KR20170108146A - 증진된 항체 효능을 위한 범용 당형태에 관한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 범용 Fc 당형태를 추가로 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

증진된 항체 효능을 위한 범용 당형태에 관한 조성물 및 방법
본 발명은 암, 염증 장애 및 감염성 질환을 포함하는 많은 질환에 대해 지시된 항체의 치료학적 효능을 증진시키기 위해 목적하는 결합/이펙터 활성으로 튜닝된 선택된 범용 Fc 당형태에 관한 것이다. 특히, 상기 선택되고/되거나 지시된 최적화된 범용 Fc 당형태가 생성될 수 있고/있거나 증진된 치료학적 효능을 위한 모노클로날 항체의 디자인 및/또는 생성에 혼입될 수 있다.
항체-기반 치료요법은 염증 장애, 암, 감염성 질환 및 고형 기관 이식 거부를 포함하는 많은 질환에 대해 입증된 효능 기록을 갖는다. 현재, 40개 초과의 치료학적 모노클로날 항체(mAb)는 미국, 유럽 및 다른 여러 국가에서 임상용으로 승인되었다. 이들 대부분은 암 및 면역 질환의 치료요법을 위한 것이다. 항-종양 활성을 갖는 치료학적 항체의 예는 항-CD20, 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD40, 항-CTLA-4, 및 항-PD-1 항체를 포함한다.
대다수의 승인된 생물약제는 목적하는 당화 패턴을 갖는 단백질을 전달하기 위해 포유동물 세포 배양 시스템에서 제조되고 따라서 감소된 면역원성 및 보다 높은 생체내 효능 및 안전성을 보장한다. 비-인간 포유동물 발현 시스템, 예를 들어, CHO 또는 NSO 세포는 복합 인간형 글리칸을 부가하기 위해 요구되는 기구를 갖는다. 그러나, 이들 시스템에서 제조된 글리칸은 인간에서 제조된 글리칸과는 상이할 수 있다. 이들의 당화 기구는 흔히 목적하지 않은 탄수화물 결정인자를 부가하여 단백질 폴딩을 변형시키고 면역원성을 유도하고 약물 순환 수명을 감소시킬 수 있다.
추가로, 포유동물 세포 배양물은 모두 동일한 성질을 갖지 않는 당화 패턴의 이종성 혼합물을 전달한다. 치료학적 단백질의 안전성, 효능성 및 혈청 수명과 같은 성질은 이들 당화 패턴에 의해 영향을 받을 수 있다. 포유동물 세포 배양 시스템은 모두 동일한 성질을 갖지 않는 당화 패턴의 이종성 혼합물을 전달한다.
요약
Fc 당화는 치료학적 모노클로날 항체 분야에서 중요한 대상이었다. Fc 당화는 Fc 수용체 결합 및 보체 활성화와 같은 Fc 이펙터 기능을 상당히 변형시킬 수 있고 따라서 치료학적 항체의 생체내 안전성 및 효능 프로파일에 영향을 줄 수 있다. 항체 내 Fc 당화에서의 다양성은 Fc 이펙터 기능에서의 다양성에 상응한다. 따라서, Fc 글리칸에서 상기 이질성은 이것이 IgG 분자의 Fc 수용체로의 결합에 영향을 주고 항체 이펙터 기능에 영향을 미침에 따라 환자에서 목적하지 않은 효과를 유발하여 안전성 문제를 고려하게 하는 기능성 결과를 초래한다.
염증 장애, 암 및 감염성 질환을 포함하는 많은 질환에 대해 개선된 모노클로날 항체 치료요법이 필요하다. Fc에서 일부 특이적 당형태는 항체-의존성 세포성 세포 독성 (ADCC)와 같은 개선된 이펙터 기능을 갖는 목적하는 생물학적 기능을 부여할 수 있다. 따라서, 최적화된 Fc 당형태를 갖는 치료학적 항체를 제조하는 것이 유용하다.
따라서, 본 발명은 암, 염증 장애 및 감염성 질환을 포함하는 많은 질환에 대한 치료학적 항체의 효능을 증진시키기 위해 목적하는 결합/이펙터 활성으로 튜닝된, 선택된 범용 Fc 당형태를 제공한다. 선택되고/되거나 지시된 최적화된 범용 Fc 당형태가 적용될 수 있고/있거나 증진된 치료학적 효능을 위해 모노클로날 항체 (바람직하게, 치료학적 모노클로날 항체)의 디자인 및/또는 제조에 혼입될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 모노클로날 항체에서 결합/이펙터 활성을 증진시키기 위한 Fc 당형태를 제공하고, 여기서, 상기 항체는 하기 식을 갖는 당형태를 포함한다:
Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2
Figure pct00001
일부 양태에서, 본 발명은 도 1의 당형태 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 감염성 과증식성 질환 및/또는 병태를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 갖는 당형태를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 항체는 하기의 서열을 포함하는 마우스 키메라 인간화되고/되거나 인간 MC41 항체이다.
[표 1-1]
항-SSEA-4 쥐, MC41의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
[표 1-2]
2번째 인간화된 모노클노날 항체, hMC41의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 1-3]
3번째 인간화된 모노클로날 항체, hMC41의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00006
Figure pct00007
하나의 양상에서, 본 발명은 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 단편은 모노클로날 항체에서 결합/이펙터 활성을 증진시키기 위한 Fc 당형태를 포함하고, 상기 항체는 하기 식을 갖는 당형태를 포함한다.
Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2
Figure pct00008
하나의 양태에서, 상기 항체는 IgG1이고 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→로의 결합은 특이적 결합이다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 서열번호 147 또는 서열번호 137을 갖는 VH 및 서열번호 148 또는 서열번호 138을 갖는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 152 (GFSLTSYG)로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열번호 153 (IWGEGST)로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열번호 154 (AMTGTAY)로부터 선택된 H-CDR3으로부터 선택된 각각의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고;
(iv) 서열번호 149 (SSVSY)로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열번호 150 (DTS)으로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열번호 151 (HQWSSSPHT)로부터 선택된 L-CDR3으로부터 선택된 각각의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 159 (QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS)로부터 선택된 H-FR1;
(ii) 서열번호 160 (VSWIRQPPGKGLE WTGV)으로부터 선택된 H-FR2;
(iii) 서열번호 161 (NYHSVLISRLTISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYC)로부터 선택된 H-FR3;
(iv) 서열번호 162 (WGQGTLVTVSS)로부터 선택된 H-FR4로부터 선택된 각각의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 HFR4를 포함하고;
(v) 서열번호 155 (QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS)로부터 선택된 L-FR1;
(vi) 서열번호 156 (MHWYQQKSGTSPKRWIY)으로부터 선택된 L-FR2;
(vii) 서열번호 157 (KLSSGVPGRFSGSGSGTSYSLTISRLEAEDAATYYC)로부터 선택된 L-FR3;
(viii) 서열번호 158 (FGGGTKVEIKR)로부터 선택된 L-FR4로부터 선택된 각각의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 인간 항체이다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 인간화된 항체이다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 서열번호 200, 서열번호 210 또는 서열번호 137을 갖는 VH 및 서열번호 201, 서열번호 211 또는 서열번호 221을 갖는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 207, 서열번호 217, 서열번호 227로부터 선택된 H-CDR1,
(ii) 서열번호 208, 서열번호 218, 서열번호 228로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열번호 209, 서열번호 219, 서열번호 229로부터 선택된 H-CDR3으로부터 선택된 각각의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고;
(iv) 서열번호 204, 서열번호 214 및 서열번호 224로부터 선택된 L-CDR1,
(v) 서열번호 205, 서열번호 215 및 서열번호 225로부터 선택된 L-CDR2,
(vi) 서열번호 206, 서열번호 216 및 서열번호 226으로부터 선택된 L-CDR3으로부터 선택된 각각의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함한다.
하나의 양태에서, 제9항의 항체는 인간 항체이다.
하나의 양태에서, 제9항의 항체는 인간화된 항체이다.
하나의 양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv 단편이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 제6항, 제7항, 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 과증식성 질환에 대한 치료에 유용하다.
하나의 양상에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은 제13항의 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하고 이로써 상기 투여된 항체는 상기 대상체에서 ADCC 활성을 증진시킨다.
하나의 양태에서, 암에 대한 치료 방법은 뇌암, 폐암, 유방암, 경구암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 골암, 피부암, 자궁암, 난소암 및 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 다른 화학치료학적 제제와 함께 조합된 약제학적 제형을 투여함을 임의로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한,
(a) 모노클로날 항체를 α-푸코시다제 및 적어도 하나의 엔도글리코시다제와 접촉시키는 단계;
(b) 단일 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화된 항체를 제조하는 단계; 및
(c) 항체의 Fc 영역의 GlcNAc에 범용 글리칸을 첨가하여 상기 당형태를 갖는 동종성 항체를 형성하는 단계를 포함하는, 동종성 항체 집단을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 상기 항체 또는 이의 결합 단편은 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 하나의 다른 양상은 MC48의 변형을 기준으로 인간화된 당항체를 제공한다. 이의 예 및 이들의 아미노산 및 핵산 구조/서열은 하기에 제공된다.
[표 17-0]
마우스 모노클로날 항체 MC48의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
[표 17-1]
인간화된 모노클로날 항체 MC48 (제1)의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00011
Figure pct00012
[표 17-2]
인간화된 모노클로날 항체 MC48 (제2)의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00013
Figure pct00014
[표 17-3]
인간화된 모노클로날 항체 MC48 (제3)의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00015
[표 17-4]
인간화된 모노클로날 항체 MC48 (제4)의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
EA4에 특이적 항체 및 이의 단편
본 발명의 하나의 양상은 SSEA-4 및 이의 단편에 결합하는 새로운 항체를 특징으로 한다. 상기 항-SSEA-4 항체는 Neu5Acα2→ 3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4 헥사사카라이드) 및 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1(SSEA-4 헥사사카라이드의 단편)에 결합한다. 일부 예에서, 상기 항체는 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 상기 항체는 Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→ 3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4 헥사사카라이드의 유사체)에 결합할 수 있다.
일부 예에서, 상기 방법은 ADCC를 증진시킨다.
하나의 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 알파-2,6-연결에서 시알산으로 종결된 범용 바이안테나 n-글리칸을 갖는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하고/하거나 이의 위험을 감소시키기 위한 방법을 제공한다.
상기 치료는 종양 크기의 감소, 악성 세포의 제거, 전이의 예방, 재발의 예방, 파종된 암의 감소 또는 사멸, 생존 기간 연장 및/또는 종양 암 진행으로의 시간의 지연을 유발한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물은 주사가능한 것으로 제형화된다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 피하내로 투여된다.
본 발명의 특정 양태의 세부사항은 본원에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명, 도면, 실시예 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
도 1. 치료학적 항체의 최적화된 범용 Fc 글리칸의 구조.
도 2. 이의 치료학적 활성의 개선을 위한 Fc 영역에서 최적화된 범용 글리칸을 갖는 동종성 항체의 제조를 위한 일반 전략.
도 3은 항-인플루엔자 바이러스 항체의 개선된 항-바이러스 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 결과를 입증한다.
도 4. 리툭시맙과 비교하여 항-CD20 GAb의 예시적 증진된 ADCC 활성을 열거하는 표.
도 5. 6개의 항-CD20 GAb
도 6a 및 6b. 도 6a는 표의 상부이고, 도 6b는 표의 하부이다. 표는 항-CD20 GAb 및 리툭시맙의 예시적 FcγRIIIA 결합을 열거한다. FcγRIIIA 결합은 당업계에서 공지된 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적 검정은 실시예에 기재되어 있다. 상기 Fc 수용체 결합은 항-CD20 GAb 대 리툭시맙의 상대적 비율로서 결정될 수 있다. 예시적 양태에서 Fc 수용체 결합은 적어도 1.2-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배 또는 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 또는 100-배 이상까지 증가된다.
도 7. CD20을 갖는 상이한 세포와 상이한 동종성 항체의 결합 활성. 도 7은 라모스(Ramos) 세포에 대한 리툭산-SCT (Gab101) 및 리툭산 모노-GlcNAc의 CDC 효과를 보여준다.
도 8. CD20을 갖는 상이한 세포와 상이한 동종성 항체의 결합 활성. 도 8은 라지(Raji) 세포에 대한 리툭산-SCT (Gab101) 및 리툭산 모노-GlcNAc의 CDC 효과를 보여준다.
도 9. CD20을 갖는 상이한 세포와 상이한 동종성 항체의 결합 활성. 도 9는 SU-DHL-4 세포에 대한 리툭산-SCT (Gab101) 및 리툭산 모노-GlcNAc의 CDC 효과를 보여준다.
도 10. FACS 상에서 분석된 바와 같은 인간 SU-DHL-4 B 세포의 고갈. 세포는 15 % 자가 혈장의 존재 또는 부재하에 상이한 농도에서 항-CD20 Gab 리툭산-SCT, 리툭산-GlcNAc 및 리툭시맙과 배양하였다. 세척 후, 세포는 항-CD2-PE 및 항-CD 19-FITC로 염색시켰다. B 세포 고갈은 CD19+ CD2-B 세포를 기준으로 FACS 상에서 분석하였다 (도 13).
도 11. FACS 상에서 분석된 바와 같은 인간 라모스 B 세포의 고갈. 세포는 15 % 자가 혈장의 부재 또는 존재하에 상이한 농도에서 항-CD20 Gab 리툭산-SCT, 리툭산-GlcNAc 및 리툭시맙과 배양하였다. 세척 후, 세포는 항-CD2-PE 및 항-CD 19-FITC로 염색시켰다. B 세포 고갈은 CD 19+ CD2-B 세포를 기준으로 FACS 상에서 분석하였다 (도 13).
도 12. FACS 상에서 분석된 바와 같은 인간 라지 B 세포의 고갈. 세포는 15 % 자가 혈장의 부재 또는 존재하에 상이한 농도에서 항-CD20 Gab 리툭산-SCT, 리툭산-GlcNAc 및 리툭시맙과 배양하였다. 세척 후, 세포는 항-CD2-PE 및 항-CD 19-FITC로 염색하였다. B 세포 고갈은 CD 19+ CD2-B 세포를 기준으로 FACS 상에서 분석하였다 (도 13).
도 13. 상이한 동종성 항체에 의한 인간 B 세포의 고갈.
도 14. 트라스투주맙과 비교하여 항-HER2 GAb의 예시적 증진된 ADCC 활성을 열거하는 표.
도 15. 항-HER2 GAb 및 리툭시맙의 예시적 FcγRIIIA 결합을 열거하는 표.
도 16. 인간화된 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위한 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4.
도 16b. 인간화된 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위한 고체 기반 ELISA 코팅 BSA.
도 17a. 온전한 인간화된 MC41 IgG에 의한 결합 활성을 평가하기 위해, 제1, 제2, 제3 인간화된 MC41, 및 키메라 MC41 (chMC41)의 온전한 IgG를 작제한다. ELISA 결과는 인간화된 제2 및 제3 MC41은 용량 의존적 방식으로 BSA가 아니라 (도 17b) SSEA-4에 반응할 수 있음(도 17a)을 보여주고, 동일한 결과는 chMC41에 대해 관찰되었다.
도 17b. 온전한 인간화된 MC41 IgG에 의한 결합 활성을 평가하기 위해, 제1, 제2 및 제3 인간화된 MC41 및 키메라 MC41(chMC41)의 온전한 IgG를 작제한다. ELISA 결과는 상기 인간화된 제2 및 제3 MC41이 용량 의존적 방식으로 BSA가 아니라 (도 17b) SSEA-4에 반응할 수 있음(도 17a)을 보여주고, 동일한 결과는 chMC41에 대해 관찰되었다.
도 18a 및 도 18b. 도 18a는 도 18b의 막대 그래프에 대한 범례를 보여준다. chMC41 및 hMC41의 결합 특이성을 결정하기 위해, 글리칸 어레이를 수행한다. 결과는 도 18b에 나타낸다. 키메라 및 인간화된 MC41은 상업적 SSEA4 항체 (MC813) 보다 특이적 결합을 보여준다. 이들은 SSEA4 또는 글리콜릴 변형된 SSEA4만을 인지하였다.
도 19a 및 19b. 도 19a는 도 19b의 막대 그래프에 대한 범례를 보여준다. chMC41 및 hMC41의 결합 특이성을 결정하기 위해, 글리칸 어레이를 수행한다. 결과는 도 19b에 나타낸다. 키메라 및 인간화된 MC41은 상업적 SSEA4 항체 (MC813) 보다 특이적 결합을 보여준다. 이들은 SSEA4 또는 글리콜릴 변형된 SSEA4만을 인지하였다.
도 20a. chMC41 및 hMC41의 이펙터 기능을 조사하기 위해, ADCC 및 CDC 검정을 수행하였다. HPAC 췌장 암 세포주를 사용하여 chMC41, hMC41, 양성 대조군 MC813 또는 음성 대조군 NHIgG 및 NMIgG의 ADCC 및 CDC 활성을 평가하였다.
도 20b. chMC41 및 hMC41의 이펙터 기능을 조사하기 위해, ADCC 및 CDC 검정을 수행하였다. HPAC 췌장 암 세포주를 사용하여 chMC41, hMC41, 양성 대조군 MC813 또는 음성 대조군 NHIgG 및 NMIgG의 ADCC 및 CDC 활성을 평가하였다.
도 21a 및 도 21b. chMC41 및 hMC41의 이펙터 기능을 조사하기 위해, ADCC 및 CDC 검정을 수행하였다. HPAC 췌장 암 세포주를 사용하여 chMC41, hMC41, 양성 대조군 MC813 또는 음성 대조군 NHIgG 및 NMIgG의 ADCC 및 CDC 활성을 평가하였다. 도 21a는 ADCC를 통한 암 세포 사멸 활성을 보여준다. 도 21b는 CDC를 통한 암 세포 사멸 활성을 보여준다.
도 22a. SSEA-4에 결합하는 항체를 동정하기 위해, 본원 발명자는 2 x 1010 구성원을 함유하는 파아지-디스플레이된 인간 순수 scFv 라이브러리를 사용하였고 이는 본원 발명자의 이전의 보고에 기재된 바와 같이 확립하였다 (문헌참조: Lu et al., 2011). 상기 라이브러리는 먼저 디나비드 (Dynabeads)-결합 파아지에 의해 제거하고 이어서 SSEA-4-결합 파아지는 SSEA-4-PEG-접합된 디나비드에 의해 선택하였다. 본원 발명자는 바이오패닝 동안에 2개의 완충 시스템인 PBS 및 0.01 % Tween20 (PBSTO.Ol)을 함유하는 PBS를 사용하였다. 친화성 선택의 5회 라운드 후, 제5 라운드의 파아지 회수는 각각 PBS 및 PBSTO.O1 시스템에서 제1 라운드의 회수와 비교하여 약 55-배 및 80-배까지 증가하였다.
도 22b. SSEA-4에 결합하는 항체를 동정하기 위해, 본원 발명자는 2 x 1010 구성원을 함유하는 파아지-디스플레이된 인간 순수 scFv 라이브러리를 사용하였고 이는 본원 발명자의 이전의 보고에 기재된 바와 같이 확립하였다 (문헌참조: Lu et al., 2011). 상기 라이브러리는 먼저 디나비드-결합 파아지에 의해 제거하고 이어서 SSEA-4-결합 파아지는 SSEA-4-PEG-접합된 디나비드에 의해 선택하였다. 본원 발명자는 바이오패닝 동안에 2개의 완충 시스템인 PBS 및 0.01 % Tween20 (PBSTO.Ol)을 함유하는 PBS를 사용하였다. 친화성 선택의 5회 라운드 후, 제5 라운드의 파아지 회수는 각각 PBS 및 PBSTO.O1 시스템에서 제1 라운드의 회수와 비교하여 약 55-배 및 80-배까지 증가하였다.
도 23a. 파아지 클론은 무작위로 선택하고 ELISA에 의해 SSEA-4 결합에 대해 시험하였다.
도 23b. 파아지 클론은 무작위로 선택하고 ELISA에 의해 SSEA-4 결합에 대해 시험하였다.
도 23c. 파아지 클론은 무작위로 선택하고 ELISA에 의해 SSEA-4 결합에 대해 시험하였다.
도 23d. 파아지 클론은 무작위로 선택하고 ELISA에 의해 SSEA-4 결합에 대해 시험하였다.
도 24. 2개의 파아지 클론의 특이성 및 결합 친화성을 조사하기 위해, 본원 발명자는 SSEA-4-BSA, 글로보 H-BSA 및 SSEA-3-BSA를 포함하는 글로보-계열 글리칸과 동일한 파아지 역가를 사용하는 비교 ELISA를 수행하였다.
도 25a. SSEA-4에 대해 완전한 인간 항체 (hAb)를 확립하기 위해, 본원 발명자는 p2-78 scFv의 VH 및 VL 암호화 서열을 각각 인간 IgG1 골격으로 분자적으로 가공하였다. 항-SSEA-4 p2-78 hAb는 프리스타일(FreeStyle) 293 발현 시스템을 사용하여 제조하고 이어서 단백질 G 세파로스 칼럼을 통해 정제하였다. 본원 발명자는 쿠마시(coomassie) 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석에 의해 항체의 순도를 조사하였다.
도 25b. 글로보-계열 글리칸에 대한 p2-78 hAb의 결합 활성을 조사하기 위한 ELISA.
도 26a. 상업적으로 가용한 IgM 항체인 MC631의 양성 대조군. p2-78 hAb의 특이성을 추가로 확인하기 위한 203개의 상이한 글리칸을 함유하는 글리칸 어레이.
도 26b. p2-78 hAb에 의해 인지되는 글리칸.
도 26c. p2-78 hAb의 특이성을 추가로 확인하기 위한 203개의 상이한 글리칸을 함유하는 글리칸 어레이.
도 27a. NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이터베이스와 함께 MC48 및 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 제1, 제2, 제3 및 제4 인간화된 MC48 서열 및 제1, 제2 및 제3 인간화된 MC41 서열을 제조하였다. 본원 발명자는 이어서 이들 인간화된 MC48 및 MC41 서열에 따라 파아지-디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 제조하였다. 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다. 본원 발명자는 제3 및 제4 인간화된 MC48, 및 제2 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파이지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면, 제1 및 제2 인간화된 MC48 및 제1 MC41 scFv는 SSEA-4에 대한 결합 활성을 상실하였음을 발견하였다. 상기 데이터는 쥐 mAb MC48 또는 MC41의 친화성과 비교하여 제4 인간화된 MC48 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파아지 클론의 결합 친화성이 유지되었음을 보여주었다.
도 27b. NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이터베이스와 함께 MC48 및 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 제1, 제2, 제3 및 제4 인간화된 MC48 서열 및 제1, 제2 및 제3 인간화된 MC41 서열을 제조하였다. 본원 발명자는 이어서 이들 인간화된 MC48 및 MC41 서열에 따라 파아지-디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 제조하였다. 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다. 본원 발명자는 제3 및 제4 인간화된 MC48, 및 제2 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파이지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면, 제1 및 제2 인간화된 MC48 및 제1 MC41 scFv는 SSEA-4에 대한 결합 활성을 상실하였음을 발견하였다. 상기 데이터는 쥐 mAb MC48 또는 MC41의 결합 친화성과 비교하여 제4 인간화된 MC48 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파아지 클론의 결합 친화성이 유지되었음을 보여주었다.
도 28a. NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이터베이스와 함께 MC48 및 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 제1, 제2, 제3 및 제4 인간화된 MC48 서열 및 제1, 제2 및 제3 인간화된 MC41 서열을 제조하였다. 본원 발명자는 이어서 이들 인간화된 MC48 및 MC41 서열에 따라 파아지-디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 제조하였다. 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다. 본원 발명자는 제3 및 제4 인간화된 MC48, 및 제2 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파이지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면, 제1 및 제2 인간화된 MC48 및 제1 MC41 scFv는 SSEA-4에 대한 결합 활성을 상실하였음을 발견하였다. 상기 데이터는 쥐 mAb MC48 또는 MC41의 결합 친화성과 비교하여 제4 인간화된 MC48 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파아지 클론의 결합 친화성이 유지되었음을 보여주었다.
도 28b. NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이터베이스와 함께 MC48 및 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 제1, 제2, 제3 및 제4 인간화된 MC48 서열 및 제1, 제2 및 제3 인간화된 MC41 서열을 제조하였다. 본원 발명자는 이어서 이들 인간화된 MC48 및 MC41 서열에 따라 파아지-디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 제조하였다. 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다. 본원 발명자는 제3 및 제4 인간화된 MC48, 및 제2 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파이지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면, 제1 및 제2 인간화된 MC48 및 제1 MC41 scFv는 SSEA-4에 대한 결합 활성을 상실하였음을 발견하였다. 상기 데이터는 쥐 mAb MC48 또는 MC41의 결합 친화성과 비교하여 제4 인간화된 MC48 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파아지 클론의 결합 친화성이 유지되었음을 보여주었다.
도 29a 및 도 29b. NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이터베이스와 함께 MC48 및 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 제1, 제2, 제3 및 제4 인간화된 MC48 서열 및 제1, 제2 및 제3 인간화된 MC41 서열을 제조하였다. 본원 발명자는 이어서 이들 인간화된 MC48 및 MC41 서열에 따라 파아지-디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 제조하였다. 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다. 본원 발명자는 제3 및 제4 인간화된 MC48, 및 제2 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파이지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면, 제1 및 제2 인간화된 MC48 및 제1 MC41 scFv는 SSEA-4에 대한 결합 활성을 상실하였음을 발견하였다. 상기 데이터는 쥐 mAb MC48 또는 MC41의 결합 친화성과 비교하여 제4 인간화된 MC48 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파아지 클론의 결합 친화성이 유지되었음을 보여주었다.
도 29b. NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이터베이스와 함께 MC48 및 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 제1, 제2, 제3 및 제4 인간화된 MC48 서열 및 제1, 제2 및 제3 인간화된 MC41 서열을 제조하였다. 본원 발명자는 이어서 이들 인간화된 MC48 및 MC41 서열에 따라 파아지-디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 제조하였다. 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다. 본원 발명자는 제3 및 제4 인간화된 MC48, 및 제2 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파이지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면, 제1 및 제2 인간화된 MC48 및 제1 MC41 scFv는 SSEA-4에 대한 결합 활성을 상실하였음을 발견하였다. 상기 데이터는 쥐 mAb MC48 또는 MC41의 결합 친화성과 비교하여 제4 인간화된 MC48 및 제3 인간화된 MC41 scFv 파아지 클론의 결합 친화성이 유지되었음을 보여주었다.
도 30a 및 30b. 온전한 인간화된 MC41 IgG에 의한 결합 활성을 평가하기 위해, 본원 발명자는 제1, 제2, 제3 인간화된 MC41 및 키메라 MC41 (chMC41)의 온전한 IgG를 작제하였다. ELISA 결과는 상기 인간화된 제2 및 제3 MC41이 용량 의존적 방식으로 BSA에 반응하지 않지만 (도 30b) SSEA-4에 반응할 수 있음(도 30a)을 보여주었고, 동일한 결과는 chMC41에 대해 관찰되었다.
도 31a 및 도 31b. chMC41 및 hMC41의 결합 특이성을 결정하기 위해, 글리칸 어레이를 수행하였다. 상기 키메라 및 인간화된 MC41은 상업적 SSEA4 항체 (MC813) 보다 더 특이적 결합을 보여주었다. 이들은 SSEA4 또는 글리콜릴 변형된 SSEA4만을 인지하였다. 도 31a는 인지된 글리칸을 보여주고 도 31b는 상기 어레이 결과를 보여준다.
도 32a 및 도 32b. chMC41 및 hMC41의 결합 특이성을 결정하기 위해, 글리칸 어레이를 수행하였다. 키메라 및 인간화된 MC41은 상업적 SSEA4 항체 (MC813) 보다 더 특이적 결합을 보여주었다. 이들은 SSEA4 또는 글리콜릴 변형된 SSEA4만을 인지하였다. 도 32a는 인지된 글리칸을 보여주고 도 32b는 어레이 결과를 보여준다.
도 33a 및 도 33b. hMC48, chMC41 및 hMC41의 이펙터 기능을 조사하기 위해, ADCC 및 CDC 검정을 수행하였다. HPAC, BxPC3 및 PL45 췌장 암 세포주를 사용하여 hMC48 또는 NHIgG에 대해 10 ㎍/ml의 농도에서 ADCC 및 CDC 활성을 평가하였다.
도 34a. HPAC 세포는 chMC41, hMC41, 양성 대조군 MC813 또는 음성 대조군 NHIgG로 처리하였다.
도 34b. HPAC 세포는 chMC41, hMC41, 양성 대조군 MC813 또는 음성 대조군 NHIgG로 처리하였다.
도 35a 및 35b. 상기 데이터는 hMC41 및 chMC41의 이펙터 기능이 hMC48의 것 보다 우수함을 보여주었다. 흥미롭게도, 상기 인간화된 MC41은 이의 본래의 활성을 유지할 뿐만 아니라 또한 ADCC 및 CDC를 통해 MC813 보다 강한 암 세포 사멸 활성을 보여주었다.
도 36. hMC41 및 hMC48의 SSEA-4로의 결합 활성은 ELISA에 의해 조사하였다. 상기 결과는 hMC41의 SSEA-4로의 결합이 hMC48 보다 훨씬 우수함을 보여주었다. 상기 인간화된 MC41은 hMC48과 비교하여 보다 높은 결합 최대값 및 보다 작은 Kd (hMC41 및 hMC48 각각에 대해 0.2 μg/ml 및 4.6 μg/ml) 값을 갖는다.
화학적 정의
특정 기능성 그룹 및 화학적 용어의 정의는 하기에서 보다 상세하게 기재된다. 화학적 원소는 원소주기율표, CAS 버젼에 따라 동정되고 (Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed., inside cover) 특이적 기능성 그룹은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가로, 유기 화학의 일반 원리, 및 특정 기능성 잔기 및 반응성은 문헌 [참조: Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; and Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있다. 더욱이, 예시적 글리칸 및 항체 방법은 문헌 [참조: Wong et al, US20100136042, US20090317837, 및 US20140051127]에 기재되어 있고 이의 각각의 기술 내용은 본원에 참조로 인용된다.
본원에 기재된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고 따라 다양한 이소형, 예를 들어, 에난티오머 및/또는 부분입체이성체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 화합물은 개별 에난티오머, 부분입체이성체 또는 기하학적 이성체 형태로 존재할 수 있거나 라세믹 혼합물 및 하나 이상의 입체이성체가 풍부한 혼합물을 포함하는 입체이성체의 혼합물 형태로 존재할 수 있다. 이성체는 키랄 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 키랄 염의 형성 및 결정화를 포함하는 당업자에게 공지된 방법에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있거나; 바람직한 이성체는 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); and Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)]을 참조한다. 본 발명은 추가로 다른 이성체가 실질적으로 없는 개별 이성체로서 및 대안적으로 다양한 이성체의 혼합물로서 본원에 기재된 화합물을 포함한다.
값의 범위가 열거되는 경우, 범위내 각각의 값 및 서브-범위를 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들어 "C1-6"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, Cl-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, 및 C 5-6을 포괄하는 것으로 의도된다.
본 발명의 수행은, 달리 지적되지 않는 경우, 당해 기술분야에 있는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 상기 기술은 문헌에 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); and Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "글리칸"은 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 언급한다. 글리칸은 또한 당단백질, 당지질, 글리코펩타이드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 또는 프로테오글리칸과 같은 당접합체의 탄수화물 부분을 언급하기 위해 사용된다. 글리칸은 일반적으로 모노사카라이드 간의 O-글리코시드 연결로만 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-연결된 D-글루코스로 구성되는 글리칸 (또는 보다 구체적으로 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 모노사카라이드 잔기의 동종 또는 이종중합체일 수 있고 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착됨을 발견할 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-연결된 글리칸은 진핵세포에서 매우 통상적인 것이지만 또한 흔하지는 않지만 원핵세포에서 발견될 수 있다. N-연결된 글리칸은 세쿠온 (sequon)에서 아스파라긴의 R-그룹 질소 (N)에 부착되는 것으로 밝혀졌다. 상기 세쿠온은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이고, 여기서, X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유동 세포측정" 또는 "FACS"는 광학적 및 전기 검출 장치를 통해 유체 스트림 중에 현탁된 입자 또는 세포의 물리적 및 화학적 성질을 조사하기 위한 기술을 의미한다.
비천연적으로 발생하거나 "단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 항체이다. 이의 천연 환경의 오염 성분들은 항체에 대한 연구, 진단학적 또는 치료학적 사용을 방해하고 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있는 물질이다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 방법에 의한 측정시 98 중량% 초과의 항체 및 일부 양태에서 99 중량% 초과, (2) 예를 들어, 회전 컵 분리기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 또는 (3) 예를 들어, 코마시 블루 또는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 균질물로 정제된다. 딘리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포내 동일계 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
상기 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CHI)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CHI 도메인의 카복시 말단에서 여러 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본원에 Fab'로 칭하고 여기서, 상기 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)은 유리 티올 그룹을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 본래에 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 제조된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종 기원의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 2개의 명백하게 구분되는 유형, 소위 카파 (κ) 및 람다 (λ) 중 하나로 할당될 수 있다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존하여, 항체 (면역글로불린)는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 5개의 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 여러개는 추가로 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, 및 IgA2로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불리운다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있고 일반적으로 예를 들어, 문헌 [참조: Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기재되어 있다. 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 항체의 공유 또는 비-공유 연합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부만을 포함하고, 여기서, 상기 일부는 온전한 항체로 존재하는 경우 상기 일부와 정상적으로 연합된 기능 중 적어도 하나 및 대부분의 많은 또는 모든 기능을 보유한다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하고 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 양태에서, 항체 단편, 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 단편은 온전한 항체에 존재하는 경우 Fc 영역과 정상적으로 연합된 생물학적 기능, 예를 들어, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나를 보유한다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 온전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 아미노산 서열과 관련된 동일성 또는 상동성은 필요한 경우 서열을 정렬하고, 최대 % 상동성을 성취하기 위해 및 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하는 것 없이 갭을 도입한 후 특정 잔기와 동일한 후보 서열 중 아미노산 잔기의 %로서 본원에 정의된다. 특정 서열로의 N-말단, C-말단 또는 내부 연결, 결실 또는 삽입의 어떠한 것도 상동성에 영향을 주는 것으로서 해석되지 않는다. 본 발명에서 요구되는 모든 서열 정렬은 상기 최대 상동성 정렬이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 단편과 목적하는 핵산 서열 간의 핵산 서열 상동성은 적어도 80 % >이고, 보다 전형적으로 바람직하게 증가하는 적어도 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 및/또는 100 %의 상동성을 갖는다. 2개의 아미노산 서열은 이들의 서열 간에 부분적 또는 완전한 동일성이 있는 경우 상동성이다.
용어 "글로보계열-관련된 장애"는 전형적으로 경로의 비정상적 기능 또는 제공을 특징으로 하거나 이에 기여하는 장애를 언급하거나 이를 기재한다. 상기 장애의 예는 암을 포함하는 과증식성 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 천연 과정을 변화시키는 시도에서의 임상적 중재를 언급하고 임상적 병리의 예방을 위해 또는 이러한 과정 동안에 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 존재 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적이거나 간접적인 병리학적 결과의 감소, 염증 및/또는 조직/기관 손상의 예방 또는 감소, 질환 진행율의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질환 또는 장애의 발달을 지연시킨다.
본 발명의 수행은, 달리 지적되지 않는 경우, 당해 기술분야에 있는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 상기 기술은 문헌에 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); and Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "글리칸"은 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 언급한다. 글리칸은 또한 당단백질, 당지질, 글리코펩타이드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 또는 프로테오글리칸과 같은 당접합체의 탄수화물 부분을 언급하기 위해 사용된다. 글리칸은 일반적으로 모노사카라이드 간의 O-글리코시드 연결로만 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-연결된 D-글루코스로 구성되는 글리칸 (또는 보다 구체적으로 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 모노사카라이드 잔기의 동종 또는 이종중합체일 수 있고 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착된 것 일 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-연결된 글리칸은 진핵세포에서 매우 통상적인 것이지만 또한 흔하지는 않지만 원핵세포에서 발견될 수 있다. N-연결된 글리칸은 세쿠온에서 아스파라긴의 R-그룹 질소 (N)에 부착되는 것으로 밝혀졌다. 상기 세쿠온은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이고, 여기서, X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 물질로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원성"은 면역 반응을 자극하는 면역원, 항원 또는 백신의 능력을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CD1d"는 다양한 인간 항원-제공 세포의 표면 상에서 발현되는 당단백질의 CD1 (분화 1의 클러스터) 계열의 구성원을 언급한다. CD1d 제공된 지질 항원은 천연 킬러 T 세포를 활성화시킨다. CD1d는 깊은 항원-결합 그루브를 갖고 여기에 당지질 항원이 결합되어 있다. 수지상 세포 상에서 발현된 CD1d 분자는 C34와 같은 알파-GalCer 유사체를 포함하는 당지질에 결합하고 제공할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "백신"은 전체 질환-유발 유기체 (사멸되거나 약화된) 또는 유기체가 유발하는 질환에 대해 면역력을 부여하기 위해 사용되는 상기 유기체의 성분들, 예를 들어, 단백질, 펩타이드 또는 폴리사카라이드로 이루어진 항원을 함유하는 제제를 언급한다. 백신 제제는 천연 기원이거나 합성이거나 재조합 DNA 기술에 의해 유도된 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원 특이적"은 특정 항원 또는 상기 항원의 단편의 공급이 특이적 세포 증식을 유도하는 세포 집단의 성질을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적으로 결합하는"은 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 상호작용을 언급한다. 다양한 경우에, 특이적으로 결합하는은 약 10-6 몰/리터, 약 10-7 몰/리터 또는 약 10-8 몰/리터 또는 그 이하의 친화성 상수에 의해 구현될 수 있다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 항체이다. 이의 천연 환경의 오염 성분들은 항체에 대한 연구, 진단학적 또는 치료학적 사용을 방해하고 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있는 물질이다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 방법에 의한 측정시 95 중량% 초과의 항체 및 일부 양태에서 99 중량% 초과, (2) 예를 들어, 회전 컵 분리기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 또는 (3) 예를 들어, 코마시 블루 또는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 균질물로 정제된다. 딘리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포내 동일계 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 유사한", "실질적으로 동일한", "동등한", 또는 "실질적으로 동등한"은 2개의 수치 값(예를 들어, 분자와 관련된 하나 및 참조/비교 분자와 관련된 다른 하나) 간의 충분히 고도의 유사성을 지칭하여 당업자가 2개의 값 간의 차이가 상기 값(예를 들어, Kd 값, 항-바이러스 효과 등)에 의해 측정된 생물학적 특성의 맥락 내에서 거의 없거나 부재인 생물학적 및/또는 통계학적 유의성을 고려하게 한다. 상기 2개의 값 간의 차이는, 예를 들어, 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 약 50 % 미만, 약 40 % 미만, 약 30 % 미만, 약 20 % 미만 및/또는 약 10 % 미만이다.
본원에 사용된 바와 같은 표현 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 2개의 수치 값 (일반적으로 분자와 관련된 하나 및 참조/비교 분자와 관련된 다른 하나) 간의 충분한 고도의 차이를 지칭하여 당업자가 상기 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특성의 맥락 내에서 통계학적 유의성인지를 고려하게 한다. 상기 2개의 값 간의 차이는, 예를 들어, 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 약 10 % 초과, 약 20 % 초과, 약 30 % 초과, 약 40 % 초과 및/또는 약 50 % 초과이다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 간의 비공유 상호작용 총합의 강도를 언급한다. 달리 지적되지 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성"은 결합 쌍(예를 들어, 항체와 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 언급한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것들을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 낮은-친화성 분자는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 용이하게 해리하는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원에 신속하게 결합하고 장기간 결합된 채로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이중 어느 하나는 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특이적 설명 양태는 하기에 기재된다.
