CN109609445A - 一种囊胚中单个卵裂球的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种囊胚中单个卵裂球的分离方法，包括如下步骤：口吸针的制备；分离针的制备；链霉蛋白酶和胰蛋白酶的准备；囊胚透明带的去除；囊胚单个卵裂球的分离收缩后的囊胚置于50μL的胰蛋白酶液滴中温育40min，温育后，先用细口口吸针将囊胚移入1g/L的BSA液滴中洗净后，用细口口吸针快速吹吸将囊胚吹散开，直到有一些细胞团无法通过吹吸进行分离，再用分离针的细段部分将细胞团中的单个细胞分开即可，本发明采用胰蛋白酶分离囊胚单卵裂球，细胞形态完整，细胞之间间隔分明，发明所需试剂耗材容易获得，经济，发明步骤简单易行，是一种可广泛推广的简单经济有效的实用方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体是一种囊胚中单个卵裂球的分离方法。
背景技术
随着生殖医学的发展，越来越多的不孕不育夫妇选择辅助生殖技术受孕，对人胚胎进行质量评价一般仅从形态及发育速度这两个角度出发，但这并不能完全准确预测胚胎的发育潜能，所以仍有部分低质量胚胎可进一步发育形成扩张囊胚。已有研究显示，移植卵裂球存活率低于50％的冷冻胚胎也能获得妊娠，即使是在复苏时严重受损的冷冻胚胎，也能继续分裂并着床，这也充分说明单个卵裂球有发育成囊胚的能力。单卵裂球的发育能力在某种程度上反映了其来源胚胎的发育潜力，根据同一胚胎来源的单卵裂球的发育特点判断胚胎发育潜力对移植胚胎的选择有很大的帮助。此外，人早期胚胎来源的卵裂球经体外培养得到扩张囊胚，其内细胞团可继续用于人胚胎干细胞研究。干细胞可诱导分化为成体各种类型的组织细胞，其中NANOG在胚胎干细胞中的表达呈异质性，对控制胚胎干细胞多能性及稳定状态发挥关键作用，NANOG高表达的胚胎干细胞具有更高的自我更新效率，而NANOG低表达的胚胎干细胞倾向于准备分化。
在早期胚胎发育过程中，胚胎发育经历了受精卵、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚、着床以及着床后发育阶段。在胚胎发育的最初7天，单个受精卵经历了一系列的细胞分裂和形态改变，形成覆盖一层致密细胞的扩张囊胚。有研究表明，在小鼠4-细胞胚胎中的单卵裂球已具有既定方向分化为滋养外胚层或内细胞团的趋势，单卵裂球之间的异质性是造成这种差异的主要原因。高度对称相似的早期胚胎4-细胞中的单卵裂球已经呈现细胞之间表达谱的异质性，因此研究早期胚胎发育中每个单卵裂球的表观遗传调控的异质性，分析每个细胞将要分化形成的细胞类型，有助于我们研究早期胚胎发育过程中的各种行为和机制。
近年来，单细胞转录组测序技术广泛应用，能够揭示单个细胞内的基因表达状态和基因结构信息，准确反映细胞之间的异质性。哺乳动物胚胎发育中第一次谱系分化发生在囊胚阶段，获得纯化的滋养层细胞或内细胞团可用于研究早期胚胎发育和分化的调控机制。实现早期胚胎发育中囊胚阶段单卵裂球的转录组分析，首先要在囊胚中分离出完整的单卵裂球。而现有的单细胞分离技术主要有连续稀释法、显微操作法、荧光流式分选法、激光捕获显微切割技术以及微流控平台，但这些技术需要耗费操作人员大量时间，且所需仪器设备较为昂贵，并不是每个科研机构都能接受。所以本发明为分离囊胚中的单卵裂球提供了一种经济、便捷且易掌握的实用方法，为早期胚胎着床前细胞命运决定的测定提供技术依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种囊胚中单个卵裂球的分离方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种囊胚中单个卵裂球的分离方法，包括如下步骤：
(1)口吸针的制备；
(2)分离针的制备；
(3)链霉蛋白酶和胰蛋白酶的准备
链霉蛋白酶：向离心管中加入30μL的10g/L链霉蛋白酶，再加入60μL1g/L的BSA滴液，吸打混匀后进行瞬离，瞬离结束后置于预热；
胰蛋白酶：将2.5g/L的胰蛋白酶预热10-15min，再移取50-100μL 2.5g/L的胰蛋白酶于进口皿中，每个进口皿中含有两个50-100μL胰蛋白酶液滴，并用石蜡油覆盖，预热；
(4)囊胚透明带的去除
取一形态较好的扩张囊胚，用移卵针移入50-60μL链霉蛋白酶液滴中，待透明带即将被消化完全时，将囊胚依次置于三个50-100μL 1g/L的BSA液滴中洗净，洗净后用一根直径小于囊胚直径的口吸针轻柔吸吐囊胚使其收缩；
(5)囊胚单个卵裂球的分离
收缩后的囊胚置于50-100μL的胰蛋白酶液滴中温育40-45min，温育后，先用细口口吸针将囊胚移入1g/L的BSA液滴中洗净后，用细口口吸针快速吹吸将囊胚吹散开，直到有一些细胞团无法通过吹吸进行分离，再用分离针的细段部分将细胞团中的单个细胞分开即可。
