 n은 독립적으로 3 ~ 17인 양의 정수로부터 선택되며, 각 m은 독립적으로 3 ~ 15인 양의 정수로부터 선택되고, x와 y는 각각 독립적으로 3 ~ 13인 양의 정수로부터 선택되지만;
상기 증폭 프라이머는 상기 보편적 서열을 포함하되 상기 가변 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 NG프라이머, NT프라이머 및 증폭 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 프라이머; 및
(ii) 임의의 낭배 배양액을 포함하는 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 검출 키트를 제공한다.
다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 NG프라이머, NT프라이머 및 증폭 프라이머는 동일한 보편적 서열을 구비한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 보편적 서열의 길이는 20 ~ 35 nt이고, 바람직하게는 25 ~ 30 nt이다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 NG프라이머와 NT프라이머의 서열은 SEQ ID NO.: 1 ~ 5로부터 선택되되; 상기 증폭 프라이머의 서열은 SEQ ID NO.: 6으로 표시된다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 키트는 시퀀싱하기 위한 시약, 핵산 칩, 면역 형광 검출 시약, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 여러 가지의 별도의 검출 관련 시약을 더 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 키트는 용해물 또는 리아제를 더 포함한다.
또 다른 하나의 바람직한 예에 있어서, 상기 키트는 태그(tag) 또는 설명서를 더 포함하고, 상기 태그 또는 설명서에 따르면 상기 키트에 수집된 낭배 배양액의 양은 10 ~ 100 μl이고, 바람직하게는 15 ~ 80 μl이며, 더 바람직하게는 20 ~ 60 μl이다.
다른 한편, 본 발명은 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 제품을 제조하는 본 발명의 검출 키트의 용도를 더 제공한다.
아래 도면과 구체적인 실시형태에 결부하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.
도1은 본 발명의 실시예1에서 각각 낭배 배양액과 낭배 세포를 이용한 A샘플에 대한 염색체 검출 결과 분석을 나타낸다.
도2는 본 발명의 실시예1에서 각각 낭배 배양액과 낭배 세포를 이용한 B샘플에 대한 염색체 검출 결과 분석을 나타낸다.
본 발명자는 장기간의 광범위하고 심층적인 연구를 거쳐, 대량의 선별과 테스트를 통하여, 소량의 배양액에서 배아를 배양하고, 극미량의 배양액을 취하여 검출한 결과, 얻은 염색체 이상의 검출 결과가 매우 높은 정확성을 갖는 것을 처음으로 우연히 발견하였다. 이 기초 상에서, 본 발명자는 본 발명을 완성하였다.
용어
본 발명 검출 기술에 사용되는 낭배 배양액은 무세포 낭배 배양액이다.
검출 방법
본 발명은 낭배를 배양한 후의 고갈된 배양액(depleted medium)(즉 상기 배양 체계에서 분리된 배양액)을 유전자 검출하여 배아 염색체 이상 여부를 검증하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 낭배를 배양한 후의 "고갈된" 배양액(즉 상기 배양 체계에서 분리된 배양액)을 유전자 검출하는 방법에 대하여 특별한 제한이 없고, 예를 들어 2세대 시퀀싱, 핵산 칩, 면역 형광 검출, 형광 PCR 검출, 1세대 시퀀싱, 3세대 시퀀싱, 질량 검출, 또는 이들의 조합과 같은 통상적인 방법으로 검출할 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 상기 검출 방법은,
수정란을 단일 정자 주사 방법으로 획득하여 3일의 난할구 시기까지 배양한 후, 새로 제조한 낭배 배양 미세 점적에 옮겨 낭배 배양하고, 이때 탈락된 과립 세포 및 수정되지 않은 정자의 오염을 제거하기 위하여 3일째에 무조건 액체를 교환하여야 하며;
형성된 낭배의 배아를 흡수하여 새로운 낭배 배양액에 옮기거나 유리화 냉동 보존 과정에 진입시키며, 약 1 μl 내지 500 μl의 나머지 원 포배 배양액, 바람직하게는 10 μl 내지 200 μl 가 배아 착상전 유전학 검사를 위해 수집하여야 하는 샘플인 낭배 배양액을 획득하는 단계(1);
단계(1)에서 얻은 원 포배 배양액을 용해물에 옮겨 원심분리시킨 후, 샘플이 다음 단계의 전체 게놈 증폭 단계로 진입하는 낭배 배양액을 수집하는 단계(2);
단계(2)에서 얻은 낭배 배양액과 용해물의 혼합물에 리아제를 넣어 균일하게 혼합한 후 부화시켜 리아제를 불활성화시키고, 용해 산물을 취하여 PCR 반응 튜브에 넣어 게놈 증폭 반응시키는 낭배 배양액에서 미량 DNA의 전체 게놈 증폭 단계(3); 및
2세대 시퀀싱, 핵산 칩 또는 면역 형광 검출로 분석하는 전체 게놈 증폭 후의 DNA 산물을 분석하여 배아의 염색체 상태의 정상 여부를 검증하는 단계(4)를 포함한다.