하나의 양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기의 검정에 의해 기재된 바와 같은 목적하는 항체의 Fab 버젼 및 이의 항원과 함께 수행되는 방사선표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 적정된 일련의 비표지된 항원의 존재하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킴에 이어서 항-Fab 항체-코팅된 플레이트와 함께 결합된 항원을 포획함에 의해 측정된다 (문헌참조: Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). 검정 조건을 확립하기 위해, 미세역가 플레이트 (Dynex)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중에서 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 밤새 코팅시키고 후속적으로 실온(대략 23 ℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중에서 2 %(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단시킨다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 목적하는(예를 들어, 문헌 (참조: Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하는) Fab의 연속 희석물과 혼합한다. 목적하는 Fab는 이어서 밤새 항온처리하지만; 상기 항온처리는 보다 오랜 기간 동안 계속 (예를 들어, 65시간)하여 평형에 확실히 도달하도록 한다. 이후, 상기 혼합물은 실온에서 항온처리 (예를 들어, 1시간 동안)를 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 플레이트는 PBS 중에서 0.1 % Tween-20으로 8회 세척하였다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 신틸란트 (MicroScint-20; Packard)를 첨가하고 플레이트는 10분 동안 탑카운트 감마 카운터 (Packard) 상에서 계수한다. 20 % 이하의 최대 결합을 부여하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택한다. 또 다른 양태에 따라, Kd 또는 Kd 값은 약 10 반응 유니트 (RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 25 ℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 사용하는 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정한다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 커플링된 단백질의 대략 10 반응 유니트 (RU)를 성취하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주사하기 전에 10 mM 나트륨 아세테이트 (pH 4.8)를 사용하여 5 ㎍/ml (~ 0.2 μM)로 희석시킨다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 각각의 실험에서, 스팟을 활성화시키고 에탄올아민을 표준 공제를 위해 사용될 고정화 단백질 없이 차단시킨다. 역학적 측정을 위해, 2배-연속 희석물의 Fab (0.78 nM 내지 500 nM)는 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25 ℃에서 0.05 % Tween 20 (PBST)과 함께 PBS 중에서 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑무이르 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon으로서 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 온-레이트는 정지-흐름 장착된 분광측정기 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광측정기 (ThermoSpectronic)와 같은 분광측정기에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2)에서 25 ℃에서 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 밴드-패스)에서 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 ~ 10 반응 유니트 (RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 25 ℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 사용하여 상기된 동일한 표면 플라스몬 공명 기술로 측정될 수 있다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)은 공급업자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 커플링된 단백질의 대략 10 반응 유니트 (RU)를 성취하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주사 전에 10 mM 나트륨 아세테이트 (pH 4.8)를 사용하여 5 ㎍/ml (~ 0.2 μM)까지 희석시킨다. 항원 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 역학적 측정을 위해, 2배 연속 희석물의 Fab (0.78 nM 내지 500 nM)를 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25 ℃에서 0.05 % Tween 20 (PBST)과 함께 PBS 중에서 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑무이르 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로서 계산하였다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 그러나, 온-레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-ls-1을 초과하는 경우, 상기 온-레이트는 정지-흐름 장착된 분광측정기 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광측정기 (ThermoSpectronic)와 같은 분광측정기에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2)에서 25 ℃에서 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 밴드-패스)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이것이 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 언급하려는 것이다. 한가지 유형의 벡터는 여기에 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 언급하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파아지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서, 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제 (예를 들어, 세균 복제 오리진을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터)할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자들의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "재조합 벡터")로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 활용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본원 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이므로 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 상호교환적으로 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 중합체를 언급하고 DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 비연속적일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 표지와의 접합에 의해 합성 후 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어, 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)을 갖는 것들 및 하전된 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, ply-L-라이신 등)과 같은 펜던트 잔기를 함유하는 것들, 삽입체 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것들, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성활성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들, 및 비변형된 형태의 폴리뉴클레오타이드(들)와 같은 유사체로서 뉴클레오타이드간 변형을 갖는 하나 이상의 천연 뉴클레오타이드의 "캡" 치환을 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실 그룹은, 예를 들어, 포스포네이트 그룹, 포스페이트 그룹에 의해 대체될 수 있거나 표준 보호 그룹에 의해 보호되거나 추가의 뉴클레오타이드로의 추가의 연결체를 제조하기 위해 활성화되거나 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 그룹 잔기로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호 그룹으로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어, 아라비노스, 크실로스 또는 리속스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아실 유사체 및 염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예를 들어, 메틸 리보사이드를 포함하는 당업계에 일반적으로 공지된 유사 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결체는 또 다른 연결 그룹에 의해 대체될 수 있다. 이들 또 다른 연결 그룹은 포스페이트가 P(0)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(0)NR2 ("아미데이트"), P(0)R, P(0)OR', CO 또는 CH2 ("포르마세탈")로 대체되거나, R 또는 R'는 각각 독립적으로 H이거나 임의로 에테르 (-O-) 연결체를 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜인, 양태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드에서 모든 연결체가 동일할 필요는 없다. 이전의 기재는 RNA 및 DNA를 포함하는, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 짧은, 일반적으로 반드시 그럴 필요는 없지만 길이가 약 200개 미만의 뉴클레오타이드인 일반적으로 단일-가닥의 일반적으로 합성 폴리뉴클레오타이드를 언급한다. 상기 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호적으로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 기재는 균등하게 그리고 완전하게 올리고뉴클레오타이드에 적용될 수 있다.
"항체" (Ab) 및 "면역글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이적 항원에 대해 결합 특이성을 나타내면서, 면역글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 없는 다른 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로 생성되고 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미에서 상호교환적으로 사용되고 모노클로날 항체 (예를 들어, 완전한 길이 또는 온전한 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이특이적 항체)를 포함하고 또한 특정 항체 단편(본원에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화된 및/또는 친화성 성숙된 것일 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 언급한다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변 부분이고 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중 서열 내에서 매우 상이하고 이의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 언급한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 균등하게 분포되어 있지 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 내 둘 다에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리우는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 불리운다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 베타-쉬트 구조의 일부를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된 베타-쉬트 형태를 대부분 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 영역에 의해 가깝게 인접하게 함께 연결되어 있고 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능, 예를 들어, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 관여를 나타낸다.
항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 이의 이름이 용이하게 결정화하는 이의 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교-결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원-인지 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2개의 쇄 Fv 종에서, 상기 영역은 단단한 비-공유 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 유연성 펩타이드 링커에 의해 공유적으로 연결되어 상기 경쇄 및 중쇄는 2개의 쇄 Fv 종의 구조와 유사한 "이량체" 구조로 결합할 수 있다. 상기 형태에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 반쪽)도 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화성이지만 항원을 인지하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역 기원의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 여러 잔기들이 첨가되어 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 함유하는 Fab'에 대한 본원의 지칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래에 이들 간에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종 기원의 항체의 "경쇄" (면역글로불린)는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 소위 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리우는 2개의 명백히 구분되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존하여, 항체 (면역글로불린)는 상이한 부류에 할당될 수 있다. 5개의 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 여러 개는 서브부류 (이소형), 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있고 일반적으로 예를 들어, 문헌 [참조: Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "완전한 길이의 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌 본원에서 이의 실질적으로 온전한 형태의 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부만을 포함하고, 여기서, 상기 일부는 온전한 항체 내에 존재하는 경우 상기 부분과 정상적으로 관련된 기능들의 적어도 하나 및 대부분의 많은 또는 모든 기능들을 보유한다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하고 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 양태에서, 항체 단편, 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 단편은 온전한 항체에 존재하는 경우 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능들, 예를 들어, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나를 보유한다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 온전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 상기 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 결합된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 언급하고, 예를 들어, 상기 집단을 포함하는 개별 항체들은 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하거나 단지 균일한 당형태 프로파일 (집단에서 당항체 상에 단지 단일 글리칸 또는 단일 글리칸 프로파일을 갖는다)만을 포함한다. Fc-297 위치에서 2,3- 및 2,6-시알릴 및 탈푸코실화된 복합체 바이-안테나 (bi-antennary) 글리칸을 사용함에 의해 이펙터 기능을 증진시키기 위한 균일한 항체 조성물의 예는 미국 제12/959,351호에 기재되어 있다. 따라서, 변형어 "모노클로날"은 구분되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 지적한다. 상기 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서, 상기 표적-결합 폴리펩타이드 서열은 다수의 폴리펩타이드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩타이드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 상기 선택 공정은 하이브리도마 클론, 파아지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은 다수의 클론으로부터 유일한 클론의 선택일 수 있다. 상기 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어, 표적에 대한 친화성을 개선시키고, 상기 표적 결합 서열을 인간화시키고, 세포 배양에서 이의 생성을 개선시키고, 이의 생체내 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 제조하기 위해서 등을 위해 추가로 변형될 수 있고 상기 변형된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 모노클로날 항체인 것으로 이해되어야만 한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 이외에, 모노클로날 항체 제제는 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되어 있지 않다는 점에서 유리하다. 변형어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 것으로서 항체의 특성을 지적하고 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법 (문헌참조: 예를 들어, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호), 파아지 디스플레이 기술 (문헌참조: 예를 들어, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)), 및 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자들의 일부 또는 모두를 갖는, 동물에서의 인간 또는 인간형 항체를 제조하기 위한 기술 (문헌참조: 예를 들어, W098/24893; WO96/34096; W096/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995))을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체를 포함하고, 여기서, 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 특정 종으로부터 유래된 항체에서 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이와 유사하지만 쇄(들)의 나머지는, 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 또 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 유사하다 (미국 특허 제4,816,567GH; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
"인간화된" 형태의 비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 하나의 양태에서, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이고, 여기서, 수용자의 초가변 영역 기원의 잔기는 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역 기원의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 수행능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 모두를 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 루프이다. 상기 인간화된 항체는 임의로 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불면 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 추가의 세부사항에 대해, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기의 검토 문헌 및 본원에 인용된 참조문헌을 참조한다: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
본원에 사용되는 경우 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 서열에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 언급한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역; VH 내 3개 (H1, H2, H3), 및 VL내 3개 (LI, L2, L3)를 포함한다. 다수의 초가변 영역 도해가 사용중에 있고 본원에 포함된다. 캐뱃 (Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하고 가장 공통적으로 사용된다 (문헌참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 초티아 (Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 언급한다 (문헌참조: Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM 초가변 영역은 캐뱃 CDR과 초티아 구조 루프 간의 절충사항을 나타내고 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 허용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기준으로 한다. 이들 초가변 영역 각각으로부터 기원하는 잔기는 하기에 나타낸다.
루프 캐뱃 AbM 초티아 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(캐뱃 넘버링)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(초티아 넘버링)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
초가변 영역은 다음과 같이 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 또는 49-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH 내 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 상기 캐뱃 등에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기들이 아닌 상기 가변 도메인 잔기들이다.
용어 "캐뱃에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "캐뱃에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형은 문헌 [참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서의 항체의 컴파일링의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 위해 사용되는 넘버링 시스템을 언급한다. 상기 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 여기로의 삽입에 상응하는 소수 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후 단일 아미노산 삽입(캐뱃에 따르면 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후 삽입된 잔기 (예를 들어, 캐뱃에 따르면 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 캐뱃 넘버링은 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 캐뱃 넘버링된 서열과 정렬시킴에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성하게 하는 VH 및 VL 도메인 간의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [ Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 언급하고 상기 단편들은 동일한 폴리펩타이드 쇄 (VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 간에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함에 의해, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는, 예를 들어, 문헌 [EP 404,097; W093/1161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 완전하게 기재되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
"친화성 성숙된" 항체는 변형(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는 하나 이상의 이의 HVR에서 하나 이상의 변형을 갖는 항체이다. 하나의 양태에서, 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 갖는다. 친화성 성숙된 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 생성된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙화를 기재하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이화는 문헌 [참조: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"블록킹" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 블록킹 항체 또는 길항제 항체는 실질적으로 또는 완전하게 항원의 생물학적 활성을 억제한다.
본원에 사용된 바와 같은 "효능제 항체"는 목적하는 폴리펩타이드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"장애"는 본 발명의 항체를 사용한 치료로부터 이득을 얻는 임의의 병태이다. 이것은 포유동물이 미지의 장애에 대한 성향을 갖는 병리학적 병태들을 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적인 예는 암을 포함한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 일부 정도의 비정상적 세포 증식과 관련된 장애를 언급한다. 하나의 양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에 사용된 바와 같은 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식을 언급하고 모든 예비-암성 및 암성 세포 및 조직을 언급한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 언급하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정 예는 편평 세포 암, 소세포 폐 암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 세포 암종, 배막의 암, 간세포 암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료"는 치료받는 개체 또는 세포의 천연 과정을 변형시키는 시도에서의 임상적 중재를 언급하고 임상적 병리의 예방 또는 과정 동안에 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발병 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적이거나 간접적인 병리학적 결과의 감소, 염증 및/또는 조직/기관 손상을 예방하거나 감소시키거나, 질환 진행율을 감소시키거나, 질환 상태를 개선 또는 완화시키고 예후의 개선 또는 차도를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키기 위해 사용된다.
"개체" 또는 "대상체"는 척추동물이다. 특정 양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물 (예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 척추동물은 인간이다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가정용 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 언급한다. 특정 양태에서, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기 위해 필요한 기간 동안 및 투여에서 효과적인 양을 언급한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유발하는 물질/분자의 능력과 같은 인자들에 따라 다양할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 이로운 효과가 물질/분자의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 성취하기 위해 필요한 기간 동안 및 용량에서 효과적인 양을 언급한다. 전형적이지만 반드시 그럴 필요가 없이, 예방학적 용량은 질환의 발병 전 또는 조기 단계에서 대상체에 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 미만이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 예방하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 언급한다. 상기 용어는 방사능활성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사능활성 동위원소), 화학치료학적 제제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 제제, 효소 및 이의 단편, 예를 들어, 핵산용해 효소, 항생제 및 독소, 예를 들어, 소분자 독소, 또는 이의 단편 및/또는 변이체를 포함하는 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 및 하기에 논의되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성제는 하기에 기재된다. 종양살생제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학치료학적 제제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료학적 제제의 예는 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌스 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감말 및 칼리케아미신 오메갈 (문헌참조: 예를 들어, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 에스페라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 첨가액, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에니루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테세네스 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 크레모포르-부재, 파클리탁셀의 알부민-가공된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), 및 TAXOTERE® 도세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 겜시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈 (XELODA®); 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 치료요법을 위한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)과의 치료 용법을 위한 약어인 FOLFOX와 같은 상기 중 2개 이상의 병용제를 포함한다.
약제학적 제형
약제학적 조성물은 용량 투여 제형과 양립가능한 방식 및 치료학적으로 효과적이고, 보호적이고 치료학적인 양으로 투여된다. 투여되기 위해 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 담당의의 판단에 의존한다. 그러나, 적합한 용량 투여 범위는 당업자에의해 용이하게 결정가능하다. 초기 투여 및 부스터 용량을 위해 적합한 용법은 또한 다양하지만 초기 투여에 이어서 후속적 투여를 포함할 수 있다. 백신의 용량은 또한 투여 경로에 의존하고 숙주의 크기에 따라 다양하다.
동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에서 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편을 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 (Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)을 참조한다. 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자, 및 이의 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, scFv (단일쇄 항체), 및 dAb (도메인 항체; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544)을 포함한다.
본원에 기재된 조성물은 본 발명의 판독시 당업자에 의해 동정가능한 추가의 활성제, 담체, 비히클, 부형제 또는 보조제와 함께 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있다.
약제학적 조성물은 바람직하게 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적 조성물에서, 본원에 기재된 조성물은 또한 "활성제"로서 언급되는 "활성 화합물"을 형성한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 용매, 분산 매질, 코팅, 항바이러스제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등의 약제학적 투여와 양립가능한 것들을 포함한다. 보충 활성 화합물은 또한 상기 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 경피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 식염수 용액, 고정된 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항세균제, 예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 이황화나트륨; 킬레이팅제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트 및 등장성 조정을 위한 제제, 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰푸울, 1회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이엘에 봉입될 수 있다.
임상적 적용
본 발명은 대상체에서 암 (예를 들어, 폐암, 대장암, 췌장암, 담관암 또는 자궁내막암), 양성 신생물 또는 혈관형성과 같은 증식성 질환의 치료에 유용한 선택되고 지시된 최적화된 당항체를 제공한다.
본원에 기재된 조성물은 또한 암 치료 및 진단 둘다에 사용될 수 있다. 인간 및/또는 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에서 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편을 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)을 참조한다. 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자 및 이의 단편, 예를 들어, Fab, F(ab') sub.2, Fv, scFv (단일쇄 항체), 및 dAb (도메인 항체; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544)를 포함한다.
이들 조성물은 적합한 담체, 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 완충제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
비천연적으로 존재하고/하거나 단리된 항체 및 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 특정 양태에서, 단리된 항체 및 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수하다.
항체의 항원 결합 도메인은 각각 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 기원하는 것인 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성되고, 상기 경쇄 및 중쇄 둘다는 3개의 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 제공한다. 가변 도메인은 단일쇄 Fv(scFv) 단편(여기서, VH 및 VL은 짧은 유연한 펩타이드를 통해 공유적으로 연결된다)으로서 또는 Fab 단편(이들 각각은 불변 도메인에 융합되고 문헌 [참조: Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 비-공유적으로 상호작용한다)으로서 파아지 상에서 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, scFv 암호화 파아지 클론 및 Fab 암호화 파아지 클론은 총체적으로 "Fv 파아지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 언급된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 별도로 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 클로닝될 수 있고 파아지 라이브러리에 무작위로 재조합되고 이는 이어서 문헌 [참조: Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 검색될 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 순수 레퍼토리는 문헌 [참조: Griffiths et al, EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 단일 공급원의 인간 항체를 제공하기 위해 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 순수 라이브러리는 또한 줄기 세포 기원의 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고 문헌 [참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 의해 기재된 바와 같이 고도로 가변 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재배열을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있다.
필라멘트성 파아지를 사용하여 마이너 코트 단백질 환제로의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이한다. 상기 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편 [여기서, VH 및 VL 도메인은 예를 들어, 문헌 (참조: Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991))에 기재된 바와 같이 유연성 폴리펩타이드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩타이드 쇄 상에서 연결된다)으로서, 또는 Fab 단편(여기서, 하나의 쇄는 예를 들어, 문헌 (참조: Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991))에 기재된 바와 같이 환제로 융합되고 다른 하나는 세균 숙주 세포 세포질주변공간(여기서, Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리는 야생형 코트 단백질의 일부를 대체함에 의해 파아지 표면상에 디스플레이된다)으로서 디스플레이될 수 있다.
항체 가변 유전자 분절 (VH 및 VL 분절을 포함하는)을 암호화하는 핵산은 목적하는 세포로부터 회수되고 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 목적하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리시킴에 이어서 문헌 (참조: Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989))에 기재된 바와 같이 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단과 매칭하는 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 이어서 발현을 위한 다양한 유전자 레퍼토리를 수득할 수 있다. V 유전자는 문헌 (참조: Orlandi et al., (1989) and in Ward et al, Nature, 341: 544-546 (1989))에 기재된 바와 같이 성숙한 V-도메인을 암호화하는 엑손의 5' 말단에 역배향 프라이머 및 J-분절 내를 기반으로 하는 정배향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해, 역배향 프라이머는 또한 문헌 [참조: Jones et al, Biotechnol, 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손 내를 기반으로 할 수 있고, 정배향 프라이머는 문헌 [참조: Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같이 불변 영역내를 기반으로 할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 축퇴성은 문헌 [참조: Orlandi et al. (1989) or Sastry et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 혼입될 수 있다. 특정 양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어, 문헌 [참조: Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]의 방법에 기재된 바와 같이 또는 문헌 [참조: Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 가용한 VH 및 VL 정렬을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함에 의해 최대화된다. 증폭된 DNA의 발현 벡터로의 클로닝을 위해, 희귀 제한 부위는 문헌 [참조: Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 하나의 말단에 태그로서 또는 문헌 [참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그된 프라이머와 함께 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 시험관내에서 V 유전자 분절로부터 유래될 수 있다. 인간 VH 유전자 분절의 대부분이 클로닝되고 서열 분석되었고 (문헌 (참조: Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992))에 보도된), 맵핑되고(문헌 (참조: Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993))에 보고된); 이들 클로닝된 분절(H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태를 포함하는)은 문헌 (참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992))에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 암호화하는 PCR 프라이머와 함께 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에서 집중된 모든 서열 다양성과 함께 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 분절을 클로닝하고 서열분석하고 (문헌 (참조: Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993))에서 보고된) 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이의 범위를 기반으로 하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 암호화한다. V-유전자 암호화 DNA의 증폭 후, 생식선 V-유전자 분절은 문헌 [참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 여러 방식으로 함께 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 조합함에 의해 작제될 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터에서 생성될 수 있고 상기 벡터는 시험관내에서, 예를 들어, 문헌 [참조: Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 또는 생체내에서 조합 감염, 예를 들어, 문헌 [참조: Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21 : 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 재조합된다. 생체내 재조합 방법은 Fab 단편의 2개의 쇄 특성을 활용하여 이. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과되는 라이브러리 크기 상의 한계를 극복한다. 순수 VH 및 VL 레퍼토리는 별도로 클로닝되고, 하나는 파아지미드로 클로닝되고 다른 하나는 파아지 벡터로 클로닝된다. 2개의 라이브러리는 이어서 파아지미드 함유 세균의 파아지 감염에 의해 조합되어 각각의 세포는 상이한 조합을 함유하고 라이브러리 크기는 단지 존재하는 세포의 수 (약 1012 클론)에 의해서만 제한된다. 벡터 둘다는 생체내 재조합 시그날을 함유하여 VH 및 VL 유전자는 단일 레플리콘 상으로 재조합되고 파아지 비리온으로 공동 팩키징된다. 이들 거대한 라이브러리는 대다수의 우수한 친화성 (약 10-8M의 Kd-1)의 다양한 항체를 제공한다.
대안적으로, 상기 레퍼토리는 후속적으로 예를 들어, 문헌 [참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터로 클로닝될 수 있거나 예를 들어, 문헌 [참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 어셈블리되고 이어서 클로닝될 수 있다. PCR 어셈블리는 또한 VH 및 VL DNA를, 유연한 펩타이드 스페이서를 암호화하는 DNA와 연결하여 단일쇄 Fv(scFv) 레퍼토리를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, "세포 PCR 어셈블리에서"는 문헌 [참조: Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 림프구 내 VH 및 VL 유전자를 조합하고 이어서 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하기 위해 사용된다.
라이브러리의 스크리닝은 임의의 당업계 공지된 기술에 의해 성취될 수 있다. 표적은 흡착 플레이트로 부착된 숙주 세포 상에서 발현되거나, 세포 분류에 사용되거나 스트렙타비딘-코팅된 비드를 사용한 포획을 위해 비오틴으로 접합되거나 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위해 임의의 다른 당업계 공지된 방법에 사용되는, 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용될 수 있다.
고체 상에 결합된 파아지는 세척되고 이어서 예를 들어, 문헌 [참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산에 의해 또는 문헌 [참조: Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해 또는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항원 경쟁, 예를 들어, 문헌 [참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 과정으로 용출된다. 파아지는 단일 라운드의 선택에서 20-1,000 배 풍부할 수 있다. 더욱이, 집적된 파아지는 세균 배양물에서 성장할 수 있고 추가 라운드의 선택에 적용될 수 있다.
선택 효율은 세척 동안에 해리 역학 및 단일 파아지 상의 다중 항체 단편이 동시에 항원과 작용할 수 있는지를 포함하는 많은 인자에 의존한다. 신속한 해리 역학 (및 약한 결합 친화성)을 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 파아지 디스플레이 및 고체 상에서 항원의 높은 코팅 다양성에 의해 보유될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파아지를 안정화시킬 뿐만 아니라 해리된 파아지의 재결합을 선호한다. 느린 해리 역학 (및 우수한 결합 친화성)을 갖는 항체의 선택은 문헌 [참조: Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) 및 WO 92/09690]에 기재된 바와 같이 긴 세척 및 다가 파아지 디스플레이를 사용하고 문헌 [참조: Marks et al, Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용하여 촉진될 수 있다.
그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이(예를 들어, 상기된 친화성 성숙화 기술의 일부로 수행된 바와 같이)는 대부분 항원에 결합하고 몇개가 보다 높은 친화성을 갖는 많은 돌연변이를 유발할 가능성이 있다. SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 제한과 함께, 희귀한 높은 친화성 파아지는 경쟁에서 이길 수 있다. 모든 보다 높은 친화성 돌연변이체를 보유하기 위해, 파아지는 과량의 비오티닐화된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H로 항온처리될 수 있지만, SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 대한 표적 몰 친화성 상수 보다 낮은 몰 농도에서 비오티닐화된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H로 항온처리될 수 있다. 높은 친화성 결합 파아지는 이어서 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 상기 "평형 포획"은 항체가 보다 낮은 친화성을 갖는 과량의 파아지로부터 2배 높은 친화성 만큼 적게 돌연변이 클론의 단리를 가능하게 하는 민감성으로 이들의 결합 친화성에 따라 선택되도록 한다. 고체 상에 결합된 파아지를 세척하는데 사용되는 조건은 또한 해리 역학을 기준으로 구별되도록 조작될 수 있다.
본 발명의 Fv 클론을 암호화하는 DNA는 통상의 과정을 사용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파아지 DNA 주형으로부터 목적하는 중쇄 및 경쇄 암호화 영역을 특이적으로 증폭시키기 위해 디자인된 올리고뉴클레오타이드를 사용함에 의해) 용이하게 단리되고 서열분석된다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 위치할 수 있고, 이는 이어서 이. 콜라이 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합체 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성을 수득하였다. 세균에서 항체-암호화 DNA의 재조합 발현에 대한 검토 문헌은 문헌 [참조: Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 암호화하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 (예를 들어, 적당한 DNA 서열은 상기 캐뱃 등으로부터 수득될 수 있다)을 암호화하는 공지된 DNA 서열과 조합하여 완전하거나 부분적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이소형의 불변 영역은 상기 목적을 위해 사용될 수 있고 상기 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있는 것으로 인지된다. 하나의 동물(예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래되고 이어서 "하이브리드"를 위해 암호화 서열(들)을 형성하기 위해 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합된 Fv 클론에서 전장 중쇄 및/또는 경쇄는 본원에 사용된 바와 같은 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 하나의 양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 모든 인간, 완전하거나 부분적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 암호화 서열(들)을 형성한다.
순수 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 제조된 항체는 적당한 친화성 (약 106 내지 107 M-1의 Kd-1)을 가질 수 있지만, 친화성 성숙화는 또한 시험관내에서 상기 문헌 [참조: Winter et al. (1994)]에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의해 모방될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 문헌 [참조: Hawkins et al., J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992)]의 방법에서 또는 문헌 [참조: Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류 경향 폴리머라제 (문헌 (참조: Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)에서 보고된)를 사용함에 의해 시험관내에서 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화성 성숙화는 예를 들어, 선택된 개체 Fv 클론에서 목적하는 CDR을 스패닝하는 무작위 서열을 수행하는 프라이머와 함께 PCR을 사용하고 보다 높은 친화성 클론을 스크리닝하면서 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시킴에 의해 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일자로 공개된)는 경쇄 유전자 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이 유발을 유도하는 방법을 기재하였다. 또 다른 효과적인 방법은 비면역화된 공여자로부터 수득된 천연의 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 함께 파아지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고 문헌 [참조: Marks et al., BiotechnoL, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 여러 라운드의 쇄 리셔플링으로 보다 높은 친화성에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술은 10-9 M 범위의 친화성과 함께 항체 및 항체 단편의 제조를 가능하게 한다.
항체의 친화성을 생성하고 평가하는 다른 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 [참조: Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); U.S. Pat. No. 4,816,567; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987; Munson et al., Anal. Biochem, 107:220 (1980); Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다.
일반 방법
항체의 생성은 당업계의 통상의 기술을 사용하여 성취될 수 있고 본원에 기재된 것들, 예를 들어, 하이브리도마 기술 및 결합제 분자의 파아지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝을 포함한다. 이들 방법은 당업계에서 널리 확립되어 있다.
간략하게, 본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론에 대해 스크리닝하는 조합적 라이브러리를 사용함에 의해 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질로 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파아지를 함유하는 파아지 라이브러리를 스크리닝함에 의해 선택된다. 상기 파아지 라이브러리는 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고 따라서 라이브러리에서 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서 결합 클론은 항원으로부터 용출되고 추가의 사이클의 항원 흡착/용출에 의해 추가로 집적될 수 있다. 본 발명의 임의의 항체는 목적하는 파아지 클론에 대해 선택하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 디자인하고 이어서 목적하는 파아지 클론으로부터 Fv 서열 및 문헌 [참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하는 전장 항체 Z클론을 작제함에 의해 수득될 수 있다.
모노클로날 항체는 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 수득될 수 있고, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연의 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형어구 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 지적한다.
본 발명의 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있고 이는 먼저 문헌 [참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기재된 하이브리도마 방법을 포함하고 또는 대안적으로 이들은 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 제조를 위해, 이를 암호화하는 핵산은 단리되고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터로 삽입된다. 상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상의 과정(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의해)을 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석된다. 많은 벡터가 가용하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용될 숙주 세포에 의존한다. 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 (일반적으로 포유동물) 기원의 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이소형의 불변 영역은 상기 목적을 위해 사용될 수 있고 상기 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있는 것으로 인지된다.
원핵 숙주 세포를 사용한 항체의 제조
벡터 작제
본 발명의 항체의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생산 세포로부터 단리되고 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 원핵세포 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 당업계에서 가용하고 공지된 많은 벡터들은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적당한 벡터의 선택은 주로 벡터 및 상기 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포로 삽입될 핵산의 크기에 의존한다. 각각의 벡터는 이의 기능 (이종성 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현 또는 둘 다) 및 이것이 잔류하는 특정 숙주 세포와의 적격성에 의존하여 다양한 성분들을 함유한다. 상기 벡터 성분들은 일반적으로 복제 오리진, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 시그날 서열, 이종성 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 적격할 수 있는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 숙주와 연계하여 사용된다. 상기 벡터는 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열 뿐만 아니라 복제 부위를 갖고 있다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 앰피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 내성을 암호화하는 유전자를 함유하고 따라서 형질전환된 세포를 동정하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파아지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 문헌 [참조: Carter et al., 미국 특허 제5,648,237호]에 상세히 기재되어 있다.
추가로, 숙주 미생물과 적격할 수 있는 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파아지 벡터는 이들 숙주와 연계하여 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEM™-11과 같은 박테리오파아지는 이. 콜라이 LE392와 같은 민감성 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있고 이는 각각 폴리펩타이드 성분들을 암호화한다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론의 업스트림 (5')에 위치한 비해독되는 조절 서열이다. 원핵세포 프로모터는 전형적으로 2개의 부류, 유도성 및 항상성에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 변화, 예를 들어, 영양물의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 응답하여 이의 제어하에 증가된 수준의 시스트론 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 다수의 프로모터는 널리 공지되어있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터에 삽입함에 의해 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동적으로 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터 둘 다를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 양태에서, 이종성 프로모터는 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교하여 보다 큰 전사 및 발현된 표적 유전자의 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 사용된다.
원핵세포 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능하는 다른 프로모터 (예를 들어, 다른 공지된 세균 또는 파아지 프로모터)가 또한 적합하다. 이들의 뉴클레오타이드 서열은 공개되어서 당업자는 이들을 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하도록 링커 또는 어댑터를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄 (문헌참조: Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269)를 암호화하는 시스트론에 작동적으로 연결시킬 수 있도록 한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 벡터 내 각각의 시스트론은 막을 거쳐 발현된 폴리펩타이드의 전좌를 지시하는 분비 시그날 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 상기 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 이것은 벡터로 삽입되는 표적 폴리펩타이드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 가공되는 (즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 하나 이어야 한다. 이종성 폴리펩타이드에 고유한 시그날 서열을 인지하지 않고 소유하지 않는 원핵 숙주 세포에 대해, 상기 시그날 서열은, 예를 들어, 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원핵 세포 시그날 서열로 대체된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 발현 시스템의 양 시스트론에 사용되는 시그날 서열은 STII 시그날 서열 또는 이의 변이체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고 따라서 각각의 시스트론 내에 분비 시그날 서열의 존재를 요구하지 않는다. 그와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 세포질내 기능성 면역글로불린을 형성하기 위해 발현되고 폴딩되고 어셈블리된다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB-균주)는 디설파이드 결합 형성을 위해 호전적일 수 있는 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유니트의 적당한 폴딩 및 어셈블리를 가능하게 한다 (문헌참조: Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995)).
본 발명의 항체는 또한 발현된 폴리펩타이드 성분의 정량 비율이 본 발명의 분비되고 적당히 어셈블리된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조절될 수 있는 발현 시스템을 사용함에 의해 생산될 수 있다. 상기 조절은 적어도 부분적으로 폴리펩타이드 성분에 대한 해독 강도를 동시에 조절함에 의해 성취된다.
해독 강도를 조절하기 위한 한가지 기술은 문헌 [참조: Simmons et al., 미국 특허 제5,840,523호]에 기재되어 있다. 이것은 시스트론내 해독 개시 영역 (TIR)의 변이체를 사용한다. 소정의 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 일정 범위의 해독 강도와 함께 제조될 수 있고 이에 의해 특정 쇄의 목적하는 발현 수준에 대해 상기 인자를 보정하는 간편한 수단을 제공한다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변형시킬 수 있는 코돈 변화를 유도하는 통상적인 돌연변이유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 양태에서, 뉴클레오타이드 서열의 변화는 사일런트하다. TIR에서의 변화는, 예를 들어, 시그날 서열에서의 변화와 함께 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격에서의 변화를 포함할 수 있다. 돌연변이 시그날 서열을 생성시키기 위한 한가지 방법은 시그날 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는(즉, 변화는 사일런트하다) 암호화 서열의 개시부에 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이것은 각각의 코돈의 3번째 뉴클레오타이드 위치를 변화시킴에 의해 성취될 수 있고; 추가로, 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 뱅크를 제조하는데 복잡성을 부가할 수 있는 다중의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 이러한 돌연변이유발 방법은 문헌 [참조: Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 벡터 세트는 여기에 각각의 시스트론에 일정 범위의 TIR 강도와 함께 생성된다. 이러한 제한된 세트는 다양한 TIR 강도 조합하에 목적하는 항체 생성물의 수율 뿐만 아니라 각각의 쇄의 발현 수준의 비교를 제공한다. TIR 강도는 문헌 [참조: Simmons et al. 미국 특허 제5,840,523호]에 상세히 기재된 바와 같은 리포터 유전자의 발현 수준을 정량함에 의해 결정될 수 있다. 해독 강도 비교를 기준으로, 목적하는 개별 TIR은 본 발명의 발현 벡터 작제물에서 조합되도록 선택된다.
본 발명의 항체를 발현시키는데 적합한 원핵 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 아키박테리아 (Archaebacteria) 및 유박테리아 (Eubacteria)를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에스케리치아 (Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 바실리 (Bacilli) (예를 들어, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 슈도모나스 계열 (예를 들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 쉬겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코커스 (Paracoccus)를 포함한다. 하나의 양태에서, 그람-음성 세포를 사용한다. 하나의 양태에서, 이. 콜라이 세포는 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 균주 W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) 및 이의 유도체를 포함하고 이는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompΤΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 제5,639,635호)를 갖는 균주 33D3을 포함한다. 다른 균주 및 이의 유도체, 예를 들어, 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 λ1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이들 실시예는 제한이기 보다는 설명을 위한 것이다. 한정된 유전자형을 갖는 상기 언급된 임의의 세균의 유도체를 작제하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [참조: Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 세균 세포에서 레플리콘의 복제성을 고려하여 적당한 세균을 선택할 필요가 있다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하기 위해 사용되는 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야만 하고 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게 세포 배양에 혼입될 수 있다.
항체 생산
숙주 세포는 상기된 발현 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
형질전환은 원핵세포 숙주로 DNA를 도입하여 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 된 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 의존하여, 형질전환은 상기 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리는 일반적으로 실질적 세포-벽 배리어를 함유하는 세균 세포에 대해 사용된다. 형질전환을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당업계에 공지된 배지에서 성장시키고 선택된 숙주 세포의 배양을 위해 적합하다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로쓰 (luria broth: LB) + 필요한 영양 보충물을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해 발현 벡터의 작제물을 기준으로 선택되는 선택 제제를 함유한다. 예를 들어, 앰피실린은 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 뿐만 아니라 임의의 필요한 보충물은 또한 단독으로 도입되거나 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 적당한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장을 위해, 예를 들어, 성장은 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 및 약 30 ℃를 포함하지만 이에 제한되지 않는 온도 범위에서 수행한다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 의존하여 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이를 위해, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0일 수 있다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에서 유도된다. 본 발명의 하나의 양상에서, PhoA 프로모터는 폴리펩타이드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지에서 배양한다. 하나의 양태에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (문헌참조: 예를 들어, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). 다양한 다른 유도제가, 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩타이드는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 일반적으로 삼투압 쇼크, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해, 전형적으로 미생물을 파쇄시킴을 포함한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 파쇄물 또는 전체 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지로 수송되고 여기에서 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있고 배양 상등액을 여과하고 생산된 단백질의 추가의 정제를 위해 농축시킨다. 상기 발현된 폴리펩타이드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리되고 동정될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식(fed-batch) 발효 과정이 재조합 단백질의 생산을 위해 가용하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 예를 들어 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양소, 특히 글루코스 (통상의 탄소/에너지원)를 분포시키기 위해 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 볼륨 용량이 대략 100 리터 이하이고 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있는 발효기에서의 발효를 언급한다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포가, 이 단계에서 세포가 초기 정지 상태로 있는 목적하는 밀도에 대한 적합한 조건, 예를 들어, 약 180 내지 220의 OD550에서 성장된 후 개시된다. 다양한 유도제는 당업계에 공지되고 상기된 바와 같이, 사용된 벡터 작제물에 따라 사용될 수 있다. 세포는 유도 전 짧은 기간 동안 성장할 수 있다. 세포는 일반적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도되지만 보다 길거나 짧은 유도 시간이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩타이드의 적당한 어셈블리 및 폴딩을 개선하기 위해, 예를 들어, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (차페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 차페론 단백질을 과발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시 형질전환시킬 수 있다. 차페론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산되는 이종성 단백질의 적당한 폴딩 및 가용성을 촉진시키는 것으로 입증되었다 (문헌참조: Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al., 미국 특허 제6,083,715호; Georgiou et al., 미국 특허 제6,027,888호; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210).
발현된 이종성 단백질 (특히 단백질분해에 민감한 것들)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이의 배합물과 같은 공지된 세균 프로테아제를 암호화하는 유전자에서 유전학적 돌연변이(들)를 수행하기 위해 변형시킬 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 가용하고 예를 들어, 문헌 [참조: Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., 미국 특허 제5,264,365호; Georgiou et al., 미국 특허 제5,508,192호; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 단백질분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 차페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주는 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
항체 정제
하나의 양태에서, 본원에서 생산된 항체 단백질은 추가의 검정 및 사용을 위해 실질적으로 균일성인 제제를 수득하기 위해 추가로 정제된다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 하기의 과정들은 적합한 정제 과정들을 예시한다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과.
하나의 양상에서, 고체 상에 고정화된 단백질 A는 본 발명의 항체 생성물의 면역친화성 정제를 위해 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화성으로 결합하는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureas) 기원의 41 kD 세포벽 단백질이다 (문헌참조: Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). 단백질 A가 고정화된 고체 상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼 또는 제어된 공극 유리 칼럼 또는 규산 칼럼일 수 있다. 일부 적용에서, 상기 칼럼은 가능하게는 오염물의 비특이적 부착을 차단하기 위해 글리세롤과 같은 시약으로 코팅된다.