一种囊胚中单个卵裂球的分离方法，包括如下步骤：
(1)口吸针的制备；
(2)分离针的制备；
(3)链霉蛋白酶和胰蛋白酶的准备
链霉蛋白酶：向离心管中加入30μL的10g/L链霉蛋白酶，再加入1g/L的BSA 60μL，吸打混匀后进行瞬离，瞬离结束后置于预热；
胰蛋白酶：将2.5g/L的胰蛋白酶预热10min，再移取50μL 2.5g/L的胰蛋白酶于进口皿中，每个进口皿中含有两个50μL胰蛋白酶液滴，并用石蜡油覆盖，预热；
(4)囊胚透明带的去除
取一形态较好的扩张囊胚，用移卵针移入50μL链霉蛋白酶液滴中，待透明带即将被消化完全时，将囊胚依次置于三个50μL 1g/L BSA液滴中洗净，洗净后用一根直径小于囊胚直径的口吸针轻柔吸吐囊胚使其收缩；
(5)囊胚单个卵裂球的分离
收缩后的囊胚置于50μL的胰蛋白酶液滴中温育40min，温育后，先用细口口吸针将囊胚移入1g/L的BSA液滴中洗净后，用细口口吸针快速吹吸将囊胚吹散开，直到有一些细胞团无法通过吹吸进行分离，再用分离针的细段部分将细胞团中的单个细胞分开即可。
步骤(1)中，口吸针的制备方法如下：取一根BJ-40细玻管拉制成直径为145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的口吸针，将口吸针的细段的前部分置于酒精灯上灼烧后拉开，拉开后针的前段部分会变得较细，此时用砂轮将较细针段的前3/4部分截去，注意截口要平整，平整的截口置于酒精灯的蓝色火焰外部轻微灼烧使其针口圆润即可。
步骤(2)中，分离针的制备方法如下：取一根BJ-40细玻管拉制成直径为145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的口吸针，将口吸针的细段的前部分置于酒精灯上灼烧后拉开，拉开后的细段部分针长度约1cm且不能弯曲。
步骤(3)中，链霉蛋白酶瞬离结束后置于38.5℃的热台上预热10min；
步骤(3)中，胰蛋白酶用石蜡油覆盖后，置于38.5℃的热台上预热5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用胰蛋白酶分离囊胚单卵裂球，细胞形态完整，细胞之间间隔分明，发明所需试剂耗材容易获得，经济，发明步骤简单易行，是一种可广泛推广的简单经济有效的实用方法。
附图说明
图1为本发明的扩张囊胚的结构示意图。
图2为本发明的囊胚裂解后分离得到的单个卵裂球的结构示意图。
具体实施方式
1.材料
BJ-40细玻管(2.5×2.0×100)；离心管(1.5mL，Axygen)；离心管(200μL，BBI lifesciences)；100μL(Dragon Lab)；直径35mm进口培养皿(Corning，USA)；离心机(eppendorf)；体视显微镜(Nikon，SMZ1000)；透明恒温台(TOKAI HIT)
2.试剂
杜氏磷酸盐缓冲液(Gibco，14190-144)；矿物油(SIGMA，M8410-1L)；胰蛋白酶(HyClone，SH30042.01)；链霉蛋白酶(AMRESCO，E629-1G)；牛血清白蛋白(SIGMA，A6003)。
实施例一：
一种囊胚中单个卵裂球的分离方法，包括如下步骤：
1.1口吸针的制备
取一根BJ-40细玻管拉制成直径为145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的口吸针，将口吸针的细段的前部分置于酒精灯上灼烧后拉开，拉开后针的前段部分会变得较细，此时用砂轮将较细针段的前3/4部分截去，注意截口要平整，平整的截口置于酒精灯的蓝色火焰外部轻微灼烧使其针口圆润即可。
1.2分离针的制备
取一根BJ-40细玻管拉制成直径为145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的口吸针，将口吸针的细段的前部分置于酒精灯上灼烧后拉开，拉开后的细段部分针长度约1cm且不能弯曲。
1.3链霉蛋白酶和胰蛋白酶的准备
链霉蛋白酶：向200μL离心管中加入30μL的10g/L链霉蛋白酶，再加入1g/L的BSA60μL，吸打混匀后进行瞬离，瞬离结束后置于38.5℃的热台上预热10min。
胰蛋白酶：将2.5g/L的胰蛋白酶预热10min，再移取50μL 2.5g/L的胰蛋白酶于进口皿中，每个进口皿中含有两个50μL胰蛋白酶液滴，并用石蜡油覆盖，置于38.5℃的热台上预热5min。
1.4囊胚透明带的去除