하나의 바람직한 예에 있어서, 액체 교환 2 ~ 3일 후, 형성된 낭배의 배아를 흡수하여 새로 제조된 낭배 배양액에 옮기거나 유리화 냉동 보존 과정에 진입시키며, 약 1 μl 내지 500 μl의 나머지 원 포배 배양액, 바람직하게는 10 μl 내지 200 μl가 바로 배아 착상전 유전학 검사를 위해 수집하여야 하는 샘플이다.
본 발명은 주로 하기와 같은 장점을 포함한다.
(1) 본 발명에서, 배아를 아주 소량의 배양액에서 배양하고, 극미량의 배양액을 검출하여, 얻은 염색체 이상의 검출 결과는 매우 높은 정확성을 갖는다.
(2) 본 발명은 단일 배아 배양 체계를 사용하고, 즉 하나의 배양액 미세 점적에 하나의 배아만 배양하며, 상기 체계에서 얻은 염색체 이상의 검출 결과는 더욱 정확하다.
아래 구체적인 실시예에 결부하여, 본 발명을 더 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는 것을 이해하여야 한다. 아래 실시예에서 구체적인 조건을 표시하지 않은 실험 방법은 예를 들어 Sambrook 등, 분자 클론: 실험실 수첩(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 조건과 같은 통상적인 조건, 또는 제조 업체에서 건의하는 조건에 따라 진행한다. 기타 설명이 없는 한, 백분율과 부수는 중량 백분율과 중량 부수이다.
달리 설명되지 않는 한, 본 발명의 실시예에서 사용된 재료 및 시약은 모두 시중에서 판매하는 제품이다.
실시예1
A, B 두 개의 체외 수정된 배아 샘플을 취하여, 각각 낭배 세포 검출의 방법과 낭배 배양액 검출의 방법으로 이의 염색체 상태를 평가하고, 구체적인 단계는 하기와 같다.
1. 낭배 배양액의 획득
1) 수정란을 단일 주사 방법으로 획득하여 3일의 난할구 시기까지 배양한 후, 새로 제조한 낭배 배양 미세 점적에 옮겨 낭배 배양한다.
2) 형성된 낭배의 배아를 흡수하여 새로운 낭배 배양액에 옮기거나 유리화 냉동 보존 과정에 진입시키고, 나머지 원 포배 배양액(약 30 ul)이 바로 배아 착상전 유전학 검사를 위해 수집하여야 하는 샘플A 및 샘플B이고, 바람직하게는 액체 교환 2 ~ 3일 후, 형성된 낭배의 배아를 흡수한다.
2. 낭배 배양액의 수집
1) 10 μl의 용해물(40 mM의 PH가 7.2인 Tris-Cl, 1 mM의 EDTA, 15 mM의 KCl 및 3 %의 Triton X-100)이 담긴 수집 튜브를 실온에 2분 동안 방치하여 용해물이 해동된 후, 샘플 수집 튜브를 미니 원심 분리기에 넣어 30초 동안 원심 분리시켜 용해물이 완전히 튜브의 바닥에 모이는 것을 확보한다.
2) 단계 1의 제2) 단계에서의 원 포배 배양액을 피펫(pipette)으로 용해물에 전부 옮긴다.
3) 마커펜으로 수집 튜브에 샘플의 이름을 표기하고, 소형의 원심 분리기로 30초 동안 분리하면, 샘플을 바로 다음 단계의 전체 게놈 증폭 단계에 진입시키거나 -20 ℃ 또는 -80 ℃에 넣어 냉동 보존할 수 있다.