정제의 제1 단계로서, 상기된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제제는 단백질 A 고정화된 고체 상으로 적용하여 목적하는 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하도록 한다. 고체 상은 이어서 세척하여 고체 상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로 목적하는 항체는 용출에 의해 고체 상으로부터 회수한다.
진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생산
벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 시그날 서열. 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 증진제 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 시그날 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 시그날 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 목적하는 폴리펩타이드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 일반적으로 선택된 이종성 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 가공되는 (즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 시그날이 가용하다.
상기 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임내 항체를 암호화하는 DNA로 연결된다.
(ii) 복제 오리진
일반적으로, 복제 오리진 성분은 포유동물 발현 벡터를 위해 요구되지 않는다. 예를 들어, SV40 오리진은 전형적으로, 단지 이것이 어얼리 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.
(iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택성 마커로서도 호칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나 (b) 경우에 따라 영양요구성 결핍을 보충하거나 (c) 복합 배지로부터 가용하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 암호화한다.
선택 계획의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용하는 것이다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고 따라서 선택 용법에서 생존한다. 상기 우성 선택의 예는 약물로서 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용하는 것이다.
포유동물 세포에 대해 적합한 선택가능한 마커의 또 다른 예는 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등과 같이 항체 핵산을 취득하기 위해 적격인 세포의 동정을 가능하게 하는 것들이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함에 의해 동정될 수 있다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적당한 숙주 세포는, 예를 들어, DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)를 포함한다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)가 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어, 가나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택가능한 마커에 대한 선택 제제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다 [문헌참조: 미국 특허 제4,965,199호].
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인지되고 목적하는 폴리펩타이드 (예를 들어, 항체)를 암호화하는 핵산으로 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵 세포에 대해 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자들의 전사 개시로부터 70 내지 80개 염기 업스트림에서 밝혀진 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는 암호화 서열의 3' 말단으로 폴리 A 테일의 부가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열들은 진핵세포 발현 벡터로 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 항체 폴리펩타이드 전사는, 예를 들어, 상기 프로모터가 숙주 세포 시스템과 적격인 경우 폴리오마 바이러스, 파울폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 어얼리 및 레이트 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 오리진을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 이메디에이트 어얼리 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 문헌 [참조: 미국 특허제4,419,446호]에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 문헌 [참조: 미국 특허 제4,601,978호]에 기재되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 전사는 흔히 인핸서 서열을 벡터에 삽입함에 의해 증가될 수 있다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로, 당업자는 진핵 세포 바이러스 기원의 인핸서를 사용한다. 이의 예는 복제 오리진의 레이트 측면 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인핸서, 복제 오리진 레이트 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵 세포 프로모터의 활성화를 위한 증진 요소들에 대해 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 상기 인핸서는 항체 펩타이드-암호화 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 또한 전사 종결을 위해 필요하고 mRNA를 안정화시키기 위해 필요한 서열을 함유한다. 상기 서열은 통상적으로 진핵 세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비해독 영역인 5' 및 때로는 3'로부터 가용하다. 이들 영역은 항체를 암호화하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오타이드 분절을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 문헌 [W094/11026] 및 본원에 기재된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터 내 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함하고, 이는 척추동물 숙주 세포를 포함한다. 배양 중 척추동물 세포의 증식 (조직 배양)은 일상적인 과정이 되어버렸다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 몽키 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 증식을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (mouse sertoli cells) (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 몽키 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리칸 그린 몽키 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 상기된 항체 생산용 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma)), RPMI-1640 (Sigma), 및 듈베코 변형된 이글스 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판되는 배지가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 추가로, 문헌 [참조: Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985]에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 임의의 배지에는 필요한 만큼 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오타이드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 GENTAMYCIN™ 약물), 미량 성분 요소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의되는), 및 글루코스 또는 등가 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고 당업자에게 자명하다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내에서 생산되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 제1 단계로서 세포내에서 생산되는 경우, 미립자 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편들은 일반적으로 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액은 일반적으로 먼저, 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유니트를 사용하여 농축된다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 이전의 단계에 포함될 수 있고 항생제는 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고 친화성 크로마토그래피는 일반적으로 허용되는 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A와 같은 친화성 시약의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌참조: Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ 3을 위해 추천된다 (문헌참조: Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔하게 아가로스이지만 다른 매트릭스가 가용하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 성취될 수 있는 것 보다 신속한 유동 속도 및 보다 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제를 위해 유용하다. 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 헤파린 SEPHAROSE™ 크로마토그래피 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술이 또한 회수될 항체에 의존하여 가용하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 경우에 따라, 예를 들어, 일반적으로 저염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 약 2.5 내지 4.5 사이의 pH에서 용출 완충액을 사용한 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 기술 및 방법은 당업계에 널리 확립되어 있는 것으로 주지되어야 하고 이는 상기된 바와 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대해 당업자에 의해 적정한 것으로 간주된다.
활성 검정
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대해 특징 분석될 수 있다.
정제된 항체는 N-말단 서열 분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광측정기, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 분해를 포함하지만 이에 제한되지 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특징 분석될 수 있다.
필요한 경우, 항체는 이들의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 이들의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 당업계에 공지되고 본원에 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 제한 없이 웨스턴 블롯, 방사선면역검정, ELISA (효소 결합된 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정, 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 임의의 적접적 또는 경쟁적 결합 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만 일부 기능을 갖는 변화된 항체를 고려하고 이는 많은 응용을 위해 바람직한 후보물이 되게하고 생체내 항체의 반감기는 중요하지만 특정 이펙터 기능(예를 들어, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 결실성이다. 특정 양태에서, 항체의 Fc 활성은 단지 목적하는 성질이 유지되도록 보장하기 위해 측정된다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합(따라서 ADCC 활성이 없을 가능성이 있는)이 없지만 FcRn 결합 능력을 보유하도록 보장하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포를 매개하기 위한 1차 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 문헌 [참조: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 제464면 상에 표 3에 요약한다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 예는 미국 특허 제5,500,362호 또는 미국 특허 제5,821,337호에 기재되어 있다. 상기 검정을 위해 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 문헌 [참조: Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에서 기재된 것과 같은 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은 또한 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성을 갖지 않음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌 [참조: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서, 전체 항체 보다는 항체 단편을 사용하는 이점이 있다. 보다 작은 크기의 단편들은 신속한 제거를 가능하게 하고 고형 종양으로의 개선된 접근을 유도할 수 있다.
항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 통상적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질 분해를 통해 유래하였다 (문헌참조: 예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어 대량의 상기 단편들의 용이한 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌참조: Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 또 다른 방법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 살비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 자명하다. 다른 양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 문헌 [WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호]을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 온전한 조합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안에 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생산하도록 작제될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra]을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편들은 단일특이적 또는 이특이적일 수 있다.
인간화된 항체
본원에 기재된 임의의 항체는 완전한 길이의 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 단리된 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 단일쇄 항체이다.
본원에 기재된 임의의 항체는 하기의 하나 이상의 특성을 갖는다:
a) 재조합 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체 단편, 이특이적 항체, 모노특이적 항체, 1가 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, 또는 항체의 유도체; b) 인간, 쥐, 인간화된, 또는 키메라 항체, 항원-결합 단편, 또는 항체의 유도체; c) 단일쇄 항체 단편, 다중항체, Fab 단편 및/또는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 이소형 및/또는 이의 서브클래스의 면역글로불린; d) (i) 암 세포의 ADCC 및/또는 CDC를 매개하는 특성; (ii) 암 세포의 아폽토시스를 유도하고/하거나 촉진시키는 특성; (iii) 암 세포의 표적 세포의 증식을 억제하는 특성; (iv) 암 세포의 식세포작용을 유도하고/하거나 촉진시키는 특성; 및/또는 (v) 세포독성 제제의 방출을 유도하고/하거나 촉진시키는 특성; e) 종양-특이적 탄수화물 항원인 종양-관련된 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 특성; f) 비-암 세포, 비-종양 세포, 양성 암 세포 및/또는 양성 종양 세포 상에 발현된 항원을 결합하지 않는 특성; 및/또는 g) 암 줄기 세포 및 정상 암 세포 상에 발현된 종양-관련된 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 특성.
바람직하게 이들의 각각의 항원으로의 항체의 결합은 특이적이다. 용어 "특이적"은 일반적으로 결합 쌍의 하나의 구성원이 이의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 다른 분자에 임의의 유의적 결합을 보여주지 않는 상황을 언급하기 위해 사용되고 예를 들어, 본원에 특정된 것들 이외의 임의의 다른 분자와 약 30 % 미만, 바람직하게 20 %, 10 % 또는 1 %의 교차-반응성을 갖는다.
적합한 항체는 고친화성 (낮은 KD 값)으로 이의 표적 에피토프에 결합하고 바람직하게 KD는 나노몰 범위 이하이다. 친화성은, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
예시적 항체 제제
본원에 기재된 글로보 H 에피토프 및 SSEA-4 에피토프에 결합할 수 있는 예시적 항체는 당업계에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다.
숙주 동물의 면역화 및 하이브리도마 기술
항-글로보 H에 대해 예시적 폴리클로날 항체 및 항-SSEA-4 항체는 혈청에서 목적하는 항체의 증가에 대해 조사된 면역화된 포유동물로부터 혈액을 수거함에 의해 그리고 임의의 통상적 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리함에 의해 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체는 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청을 포함하고 상기 폴리클로날 항체를 함유하는 분획물은 혈청으로부터 분리될 수 있다.
폴리클로날 항체는 일반적으로 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 숙주 동물 (예를 들어, 토끼, 마우스, 말 또는 염소)에서 생성된다. 관련 항원을 이기능성 또는 유도화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한), 글루타르알데하이드, 숙신 무수물, SOC12 등을 사용하여 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
임의의 포유동물은 목적하는 항체를 생성하기 위해 항원으로 면역화시킬 수 있다. 일반적으로, 설치류, 토끼목 또는 영장류 동물이 사용될 수 있다. 설치류 동물은, 예를 들어, 마우스, 래트 및 햄스터를 포함한다. 토끼목의 동물은, 예를 들어, 토끼를 포함한다. 영장류의 동물은, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis), 래서스 몽키 (rhesus monkey), 비비 및 챔팬지와 같은 카타르히니 (Catarrhini) 몽키 (긴꼬리 몽키)를 포함한다.
동물을 항원으로 면역화시키기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 항원의 복강내 주사 또는 피하 주사는 포유동물의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로, 항원은 적당량의 포스페이트 완충 식염수 (PBS), 생리학적 식염수 등에서 희석되고 현탁될 수 있다. 경우에 따라, 항원 현탁액을 적당량의 프룬트 완전 보조제와 같은 표준 보조제와 혼합하고 유제로 제조하고 이어서 포유동물에 투여할 수 있다. 동물은, 1 mg 또는 1 ㎍의 펩타이드 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 용적의 프룬트의 불완전 보조제와 조합함에 의해 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화된다.
동물은 4 내지 21일 마다 적당량의 프룬트 불완전 보조제와 혼합한 항원을 수차례 투여하여 역가 정체기까지 부스팅될 수 있다. 동물은 다중 부위에서 피하 주사에 의해 프룬트 완전 보조제 중에 펩타이드 또는 접합체의 본래 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅된다. 7 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하고 혈청은 항체 역가에 대해 분석한다. 적당한 담체는 또한 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같이 면역화 후, 혈청은 목적하는 항체 양의 증가를 위한 표준 방법에 의해 조사된다. 바람직하게, 상기 동물은 동일한 항원의 접합체로 부스팅되지만 상이한 단백질에 접합되고/되거나 상이한 가교 결합 시약을 통해 접합된다. 접합체는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양물에서 제조될 수 있다. 또한, 알룸과 같은 응집제는 적합하게 면역 반응을 증진시키기 위해 사용된다.
과거 20년 내지 30년 넘게, 인간 생체내 치료학적 적용을 위해 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 제조하기 위해 다수의 방법이 개발되었다. 가장 흔하게 사용되고 입증된 방법은 하이브리도마 방법을 사용하여 마우스 mAb를 제조하고 이어서 인간 VH 및 VL 도메인 및 mAbs의 불변 도메인의 프레임워크 영역을 인간 VH 및 VL 도메인의 대부분 상동성의 인간 프레임워크 영역 및 목적하는 인간 γ 면역글로불린 이소형 및 서브클래스의 불변 영역으로 전환시킴에 의해 mAb를 인간화시킨다. 임상적으로 사용되는 많은 mAb, 예를 들어, Xolair는 인간 γ1, κ 이소형 및 서브클래스의 인간화된 mAb이고 상기 방법을 사용하여 제조된다.
일부 양태에서, 항체는 통상의 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다 [문헌참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]. 상기 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적당한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터 또는 토끼는 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하거나 제조할 수 있는 림프구를 유발하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 면역화시킨다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 면역 세포는 항원으로 면역화된 포유동물로부터 수거하고 상기된 바와 같은 혈청에서 목적하는 항체의 증가된 수준에 대해 조사하고 세포 융합시킨다. 세포 융합을 위해 사용되는 면역 세포는 바람직하게 비장으로부터 수득한다. 상기 면역세포와 융합될 다른 바람직한 모 세포는, 예를 들어, 포유동물의 골수종 세포, 및 보다 바람직하게 약물에 의해 융합된 세포의 분리를 위해 획득된 성질을 갖는 골수종 세포를 포함한다.
바람직한 흑색종 세포는 효율적으로 융합시키고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정한 고수준의 항체 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 기관 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA]으로부터 구입한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 기관 [American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA]으로부터 구입한 SP-2 세포로부터 유래된 것들과 같은 쥐 골수종 세포주이다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 기재되었다 (문헌참조: Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
상기 면역세포 및 골수종 세포는 공지된 방법, 예를 들어, 밀스테인 등의 방법에 따라 융합될 수 있다 (문헌참조: Galfre et al., Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). 림프구는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌참조: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 세포 융합에 의해 수득된, 수득한 하이브리도마는 HAT 배지 (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 함유 배지)와 같은 표준 선택 배지에서 이들을 배양함에 의해 선택될 수 있다. 상기 세포 배양은 전형적으로 목적하는 하이브리도마를 제외한 다른 모든 세포 (비융합된 세포)를 사멸시키기에 충분한 시간인 수일 내지 수주 동안 HAT 배지에서 계속한다. 이어서, 표준 제한 희석은 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 스크리닝하고 클로닝하기 위해 수행된다.
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 씨딩하고 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 차단하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정에 의해 결정된다. 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 방사선면역검정 (RIA), 및/또는 면역형광내 흡광도 측정을 사용하여 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 측정할 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체는 플레이트 상에 고정화되고, 본 발명의 단백질은 상기 플레이트에 적용되고 이어서 항체 생산 세포 또는 정제된 항체의 세포 상등액과 같은 목적하는 항체를 함유하는 샘플이 적용된다. 이어서, 1차 항체를 인지하고 알칼린 포스파타제와 같은 효소로 표지된 2차 항체가 적용되고 상기 플레이트를 항온처리한다. 이어서, 세척 후, 효소 기질, 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트는 상기 플레이트에 첨가하고 흡광도는 샘플의 항원 결합 활성을 평가하기 위해 측정된다. C-말단 또는 N-말단 단편과 같은 단백질의 단편은 상기 방법에 사용될 수 있다. BIAcore (Pharmacia)는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어, 문헌 [참조: Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드 분석에 의해 결정될 수 있다.
상기된 것들을 포함하는 임의의 통상의 방법을 적용하여, 본원에 기재된 에피토프에 결합하는 하이브리도마 세포 생산 항체는 추가의 특징 분석을 위해 동정되고 선택될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 동정된 후, 클론을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌참조: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 상기 목적을 위해 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실애퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
추가로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장할 수 있다. 예를 들어, 수득된 하이브리도마는 후속적으로 마우스의 복강내로 이식될 수 있고 복수는 수거된다.
수득된 모노클로날 항체는, 예를 들어, 황산암모늄 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 단백질이 커플링된 친화성 칼럼에 의해 정제될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질의 정제 및 검출을 위해서 뿐만 아니라 본 발명의 단백질의 효능제 및 길항제에 대한 후보물로서 사용될 수 있다. 추가로, 상기 항체는 본 발명의 단백질과 관련된 질환에 대한 항체 치료에 적용될 수 있다.
재조합 기술
이와 같이 수득된 모노클로날 항체는 또한 유전학적 가공 기술을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다 (문헌참조: 예를 들어, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD, 1990). 항체를 암호화하는 DNA는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포로부터 클로닝될 수 있고 적당한 벡터에 삽입될 수 있고 숙주 세포에 도입되어 재조합 항체를 제조할 수 있다. 본 발명은 또한 상기된 바와 같이 제조된 재조합 항체를 제공한다.
수득된 항체가 인체로 투여되어야 하는 경우 (항체 치료), 인간 항체 또는 인간화된 항체는 면역원성을 감소시키기 위해 바람직할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 유전자전이 동물은 단백질, 단백질 발현 세포 또는 이들의 용해물로부터 선택된 항원으로 면역화시킬 수 있다. 이어서 항체 생산 세포는 동물로부터 수거하고 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 수득하고 이로부터 단백질에 대한 인간 항체를 제조할 수 있다. 대안적으로, 항체를 생산하는 면역화된 림프구와 같은 면역 세포는 발암유전자에 의해 불멸화시킬 수 있고 모노클로날 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의해) 용이하게 분리되고 서열분석될 수 있다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터에 위치시킬 수 있고 이는 이어서 다른 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 세균에서 항체를 암호화하는 DNA의 재조합 발현에 대한 검토 문헌은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
상기된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 기술을 통해 유전학적으로 변형시켜 유전학적으로 가공된 항체를 제조할 수 있다. 유전학적으로 가공된 항체, 예를 들어, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체 및 이중 특이적 항체는, 예를 들어, 통상적인 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 상기 DNA는 이어서 예를 들어, 상동성 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열을 치환시킴에 의해(문헌참조: Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851) 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열 모두 또는 부분을 상기 면역글로불린 암호화 서열에 공유 결합시킴에 의해 변형시킬 수 있다. 상기 방식으로, 표적 항원의 결합 특이성을 갖는 유전학적으로 가공된 항체, 예를 들어, "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조할 수 있다.
"키메라 항체"를 제조하기 위해 개발된 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다[문헌참조: 예를 들어, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; and Takeda et al. (1984) Nature 314:452].
전형적으로 상기 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 항체의 불변 도메인으로 대체되거나 이들은 항체의 하나의 항원-조합 부위의 가변 도메인으로 대체되어 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-조합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 또 다른 항원-조합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 제조한다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결합 제제를 포함하는 것들을 포함하는 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디설파이드-교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함에 의해 작제될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
비-인간 항체를 인간화시키기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 여기에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트" 잔기로서 언급되고 이는 전형적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로 설치류 CDR들 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환시킴에 의해 문헌 (참조: Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))의 방법에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 키메라 항체 (미국 특허 번호 제4,816,567호)이고, 여기서, 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인 미만은 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되었다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 능히 일부 FR 잔기들이 설치류 항체내 유사 부위 기원의 잔기들에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제조하는데 사용되는 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "최상 피트" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝한다. 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열은 이어서 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (문헌참조: Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 여러 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌참조: Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Prestaetal., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).
항체가 항원 및 다른 선호적 생물학적 성질에 대해 고친화성을 보유하는 것으로 인간화되는 것이 추가로 중요하다. 상기 목표를 성취하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 가용하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보물 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태적 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 가용하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보물 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할의 분석, 즉, 이의 항원에 결합하는 후보물 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 상기 방식으로, FR 잔기들은 수용자 및 임포트 서열로부터 선택되고 조합하여 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 목적하는 항체 특성이 성취된다. 일반적으로, CDR 잔기들은 항원 결합에 영향을 주는데 직접적으로 및 대부분 실질적으로 관여한다.
대안적으로, 현재 내인성 면역글로불린 생산 부재하에, 면역화시, 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자전이 동물 (예를 들어, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제하는 것으로 보고되었다. 상기 생식선 돌연변이체 마우스에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지시 인간 항체를 생성시킨다. 문헌(예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993). Human antibodies can also be derived from phage-display libraries (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))을 참조한다.
본원에 기재된 항-글로보 H 및 항-SSEA-4 항체 (중쇄, 경쇄 또는 둘 다를 포함하는)를 암호화하는 임의의 핵산, 하나 이상의 핵산을 포함하는 발현 벡터와 같은 벡터 및 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-글로보 H 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-SSEA-4 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 있다. 다른 예에서, 상기 벡터는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이들의 발현은 단일 프로모터 또는 2개의 별도의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 또한, 예를 들어, 본 섹션에서 기재된 재조합 기술을 통해, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-글로보 H 및 항-SSEA-4 항체를 제조하기 위한 방법이 제공된다.
항체를 제조하기 위한 다른 기술
다른 양태에서, 완전한 인간 항체는 특이적 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 가공된 상업적으로 시판되는 마우스를 사용함에 의해 수득될 수 있다. 보다 목적하는 (예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 보다 강한 면역 반응을 생성하도록 디자인된 유전자전이 동물은 또한 인간화되거나 인간 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 기술의 예는 제조원 (Amgen, Inc. (Fremont, Calif.))의 XenomouseR TM 및 제조원 (Medarex, Inc. (Princeton, N.J.)) 기원의 HuMAb-MouseR TM 및 TC Mouse™이다. 또 다른 대안에서, 항체는 파아지 디스플레이 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [미국 특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455]을 참조한다. 대안적으로, 파아지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)을 사용하여 비면역화된 공여자 기원의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내 인간 항체 및 항체 단편을 제조할 수 있다.
온전한 항체 (완전한 길이의 항체)의 항원-결합 단편은 통상의 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자, 및 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴에 의해 생성될 수 있는 Fab 단편의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 항-글로보 H 및 항-SSEA-4 항체는 문헌 [참조: McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리 (예를 들어, 단일쇄 항체 파아지 라이브러리)로부터 분리될 수 있다. 후속적 공보는 쇄 셔플링 (문헌참조: Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 및 매우 큰 파아지 라이브러리 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))를 작제하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조를 기재하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 분리를 위한 통상적 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
본원에 기재된 바와 같이 수득된 항체는 균일하게 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체의 분리 및 정제는 일반 단백질에 대해 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 친화성 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 포커싱 및 기타 (항체: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)와 같은 칼럼 크로마토그래피의 적당히 선택되고 조합된 사용으로 분리되고 단리될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 상기된 바와 같이 수득된 항체의 농도는 흡광도 측정, 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 등에 의해 결정할 수 있다. 친화성을 제외한 예시적 크로마토그래피는, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡수 크로마토그래피 등을 포함한다 (문헌참조: Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 크로마토그래피 과정은 액상 크로마토그래피, 예를 들어, HPLC, FPLC에 의해 수행될 수 있다.
상기 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 한가지 방법은 항원이 결합하는 에피토프 또는 "에피토프 맵핑"을 동정하는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]에 기재된 바와 같이 항체-항원 복합체의 결정 구조를 해독하고, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정 및 합성 펩타이드 기반 검정을 포함하는, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 특성분석을 위한 당업계에 공지된 많은 방법이 있다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 에피토프는 즉, 단일 스트레치의 아미노산에 함유된 선형 에피토프 또는 단일 스트레치 (1차 구조 선형 서열)에 필연적으로 함유될 수 없는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이 (예를 들어, 적어도 4 내지 6개 아미노산 길이)의 펩타이드는 항체를 사용한 결합 검정에 대해 단리되거나 합성되고 (예를 들어, 재조합적으로) 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩타이드를 사용하고 항체에 의한 결합을 결정함에 의해 전신 스크리닝으로 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따라, 표적 항원을 암호화하는 개방 판독 프레임은 무작위로 또는 특이적 유전학적 작제에 의해 단편화되고 발현된 항원의 단편과 시험될 항체의 반응성이 결정된다. 유전자 단편들은, 예를 들어, PCR에 의해 제조될 수 있고 이어서 전사되고 방사능활성 아미노산의 존재하에 시험관내 단백질로 해독될 수 있다. 항체의 방사능활성적으로 표지된 항원 단편으로의 결합은 이어서 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파아지 입자 (파아지 라이브러리)의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩타이드 서열의 대형 라이브러리를 사용함에 의해 동정될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩타이드 단편의 한정된 라이브러리는 단순 결합 검정에서 시험 항체에 결합하기 위해 시험될 수 있다.
추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 에피토프 결합을 위해 요구되고, 충분하고/하거나 필요한 잔기를 동정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은 후보 항체에 대한 결합 에피토프에서 다양한 잔기들이 밀접하게 관련되지만 항원적으로 구분되는 단백질 (예를 들어, 뉴로트로핀 단백질 계열의 또 다른 구성원) 기원의 서열로 대체된(스와핑된) 표적 항원의 돌연변이체를 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이체 표적 단백질로의 항체의 결합을 평가함에 의해, 항체 결합에 대한 특정 항원 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
대안적으로, 경쟁 검정은 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 MC45 항체)를 사용하여 수행될 수 있다. 경쟁 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
예시적으로 적합한 일반 항체 제조 방법의 추가의 양상
동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에서 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편을 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다. 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자, 및 이의 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, scFv (단일쇄 항체), 및 dAb (도메인 항체; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544)를 포함한다.
본원에 기재된 조성물은 본 발명의 판독시 당업자에 의해 동정될 수 있는 추가의 활성제, 담체, 비히클, 부형제 또는 보조제와 함께 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있다.
약제학적 조성물은 바람직하게 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적 조성물에서, 본원에 개시된 조성물은 또한 "활성제"로서도 언급되는 "활성 화합물"을 형성한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여에 적격한 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물은 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적격하게 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피 (국소적), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용제 또는 현탁제는 하기의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 식염 용액, 비휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항세균제, 예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 이황화나트륨; 킬레이팅제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정제, 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰푸울, 1회용 시린지, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이엘에 봉입될 수 있다.
적어도 하나의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체 또는 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 양태에서, 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 결합하는 하나 이상의 항체 및/또는 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 결합하는 하나 이상의 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 널리 공지된 적합한 담체, 예를 들어, 완충제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
단리된 항체 및 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 특정 양태에서, 단리된 항체 및 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수하다.
하나의 양태에서, 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 모노클로날이다. 또 다른 양태에서, 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체의 단편 (예를 들어, Fab, Fab'-SH 및 F(ab')2 단편)이 제공된다. 이들 항체 단편들은 효소적 분해와 같은 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 항체 단편들은 키메라, 인간화된 또는 인간일 수 있다. 이들 단편들은 하기 제시된 진단학적 및 치료학적 목적을 위해 유용하다.
목적하는 항체가 수득될 수 있는 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 목적하는 항체를 생성하는 한가지 방법은 문헌 [참조: Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 기재된 바와 같은 파아지 항체 라이브러리의 사용을 통해서이다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위한 조합적 라이브러리를 사용함에 의해 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파아지를 함유하는 파아지 라이브러리를 스크리닝함에 의해 선택된다. 상기 파아지 라이브러리는 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고 따라서 라이브러리내 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서 상기 결합 클론은 항원으로부터 용출되고 항원 흡착/용출의 추가의 사이클에 의해 추가로 집적될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 목적하는 파아지 클론을 선별하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 디자인하고 이어서 문헌 [참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NTH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 목적하는 파아지 클론으로부터 Fv 서열 및 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 완전한 길이의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체 클론을 작제하여 수득될 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인은 약 110개 아미노산의 2개의 가변(V) 영역으로부터 형성되고 각각 하나는 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)로부터 기원하고 상기 경쇄 및 중쇄 둘 다는 3개의 초가변 루프 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 제공한다. 가변 도메인은 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서 파아지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있고, 여기서, VH 및 VL은 짧은 유연성 펩타이드를 통해 또는 Fab 단편으로서 공유 결합되고, 여기서, 이들은 각각 불변 도메인에 융합되고 문헌 [참조: Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 비-공유적으로 상호작용한다. 본원에 사용된 바와 같이, scFv 암호화 파아지 클론 및 Fab 암호화 파아지 클론은 총체적으로 "Fv 파아지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 언급된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에 무작위로 재조합될 수 있고 이는 이어서 문헌 [참조: Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 검색될 수 있다. 면역화된 공급원 기원의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 순수 레퍼토리는 문헌 [참조: Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같은 임의의 면역화 없이 광범위한 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 순수 라이브러리는 또한 줄기 세포 기원의 비정렬된 V-유전자 분절을 클로닝하고 문헌 [참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 고도로 가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재정렬을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있다.
필라멘트 파아지는 최소 코트 단백질 환제에 융합시킴에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 사용된다. 상기 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편으로서 디스플레이될 수 있고, 여기서, VH 및 VL 도메인은, 예를 들어, 문헌 [참조: Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 유연성 폴리펩타이드 스페이서에 의해, 또는 Fab 단편으로서 동일한 폴리펩타이드 쇄 상에 연결되고, 여기서, 하나의 쇄는 환제에 융합되고 다른 하나는 세균 숙주 세포 주변세포질로 분비되고 여기서, Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리는, 예를 들어, 문헌 [참조: Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이 야생형 코트 단백질 일부를 대체함에 의해 파아지 표면 상에 디스플레이된다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 암호화하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거된 면역 세포로부터 수득된다. 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 클론을 선호하여 편중된 라이브러리가 요구되는 경우, 상기 대상체는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H로 면역화시켜 항체 반응을 생성하고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구(PBL)는 라이브러리 작제를 위해 회수된다. 하나의 양태에서, 항-인간 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 클론을 선호하여 편중된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 기능성 인간 면역글로불린 유전자 어레이(및 기능성 내인성 항체 생산 시스템이 없는)를 갖는 유전자전이 마우스에서 항-인간 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체 반응을 생성시킴에 의해 수득되고 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 면역화는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 대한 인간 항체를 생성하는 B 세포를 유도한다. 인간 항체-생산 유전자전이 마우스의 생성은 하기에 기재되어 있다.
항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 반응성 세포 집단에 대한 추가의 집적은 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 단리하기 위한 적합한 스크리닝 과정을 사용함에 의해, 예를 들어, SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 친화성 크로마토그래피를 사용한 세포 분리 또는 세포의 플루오로크롬-표지된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H로의 흡착에 이어서 유동-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 수득될 수 있다.
대안적으로, 비면역화된 공여자 기원의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은, 가능한 항체 레퍼토리를 보다 우수하게 제공하고 또한 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용하는 항체 라이브러리의 작제를 허용한다. 시험관내 항체 유전자 작제물을 혼입한 라이브러리에 대해 줄기 세포는 비정렬된 항체 유전자 분절을 암호화하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 수거된다. 목적하는 면역 세포는 다양한 동물 종, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 루프린, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 조류 종 등으로부터 수득될 수 있다.
항체 가변 유전자 분절 (VH 및 VL 분절을 포함하는)을 암호화하는 핵산은 목적하는 세포로부터 회수되고 증폭된다. 재정렬된 VH 및 VLL 유전자 라이브러리의 경우에, 목적하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 분리함에 이어서 문헌 [참조: Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같이 재정렬된 VH 및 VL 유전자의 5' 말단 및 3' 말단과 매칭하는 프라이머와 함께 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 발현용의 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조하여 수득될 수 있다. V 유전자는 문헌 [참조: Orlandi et al. (1989) and in Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이 성숙한 V-도메인을 암호화하는 엑손의 5' 말단에서 역 프라이머 및 J-분절 내 기반을 둔 정배향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해, 역 프라이머는 또한 문헌 [참조: Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손 내 기반을 둘 수 있고 정배향 프라이머는 문헌 [참조: Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같은 불변 영역 내 기반을 둘 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 축퇴성은 문헌 [참조: Orlandi et al. (1989) or Sastry et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머에 혼입될 수 있다. 특정 양태에서, 라이브러리 다양성은, 예를 들어, 문헌 [참조: Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 기재된 바와 같이 또는 문헌 [참조: Oram et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 가용한 VH 및 VL 정렬을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 계열에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함에 의해 최대화된다. 증폭된 DNA의 발현 벡터로의 클로닝을 위해, 희귀 제한 부위는 문헌 [참조: Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같은 하나의 말단에 태그로서 또는 문헌 [참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그된 프라이머와 함께 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재정렬된 V 유전자들의 레퍼토리는 V 유전자 분절로부터 시험관내 유래될 수 있다. 인간 VH-유전자 분절의 대부분은 클로닝되고 서열분석되고 (문헌 (참조: Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)에 보고된 바와 같이)), 맵핑되고 (문헌 (참조: Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)에 보고된 바와 같이)); 이들 클로닝된 분절(H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태를 포함하는)을 사용하여 문헌 [참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 암호화하는 PCR 프라이머와 함께 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성할 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같은 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성과 함께 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 분절은 클로닝되고 서열 분석되었고 (문헌 (참조: Williams and Winter,Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)에 보고된 바와 같이)) 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 합성 V 유전자 레퍼토리는 VH 및 VL 폴드의 범위 및 L3 및 H3 길이 범위를 기반으로 하고 상당한 구조적 다양성의 항체를 암호화한다. V-유전자 암호화 DNA의 증폭 후, 생식선 V-유전자 분절은 문헌 [참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내 재정렬될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 다양한 방식으로 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 조합함에 의해 작제할 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터에 생성될 수 있고 예를 들어, 문헌 [참조: Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내 재조합된 벡터 또는 조합 감염에 의한 생체내 재조합된 벡터, 예를 들어, 문헌 [참조: Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에서 생성될 수 있다. 생체내 재조합 방법은 이. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기에 대한 한계를 극복하기 위해 Fab 단편의 2개 쇄 성질을 사용한다. 순수 VH 및 VL 레퍼토리는 별도로 클로닝되어 하나는 파아지미드에 클로닝되고 다른 하나는 파아지 벡터에 클로닝된다. 이어서 2개의 라이브러리는 파아지미드-함유 세균의 파아지 감염에 의해 조합되어 각각의 세포는 상이한 조합을 함유하고 라이브러리 크기는 단지 존재하는 세포의 수 (약 1012 클론)에 의해서만 제한된다. 2개의 벡터는 생체내 재조합 시그날을 함유하여 VH 및 VL 유전자들은 단일 레플리콘 상에 재조합되고 파아지 비리온으로 동시 팩키징된다. 이들 거대한 라이브러리는 양호한 친화성 (약 10-8 M의 Kd-1)의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
대안적으로, 상기 레퍼토리는 후속적으로 예를 들어, 문헌 [참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터에 클로닝될 수 있거나, 예를 들어, 문헌 [참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 어셈블리되고 이어서 클로닝된다. PCR 어셈블리를 또한 사용하여 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하도록 유연성 펩타이드 스페이서를 암호화하는 DNA와 VH 및 VL DNA를 연결할 수 있다. 또 다른 기술에서, "세포 PCR 어셈블리 내"에서는 문헌 [참조: Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 림프구 내에 VH 및 VL 유전자를 조합하고 이어서 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하기 위해 사용된다.
라이브러리의 스크리닝은 임의의 당업계 공지된 기술에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 표적을 사용하여 흡착 플레이트에 고정되거나 세포 분류에 사용되거나 스트렙타비딘-코팅된 비드를 사용한 포획을 위해 비오틴에 접합되거나 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 당업계 공지된 방법에 사용되는 숙주 세포 상에 발현되는 흡착 플레이트의 웰을 코팅시킬 수 있다.
파아지 라이브러리 샘플은 흡착제와 파아지 입자의 적어도 일부의 결합을 위해 적합한 조건하에서 고정화된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H와 접촉시킨다. 정상적으로 pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하기 위해 선택된다. 고체 상에 결합된 파아지를 세척하고 이어서 예를 들어, 문헌 [참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같은 산에 의해 또는 문헌 [참조: Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같은 알칼리에 의해 또는, 예를 들어, 문헌 [참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 과정에서 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파아지는 단일 라운드의 선택에서 약 20 내지 약 1,000배 집적될 수 있다. 더욱이, 집적된 파아지는 세균 배양에서 성장시키고 추가 라운드 선택에 적용될 수 있다.
선택의 효율은 세척 동안에 해리 역학 및 단일 파아지 상에 다중 항체 단편이 동시에 항원과 결합할 수 있는지를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 신속한 해리 역학 (및 약한 결합 친화성)을 갖는 항체는 고체 상에서 항원의 짧은 세척, 다가 파아지 디스플레이 및 높은 코팅 밀도를 사용하여 보유될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파아지를 안정화시키는 것 뿐만 아니라 해리된 파아지의 재결합을 호전시킨다. 느린 해리 역학 (및 우수한 결합 친화성)을 갖는 항체의 선택은 문헌 [참조: Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) 및 WO 92/09690]에 기재된 바와 같이 긴 세척 및 1가 파아지 디스플레이 및 문헌 [참조: Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용하여 촉진될 수 있다.
SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 대해, 상이한 친화성, 심지어 약간 상이한 친화성을 갖는 파아지 항체들 사이에서 선택할 수 있다. 그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 상기된 친화성 성숙화 기술 중 일부로 수행된 바와 같이)는 대부분 항원에 결합하고 소수는 보다 높은 친화성을 갖는 많은 돌연변이체를 유발할 가능성이 높다. SSEA-3/SSEA-4/글로보 H가 제한되면서, 희귀 고친화성 파아지는 경쟁에서 이길 수 있다. 모든 보다 높은 친화성 돌연변이체를 보유하기 위해, 파아지는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 대한 표적 몰 친화성 상수 보다 낮은 몰 농도에서 과량의 비오티닐화된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H와 또는 비오티닐화된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H로 항온처리될 수 있다. 고친화성-결합 파아지는 이어서 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 상기 "평형 포획"은 보다 낮은 친화성을 갖는 과량의 파아지로부터의 2배 높은 친화성 정도로 적게 돌연변이체 클론의 분리를 가능하게 하는 민감성과 함께 이들의 결합 친화성에 따라 항체가 선택되도록 한다. 고체 상에 결합된 파아지를 세척하는데 사용되는 조건은 또한 해리 역학을 기준으로 구분되도록 조작될 수 있다.
항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 클론은 선택된 활성일 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명은 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 리간드와 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 간의 결합을 차단하지만 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 리간드와 제2 단백질 간의 결합을 차단하지 않는 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 제공한다. 상기 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 섹션 B (I) (2)에 기재된 바와 같이 파아지 라이브러리로부터 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 클론을 분리하고 적합한 세균 숙주에서 집단을 성장시킴에 의해 단리된 파아지 클론 집단을 임의로 증폭시키고; (2) SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 및 차단 및 비-차단 활성이 각각 요구되는 제2 단백질을 선택하고; (3) 고정화된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 파아지 클론을 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 상기 제2 단백질의 결합 결정 인자와 중첩하거나 이와 공유되는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H-결합 결정인자를 인지하는 임의의 목적하지 않은 클론을 용출시키고; (5) 하기 단계 (4)에 따라 흡착된 채로 유지된 클론을 용출시킴에 의해 선택될 수 있다. 임의로, 목적하는 차단/비-차단 성질을 갖는 클론은 추가로 본원에 기재된 선택 과정을 1회 이상 반복함에 의해 집적될 수 있다.
본 발명의 Fv 클론을 암호화하는 DNA는 통상의 과정 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파아지 DNA 주형으로부터 목적하는 중쇄 및 경쇄 암호화 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용함에 의해)을 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석된다. 일단 단리된 경우, DNA는 발현 벡터에 위치할 수 있고 이는 이어서 이. 콜라이 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 면역글로불린 단백질을 달리 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 세균에서 항체-암호화 DNA의 재조합 발현에 대한 검토 문헌은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 암호화하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 암호화하는 공지된 DNA 서열 (예를 들어, 적당한 DNA 서열들은 상기 캐뱃 등으로부터 수득될 수 있다)과 조합하여 완전하거나 부분적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이소형의 불변 영역이 상기 목적을 위해 사용될 수 있고 상기 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 완전한 길이의 중쇄 및/또는 경쇄의 "하이브리드"에 대한 암호화 서열(들)을 형성하기 위해 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래되고 이어서 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되는 Fv 클론은 본원에 사용된 바와 같은 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 하나의 양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 모든 인간, 완전한 또는 부분적 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 암호화 서열(들)을 형성하기 위해 인간 불변 영역 DNA에 융합된다.
