KR20160105743A - 천연 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark), 계지 및 작약(Peony Root), 또는 계지 및 적복령(Poria) 혼합 추출물은 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며, 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고, 다양한 당뇨합병증 동물모델, 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성, 망막부종 및 하지부종을 지연, 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써, 상기 혼합 추출물을 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증 등을 포함하는 당뇨합병증(diabetic complications) 및 황반(망막)부종, 황반변성 및 하지정맥류를 포함하는 혈관부종(angioedema)의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark), 계지 및 작약(Peony Root), 또는 계지 및 적복령(Poria) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증 등을 포함하는 당뇨합병증(diabetic complications)과 황반(망막)부종, 황반변성 및 하지정맥류를 포함하는 혈관부종(angioedema) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병 환자는 현재 전 세계적으로 2억4천만 명을 넘었으며, 2025년에는 3억8천만 명으로 증가하고 이중 60%가 아시아 지역일 것이라고 2009년 미국의사협회(JAMA)에서 발표하였다. 특히 전 세계적으로 (초)고령화 사회로의 진입과 당뇨 발병 연령이 계속 낮추어짐에 따라 당뇨합병증 발병이 급속도로 증가하고 있다. 최근 우리나라도 당뇨병 유병률이 10％에 달하며, 특히 당뇨발병 시기가 청장년으로 당겨지고, 수명이 연장됨으로 인해서 당뇨 합병증 환자가 폭발적으로 증가하는 상황이다.
당뇨합병증(diabetic complications)이 지난 5년 새 60%가 늘었고, 진료비도 54% 늘어난 2,035억 원에 달했다고 보고하였다(국민건강보험공단, 2011. 08.). 즉, 당뇨병 발병 10~15년 후 신체 거의 모든 기관이 손상을 받아 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨성 족부궤양(diabetic foot ulcers), 당뇨성 심장병(diabetic heart disease), 당뇨성 골다공증(diabetic osteoposis) 또는 당뇨성 동맥경화증(diabetic arteriosclerosis) 등으로 나타난다.
현재 투약되고 있는 여러 기전의 당뇨병 치료약들은(메트포르민, 로지글리타존, 제미글로, 자누비아 등) 당뇨 초기의 혈당을 조절할지라도, 완치가 불가능하여 만성적으로 진행되어 발병되는 당뇨병성 합병증(당뇨성 안구질환, 신증, 신경병증, 족부궤양 등)으로의 이행을 근본적으로 예방 또는 치료하지 못한다. 당뇨합병증이 당뇨로 시작되지만, 당뇨합병증으로 이행 기전은 당뇨병과 다름을 의미한다. 그러므로 신속히 혈당조절제로 조절하면서 당뇨합병증을 지연 또는 예방할 수 있는 약을 병용하여 당뇨합병증을 지연, 예방 또는 치료하는 것이 필요하다.
만성 당뇨성 신증은 혈액 투석 및 장기 이식치료를 요구하며, 당뇨성 백내장과 망막증은 실명을 초래한다. 미국의 경우 25세에서 74세 연령대의 실명의 주원인이 당뇨병으로 보고되었다. 당뇨성 족부궤양으로 인하여 팔 다리를 절단해야하는 끔직한 상황이 전개되며, 당뇨성 신경병증은 칼로 찌르는 듯한 고통을 수반한다. 당뇨성 심장병은 급격한 죽음을 일으킨다. 그러므로 당뇨환자의 합병증 발병이 몇 년만 지연되더라도 환자와 가족의 삶의 질이 달라질 것이며, 국가재정에도 커다란 도움을 준다.
이러한 당뇨합병증을 유발하는 대표적인 인자는 최종당화산물 생성, 알도즈 리덕테이즈(aldose reductase)의 활성화, PKC isomer의 활성화, 헥소사민 경로 flux의 증가 등으로 보고되었다(Nature, 414, 813-820, 2000; Diabetologia, 38: 357-3941, 1995). 이러한 인자들의 비가역적인 반응으로 산화적 스트레스가 가속화됨으로 당뇨합병증이 더욱 악화된다.