3. 낭배 배양액에서 미량 DNA의 전체 게놈 증폭
1) 낭배 배양액과 용해물의 혼합물을 실온 하에서 용해시킨다.
2) 튜브에 프로테아제를 넣어, 상하로 흔들어 혼합한다.
3) 튜브를 40 ℃에 놓아 3시간 동안 부화시킨다.
4) 튜브를 90 ℃에 5분 동안 놓아 리아제를 불활성화시킨다.
5) 튜브에서 용해 산물을 취하여 PCR 반응 튜브에 넣는다.
6) PCR 반응 튜브에 증폭 혼합액(15 mM의 Tris-HCl, 15 mM의 (NH4)2SO4, 20 mM의 KCl, 1 mM의 MgSO4, 5 %의 DMSO와 2 %의 Triton X-100), 5 %의 DMSO, 10 mM의 dNTP, 50 μM의 NG (5′-GT GAG TGA TGG TTG AGG TAG TGT GGA GNNNNNGGG-3′)와 NT (5′-GT GAG TGA TGG TTG AGG TAG TGT GGA GNNNNNTTT-3′)프라이머, 100 μM의 증폭 프라이머(5′-GT GAG TGA TGG TTG AGG TAG TGT GGA G-3′), 1단위의 BstDNA중합 효소, 1단위의 DeepVe ntR를 넣는다.
7) PCR 반응 튜브를 PCR기에 넣어 전체 게놈 증폭시키고, 열 순환 과정은 하기와 같다.
Figure pct00001
4. 증폭 후의 DNA 산물을 통상적인 방법으로 2세대 시퀀싱하여 배아의 염색체 상태 정상 여부를 검증한다.
2세대 시퀀싱 데이터 결과에 따르면, A샘플에서, 낭배 배양액 검출 방법(도A1)과 낭배 세포 검출 방법(도A2)에서 모두 여러 가닥의 염색체 이상을 검출할 수 있지만; B샘플에서, 낭배 배양액 검출 방법(도B1)과 낭배 세포 검출 방법(도B2)에서 모두 염색체 정상으로 판정되었다. 상기 결과로부터, 낭배 배양액 검출과 낭배 세포 검출 이 두 가지 방법을 사용한 배아 염색체 상태 검증은 동일한 결과를 얻으므로, 상기 비침투성의 검출 방법이 더욱 정확하고 신뢰할 수 있는 것을 증명한다.
실시예2
임의로 42개의 체외 배양한 배아를 선택하여, 각각 실시예1에서의 방법에 따라 낭배 배양액 검출과 낭배 세포 검출 이 두 가지 방법을 비교한다. 검출 결과의 대응 관계는 논리적으로 4가지 조합 형식으로 표현될 수 있다.
첫 번째 유형. 세포 검출에서 이상으로 나타나고, 배양액 검출에서도 이상으로 나타난다.
두 번째 유형제. 세포 검출에서 정상으로 나타나고, 배양액 검출에서도 정상으로 나타난다.
세 번째 유형. 세포 검출에서 정상으로 나타나고, 배양액 검출에서 이상으로 나타난다.
네 번째 유형. 세포 검출에서 이상으로 나타나고, 배양액 검출에서 정상으로 나타난다.
42개의 비교 결과에서, 이 4가지 대응 관계의 사례 수 분포는 하기 표1과 같다.
Figure pct00002
결과에 따르면, 세포 검출을 최적 기준으로 할 경우, 계산하여 얻은 배양액 검출의 민감도는 88.2 %이고, 특이성은 84.0 %이며, 양성 예측값은 78.9이고, 음성 예측값은 91.3 %이다. 모든 지표가 모두 100 %가 아니더라도, 비침습성 방법으로 최적 기준에 접근하는 검출 결과를 충분히 제공하므로, 본 발명의 유익한 가치를 충분히 증명한다.
실시예3
본 발명의 실시예1의 방법에 따라 8사례의 상이한 원인으로 인하여 불임을 겪고 있는 환자의 배아를 배아 배양액 검출하고, 검출 결과에 따라 염색체가 정상인 배아를 선택하여 배아를 모친의 자궁에 이식한다.