순수 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해 생성된 항체는 적당한 친화성 (약 106 내지 107 M-1의 Kd-1)일 수 있지만 친화성 성숙화는 또한 문헌 [참조: Winter et al. (1994), supra]에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의해 시험관내 모방될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 문헌 [참조: Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법에서 또는 문헌 [참조: Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 에러-경향(error-prone) 폴리머라제 (문헌(Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)에 보고된 바와 같은)를 사용함에 의해 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화성 성숙화는, 예를 들어, 선택된 개체 Fv 클론에서 목적하는 CDR에 걸쳐있는 무작위 서열 스패닝을 갖는 프라이머를 사용한 PCR을 사용하고 보다 높은 친화성 클론을 스크리닝하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시킴에 의해 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일자로 공개됨)는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위한 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이 유발을 유도하기 위한 방법을 기재하였다. 또 다른 효과적인 방법은 비면역화된 공여자로부터 수득된 천연 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 함께 파아지 디스플레이함에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고 문헌 [참조: Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회 라운드의 쇄 재셔플링에서 보다 높은 친화성을 스크리닝하는 것이다. 이러한 기술은 10-9M 범위의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편의 생성을 가능하게 한다.
항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 생산하기 위한 다른 방법
항체의 친화성을 생성하고 평가하는 다른 방법은 당업계에서 널리 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 [참조: Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); U.S. Pat. No. 4,816,567; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987; Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Engels et al., Agnew. Chem.Tnt. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다.
일반 방법
따라서, 본 발명의 하나의 양상은 글로보 H, SSEA3 및 SSEA-4를 3중 표적화하는 단리된 항체를 특징으로 한다. 상기 3중 표적화 항체는 특이적으로 Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (글로보 H 헥사사카라이드) 및 Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (SSEA-3 펜타사카라이드) 및 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (SSEA-4 헥사사카라이드)에 결합한다. 하나의 예에서, 3중 표적화 항체는 mAb 651이다.
본 발명의 또 다른 양상은 글로보 H 및 SSEA3을 2중 표적화하는 단리된 항체를 특징으로 한다. 2중 표적화 항체는 특이적으로 Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (글로보 H 헥사사카라이드) 및 Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (SSEA-3 펜타사카라이드)에 결합한다. 하나의 예에서, 2중 표적화 항체는 mAb 273이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 SSEA-4에 특이적인 단리된 항체를 특징으로 한다. 항-SSEA-4 항체는 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (SSEA-4 헥사사카라이드)에 결합한다. 일부 예에서, 상기 항체는 Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (SSEA-4 헥사사카라이드의 유사체)에 결합할 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 마우스 IgG3 (예를 들어, mAb MC-831-70)이 아니고, 상기 항체는 마우스 IgM (예를 들어, 항-RMl)이 아니다. 상기 항체의 예는 mAb 45 및 48을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양상은 SSEA-4 및 이의 단편에 특이적인 단리된 항체를 특징으로 한다. 항-SSEA-4 항체는 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (SSEA-4 헥사사카라이드) 및 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1 (SSEA-4 헥사사카라이드의 단편)에 결합한다. 일부 예에서, 상기 항체는 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 항체는 Neu5Gcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1 (SSEA-4 헥사사카라이드의 유사체)에 결합할 수 있다. 하나의 예에서, 항체는 mAb 46이다.
글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4를 3중 표적화하는 항체, 글로보 H 및 SSEA-3을 2중 표적화하는 항체, 및 항-SSEA-4 항체가 개발되었고 본원에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 항체는 치료제, 진단 또는 연구 도구로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상은 Fc 상에 단일의 균일한 N-글리칸을 포함하는 균일한 모노클로날 항체 집단의 조성에 관한 것이고, 여기서, 상기 구조물은 이펙터 세포 기능의 효능을 증진시키기 위해 최적화된 N-글리칸 구조물이다.
바람직한 양태에서, N-글리칸은 Fc 영역의 Asn-297에 부착되어 있다.
바람직한 양태에서, N-글리칸은 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2의 구조물로 이루어진다.
본원에 기재된 당항체는 시험관내 제조될 수 있다. 당항체는 Fc 당가공에 의해 생성될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 당항체는 포유동물 세포 배양에 의해 수득된 모노클로날 항체로부터 효소적으로 또는 화학효소적으로 가공된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 당항체의 Fc 영역은 상응하는 모노클로날 항체에서 야생형 Fc 영역에 비해 FcγRIIA 또는 FcγRIIIA에 대해 증가된 결합 친화성을 나타낸다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 당항체는 야생형 면역글로불린에 비해 증진된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 나타낸다.
일부 양태에서, 당항체는 인간 IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 모노클로날 항체는 인간화된, 인간 또는 키메라일 수 있다.
본원에 기재된 당항체는 암, 자가면역 장애, 염증 장애 또는 감염성 질환과 관련된 항원에 결합할 수 있다. 예시적 암 관련 항원은, 예를 들어, 글로보-H, SSEA-3, SSEA-4를 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본원에 기재된 항체는 글리칸 변이체 및 유도체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 글리칸의 환원 말단이 부재이거나 천연 (예를 들어, SSEA4 당지질) 또는 비-천연 (예를 들어, 글리칸 어레이를 제조하기 위한 또는 진단 목적용 접합을 위한 링커) 테일에 연결된다. 모든 이들 유도체는 항체에 의해 인지될 수 있다.
특정 진단학적 및 어레이 양태에서, 따라서 본 발명의 항체는 본원에 기재된 글리칸을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 이의 산화된 변이체를 검출할 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 상기 산화된 변이체로의 접합 생성물을 검출할 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명은 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1, 및 이의 산화된 변이체, 및 상기 산화된 변이체로의 접합 생성물, 및 이의 산화된 변이체, 및 상기 산화된 변이체로의 접합 생성물에 특이적으로 결합하는 단리된 인간화된 모노클로날 당항체를 제공하고; 여기서, 상기 산화된 변이체는 글리칸 1차 알콜의 카보닐로의 전환 생성물이고, 상기 접합 생성물은 카보닐의 1차 또는 2차 아민 잔기를 갖는 이민으로의 전환 생성물이다.
예를 들어, 1차 알콜을 포함하는 글리칸은 당업자에게 공지된 방법에 의해 산화된 변이체로 전환될 수 있다. 비제한적인 예로서, 갈락토스 상의 1차 알콜은 상기 글리칸을 산화제, 예를 들어, 나트륨 페리오데이트 (나트륨 m-페리오데이트) 또는 페리오데이트의 또 다른 염 (예를 들어, 칼륨, 암모늄, 망간, 리튬)과 접촉시킴에 의해 알데하이드로 전환될 수 있다. 글리칸 중에 하나 또는 다수의 당 잔기는 산화될 수 있다. 산화제의 농도는 물 또는 적합한 완충액 중에서 1 마이크로몰, 5 마이크로몰, 10 마이크로몰, 25 마이크로몰, 50 마이크로몰, 100 마이크로몰, 200 마이크로몰, 500 마이크로몰, 750 마이크로몰, 1 밀리몰, 5 밀리몰, 10 밀리몰, 25 밀리몰, 50 밀리몰, 100 밀리몰, 또는 500 밀리몰일 수 있다. 온도는 섭씨 5 내지 45 도, 바람직하게 섭씨 15 내지 40도, 보다 바람직하게 섭씨 35 내지 40도일 수 있다. 반응 시간은 10초 내지 20분, 바람직하게 30초 내지 10분일 수 있다. 적합한 완충액은 식염수, 포스페이트, CHES, MES, 보레이트, 아세테이트, 카보네이트, 포르메이트, 시트레이트, 옥살레이트를 포함하거나 배제할 수 있다. 바람직하게, 약 산성 완충액이 사용된다. 바람직하게, TRIS 또는 글라이신 또는 유리 당은 반응에서 경쟁하기 때문에 이들이 없는 완충액이 사용된다. 상기 전환은 당업자에게 공지된 방법에 의한 투석 또는 원심분리 투석에 의해 정제될 수 있다.
접합 생성물은 당업자에게 공지되고 문헌 [참조: G. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3rd　Ed., ISBN: 978-0-12-382239-0, Academic Press, 2013, 본원에 참조로 인용된다)에 기재된 방법에 의해 산화된 생성물과 적당한 아민, 하이드라진, 하이드라지드 또는 옥소-아민의 반응으로부터 형성될 수 있다. 비-제한 예로서, 예시적 아민은 글리칸을 글리칸 내 갈락토스의 페리오데이트-산화된 1차 알콜로부터 형성된 단일 알데하이드 기능성 그룹과 반응될 수 있다. 순수(net) 생성물은 이민이다. 상기 이민은 임의로, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 시아노보로하이드라이드 환원에 의해 알콜로 추가로 환원되어 가수분해에 대해 보다 안정한 접합 생성물을 형성할 수 있다. 일부 양상에서, 아민, 하이드라진, 하이드라지드, 또는 옥소-아민은 어레이, 리포터 분자 또는 접합 생성물의 추가의 변형을 위한 비오틴에 추가로 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 양상에서, 상기 리포터 분자는 형광성 분자일 수 있다. 일부 양상에서, 리포터 분자는 방사능표지된 분자일 수 있다. 일부 양상에서, 리포터 분자는 특유의 스펙트럼 특성 (예를 들어, IR 스펙트럼, 라만 스펙트럼, 또는 NMR 스펙트럼)을 갖는 분자일 수 있다. 일부 양상에서, 상기 어레이는 고체 표면, 화학적으로 변형된 표면, 중합체-코팅된 표면, 비드, 겔, 입자 또는 나노입자일 수 있다. 일부 양상에서, 상기 나노입자는 형광성일 수 있거나 광발광성을 나타낼 수 있다. 일부 양상에서, 상기 접합 생성물은 카보닐의 1차 또는 2차 아민 잔기를 갖는 이민으로의 전환 생성물일 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 친화성-성숙화된 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 제공한다. 이들 항체는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 대해 증가된 친화성 및 특이성을 갖는다. 친화성 및 민감성에서 이러한 증가는 본 발명의 분자가 (a) 본 발명의 분자의 증가된 민감성 및/또는 (b) 본 발명의 분자에 의한 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H의 단단한 결합에 의해 이득이 되는 응용 및 방법을 위해 사용되도록 한다.
하나의 양상에서, SSEA4/SSEA3/글로보 H는 암 세포 및 암 줄기 세포에 대해 특이적으로 발현되는 3개의 글리칸이다. 이들 3개의 당지질의 합성을 위한 주요 효소인 베타-3-GalT5의 녹다운은 암 세포의 아폽토시스를 유발하지만 정상적인 세포의 아폽토시스를 유발하지 않는다. 항체, 특히 우선적으로 또는 특이적으로 SSEA4에 대해 및/또는 동시에 SSEA3/SSEA4/글로보 H에 대한 당항체는 효과적인 암 치료제이다. 또 다른 양태에서, 3개의 글리칸, SSEA4/SSEA3/글로보 H, 특히 SSEA3은 암 줄기 세포 마커로서 유용하다.
하나의 양상에서, SSEA4 및/또는 조합된 SSEA4/SSEA3/글로보 H는 상이한 암의 치료를 위한 치료학적 표적으로서 유용하고, 상기 암은, 예를 들어, 뇌암, 폐암, 유방암, 경구암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 골암 (골육종), 피부암, 자궁암, 난소암 및 전립선암을 포함한다.
하나의 양태에서, 이들 예시적 암 유형의 세포 표면 상에서 발현된 SSEA4에 대한 인간 또는 인간화된 치료학적 항체가 제공된다.
또 다른 양태에서, 이들 예시적 암 유형의 세포 표면 상에서 동시에 발현된 SSEA3/SSEA4/글로보 H에 대한 인간 또는 인간화된 치료학적 항체가 제공된다.
추가로, 본 발명은 또한 글로보 계열 글리코스핑고지질 합성을 조절하기 위해 유용한 항체 및/또는 결합 단편 생성을 유발할 수 있는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 관련된 에피토프 (천연 및 변형된)를 표적화하는 면역원성 접합체 조성물에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 과증식성 질환 및/또는 병태의 치료 또는 검출을 위해 본원에 기재된 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 활성의 부분적 또는 전체 차단이 요구되는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H-매개된 장애의 치료를 위해 유용하다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 암을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 질량 분광측정기 또는 유전학적 조작이 필요 없이 샌드위치 검정, 면역침전, ELISA 또는 면역현미경과 같은 면역검정에서 에피토프의 민감하고 특이적인 검출을 가능하게 한다. 결국, 이것은 이들 경로의 정상적 기능을 관찰하고 설명하며 경로가 비정상적으로 기능하는 경우 검출하는데 상당한 이점을 제공한다.
본 발명의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 또한 사용하여 질환의 발달 및 발병에서의 역할을 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기된 바와 같이, 본 발명의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 사용하여 하나 이상의 질환 상태와 상호관련될 수 있는 TACA가 정상적으로 일시적으로 발현되는지를 결정할 수 있다.
본 발명의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체가 특이적이지 않은 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H의 정상 활성을 방해하는 것 없이 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H가 비정상적으로 조절되거나 비정상적으로 기능하는 질환을 치료하기 위해 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 다양한 세포 유형 및 조직에서 암 상태의 검출을 위한 시약으로서의 용도를 모색한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 본 발명의 대상 항체의 것들과 유사한 차단 활성 패턴을 갖는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 길항제의 개발을 위해 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 사용하여 동일한 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 결합 특성 및/또는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H-경로를 차단하는 능력을 갖는 다른 항체를 결정하고 동정할 수 있다.
추가의 예로서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 사용하여 선형 및 형태적 에피토프를 포함하는 본원에 예시된 항체와 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H의 동일한 항원성 결정인자(들)에 실질적으로 결합하는 다른 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체를 동정할 수 있다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H가, 항체가 하는 바와 같이 하나 이상의 결합 파트너의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H로의 결합을 차단하는데 유사한 약리학적 효과를 나타내는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H의 소분자 길항제를 스크리닝하기 위해 포함되는 생리학적 경로를 기준으로 하는 검정에 사용될 수 있다.
항체의 생성은 하이브리도마 기술 및 결합제 분자의 파아지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝과 같이 본원에 기재된 것들을 포함하는 당업계의 통상적 기술을 사용하여 성취될 수 있다. 이들 방법은 당업계에서 널리 확립되어 있다.
간략하게, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위한 조합적 라이브러리를 사용함에 의해 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파아지를 함유하는 파아지 라이브러리를 스크리닝함에 의해 선택된다. 상기 파아지 라이브러리는 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고 따라서 라이브러리에서 비-결합 클론으로부터 분리된다. 결합 클론은 이어서 항원으로부터 용출되고 항원 흡착/용출의 추가의 사이클에 의해 추가로 집적될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 목적하는 파아지 클론을 선택하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 디자인함에 이어서 문헌 [참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 목적하는 파아지 클론 및 적합한 불변 영역 (Fc) 서열 기원의 Fv 서열을 사용하여 완전한 길이의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체 클론을 작제하여 수득될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 모노클로날이다. 또한 본원에 제공된 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편, 및 이의 변이체와 같은 항체 단편이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 항체 단편들은 효소적 분해와 같은 통상적 수단에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 항체 단편들은 키메라, 인간 또는 인간화된 것일 수 있다. 이들 단편들은 본원에 제시된 실험적, 진단학적 및 치료학적 목적을 위해 유용하다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득될 수 있고, 즉, 개별 항체 함유 집단은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형어구 "모노클로날"은 구분되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 지적한다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 모노클로날 항체는 문헌 [참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기재된 제1 하이브리도마 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있거나 대안적으로 이들은 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 이를 암호화하는 핵산이 단리되고 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 항체를 암호화하는 DNA는 용이하게 단리되고 통상적인 과정 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자들에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의해)을 사용하여 서열분석된다. 많은 벡터가 가용하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용될 숙주 세포에 의존한다. 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 (일반적으로 포유동물) 기원의 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이소형의 불변 영역이 상기 목적을 위해 사용될 수 있고 상기 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있는 것으로 인지된다.
원핵 숙주 세포를 사용한 항체 생성
벡터 작제
본 발명의 항체의 폴리펩타이드 성분들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생산 세포로부터 단리되고 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 원핵세포 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 당업계에서 가용하고 공지된 많은 벡터들은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적당한 벡터의 선택은 주로 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 특정 숙주 세포로 삽입될 핵산의 크기에 의존한다. 각각의 벡터는 이의 기능 (이종성 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현 또는 둘 다) 및 이것이 잔류하는 특정 숙주 세포와의 적격성에 의존하여 다양한 성분들을 함유한다. 상기 벡터 성분들은 일반적으로 복제 오리진, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 시그날 서열, 이종성 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 적격할 수 있는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 숙주와 연계하여 사용된다. 상기 벡터는 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열 뿐만 아니라 복제 부위를 갖고 있다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 앰피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 내성을 암호화하는 유전자를 함유하고 따라서 형질전환된 세포를 동정하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파아지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 문헌 [참조: Carter et al., 미국 특허 제5,648,237호]에 상세히 기재되어 있다.
추가로, 숙주 미생물과 적격할 수 있는 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파아지 벡터는 이들 숙주와 연계하여 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEM™-11과 같은 박테리오파아지는 이. 콜라이 LE392와 같은 민감성 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있고 이는 각각 폴리펩타이드 성분들을 암호화한다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론의 업스트림 (5')에 위치한 비해독되는 조절 서열이다. 원핵세포 프로모터는 전형적으로 2개의 부류, 유도성 및 항상성에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 변화, 예를 들어, 영양물의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 응답하여 이의 제어하에 증가된 수준의 시스트론 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 다수의 프로모터는 널리 공지되어있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터에 삽입함에 의해 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동적으로 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터 둘 다를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 양태에서, 이종성 프로모터는 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교하여 보다 큰 전사 및 발현된 표적 유전자의 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 사용된다.
원핵세포 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능하는 다른 프로모터 (예를 들어, 다른 공지된 세균 또는 파아지 프로모터)가 또한 적합하다. 이들의 뉴클레오타이드 서열은 공개되었고 당업자는 이들을 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하도록 링커 또는 어댑터를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄 (문헌참조: Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269)를 암호화하는 시스트론에 작동적으로 연결시킬 수 있도록 한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 재조합 벡터 내 각각의 시스트론은 막을 거쳐 발현된 폴리펩타이드의 전좌를 지시하는 분비 시그날 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 상기 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 이것은 벡터로 삽입되는 표적 폴리펩타이드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 가공되는 (즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 하나이어야 한다. 이종성 폴리펩타이드에 고유한 시그날 서열을 인지하지 않고 소유하지 않는 원핵 숙주 세포에 대해, 상기 시그날 서열은, 예를 들어, 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원핵 세포 시그날 서열로 대체된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 발현 시스템의 양 시스트론에 사용되는 시그날 서열은 STII 시그날 서열 또는 이의 변이체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고 따라서 각각의 시스트론 내에 분비 시그날 서열의 존재를 요구하지 않는다. 그와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 세포질내 기능성 면역글로불린을 형성하기 위해 발현되고 폴딩되고 어셈블리된다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB-균주)는 디설파이드 결합 형성을 위해 호전적일 수 있는 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유니트의 적당한 폴딩 및 어셈블리를 가능하게 한다 (문헌참조: Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
본 발명의 항체는 또한 발현된 폴리펩타이드 성분의 정량 비율이 본 발명의 분비되고 적당히 어셈블리된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조절될 수 있는 발현 시스템을 사용함에 의해 생산될 수 있다. 상기 조절은 적어도 부분적으로 폴리펩타이드 성분에 대한 해독 강도를 동시에 조절함에 의해 성취된다.
해독 강도를 조절하기 위한 한가지 기술은 문헌 [참조: Simmons et al., 미국 특허 제5,840,523호]에 기재되어 있다. 이것은 시스트론내 해독 개시 영역 (TIR)의 변이체를 사용한다. 소정의 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 일정 범위의 해독 강도와 함께 제조될 수 있고 이에 의해 특정 쇄의 목적하는 발현 수준에 대해 상기 인자를 보정하는 간편한 수단을 제공한다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변형시킬 수 있는 코돈 변화를 유도하는 통상적인 돌연변이유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 양태에서, 뉴클레오타이드 서열의 변화는 사일런트하다. TIR에서의 변화는, 예를 들어, 시그날 서열에서의 변화와 함께 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격에서의 변화를 포함할 수 있다. 돌연변이 시그날 서열을 생성시키기 위한 한가지 방법은 시그날 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는(즉, 변화는 사일런트하다) 암호화 서열의 개시부에 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이것은 각각의 코돈의 3번째 뉴클레오타이드 위치를 변화시킴에 의해 성취될 수 있고; 추가로, 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 뱅크를 제조하는데 복잡성을 부가할 수 있는 다중의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 이러한 돌연변이유발 방법은 문헌 [참조: Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 벡터 세트는 여기에 각각의 시스트론에 일정 범위의 TIR 강도와 함께 생성된다. 이러한 제한된 세트는 다양한 TIR 강도 조합하에 목적하는 항체 생성물의 수율 뿐만 아니라 각각의 쇄의 발현 수준의 비교를 제공한다. TIR 강도는 문헌 [참조: Simmons et al. 미국 특허 제5,840,523호]에 상세히 기재된 바와 같은 리포터 유전자의 발현 수준을 정량함에 의해 결정될 수 있다. 해독 강도 비교를 기준으로, 목적하는 개별 TIR은 본 발명의 발현 벡터 작제물에서 조합되도록 선택된다.
본 발명의 항체를 발현시키는데 적합한 원핵 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 아키박테리아 (Archaebacteria) 및 유박테리아 (Eubacteria)를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에스케리치아 (Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 바실리 (Bacilli) (예를 들어, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 슈도모나스 계열 (예를 들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 쉬겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코커스 (Paracoccus)를 포함한다. 하나의 양태에서, 그람-음성 세포를 사용한다. 하나의 양태에서, 이. 콜라이 세포는 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 균주 W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) 및 이의 유도체를 포함하고 이는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompΤΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 제5,639,635호)를 갖는 균주 33D3을 포함한다. 다른 균주 및 이의 유도체, 예를 들어, 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 λ1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이들 실시예는 제한이기 보다는 설명을 위한 것이다. 한정된 유전자형을 갖는 상기 언급된 임의의 세균의 유도체를 작제하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [참조: Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 세균 세포에서 레플리콘의 복제성을 고려하여 적당한 세균을 선택할 필요가 있다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하기 위해 사용되는 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야만 하고 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게 세포 배양에 혼입될 수 있다.
항체 생산
숙주 세포는 상기된 발현 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
형질전환은 원핵세포 숙주로 DNA를 도입하여 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 된 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 의존하여, 형질전환은 상기 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리는 일반적으로 실질적 세포-벽 배리어를 함유하는 세균 세포에 대해 사용된다. 형질전환을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당업계에 공지된 배지에서 성장시키고 선택된 숙주 세포의 배양을 위해 적합하다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로쓰 (LB) 필요한 영양 보충물을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해 발현 벡터의 작제물을 기준으로 선택되는 선택 제제를 함유한다. 예를 들어, 앰피실린은 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 뿐만 아니라 임의의 필요한 보충물은 또한 단독으로 도입되거나 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 적당한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장을 위해, 예를 들어, 성장은 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 및 약 30 ℃를 포함하지만 이에 제한되지 않는 온도 범위에서 수행한다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 의존하여 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이를 위해, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0일 수 있다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에서 유도된다. 본 발명의 하나의 양상에서, PhoA 프로모터는 폴리펩타이드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지에서 배양한다. 하나의 양태에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (문헌참조: 예를 들어, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). 다양한 다른 유도제가, 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩타이드는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 일반적으로 삼투압 쇼크, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 전형적으로 미생물을 파쇄시킴을 포함한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 파쇄물 또는 전체 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지로 수송되고 여기에서 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있고 배양 상등액을 여과하고 생산된 단백질의 추가의 정제를 위해 농축시킨다. 상기 발현된 폴리펩타이드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리되고 동정될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식(fed-batch) 발효 과정이 재조합 단백질의 생산을 위해 가용하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 예를 들어 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양소, 특히 글루코스 (통상의 탄소/에너지원)를 분포시키기 위해 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 볼륨 용량이 대략 100 리터 이하이고 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있는 발효기에서의 발효를 언급한다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포가, 이 단계에서 세포가 초기 성장 정지 상태로 있는 목적하는 밀도에 대한 적합한 조건, 예를 들어, 약 180 내지 220의 OD550에서 성장된 후 개시된다. 다양한 유도제는 당업계에 공지되고 상기된 바와 같이, 사용된 벡터 작제물에 따라 사용될 수 있다. 세포는 유도 전 짧은 기간 동안 성장할 수 있다. 세포는 일반적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도되지만 보다 길거나 짧은 유도 시간이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩타이드의 적당한 어셈블리 및 폴딩을 개선하기 위해, 예를 들어, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (차페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 차페론 단백질을 과발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시 형질전환시킬 수 있다. 차페론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산되는 이종성 단백질의 적당한 폴딩 및 가용성을 촉진시키는 것으로 입증되었다 (문헌참조: Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al., 미국 특허 제6,083,715호; Georgiou et al, 미국 특허 제6,027,888호; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210).
발현된 이종성 단백질 (특히 단백질분해에 민감한 것들)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이의 배합물과 같은 공지된 세균 프로테아제를 암호화하는 유전자에서 유전학적 돌연변이(들)를 수행하기 위해 변형시킬 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 가용하고 예를 들어, 문헌 [참조: Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al, 미국 특허 제5,264,365호; Georgiou et al., 미국 특허 제5,508,192호; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 단백질분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 차페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주는 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
항체 정제
하나의 양태에서, 본원에서 생산된 항체 단백질은 추가의 검정 및 사용을 위해 실질적으로 균일성인 제제를 수득하기 위해 추가로 정제된다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 하기의 과정들은 적합한 정제 과정들을 예시한다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과.
하나의 양상에서, 고체 상에 고정화된 단백질 A는 본 발명의 항체 생성물의 면역친화성 정제를 위해 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화성으로 결합하는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureas) 기원의 41 kD 세포벽 단백질이다 (문헌참조: Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). 단백질 A가 고정화된 고체 상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼 또는 제어된 공극 유리 칼럼 또는 규산 칼럼일 수 있다. 일부 적용에서, 상기 칼럼은 가능하게는 오염물의 비특이적 부착을 차단하기 위해 글리세롤과 같은 시약으로 코팅된다.
정제의 제1 단계로서, 상기된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제제는 단백질 A 고정화된 고체 상으로 적용하여 목적하는 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하도록 한다. 고체 상은 이어서 세척하여 고체 상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로 목적하는 항체는 용출에 의해 고체 상으로부터 회수한다.
진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생산
벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 시그날 서열. 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 증진제 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 시그날 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 시그날 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 목적하는 폴리펩타이드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 일반적으로 선택된 이종성 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 가공되는 (즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 시그날이 가용하다.
상기 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임내 항체를 암호화하는 DNA로 연결된다.
(ii) 복제 오리진
일반적으로, 복제 오리진 성분은 포유동물 발현 벡터를 위해 요구되지 않는다. 예를 들어, SV40 오리진은 전형적으로, 단지 이것이 어얼리 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.
(iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택성 마커로서도 호칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나 (b) 경우에 따라 영양요구성 결핍을 보충하거나 (c) 복합 배지로부터 가용하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 암호화한다.
선택 계획의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용하는 것이다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고 따라서 선택 용법에서 생존한다. 상기 우성 선택의 예는 약물로서 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용하는 것이다.
포유동물 세포에 대해 적합한 선택가능한 마커의 또 다른 예는 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등과 같이 항체 핵산을 취득하기 위해 적격인 세포의 동정을 가능하게 하는 것들이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함에 의해 동정될 수 있다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적당한 숙주 세포는, 예를 들어, DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)를 포함한다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)가 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어, 가나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택가능한 마커에 대한 선택 제제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다 [문헌참조: 미국 특허 제4,965,199호].
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인지되고 목적하는 폴리펩타이드 (예를 들어, 항체)를 암호화하는 핵산으로 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵 세포에 대해 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자들의 전사 개시로부터 70 내지 80개 염기 업스트림에서 밝혀진 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는 암호화 서열의 3' 말단으로 폴리 A 테일의 부가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열들은 진핵세포 발현 벡터로 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 항체 폴리펩타이드 전사는, 예를 들어, 상기 프로모터가 숙주 세포 시스템과 적격인 경우 폴리오마 바이러스, 파울폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 어얼리 및 레이트 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 오리진을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 이메디에이트 어얼리 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 문헌 [참조: 미국 특허제4,419,446호]에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 문헌 [참조: 미국 특허 제4,601,978호]에 기재되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 전사는 흔히 인핸서 서열을 벡터에 삽입함에 의해 증가될 수 있다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로, 당업자는 진핵 세포 바이러스 기원의 인핸서를 사용한다. 이의 예는 복제 오리진의 레이트 측면 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인핸서, 복제 오리진 레이트 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵 세포 프로모터의 활성화를 위한 증진 요소들에 대해 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 상기 인핸서는 항체 펩타이드-암호화 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 또한 전사 종결을 위해 필요하고 mRNA를 안정화시키기 위해 필요한 서열을 함유한다. 상기 서열은 통상적으로 진핵 세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비해독 영역인 5' 및 때로는 3'로부터 가용하다. 이들 영역은 항체를 암호화하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오타이드 분절을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 문헌 [W094/11026] 및 본원에 기재된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터 내 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함하고, 이는 척추동물 숙주 세포를 포함한다. 배양 중 척추동물 세포의 증식 (조직 배양)은 일상적인 과정이 되어버렸다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 몽키 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 증식을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (mouse sertoli cells) (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 몽키 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리칸 그린 몽키 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 상기된 항체 생산용 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma)), RPMI-1640 (Sigma), 및 듈베코 변형된 이글스 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판되는 배지가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 추가로, 문헌 [참조: Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985]에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 임의의 배지에는 필요한 만큼 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오타이드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 GENTAMYCIN™ 약물), 미량 성분 요소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의되는), 및 글루코스 또는 등가 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고 당업자에게 자명하다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내에서 생산되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 제1 단계로서 세포내에서 생산되는 경우, 미립자 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편들은 일반적으로 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액은 일반적으로 먼저, 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유니트를 사용하여 농축된다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 이전의 단계에 포함될 수 있고 항생제는 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고 친화성 크로마토그래피는 일반적으로 허용되는 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A와 같은 친화성 시약의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌참조: Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ 3을 위해 추천된다 (문헌참조: Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔하게 아가로스이지만 다른 매트릭스가 가용하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 성취될 수 있는 것 보다 신속한 유동 속도 및 보다 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제를 위해 유용하다. 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 헤파린 SEPHAROSE™ 크로마토그래피 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술이 또한 회수될 항체에 의존하여 가용하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 경우에 따라, 예를 들어, 일반적으로 저염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 약 2.5 내지 4.5 사이의 pH에서 용출 완충액을 사용한 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 기술 및 방법은 당업계에 널리 확립되어 있는 것으로 주지되어야 하고 이는 상기된 바와 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대해 당업자에 의해 적정한 것으로 간주된다.
활성 검정
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대해 특징 분석될 수 있다.
정제된 항체는 N-말단 서열 분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광측정기, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 분해를 포함하지만 이에 제한되지 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특징 분석될 수 있다.
필요한 경우, 항체는 이들의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 이들의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 당업계에 공지되고 본원에 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 제한 없이 웨스턴 블롯, 방사선면역검정, ELISA (효소 결합된 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정, 화학발광 면역검정, 나노입자 면역검정, 아프타머 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 임의의 적접적 또는 경쟁적 결합 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서, 전체 항체 보다는 항체 단편을 사용하는 이점이 있다. 보다 작은 크기의 단편들은 신속한 제거를 가능하게 하고 고형 종양으로의 개선된 접근을 유도할 수 있다.
항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 통상적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질 분해를 통해 유래하였다 (문헌참조: 예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어 대량의 상기 단편들의 용이한 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌참조: Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 또 다른 방법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 살비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 자명하다. 다른 양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 문헌 [WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호]을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 온전한 조합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안에 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생산하도록 작제될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra]을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편들은 단일특이적 또는 이특이적일 수 있다.
인간화된 항체
본 발명은 인간화된 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 비-인간의 공급원으로부터 여기에 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트" 잔기로서 언급되고 이는 전형적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 필수적으로 문헌 [참조: Winter and co-workers (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536)]의 방법에 따라 초가변 영역 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체함에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이고 여기서, 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인 일부가 비-인간 종 기원의 상응하는 서열에 의해 대체되어 있다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위 기원의 잔기들에 의해 대체되어 있는 전형적 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제조하는데 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 중요할 수 있다. 소위 "베스트-피트 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류 서열에 가장 밀접한 인간 서열은 이어서 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크로서 수용된다 (문헌참조: Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 여러 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌참조: Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151: 2623).
항체가 항원에 대해 높은 친화성을 보유하고 다른 유리한 생물학적 성질을 보유하도록 인간화되는 것이 추가로 일반적으로 요구될 수 있다. 이러한 목적을 성취하기 위해, 하나의 방법에 따라, 인간화된 항체는 모 서열, 및 모 서열과 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념적 인간화된 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 가용하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태적 구조를 도해하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 가용하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할의 분석, 즉, 이의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기들의 분석을 가능하게 한다. 상기 방식으로, FR 잔기들은 수용자 및 임포트 서열로부터 선택되고 조합될 수 있어 목적하는 항체 특성, 예를 들어, 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화성을 성취된다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
본 발명의 인간 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는, 인간-유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함에 의해 작제될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는, 예를 들어, 문헌 [참조: Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되어 있다.
현재, 면역화시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자전이 동물 (예를 들어, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제시키는 것으로 보고되었다. 상기 생식선 돌연변이 마우스에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지시 인간 항체의 생산을 유도한다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)]을 참조한다.
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어, 설치류, 항체로부터 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있고, 여기서, 상기 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅"으로도 불리우는 상기 방법에 따라서, 상기된 바와 같은 파아지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 인간 V 도메인 유전자 레퍼토리로 대체되어 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성시킨다. 항원과의 선택은 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab의 단리를 유도하고 여기서, 상기 인간 쇄는 1차 파아지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시 파괴된 항원 결합 부위를 복구하고, 즉 에피토프는 인간 쇄 파트너의 선택을 지배한다 (임프린트). 상기 공정이 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 반복되는 경우, 인간 항체가 수득된다[문헌참조: 1993년 4월 1일자로 공개된 PCT WO 93/06213]. CDR 그래프팅에 의한 비-인간 항체의 통상적 인간화같지 않게, 상기 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전한 인간 항체를 제공한다.
이특이적 항체
이특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원들에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 양태에서, 이특이적 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 특정 양태에서, 결합 특이성 중 하나는 특이적 라이신 연결을 포함하는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 양태에서, 이특이적 항체는 2개의 상이한 라이신 연결을 갖는 2개의 상이한 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 결합할 수 있다. 이특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현을 기초로 하고, 여기서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌참조: Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고 이중에서 유일한 하나가 올바른 이특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된 올바른 분자의 정제는 오히려 복잡하고 생성물 수율은 낮다. 유사한 과정은 문헌 [참조: WO 93/08829 published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 기재되어 있다.
상이한 양태에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합체는, 예를 들어, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 특정 양태에서, 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CHI)은 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고 적합한 숙주 유기체 내로 동시 형질감염된다. 이것은 작제에 사용되는 3개의 폴리펩타이드 쇄의 불균등 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우의 양태에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄의 발현이 고수율을 유도하거나 상기 비율이 특정 유의성을 갖지 않는 경우 하나의 발현 벡터에서 2개 또는 모든 3개의 폴리펩타이드 쇄를 위해 암호화 서열을 삽입할 수 있다.
상기 방법의 하나의 양태에서, 이특이적 항체는 하나의 아암에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 구성된다. 상기 비대칭 구조는 이특이적 분자의 단지 절반에서 면역글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이특이적 화합물의 분리를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 방법은 문헌 [참조: WO 94/04690]에 기재되어 있다. 이특이적 항체를 생성시키는 추가의 세부 사항에 대해 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 방법에 따라, 항체 분자의 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 %를 최대화하기 위해 가공될 수 있다. 상기 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 대형 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공간"은 대형 아미노산 측쇄를 보다 작은 하나(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함에 의해 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물 이상으로 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이특이적 항체는 가교결합되거나 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 중 항체의 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포로 표적화하기 위해 제안되었고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 제안되었다 (WO 91/00360, WO 92/00373, 및 EP 03089). 이종접합체 항체는 임의의 간편한 가교결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 널리 공지되어 있고 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 이다.
항체 단편으로부터 이특이적 항체를 생성시키기 위한 기술은 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌 [참조: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 온전한 항체가 F(ab')2 단편을 생성시키기 위해 단백질분해적으로 절단되는 과정을 기재한다. 이들 단편들은 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 차단하기 위해 디티올 착화제 아비산 나트륨의 존재하에 환원시킨다. 생성된 Fab' 단편들은 이어서 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 이특이적 항체를 형성하기 위해 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합한다. 생성된 이특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
최근 진행은 이특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있는 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 촉진시켰다. 문헌 [참조: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각각의 Fab' 단편은 별도로 이. 콜라이로부터 분비되었고 이특이적 항체를 형성하기 위해 시험관내 직접적인 화학적 커플링에 적용하였다. 이와 같이 형성된 이특이적 항체는 인간 유방 종양 표적에 대해 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 뿐만 아니라 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이특이적 항체 단편을 제조하고 단리시키기 위한 다양한 기술은 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 이특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산하였다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]을 참조한다. Fos 및 Jun 단백질로부터 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 상기 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성하고 이어서 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산을 위해 사용될 수 있다. 문헌 [참조: The "diabody" technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 메카니즘을 제공하였다. 상기 단편은 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 간에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 형성하도록 하였다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함에 의해 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략은 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 3특이적 항체가 제조될 수 있다 [문헌참조: Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는, 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 동화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위 (예를 들어, 4가 항체)를 갖는 다가 항체 (이는 IgM 부류와는 다른)일 수 있고 이는 항체의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상이 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 이량체화 도메인은, 예를 들어, Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이루어진다). 상기 시나리오에서, 상기 항체는 Fc 영역에 대한 아미노-말단에 Fc 영역 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 다가 항체는, 예를 들어, 3개 내지 약 8개, 또는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩타이드 쇄(예를 들어, 2개의 폴리펩타이드 쇄)를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있고, 여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩타이드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 쇄(들)는 다음을 포함할 수 있다: VH-CH1-유연성 링커-VH-CHl-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본원에서 다가 항체는 적어도 2개 (예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2 내지 약 8개 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 여기서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다. 항체 변이체
일부 양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오타이드 변화를 항체 핵산으로 도입함에 의해 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 상기 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기들로부터 결실, 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 이르도록 만들어질 수 있고 단, 최종 작제물은 목적하는 특성을 갖는다. 아미노산 변형은 서열이 만들어진 시점에서 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발을 위해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 동정을 위해 유용한 방법은 문헌 [참조: Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들 그룹은 동정되고 (예를 들어, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu와 같은 하전된 잔기들) 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미치는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 상기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 상기 아미노산 위치는 이어서 추가로 또는 다른 변이체를 치환 부위에서 또는 상기 부위에 대해 도입함에 의해 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위를 미리 결정하지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 수행능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발은 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고 발현된 면역글로불린은 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기들의 내부서열 삽입 뿐만 아니라 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기들을 함유하는 폴리펩타이드까지 길이의 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합체를 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들어, ADEPT에 대해) 또는 폴리펩타이드로의 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환적 돌연변이 유발을 위해 가장 큰 목적하는 부위는 초가변 영역을 포함하지만 FR 변형이 또한 고려된다. 보존성 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 A에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성에서의 변화를 유도하는 경우, 표 A에서 "예시적 치환"으로 지칭된 보다 실질적 변화 또는 아미노산 부류를 참조하여 하기에 추가로 기재된 바와 같은 변화가 도입될 수 있고 생성물을 스크리닝한다.