단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of protein)은 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소 작용 없는 축합반응(밀리아드 반응)에 의해 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs)이 생성하는 것을 말한다. 즉 초기 단계 산물인 쉬프염기(schiff base)를 형성하고, 이 쉬프염기와 인접한 케토아민 어닥트(ketoamine adduct)가 서로 축합하여 가역적인 아마도리(Amadori)형의 조기당화산물이 생성하며, 고혈당 상태가 지속되면 가역적인 아마도리형의 조기당화산물이 분해되지 않고 재배열(rearrangement)되어 비가역산물인 최종당화산물이 생성된다. 이렇게 생성된 최종당화산물들이 단백질 또는 지질 등과 결합 또는 교차결합(cross-linking)하여 비가역적인 당화단백질 또는 당화지질 등의 산물이 생성된다. 이 최종당화산물은 기저막, 혈장 알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등의 단백질 또는 지질과 (교차)결합하여, 그 단백질이나 지질의 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 합병증을 유발시킨다. 또한 혈당이 다시 정상으로 회복이 되더라고 이미 생성된 최종당화산물은 단백질이나 지질과의 반응은 계속 진행되므로 합병증은 발병한다(N. Engl . Med.,1988, 318, 1315-1321). 또한, 이러한 상태에서 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다(J. of Trad . Med. 2001, 18: 107-112). 이러한 기전에 기초해서 당뇨합병증의 발병을 지연하거나 예방(치료)하기 위해 최종당화산물 생성 억제하는 것이 중요함이 보고되었다(N. Engl . Med. 1998, 318, 1315-1321).
당뇨병성 망막증은 만성적 고혈당 상태에서 망막의 혈관과 신경세포가 손상되어 비증식성 망막증으로 진행되어 결국엔 증식성 망막증으로 진전되어 실명하게 된다. 즉 고혈당 환경에서 망막의 모세혈관을 싸고 있는 주변세포(pericyte)가 손상되기 시작하면서 미세동맥류(microaneurysm) 현상이 생기고 이여서 내피세포의 손상으로 이어져, 혈관으로서 기능을 할 수 없는 무세포성 모세혈관(acellular capillary)이 많이 생성된다. 이러한 비정상적인 신생혈관의 벽이 매우 약하여 쉽게 파괴되어 혈액성분 등이 밖으로 유출되어 결국엔 실명에 이르게 된다. 오클루딘(occludin)이나 클라우딘(claudin) 등과 같은 주변세포와 내피세포 등과 연결하는 세포간 치밀이음부 단백질(tight-junction protein)이 손상되므로 여러 병리적인 현상이 일어난다. 이러한 당뇨병성 망막증을 예방하기 위하여 초기증상인 주변세포 손상을 막아야할 것이다. 2013년 12월에 호주 FDA 승인은 받은 페노파이브레이트(fenofibrate)(Lipidil, Abott)는 PPARα agonist로 당뇨병성 망막증 치료제로 승인되었다. ACCORD study와 FILD study는 엄격한 혈당 조절한 당뇨환자의 33%는 당뇨병성 망막증으로 전이되는 것을 막았으나, 약 40% 정도 당뇨병성 망막증으로 전이되는 것을 지연하였다고 보고하였다.
2014년 미국 FDA 승인을 받은 일루비엔(IIuvien, fluocinolone acetonide intravitreal implant, Alimera Science)은 당뇨병성 황반부종 치료제로 승인되었다.
당뇨병성 신증은 최종당화산물과 단백질이 결합한 당화 알부민이 만성 당뇨성 신증을 일으키는 중요한 요인으로 작용한다. 당화 알부민은 정상 알부민에 비해 더 용이하게 신사구체 세포 내로 유입되고, 만성적인 고농도의 포도당은 메산지움 세포를 자극하여 세포외기질(extracellular matrix)합성을 증가시킨다. 과도하게 유입된 당화 알부민과 증가된 세포외기질로 인하여 신사구체의 섬유화가 야기된다. 이와 같은 기전으로 신사구체가 계속 손상 받게 되어 혈액투석 또는 장기이식 등의 극단적인 치료방법을 쓸 수밖에 없는 단계에 이르게 되는 것이다.
혈관부종(angioedema)은 피부 깊숙한 곳이나 피부 아래, 혹은 점막 밑에 있는 혈관의 투과성이 증가하여 체액이 혈관에서 빠져 나와 주위 조직에 고이는(즉 부종이 생기는) 질환을 말하는 것으로, 비교적 느슨한 조직에서 잘 발생하는데 눈 주위, 입술 주위, 손에 생기는 경우가 흔하고, 혀, 입 안, 후두, 위장관 벽 같은 점막에도 발생하며, 특히 망막혈액장벽의 손상으로 인한 혈관부종으로 황반(망막)부종 또는 황반변성, 또는 하지정맥류 등이 발생한다.