결과는 표2에서 나타내는 바와 같다.
Figure pct00003
통상적으로, 균형 전위 환자의 배우자(즉 정자 또는 난자) 중의 80 %에는 염색체 이배체가 존재하되, 자연적인 임신 성공률이 매우 낮다. 통상적인 시험관 아기 방법은 염색체 이배체에 존재하는 배아를 검증하기 어려울 뿐만 아니라, 성공률도 매우 낮다.
본 발명의 결과에 따르면, 3호 환자와 8호 환자에서 높은 품질의 수정란을 검출하지 못하였고, 배아 염색체에 이상이 있으므로, 배아 이식으로 사용하지 않았다. 이 외에, 나머지 6사례 환자의 결과로부터 본 발명의 방법으로 염색체가 정상인 배아를 선택하여 모체에 이식한 후 한 번에 임신 성공하였고, 배아 이식 및 생존 유지 성공률은 5/6(즉, 83.3 %)에 달하였으며, 다시 말하면, 한 사례의 환자에서만 성공하지 못하였다.
따라서, 결과로부터 본 발명의 방법으로 아주 높은 임신율과 배아 생존율을 얻을 수 있다.
본 발명에서 개시된 실시예의 상기 설명은, 당업자가 본 발명을 실현하거나 사용할 수 있도록 하고, 아울러 상기 설명된 내용은 단지 본 발명의 비교적 바람직한 실시예로, 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명 실시예의 사상과 원칙 내의 임의의 변형, 동등한 교체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위 내에 속한다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 참조되는 것과 같이 본 출원에서 참조 문헌으로 인용된다. 이 외에, 본 발명의 상기 교시를 읽은 후, 당업자는 본 발명을 다양하게 변경 또는 수정할 수 있고, 이러한 등가적 형식 또한 본 출원에 첨부된 청구범위에서 제한하는 범위 내에 속한다.
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Claims (20)

  1. 수정란을 단일 정자 주사 방법으로 획득하여 3일의 난할구 시기까지 배양한 후, 새로 제조한 낭배 배양 미세 점적에 옮겨 낭배 배양하고, 형성된 낭배의 배아를 흡수하여 새로운 낭배 배양액에 옮기거나 유리화 냉동 보존 과정에 진입시키며, 나머지 원 포배 배양액이 바로 검출할 때 수집하여야 하는 샘플인 낭배 배양액을 획득하는 단계(1);
    단계(1)에서 얻은 원 포배 배양액을 용해물에 옮겨 원심분리시킨 후, 샘플이 다음 단계의 전체 게놈 증폭 단계로 진입하는 낭배 배양액을 수집하는 단계(2);
    단계(2)에서 얻은 낭배 배양액과 용해물의 혼합물에 리아제를 넣어 균일하게 혼합한 후 부화시켜 리아제를 불활성화시키고, 용해 산물을 취하여 PCR 반응 튜브에 넣어 게놈 증폭 반응시키는 낭배 배양액에서 미량 DNA의 전체 게놈 증폭 단계(3); 및
    2세대 시퀀싱, 핵산 칩 또는 면역 형광 검출로 분석하는 전체 게놈 증폭 후의 DNA 산물을 분석하여 배아의 염색체 상태의 정상 여부를 검증하는 단계(4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계(2)에서 용해물의 성분은 25 ~ 45 mM의 PH가 7.0 ~ 8.0인 Tris-Cl, 0.5 ~ 3 mM의 EDTA, 10 ~ 25 mM의 KCl 및 농도가 0.05 ~ 5 %인 세제이고, 상기 세제는 Triton X-100, Triton X-114, 트윈 20, NP40, 및 SDS로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    바람직하게 용해물의 성분은 40 mM의 PH가 7.2인 Tris-Cl, 1 mM의 EDTA, 15 mM의 KCl 및 3 %의 Triton X-100인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    단계(3)에서의 리아제는 프로테아제K, 퀴아젠프로테아제(Qiagen Protease), 펩신(pepsin), 파파인(papain), 트립신(trypsin) 및 리소자임(Lysozyme)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상선택되고, 상기 리아제의 농도는 1 ~ 25 μg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    바람직하게 상기 리아제의 농도는 20 μg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단계(3)에서 부화 온도는 30 ~ 60 ℃이고, 부화 시간은 1분 내지 12시간이며, 불활성화 온도는 75 ~ 95 ℃이고, 불활성화 시간은 1 ~ 15분인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    단계(3)에서 바람직하게 부화 온도는 40 ℃이고, 부화 시간은 3시간이며, 불활성화 온도는 90 ℃이고, 불활성화 시간은 5분인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계(3)에서 진행되는 PCR 반응 경우의 PCR 반응 튜브에는 증폭 혼합액, 0.5 ~ 20 %의 PCR 억제물 길항제, 5 ~ 20 mM의 dNTP, 