[표 A]
바람직한 본래의 예
잔기 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu
Phe; 노르류신
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Ile
Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Leu
Ala; 노르류신
항체의 생물학적 성질에서 실질적 변형은 (a) 예를 들어, 쉬트 또는 나선 형태로서 치환의 분야에 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 이들의 효과가 상당히 상이한 치환을 선택함에 의해 성취된다. 아미노산은 이들의 측쇄의 성질에서 유사성에 따라 분류될 수 있다 (문헌참조: A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 하전되지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (O)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
대안적으로, 천연의 잔기들은 통상의 측쇄 성질을 기준으로 그룹으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기들: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환시킴을 필요로 한다. 상기 치환된 잔기들은 또한 보존성 치환 부위로 또는 나머지 (비-보존성) 부위로 도입될 수 있다.
치환 변이체의 하나의 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기들을 치환시킴을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 수득한 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비하여 변형된 (예를 들어, 개선된) 생물학적 성질을 갖는다. 상기 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파아지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙화를 포함한다. 간략하게, 여러 초가변 영역 부위(예를 들어, 6 내지 7개 부위)는 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이와 같이 생성된 항체는 각각의 입자내 팩키징된 파아지 코트 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부와의 융합체로서 필라멘트 파아지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서 파아지-디스플레이된 변이체는 본원에 기재된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형시키기 위한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해, 스캐닝 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)은 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기들을 동정하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 간의 접촉점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 상기 접촉 잔기들 및 이웃하는 잔기는 당업계에 공지된 기술에 따른 치환을 위한 후보이고, 이것은 본원에서 설명된 것들을 포함한다. 일단 상기 변이체가 생성되면, 변이체 패널은 당업계에 공지된 기술을 사용한 스크리닝에 적용하고 이는 본원에 기재된 것들을 포함하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 성질을 갖는 항체는 추가의 개발을 위해 선택될 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원으로부터의 단리(천연의 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리뉴클레오타이드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
발명의 항체의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 도입함으로써 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 요구될 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
면역접합체
또 다른 양상에서, 본 발명은 화학치료학적 제제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사선활성 동위원소 (즉, 방사선접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는, 면역접합체, 또는 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다.
세포독성 또는 세포성장 억제제, 즉, 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체의 사용 (문헌참조: Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; 미국 특허 제4,975,278호)은 약물 잔기의 종양으로의 표적화된 전달 및 세포내 축적을 가능하게 하고, 여기서, 이들 비접합된 약물 제제의 전신 투여는 제거되어야 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해 수용가능하지 않은 수준의 독성을 유발할 수 있다 (문헌참조: Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 이로써 최소 독성을 갖는 최대 효능이 모색된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다는 이들 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (문헌참조: Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (문헌참조: Rowland et al., (1986) supra). 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 디프테리아 독소와 같은 세균 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신과 같은 작은 분자 (문헌참조: Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581 ; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 마이탄시노이드 (문헌참조: EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리케아미신 (문헌참조: Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)을 포함한다. 독소는 투부틴 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함하는 메카니즘에 의해 이들의 세포독성 및 세포성장 억제 효과에 영향을 줄 수 있다. 일부 세포독성 약물은 대형 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우 불활성이거나 덜 활성인 경향이 있다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되어 있고 용이하게 가용한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 하나의 양태에서, 항체의 유도체화를 위해 적합한 잔기들은 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 이의 안정성으로 인해 제조에 있어서 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 측쇄 또는 비측쇄일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 이상의 중합체가 부착된 경우, 상기 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 항체 유도체가 한정된 조건 등하에서 사용되는 것에 상관 없이 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고려 사항을 기준으로 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 방사선으로의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 잔기의 접합체가 제공된다. 하나의 양태에서, 비단백질성 잔기는 탄소 나노튜브이다 (문헌참조: Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고 정상 세포에는 무해하지만 항체-비단백질성 잔기에 인접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 잔기를 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약제학적 제형
본 발명의 항체를 포함하는 치료학적 제형은 수용액, 동결건조되거나 다른 건조된 제형 형태로 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 혼합함에 의해 저장을 위해 제조된다 (문헌참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만)의 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 짝이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료될 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 포함하고, 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 분자는 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합적으로 적합하게 존재한다.
활성 성분들은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡술 중에 포집될 수 있고, 예를 들어, 각각 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중에서 또는 마크로에멀젼 중에서 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐이 있다. 상기 기술은 문헌 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되어야 하는 제형은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취된다.
지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 면역글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 성형품 형태로 있다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상 동안 분자를 방출시킬 수 있고, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린이 장시간 동안 체내에 유지되어 있는 경우, 이들은 37 ℃에서 수분에 노출 결과로서 변성되거나 응집할 수 있어 생물학적 활성이 상실되고 면역원성에서의 가능한 변화가 유도될 수 있다. 이상적인 전략은 관련된 메카니즘에 의존하여 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적당한 첨가제를 사용하고 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함에 의해 성취될 수 잇다.
용도
본 발명의 항체는, 예를 들어, 시험관내, 생체외 및 생체내 치료학적 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 특이적 항원 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단시키기 위한 길항제로서 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종 기원의 항원 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물, 인간 대상체 또는 본 발명의 항체가 교차 반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상체 (예를 들어, 침팬지, 비비, 마모셋, 시노몰구스 및 레서스, 돼지 또는 마우스)에서 특정 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시켜 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 항원은 인간 단백질 분자이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 해로운 장애를 앓는 대상체에서 항원을 억제하기 위한 방법에 사용될 수 있고, 상기 방법은 대상체에서 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 항체를 대상체에게 투여함을 포함한다. 하나의 양태에서, 항원은 인간 단백질 분자이고 상기 대상체는 인간 대상체이다. 대안적으로, 상기 대상체는 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 여전히 추가로, 상기 대상체는 항원이 도입된 (예를 들어, 항원의 투여에 의해 또는 항원 전이유전자의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료학적 목적을 위해 인간 대상체에 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 수의과 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서 항체가 교차 반응하는 항원을 발현하는 비인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자에 관하여, 상기 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능(예를 들어, 투여용량 및 투여의 시간 과정의 시험)을 평가하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로-관련 유전학적 장애, 면역/염증 장애, 신경학적 장애 및 다른 유비퀴틴 경로-관련 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는 SSEA-3/SSE A-4/글로보 H 및 SSEA-3/SSEA-4/글로보 헤이티드 단백질의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나, 억제하거나 이의 진행을 지연시키거나, 이의 재발을 예방하고/지연시키거나, 완화시키거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 차단 항체는 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 대해 특이적이다.
특정 양태에서, 세포독성제와 접합된 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체는 환자에게 투여된다. 일부 양태에서, 면역접합체 및/또는 이것이 결합된 항원은 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H와 관련된 이들의 세포 표면 상의 하나 이상의 단백질을 발현하는 세포에 의해 내재화되고 이는 이것이 관련된 표적 세포를 사멸시키는데 면역접합체의 증가된 치료학적 효능을 유도한다. 하나의 양태에서, 세포독성제는 표적 세포에서 핵산을 표적화하고 이를 방해한다. 상기 세포독성제의 예는 본원에 주지된 임의의 화학적 치료학적 제제 (예를 들어, 마이탄시노이드 또는 칼리키아미신), 방사능 동위원소, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 배합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또 다른 항체 및/또는 보조제/치료학적 제제 (예를 들어, 스테로이드)와 함께 동시 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 치료 계획, 예를 들어, 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로-관련 유전학적 장애, 면역/염증 장애, 신경학적 장애 및 다른 유비퀴틴 경로-관련 장애를 포함하는 본원에 기재된 임의의 질환을 치료하는데 있어서 소염제 및/또는 소독제와 배합될 수 있다. 상기된 이러한 배합 치료제는 배합 투여 (여기서, 2개 이상의 제제가 동일하거나 별도의 제형으로 포함된다) 및 별도의 투여 (이 경우에 본 발명의 항체의 투여는 보조 투여요법 또는 치료요법들의 투여 전, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다)를 포함한다.
본 발명의 항체 (및 보조 치료학적 제제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내 및 국소 투여를 위해 요구되는 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 상기 항체는 특히 감소하는 항체 용량과 함께 적합하게는 펄스 주입에 의해 투여된다. 투여는 부분적으로 투여가 간략하거나 만성인지에 의존하여 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의한 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 표적의 위치는 항체 제조 및 투여에서 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자인 경우, 본 발명의 특정 양태는 결합 표적이 위치하는 세포로 도입될 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 인트러바디로서 세포내 발현될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인트러바디"는 세포내 발현되고 문헌 [참조: Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); 미국 특허 제6,004,940호 및 제6,329,173호; 미국 특허 출원 공보 제2003/0104402호, 및 PCT 공보 제WO2003/077945호]에 기재된 바와 같이 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 언급한다. 인트러바디의 세포내 발현은 목적하는 항체 또는 이의 항원-결합부 (상기 항체 또는 항원 결합 단편과 통상적으로 관련된 야생형 리더 서열 및 분비 시그날이 없는)를 암호화하는 핵산을 표적 세포로 도입함에 의해 수행된다. 미세주사, 탄도 주사, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포좀 및 목적하는 핵산을 함유하는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 백시니아 벡터로의 형질감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 핵산을 세포로 도입하는 임의의 표준 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/글로보 H 항체 모두 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 핵산은 표적 세포에 전달되어 하나 이상의 인트러바디가 발현되어 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H에 세포내 결합할 수 있고 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/글로보 H-매개된 세포 경로를 조절할 수 있다.
또 다른 양태에서, 내재화 항체가 제공된다. 항체는 항체의 세포로의 전달을 증진시키는 특정 특성을 소유할 수 있거나 상기 특성을 갖도록 변형될 수 있다. 이를 성취하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 세포로의 이의 흡수를 촉진시키는 것으로 공지되어 있다 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,703,019호). 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체를 세포로 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편은 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩타이드 분자를 디자인할 수 있다. 상기 펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 문헌 [예를 들어, Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)]을 참조한다.
조절제 폴리펩타이드의 표적 세포로의 진입은 당업계에 공지된 방법에 의해 증진될 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 또는 안테나페디아 호메오도메인 단백질로부터 유래된 것들과 같은 특정 서열은 세포막을 거치는 이종성 단백질의 효율적인 흡수를 지시할 수 있다. 문헌 [예를 들어, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329]을 참조한다.
결합 표적이 뇌에 위치하는 경우, 본 발명의 특정 양태는 혈뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 신경퇴행성 질환은 혈뇌 장벽의 투과성의 증가와 관련되고 항체 또는 항원-결합 단편은 뇌에 용이하게 도입될 수 있다. 혈뇌 장벽이 온전하게 유지된 경우, 이를 관통하여 분자를 수송하기 위한 여러 당업계에 공지된 방법이 존재하고 물리적 방법, 지질 기반 방법 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈뇌 장벽을 관통하는 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 물리적 방법은 전반적으로 혈뇌 장벽을 우회하거나 혈뇌 장벽에 구멍을 생성시킴에 의한 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 우회 방법은 뇌로의 직접적인 주사 (문헌참조: 예를 들어, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)), 간질 주입/대류 증진된 전달 (문헌참조: 예를 들어, Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)), 및 뇌에 전달 장치의 이식(문헌참조: 예를 들어, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); and Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 장벽에 구멍을 생성시키는 방법은 초음파 처리 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 공보 제2002/0038086호), 삼투압 (문헌참조: 예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의해 (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), 예를 들어, 브라디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과화 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,112,596호, 제5,268,164호, 제5,506,206호, 및 제5,686,416호), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터를 사용한 혈뇌 장벽에 걸쳐 있는 뉴런의 형질감염 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 공보 제2003/0083299호)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈뇌 장벽을 거쳐 항체 또는 항원-결합 단편을 수송시키는 지질 기반 방법은 혈뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포좀에 항체 또는 항원-결합 단편을 캡슐화시키고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제20020025313호), 저밀도 지질단백질 입자 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제20040204354호) 또는 아포지질단백질 E (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제20040131692호)로 항체 또는 항원-결합 단편을 코팅시킴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈뇌 장벽을 거쳐 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 혈뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위해 글루코코르티코이드 차단제를 사용하고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2002/0065259호, 제2003/0162695호, 및 제2005/0124533호); 칼륨 채널을 활성화시키고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2005/0089473호), ABC 약물 수송체를 억제하고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2003/0073713호); 항체를 트랜스페린으로 코팅시키고 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성을 조절하고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허원 공보 제2003/0129186호), 및 항체를 양이온화시킴(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,004,697호)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 조성물은 양호한 의학적 수행과 일치하는 양상으로 제형화되고 용량화되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 인자들은 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 조건, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의학적 수행자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 항체는 그럴 필요는 없지만 미지의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 임의로 제형화된다. 상기 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 동일한 용량으로 및 투여 경로로 사용되거나 본원에 기재된 용량의 약 1 내지 99 % 또는 임의의 용량으로 및 적당히 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적당한 용량 (단독으로 사용되거나 화학치료학적 제제와 같은 다른 제제와 배합하여 사용되는 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당의의 판단에 의존한다. 상기 항체는 1회째 또는 일련의 치료 동안 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 의존하여, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg)의 항체는, 예를 들어, 하나 이상의 별도의 투여 또는 연속 주입에 의해서든 상관 없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 하나의 전형적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상 동안 반복적인 투여를 위해, 조건에 따라 치료는 일반적으로, 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지연된다. 항체의 하나의 예시적 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자가 항체의 약 2 내지 약 20회 용량 또는, 예를 들어, 약 6회 용량을 수용하도록) 투여될 수 있다. 초기에 높은 로딩 용량에 이어서 하나 이상의 적은 용량이 투여될 수 있다. 예시적 투여 용법은 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량을 투여함에 이어서 주마다 약 2 mg/kg의 항체 용량을 유지시킴을 포함한다. 그러나, 다른 투여 용법이 유용할 수 있다. 상기 치료요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
제품
발명의 또 다른 양상에서, 상기된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 컨테이너 및 컨테이너 상에 또는 이와 연합된 표지 또는 팩키지 삽입체를 포함한다. 적합한 컨테이너는, 예를 들어, 병, 바이엘, 시린지 등을 포함한다. 컨테이너는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 그 자체로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 효과적인 또 다른 조성물과 배합되는 조성물을 유지하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 컨테이너는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 바이엘일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 팩키지 삽입체는 조성물이 선택 병태를 치료하기 위해 사용됨을 지적한다. 더욱이, 제품은 (a) 여기에 함유된 조성물을 갖는 제1 컨테이너 (여기서, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 여기에 함유된 조성물을 갖는 제2 컨테이너 (여기서, 상기 조성물은 추가의 세포독성 또는 다른 치료학적 제제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 양태에서 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지적하는 팩키지 삽입체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제품은 세균 증식 억제성 주사용수 (BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 (또는 제3) 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 여과제, 니들 및 시린지를 포함하는 상업적 및 사용자 견지로부터 바람직할 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
약제학적 조성물 및 제형
본원에 기재된 바와 같은 항체의 제조 후, "예비 동결건조된 제형"이 제조될 수 있다. 제형을 제조하기 위한 항체는 바람직하게 필수적으로 순수하고 바람직하게 필수적으로 균일하다 (즉, 오염 단백질 등이 없는). "필수적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 단백질의 적어도 약 90 중량%, 바람직하게 적어도 약 95 중량%를 포함하는 조성물을 의미한다. "필수적으로 균일한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 약 99 중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 특정 양태에서, 단백질은 항체이다.
예비-동결건조된 제형 중 항체의 양은 목적하는 투여 용적, 투여 방식(들) 등을 고려하여 결정된다. 선택된 단백질이 온전한 항체 (완전한 길이의 항체)인 경우, 약 2 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 바람직하게 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 및 가장 바람직하게 약 20 내지 30 mg/mL가 예시적 출발 단백질 농도이다. 상기 단백질은 일반적으로 용액 중에 존재한다. 예를 들어, 상기 단백질은 약 4-8 및 바람직하게 약 5-7의 pH에서 pH 완충 용액 중에 존재할 수 있다. 예시적 완충제는 히스티딘, 포스페이트, Tris, 시트레이트, 숙시네이트 및 다른 유기산을 포함한다. 완충제 농도는, 예를 들어, 완충제 및 목적하는 제형의 등장성 (예를 들어, 재구성된 제형의)에 따라 약 1 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 바람직한 완충제는 하기 입증된 바와 같이 이것이 동결보호 성질을 가질 수 있는 히스티딘이다. 숙시네이트는 또 다른 유용한 완충제인 것으로 나타났다.
동결보호제는 예비 동결건조 제형에 첨가한다. 바람직한 양태에서, 동결보호제는 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 비-환원 당이다. 예비 동결건조된 제형 중 동결보호제의 양은 일반적으로 재구성시 수득한 제형이 등장성이도록 하는 것이다. 그러나, 고장성 재구성된 제형이 또한 적합할 수 있다. 추가로, 동결보호제의 양은 허용할 수 없는 양의 단백질의 분해/응집이 동결 건조시 일어나도록 너무 낮지 말아야 한다. 동결보호제가 당 (예를 들어, 슈크로스 또는 트레할로스)이고 단백질이 항체인 경우, 예비 동결건조된 제형 중 예시적 동결보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 및 바람직하게 약 30 mM 내지 약 300 mM, 및 가장 바람직하게 약 50 mM 내지 약 100 mM이다.
단백질 대 동결보호제의 비율은 각각의 단백질 및 동결보호제 배합을 위해 선택된다. 선택 단백질로서 항체 및 높은 단백질 농도와 함께 등장성 재구성된 제형을 생성하기 위한 동결보호제로서 당(예를 들어, 슈크로스 또는 트레할로스)의 경우에, 동결보호제 대 항체의 몰비는 약 100 내지 약 1500 몰 동결보호제 대 1몰 항체, 및 바람직하게 약 200 내지 약 1000 몰의 동결보호제 대 1몰 항체, 예를 들어, 약 200 내지 약 600 몰의 동결 보호제 대 1몰 항체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 예비 동결건조된 제형에 계면활성제의 첨가가 요구될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 대안적으로, 또는 추가로, 계면활성제는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형에 첨가될 수 있다. 예시적 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤(Triton); 나트륨 도데실 설페이트 (SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레놀-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔니도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUATTM 계열 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, Pluronics, PF68 등)를 포함한다. 첨가된 계면활성제의 양은 이것이 재구성된 단백질의 응집을 감소시키고 재구성 후 미립자의 형성을 최소화하는 양이다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 약 0.001-0.5 %, 및 바람직하게 약 0.005-0.05 %의 양으로 예비 동결건조된 제형으로 존재할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 동결보호제 (예를 들어, 슈크로스 또는 트레할로스)와 벌크제 (예를 들어, 만니톨 또는 글라이신)의 혼합물은 예비-동결건조 제형의 제조에 사용된다. 벌크제는 여기에 과도한 포켓 없이 균일한 동결건조된 케이크의 제조를 가능하게 할 수 있다.
문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재된 것들과 같은 다른 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 예비 동결건조된 제형 (및/또는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형)에 포함될 수 있고 단 이들은 제형의 목적하는 특성에 불리한 영향을 미치지 않는다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여용량 및 농도에서 수용체에게 비독성이고 다음을 포함한다; 추가의 완충제; 보존제; 보조 용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; EDTA와 같은 킬레이팅제; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 생분해가능한 중합체, 예를 들어 폴리에스테르; 및/또는 나트륨과 같은 염-형성 짝이온.
본원에 기재된 약제학적 조성물 및 제형은 바람직하게 안정하다. "안정한" 제형/조성물은 여기에서 항체가 본질적으로 저장시 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 통합성을 유지하는 제형/조성물이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석학적 기술은 당업계에서 가용하고 문헌 [참조: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 검토되었다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균성이어야 한다. 이것은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취된다. 대안적으로, 전체 혼합물의 멸균성은 예를 들어 약 120 ℃에서 약 30분 동안 단백질을 제외하고 성분들을 오토클레이빙함에 의해 성취될 수 있다.
단백질, 동결보호제 및 다른 최적의 성분들이 함께 혼합된 후, 상기 제형을 동결건조시킨다. 많은 상이한 동결 건조기는 상기 목적을 위해 Hull50® (Hull, USA) 또는 GT20® (Leybold-Heraeus, Germany) 동결 건조기와 같이 가용하다. 동결 건조는 제형을 동결시키고 후속적으로 1차 건조에 적합한 온도에서 동결된 내용물로부터 얼음을 승화시킴에 의해 성취된다. 상기 조건하에서, 생성물 온도는 제형의 공융점 또는 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 1차 건조를 위한 저장 온도는 약 -30 내지 25 ℃ 범위이다. 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr 범위의 적합한 압력에서 (단, 생성물은 1차 건조 동안에 동결된 상태로 유지된다). 샘플을 보유한 컨테이너 (예를 들어, 유리 바이엘)의 제형, 크기 및 유형 및 액체 용적은 주로 건조를 위해 요구되는 시간에 좌우되고, 이는 몇시간에서 수일의 범위 (예를 들어, 40 내지 60시간)일 수 있다. 2차 건조 단계는 주로 컨테이너의 유형 및 크기 및 사용되는 단백질의 유형에 의존하여 약 0 내지 40 ℃에서 수행될 수 있다. 그러나, 2차 건조 단계가 요구될 수 없는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 동결건조의 전체 물 제거 단계에 걸쳐 저장 온도는 약 15-30 ℃일 수 있다. (예를 들어, 약 20 ℃). 2차 건조를 위해 요구되는 시간 및 압력은, 예를 들어, 온도 및 다른 계수에 의존하여 적합한 동결건조된 케이크를 생성하는 것이다. 2차 건조 시간은 생성물 중에 목적하는 잔류 수분 수준에 의해 의존되고 전형적으로 적어도 약 5시간 (예를 들어 10 내지 15시간) 걸린다. 상기 압력은 1차 건조 단계 동안에 사용된 것과 동일할 수 있다. 동결-건조 조건은 제형 및 바이엘 크기에 따라 다양할 수 있다.
일부 경우에, 단백질의 재구성이 전달 단계를 피하기 위해 수행되어야 하는 컨테이너에서 단백질 제형을 동결건조시키는 것이 요구될 수 있다. 상기 경우에 컨테이너는, 예를 들어, 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이엘일 수 있다. 일반적인 제안으로서, 동결건조는 이의 수분 함량이 약 5 % 미만 및 바람직하게 약 3 % 미만인 동결건조된 제형을 유도한다.
목적하는 단계에서, 전형적으로 이것이 단백질을 환자에게 투여할 시간인 경우, 동결건조된 제형은 재구성된 제형에서 단백질 농도가 적어도 50 mg/mL, 예를 들어, 약 50 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 보다 바람직하게 약 80 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 및 가장 바람직하게 약 90 mg/mL 내지 약 150 mg/mL 이도록 희석제와 재구성될 수 있다. 재구성된 제형에서 상기 높은 단백질 농도는 특히 재구성된 제형의 피하 전달이 의도되는 경우 유용한 것으로 고려된다. 그러나, 다른 투여 경로, 예를 들어, 정맥내 투여를 위해, 재구성된 제형 중에 보다 낮은 농도의 단백질이 요구될 수 있다 (예를 들어, 재구성된 제형 중의 약 5-50 mg/mL, 또는 약 10-40 mg/mL 단백질). 특정 양태에서, 재구성된 제형 중의 단백질 농도는 예비 동결건조된 제형에서의 것보다 상당히 높다. 예를 들어, 재구성된 제형 중의 단백질 농도는 예비 동결건조된 제형의 약 2-40배, 바람직하게 3-10배 및 가장 바람직하게 3-6배(예를 들어, 적어도 3배 또는 적어도 4배)일 수 있다.
재구성은 일반적으로 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25 ℃의 온도에서 일어지만 다른 온도가 요구되는 바와 같이 사용될 수 있다. 재구성을 위해 요구되는 시간은, 예를 들어, 희석제의 유형, 부형제(들) 및 단백질의 양에 의존한다. 예시적인 희석제는 멸균수, 세균증식억제 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 희석제는 임의로 보존제를 함유한다. 예시적 보존제는 상기된 바와 같고 벤질 또는 페놀 알콜과 같은 방향족 알콜을 갖는 것이 바람직한 보존제이다. 사용되는 보존제의 양은 단백질 및 보존제 효능 시험과의 적합성에 대해 상이한 보존제 농도를 평가함에 의해 결정된다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알콜(예를 들어, 벤질 알콜)인 경우, 이것은 약 0.1-2.0 % 및 바람직하게 약 0.5-1.5 %, 그러나 가장 바람직하게 약 1.0-1.2 %의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게, 재구성된 제형은 크기가 10 ㎛ 초과인, 바이엘 당 6000개 입자 미만을 갖는다.
치료학적 적용
본원에 기재된 하나 이상의 항체를 포함하는 치료학적 유효량의 조성물을 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 치료학적 방법이 본원에 기재되어 있다.
특정 양태에서, 치료될 대상체는 포유동물이다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 양태에서, 상기 대상체는 가축, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 특정 양태에서, 상기 대상체는 반려 동물, 예를 들면, 개 또는 고양이다. 특정 양태에서, 상기 대상체는 가축, 예를 들면, 소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 특정 양태에서, 상기 대상체는 동물원 동물이다. 또 다른 양태에서, 상기 대상체는 연구 동물, 예를 들어, 설치류, 개, 또는 비인간 영장류이다. 특정 양태에서, 상기 대상체는 비-인간 이식유전자 동물, 예를 들어, 이식유전자 마우스 또는 이식유전자 돼지이다.
일부 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)는 암 갖거나 이의 위험에 처한 것으로 진단된다. 암의 예는 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁암, 난소암 및 전립선암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 상기 암은 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암 또는 췌장암이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 암은 뇌암 또는 다형성 교모세포종 (GBM) 암이다.
바람직한 양태에서, 상기 항체는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4-발현 암 세포를 표적화할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 항체는 암 세포 상의 글로보 H 및 SSEA를 표적화할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 항체는 암에서 SSEA를 표적화할 수 있다.
따라서, 상기 항체는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 3중 표적화 항체이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 글로보 H 및 SSEA-3에 대한 2중 표적화 항체와 항-SSEA-4 항체의 혼합물이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 3중 표적화 항체와 항-SSEA-4 항체의 혼합물이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 항-글로보 H, 항-SSEA-3 및 항-SSEA-4 항체의 혼합물이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 항-글로보 H와 항-SSEA-4 항체의 혼합물이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 항-SSEA-4 항체이다.
상기 치료는 종양 크기의 감소, 악성 세포의 제거, 전이의 예방, 재발의 예방, 파종된 암의 감소 또는 사멸, 생존 연장 및/또는 종양 암 진행으로의 시간 연장을 유도한다.
일부 양태에서, 상기 치료는 항체를 투여하기 전, 투여 동안에 또는 투여 후 상기 대상체에게 추가의 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 추가의 치료요법은 화학치료학적 제제를 사용한 치료이다. 일부 양태에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법이다.
본 발명의 방법은 특히 조기 단계 종양을 치료하고 예방하는데 있어서 유리하여 보다 진행된 단계로의 진행을 차단하여 진행된 암과 관련된 사망율 및 치사율을 유도한다. 본 발명의 방법은 또한 종양의 재발 또는 종양의 재성장, 예를 들어, 1차 종양의 제거 후 지속하는 잠재적 종양의 재성장을 예방하거나 종양의 발생을 감소시키거나 예방하는데 유리하다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 암이 증가된 글로보 H, SSEA-3 및/또는 SSEA-4 발현을 특징으로 하는 경우 암의 치료 또는 예방을 위해 유용하다. 일부 양태에서, 상기 암은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 암은 예비 암 및/또는 악성 암 및/또는 치료요볍 내성 암이다. 일부 양태에서, 상기 암은 뇌암이다.
본 발명의 방법을 위해, 암은 고형 종양, 예를 들어, 유방암, 결장직장암, 직장암, 폐암, 신장 세포 암, 신경교종 (예를 들어, 성형술 성상세포종, 성형술 올리고성상세포종, 성형술 핍지교종, 다형성 교모세포종 (GBM)), 신장암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카시노이드 암종, 두경부암, 흑색종 및 난소암일 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 암은 뇌암 또는 GBM이다. 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해, 본원에 기재된 적어도 하나의 항체를 함유하는 상기된 유효량의 약제학적 조성물/제형은 적합한 경로를 통해, 예를 들어, 정맥내 투여, 예를 들어, 볼러스로서 또는 일정시간 동안 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 경막내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 포함하는 액체 제형용의 시판되는 분무기가 투여를 위해 유용하다. 액체 제형은 직접 분무될 수 있고 동결건조된 분말은 재구성 후 분무될 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 불화탄소 제형 및 계량된 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 수 있거나 동결건조되고 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁암, 난소암 및 전립선암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암을 갖거나 이의 위험에 처해있거나 갖는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 암을 갖는 대상체는 통상적인 의학적 조사에 의해 동정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 활성제와 배합하여 대상체 상에서 치료학적 효과를 부여하기 위해 요구되는 각각의 활성제의 양을 언급한다. 유효량은 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 치료될 특정 병태, 병태의 중증도, 연령, 신체적 조건, 크기, 성별 및 체중을 포함하는 개별 환자 파라미터, 치료 기간, 동시 치료요법의 특성 (임의의 경우), 특정 투여 경로 및 건강 실행자의 지식 및 경험내에서 인자에 의존하여 다양하다. 이들 인자들은 당업자에게 널리 공지되어 있고 단지 통상의 실험으로 해결될 수 있다. 일반적으로 개별 성분들 또는 이의 배합의 최대 용량이 사용되고, 즉 건전한 의학적 판단에 따라 최고의 안정한 용량이 사용되는 것이 바람직하다. 그러나 환자는 의학적 이유 때문에 보다 낮은 용량 또는 내인성 용량, 생리학적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유 때문에 주장할 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다.
반감기와 같은 경험적 고려는 일반적으로 용량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계에 적격인 항체, 예를 들어, 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체를 사용하여 항체의 반감기를 연장할 수 있고 항체가 숙주 면역계에 의해 공격받지 않도록 할 수 있다. 투여 빈도를 결정하고 치료 과정 동안에 조정되고 일반적으로 반드시 그럴 필요는 없지만 암의 치료 및/또는 억제 및/또는 완화 및/또는 지연을 기반으로 한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체의 지연 연속 방출 제형은 적당할 수 있다. 지연 방출을 성취하기 위한 다양한 제형 및 장치는 당업계에 공지되어 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체에 대한 투여용량은 항체의 하나 이상의 투여(들)이 주어진 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 항체를 증가분의 용량으로 투여받는다. 항체의 효능을 평가하기 위해, 질환 (예를 들어, 암)의 지시기는 통상의 관행에 따라 수행될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 임의의 항체를 투여하기 위해, 초기 후보 용량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 전형적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 의존하여 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 이상 중 임의의 범위일 수 있다. 수일 이상 동안 반복적인 투여를 위해, 병태에 의존하여, 상기 치료는 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 또는 충분한 치료학적 수준이 암 또는 이의 증상을 경감하도록 성취될 때까지 지속된다. 예시적 투여 용법은 약 2 mg/kg의 초기 용량을 투여하고 이어서 항체를 주마다 약 1 mg/kg의 용량을 유지시키거나 이어서 격주로 약 1 mg/kg의 용량을 유지시킴을 포함한다. 그러나, 다른 투여 용법은 실행자가 성취하고 싶은 약리역학적 쇠퇴의 패턴에 의존하여 유용할 수 있다. 예를 들어, 주당 1 내지 4회의 투여가 고려된다. 일부 양태에서, 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg (예를 들어, 약 3 μg/mg, 약 10 ㎍/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300μg/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 2 mg/kg) 범위의 투여 용량이 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 투여 빈도는 1주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다 또는 1개월 마다, 2개월 마다, 또는 3개월 마다 또는 그 이상 마다 1회이다. 상기 치료요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 용법 (사용되는 항체를 포함하는)은 시간 경과에 따라 다양할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 본원에 기재된 항체의 적당한 투여량은, 사용되는 특이적 항체 (또는 이의 조성물), 암의 유형 및 중증도, 항체가 예방학적 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당의의 판단에 의존한다. 본원에 기재된 항체의 투여는, 예를 들어, 암 발병 전, 동안에 또는 이후에 미리선택된 기간 동안 필수적으로 연속적이거나 일련의 간격 투여로 수행딜 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"은 암, 암의 증상 또는 암에 대한 성향을 치유하거나, 고치거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변화시키거나 치료하거나 호전시키거나 개선시키거나 영향을 줄 목적으로 암, 암의 증상 또는 암에 대한 성향을 갖는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용하거나 투여함을 언급한다.
암의 완화는 암의 발병 또는 진행을 지연시키거나 암 중증도를 감소시킴을 포함한다. 암의 완화는 필연적으로 치유적 결과를 요구하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 암의 발병의 "지연"은 암의 진행을 늦추거나, 저해하거나, 느리게하거나, 지체시키거나, 안정화시키고/시키거나 연기시킴을 의미한다. 상기 지연은 암의 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 암의 발병을 "지연"시키거나 완화시키거나 암의 개시를 지연시키는 방법은, 소정의 시간 프레임에서 암의 하나 이상의 증상을 발병할 가능성 (위험)을 감소시키고/시키거나 상기 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여 소정의 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 상기 비교는 전형적으로, 통계학적으로 유의적 결과를 부여하기에 충분한 다수의 대상체를 사용한 임상적 연구를 기반으로 한다.
암의 "발달" 또는 "진행"은 암의 초기 증상 및/또는 계속되는 진행을 의미한다. 암의 발달은 당업계에 널리 공지된 바와 같이 표준 임상적 기술을 사용하여 검출가능하거나 평가될 수 있다. 그러나, 발달은 또한 검출될 수 없는 진행을 언급한다. 본 발명의 목적을 위해, 발달 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 언급한다. "발달"은 발병, 재발 및 개시를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 암의 "개시" 또는 "발병"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
의학 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 치료될 질환 유형 또는 질환 부위에 의존하여 약제학적 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 상기 조성물은 또한 다른 통상적 경로를 통해 투여될 수 있고, 예를 들어, 경구로 투여되거나, 비경구적으로 투여되거나, 흡입 분무, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질내로, 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 경막내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 추가로, 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능하거나 생분해가능한 물질 및 방법을 사용하는 것과 같은 주사가능한 데포 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
주사가능한 조성물은 식물성유, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 함유할 수 있다. 정맥내 주사를 위해, 수용성 항체는 적가 방법에 의해 투여될 수 있고 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용되는 부형제는, 예를 들어, 5 % 덱스트로스, 0.9 % 식염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어, 적합한 가용성 염 형태의 항체의 멸균 제형이 용해되고 주사용수, 0.9 % 식염수 또는 5 % 글루코스 용액과 같은 약제학적 부형제 중에서 투여될 수 있다.
진단학적 적용
대상체에서 암을 진단하기 위한 방법에 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 (a) GM3, GM2, GM1, GD1, GD1a, GD3, GD2, GTlb, A2B5, LeX, sLeX, LeY, SSEA-3, SSEA-4, 글로보 H, TF, Tn, sTn, CD44, CD24, CD45, CD90, CD133으로 이루어진 마커 패널의 발현을 검출하는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 조성물을 대상체로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플에 적용하고; (b) 모노클로날 항체의 세포 또는 조직 샘플로의 결합을 분석하고; (c) 상기 결합을 정상 대조군과 비교하여 대상체에서 암의 존재를 결정함을 포함한다.
검출 및 진단을 위한 암의 예는 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁암, 난소암 및 전립선암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 상기 암은 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암, 또는 췌장암이다.
일부 양태에서, 마커는 GM2, GM1, GDla, GTlb, A2B5, Tf, Tn, 글로보 H, SSEA3, SSEA4, CD24, CD44 및 CD90으로 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 GM2, GM1, GDla, GTlb, A2B5, Tf, Tn, 글로보 H, SSEA3, SSEA4, CD24, CD44 및 CD90을 검출할 수 있는 다수의 모노클로날 항체를 포함한다.
일부 양태에서, 항체는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4-발현 암 세포를 검출할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 항체는 암 세포 상의 글로보 H 및 SSEA를 검출할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 항체는 암에서 SSEA를 검출할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 암은 뇌암 또는 다형성 교모세포종 (GBM) 암이고 상기 항체는 항-SSEA-4 모노클로날 항체이다.
글로보 H, SSEA-3 및/또는 SSEA-4-특이적 모노클로날 항체는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4-발현 암 세포 (예를 들어, 본원에 지적된 바와 같은 GBM, 특정 고형 종양 세포 및 조혈 암 세포)를 검출하기 위한 시험관내 및 생체내 진단학적 검정을 위해 단독으로 또는 배합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플 또는 조직 생검)은 환자로부터 수득될 수 있고 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 3중 표적화 항체, 또는 항-SSEA-4와 배합된 글로보 H/SSEA-3원-표적화 항체와 접촉시킬 수 있고 환자 샘플에서 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4 발현 암 세포의 존재는 항체 결합을 검출함에 의해 결정할 수 있다. 항체 결합은 직접적으로 (예를 들어, 항체 자체가 표지된 경우) 또는 2차 항체와 같은 제2 검출제를 사용함에 의해 검출될 수 있다. 검출가능한 수준은, 예를 들어, 킬레이터 또는 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 본 발명의 항체와 연합될 수 있다.
일부 양태에서, 글로보 H, SSEA-3 및/또는 SSEA-4 특이적 모노클로날 항체는 암을 갖거나 가질 것으로 의심되는 개체 기원의 생물학적 샘플과 접촉시키고 샘플내 세포와 결합하는 항체는 정상 항체 결합 보다 높거나 낮은 경우 개체가 암을 갖고 있음을 지적하는 것으로 결정된다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 혈액 분획물 (예를 들어, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구 세포, 백혈구 세포)이다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플은, 예를 들어, 공지된 종양의 경계선을 결정하기 위해, 예를 들어, 의심되는 종양 부위로부터 또는 영향받는 것으로 공지된 조직으로부터의 조직 샘플 (생검)이다. 일부 양태에서, 생물학적 샘플은 염증 부위로부터 수득된다.
생검은 전형적으로 조직, 즉, 비-유체 세포 유형으로부터 샘플을 수득하기 위해 수행된다. 적용된 생검 기술은 평가될 조직 유형 (예를 들어, 유방, 피부, 결장, 전립선, 신장, 폐, 방광, 림프절, 간, 골수, 기도 또는 폐)에 의존한다. 암의 경우에, 기술은 또한 다른 인자들 중에서 종양의 크기 및 유형 (예를 들어, 고체, 현탁되거나 혈액)에 의존한다. 생검 기술은, 예를 들어, 문헌 [참조: Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70, and throughout Part V]에서 논의된다.
샘플내 세포에 결합하는 항체를 검출하는 임의의 방법은 본 발명의 진단학적 검정을 위해 사용될 수 있다. 항체 결합을 검출하는 방법은, 예를 들어, 유동 세포측정, 형광 현미경, ELISA 등에 널리 공지되어 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 결정 단계 전에 검출을 위한 생물학적 샘플을 제조함을 포함한다. 예를 들어, 세포 (예를 들어, 백혈구 세포)의 아집단은 개체 기원의 샘플의 나머지 (예를 들어, 다른 혈액 성분)로부터 분리될 수 있거나 조직 중 세포는 보다 용이한 검출을 위해 현탁될 수 있다.