황반변성(Age-related macular degeneration: AMD)은 비가역적인 질병 중 하나로 많은 연장자에게 발병하며 실명으로 유도하는 대표적인 안과 질환이다. 전 세계적으로 인구 노령화로 인해 발병율이 점점 증가하고 있다. 미국에서는 황반변성은 실명의 주된 원인으로, 환경적인 요소 및 유전자적 요소도 발병에 영향을 끼치며, 특히 흡연은 가장 치명적인 발병요인으로 보고되었다. 뿐만 아니라 비만, 과도한 항산화제 및 식이 지방의 섭취도 황반변성을 유발하고 더욱 진전시키는 영향을 준다. 그러므로 건강한 식이섭취, 체중조절, 적절한 운동, 금연 등이 황반변성 발병을 저하시킨다. 미국 내 조기(건식) 황반변성 유병율이 40∼50 연령대에서는 3.9% 정도이나, 75세 이상의 연령대에는 22.8%로 발병 비율이 매우 큼을 보였다(Beaver Dam Eye Study). 또한, 75세 이상 노령층에서는 5.4% 발병율을 보였고, 7.1%는 말기 황반변성 환자이다. 호주에 사는 코카시안 민족의 1.9%가 말기 황반변성이며, 5년 기간 동안 55세 이하의 젊은 연령대에는 발병율 0% 이나 85세 이상 노령층에서는 18.5%나 발병하였다. 또한, 아시아 말레이 민족의 경우에도 비슷하였다(Blue Mountain Eye Study; Progress in retinal and eye research, 1-15, 2014). 한국의 경우, 최근 1년간 습성 황반변성 환자가 7.4배 증가했고, 40~50대 연령대에서의 발병율은 9배나 증가했음을 망막학회가 보고하였다(2011년). 그러나 무엇보다도 심각한 것은 황반변성 치료제가 없다는 것이다. 스위스 노바티스의 루센티스는 항체 치료제이며 매우 고가이고 또한 병 진행을 멈추는 정도로 시력이 회복 불가능하다는 단점이 있다.
황반변성은 건식 황반변성과 습식 황반변성으로 분류된다. 건식 황반변성은 황반에 노폐물 덩어리인 두루젠(drusen)이 쌓여 맥락막(choroid)과 황반 윗부분 사이의 대사 연결(metabolic connection)을 손상시켜 건식 황반변성이 발병한다. 이것이 계속 진행되면 습식 황반변성으로 진전된다. 즉 황반 부위에 노폐물이 쌓여 혈관이 정상적인 기능을 하지 못해 영양분이나 산소 등 필요한 것들이 공급되지 못하므로, 새로운 비정상적인 혈관들이 생성되기 시작한다(choroidal neovascularization: CNV). 이렇게 생성되는 혈관들은 벽이 매우 약해 혈관 속의 단백질 또는 적혈구 등이 황반 부위와 망막으로 스며 나오고 결국엔 혈관 출혈으로 광수용체(rod-. cone photoreceptor)와 망막색소 상피세포층이 사멸되는 등 여러 요인이 발생하여 결국 실명에 이른다(Nutrition Research, 34, 95-105, 2014; Plos one, 8, e71064, 2013).
망막색소 상피세포(retinal pigment epithelial cell: RPE)는 비증식성 상태를 유지하고 Bruch's membrane(BrM)을 지지하여 건강한 시력을 유지하는 중요한 역할을 한다. 망막색소 상피세포에서 분비되는 시스타틴(cystatin) C는 강력한 시스테인 단백분해 억제제(cysteine proteinase inhibitor)로 BrM에서 단백질의 순환 등을 정상적으로 조절하는 중요한 역할을 한다. 그러나 최종당화산물이 과도하게 축적이 되면 시스타틴 C 단백질의 발현과 분비가 저하되어 RPE 기저부분에서 단백질 분해 작용의 불균형을 일으켜 결국 황반변성이 생긴다. 그러므로 최종당화산물의 생성을 억제할 때 황반변성도 예방(치료) 할 수 있음이 보고되었다(Kay P, et al., IOVS, 2014, 55(2), 926-34).
VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)는 망막색소 상피세포층에서 분비되어 Bruch’s membrane(BrM) 주위 부분을 정상적으로 조절하고 맥락 모세혈관 내피세포의 성장과 치밀도를 조절한다. 정상상태에서는 신생혈관생성이 되지 않도록 VEGF 분비가 매우 엄격하게 조절된다. 그러나 VEGF 분비가 엄격하게 조절이 안되면 황반변성의 말기 단계에 이르는 결정적인 인자로 작용한다. VEGF 분비가 비정상적으로 증가하면 비정상적이고 약한 혈관이 생성되어 혈관이 파괴된다(J. Cell . Mol . Med ., 17, 7, 833-843, 2013).
하지정맥류(varicose vein)는 정맥이 피부 밖으로 보이는 질환으로, 팔다리에 분포되어 있는 정맥은 근육 사이에 놓여있는 큰 심부 정맥(Deep vein)과 피부 바로 밑으로 보이는 표재 정맥(Superficial vein), 그리고 이들 두 정맥을 연결하는 관통 정맥(Perforating vein)으로 분류되며, 이중 하지정맥류는 표재 정맥이 늘어나서 피부 밖으로 돌출되어 보이는 것을 의미하며, 정맥 내부에 혈액의 흐름을 항상 심장 쪽으로 일정하게 유지하게 만드는 판막(Valve)이 하지 정맥 내의 압력이 높아지는 경우 정맥 벽이 약해지면서 판막이 손상되어 심장으로 가는 혈액이 역류하여 정맥이 늘어남으로써 발생한다.
