JP2021007403A - 胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する方法 - Google Patents

胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】胚盤胞培養液から胚の染色体の状態を検出する方法の提供。【解決手段】（１）単精子注射方法によって受精卵を取得し、３日目の卵割球に培養した後に、新しく調製された胚盤胞培養のための微小滴に移して胚盤胞の培養を行い、胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すか又はガラス化冷凍保存プロセスに供し、残った元の胚盤胞培養液を検出用サンプルに供する工程、（２）工程（１）で得られた胚盤胞培養液を溶解液と混合する工程、（３）工程（２）で得られた混合物にタンパク質分解酵素を添加した後にインキュベートし、その後、分解酵素を不活性化させ、分解物をＰＣＲ反応管に入れてＰＣＲ反応により全ゲノム増幅反応を行う工程、及び（４）工程（３）で得られた増幅ゲノムを、第２世代シーケンシング、核酸チップ又は免疫蛍光検出を使用して、検出する工程を含む、胚の染色体異常を検出する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、生物医学および分子細胞生物学の分野に関し、具体的に、胚盤胞培養液で胚の染色体の状態を検出・分析する方法に関する。
試験管ベビー技術は不妊・不育に対抗する強い技術手段で、その技術過程は、まず母親から複数の卵子（通常8〜15個）を採取し、さらに父親の精子で卵子に対して体外受精を
行い、受精卵が体外培養液で5日生長したら、胚は約80〜100個の細胞からなるのう状構造、すなわち胚盤胞で、2〜3個の胚盤胞を母親の子宮に置いた後、理想の場合、子宮に置いた胚盤胞のうち1個〜3個が正常の妊娠期で発育に成功し、出産に至る。しかし、様々な原因で、胚盤胞を子宮に置いてから胎児が生まれるまでの成功率が低く、通常40％程度だけで、母親自身の健康の原因以外、受精卵の品質は胚盤胞発育の失敗の要因の一つである。
受精卵の染色体は母親由来の卵子と父親由来の精子からのもので、いずれの一方の染色体異常も受精卵の染色体異常につながる。正常者の受精卵、各胚細胞および胎児、嬰幼児から成人までの各細胞内に44本、すなわち22対の常染色体(二倍体と呼ぶ)および2本の性
染色体(男性はXYで、女性はXXである)。異常の場合、任意の染色体の全部または局部に二倍体よりも多いか少ない状態が現れることがあり、異数体異常と呼び、異数体異常は最も見られる胚発育の失敗につながる染色体異常の形態である。通常の試験管ベビー技術において、顕微鏡による形態観察だけで、複数（通常8〜15個）の胚から2〜3個の比較的に「
正常」のものを選んで母親の子宮に置く。顕微鏡における形態の正常で染色体が正常か反映することができないため、間違えて形態が正常であるが染色体が異常の胚を選んで母親の子宮に置くことで多くの試験管ベビーの受胎の失敗につながる。
近年、いくつかの技術が確立し、着床前遺伝学的スクリーニング(Preimplantation Genetic Screen、PGS)と総称されるものによって体外培養胚の染色体状態を検出することに
よって、染色体正常の胚をスクリーニングして母親の子宮に置くことで、受胎成功率を向上させる。研究では、PGSによって改めて子宮に置く試験管ベビーの操作は成功率を60％
以上に向上させることが示されたが、様々なPGS方法は免疫蛍光検出(FISH)、チップ検出
、第2世代シーケンシング検出などを含む。上記各検出に必要な生物サンプルはいずれも
体外培養胚から採取される1個〜数個の細胞で、このような少量の細胞に対する検出によ
って胚全体の染色体が正常か反映される。
具体的に、5日体外で培養された受精卵が胚盤胞期まで発育したら栄養膜細胞（trophoblast）が採取できるようになる。通常の操作は、顕微鏡において、ガラス毛管で1個〜数
個の栄養膜細胞を吸い取って細胞を分解させ、その中の微量DNAを放出させ、微量DNAに対して全ゲノム増幅を行った後、核酸チップまたは第2世代シーケンシングなどの方法によ
って細胞の染色体の状態を検出する(特許文献１)。理論上、吸い取った数個の細胞における染色体の状態は胚におけるほかの細胞と一致し、この数個の細胞を検出すれば、当該胚の染色体の状態が正常かわかる。一般的に、この時数個の栄養膜細胞を吸い取っても胚の発育に悪影響を与えることがないとされ、生まれた嬰児の健康状況からみても、この操作は確かに健康に影響しない。しかし、当該技術が現れてからまだ日が短く（わずか数年で）、ヒトの終生の健康に長期間の影響があるかまだ観察が必要である。
また、胚盤胞腔液で胚の品質を検出する方法が研究・開発され、まず胚盤胞腔液において遊離DNAを採取し、すなわち、顕微操作装置において微小穿刺技術によって、無菌の針
先で胚盤胞腔液における遊離DNAを吸い取った(特許文献２および非特許文献１)。しかし
ながら、胚盤胞腔液は胚盤胞腔における液体で、胚盤胞腔液を得るには胚盤胞に穴を開けるか穿刺することが必要で、その介入性は依然として胚に不可避な損傷を与える。
上記のように、既存技術に存在する主な欠点は以下の通りである。
1．細胞の採取時、胚の操作技術に対する要求が高く、操作ミス、荒い操作は胚の重い
損傷につながり、損傷が重すぎると胚の発育が止まる。
2．良い操作でも、細胞の採取時不可避に胚に対して細胞の損失および軽い損傷を与え