일부 양태에서, 샘플에서 글로보 H/SSEA-3/SSEA-4 발현 세포의 %가 결정되고 대조군, 예를 들어, 암을 가질 것으로 공지된 개체 또는 개체 그룹 (양성 대조군) 또는 암을 갖지 않을 것으로 공지된 개체 또는 개체 그룹 (정상, 비-질환 또는 음성 대조군)으로부터의 샘플과 비교한다. 일부 양태에서, 상기 대조군은 소정의 조직을 위해 확립된 글로보 H/SSEA-3/SSEA-4 발현의 표준 범위이다. 정상 보다 높거나 낮은 %의 글로보 H/SSEA-3/SSEA-4 발현 세포 또는 보다 높거나 낮은 발현 수준은 개체가 암을 가짐을 지적한다.
하나의 양태에서, 키트는 혈액 샘플 또는 조직 샘플과 같은 생물학적 샘플에서 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4를 검출하기 위해 제공된다. 예를 들어, 대상체에서 암 진단을 확인하기 위해, 생검은 조직학적 검사를 위한 조직 샘플을 수득하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 혈액 샘플은 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4의 존재를 검출하기 위해 수득될 수 있다. 폴리펩타이드를 검출하기 위한 키트는 전형적으로 본원에 기재된 임의의 항체와 같은 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 (예를 들어, 형광, 방사능활성 또는 효소적 표지로) 표지시킨다.
하나의 양태에서, 키트는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체의 사용 수단을 기재하는 지침서를 포함한다. 지시 지침서는 전기 형태 (예를 들어, 컴퓨터 디스켓 또는 컴팩트 디스크)로 기재되어 있을 수 있거나 (비디오 파일과 같이) 가시적일 수 있다. 키트는 또한 이를 위해 키트가 디자인된 특정 적용을 촉진시키는 추가의 성분들을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 키트는 추가로 표지를 검출하기 위한 수단 (예를 들어, 효소적 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지, 2차 항체 등과 같은 적당한 2차 표지를 검출하기 위한 필터 세트)을 함유한다. 키트는 특정 방법의 수행을 위해 통상적으로 사용되는 완충제 및 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트 및 적당한 내용물은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
세포 표면 마커의 존재 또는 부재를 결정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 항체는 효소, 자기 비드, 콜로이드성 자기 비드, 합텐, 형광단, 금속 화합물, 방사능활성 화합물 또는 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 화합물과 접합될 수 있다. 상기 항체는 또한 이에 제한되지 않지만 방사능면역검정 (RIA), 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 면역조직학적 검정과 같은 면역검정에 사용될 수 있다. 항체는 또한 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 위해 사용될 수 있다. FACS는 다수의 색상 채널, 낮은 각도 및 둔감한 광-산란 검출 채널 및 임피던스 채널을 사용하여 다른 보다 정교한 검출 수준 중에서 세포를 분리하거나 분류한다 (문헌참조: 미국 특허 제5, 061,620호). 본원에 기재된 바와 같은 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4에 결합하는 임의의 모노클로날 항체는 이들 검정에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 항체는 제한 없이 ELISA, RIA, FACS, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전을 제한 없이 포함하는 통상의 면역검정에 사용될 수 있다.
종양의 단계를 결정하고/하거나 예후를 결정하기 위한 방법
본 발명의 또 다른 양상은 인간 환자에서 종양의 단계를 결정하고/하거나 예후를 결정하기 위한 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은: (a) SSEA-3, SSEA-4 및 글로보 H로 이루어진 마커의 발현을 검출하는 하나 이상의 항체를 포함하는 조성물을 환자로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플에 적용하고; (b) 모노클로날 항체의 세포 또는 조직 샘플로의 결합을 분석하고; (c) 시험 샘플 중에 마커의 발현 수준을 참조 샘플에서의 수준과 비교하고, (d) 단계 (c)에 동정된 결과를 기준으로 환자에서 종양의 단계 및/또는 예후를 결정함을 포함한다.
일부 양태에서, 암은 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암, 또는 췌장암이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 암은 뇌암 또는 GBM이다.
일부 양태에서, 항체는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4 발현 암 세포를 검출할 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 암 세포 상의 글로보 H 및 SSEA를 검출할 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 암에서 SSEA를 검출할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 암은 뇌암 또는 다형성 교모세포종 (GBM) 암이고, 상기 항체는 항-SSEA-4 모노클로날 항체이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 암이 뇌암 또는 GBM인 경우 항-SSEA-4이다.
일부 양태에서, 상기 제공된 글리칸 접합체, 면역원성 조성물은 청신경종, 선암종, 부신암, 항문암, 혈관육종 (예를 들어, 림프관 육종, 림프관내피육종, 혈관육종), 충수암, 양성 모노클로날 감마글로불린병증, 담관암 (예를 들어, 담관암종), 방광암, 유방암 (예를 들어, 유방의 선암종, 유방의 유두암종, 유방암 (mammary cancer), 유방의 수질암종), 뇌암 (예를 들어, 뇌수막종; 신경교종, 예를 들어, 성상세포종, 핍지교종; 수모세포종), 기관지 암, 카르시노이드 종양, 자궁경부암 (예를 들어, 자궁경부 선암종), 융모암, 척색종, 두개인두종, 결장직장암 (예를 들어, 결장암, 직장암, 결장직장 선암종), 상피 암종, 상의세포종, 내피육종 (예를 들어, 카포시 육종, 다발성 특발성 출혈성 육종), 자궁내막암 (예를 들어, 자궁암, 자궁 육종), 식도암 (예를 들어, 식도의 선암종, 바레트 선암종 (Barrett's adenocarinoma)), 어윙 육종, 안 암 (예를 들어, 안내 흑색종, 망막아종), 가계성 과다호산구증가증, 담낭암, 위암 (예를 들어, 위 선암종), 위장관 간질 종양 (GIST), 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종, 구강암(예를 들어, 구강 편평 세포 암종 (OSCC), 인후암 (예를 들어, 후두암, 인두암, 비인두암, 구인두암)), 조혈암 (예를 들어, 백혈병, 예를 들어, 급성 림프구 백혈병 (ALL) (예를 들어, B-세포 ALL, T-세포 ALL), 급성 골수세포 백혈병 (AML) (예를 들어, B-세포 AML, T-세포 AML), 만성 골수세포 백혈병 (CML) (예를 들어, B-세포 CML, T-세포 CML), 및 만성 림프구 백혈병 (CLL) (예를 들어, B-세포 CLL, T-세포 CLL); 림프종, 예를 들어, 호지킨 림프종 (HL) (예를 들어, B-세포 HL, T-세포 HL) 및 비-호지킨 림프종 (NHL) (예를 들어, B-세포 NHL, 예를 들어, 확산 대형 세포 림프종 (DLCL) (예를 들어, 확산 대형 B-세포 림프종 (DLBCL)), 여포 림프종, 만성 림프구 백혈병/소형 림프구 림프종 (CLL/SLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 변연대 B-세포 림프종 (예를 들어, 점막 관련 림프구 조직 (MALT) 림프종, 결절성 변연대 B-세포 림프종, 비장 변연대 B-세포 림프종), 1차 종격동 B-세포 림프종, 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 림프형질세포성 림프종 (즉, "발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)"), 모발 세포 백혈병 (HCL), 면역아세포 대형 세포 림프종, 전구체 B-림프아구 림프종 및 1차 중추 신경계(CNS) 림프종; 및 T-세포 NHL, 예를 들어, 전구체 T-림프아구 림프종/백혈병, 말초 T-세포 림프종 (PTCL) (예를 들어, 피부 T-세포 림프종 (CTCL) (예를 들어, 균상식 육종, 세자리 증후군 (Sezary syndrome)), 혈관면역모세포 T-세포 림프종, 림프절외 천연 킬러 T-세포 림프종, 장병증형 T-세포 림프종, 피하 지방층염형 T-세포 림프종, 성형술 대형 세포 림프종); 상기된 바와 같은 하나 이상의 백혈병/림프종의 혼합; 및 다발성 골수종 (MM)), 중쇄 질환 (예를 들어, 알파 쇄 질환, 감마 쇄 질환, mu 쇄 질환), 혈관아세포종, 염증성 근섬유아세포 종양, 면역세포 아밀로이드증, 신장암 (예를 들어, 신아세포종 a.k.a. 빌름 종양, 신장 세포 암종), 간 암 (예를 들어, 간세포 암 (HCC), 악성 간암), 폐암 (예를 들어, 기관지 암종, 소세포 폐암 (SCLC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐의 선암종), 평활근육종 (LMS), 비만세포증 (예를 들어, 전신 비만세포증), 골수형성이상증후군 (MDS), 중피종, 골수증식성 장애 (MPD) (예를 들어, 진성적혈구 증가증(PV), 본태성 혈소판 증가증 (ET), 원인불명골수화생(agnogenic myeloid metaplasia) (AMM), a.k.a. 골수섬유증 (MF), 만성 특발성 골수섬유증, 만성 골수세포 백혈병 (CML), 만성 호중구 백혈병 (CNL), 호산구증가증후군 (HES)), 신경아세포종, 신경섬유종 (예를 들어, 신경섬유종증 (NF) 1형 또는 2형, 신경초종증), 신경내분비 암 (예를 들어, 위장췌장 신경내분비 종양 (GEP-NET), 카시노이드 종양), 골육종, 난소암 (예를 들어, 낭종암, 난소 배아 암종, 난소 선암종), 유두상 선암종, 췌장암 (예를 들어, 췌장 선암종, 췌장내 유두상 점액 종양 (IPMN), 도세포 종양), 음경암 (예를 들어, 음경의 파제트 질환 (Paget's disease of the penis) 및 음낭 (scrotum)), 송과체종 (pinealoma), 원시 신경외배엽 종양 (PNT), 전립선암 (예를 들어, 전립선 선암종), 직장암, 횡문근육종, 침샘암, 피부암 (예를 들어, 편평 세포 암종 (SCC), 각질가시세포종 (keratoacanthoma) (KA), 흑색종, 기저 세포 암종 (basal cell carcinoma) (BCC)), 소장 암 (예를 들어, 충수암), 연질 조직 육종 (예를 들어, 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 지방육종, 악성 말초 신경 시스 종양 (malignant peripheral nerve sheath tumor) (MPNST), 연골육종, 섬유육종, 점액육종), 피지선 암종, 땀샘 암종, 활막종, 고환암 (예를 들어, 정상피종, 고환 배아 암종), 갑상선암 (예를 들어, 갑상선의 유두상 암종, 유두상 갑상선 암종 (PTC), 수질 갑상선 암), 요도암, 질암 및 외음부암 (예를 들어, 외음부의 파젯 질환)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암을 치료하거나 진단하는데 유용하다. 특정 양태에서, 제공된 글리칸 접합체, 면역원성 조성물 또는 백신은 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 골암, 피부암, 자궁암, 난소암, 및 전립선암을 치료하기 위해 유용하다.
본원에 기재된 치료 방법을 수행하기 위해, 본원에 기재된 유효량의 임의의 글리칸 조성물은 상기된 바와 같은 적합한 경로를 통해 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 인간 대상체와 같은 대상체는 암을 갖거나, 암을 가질 것으로 의심되거나 암에 민감한 환자일 수 있다. 일부 양태에서, 글리칸 접합체 또는 면역원성 조성물의 양은 암 성장의 억제 및/또는 종양 매쓰의 감소를 유도하는 반응을 유발하기에 충분하다. 다른 양태에서, 상기 글리칸 조성물의 양은 표적 암의 발병을 지연시키거나 암을 발병할 위험성을 감소시키는데 효과적일 수 있다. 유효량을 성취하기 위해 요구되는 제공된 글리칸 조성물의 정확한 양은 예를 들어, 대상체의 종, 성별 및 일반 병태, 부작용 또는 장애의 중증도, 특정 화합물(들)의 실체, 투여 방식 등에 의존하여 대상체 마다 다양하다. 목적하는 용량은 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 격일, 3일마다, 매주, 2주 마다, 3주 마다 또는 4주 마다 전달될 수 있다. 특정 양태에서, 목적하는 용량은 다중 투여 (예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회 이상의 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
특정 양태에서, 70 kg 성인에 대해 하루 1회 이상 투여하기 위한 제공된 글리칸 조성물의 유효량은 유닛 용량 형태 당 화합물의 약 0.0001 mg 내지 약 3000 mg, 약 0.0001 mg 내지 약 2000 mg, 약 0.0001 mg 내지 약 1000 mg, 약 0.001 mg 내지 약 1000 mg, 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg, 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg, 약 1 mg 내지 약 1000 mg, 약 1 mg 내지 약 100 mg, 약 10 mg 내지 약 1000 mg, 또는 약 100 mg 내지 약 1000 mg을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 제공된 글리칸 조성물은 목적하는 치료학적 효과를 수득하기 위해 하루 1회 이상 하루 대상체의 체중 kg 당 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 바람직하게 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 바람직하게 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 및 보다 바람직하게 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg을 전달하기에 충분한 용량 수준으로 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 용량 범위는 제공된 글리칸 접합체, 면역원성 조성물 또는 백신의 성인으로의 투여를 위한 지침을 제공하는 것으로 인지된다. 예를 들어, 어린이 또는 청소년으로의 투여될 양은 의학적 담당의 또는 당업자에 의해 결정될 수 있고 성인에게 투여되는 것 보다 낮거나 동일한 양일 수 있다.
또한, 제공된 글리칸 조성물은 하나 이상의 추가의 치료학적 활성제와 병용하여 투여될 수 있는 것으로 인지된다. 제공된 글리칸 접합체, 면역원성 조성물 또는 백신은 체내에서 이들의 생물유용성을 개선시키고, 이들의 대사를 감소시키고/시키거나 변형시키고, 이들의 분비를 억제하고/하거나 이들의 분포를 변형시키는 추가의 치료학적 활성제와 병용하여 투여될 수 있다. 또한, 사용된 치료요법은 동일한 질환에 대해 바람직한 효과를 달성할 수 있고/있거나 상이한 효과를 달성할 수 있는 것으로 인지된다.
제공된 글리칸 조성물은 하나 이상의 추가의 치료학적 활성제와 동시에, 이전에 또는 후속적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 제제는 상기 제제에 대해 결정된 용량에서 및/또는 시간 스케줄상에서 투여된다. 상기 병용에 사용되는 추가의 치료학적 활성제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 상이한 조성물에서 별도로 투여될 수 있는 것으로 추가로 인지된다. 치료용법에 사용하기 위한 특정 병용은 추가의 치료학적 활성제 및/또는 달성될 목적하는 치료학적 효과를 갖는 본 발명의 화합물의 양립가능성을 고려한다. 일반적으로, 병용에 사용되는 추가의 치료학적 활성제는 이들이 개별적으로 사용되는 수준을 초과하지 않는 수준으로 사용되는 것으로 예상된다. 일부 양태에서, 병용하여 사용되는 수준은 개별적으로 사용되는 것들 보다 낮다.
특정 양태에서, 제공된 글리칸 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 추가의 약제학적 제제와 병용하여 투여된다. 특정 양태에서, 추가의 약제학적 제제는 항암제이다. 항암제는 화학치료학적 제제 뿐만 아니라 생물치료학적 항암제를 포함한다.
예시적 생물치료학적 항암제는 인터페론, 사이토킨 (예를 들어, 종양 괴사 인자, 인터페론 α, 인터페론 γ), 백신, 조혈 성장 인자, 모노클로날 혈청치료요법, 면역자극제 및/또는 면역조절제 (예를 들어, IL-1, 2, 4, 6, 또는 12), 면역 세포 성장 인자 (예를 들어, GM-CSF) 및 항체 (예를 들어, HERCEPTIN (트라스투주맙), T-DM1, AVASTIN (베바시주맙), ERBITUX (세툭시맙), VECTIBIX (파니투무맙), RITUXAN (리툭시맙), BEXXAR (토시투모맙))을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적 화학치료학적 제제는 항-에스트로겐 (예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 및 메게스트롤), LHRH 효능제 (예를 들어, 고스크르클린 및 류프롤리드), 항-안드로겐 (예를 들어, 플루타미드 및 바이칼루타미드), 광동력학 치료요법 (예를 들어, 베르토포르핀 (BPD-MA), 프탈로시아닌, 감광제 Pc4, 및 데메톡시-하이포크렐린 A (2B A-2-DMHA)), 질소 머스타드 (예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 트로포스파미드, 클로람부실, 에스트라무스틴 및 멜팔란), 니트로소우레아 (예를 들어, 카무스틴 (BCNU) 및 로무스틴(CCNU)), 알킬설포네이트 (예를 들어, 부설판 및 트레오설판), 트리아젠 (예를 들어, 다카바진, 테모졸로미드), 백금 함유 화합물 (예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 탁소이드 (예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 등가물, 예를 들어, 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀(Abraxane), 도코사헥사에노산 결합된-파클리탁셀 (DHA-파클리탁셀, 탁소프렉신), 폴리글루타메이트 결합된-파클리탁셀 (PG-파클리탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스, CT-2103, XYOTAX), 종양-활성화된 프로드럭 (TAP) ANG1005 (파클리탁셀의 3개의 분자에 결합된 안지오펩-2), 파클리탁셀-EC-1 (erbB2-인지 펩타이드 EC-1에 결합된 파클리탁셀), 및 글루코스-접합된 파클리탁셀, 예를 들어, 2'-파클리탁셀 메틸 2-글루코피라노실 숙시네이트; 도세탁셀, 탁솔), 에피포도필린 (예를 들어, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, 캄프토이리노테칸, 이리노테칸, 크리스나톨, 미토마이신 C), 항-대사물, DHFR 억제제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 디클로로메토트렉세이트, 트리메트렉세이트, 에다트렉세이트), IMP 데하이드로게나제 억제제 (예를 들어, 미코페놀산, 티아조푸린, 리바비린, 및 EICAR), 리보뉴클레오타이드 리덕타제 억제제 (예를 들어, 하이드록시우레아 및 데페록사민), 우라실 유사체(예를 들어, 5-플루오로우라실 (5-FU), 플록스우리딘, 독시플루리딘, 라티트렉세드, 테가푸르-우라실, 카페시타빈), 사이토신 유사체 (예를 들어, 시타라빈 (ara C), 사이토신 아라비노사이드 및 플루다라빈), 퓨린 유사체 (예를 들어, 머캅토퓨린 및 티오구아닌), 비타민 D3 유사체(예를 들어, EB 1089, CB 1093, 및 KH 1060), 이소프레닐화 억제제 (예를 들어, 로바스타틴), 도파민성 신경독소(예를 들어, l-메틸-4-페닐피리디늄 이온), 세포 주기 억제제 (예를 들어, 스타우로스포린), 액티노마이신 (예를 들어, 액티노마이신 D, 닥티노마이신), 블레오마이신 (예를 들어, 블레오마이신 A2, 블레오마이신 B2, 페플로마이신), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화된 리포좀 독소루비신, 이다루시빈, 에피루비신, 피라루비신, 조루비신, 미톡산트론), MDR 억제제 (예를 들어, 베라파밀), Ca2 + ATPase 억제제 (예를 들어, 타프시가르긴), 이마티니브, 탈리도미드, 레날리도미드, 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 악시티니브 (AGO13736), 보수티니브 (SKI-606), 세디라니브 (RECENTIN™, AZD2171), 다사티니브 (SPRYCEL®, BMS-354825), 에를로티니브 (TARCEVA®), 게피티니브 (IRESSA®), 이마티니브 (Gleevec®, CGP57148B, STI-571), 라파티니브 (TYKERB®, TYVERB®), 레스타우르티니브 (CEP-701), 네라티니브 (HKI-272), 닐로티니브 (TASIGNA®), 세막사니브 (세막시니브, SU5416), 수니티니브 (SUTENT®, SU1 1248), 토세라니브 (PALLADIA®), 반데타니브 (ZACTIMA®, ZD6474), 바탈라니브 (PTK787, PTK/ZK), 트라스투주맙 (HERCEPTIN®), 베바시주맙 (AVASTIN®), 리툭시맙 (RITUXAN®), 세툭시맙 (ERBITUX®), 파니투무맙 (VECTIBIX®), 라니비주맙 (Lucentis®), 닐로티니브(TASIGNA®), 소라페니브 (NEXAVAR®), 에베롤리무스 (AFINITOR®), 알렘투주맙 (CAMPATH®), 겜투주맙 오조가미신 (MYLOTARG®), 템시롤리무스 (TORISEL®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, 도비티니브 락테이트 (TKI258, CHIR-258), BIBW 2992 (TOVOK™), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF ®), AP24534, TNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, 티보자니브 (AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647, 및/또는 XL228), 프로테아좀 억제제 (예를 들어, 보르테조미브 (VELCADE)), mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신, 템시롤리무스 (CCI-779), 에베롤리무스 (RAD-001), 리다포롤리무스, AP23573 (Ariad), AZD8055 (AstraZeneca), BEZ235 (Novartis), BGT226 (Norvartis), XL765 (Sanofi Aventis), PF-4691502 (Pfizer), GDC0980 (Genetech), SF 1126 (Semafoe) 및 OSI-027 (OSI)), 오블리메르센, 젬시타빈, 카미노마이신, 류코보린, 페메트렉세드, 사이클로포스파미드, 다카바진, 프로카비진, 프레드니솔론, 덱사메타손, 캄파테신, 플리카마이신, 아스파라기나제, 아미노프테린, 메토프테린, 포르피로마이신, 멜팔란, 류로시딘, 류로신, 클로람부실, 트라벡테딘, 프로카바진, 디스코데르몰리드, 카미노마이신, 아미노프테린, 및 헥사메틸 멜라민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 수행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 지금 기재된다. 본원에 구체적으로 언급된 모든 공보 및 특허는 화학물질, 세포주, 벡터, 동물, 장비, 통계학적 분석 및 방법을 기술하고 기재함을 포함하는 모든 목적을 위해 참조로 인용되고 이들은 공보에서 보고되고 본 발명과 연계하여 사용될 수 있다. 본원 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 당업계의 기술 수준을 지적하는 것으로서 수용되어야 한다. 본원에서 어떠한 것도 본원 발명이 종래 발명에 의해 상기 기재 내용 보다 선행하지 않음을 인정하는 것으로서 해석되지 말아야 한다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 이후 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 수행에서 잘 기능하는 것으로 본원 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고 따라서 이의 수행을 위해 바람직한 양상을 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 인지해야 한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 측면에서 기재된 특정 양태에 많은 변화가 가해질 수 있고 여전히 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인지한다.
실시예 1: 최적화된 범용 Fc 글리칸의 예시적 구조
치료학적 항체에 대해 최적화된 범용 Fc 글리칸의 글리칸 구조는 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (도 1)이다.
Figure pct00018
도 1. 치료학적 항체의 최적화된 범용 Fc 글리칸의 구조
실시예 2: Fc 영역에서 최적화된 범용 글리칸을 갖는 동종성 항체의 제조를 위한 예시적 일반 과정
본 발명은 (a) 모노클로날 항체를 α-푸코시다제 및 적어도 하나의 엔도글리코시다제와 접촉시켜 단일 N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화된 항체를 생성시키는 단계 및 (b) 범용 글리칸을 항체의 Fc 영역의 GlcNAc에 첨가하여 최적화된 글리칸 형태를 보여주는 도 1에서와 같이 동종성 항체를 형성하는 단계를 포함하는 Fc 영역에서 최적화된 범용 글리칸을 갖는 동종성 항체 집단을 제조하기 위한 예시적 개선된 방법을 제공한다 (도 2).
도 2를 참조한다. 이의 치료학적 활성을 개선시키기 위해 Fc 영역에서 최적화된 범용 글리칸을 갖는 동종성 항체의 제조를 위한 일반 전략.
엔도글리코시다제는 N-글리칸에서 올리고사카라이드의 가변 부분을 제단하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 엔도글리코시다제의 예는 EndoA, EndoF, EndoFl, EndoF2, EndoH, EndoM, EndoS, 및 이의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
실시예 3: 모노클로날 항체 매개된 항바이러스 치료를 증진시키는 방향으로 Fc 영역에서 범용 글리칸을 갖는 동종성 항체의 제조.
이의 ADCC 효과를 증가시키기 위해 Fc 영역에서 범용 글리칸을 갖는 동종성 항-인플루엔자 바이러스의 예시적 제조 방법.
헤마글루티닌 (HA)의 보존된 스톡 (stalk) 영역을 표적화하는 광범위한 중화 모노클로날 항체는 항체 Fc와 Fc 수용체 간의 상호작용에 의해 촉진되어 이의 기능을 유발할 수 있다. 항-인플루엔자 바이러스 항체 FI6은 이의 입증된 ADCC 효과를 기준으로 선택되었고 다른 항-인플루엔자 바이러스 항체 F10은 본원에 기재된 일반 전략 및 방법을 사용함에 의해 최적화된 범용 글리칸을 갖는 동종성 항체의 제조를 위해 (HA)의 스톡 영역을 표적화한다. 간략하게, FI6 및 F10 항체는 문헌에 보고된 방법(ref)에 의해 제조하였다. 수제 이종성 모노클로날 항체 FI6 또는 F10은 출발 물질로서 사용하였고 엔도글리코시다제 엔도 S로 변형시켜 GlcNAc-Fuc의 2당 mAb 및 GlcNAc의 1당 mAb의 혼합물을 수득하였다. 후속적으로 동종성 1당 mAb는 푸코시다제를 적용하여 수득하거나 1당 종은 하나의 단계에서 Endo S와 푸코시다제를 조합하여 수득하였다.
인산나트륨 완충액 (50 mM, pH 7.0, 0.125 mL) 중 FI6/F10 (0.25 mg)은 22시간 동안 37 ℃에서 Endo S (12.5 μg) 및 BfFucH (0.25 mg)로 항온처리하였다. LC-MS 및 SDS-PAGE 분석은 중쇄 상의 N-글리칸의 완전한 절단을 지적했다. 반응 혼합물은 인산나트륨 완충액 (20 mM, pH 7.0)과 예비 평형화된 단백질 A-아가로스 수지(0.1 mL)의 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 상기 칼럼은 인산나트륨 완충액 (20 mM, pH 7.0, 1.0 mL)으로 세척하였다. 결합된 IgG는 글라이신-HCl(50 mM, pH 3.0, 1.0 mL)로 방출시키고, 용출 분획물은 Tris-Cl 완충액 (1.0 M, pH 8.3)으로 즉시 중화시켰다. Fc 단편을 함유하는 분획물을 조합하고 원심분리 여과 (Amicon Ultra centrifugal filter, Millipore, Billerica, MA)로 농축시켜 모노-GlcNAc 동종성 항체 (0.193 mg)를 수득하였다. 생성물을 트립신 처리하고 당펩타이드, TKPREEQYNSTYR 및 EEQYNSTYR은 나노스프레이 LC/MS를 사용하여 분석하여 글리칸 가공 FI6/F10의 당화 패턴을 확인하였다.
암닭 난황으로부터의 시알릴글리칸 (SCT)의 분리는 약간의 변형과 함께 공개된 방법에 따랐다. 간략하게, 암닭 난황의 에탄올 추출물을 원심분리하고 여과하고 endo M으로 처리하고, 반응이 종결된 후 SCT는 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제하고, 정제된 SCT는 동결건조시켜 백색 분말 (82 %)로서 순수한 SCT 생성물을 수득하였다.
물 (60.0 μL) 중에서 SCT (Sia2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc) (3.0 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드 (DMC) (6.3 mg) 및 Et3N (9.0 μL) 용액을 1시간 동안 4 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 0.05 % 수성 Et3N에 의해 용출되는 세파덱스 G-25 칼럼 상의 겔 여과 크로마토그래피에 적용하였다. 생성물 (SCT 옥사졸린)을 함유하는 분획물을 조합하고 동결건조시켜 백색 분말 (2.6 mg, 수율 87.4 %)을 수득하였다.
SCT 옥사졸린을 50 mM Tris 완충액 (pH 7.8) 중에서 글리코신타제 및 모노-GlcNAc FI6 또는 F10의 혼합물에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 상기 반응 혼합물은 단백질 A 친화성 칼럼으로 정제하고 이어서 음이온 교환 칼럼 capto Q로 정제하여 목적하는 생성물, 최적화된 항-인플루엔자 바이러스 동종성 항체 FI6-M 또는 F10-M을 수거하였다. 생성물은 트립신 처리하고 당펩타이드, TKPREEQYNSTYR 및 EEQYNSTYR은 나노스프레이 LC/MS를 사용하여 분석하여 FI6-M 또는 F10-M의 당화 패턴을 확인하였다.
실시예 4:
FI6/F10 및 당가공 FI6-M/F10-M의 ADCC 검정. 도 3은 항-인플루엔자 바이러스 항체의 증진된 ADCC 결과를 입증하였음을 보여준다.
항-바이러스 항체-의존성 세포 매개된 세포성 세포독성 (ADCC) 증진은 글리칸 변형을 갖는 항-인플루엔자 모노클로날 항체 FI6 및 F10을 사용하여 입증된다. 인간 HEK293T 세포는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켜 세포 표면 상에 전장 Cal/09 HA를 발현시켜 인플루엔자 바이러스 감염된 세포를 모방하였다. 이들 세포는 건강한 공여자로부터 단리된 새롭게 제조된 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)와 혼합하고 감염된 세포 대 PBMC의 비율은 1:20 또는 1:50이다. 이어서 글리칸 변형 존재 및 부재하에 상이한 농도에서 항체 FI6 및 F10을 상기 혼합물에 첨가한다. 5시간 후, FI6 및 F10 유도된 ADCC의 결과는 HEK293T 세포 용해 (LDH 방출)에 의해 모니터링하였다. 상기 결과는 당 변형을 갖는 항체 FI6 및 F10에 의해 유도된 ADCC가 1.5 내지 3배 증진됨을 보여준다.
실시예 5: ADCC 검정을 위한 예시적 방법 및 재료
실시예: 항-줄기 모노클로날 항체 FI6 및 F10
F10 및 FI6 항체 발현 플라스미드는 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293F 세포에 형질감염시키고 프리스타일 293 발현 배지 (Invitrogen) 중에서 배양하였다. 7일 배양 후, 상등액은 원심분리에 의해 수거하고 항체는 단백질 A 비드 (Roche Diagnostics)에 의해 정제하였다. 항체는 추가로 PBS 완충액 중에서 Superdex 200 (GE Healthcare) 상의 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 6:
시험관내 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 검정
HEK293T 세포는 48시간 동안 pVax-Cal/09 헤마글루티닌 (HA) 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. HA-발현 HEK293T 세포는 트립신 처리하고 50 ㎕ DMEM 배지 (Gibco) 중에서 웰당 5,000개 세포로 96-웰, U-기저 플레이트에 씨딩하였다.
말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)는 건강한 지원자로부터 수득된 전혈의 피콜-파크(Ficoll-Paque) 분리에 의해 제조하고 ADCC 검정에서 이펙터 세포로서 사용하였다. 간략하게, 전혈은 동등한 용적의 HBSS로 희석시키고 피콜-파크 플러스 (GE Healthcare) 상에 적층시키고 40분 동안 400 g에서 원심분리하였다. PBMC 세포를 수거하고 HBSS로 2회 세척하였고 50/1의 이펙터 대 표적 비율을 사용하여 HA-발현 HEK293T 세포와 혼합하였다.
PBMC, 및 HA-발현 HEK293T 세포의 혼합물을 상이한 농도의 항체 FI6 및 F10으로 처리하고 37 ℃에서 5시간 동안 항온처리하였다.
5시간 항온처리 후, ADCC는 cytoTox96 비-방사능활성 세포독성 검정 키트 (Promega)를 사용하여 방출된 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)를 측정함에 의해 모니터링하였다.
실시예 7: 모노클로날 항체 매개된 항암 치료제를 증진시키는 방향으로 Fc 영역에서 범용 글리칸을 갖는 동종성 항체의 제조
대표적인 실시예:
상업적으로 시판되는 Rituxan® 및 Herceptin®은 Fc 영역에서 범용 글리칸을 갖는 동종성 항-인플루엔자 바이러스 항체의 제조를 위해 이전에 기재된 동일한 방법 후 출발 물질로서 사용하였다. Fc 영역에서 최적화된 범용 글리칸 Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 갖는 동종성 Rituxan® 및 Herceptin®을 수득할 수 있다. 동일한 방법을 사용하여, 본원 발명자는 또한 상이한 글리칸을 갖는 항체 활성의 비교를 위해 이들의 Fc 영역에서 상이한 글리칸형태를 갖는 상이한 동종성 Rituxan® 및 Herceptin® 항체를 제조하였다.
항-CD20 동종성 항체의 생물학적 특성
Fc 상의 당화는 ADCC, CDC 및 순환 반감기를 포함하는, 다양한 면역글로불린 이펙터 매개된 기능에 영향을 미칠 수 있다. ADCC 증진은 치료학적 항체 약물 효능을 개선시키기 위한 주요 전략이다. 이것은 보다 낮은 약물 비용의 이득을 위해 효과적인 약물 용량을 저하시킬 수 있다. 본원에 기재된 항-CD20 동종성 항체는 기능적 성질을 특징으로 할 수 있다. 항-CD20 GAb는 인간 CD20 발현 세포에 대한 아폽토시스를 포함하는 세포 성장 억제 활성을 갖는다. 일부 양태에서, 항-CD20 GAb는 이의 모 항체와 비교하여 보다 강력한 세포 성장 억제 활성을 나타낸다.
실시예 8:
항-CD20 당항체의 ADCC 활성
본 발명에 따른 동종성 항체의 ADCC 활성은 모 항체의 ADCC 활성과 비교하여 적어도 8배, 바람직하게 적어도 15배 증가되고, 보다 바람직하게 적어도 35배 증가된 ADCC 활성, 바람직하게 적어도 50배 증가된 ADCC 활성, 바람직하게 적어도 60배 증가된 ADCC 활성, 가장 바람직하게 적어도 80배 증가된 ADCC 활성을 나타낸다.
본 발명의 동종성 항체의 ADCC 용해 활성은 예를 들어, SKBR5, SKBR3, LoVo, MCF7, OVCAR3 및/또는 Kato III과 같은 표적 암 세포주를 사용하여 모 항체와 비교하여 측정될 수 있다.
본원에 기재된 다수의 항-CD20 GAb, 특히 GAb101, 및 GAb104는 이의 모 항체인 리툭시맙과 비교하여 증진된 ADCC 활성을 나타냈다. 본 발명의 동종성 항체는 B 세포 매개된 악성 종양, 및 B 세포 또는 B 세포에 의해 제조된 항체가 관여하는 면역학적 질환에 대한 치료학적 제제로서 우수한 효과를 나타낼 수 있고, 본 발명의 목적은 치료학적 제제의 개발에서 항-CD20 GAb를 사용하는 것이다.
실시예 9: 항-CD20 당항체의 CDC 활성
본원에 기재된 동종성 항체는 놀랍게도 CDC에 영향을 주는 것 없이 개선된 ADCC를 제공할 수 있다. 예시적 CDC 검정은 실시예에 기재되어 있다. 예시적 양태에서, 당항체의 ADCC는 증가되지만 보체 의존성 세포독성 (CDC)과 같은 다른 면역글로불린형 이펙터 기능은 유사한 채로 남아있거나 상당히 영향받지 않는다.
FcγRIII 및 항-CD20 당항체 간의 결합
FcγRIIIA를 HEK-293 세포에 형질감염시켜 재조합 단백질을 발현한다. 분비된 FcγRIIIA 재조합 단백질을 정제하고 이어서 HBS-EP 완충액 중에서 일련의 농도로 희석시켰다 (200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 및 12.5 nM). 항-CD20 GAbs101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 및 111 각각은 HBS-EP 완충액 중에서 10 mg/ml의 농도로 희석시키고 이어서 CM5 칩 (여기서, 항-인간 Fab 도메인 항체는 예비 고정화되어 있다)에 포획하였다. FcγRIIIA의 연속 적정액을 주사하고 30 ml/분의 유속으로 결합시켰다. 단일 주기 역학 데이터는 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 피팅하여 평형 상수 (Ka/Kd)를 측정하였다. 상기 결과는 표 2에 나타내었다.
표 2는 항-CD20 GAb 및 리툭시맙의 예시적 FcγRIIIA 결합을 열거한다. FcγRIIIA 결합은 당업계에 공지된 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적 검정은 실시예에 기재되어 있다. Fc 수용체 결합은 항-CD20 GAb 대 리툭시맙의 상대적 비율로서 결정될 수 있다. 예시적 양태에서 Fc 수용체 결합은 적어도 1.2-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배 또는 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 100-배 이상 증가된다.
표 2.
리툭시맙과 비교하여, 상기 결합 데이터는 항-CD20 GAb, 특히, GAb 101 및 GAb104가 표적 분자 CD20에 대해 보다 강한 결합 친화성을 나타냄을 보여주었다.
종합해 보면, 항-CD20 GAb, 특히 GAb101, 및 GAb104는 리툭시맙과 비교하여 증진된 ADCC 활성 및 보다 강한 FcγRIIIA 결합 친화성을 나타냈다. 본 발명의 동종성 항체는 단독으로 또는 바람직하게 2개 이상의 상기 항체를 포함하는 조성물 및 임의로 화학치료요법과 같은 다른 치료와 조합하여 보다 우수한 임상적 반응을 제공할 수 있다. ADCC-증진된 항-CD20 당항체는 B-세포 림프종 및 다른 질환에 대한 대안적 치료제를 제공할 수 있다. 본 발명의 당항체는 현재 투여 경로 및 현재 치료학적 용법을 변화시키기 위해 사용될 수 있고 이는 이들의 증가된 이펙터 기능이, 이들이 보다 낮은 농도 및 보다 적은 횟수로 투여되어 항체 독성에 대한 잠재력 및/또는 항체 내성의 발병을 감소시킬 수 있음을 의미한다. 추가로, 이들의 개선된 이펙터 기능은 이전에 재조합 숙주 시스템에서 제조된 상응하는 항-CD20 모노클로날 항체를 사용한 치료에 내성이었거나 난치성이었던 임상적 징후를 치료하는 것에 대한 새로운 방법을 생성시킨다.
실시예 10: B-림프종 세포로의 결합
리툭산-SCT (GAb101) 및 리툭산 모노-GlcNAc의 라모스 세포, 라지 및 SU-DHL-4 세포로의 결합 활성을 조사하였고 상기 결과는 둘 다가 리툭시맙과 유사한 결합 활성을 가짐을 보여주었다 (도 4).
도 4. CD20을 갖는 상이한 세포와 상이한 동종성 항체의 결합 활성.
실시예 11: CDC 대 B-림프구 세포
라모스 세포, 라지 및 SU-DHL-4 세포에 대한 리툭산-SCT (GAb101) 및 리툭산 모노-GlcNAc의 CDC 효과를 시험하였다. 라모스 세포와 함께 나타나는 비교 CDC 프로필 (GAb101에 의해 증진되고 리툭산-GlcNAc에 의해 감소된)은 다른 B-림프종 세포주 SU-DHL-4 (도 5 우측 패널)에서 확인되었다. 재현성 결과는 상이한 세포 계대를 사용한 제2 시기 상에 수행되는 경우 수득되었다.