5 ~ 100 μM의 NG와 NT프라이머, 50 ~ 200 μM의 증폭 프라이머, 0.5 ~ 10단위의 핵산 중합 효소가 함유되고, 상기 PCR억제물 길항제는 DMSO, 베타인(Betaine), 포름아미드(Formamide), 글리세린(glycerin) 및 알부민(albumin) 으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되며, 상기 핵산 중합 효소는 Phi29 DNA중합 효소, Bst DNA 중합 효소, Vent 중합 효소, Deep Vent 중합 효소, Klenow Fragment DNA 중합 효소I, MMLV 역전사 효소, AMV역전사 효소, HIV역전사 효소, Phusion® 최고 충실도 DNA 중합 효소, Taq 중합 효소, 대장균(E.coli) DNA중합 효소, LongAmp Taq DNA중합 효소 및 OneTaq DNA중합 효소로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 증폭 혼합액의 성분은 10 ~ 25 mM의 Tris-HCl, 5 ~ 25 mM의 (NH4)2SO4, 5 ~ 30 mM의 KCl, 0.5 ~ 5 mM의 MgSO4, 0.1 ~ 20 %의 DMSO 및 0.05 ~ 5 %의 Triton X-100인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    바람직하게, 상기 증폭 혼합액의 성분은 15 mM의 Tris-HCl, 15 mM의 (NH4)2SO4, 20 mM의 KCl, 1 mM의 MgSO4, 5 %의 DMSO 및 2 %의 Triton X-100인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 NG와 NT프라이머는 5’말단에서 3’말단까지의 보편적 서열과 가변 서열을 포함하고, 상기 보편적 서열은 G, A, C와 T 네 가지 염기 중의 세 가지 또는 두 가지로 조성되며, 상기 보편적 서열이 상이할 경우 G와 C를 포함하고; 상기 증폭 프라이머는 상기 보편적 서열을 포함하되 상기 가변 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 가변 서열은, (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG, (N)xGTGG(N)y로부터 선택되고, N은 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이며, n은 3 ~ 17인 양의 정수로부터 선택되고, m은 3 ~ 15인 양의 정수로부터 선택되며, x와 y는 각각 3 ~ 13인 양의 정수로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 NG와 NT프라이머는 SEQ ID NO: 1 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN], SEQ ID NO: 2 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG], SEQ ID NO: 3 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT], SEQ ID NO: 4 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG] 또는 SEQ ID NO: 5 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]의 서열을 포함하고, N은 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이며; 상기 증폭 프라이머는 5’에서 3’까지 SEQ ID NO: 6 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]의 서열을 구비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    단계(3)에서 전체 게놈 증폭의 열순환 과정은,
    (1) 90 ~ 98 ℃ 사이의 제1 변성 온도에서 5 ~ 20초 동안 반응시키고;
    (2) 5 ~ 15 ℃ 사이의 제 1 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키며, 15 ~ 25 ℃ 사이의 제2 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키고, 25 ~ 35 ℃ 사이의 제3 어닐링 온도에서 30 ~ 80초 동안 반응시키며, 35 ~ 45 ℃ 사이의 제4 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키고, 45 ~ 55 ℃ 사이의 제5 어닐링 온도에서 5 ~ 60초 동안 반응시키며;
    (3) 55 ~ 80 ℃ 사이의 제1 연신 온도에서 10 ~ 150분 동안 반응시키고;
    (4) 90 ~ 98 ℃ 사이의 제2 변성 온도에서 5 ~ 30초 동안 반응시키며;
    (5) 45 ~ 70 ℃ 사이의 제6 어닐링 온도에서 10 ~ 30초 동안 반응시키고;
    (6) 60 ~ 80 ℃ 사이의 제2 연신 온도에서 1 ~ 10분 동안 반응시키며;