る。現在細胞の損失および軽い損傷が胚の発育および生まれた後の健康に悪影響を与える証拠がまだないが、当該技術が現れてからまだ日が短く（わずか数年で）、ヒトの終生の健康に長期間の影響があるかまだ観察が必要である。
3．少数の場合、採取された数個の細胞の染色体の状態が胚におけるほかの細胞の染色
体の状態と異なることがあり、検出結果のミスにつながる。
そのため、胚自身を損傷せず、胚の染色体の状況を検査する非侵襲性の技術手段は、健康に影響する危険を取り除き、胚の検出の安全性を確保する現実的な需要である。
CN104711362A CN104450923A
Luca Gianaroli, M. Cristina Magli, Alessandra Pomanteら, Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility, 2014, 102(6):1692-1698.
本発明の目的は、上記既存技術における不足に対し、胚にどのような損傷も与えず、操作が簡単で、安全性と信頼性がより高い、胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する方法を提供することである。
上記目的を果たすために、本発明は胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する方法であって、
(1)胚盤胞培養液の獲得：単精子注射方法によって受精卵を得、それを3日目の卵割球に培養したら新しく調製された胚盤胞培養小滴に移して胚盤胞の培養を行い、この時3日目
に液置換が必要で、目的は脱落した顆粒球および未受精精子の汚染を除去することで、
胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すかガラス化冷凍保存プロセスに入り、残った元の胚盤胞培養液は約1μL〜500μL、好ましくは10μL〜200μLで、すなわ
ち、着床前遺伝学的スクリーニング(PGS)のために収集されるサンプルになる工程と、
(2)胚盤胞培養液の採取：工程(1)で得られた元の胚盤胞培養液を溶解液に移し、遠心後、サンプルが次の全ゲノム増幅工程に入る工程と、
(3)胚盤胞培養液における微量DNAの全ゲノム増幅：工程(2)で得られた胚盤胞培養液と
溶解液の混合物に分解酵素を入れ、均一に混合した後インキュベートし、その後分解酵素を不活性化させ、分解物を取ってPCR反応管に入れてPCR反応を行う工程と、
(4)全ゲノム増幅後のDNA産物の分析による胚の染色体の状態の正常かの同定：分析時第2世代シーケンシング、核酸チップまたは免疫蛍光検出を使用する工程と、
を含む方法を提供する。
一つの好適な例において、液置換の2〜3日後、胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すかガラス化冷凍保存プロセスに入り、残った元の胚盤胞培養液は約1μL〜500μL、好ましくは10μL〜200μLで、すなわち、着床前遺伝学的スクリーニング(PGS)のために収集されるサンプルになる。
ここで、工程(2)における溶解液の成分は、pHが7.0〜8.0のTris-HCl 25〜45mM、EDTA 0.5〜3mM、KCl 10〜25mMおよび濃度が0.05％〜5％の汚染除去剤で、前記界面活性剤はTriton X-100、Triton X-114、ツイン20、NP40およびSDSのうちの1種類または複数種類である。好ましくは、溶解液の成分は、pHが7.2のTris-Cl 40mM、EDTA 1mM、KCl 15mMおよび3％のTriton X-100である。
一つの好適な実施形態において、工程（3）では、使用されるプライマーはNGプライマ
ー、NTプライマーおよび増幅プライマーを含み、
ここで、前記のNGプライマーおよびNTプライマーは5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列を含み、ここで、前記共通配列はG、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含むことで、
前記NGプライマーの可変配列は(N)nGGG、(N)xGTGG(N)y、またはその組み合わせからな
る群から選ばれ、前記NTプライマーの可変配列は(N)nTTT、(N)mTNTNG、またはその組み合わせからなる群から選ばれ、ここで、Nは任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで
、各nは独立に3〜17の正整数から、各mは独立に3〜15の正整数から、xおよびyはそれぞれ3〜13の正整数から選ばれ、
前記増幅プライマーは前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まない。
工程(3)における分解酵素はプロテイナーゼK、QIAGEN Protease、ペプシン、パパイン
、トリプターゼおよびリゾチームのうちの1種類または複数種類から選ばれ、前記分解酵
素の濃度は1-25μg/ml、好ましくは20 μg/mlで、工程(3)では、インキュベート温度は30〜60℃で、インキュベート時間は1min〜12hで、不活性化温度は75〜95℃で、不活性化時
間は1〜15minで、好ましくは、インキュベート温度は40℃で、インキュベート時間は3hで、不活性化温度は90℃で、不活性化時間は5minである。
工程(3)において、PCR反応を行う時のPCR反応管に増幅混合液、0.5％〜20％のPCR阻害