取一洁净的直径为35mm的进口培养皿皿盖，置于体视显微镜38.5℃的透明恒温台上，移取50μL的链霉蛋白酶置于皿盖上部，以及三个50μL 1g/L的BSA液滴置于皿盖中部，用于清洗去除透明带后的囊胚。取一形态较好的扩张囊胚，如图1所示，用移卵针移入50μL链霉蛋白酶液滴中，待透明带即将被消化完全时，将囊胚依次置于三个50μL 1g/L的BSA中洗净，洗净后用一根直径小于囊胚直径的口吸针轻柔吸吐囊胚使其收缩。
1.5囊胚单个卵裂球的分离
收缩后的囊胚置于50μL的胰蛋白酶液滴中温育40min，40min后先用细口口吸针将囊胚移入1g/L的BSA液滴中洗净后，用细口口吸针快速吹吸将囊胚吹散开，此时应有70％的单卵裂球都完整分离，直到有一些细胞团无法通过吹吸进行分离，再用分离针的细段部分将细胞团中的单个细胞分开即可，如图2所示。
结果显示，本发明的这种方法分离囊胚的单卵裂球是可行的，并且这种方法较为简单易行，分离出的单卵裂球形态完好，细胞膜结构完整。由于囊胚单卵裂球之间的连接较为紧密，分离有一定的难度，以往的分离方法较为繁琐，此方法先对囊胚整体进行处理，能使所有卵裂球都得到充分的反应，待囊胚整体单卵裂球松散开，再对为数不多的小细胞团中的单卵裂球进行单一剥离即可得到理想的发明材料，相比于连续稀释法、显微操作法、荧光流式分选法、激光捕获显微切割技术以及微流控平台法，此法对早期胚胎发育中囊胚较为适用，针对性强，价格低廉，为广大科研机构所能接受。显微操作法、荧光流式分选法、激光捕获显微切割技术以及微流控平台法所用发明设备较为昂贵，且需要发明人员进行一段时间的学习才能掌握，发明步骤繁琐，花费大量的人力物力资源。连续稀释法虽然操作简便，不需要特殊仪器设备，但是它依赖于梯度稀释计算，不是直接的单个细胞分离，容易出现误差。
综合所述，采用胰蛋白酶分离囊胚单卵裂球，细胞形态完整，细胞之间间隔分明，发明所需试剂耗材容易获得，经济，发明步骤简单易行，是一种可广泛推广的简单经济有效的实用方法。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种囊胚中单个卵裂球的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)口吸针的制备；
(2)分离针的制备；
(3)链霉蛋白酶和胰蛋白酶的准备
链霉蛋白酶：向离心管中加入30μL的10g/L链霉蛋白酶，再加入60μL1g/L的BSA滴液，吸打混匀后进行瞬离，瞬离结束后置于预热；
胰蛋白酶：将2.5g/L的胰蛋白酶预热10-15min，再移取50-100μL 2.5g/L的胰蛋白酶于进口皿中，每个进口皿中含有两个50-100μL胰蛋白酶液滴，并用石蜡油覆盖，预热；
(4)囊胚透明带的去除
取一形态较好的扩张囊胚，用移卵针移入50-60μL链霉蛋白酶液滴中，待透明带即将被消化完全时，将囊胚依次置于三个50-100μL 1g/L的BSA液滴中洗净，洗净后用一根直径小于囊胚直径的口吸针轻柔吸吐囊胚使其收缩；
(5)囊胚单个卵裂球的分离
收缩后的囊胚置于50-100μL的胰蛋白酶液滴中温育40-45min，温育后，先用细口口吸针将囊胚移入1g/L的BSA液滴中洗净后，用细口口吸针快速吹吸将囊胚吹散开，直到有一些细胞团无法通过吹吸进行分离，再用分离针的细段部分将细胞团中的单个细胞分开即可。
2.根据权利要求1所述的囊胚中单个卵裂球的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，口吸针的制备方法如下：取一根BJ-40细玻管拉制成直径为145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的口吸针，将口吸针的细段的前部分置于酒精灯上灼烧后拉开，拉开后针的前段部分会变得较细，此时用砂轮将较细针段的前3/4部分截去，注意截口要平整，平整的截口置于酒精灯的蓝色火焰外部轻微灼烧使其针口圆润即可。
3.根据权利要求1所述的囊胚中单个卵裂球的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，分离针的制备方法如下：取一根BJ-40细玻管拉制成直径为145-155μm、细段长度为9-12cm、粗细均匀的口吸针，将口吸针的细段的前部分置于酒精灯上灼烧后拉开，拉开后的细段部分针长度约1cm且不能弯曲。
4.根据权利要求1所述的囊胚中单个卵裂球的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，链霉蛋白酶瞬离结束后置于38.5℃的热台上预热10min。
5.根据权利要求1所述的囊胚中单个卵裂球的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，胰蛋白酶用石蜡油覆盖后，置于38.5℃的热台上预热5min。
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