실시예 11:
도 5를 참조한다. 인간 B 세포의 고갈
인간 B 세포의 고갈은 인간 혈액으로부터 새롭게 제조된 인간 PBMC 세포를 사용하여 수행하였다. 미세플레이트 상에서 배양된 RPMI 1640-5 % FBS 중 2 x 106의 세포를 4시간 동안 37 ℃에서 15 % 자가 혈장의 부재 또는 존재하에 상이한 농도의 항-CD20 GAb 리툭산-SCT, 리툭산-GlcNAc 및 리툭시맙으로 항온처리하였다. 세척 후 세포는 5분 동안 빙상에서 항-CD2-PE 및 항-CD 19-FITC로 염색시켰다. B 세포 고갈은 CD19+ CD2-B 세포를 기준으로 FACS 상에서 분석하였다. (도 6) 도 6을 참조한다. 상이한 동종성 항체에 의한 인간 B 세포의 고갈.
실시예 12: B-림프종 세포로의 결합.
항체의 결합은 CD20+ B 림프종 세포주(라모스, 라지 및)에서 조사하였고 유동 세포측정 상에서 분석하였다. 미세플레이트 상에서 2 x 105/웰로 1 % 태아 소 혈청을 함유하는 PBS 중의 세포는 상이한 농도에서 목적하는 항체로 1시간 동안 빙상에서 항온처리하였다. 세포는 세척하고 PBS 완충액 중에 재현탁시키고 30분 동안 빙상에서 검출하는 염소 항-hIgG-Fcγ-PE로 항온처리하였다. 세포를 세척하고 FACS 상에서 분석하였다.
실시예 13: FcRIIIa-발현 CHO 세포로의 결합.
항체 의존성 세포성 세포 독성 (ADCC)의 유도와 서로 관련된 것으로 공지된 전구체 반응인, 항체의 FcRIIIa 수용체 (CD16a)로의 결합은 고친화성 CD16a (158Val)로 형질감염시킨 CHO 세포에서 조사하였고 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. 미세플레이트 상의 1 x 105/웰에서 1 % 태아 소 혈청을 함유하는 PBS 중의 세포는 상이한 농도에서 목적하는 항체와 1시간 동안 빙상에서 항온처리하였다. 세포를 세척하고 PBS 완충액 중에 재현탁시키고 30분 동안 빙상에서 염소 항-hIgG-Fcγ-PE로 항온처리하였다. 세포를 세척하고 FACS 상에서 분석하였다.
B-림프종 세포에 대한 보체-의존성 세포독성 (CDC). 항체에 의해 유도된 CDC 효과는 CD20+ B 림프종 세포주 (라모스 및 SKW6.4)에서 조사되었고 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. 미세플레이트 상에서 2.0 x 105/웰로 RPMI 1640 배양 배지에서 세포는 30분 동안 빙상에서 상이한 농도의 목적하는 항체로 항온처리하였다. 세포를 세척하고 37 ℃에서 30분 동안 RPMI 1640 중에서 10 % 인간 혈청으로 항온처리하였다. 세포는 세척하고 5분 동안 암실에서 PI 시약으로 항온처리하였다. CDC에 의한 세포사는 FACS 상에서 분석하였다.
B-림프종 세포에 대한 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC). 당-항체에 의해 유도된 ADCC 효과는 이펙터 세포로서 새롭게 제조된 인간 PBMC를 사용하여, CD20-함유 B 림프종 세포주 (라모스 및 SKW6.4)에서 조사되었고 상기 결과는 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. PBS-0.1 % BSA에서 표적 B 세포는 먼저 5분 동안 37 ℃에서 CFSE로 표지시켰다. 세척 후, RPMI 1640 배지에서 CFSE-표지된 세포는 미세플레이트 상에서 4시간 동안 37 ℃에서 상이한 농도의 목적하는 당-항체 및 PBMC 이펙터 세포로 항온처리하였다. 표적 세포 대 이펙터 세포의 비율은 25:1로 설정하였다. 상기 수득한 혼합물은 5분 동안 암실에서 PI 시약으로 염색시켰다. ADDC에 의한 세포사는 FACS 상에서 분석하였다.
인간 B 세포의 고갈. 인간 B 세포의 고갈은 인간 혈액으로부터 새롭게 제조된 인간 PBMC 세포를 사용하여 수행하였다. 미세플레이트 상에서 배양된 RPMI 1640-5 % FBS 중에 2 x 106의 세포는 4시간 동안 37 ℃에서 15 % 자가 혈장의 부재 또는 존재하에 상이한 농도의 목적하는 항체로 항온처리하였다. 세척 후 세포는 5분 동안 빙상에서 항-CD2-PE 및 항-CD 19-FITC로 염색시켰다. B 세포 고갈은 CD19+ CD2-B 세포를 기준으로 FACS 상에서 분석하였다.
글리칸 가공의 전략에 의한 동종성 Herceptin®의 제조.
상이한 글리칸 변형된 동종성 Herceptin®을 제조하기 위한 방법.
항-HER2 동종성 항체의 생물학적 특성
Fc 상의 당화는 ADCC, CDC 및 순환 반감기를 포함하는, 다양한 면역글로불린 이펙터 매개된 기능에 영향을 미칠 수 있다. ADCC 증진은 치료학적 항체 약물 효능을 개선시키기 위한 주요 전략이다. 이는 보다 낮은 약물 비용의 이득을 위한 효과적인 약물 용량을 저하시키는 잠재력을 갖는다. 본원에 기재된 항-HER2 당항체는 기능적 성질을 특징으로 할 수 있다. 항-HER2 GAb는 인간 FIER2 발현 세포에 대한 아폽토시스를 포함하는 세포 성장 억제 활성을 갖는다. 일부 양태에서, 항-HER2 GAb는 이의 모 항체와 비교하여 보다 강력한 세포 성장 억제 활성을 나타낸다.
항-HER2 당항체의 ADCC 활성
본 발명에 따른 당항체의 ADCC 활성은 모 항체의 ADCC 활성과 비교하여 적어도 3배 증가되고, 바람직하게 적어도 9배, 보다 바람직하게는 적어도 10배 증가된 ADCC 활성, 바람직하게 적어도 12배 증가된 ADCC 활성, 바람직하게 적어도 20배 증가된 ADCC 활성, 가장 바람직하게는 적어도 30배 증가된 ADCC 활성을 나타낸다.
본 발명의 당항체의 ADCC 용해 활성은 SKBR5, SKBR3, LoVo, MCF7, OVCAR3 및/또는 Kato III와 같은 표적 암 세포주를 사용하여 모 항체와 비교하여 측정될 수 있다.
표 3은 트라스투주맙과 비교하여 항-HER2 GAb의 예시적 증진된 ADCC 활성을 열거한다. 예시적 검정은 하기의 실시예에 기재되어 있다.
[표 3]
Figure pct00019
Anti-HER2: 항-HER2
Trastuzumab: 트라스투주맙
(fold) (배수)
본원에 기재된 다수의 항-HER2 GAb, 특히 GAb101, 및 GAb104는 이의 모 항체, 리툭시맙과 비교하여 증진된 ADCC 활성을 나타낸다. 본 발명의 당항체는 HER2-양성 질환에 대한 치료학적 제제 보다 우수한 효과를 나타낼 수 있고 본 발명의 목적은 치료학적 제제의 개발에서 항-HER2 GAb를 사용하는 것으로 고려된다.
항-HER2 당항체의 CDC 활성
본원에 기재된 당항체는 놀랍게도 CDC에 영향을 주는 것 없이 개선된 ADCC를 제공할 수 있다. 예시적 CDC 검정은 실시예에 기재되어 있다. 예시적 양태에서, 당항체의 ADCC는 증가되지만 보체-의존성 세포독성 (CDC)와 같은 다른 면역글로불린형 이펙터 기능은 유사한채로 남아있고 상당히 영향받지 않는다.
FcγRIII과 항-HER2 당항체 간의 결합
표 4는 항-HER2 GAb 및 리툭시맙의 예시적 FcγRIIIA 결합을 열거한다.
표 4.
FcγRIIIA 결합은 당업계에 공지된 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적 검정은 실시예에 기재되어 있다. Fc 수용체 결합은 항-HER2 GAb 대 트라스투주맙의 상대적 비율로서 결정될 수 있다. 예시적 양태에서 Fc 수용체 결합은 적어도 2.5-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 15-배 또는 20-배, 30-배, 40-배, 50-배 이상까지 증가된다.
트라스투주맙과 비교하여, 결합 데이터는 항-HER2 GAb, 특히 GAb101 및 GAb104가 표적 분자 HER2에 대해 보다 강한 결합 친화성을 나타냄을 보여주었다.
종합해 보면, 항-HER2 GAb, 특히 GAb101, 및 GAb104는 트라스트주맙과 비교하여 증진된 ADCC 활성 및 보다 강한 FcγRIIIA 결합 친화성을 나타낸다. 본 발명의 당항체는 단독으로 또는 바람직하게 2개 이상의 상기 항체를 포함하는 조성물에서 및 임의로 화학치료요법과 같은 다른 치료와 조합하여 우수한 임상적 반응을 제공할 수 있는 것으로 고려된다. ADCC-증진된 항-HER2 당항체는 HER2-양성 질환에 대한 대안적 치료제를 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 본 발명의 당항체는 유리하게 현재 투여 경로 및 현재 치료학적 용법을 변형시키기 위해 사용될 수 있고 이는 이들의 증가된 이펙터 기능이, 이들이 보다 낮은 농도 및 보다 낮은 횟수로 투여되어 항체 독성에 대한 잠재력 및/또는 항체 내성의 발생을 감소시킬 수 있음을 의미한다. 추가로, 이들의 개선된 이펙터 기능은 이전에 재조합 숙주 시스템에서 제조된 상응하는 항-HER2 모노클로날 항체를 사용한 치료에 내성이었거나 난치성인 임상적 징후를 치료하기 위한 새로운 방법을 생성시킨다.
모노클로날 항체 매개된 항-염증 치료제를 증진시키는 방향으로 Fc 영역에서 범용 글리칸 (SCT)을 갖는 동종성 항체의 제조
siaa2,6Gal 구조를 갖는 Fc 영역은 항-염증 활성을 증가시킬 수 있다. 여기서, 본원 발명자는 이의 항-염증 활성을 개선시키기 위해 Fc 영역에 SCT 글리칸을 갖는 동종성 휴미라를 제조한다.
항-TNFα의 N-당화의 분석을 위한 일반 과정
본원 발명자는 당펩타이드 전구체에 적용되는 충돌 유도된 해리 (CID) 에너지에 대한 올리고사카라이드-유래된 단편 이온 (옥소늄 이온)의 수율을 모니터링하기 위해 질량 분광측정 방법을 개발하였다. 옥소늄 이온 방법의 다중 반응 모니터링 (MRM)은 향후 생물유사한 치료제의 일상적인 품질 관리 분석에 대한 규제 요건을 충족할 수 있다.
5 ㎍의 아달리무맙 (Humira®) (제조원 (Abbvie)으로부터 구입함)을 25 ㎕의 2M 구아니딘-HCl 중에 용해시키고 디티오트레이톨 (DTT)을 최종 농도 5 mM로 첨가하였다. 110 ℃에서 10분 항온처리 후, 감소된 시스테인 잔기는 1시간 동안 37 ℃에서 10 mM 로도아세트아미드 (IAA) 중에서 알킬화시켰다. RT에서 10분 동안 5 mM의 DTT를 첨가하여 과도한 IAA를 켄칭하였다. 생성물은 회전 칼럼 (lO kDa 단백질 MW 컷-오프)으로 미세원심분리하기 전에 50 mM 중탄산나트륨 중에서 15배 희석시켰다. 트립신 분해는 1:25 (w/w)의 효소 단백질 비율을 사용하여 37 ℃에서 4시간 동안 수행하였다. 샘플은 LC-MS/MS 분석을 위해 -20 ℃에서 동결시켰다.
기기 장치
m/z 204 옥소늄 이온 (HexNAc) 모니터링에 의한 당펩타이드 정량은 Aglient 1200 HPLC 시스템을 갖는 4000 QTrap 3중 사중극자 분광측정기 (AB Sciex)를 사용하여 수행하였다. 당펩타이드 미세이종성의 상대적 정량을 위해, 전구체 이온 m/z를 인-실리코 유래하고 이는 모든 가능한 글리칸 조성물을 포괄하고 단일 정량적 전이는 각각의 전구체 이온 (Q3 m/z= 204)에 대해 모니터링하였다.
MS 데이터 분석
획득된 미가공 데이터는 애널리스트(Analyst) 1.5 (AB Sciex)로 가공하였다. 각각의 전이의 질량 크로마토그램을 적분하고 피크 면적에 의해 정량하였다. 각각의 성분의 % 조성은 조합된 모든 성분의 합과 관련하여 계산하였다.
항-TNFα 항체 휴미라-SCT의 제조
암닭 난황으로부터 시알릴글리코펩타이드 (SGP)의 분리는 공개된 방법에 따랐다. 간략하게, 암닭 난황의 페놀 추출물을 원심분리하고 여과하고 Sephadex G-50, Sephadex G-25, DEAE-Toyoperarl 650M, CM-Sephadex C-25 및 Sephadex G-25를 포함하는 크로마토그래피 칼럼에 의해 정제하였다. 인산나트륨 완충액(50 mM, pH 6.0, 5 mM) 중 시알릴글리코펩타이드 (SGP) (52 mg) 용액을 37 ℃에서 Endo M (53㎍)으로 항온처리하였다. 7시간 후, 반응 혼합물은 물에 의해 용출되는 Sephadex G-25 칼럼 상의 겔 여과 크로마토그래피에 적용하였다. 생성물을 함유하는 분획물을 조합하고 동결건조시켜 백색 분말 (30 mg, 수율 82 %)로서 생성물 (글리칸-101)을 수득하였다.
물 중에서 글리칸-101 (Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc) (30 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드 (DMC) (62.7 mg) 및 Et3N (89 ㎕) 용액을 1시간 동안 4 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 Sephadex G-25 칼럼 상의 겔 여과 크로마토그래피에 적용하고 0.05 % 수성 Et3N에 의해 용출시켰다. 생성물 (SCT 옥사졸린)을 함유하는 분획물은 조합하고 동결건조시켜 백색 분말을 수득하였다.
SCT 옥사졸린은 50 mM Tris 완충액 (pH 7.8) 중의 엔도글리코시다제 및 GAb 휴미라-GlcNAc의 혼합물에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 반응 혼합물은 단백질 A 친화성 칼럼으로 정제함에 이어서 음이온 교환 칼럼 capto Q로 정제하여 목적하는 생성물인, 항-TNFα GAb101을 수거하였다. 생성물은 트립신처리하고 당펩타이드, TKPREEQYNSTYR 및 EEQYNSTYR은 나노스프레이 LC/MS를 사용하여 분석하여 휴미라-SCT의 당화 패턴을 확인하였다.
항-TNFα의 결합 친화성
158개 아미노산 (MW=17.5 kDa)을 함유하는 인간 재조합 TNF-α를 이. 콜라이 (PROSPEC)로부터 제조하고 정제하였다. 재조합 인간 TNF-α 단백질을 적정하고 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 및 3.125 nM의 연속 희석물을 HBS-EP 완충액 중에서 제조하였다. 아달리무맙 및 항-TNFα GAb 200 및 401은 HBS-EP 완충액 중에서 10 μg/ml의 농도로 희석하고, 이어서 CM5 칩 (여기서, 항-인간 Fc 도메인 항체는 예비-고정화되어 있다)에 포획하였다. 분석물로서 일련의 농도의 재조합 인간 TNF-알파를 수득하고 이어서 주입하고 30 ㎕/분의 유속으로 칩상에 포획된 항체에 결합시켰다. 결합 후, 항체-분석물 복합체는 50 ㎕/분의 유속으로 재생 완충액, 10 mM 글라이신-HCl pH 1.5에 의해 세척하였다. CM5 칩은 추가의 사용을 위해 4 ℃에서 PBS pH 7.4에 유지시켰다. 단일 주기 역학 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델로 피팅하여 평형 상수 (Ka/Kd)를 측정하였다.
실시예 13: 항-SSEA-4 모노클로날 항체의 생산
하이브리도마 방법은 SSEA-4에 특이적인 mAb의 개발을 위해 사용하였다. 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스는 SSEA-4 백신으로 3회 피하 면역화시켰다. 3회 면역화는 2주 간격으로 주어졌다. 각각의 백신 접종은 2 μg의 SSEA-4를 함유하였다. 모든 혈청은 10분 동안 4,000 × g에서 원심분리하여 수득하였다. 혈청학적 반응은 글리칸 현미경으로 분석하였다. 최종 부스트는 2 μg의 SSEA-4로 복강내 주어졌고, 3일 후, 면역화된 마우스로부터 비장 세포는 하이브리도마를 제조하기 위해 사용하였다.
목적하는 항원-결합 활성을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 다음과 같이 스크리닝하였다. 미세역가 플레이트는 탄산 완충액, 0.1 M, pH 9.6에서 4 ℃에서 밤새 4 μg/mL의 뉴트라비딘으로 항온처리함에 의해 코팅시켰다. 웰은 1시간 동안 PBS, pH=7.3에서 1 % BSA로 차단시키고 1시간 동안 4 μg/mL의 SSEA-4-비오틴으로 항온처리하였다. 항혈청은 37 ℃에서 1시간 동안 다양하게 희석시켰다. 세척 후, 리간드-결합 항체는 1:10,000의 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체 (Jackson ImmunoResearch)에 의해 검출하고 37 ℃에서 1시간 동안 항온처리함에 이어서 TMB 기질과 항온처리하였다. OD는 450 nm에서 결정하였다. 양성 클론은 추가의 특징 분석을 위해 선택하였다. 3개의 예시적 클론 45, 46 및 48은 SSEA-4에 특이적으로 결합함으로써 본 연구에서 동정되었다. 마우스 모노클로날 이소형 분류를 위해, IsoQuick 스트립 및 키트를 사용하였다 (sigma, I9535). 하이브리도마 배지를 반응 바이엘에 첨가한다. 스트립이 꼿꼿해 지도록 확실히 하면서 상기 스트립을 샘플에 삽입한다. 상기 샘플은 스트립을 상향 이동한다. 스트립은 최종 해석하기 전 5분 동안 전개되도록 한다.
mAb 45,46 및 48의 VH 및 VL 유전자 분절은 항체를 분비하는 하이브리도마 클론으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 이와 같이 수득된 상기 유전자 분절은 서열 분석하여 표 3 내지 5에 나타낸 바와 같이 mAb 45, 46 및 48의 VH 및 VL 서열을 결정하였다.
실시예 14: 키메라 항체의 생성
mAb 273 및 651의 VH 및 VL 유전자 분절은 항체를 분비하는 하이브리도마 클론으로부터 PCR로 증폭시켰다. 이와 같이 수득된 유전자 분절은 서열 분석하여 표 1 및 2에 나타낸 mAb 273 및 651의 VH 및 VL 서열을 결정하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 도 9에 보여지는 바와 같이 인간 IgG1 항체 발현 벡터에 클로닝하였다. VH는 효소 부위 BsiWI 및 ApaI를 사용하고, VL은 효소 부위 BsPEI 및 NheI를 사용하였다. 벡터는 293F 또는 CHO-S 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 재조합 키메라 Ab를 정제하고 결합 검정 및 보체-의존성 종양 세포 용해 검정에 대해 추가로 연구한다.
mAb 46 및 48의 VH 및 VL 유전자 분절은 항체를 분비하는 하이브리도마 클론으로부터 PCR로 증폭시켰다. 이와 같이 수득된 유전자 분절은 서열 분석하여 표 5 및 4에 나타낸 mAb 46 및 48의 VH 및 VL 서열을 결정하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 도 9에 보여지는 바와 같이 인간 IgG1 항체 발현 벡터에 클로닝하였다. VH는 효소 부위 BsiWI 및 ApaI를 사용하고, VL은 효소 부위 BsPEI 및 NheI를 사용하였다. 벡터는 293F 또는 CHO-S 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 재조합 키메라 Ab를 정제하고 결합 검정 및 보체-의존성 종양 세포 검정에 대해 추가로 연구한다.
실시예 15: 유동 세포측정에 의한 암 세포에 대한 항체의 결합 분석
mAb 273 및 항-SSEA-4 (mAb 45, 46 및 48)의 암 세포주로의 결합을 조사하였다. 세포 (1 x 1O5)는 다양한 농도의 항체를 함유하는 100 μL의 FACS 완충액 (1 % BSA/PBS 용액) 중에 재현탁시키고 30분 동안 빙상에서 항온처리하였다. FACS 완충액으로 2회 세척한 후 세포는 FACSCalibur 시스템 (BD Biosciences) 상의 분석 전에 빙상에서 30분 동안 649-표지된 염소 항-마우스 항체 (1:100; Jackson ImmunoResearch)로 항온처리하였다. 상기 결과는 도 7a-d에 나타낸다. 유방암 세포 MCF-7는 mAb 273으로 염색하였다 (도 7a). 췌장암 세포 (HPAC 및 BxPC3) 및 유방암 세포 MCF-7은 mAb 45로 염색하였다 (도 7b). 췌장암 세포 (HPAC 및 BxPC3) 및 유방암 세포 MCF-7은 mAb 46으로 염색하였다 (도 7c). 췌장암 세포 (HPAC 및 BxPC3) 및 유방암 세포 MCF-7은 mAb 48로 염색시켰다 (도 7d).
본원 발명자는 또한, 표면 상에서 SSEA-4 헥사사카라이드로 MC45, MC48 및 MC813-70의 해리 상수를 결정하기 위해 글리칸 어레이를 사용하였고 MC45, 48 및 813에 대한 Kd 값은 아래에 나타낸다. 이러한 결과는 이들 mAb가 SSEA4에 대해 매우 특이적임을 나타내었다.
Figure pct00020
실시예 16: SSEA-4 발현 세포의 CDC를 매개하는 예시적 mAb 46 및 48의 능력을 조사하였다. 보체 공급원으로서 토끼 혈청의 존재하에 호모 사피엔스 췌장 선암종 세포 (BxPC3). 세포사는 생존능 프로브 7-AAD의 첨가로 평가하였다. 7-AAD 측정 결과를 토대로, %-특이적 용해는 FACScan 유동 세포측정기를 사용하여 계산하였다. 상기 항체는 40 μg/mL에서 약 20 % 사멸 활성을 보여주었다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, mAb 46 및 48은 SSEA-4 발현 세포의 CDC를 성공적으로 매개하였다.
실시예 15 예시적 파아지 디스플레이 바이오패닝 과정
파아지-디스플레이된 인간 순수 scFv 라이브러리 함유된 2.5 × 1010 클론 (Lu et al., 2011)은 실온 (RT)에서 1시간 동안 PEG-접합된 카복실 다이나비드 (Invitrogen)에서 비특이적 결합을 공제하고 이어서 1시간 동안 4 ℃에서 SSEA-4-PEG 고정화된 다이나비드로 항온처리하였다. PBS 또는 0.01 Tween 20 (PBST0.01)을 함유하는 PBS로 세척한 후, SSEA-4-PEG-다이나비드에 결합된 파아지는 0.5시간 동안 37 ℃에서 이. 콜라이 TGl로 감염시킴에 의해 회수하였다. 감염된 세포의 일부는 연속으로 희석하여 역가를 결정하고 다른 것들은 M13K07 파아지에 의해 구제하고 증폭시켰다. 구제된 파아지 역가의 결정 후, 다음 라운드의 바이오스패닝을 수행하였다. 제4 및 제5 라운드의 바이오스패닝에서, 파아지 클론을 무작위로 선택하여 ELISA 스크리닝을 위해 배양하였다.
선택된 파아지 클론의 ELISA 스크리닝
항원 인지의 검출을 위해, 마이크로웰 플레이트 (Nunc)는 각각 0.2 μg/mL의 SSEA-4-BSA, 글로보 H-BSA, SSEA-3-BSA 및 BSA로 코팅시켰다. 선택된 파아지 클론은 3 % BSA를 함유하는 PBS에서 1:2로 희석시키고 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트는 1시간 동안 RT에서 항온처리하고, PBSTO.1로 세척하고 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 마우스 항-M13 파아지 항체 (GE Healthcare)로 항온처리하였다. 상기 플레이트는 다시 세척하고 OPD 및 H202를 첨가하였다. 3N HC1에 의한 반응의 종결 후, 미세역가 판독기 (Model 680, BioRad)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본원 발명자는 자가-서열분석에 의해 scFv 암호화 영역을 동정하기 위해 ELISA-양성 파아지 클론으로부터 파아지미드를 추출하였다.
항-SSEA-4 인간 IgG의 작제 및 발현
선택된 scFv의 VH 영역은 AgeI 및 NheI 부위와 함께 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄의 시그날 펩타이드 및 불변 영역을 함유하는 변형된 발현 벡터 pcDNA5-FRT-감마 1에 클로닝하였다. 선택된 scFv의 VL 영역은 AgeI 및 EcoRV 부위와 함께 인간 면역글로불린 카파 경쇄의 시그날 펩타이드 및 불변 영역을 함유하는 변형된 발현 벡터 p-Kappa-HuGs에 클로닝하였다. 2개의 플라스미드는 FreeStyle293 세포 (Invitrogen)에 형질감염시키고 1주일 동안 37 ℃에서 무혈청 배지에서 계속적으로 항온처리하여 인간 항체를 제조하였다.
항-SSEA-4 인간 IgG의 정제
배양 배지를 수거하고 원심분리하고 0.45 μm 공극-크기 막으로 여과하였다. 이어서 상등액은 항-SSEA-4 인간 IgG의 정제를 위해 단백질 G 칼럼 크로마토그래피 (GE healthcare)에 적용하였다. PBS로 용출물을 투석한 후, 항체는 통상적으로 코마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석에 의해 조사하였다. 항체의 농도는 브래드포드 시약 (Thermo Scientific) 및 분광측정기로 평가하였다.
MC48의 인간화
2개의 인간 유전자들인, GenBank 승인번호 Q9UL73 및 AY577298은 각각, MC48 VH 및 VL과 가장 유사하였다. 본원 발명자는 Q9UL73의 변형된 프레임워크 (FR) 1 내지 FR4로 이루어진 제1 인간화된 MC48 (hMC48) VH 및 승인번호 AY577298로부터 4개의 FR, VH에 이어서 PDB 기원의 1YY8의 제2 hMC48 FR로 이루어진 제1 hMC48 VL을 포함하는 MC48의 3개의 서열을 인간화시켰고 제2 hMC48 VL은 제1 서열과 동일하고 제3 hMC48 VH 서열은 Q9UL73 유전자의 FR1, 2 및 4를 변형시키고 제3 hMC48 VL은 FR2 및 FR4를 인간 AY577298 유전자로 변화시켰다. 모든 이들 인간화된 서열은 MC48의 VH 및 VL의 CDR1 내지 CDR3을 보존하였다.
인간화된 MC48 변이체의 단일쇄 단편 가변 (scFv)의 작제
인간화된 MC48 서열 (VH-GGGGSGGGGSGGGGS-VL (서열번호 115))의 scFv 형태는 유전자 합성하였고 (Genomics) Sfi I 및 Not I (Fermentas)로 절단하였다. 겔 추출 후, 분해된 생성물은 pCANTAB-5E 파아지미드 (GE Healthcare)에 클로닝하였다.
인간화된 MC48 (hMC48) scFv 파아지 클론의 제조.
hMC48 변이체 파아지미드는 TGI 이. 콜라이로 형질전환시키고 100 μg/mL의 앰피실린 및 2 % 글루코스를 함유하는 2 × YT 배지 (BD Pharmingen)에서 회수하고 1시간 동안 37 ℃에서 M13K07 헬퍼 파아지 (NEB)로 구제하였다. 10분 동안 1,500 × g로 원심분리 한 후, 이들 펠렛은 밤새 100 μg/mL의 앰피실린 및 50 μg/mL의 가나마이신을 함유하는 2 × YT 배지에 재현탁시켜 scFv-파아지를 제조하였다.
ELISA에 의한 hMC48 scFv 파아지 클론의 결합 검정
SSEA-4-BSA는 0.2 μg/ml의 농도에서 ELISA 플레이트 상에 코팅시켰다. 세척 및 차단 후, 연속 희석된 파아지는 1.5시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 세척 후, 1:1000 희석된 HRP-접합된 항-M13 항체 (GE Healthcare)를 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 이어서, 액체 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 전개하고 3N HCl로 종결하였다. 광학 밀도는 450 nm에서 측정하였다.
결과
SSEA-4와 결합하는 파아지-디스플레이된 scFv의 동정
SSEA-4에 결합하는 항체를 동정하기 위해, 본원 발명자는 본원 발명자의 이전에 기재된 보고에서와 같이 확립된 파아지-디스플레이된 인간 순수 scFv 라이브러리 함유 2 × 1010 구성원을 사용하였다 (Lu et al., 2011). 상기 라이브러리는 처음으로 제거된 다이나비드-결합 파아지이고 이어서 SSEA-4-PEG-접합된 다이나비드에 의해 SSEA-4-결합 파아지에 대해 선택하였다. 본원 발명자는 바이오스패닝 동안에 2개의 완충제 시스템, PBS 및 0.01 % Tween20 (PBST0.01)을 함유하는 PBS를 사용하였다. 제5 라운드의 친화성 선택 후, 상기 제5 라운드의 파아지 회수는 각각 PBS 및 PBST 0.01 시스템에서 제1 라운드의 것 보다 약 55배 및 80배 증가시켰다 (도 10). 파아지 클론은 무작위로 선택하였고 ELISA에 의한 SSEA-4 결합에 대해 시험하였다 (도 11). 본원 발명자는 SSEA-4-BSA에 특이적으로 결합하지만 BSA 대조군 단백질에는 결합하지 않는 7개의 클론을 발견하였다. 모든 8개의 개별 클론을 서열 분석함에 의해, 본원 발명자는 독특한 인간 VH 및 VL 암호화 영역을 함유하는 2개의 독특한 항-SSEA-4 파아지 클론 (pl-52 및 p2-78)을 동정하였다 (도 16a).
2개의 파아지 클론의 특이성 및 결합 친화성을 조사하기 위해, 본원 발명자는 SSEA-4-BSA, 글로보 H-BSA 및 SSEA-3-BSA를 포함하는 글로보-계열 글리칸과 동일한 파아지 역가를 사용하는 비교 ELISA를 수행하였다 (도 12). p2-78 파아지 클론은 SSEA-4-BSA 및 SSEA-3-BSA에 강한 결합을 보여주었고, 글로보 H-BSA에 대해 약간의 약한 결합을 보여주었다. 그러나, 본원 발명자는 SSEA-4-BSA에 대한 pl-52 파아지의 결합 활성이 매우 약함을 발견하였다. 따라서, 본원 발명자는 추가의 연구를 위해 p2-78 클론에 집중하였다.
SSEA-4에 대한 완전한 인간 항체 (hAb)를 확립하기 위해, 본원 발명자는 p2-78 scFv의 VH 및 VH 암호화 서열을 각각 인간 IgG1 골격으로 분자적으로 가공하였다. 항-SSEA-4 p2-78 hAb는 프리스타일 293 발현 시스템을 사용하여 제조하고 이어서 단백질 G 세파로스 칼럼을 통해 정제하였다. 본원 발명자는 코마시 블루 염색과 함께 SDS-PAGE 분석에 의해 항체의 순도를 조사하였다 (도 13a). 상기 결과는 95 % 초과의 항체의 순도 수준을 보여준다. 후속적으로, 본원 발명자는 글로보-계열 글리칸에 대한 p2-78 hAb의 결합 활성을 조사하기 위해 ELISA를 수행하였다 (도 13b). 본원 발명자는 p2-78 hAb가 SSEA-4 및 SSEA-3에 결합하지만 글로보 H에는 결합하지 않음을 발견하였고 이는 인간 IgG 버젼의 p2-78이 이의 모체 scFv 버젼의 활성을 유지하여 SSEA-4의 결합 에피토프를 인지함을 입증한다.
본원 발명자는 203개의 상이한 글리칸을 함유하는 글리칸 어레이를 사용하여 p2-78 hAb의 특이성을 추가로 확인하였다. 상기 결과는 p2-78 hAb가 SSEA4, 시알릴-SSEA4, SSEA4Gc, 및 Gb5 (SSEA3)을 인지함음을 보여주었다 (도 14b). 흥미롭게도, p2-78 hAb는 또한 ELISA 검정 기원의 결과와 유사하게 글로보 H를 인지하였다 (도 12). 상업적으로 시판되는 IgM 항체인 MC631은 양성 대조군으로서 사용하였다 (도 14a).
인간화된 MC48 mAb의 개발
비-인간화된 쥐 mAb는 이들의 짧은 혈청 반감기, 인간 이펙터 기능을 유발하지 못하는 무능력 및 인간 항-쥐 항체 (HAMA) 반응의 생성 (LoBuglio et al., 1989)을 포함하는, 임상적 세팅에서 특정 한계를 가질 수 있다. 따라서, mAb는 이들의 CDR을 인간 Ig 분자의 VH 및 VL FR 상으로 접목시킴에 의해 인간화될 수 있다 (Roguska et al., 1994).
인간화된 MC48을 개발하기 위해, 본원 발명자는 하이브리도마 세포 기원의 MC48의 VH 및 VL 가변 영역을 서열분석하였다 (표 4). NCBI IgBLAST 데이터베이스를 사용한 MC48의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 MC48의 FR을 변형시키고 1차, 2차, 3차 및 4차 인간화된 MC48 서열을 생성시켰다 (표 17, 도 17). 본원 발명자는 이어서 이들 인간화된 MC48 서열에 따라 파아지-유래된 scFv 포맷을 작제하고 생성하였다. 인간화된 MC48 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다 (도 15 및 18). 본원 발명자는 인간화된 MC48 scFv 파아지가 용량 의존 방식으로 SSEA-4를 인자할 수 있음을 밝혔다. 상기 데이터는 4차 인간화된 MC48 scFv 파아지가 쥐 mAb MC48과 비교하여 이의 결합 친화성을 유지하였음을 지적했다.
실시예 16
보체-의존성 세포독성 (CDC) 검정
SSEA-4 발현 세포의 CDC를 매개하는 예시적 인간화된 MC48의 능력을 조사하였다. 호모 사피엔스 유방 또는 췌장 암종 세포는 검정 전에 밤새 성장을 위해 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 분주하였다. 이어서 상기 세포는 보체의 공급원 (1:5의 희석; Life Technologies)으로서 토끼 혈청의 존재하에 RPMI 중 연속 희석된 농도의 인간화된 MC48 또는 인간 IgG1 이소형 대조군으로 항온처리하였다. 세포사는 생존능 프로브 7-AAD를 첨가하여 평가한다. 7-AAD 측정 결과를 기준으로, %-특이적 가수분해는 FACScan 유동 세포측정기를 사용하여 계산한다. 상기 항체는 이소형 대조군과 비교하여 10 ㎍/mL에서 상당한 사멸 활성을 보여준다. 보여준 바와 같이, 인간화된 MC48-4는 성공적으로 SSEA-4 발현 세포의 CDC를 매개한다.
실시예 17
재료 및 방법
MC41, 1차-hMC41, 2차-hMC41 및 3차-hMC41 파아지 클론의 예시적 단일쇄 단편 가변 (scFv)의 작제
MC41, 1차-hMC41, 2차-hMC41 및 3차-hMC41 서열 (VH-GGGGSGGGGSGGGGS-VL)의 scFv 형태는 SfiI 및 NotI (Fermentas)에 의해 합성되고 (Genomics) 절단된 유전자였다. 겔 추출 후, 분해된 생성물을 pCANTAB-5E 파아지미드 (GE Healthcare)에 클로닝하였다. hMC41 변이체 파아지미드는 TGI 이. 콜라이로 형질전환시키고 100 μg/ml의 앰피실린 및 2 % 글루코스를 함유하는 2 x YT 배지 (BD Pharmingen) 중에서 회수하고 1시간 동안 37 ℃에서 M13K07 헬퍼 파아지 (NEB)에 의해 구제하였다. 10분 동안 1,500 x g로 원심분리한 후, 이들 펠렛은 밤새 100 ㎍/ml의 앰피실린 및 50 ㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 2 x YT 배지에 재현탁시켜 scFv-파아지를 생성하였다.
효능의 결정: ELISA에 의한 MC41 및 hMC41 scFv 파아지 클론 또는 IgG의 결합 검정
SSEA-4-BSA를 0.2 ㎍/ml의 농도로 ELISA 플레이트 상에 코팅시켰다. 세척 및 차단 후, 연속 희석된 파아지 또는 IgG는 1.5시간 동안 RT에서 항온처리하였다. 세척 후, 1:1000 희석된 HRP-접합된 항-M13 항체 (GE Healthcare), 1:2000 희석된 HRP-접합된 항-인간 또는 -마우스 IgG 항체는 RT에서 1시간 동안 첨가하였다. 이어서, 액체 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 제조하고 3N HCl로 종결시켰다. 광학 밀도는 450 nm에서 측정하였다.
효능의 입증: MC41의 인간화
2개 인간 유전자인 IGHJ4*08 및 IGKV6-21*02는 MC41 VH 및 VL과 가장 유사하였다. 이와 같이, 본원 발명자는 MC41의 인간화를 위해 이들 2개 유전자로부터 FR을 선택하였다. 모든 인간화된 MC41에서 VH 및 VL의 CDR1 내지 CDR3은 보존적이었다.
효능의 입증: 항-SSEA-4 인간화된 IgG의 작제 및 발현
인간화된 MC41의 VH 영역은 AgeI 및 NheI과 함께 시그날 펩타이드 및 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄의 불변 영역을 함유하는 변형된 발현 벡터 pcDNA5-FRT-감마 1로 클로닝하였다. 인간화된 MC41의 VL 영역은 AgeI 및 EcoRV 부위와 함께 시그날 펩타이드 및 인간 면역글로불린 카파 경쇄의 불변 영역을 함유하는 변형된 발현 벡터 p-Kappa-HuGs로 클로닝하였다. 플라스미드 둘다는 자유형293 세포 (Invitrogen)로 형질감염시키고 1주 동안 37 ℃에서 무혈청 배지에서 계속 항온처리하여 인간화된 항체를 생성한다.
효능의 입증: 항-SSEA-4 인간화된 IgG의 정제
배양 배지를 수거하고 원심분리하고 0.45 ㎛ 공극 크기 막으로 여과하였다. 이어서 상등액은 항-SSEA-4 인간화된 IgG의 정제를 위해 단백질 G 칼럼 크로마토그래피 (GE healthcare)에 적용하였다. PBS로 용출물을 투석한 후, 상기 항체는 통상적으로 쿠마시 블루 염색과 함께 SDS-PAGE 분석에 의해 조사하였다. 항체의 농도는 브래드포드 시약 (Thermo Scientific) 및 분광측정기에 의해 평가하였다.
효능의 입증: 글리칸 어레이에 의한 chMC41 및 hMC41의 결합 특이성
글리칸 어레이 슬라이드는 45분 동안 1 % BSA에 의해 차단하고 이어서 RT에서 또 다른 45분 동안 연속으로 희석된 chMC41 또는 hMC41 IgG로 항온처리하였다. 세척 후, 당나귀 항-인간 IgG Fcγ-F674는 RT에서 40분 동안 제2 항체로서 사용하였다. 최종적으로, 슬라이드를 세척하고 건조시키고 후속적으로 파장 674 nm로 스캐닝하였다.
효능의 입증: 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 검정
FIPAC (5 x 103 세포) 췌장 암 세포는 96웰 플레이트에 씨딩하고 약 80 % 컨플루언트 할때까지 배양하였다. 이들 세포는 이어서 16시간 동안 37 ℃에서 PBMC (이펙터, E)와 함께 항체 chMC41, hMC41, MC813, NHIgG 또는 NMIgG로 항온처리하였다. 치료 후, LDH 발현 수준은 CytoTox-ONE™ 동종성 막 통합 검정 키트 (Promega)로 검출하였다. 반응은 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 사용한 형광성에 의해 판독하였다 (Molecular Device, SpectraMax M5).