物質拮抗剤、5〜20mM dNTP、5〜100μM NGおよびNTプライマー、50〜200μM増幅プライマー、0.5〜10単位の核酸ポリメラーゼが含まれ、前記PCR阻害物質拮抗剤はDMSO、ベタイン、ホルムアミド、グリセリンおよびアルブミンのうちの1種類または複数種類から選ばれ
、前記核酸ポリメラーゼはPhi29 DNAポリメラーゼ、Bst DNA ポリメラーゼ、Vent ポリメラーゼ、Deep Vent ポリメラーゼ、Klenow Fragment DNAポリメラーゼI、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、Phusion(R)ハイフィデリティーDNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ、LongAmp Taq DNAポリメラーゼおよびOneTaq DNAポリメラーゼのうちの1種類または複数種類から選ばれる。
前記増幅混合液の成分は10〜25mM Tris-HCl、5〜25mM (NH4)2SO4、5〜30mM KCl、0.5〜5mM MgSO4、0.1％〜20％DMSOおよび0.05〜5％Triton X-100である。好ましくは、前記増
幅混合液の成分は15mM Tris-HCl、15mM (NH4)2SO4、20mM KCl、1mM MgSO4、5％ DMSOおよび2％Triton X-100である。
前記NGおよびNTプライマーは5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列を含み、ここで、前記共通配列はG、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条
件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含むことで、前記増幅プライマーは前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まない。前記可変配列は(N)nGGG、(N)nTTT、(N)mTNTNG
、(N)xGTGG(N)yからなる群から選ばれ、ここで、Nは任意の天然核酸と塩基対合するヌク
レオチドで、nは3〜17の正整数から、mは3〜15の正整数から、xおよびyはそれぞれ3〜13
の正整数から選ばれる。
好ましくは、前記NGおよびNTプライマーは
配列番号1[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN]、
配列番号2[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]、
配列番号3[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]、
配列番号4[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG]または
配列番号5[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]
の配列を含み、ここで、Nは任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで、前記増幅プ
ライマーは5'から3'配列番号6[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]の配列を有する。
工程（3）における全ゲノム増幅の熱サイクルプログラムは、
(1)90〜98℃の間に介する第1の変性温度で5〜20s反応させ、
(2)5〜15℃の間に介する第1のアニーリング温度で5〜60s反応させ、15〜25℃の間に介
する第2のアニーリング温度で5〜60s反応させ、25〜35℃の間に介する第3のアニーリング温度で30〜80s反応させ、35〜45℃の間に介する第4のアニーリング温度で5〜60s反応させ、45〜55℃の間に介する第5のアニーリング温度で5〜60s反応させ、
(3)55〜80℃の間に介する第1の伸長温度で10〜150min反応させ、
(4)90〜98℃の間に介する第2の変性温度で5〜30s反応させ、
(5)45〜70℃の間に介する第6のアニーリング温度で10〜30s反応させ、
(6)60〜80℃の間に介する第2の伸長温度で1〜10min反応させ、
(7)工程(4)〜(6)を5〜50サイクル繰り返し、
(8)60〜80℃の間に介する温度で続いて1〜10min伸長反応させ、
(9)増幅された産物を0〜5℃で冷蔵保存するものである。
好ましくは、工程（3）における全ゲノム増幅の熱サイクルプログラムは、
(1)第1の変性温度95℃で10s反応させ、
(2)第1のアニーリング温度10℃で45s反応させ、第2のアニーリング温度20℃で45s反応
させ、第3のアニーリング温度30℃で60s反応させ、第4のアニーリング温度40℃で45s反応させ、第5のアニーリング温度50℃で45s反応させ、
(3)第1の伸長温度62℃で90min反応させ、
(4)第2の変性温度95℃で20s反応させ、
(5)第6のアニーリング温度59℃で20s反応させ、
(6)第2の伸長温度72℃で3min反応させ、
(7)工程(4)〜(6)を10〜30サイクル繰り返し、
(8)72℃で続いて5min伸長反応させ、
(9)増幅された産物を4℃で冷蔵保存するものである。
上記工程(9)で得られた増幅産物は、Illumina Hiseq、Miseq、Life Technology PGM、Protonシクエンシング装置の技術要求、通常のライブラリーの構築、シーケンシング、デ