    (7) 단계(4)부터 단계(6)까지 5개 내지 50개 순환을 반복하고;
    (8) 60 ~ 80 ℃ 사이의 온도 하에서 계속하여 1 ~ 10분 동안 연신 반응시키며;
    (9) 증폭 후의 산물을 0 ~ 5 ℃의 온도 하에서 냉장 보존하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    단계(3)에서 전체 게놈 증폭의 열순환 과정은,
    (1) 95 ℃의 제1 변성 온도 하에서 10초 동안 반응시키고;
    (2) 10 ℃의 제 1 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키며, 20 ℃의 제2 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키고, 30 ℃의 제3 어닐링 온도 하에서 60초 동안 반응시키며, 40 ℃의 제4 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키고, 50 ℃의 제5 어닐링 온도 하에서 45초 동안 반응시키며;
    (3) 62 ℃의 제1 연신 온도 하에서 90분 동안 반응시키고;
    (4) 95 ℃의 제2 변성 온도 하에서 20초 동안 반응시키며;
    (5) 59 ℃의 제6 어닐링 온도하에서 20초 동안 반응시키고;
    (6) 72 ℃의 제2 연신 온도 하에서 3분 동안 반응시키며;
    (7) 단계(4)부터 단계(6)까지 10개 내지 30개 순환을 반복하고;
    (8) 72 ℃의 온도 하에서 계속하여 5분 동안 연신 반응시키며;
    (9) 증폭 후의 산물을 4 ℃의 온도 하에서 냉장 보존하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    단계(3)에서 진행되는 PCR반응 경우의 프라이머는 NG프라이머, NT프라이머 및 증폭 프라이머를 포함하고,
    상기 NG프라이머와 NT프라이머는 5’말단에서 3’말단까지의 보편적 서열과 가변 서열을 포함하며, 상기 보편적 서열은 G, A, C와 T 네 가지 염기 중의 세 가지 또는 두 가지로 조성되고, 상기 보편적 서열이 상이할 경우 G와 C를 포함하며;
    상기 NG프라이머의 가변 서열은 (N)nGGG, (N)xGTGG(N)y, 또는 이들의 조합으로부터 선택되지만; 상기 NT프라이머의 가변 서열은 (N)nTTT, (N)mTNTNG, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고; N은 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이며, 각 n은 독립적으로 3 ~ 17인 양의 정수로부터 선택되고, 각 m은 독립적으로 3 ~ 15인 양의 정수로부터 선택되며, x와 y는 각각 3 ~ 13인 양의 정수로부터 선택되지만;
    상기 증폭 프라이머는 상기 보편적 서열을 포함하되 상기 가변 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. (i) NG프라이머와 NT프라이머는 5’말단에서 3’말단까지의 보편적 서열과 가변 서열을 포함하고, 상기 보편적 서열은 G, A, C와 T 네 가지 염기 중의 세 가지 또는 두 가지로 조성되며, 상기 보편적 서열은 상이할 경우 G와 C를 포함하고;
    상기 NG프라이머의 가변 서열은 (N)nGGG, (N)xGTGG(N)y, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고; 상기 NT프라이머의 가변 서열은 (N)nTTT, (N)mTNTNG, 또는 이들의 조합으로부터 선택되며; N은 천연적인 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드이고, 각 n은 독립적으로 3 ~ 17인 양의 정수로부터 선택되며, 각 m은 독립적으로 3 ~ 15인 양의 정수로부터 선택되고, x와 y는 각각 독립적으로 3 ~ 13인 양의 정수로부터 선택되지만;
    상기 증폭 프라이머는 상기 보편적 서열을 포함하되 상기 가변 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 NG프라이머, NT프라이머 및 증폭 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 프라이머; 및
    (ii) 선택적으로 낭배 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 검출 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 NG프라이머, NT프라이머 및 증폭 프라이머는 동일한 보편적 서열을 구비하는 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 보편적 서열의 길이는 20 ~ 35 nt이고, 바람직하게는 25 ~ 30 nt인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 낭배 배양액을 이용한 배아 염색체 이상을 검출하는 제품을 제조하는 제17항에 따른 검출 키트의 용도.
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