효능의 입증: 보체-의존성 세포독성 (CDC) 검정
HPAC (5 x 103 세포) 췌장 세포주는 밤새 약 80 %까지 컨플루언트할때까지 배양하고 16시간 동안 37 ℃에서 항체 chMC41, hMC41, MC813, NHIgG 또는 NMIgG 및 토끼 보체 (20 %) (Low-Tox-M 토끼 보체, Cedarlane)를 함유하는 혼합물과 반응시켰다. 이어서, 세포 생존능은 ADCC 검정과 동일한 과정에 따라 CytoTox-ONE™ 동종성 막 통합 검정 키트로 측정하였다.
효능의 입증: 인간화된 MC41 mAb의 개발
쥐 mAb는 이들의 짧은 혈청 반감기, 인간 이펙터 기능을 유발하지 못하는 무능력 및 인간 항-쥐 항체 (HAMA) 반응의 생성을 포함하는 제한된 임상 용도를 갖는다 (LoBuglio et al., 1989). 따라서, mAb는 이들의 CDR을 인간 Ig 분자의 VH 및 VL FR 상으로 접목시킴에 의해 인간화시켜야만 한다 (Roguska et al., 1994).
NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이터베이스와 함께 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 1차, 2차 및 3차 인간화된 MC41 서열을 생성하였다. 이어서 본원 발명자는 이들 인간화된 MC41 서열에 따라 파아지-디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 생성하였다. 인간화된 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA를 수행하였다 (도 1). 본원 발명자는 2차 및 3차 인간화된 MC41 scFv 파아지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면, 1차 MC41 scFv는 SSEA-4로의 결합 활성을 상실하였음을 밝혔다 (도 1). 온전한 인간화된 MC41 IgG에 의한 결합 활성을 평가하기 위해, 본원 발명자는 1차, 2차, 3차 인간화된 MC41 및 키메라 MC41 (hcMC41)의 온전한 IgG를 작제하였다. ELISA 결과는 인간화된 2차 및 3차 MC41이 용량 의존성 패턴으로 SSEA-4에 반응할 수 있지만 (도 2a) BSA에 반응하지 않음(도 2b)을 보여주었고, 동일한 결과는 chMC41에 대해 관찰되었다. 2차 및 3차 인간화된 MC41의 결합 친화성은 쥐 MC41의 것과 비교하여 유지되었다. 본원 발명자는 인간화된 2차 IgG를 hMC41로 명명하였다. chMC41 및 hMC41의 결합 특이성을 결정하기 위해, 글리칸 어레이를 수행하였다. 키메라 및 인간화된 MC41은 시판되는 SSEA4 항체 (MC813)보다 더 특이적 결합을 보여주었다. 이들은 SSEA4 또는 글리콜릴 변형된 SSEA4만을 인지하였다 (도 3).
효능의 입증: chMC41 및 hMC41의 ADCC 및 CDC.
chMC41 및 hMC41, ADCC 및 CDC의 이펙터 기능을 입증하기 위해, 검정을 수행하였다. HPAC 췌장 암 세포주를 사용하여 chMC41, hMC41, 양성 대조군 MC813 또는 음성 대조군 NHIgG 및 NMIgG의 ADCC 및 CDC 활성을 평가하였다 (도 4 및 5). 상기 데이터는 hMC41의 이펙터 기능이 chMC41과 유사하였음을 보여주었다. 흥미롭게도, 인간화된 MC41은 이의 본래의 활성을 유지할 뿐만 아니라 이는 ADCC 및 CDC를 통해 MC813 보다 더 강한 암 세포 사멸 활성을 보여주었다 (도 5).
참조문헌
LoBuglio, A.F., Wheeler, R.H., Trang, J., Haynes, A., Rogers, K., Harvey, E.B., Sun, L., Ghrayeb, J., and Khazaeli, M.B. (1989). Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: kinetics and immune response. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 4220-4224.
Roguska, M.A., Pedersen, J.T., Keddy, C.A., Henry, A.H., Searle, S.J., Lambert, J.M., Goldmacher, V.S., Blattler, W.A., Rees, A.R., and Guild, B.C. (1994). Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 969-973.
실시예 18
효능의 입증: 재료 및 방법
파아지 디스플레이 바이오스패닝 과정
2.5 x 1010 클론을 함유하는 파아지 디스플레이된 인간 순수 scFv 라이브러리 (Lu et al., 2011)는 실온(RT)에서 1시간 동안 PEG-접합된 카복실 다이나비드 (Invitrogen)에서 비-특이적 결합으로 공제되었고 후속적으로 1시간 동안 4 ℃에서 SSEA-4-PEG 고정화된 다이나비드로 항원처리하였다. PBS 또는 0.01 % Tween 20(PBST0.01)을 함유하는 PBS로 세척한 후, SSEA-4-PEG-다이나비드에 결합된 파아지는 0.5시간 동안 37 ℃에서 이. 콜라이 TGI로 감염시킴에 의해 회수하였다. 감염된 세포의 일부는 결정된 역가로 연속으로 희석시키고 나머지는 M13K07 파아지에 의해 구제하였고 증폭시켰다. 구제된 파아지 역가의 결정 후, 다음 바이오스패닝 라운드를 수행하였다. 제4 및 제5 바이오스패닝 라운드에서, 파아지 클론은 ELISA 스크리닝용으로 배양하기 위해 무작위로 선택하였다.
선택된 파아지 클론의 ELISA 스크리닝
항원 인지의 검출을 위해, 마이크로웰 플레이트 (Nunc)는 각각 0.2 ㎍/ml의 SSEA-4-BSA, 글로보 H-BSA, SSEA-3-BSA 및 BSA로 코팅하였다. 선택된 파아지 클론은 3 % BSA를 함유하는 PBS 중에서 1:2로 희석하고 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트는 1시간 동안 RT에서 항온처리하고 PBST0 .1로 세척하고 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 마우스 항-M13 파아지 항체 (GE Healthcare)로 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하고 OPD 및 H202를 첨가하였다. 3N HCl에 의한 반응 종결 후, 흡광도는 미세플레이트 판독기 (Model 680, BioRad)로 490 nm를 사용하여 측정하였다. 본원 발명자는 ELISA-양성 파아지 클론으로부터 파아지미드를 추출하여 자가 서열분석에 의해 scFv 암호화 영역을 동정하였다.
효능의 입증: 항-SSEA-4 인간 IgG의 작제 및 발현
선택된 scFv의 VH 영역은 AgeI 및 NheI 부위와 함께 시그날 펩타이드 및 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄의 불변 영역을 함유하는 변형된 발현 벡터 pcDNA5-FRT-감마 1에 클로닝하였다. 선택된 scFv의 VL 영역은 AgeI 및 EcoRV 부위와 함께 시그날 펩타이드 및 인간 면역글로불린 카파 경쇄의 불변 영역을 함유하는 변형된 발현 벡터 p-Kappa-HuGs에 클로닝하였다. 플라스미드 둘다는 자유형293 세포 (Invitrogen)에 형질감염시키고 1주 동안 37 ℃에서 무혈청 배지에서 항온처리하여 인간 항체를 생성하였다.
효능의 입증: 항-SSEA-4 인간 IgG의 정제
배양 배지를 수거하고 원심분리하고 0.45 ㎛ 공극 크기 막으로 여과하였다 . 이어서 상등액은 항-SSEA-4 인간 IgG의 정제를 위해 단백질 G 칼럼 크로마토그래피 (GE healthcare)에 적용하였다. 용출물을 PBS로 투석시킨 후, 항체는 통상적으로 쿠마시 블루 염색과 함께 SDS-PAGE 분석에 의해 조사하였다. 항체의 농도는 브래드포드 시약 (Thermo Scientific) 및 분광측정기로 평가하였다.
효능의 입증: MC48 및 MC41의 인간화
2개의 인간 유전자인 GenBank 승인번호 Q9UL73 및 AY577298은 각각 MC48 VH 및 VL과 가장 유사하였다. 본원 발명자는 Q9UL73 유전자의 변형된 골격 (FR) 1 내지 FR4로 이루어진 1차 인간화된 MC48 (hMC48) VH, 승인번호 AY577298로부터 4개의 FR로 이루어진 1차 hMC48 VL, PDB로부터 VH에 이어서 1YY8의 2차 hMC48 FR(여기서 2차 hMC48 VL은 1차 서열과 동일하다) 및 Q9UL73 유전자의 FR1, 2 및 4로 변형된 3차 hMC48 VH 서열 및 인간 AY577298 유전자로 FR2 및 FR4만이 변형된 3차 hMC48 VL을 포함하는 MC48의 3개의 서열을 인간화시켰다. 다른 2개의 인간 유전자인 IGHJ4*08 및 IGKV6-21*02는 MC41 VH 및 VL과 가장 유사하였다. 이와 같이, 본원 발명자는 MC41의 인간화를 위해 2개의 유전자로부터 FR을 선택하였다. 모든 인간화된 MC48 및 MC41에서 VH 및 VL의 CDR1 내지 CDR3은 보존되었다.
효능의 입증: 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 단일쇄 단편 가변 (scFv)의 작제
인간화된 MC48 (hMC48) 및 MC41 (hMC41) 서열 (VH-GGGGSGGGGSGGGGS-VL)의 scFv 형태는 SfiI 및 NotI (Fermentas)에 의해 합성되고 (Genomics) 절단된 유전자이다. 겔 추출 후, 분해된 생성물은 pCANTAB-5E 파아지미드 (GE Healthcare)에 클로닝하였다. hMC48 및 hMC41 변이체 파아지미드는 TGI 이. 콜라이로 형질전환시키고 100 ㎍/ml 앰피실린 및 2 % 글루코스를 함유하는 2x YT 배지 (BD Pharmingen)에서 회수하고 1시간 동안 37 ℃에서 M13K07 헬퍼 파아지 (NEB)에 의해 구제하였다. 10분 동안 1,500 x g에 의한 원심분리 후, 이들 펠렛은 100 ㎍/ml의 앰피실린 및 50 ㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 2 x YT 배지에서 밤새 재현탁시켜 scFv-파아지를 생성하였다.
효능의 입증: ELISA에 의한 hMC48 및 hMC41 scFv 파아지 클론 또는 IgG의 결합 검정
SSEA-4-BSA는 0.2 ㎍/ml의 농도로 ELISA 플레이트 상에 코팅시켰다. 세척 및 차단 후, 연속 희석된 파아지 또는 IgG는 1.5시간 동안 RT에서 항온처리하였다. 세척 후, 1:1000 희석된 HRP-접합된 항-M13 항체 (GE Healthcare), 1:2000 희석된 HRP-접합된 항-인간 또는 -마우스 IgG 항체는 1시간 동안 RT에서 첨가하였다. 이어서, 액체 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 생성하고 3N HCl로 종결하였다. 광학 밀도는 450 nm에서 측정하였다.
효능의 입증: 글리칸 어레이에 의한 p2-78 hAb, chMC41 및 hMC41의 결합 특이성
글리칸 어레이 슬라이드는 45분 동안 1 % BSA에 의해 차단하고 이어서 RT에서 또 다른 45분 동안 연속으로 희석된 p2-78 hAb, chMC41 또는 hMC41 IgG로 항온처리하였다. 세척 후, 당나귀 항-인간 IgG Fcγ-F674는 RT에서 40분 동안 제2 항체였다. 최종적으로, 상기 슬라이드를 세척하고 건조시키고 후속적으로 파장 674 nm로 스캐닝하였다.
효능의 입증: 항체-의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 검정
HPAC, BxPC3 또는 PL45 (5 x 103 세포) 췌장 암 세포는 96웰 플레이트에 시딩하고 약 80 % 컨플루언트할때까지 배양하였다. 이어서, 이들 세포는 16시간 동안 37 ℃에서 PBMC (이펙터, E)와 함께 항체 hMC48, hMC41 또는 NHIgG로 항온처리하였다. 처리 후, LDH 발현 수준은 CytoTox-ONE™ 동종성 막 통합 검정 키트 (Promega)로 검출하였다. 반응은 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 사용한 형광성에 의해 판독하였다 (Molecular Device, SpectraMax M5).
효능의 입증: 보체-의존성 세포독성 (CDC) 검정
HPAC, BxPC3 또는 PL45 (5 x 103 세포) 췌장 암 세포주는 약 80 % 컨플루언트할때까지 밤새 배양하고 16시간 동안 37 ℃에서 항체 hMC48, hMC41 또는 HIgG 및 토끼 보체 (10 % 및 20 %) (Low-Tox-M 토끼 보체, Cedarlane)를 함유하는 혼합물과 반응시켰다. 이어서, 세포 생존능은 ADCC 검정의 것과 동일한 과정을 따라 CytoTox-O E™ 동종성 막 통합 검정 키트 (Promega)로 측정하였다.
효능의 입증:
SSEA-4에 결합하는 파아지 디스플레이된 scFv의 동정
SSEA-4에 결합하는 항체를 동정하기 위해, 본원 발명자는 본원 발명의 이전의 보고에 기재된 바와 같이 확립된 2 x 1010 구성원을 함유하는 파아지 디스플레이된 인간 순수 scFv 라이브러리를 사용하였다 (Lu et al., 2011). 상기 라이브러리는 먼저 다이나비드-결합 파아지에 의해 제거하고 이어서 SSEA-4-결합 파아지는 SSEA-4-PEG-접합된 다이나비드에 의해 선택하였다. 본원 발명자는 바이오스패닝 동안에 PBS 및 0.01 % Tween 20 (PBST0 . 01)을 함유하는 PBS인 2개의 완충 시스템을 사용하였다. 친화성 선택의 5회 라운드 후에, 제5 라운드의 파아지 회수는 각각 PBS 및 PBST0 . 01 시스템에서 제1 라운드의 것과 비교하여 약 55배 및 80배 증가하였다 (도 1). 파아지 클론은 ELISA에 의해 SSEA-4 결합에 대해 무작위로 선택하고 시험하였다 (도 2). 본원 발명자는 SSEA-4-BSA에 특이적으로 결합하지만 BSA 대조군 단백질에 결합하지 않는 7개 클론을 발견하였다. 모든 8개의 개별 클론을 서열분석함에 의해, 본원 발명자는 독특한 인간 VH 및 VL 암호화 영역을 함유하는 2개의 독특한 항-SSEA-4 파아지 클론 (pl-52 및 p2-78)을 동정하였다 (표 1).
2개의 파아지 클론의 특이성 및 결합 친화성을 조사하기 위해, 본원 발명자는 SSEA-4-BSA, 글로보 H-BSA 및 SSEA-3-BSA를 포함하는 글로보 계열 글리칸과 동일한 파아지 역가를 사용하여 비교 ELISA를 수행하였다 (도 3). p2-78 파아지 클론은 SSEA-4-BSA 및 SSEA-3-BSA에 대해 강한 결합을 보여주었고 글로보 H-BSA에는 보다 약하게 결합하였다. 그러나, 본원 발명자는 pl-52 파아지 클론의 SSEA-4-BSA로의 결합 활성이 매우 약함을 밝혔다. 따라서, 본원 발명자는 추가의 연구를 위해 p2-78 클론에 집중하였다.
SSEA-4에 대한 완전한 인간 항체 (hAb)를 확립하기 위해, 본원 발명자는 p2-78 scFv의 VH 및 VL 암호화 서열을 각각 인간 IgG1 골격으로 분자적으로 가공하였다. 항-SSEA-4 p2-78 hAb는 프리스타일 293 발현 시스템을 사용하여 제조하였고 이어서 단백질 G 세파로스 칼럼을 통해 정제하였다. 본원 발명자는 쿠마시 블루 염색과 함께 SDS-PAGE 분서에 의해 항체의 순도를 조사하였다 (도 4a). 상기 결과는 항체의 순도 수준이 95 %를 초과함을 보여준다. 후속적으로, 본원 발명자는 글로보-계열 글리칸에 대한 p2-78의 결합 활성을 조사하기 위해 ELISA를 수행하였다 (도 4b). 본원 발명자는 p2-78 hAb가 SSEA-4 및 SSEA-3에 결합하지만 글로보 H에는 결합하지 않음을 밝혔고 이는 p2-78의 인간 IgG 버젼이 SSEA-4의 결합 에피토프를 인지하기 위해 이의 모 scFv 버젼의 활성을 보유함을 입증한다.
본원 발명자는 203개의 상이한 글리칸을 함유하는 글리칸 어레이를 사용하여 p2-78 hAb의 특이성을 추가로 확인하였다. 상기 결과는 p2-78 hAb가 SSEA4, 시알릴-SSEA4, SSEA4Gc, 및 Gb5 (SSEA3)를 인지함을 보여주었다 (도 5b). 흥미롭게도, p2-78 hAb는 또한 ELISA 검정으로부터의 결과와 유사하게 글로보 H를 약간 인지하였다 (도 3). 시판되는 IgM 항체인 MC631은 양성 대조군으로서 사용하였다 (도 5a).
효능의 입증: 인간화된 MC48 및 MC41 mAb의 개발
쥐 mAb는 이들의 짧은 혈청 반감기, 인간 이펙터 기능을 유발하지 못하는 무능력 및 인간 항-쥐 항체 (HAMA) 반응의 생성을 포함하는 제한된 임상적 용도를 갖는다 (LoBuglio et al., 1989). 따라서, mAb는 이들의 CDR을 인간 Ig 분자의 VH 및 VL FR 상으로 접목시킴에 의해 인간화될 수 있다 (Roguska et al., 1994).
NCBI IgBLAST 또는 IMGT 데이타베이스와 함께 MC48 및 MC41의 VH 및 VL 가변 영역의 정렬 후, 본원 발명자는 1차, 2차, 3차 및 4차 인간화된 MC48 서열 및 1차, 2차 및 3차 인간화된 MC41 서열을 제조하였다. 이어서 본원 발명자는 이들 인간화된 MC48 및 MC41 서열에 따라 파아지 디스플레이된 scFv 포맷을 작제하고 생성하였다. 인간화된 MC48 및 MC41 파아지 클론의 결합 활성을 결정하기 위해, 본원 발명자는 고체 기반 ELISA 코팅 SSEA-4-BSA (도 6, 7 및 8)를 수행하였다. 본원 발명자는 3차 및 4차 인간화된 MC48, 및 2차 및 3차 인간화된 MC41 scFv 파아지가 용량 의존적 방식으로 SSEA-4를 인지할 수 있는 반면 1차 및 2차 인간화된 MC48 및 1차 MC41 scFv는 SSEA-4에 대한 결합 활성을 상실하였음을 발견하였다 (도 6, 7 및 8). 상기 데이타는 4차 인간화된 NC48 및 3차 인간화된 MC41 scFv 파아지 클론의 결합 친화성이 쥐 mAb MC48 또는 MC41의 것과 비교하여 이의 결합 친화성을 유지함을 보여주었다. 온전한 인간화된 MC41 IgG에 의한 결합 활성을 평가하기 위해, 본원 발명자는 1차, 2차, 3차 인간화된 MC41 및 키메라 MC41 (chMC41)의 온전한 IgG를 작제하였다. 상기 ELISA 결과는 인간화된 2차 및 3차 MC41이 용량 의존성 패턴으로 SSEA-4와 반응할 수 있지만 (도 9a) BSA에는 결합하지 않음 (도 9b)을 보여주었고, 동일한 결과는 chMC41에 대해 관찰되었다. 본원 발명자는 인간화된 2차 IgG를 hMC41로서 명명하였다. chMC41 및 hMC41의 결합 특이성을 결정하기 위해, 글리칸 어레이를 수행하였다. 키메라 및 인간화된 MC41은 시판되는 SSEA4 항체 (MC813) 보다 더 특이적인 결합을 보여주었다. 이들은 SSEA4 또는 글리콜릴 변형된 SSEA4만을 인지하였다 (도 10).
효능의 입증: hMC48, chMC41 및 hMC41의 ADCC 및 CDC 시험
hMC48, chMC41 및 hMC41의 이펙터 기능을 조사하기 위해, ADCC 및 CDC 검정을 수행하였다. HPAC, BxPC3 및 PL45 췌장 암 세포주를 사용하여 hMC48 또는 NHIgG에 대해 10 ㎍/ml의 농도에서 ADCC 및 CDC 활성을 평가하였다 (도 11). 추가로, HPAC 세포는 chMC41, hMC41, 양성 대조군 MC813 또는 음성 대조군 NHIgG로 처리하였다 (도 12 및 13). 상기 데이타는 hMC41 및 chMC41의 기능이 hMC48의 것 보다 우수함을 보여주었다. 흥미롭게도, 인간화된 MC41은 이의 본래의 활성을 유지할 뿐만 아니라 이는 또한 ADCC 및 CDC를 통해 MC813 보다 더 강한 암 세포 사멸 활성을 보여주었다 (도 13).
실시예 19
MC41 대 MC48의 결합
hMC41 및 hMC48의 SSEA-4로의 결합 능력은 ELISA에 의해 조사하였다. 상기 결과는 hMC41의 SSEA-4로의 결합이 hMC48 보다 우수함을 보여주었다. 인간화된 MC41은 hMC48과 비교하여 보다 높은 결합 최대 및 보다 작은 Kd (각각 hMC41 및 hMC48에 대해 0.2 ㎍/ml 및 4.6 ㎍/ml)를 갖는다.
참조문헌
LoBuglio, A.F., Wheeler, R.H., Trang, J., Haynes, A., Rogers, K., Harvey, E.B., Sun, L., Ghrayeb, J., and Khazaeli, M.B. (1989). Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: kinetics and immune response. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 4220-4224.
Lu, R.-M., Chang, Y.-L., Chen, M.-S., and Wu, H.-C. (2011). Single chain anti-c-Met antibody conjugated nanoparticles for in vivo tumor-targeted imaging and drug delivery. Biomaterials 32, 3265-3274.
Roguska, M.A., Pedersen, J.T., Keddy, C.A., Henry, A.H., Searle, S.J., Lambert, J.M., Goldmacher, VS., Blattler, W.A., Rees, A.R., and Guild, B.C. (1994). Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 969-973.
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Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 33 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Val 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Thr Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala <210> 34 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 34 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val 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synthetic peptide <400> 40 Ala Lys Thr Gly Thr Ser Tyr 1 5 <210> 41 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 41 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60 acatgcactg tctcagggtt ctcattaacc agctatggtg taagctgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg aggggagcac aaattatcat 180 tcagttctca tatccagact gaccattagt aaggataact ccaagagcca agttttctta 240 aaactgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccacgtact actgtgccat gactgggaca 300 gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctgca 339 <210> 42 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 42 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgt cttctggagt ccctggtcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcaggtt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccatcagtgg agtagtagtc cacacacgtt cggagggggg 300 accaagttgg agataaaa 318 <210> 43 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 43 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Thr Gly Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala <210> 44 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 44 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 45 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 47 His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 48 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 49 Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 50 Ala Met Thr Gly Thr Ala Tyr 1 5 <210> 51 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 51 Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser 20 25 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 52 Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 53 Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 15 Arg <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 54 Thr Tyr Tyr Lys Ser Thr Trp His Asn 1 5 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser 20 25 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 56 Gly Phe Thr Phe Arg Lys Ser Trp 1 5 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 57 Met Gly Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 15 Asn <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 58 Thr Asn Asp Asp Ala Lys Glu Lys 1 5 <210> 59 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 59 Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr 1 5 10 15 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 60 Ala Arg Glu Lys Gly Arg Val Arg Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 61 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 62 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 62 Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn 1 5 10 15 Asp Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Phe Cys 35 <210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 63 Ala Ser Leu Ser Ser Val Ser Ala Gly Asp Pro Pro Arg Gly Pro Glu 1 5 10 15 Asn Ile Glu Tyr Phe Glu His 20 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 64 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 65 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 66 Gln Ser Val Gly Asn Lys Tyr 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 67 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 68 <400> 68 000 <210> 69 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 70 Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 71 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 72 <400> 72 000 <210> 73 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 73 Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 74 Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Arg Arg Leu Thr 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 75 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 76 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 76 Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 77 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 78 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 79 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 79 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 80 Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 81 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 81 Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 1 5 10 <210> 82 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 82 Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile 1 5 10 15 Ser Arg Leu <210> 83 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 83 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 84 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 84 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 1 5 10 <210> 85 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 85 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 86 Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 1 5 10 <210> 87 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 87 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 88 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 1 5 10 <210> 89 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 89 Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 90 Ala Met Thr Gly Thr Ala Tyr 1 5 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 91 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 92 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 92 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 93 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 94 Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 20 25 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 95 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 96 Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 <210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 97 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 98 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 98 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 20 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 99 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 100 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 101 Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser 1 5 <210> 102 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 102 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 103 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 104 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 104 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 105 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 106 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 106 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 20 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 107 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 108 Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 109 His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 1 5 <210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 110 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 111 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 111 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 112 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 113 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 114 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 114 Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 115 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 115 caggtgcagc tgcaagagtc aggacctggc ctggtgaaac cctcagaaac tctgtccctt 60 acatgcactg tctcagggtt ctcattaacc agctatggtg taagctggat tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gattggagta atatggggtg aggggagcac aaattatcat 180 tcagttctca tatccagact gaccattagt gtggatacct ccaagaatca atttagctta 240 aaactgagca gtgttaccgc tgctgacaca gccgtttact actgtgccat gactgggaca 300 gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctagc 339 <210> 116 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 116 gagattgtgc tgacccagag ccctgccaca ctgtcactga gcccaggcga gcgagccaca 60 ctgtcctgtt ctgctagctc ctctgtctcc tacatgcatt ggtatcagca gaagccagga 120 ctggcaccac gactgctgat ctatgacact tctaaactga gttcaggcat tcccgccaga 180 ttcagtggct cagggagcgg aaccgacttt actctgacca ttagctccct ggagcctgaa 240 gatttcgccg tgtactattg ccatcagtgg tcatcaagcc ctcatacctt cggggggggg 300 actaaggtgg aaatcaaacg c 321 <210> 117 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 117 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly 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artificial sequence: synthetic peptide <400> 119 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 120 <400> 120 000 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 121 His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 1 5 <210> 122 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 122 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 123 Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 124 Ala Met Thr Gly Thr Ala Tyr 1 5 <210> 125 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 125 caggtgcagc tgaagcagag cggacctggc ctggtgcagc cctcacagag cctgagcatc 60 acttgtaccg tcagtggatt ctccctgaca tcttacggcg tgtcttgggt caggcagagc 120 cctggcaagg ggctggagtg gctgggcgtg atctggggag aaggctcaac taactatcac 180 agcgtcctga tcagtcgcct gtcaattaac aaggacaatt ctaaaagtca ggtgttcttt 240 aaaatgaaca gcctgcagtc caatgatacc gccatctact attgcgctat gaccggcaca 300 gcatactggg ggcagggaac actggtgact gtctccgct 339 <210> 126 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 126 gagattgtgc tgacccagag ccctgccaca ctgtcactga gcccaggcga gcgagccaca 60 ctgtcctgtt ctgctagctc ctctgtctcc tacatgcatt ggtatcagca gaagccagga 120 ctggcaccac gactgctgat ctatgacact tctaaactga gttcaggcat tcccgccaga 180 ttcagtggct cagggagcgg aaccgacttt actctgacca ttagctccct ggagcctgaa 240 gatttcgccg tgtactattg ccatcagtgg tcatcaagcc ctcatacctt cggggggggg 300 actaagctgg aaatcaaacg c 321 <210> 127 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 127 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Thr Gly Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala <210> 128 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 128 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 129 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 130 <400> 130 000 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 131 His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 1 5 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 132 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 133 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 133 Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 <210> 134 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 134 Ala Met Thr Gly Thr Ala Tyr 1 5 <210> 135 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 135 caggtgcagc tgcaggaaag cggacccgga ctggtgaaac ctagcgaaac actgagcctg 60 acttgtaccg tgagcggatt ttccctgacc tcttatggag tgagctggat cagacagccc 120 cctggcaagg gactggagtg gatcggcgtg atttggggag aaggctccac aaactatcac 180 agtgtcctga tctcacgact gactatttct aaggacaact ctaaaagtca ggtcttcctg 240 aaactgaata gtctgcagac tgacgatacc gctacatact attgcgcaat gacagggaca 300 gcatactggg gacagggaac cctggtgaca gtcagctcc 339 <210> 136 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 136 cagatcgtgc tgacacagtc ccctgcaatt atgtcagcca gcccagggga aaaggtgaca 60 atgacttgta gtgcttctag ttcagtctca tacatgcatt ggtatcagca gaagccaggc 120 ctggccccca gactgctgat ctacgacacc tccaaactga gctccggcgt gcccgggaga 180 ttttccggct ctgggagtgg aacttcatat agcctgacca tttctaggct ggaggccgaa 240 gatgccgcta catactattg ccaccagtgg agcagtagcc cccatacatt cggaggcggg 300 accaaagtgg aaatcaaacg c 321 <210> 137 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 137 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Thr Gly Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 138 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 138 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 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Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 144 Ala Met Thr Gly Thr Ala Tyr 1 5 <210> 145 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 145 caggtccagc tgaaagagag cggccccgga ctggtcgccc cttcacagag cctgagcatt 60 acttgcaccg tgagcggatt ttcactgacc agctacggag tgagctggat tagacagcct 120 cctggcaagg gactggagtg gatcggcgtg atttggggag aaggcagcac caactatcac 180 agtgtcctga tctcacgcct gacaatttcc aaggacaaca gcaaatccca ggtcttcctg 240 aaactgaatt ctctgcagac tgacgatacc gctacatact attgcgcaat gacagggaca 300 gcatactggg gacagggaac cctggtgaca gtcagtagt 339 <210> 146 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 146 cagatcgtgc tgacacagtc cccagcaatt atgtctgcca gtcccgggga gaaggtgaca 60 atgacttgta gtgccagctc ctctgtctca tacatgcatt ggtatcagca gaagtccggc 120 acatctccta aacggtggat ctacgacact tctaaactga gttcaggcgt gcccgggaga 180 ttttcaggca gcgggtccgg aacttcttat agtctgacca tttcccgact ggaggccgaa 240 gatgccgcta cctactattg ccatcagtgg tcttcaagcc ctcatacttt tgggggggga 300 actaaggtgg aaatcaagcg a 321 <210> 147 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 147 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Thr Gly Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 148 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 148 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 149 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 150 <400> 150 000 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 151 His Gln Trp Ser Ser Ser Pro His Thr 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 152 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 153 Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 154 Ala Met Thr Gly Thr Ala Tyr 1 5 <210> 155 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 155 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 20 25 <210> 156 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 156 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 157 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 157 Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 158 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 159 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 159 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 160 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 160 Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 Val <210> 161 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 161 Asn Tyr His Ser Val Leu Ile Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp 20 25 30 Thr Ala Thr 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<210> 189 <400> 189 000 <210> 190 <400> 190 000 <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 200 caggtgcagc tgaaggaaag cggacccgga ctggtcgccc cctctaagtc tctgtctatt 60 acttgtactg tgagcggatt ctctctgagc tcccagggcg tgtactgggt gaggcagcca 120 cctggcaagg gcctggagtg gctgggagcc atctgggcag gaggcagcac caactataat 180 tccgccctga tgtctcgcct gtctatcagc aaggacaact ccaagtctca ggtgttcctg 240 aagatgaaca gcctgcagac cgacgataca gccatgtact attgcgcccg ggtggacggc 300 tacagaggct ataacatgga ttactggggc cagggcacca gcgtgacagt gtctagc 357 <210> 201 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 201 gagaatgtgc tgacacagtc cccagcaatc atgagcgcct ccccaggaga gaaggtgacc 60 atgacatgtt ccgcctcctc tagcgtgtct tacatgcact ggtatcagca gaagtcctct 120 accagcccta agctgtggat ctacgacaca agcaagctgg cctccggcgt gcccggccgg 180 ttttctggca gcggctccgg caactcttat agcctgacca tcagcagcat ggaggccgag 240 gatgtggcca catactattg ctttcagggc tctggctacc cactgacatt cggggctgga 300 actaaactgg aactgaagcg a 321 <210> 202 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 202 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Lys 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gln 20 25 30 Gly Val Tyr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ala Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asp Gly Tyr Arg Gly Tyr Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 203 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 203 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 204 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 204 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 205 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 205 Asp Thr Ser 1 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 206 Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 207 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 207 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gln Gly 1 5 <210> 208 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 208 Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 209 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 209 Ala Arg Val Asp Gly Tyr Arg Gly Tyr Asn Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 210 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 210 caggtgcagc tgaaggagtc cggaccagga ctggtggcac catctaagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggctt ctccctgagc tcccagggcg tgtactggat caggcagcca 120 cctggcaagg gactggagtg gatcggcgcc atctgggccg gcggctctac aaactataat 180 tccgccctga tgtctcgcct gtctatcagc aaggacaact ccaagtctca ggtgtttctg 240 aagatgaata gcctgcagac cgacgataca gccatgtact attgcgcccg ggtggacggc 300 tacagaggct ataacatgga ttattggggc cagggcaccc tggtgacagt gtctagc 357 <210> 211 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 211 gagaatgtgc tgacccagtc tcctgccatc atgagcgcca caccaggcga gaaggtgacc 60 atgacatgtt ccgcctcctc tagcgtgtct tacctgcact ggtatcagca gaagtcctct 120 accagcccca agctgtggat ctacgacaca agcaagctgg catccggagt gcctggccgg 180 ttcagcggat ccggatctgg aaacagctat accctgacaa tcagctccat ggaggccgag 240 gatgtggcca cctactattg tttccaggga tccggatacc cactgacctt tggcgccggc 300 acaaagctgg agatcaagcg t 321 <210> 212 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 212 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Lys 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gln 20 25 30 Gly Val Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asp Gly Tyr Arg Gly Tyr Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 213 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 213 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 214 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 214 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 215 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 215 Asp Thr Ser 1 <210> 216 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 216 Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 217 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 217 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gln Gly 1 5 <210> 218 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 218 Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 219 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 219 Ala Arg Val Asp Gly Tyr Arg Gly Tyr Asn Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 220 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 220 caggtgcagc tgaaggagtc cggaccagga ctggtggcac catctaagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggctt ctccctgagc tcccagggcg tgtactggat caggcagcca 120 cctggcaagg gactggagtg gatcggcgcc atctgggccg gcggctctac aaactataat 180 tccgccctga tgtctcgcct gtctatcagc aaggacaact ccaagtctca ggtgtttctg 240 aagatgaata gcctgcagac cgacgataca gccatgtact attgcgcccg ggtggacggc 300 tacagaggct ataacatgga ttattggggc cagggcacct cggtgacagt gtctagc 357 <210> 221 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 221 gagaatgtgc tgacccagtc tcctgccatc atgagcgcca caccaggcga gaaggtgacc 60 atgacatgtt ccgcctcctc tagcgtgtct tacatgcact ggtatcagca gaagtcctct 120 accagcccca agctgtggat ctacgacaca agcaagctgg catccggagt gcctggccgg 180 ttcagcggat ccggatctgg aaacagctat accctgacaa tcagctccat ggaggccgag 240 gatgtggcca cctactattg tttccaggga tccggatacc cactgacctt tggcgccggc 300 acaaagctgg agatcaagcg t 321 <210> 222 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 222 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Lys 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gln 20 25 30 Gly Val Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asp Gly Tyr Arg Gly Tyr Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 223 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polypeptide <400> 223 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 224 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 224 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 225 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 225 Asp Thr Ser 1 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 226 Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 227 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 227 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gln Gly 1 5 <210> 228 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 228 Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 229 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic peptide <400> 229 Ala Arg Val Asp Gly Tyr Arg Gly Tyr Asn Met Asp Tyr 1 5 10

Claims (19)

  1. Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 단편이모노클로날 항체에서 결합/이펙터 활성을 증진시키기 위한 Fc 당형태를 포함하고, 상기 항체가 하기 식을 갖는 당형태를 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편.
    Sia2(α2-6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2
    Figure pct00021
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체가 IgG1이고 Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1로의 결합이 특이적 결합인, 단리된 항체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 147 또는 서열번호 137을 갖는 VH 및 서열번호 148 또는 서열번호 138을 갖는 VL을 포함하는, 단리된 항체.
  4. 제 3항에 있어서,
    (i) 서열번호 152 (GFSLTSYG)로부터 선택된 H-CDR1;
    (ii) 서열번호 153 (IWGEGST)으로부터 선택된 H-CDR2;
    (iii) 서열번호 154 (AMTGTAY)로부터 선택된 H-CDR3으로부터 선택된 각각의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고;
    (iv) 서열번호 149 (SSVSY)로부터 선택된 L-CDR1;
    (v) 서열번호 150 (DTS)으로부터 선택된 L-CDR2; 및
    (vi) 서열번호 151 (HQWSSSPHT)로부터 선택된 L-CDR3으로부터 선택된 각각의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이
    (i) 서열번호 159 (QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS)로부터 선택된 H-FR1;
    (ii) 서열번호 160 (VSWIRQPPGKGLEWIGV)으로부터 선택된 H-FR2;
    (iii) 서열번호 161 (NYHSVLISRLTISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYC)로부터 선택된 H-FR3; 및
    (iv) 서열번호 162 (WGQGTLVTVSS)로부터 선택된 H-FR4로부터 선택된 각각의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4를 추가로 포함하고;
    (v) 서열번호 155 (QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS)로부터 선택된 L-FR1;
    (vi) 서열번호 156 (MHWYQQKSGTSPKRWIY)으로부터 선택된 L-FR2;
    (vii) 서열번호 157 (KLSSGVPGRFSGSGSGTSYSLTISRLEAEDAATYYC)로부터 선택된 L-FR3; 및
    (viii) 서열번호 158 (FGGGTKVEIKR)로부터 선택된 L-FR4로부터 선택된 각각의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체인, 항체.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 항체가 인간화된 항체인, 항체.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 202, 서열번호 212 또는 서열번호 222를 갖는 VH 및 서열번호 203, 서열번호 213 또는 서열번호 223을 갖는 VL을 포함하는, 단리된 항체.
  9. 제 8항에 있어서,
    (i) 서열번호 207, 서열번호 217, 서열번호 227로부터 선택된 H-CDR1,
    (ii) 서열번호 208, 서열번호 218, 서열번호 228로부터 선택된 H-CDR2;
    (iii) 서열번호 209, 서열번호 219, 서열번호 229로부터 선택된 H-CDR3으로부터 선택된 각각의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하고;
    (iv) 서열번호 204, 서열번호 214 및 서열번호 224로부터 선택된 L-CDR1,
    (v) 서열번호 205, 서열번호 215 및 서열번호 225로부터 선택된 L-CDR2,
    (vi) 서열번호 206, 서열번호 216 및 서열번호 226으로부터 선택된 L-CDR3으로부터 선택된 각각의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체인, 항체.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 항체가 인간화된 항체인, 항체.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv 단편인, 단리된 항체.
  13. 제 6항, 제 7항, 제 10항 또는 제 11항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 조성물이 과증식성 질환에 대한 치료에 유용한, 약제학적 조성물.
  15. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서, 상기 방법은 제 13항의 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하고 이로써 상기 투여된 항체는 상기 대상체에서 ADCC 활성을 증진시키는, 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 암이 뇌암, 폐암, 유방암, 경구암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 골암, 피부암, 자궁암, 난소암 및 전립선암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 다른 화학치료학적 제제와 함께 조합된 약제학적 제형을 투여함을 임의로 포함하는, 조성물.
  18. (a) 모노클로날 항체를 α-푸코시다제 및 적어도 하나의 엔도글리코시다제와 접촉시키는 단계;
    (b) 단일 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화된 항체를 제조하는 단계; 및
    (c) 항체의 Fc 영역의 GlcNAc에 범용 글리칸을 첨가하여 상기 당형태를 갖는 동종성 항체를 형성하는 단계를 포함하는, 제 13항의 동종성 항체 집단을 제조하기 위한 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 결합 단편이 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 결합 단편.
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