ータ分析などを含むが、これらに限定されない工程に従ってサンプルのゲノムにおける各染色体および染色体の局部のコピー数を検出する。正常の染色体および染色体の局部のコピー数は2である。コピーが2よりも大きい(たとえば≧2.5)か2よりも小さい(たとえば≦1.8)場合、いずれもコピー数が異常で、すなわち、染色体に異常が生じたことになる。こ
の正常または異常の検出結果は培養液由来の胚の染色体の正常または異常を表す。染色体が異常の胚を母体に導入すると、胚の着床失敗、流産などの不良な結果につながる。染色
体が正常の胚を母体に導入しないと、受胎が成功する可能性が高くならない。
本発明は胚の早期体外培養液(胚盤胞培養液)から胚由来の遊離DNAを検出することによ
って、当該胚の染色体の状況(染色体全体または局部の異数体が現れたか)を判断する。胚は早期体外培養の発育過程において胚盤胞培養液に極少量(約数十pg)のDNAを放出するた
め、このように微量のDNAで染色体の異数体の検出を行うには、まずDNAに大幅の均一な増幅を行う必要がある。胚盤胞培養液の体積は約30μLであるため、培養液における胚由来
のDNAは高度に希釈されたもので、同時に胚培養液の成分は複雑で、その中の一部の成分
はDNAの増幅に抑制作用が生じる。本発明における技術方案は上記様々な技術難題を克服
し、胚盤胞培養液から胚の染色体の異数体を検出する技術方法の確立に成功した。
そのため、既存技術と比べ、本発明は通常のPGS検出のサンプリング方法による胚の細
胞の損失と損傷を避け、かつPGSのサンプルを得る時の操作を簡易化する。また、胚盤胞
培養液は試験管ベビーの操作過程における胚体外培養段階の廃棄物で、臨床に余計な面倒を増やさずに相応する胚の染色体の状態に対する評価を実現する。
もう一つの側面では、本発明は胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する検出キットであって、
（i）NGプライマー、NTプライマーおよび増幅プライマーを含む、PCRに使用されるプライマーと、
（ii）任意の胚盤胞培養液とを含み、
ここで、前記のNGプライマーおよびNTプライマーは5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列を含み、ここで、前記共通配列はG、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含むことで、
前記NGプライマーの可変配列は(N)nGGG、(N)xGTGG(N)y、またはその組み合わせからな
る群から選ばれ、前記NTプライマーの可変配列は(N)nTTT、(N)mTNTNG、またはその組み合わせからなる群から選ばれ、ここで、Nは任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで
、各nは独立に3〜17の正整数から、各mは独立に3〜15の正整数から、xおよびyはそれぞれ3〜13の正整数から選ばれ、
前記増幅プライマーは前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まない、
キットも提供する。
もう一つの好適な例において、前記のNGプライマー、NTプライマーおよび増幅プライマーは同様の共通配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の共用配列の長さは20〜35 nt、好ましくは25〜30 ntである。
もう一つの好適な例において、前記NGプライマーおよびNTプライマーの配列は配列番号1〜5から選ばれ、前記増幅プライマーの配列は配列番号6で示される。
もう一つの好適な例において、前記キットは、さらに、シーケンシングに使用される試薬、核酸チップ、免疫蛍光検出試薬、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる1種類または複数種類のほかの検出関連試薬を含む。
もう一つの好適な例において、前記キットは、さらに、溶解液または分解酵素を含む。
もう一つの好適な例において、前記キットは、さらに、ラベルまたは説明書を含み、前記ラベルまたは説明書に明記される前記キットで採取される胚盤胞培養液の量は10〜100
μl、好ましくは15〜80μl、より好ましくは20〜60μlである。
もう一つの側面では、本発明は胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する製品の製造における本発明に係る検出キットの使用も提供する。
以下、図面および具体的な実施形態を合わせて本発明をさらに詳しく説明する。
図1は、本発明の実施例1においてそれぞれ胚盤胞培養液と胚盤胞細胞でAサンプルに対して染色体の検出を行った結果の分析である。 図2は、本発明の実施例1においてそれぞれ胚盤胞培養液と胚盤胞細胞でBサンプルに対して染色体の検出を行った結果の分析である。
本発明者は長期間にわたって幅広く深く研究し、大量の選別およびテストによって、初めて意外に、少量の培養液において胚を培養し、極微量の培養液を取って検出すると、得られる染色体異常の検出結果に極めて高い精確性があることを見出した。これに基づき、本発明者が本発明を完成した。
用語
本発明の検出技術に使用される胚盤胞培養液は細胞のない胚盤胞培養液である。
検出方法
本発明は、胚盤胞を培養した後の欠乏培養液(depleted medium)(すなわち前記培養系から分離される培養液)に対して遺伝子検出を行うことによって、胚の染色体が異常か同定
する方法を提供する。
本発明において、胚盤胞を培養した後の「欠乏」培養液(すなわち前記培養系から分離
される培養液)に対して遺伝子検出を行う方法は特に制限されないが、通常の方法、たと
えば第2世代シーケンシング、核酸チップ、免疫蛍光検出、蛍光PCR検出、第1世代シーケ
ンシング、第3世代シーケンシング、質量分析、またはこれらの組み合わせによって検出
することができる。
一つの実施形態において、前記検出方法は、
(1)胚盤胞培養液の獲得：単精子注射方法によって受精卵を得、それを3日目の卵割球に培養したら新しく調製された胚盤胞培養小滴に移して胚盤胞の培養を行い、この時3日目
に液置換が必要で、目的は脱落した顆粒球および未受精精子の汚染を除去することで、
胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すかガラス化冷凍保存プロセスに入り、残った元の胚盤胞培養液は約1μL〜500μL、好ましくは10μL〜200μLで、すなわ
ち、着床前遺伝学的スクリーニング(PGS)のために収集されたサンプルである工程と、
(2)胚盤胞培養液の採取：工程(1)で得られた元の胚盤胞培養液を溶解液に移し、遠心後、サンプルが次の全ゲノム増幅工程に入る工程と、
(3)胚盤胞培養液における微量DNAの全ゲノム増幅：工程(2)で得られた胚盤胞培養液と
溶解液の混合物に分解酵素を入れ、均一に混合した後インキュベートし、その後分解酵素を不活性化させ、分解物を取ってPCR反応管に入れてPCR反応を行う工程と、
(4)全ゲノム増幅後のDNA産物の分析による胚の染色体の状態の正常かの同定：分析時第2世代シーケンシング、核酸チップまたは免疫蛍光検出を使用する工程と、
を含む。
一つの好適な例において、液置換の2〜3日後、胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すかガラス化冷凍保存プロセスに入り、残った元の胚盤胞培養液は約1μL〜500μL、好ましくは10μL〜200μLで、すなわち、着床前遺伝学的スクリーニング(PGS)の
ために収集されたサンプルである。
［発明の効果］
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明において、胚を少量の培養液において培養し、かつ極微量の培養液を検出
し、得られる染色体異常の検出結果に意外と極めて高い精確性がある。
（2）本発明は単胚培養系を使用し、すなわち、一つの培養小滴において一つだけの胚
を培養し、当該系で得られる染色体異常の検出結果はより精確である。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コール
ド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
特に説明しない限り、本発明の実施例で使用された材料および試薬はいずれも市販品である。
実施例1
A、Bと2つの体外受精の胚サンプルを選択し、それぞれ胚盤胞細胞を検出する方法およ
び胚盤胞培養液を検出する方法でその染色体の状態を評価したが、具体的な工程は下記の通りである。
1．胚盤胞培養液の獲得
1）単精子注射方法によって得られた受精卵を3日目の卵割球に培養したら、新しく調製された胚盤胞培養小滴に移して胚盤胞の培養を行った。
2）胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すかガラス化冷凍保存プロセ
スに入り、残った元の胚盤胞培養液（約30μL）はPGSのために収集されたサンプルAおよ
びサンプルBで、好ましくは液置換の2〜3日後、胚盤胞になった胚を吸い取った。
2．胚盤胞培養液の採取
1）10μLの溶解液(pHが7.2のTris-HCl 40mM、EDTA 1mM、KCl 15mMおよび3％のTriton X-100)を入れた採取管を室温で2min置き、溶解液が解凍した後、サンプル採取管をミニ遠
心機にセットし、分解液が全部管の底に集まるように30s遠心した。
2）工程1のステップ2）における元の胚盤胞培養液をピペットで全部溶解液に移した。
3）マーカーペンで採取管にサンプルの名称を表記し、ミニ遠心機で30s遠心し、サンプルをすぐ次の全ゲノム増幅工程に供したか、あるいは-20℃または-80℃で冷凍保存した。
3．胚盤胞培養液における微量DNAの全ゲノム増幅
1）胚盤胞培養液と溶解液の混合物を室温で溶解させた。
2）管にプロテイナーゼを入れ、上下に吹いて均一に混合した。
3）管を40℃で3hインキュベートした。
4）管を90℃で5min置いて分解酵素を不活性化させた。
5）管から分解産物を取ってPCR反応管に入れた。
6）PCR反応管に増幅混合液(15mM Tris-HCl、15mM (NH4)2SO4、20mM KCl、1mM MgSO4、5％ DMSOおよび2％ Triton X-100)、5％ DMSO、10 mM dNTP、50μM NG (5′-GT GAG TGA TGG TTG AGG TAG TGT GGA GNNNNNGGG-3′)およびNT (5′-GT GAG TGA TGG TTG AGG TAG TGT GGA GNNNNNTTT-3′ )プライマー、100μM増幅プライマー(5′-GT GAG TGA TGG TTGAGG TAG TGT GGA G-3′)、1単位のBstDNAポリメラーゼ、1単位のDeepVentRを入れた。
7）PCR反応管をPCR装置にセットして全ゲノム増幅を行ったが、熱サイクルプログラム
は以下の通りである。
Figure 2021007403
4．増幅後のDNA産物を通常の方法によって第2世代シーケンシングを行うことで胚の染
色体の状態の正常か同定した。
第2世代シーケンシングのデータ結果から、Aサンプルでは、胚盤胞培養液の検出方法（図A1）と胚盤胞細胞の検出方法（図A2）はいずれもいくつかの染色体異常が検出されたが、Bサンプルでは、胚盤胞培養液の検出方法（図B1）と胚盤胞細胞の検出方法（図B2）は
いずれも染色体正常と判定されたことが示された。上記結果から、胚盤胞培養液の検出と胚盤胞細胞の検出の2種類の方法によって胚の染色体の状態を同定したところ、同様の結
果が得られたことが示され、さらに、当該非侵入性の検出方法が正確で、信頼できることが実証された。
実施例2
ランダムに42個の体外培養胚を選択し、それぞれ実施例1における方法に従って胚盤胞
培養液の検出と胚盤胞細胞の検出の2種類の方法の間で比較した。検出結果の相応関係は
、理論上4種類の組み合わせの様態がある。
第1種類．細胞の検出では異常を示し、培養液の検出結果でも異常を示す。
第2種類．細胞の検出では正常を示し、培養液の検出結果でも正常を示す。
第3種類．細胞の検出では正常を示し、培養液の検出結果では異常を示す。
第4種類．細胞の検出では異常を示し、培養液の検出結果では正常を示す。
42個の比較結果では、この4種類の相応関係の例数の分布は表1に示す。
Figure 2021007403
結果から、細胞の検出をゴールドスタンダードとする場合、算出された培養液の検出の感度は88.2％で、特異性は84.0％で、陽性予測値は78.9で、陰性予測値は91.3％であった。各指標はいずれも100％未満であったが、非侵襲的方法で十分にゴールドスタンダード
に近い検出結果を提供したことは、本発明の有益な価値を証明した。
実施例3
8例の異なる原因による妊娠困難の患者の胚に対して本発明の実施例1の方法によって胚培養液の検出を実施し、検出結果から染色体正常の胚を選択して母親の子宮に導入した。
結果は表2に示す。
Figure 2021007403
通常、均衡転座の患者の配偶子(すなわち精子または卵子)のうちの80％が染色体異数体が存在し、自然妊娠の成功率が低い。通常の試験管ベビー方法も染色体異数体が存在する胚を同定することができず、成功率が非常に低い。
本発明の結果から、3番と8番の患者では高品質の受精卵が検出されず、胚の染色体が異常であったことが示されたため、胚の移植が行われなかった。それ以外、ほかの6例の患
者の結果から、本発明の方法で染色体正常の胚を選んで患者の母体に移植して1回で妊娠
に成功し、胚を移植して生存した成功率は5/6（すなわち、83.3％）で、つまり、1例の患者だけ成功しなかったことが示された。
そのため、結果から、本発明の方法で非常に高い妊娠率および胚生存率を得ることができることが示された。
本発明で公開された実施例の上記説明によって、当業者が本発明を実現または使用することができようになり、同時に以上は本発明の好適な実施例だけで、本発明の実施例を制限するものではなく、本発明の実施例の趣旨と原則の範囲内で行われるいずれの変更、同等代替や改良も、本発明の実施例の保護範囲内に含まれる。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
ここで、工程(2)における溶解液の成分は、pHが7.0〜8.0のTris-HCl25〜45mM、EDTA0.5〜3mM、KCl10〜25mMおよび濃度が0.05％〜5％の界面活性剤で、前記界面活性剤はTriton X-100、Triton X-114、ツイン20、NP40およびSDSのうちの1種類または複数種類である。好ましくは、溶解液の成分は、pHが7.2のTris-HCl40mM、EDTA1mM、KCl15mMおよび3％のTriton X-100である。

Claims (20)

  1. 以下の工程(1)-(4)を含む、胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する方法；
    (1)単精子注射方法によって受精卵を取得し、それを3日目の卵割球に培養した後に、新しく調製された胚盤胞培養のための微小滴に移して胚盤胞の培養を行い、その胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すか又はガラス化冷凍保存プロセスに供し、残った元の胚盤胞培養液を検出用サンプルに供する工程、
    (2)工程(1)で得られた胚盤胞培養液を溶解液と混合する工程、
    (3)工程(2)で得られた混合物にタンパク質分解酵素を添加した後にインキュベートし、その後、該分解酵素を不活性化させ、その分解物をPCR反応管に入れてＰＣＲ反応によ
    り全ゲノム増幅反応を行う工程、及び
    (4)工程(3)で得られた増幅ゲノムを、第2世代シーケンシング、核酸チップまたは免
    疫蛍光検出を使用して、胚の染色体異常を検出する工程。
  2. 工程(2)における溶解液の成分が、pHが7.0〜8.0のTris-HCl 25〜45 mM、EDTA 0.5
    〜3mM、KCl 10〜25mMおよび濃度が0.05％〜5％の界面活性剤で、前記界面活性剤は、Triton X-100、Triton X-114、Tween20、NP40およびSDSから選択される1種類または複数種類
    であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  3. 溶解液の成分は、好ましくはpHが7.2のTris-HCl 40 mM、EDTA 1mM、KCl 15mMおよ
    び3％のTriton X-100であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
  4. 工程(3)におけるタンパク質分解酵素は、プロテイナーゼK、QIAGEN Protease、ペ
    プシン、パパイン、トリプターゼおよびリゾチームから選択される1種類または複数種類
    であり、その濃度は1〜25μg/mlであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  5. 前記タンパク質分解酵素の濃度は、20μg/mlであることを特徴とする、請求項4に
    記載の方法。
  6. 工程(3)において、インキュベートは温度30〜60℃で、1分〜12時間行い、不活性化
    は温度75〜95℃で、1〜15分処理することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  7. 工程(3)において、インキュベートは温度40℃で、3時間で行い、不活性化は温度90℃で、5分処理することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  8. 工程(3)において、PCR反応を行う時のPCR反応管に、増幅混合液、0.5％〜20％のPCR阻害物質拮抗剤、5〜20mMのdNTP、5〜100μMのNGおよびNTプライマー、50〜200μMの増
    幅プライマー、0.5〜10単位の核酸ポリメラーゼが含まれ、前記PCR阻害物質拮抗剤は、DMSO、ベタイン、ホルムアミド、グリセリンおよびアルブミンからなる群より選択される1
    種類または複数種類であり、前記核酸ポリメラーゼは、Phi29 DNAポリメラーゼ、Bst DNA
    ポリメラーゼ、Vent ポリメラーゼ、Deep Vent ポリメラーゼ、Klenow Fragment DNAポ
    リメラーゼI、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、Phusion（商標）ハイフィデリティーDNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ、LongAmp Taq DNAポリメラーゼおよびOneTaq DNAポリメラーゼから選択される1種類または複数種類であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  9. 前記増幅混合液の成分は、10〜25mMのTris-HCl、5〜25mMの(NH4)2SO4、5〜30mMのKCl、0.5〜5mMのMgSO4、0.1％〜20％のDMSOおよび0.05〜5％のTriton X-100であることを
    特徴とする、請求項8に記載の方法。
  10. 前記増幅混合液の成分は、15mMのTris-HCl、15mMの(NH4)2SO4、20mMのKCl、1mMのMgSO4、5％のDMSOおよび2％のTriton X-100であることを特徴とする、請求項9に記載の方
    法。
  11. 前記NGおよびNTプライマーは、5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列を含み、ここで、前記共通配列はG、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からな
    り、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含むことで、前記増幅プライマーは前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まないことを特徴とする、請求項8に記載の方法
    。
  12. 前記可変配列は、(N)nGGG、(N)nTTT、(N)mTNTNG、及び(N)xGTGG(N)yからなる群か
    ら選ばれ、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで、nは、3〜17の
    正の整数から、mは、3〜15の正の整数から、xおよびyは、それぞれ3〜13の正の整数から
    選ばれることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
  13. 前記NGおよびNTプライマーは、
    配列番号1[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN]、
    配列番号2[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]、
    配列番号3[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]、
    配列番号4[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG]、又は
    配列番号5[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]の配列を含み、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで、前記増幅プライマーは、5'から3'配列番号6[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]の配列を有することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
  14. 工程（3）における全ゲノム増幅の熱サイクルプログラムは、
    (1)5〜20秒間、90〜98℃の第1の変性温度で反応させ、
    (2)5〜60秒間、5〜15℃の第1のアニーリング温度で反応させ、5〜60 秒間、15〜25℃の第2のアニーリング温度で反応させ、30〜80 秒間、25〜35℃の第3のアニーリング温度
    で反応させ、5〜60秒間、35〜45℃の第4のアニーリング温度で反応させ、5〜60秒間、45
    〜55℃の第5のアニーリング温度で反応させ、
    (3)10〜150分間、55〜80℃の第1の伸長温度で反応させ、
    (4)5〜30秒間、90〜98℃の第2の変性温度で反応させ、
    (5)10〜30秒間、45〜70℃の第6のアニーリング温度で反応させ、
    (6)1〜10分間、60〜80℃の第2の伸長温度で反応させ、
    (7)工程(4)〜(6)を5〜50サイクル繰り返し、
    (8)1〜10分間、60〜80℃の温度で続いて伸長反応させ、
    (9)増幅された産物を0〜5℃で冷蔵保存するものである、
    ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  15. 工程（3）における全ゲノム増幅の熱サイクルプログラムは、
    (1)10秒間、95℃の第1の変性温度で反応させ、
    (2)45秒間、第1のアニーリング温度10℃で反応させ、45秒間、第2のアニーリング温
    度20℃で反応させ、60秒間、第3のアニーリング温度30℃で反応させ、45秒間、第4のアニーリング温度40℃で反応させ、45秒間、第5のアニーリング温度50℃で反応させ、
    (3)90分間、62℃の第1の伸長温度で反応させ、
    (4)20秒間、95℃の第2の変性温度で反応させ、
    (5)第6のアニーリング温度59℃で20秒間反応させ、
    (6)第2の伸長温度72℃で3分間反応させ、
    (7)工程(4)〜(6)を10〜30サイクル繰り返し、
    (8)続いて、5秒間、72℃で伸長反応させ、
    (9)増幅された産物を4℃で冷蔵保存するものである、
    ことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
  16. 工程（3）のＰＣＲ反応で使用されるプライマーは、NGプライマー、NTプライマー
    および増幅プライマーを含み、
    ここで、前記のNGプライマーおよびNTプライマーは、5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列を含み、ここで、前記共通配列は、G、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含むことで、
    前記NGプライマーの可変配列は、(N)nGGG、(N)xGTGG(N)y及びその組み合わせからな
    る群から選ばれ、前記NTプライマーの可変配列は、(N)nTTT、(N)mTNTNG、及びその組み合わせからなる群から選ばれ、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチド
    で、各nは、独立に3〜17の正の整数から、各mは、独立に3〜15の正の整数から、xおよびyは、それぞれ3〜13の正の整数から選ばれ、
    前記増幅プライマーは、前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まない、
    ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  17. 胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する検出キットであって、
    （i）NGプライマー、NTプライマーおよび増幅プライマーを含む、PCR増幅に使用されるプライマーと、
    （ii）任意の胚盤胞培養液とを含み、
    ここで、前記のNGプライマーおよびNTプライマーは、5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列とを含み、ここで、前記共通配列はG、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含み、
    前記NGプライマーの可変配列は、(N)nGGG、(N)xGTGG(N)y、及びその組み合わせから
    なる群から選ばれ、前記NTプライマーの可変配列は、(N)nTTT、(N)mTNTNG、及びその組み合わせからなる群から選ばれ、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチ
    ドで、各nは、独立に3〜17の正の整数から、各mは、独立に3〜15の正の整数から、xおよ
    びyは、それぞれ3〜13の正の整数から選ばれ、
    前記増幅プライマーは、前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まない、
    ことを特徴とするキット。
  18. 前記のNGプライマー、NTプライマーおよび増幅プライマーは、同様の共通配列を有することを特徴とする、請求項17に記載のキット。
  19. 前記の共通配列の長さは、20〜35nt、好ましくは25〜30ntであることを特徴とする、請求項17に記載のキット。
  20. 請求項17に記載の検出キットの使用であって、胚盤胞の培養液を用いて胚の染色体異常を検出する製品の製造に使用されることを特徴とする使用。
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