계지(Cinnamomi Twig)는 장나무과의 상록교목 식물인 계수나무(또는 계피나무라고도 함)의 어린 가지로, 맵고 달며 성질은 따뜻하고 심과 폐와 방광에 작용한다. 위를 튼튼하게 하고, 중풍을 억제하며 진통, 강심작용이 있고 피부혈관을 확장시키고 한선을 자극하여 땀을 내어 해열작용을 하며 바이러스의 억제작용을 한다고 알려져 있으며, 오한, 발열, 두통, 몸의 통증, 땀이 나지 않는 경우나 심계항진 등에 사용한다. 긴 원주형으로 많은 가지가 있으며 길이는 30 내지 70 cm, 굵은 쪽의 지름은 0.3 내지 1 cm이다. 표면은 홍갈색이나 갈색으로 세로의 능선이 있고 가는 주름과 작은 덩어리 모양의 잎과 가지가 붙어있던 흔적이 있으며, 질은 단단하고 부서지기 쉬우며 절단하기 쉽고, 광서, 광동성이 주산지이며 월남, 스리랑카, 인도 등지에서도 재배된다. 계지의 약리실험 결과로 발한작용, 해열작용, 진통작용, 강심작용, 항알레르기작용 및 항바이러스작용 등이 밝혀졌으나, 현재까지 계지의 당뇨합병증 또는 혈관부종 관련 효과가 개시된 바는 없다.
목단피(Moutan Root Bark)는 오래전부터 사용한 중요한 한약재로서 그 성질이 차서 한방에서 소염성 구어혈약으로서 사용되며, 그 약효는 하복부 장기의 혈관계의 염증, 울혈에 의한 동통, 발열, 화농, 출혈 등에 이용되고, 특히 부인과 영역에서 월경불순, 자궁 및 부속기의 염증, 울혈, 견인통에 대해 소염, 진통, 진경의 효과가 있으며, 치질, 충수염에도 응용되고 있다.
작약(Peony Root)은 미나리아재비과의 여러해살이풀로, 백작약(Radix Paeoniae Alba)과 적작약(Radix Paeoniae Rubra)이 있다. 백작약과 적작약은 껍질의 유무로 결정하고 있으며, 껍질이 있는 것을 적작약, 껍질을 벗겨낸 것을 백작약이라고 한다(Altern . Med . Rev ., 6(5), pp495-499, 2001). 백작약은 적작약과 더불어 위, 장의 평활근 및 자궁 평활근에 대해 수축억제효과, 관동맥 확장 효과 및 혈관질환에 대해 죽상경화증 방지, 혈압강하 및 혈류 개선, 항산화 효과(Ohsugi M et al., J. Ethnopharmacol ., 67, pp111-119, 1999), 혈소판응집억제효과(Lin HC et al., Planta Med, 65, pp595-599, 1999), 항혈전효과(Ishida H et al., Chem . Pharm. Bull, 35(2), pp849-852, 1987), 고지혈증 방지(Yang HO et al., Fitoterapia, 75(1), pp45-49, 2004) 등이 있다. 또한, 작약의 구성성분 중의 일부인 글리코시드(glycoside)가 뇌경색의 치료에 효과가 있는 것으로 보고되었다(Yang J et al., Zhong Yao Cai, 23(2), pp95-97, 2000).
적복령(Poria)은 소나무 뿌리에서 자라난 균핵으로, 지름 5 내지 7 ㎝의 공모양 혹은 타원형을 띄며, 땅 위에서는 나무껍질 조각과 함께 밤색 또는 더러운 흑색을 띤다. 적복령은 코르크화되어 단단하고 0.2 내지 0.5 ㎜의 두께로 덮여 있고, 방사상으로 균열이 생긴다. 적복령은 거의 맛과 냄새가 없으나, 때로는 연한 점액과 함께 펴지며 요오드에 양성 반응을 나타낸다. 또한, 적복령은 안정제로 쓰이며, 태열안정의 효과가 있을 뿐만 아니라 몸을 따뜻하게 한다고 전해지고 있다.
이에, 본 발명자들은 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료를 위한 독성 및 부작용이 없이 안전하고 효과적인 천연 약재를 개발하기 위해 노력한 결과, 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물이 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며, 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고, 다양한 당뇨합병증 동물모델, 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성, 망막부종 및 하지부종을 지연, 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써, 상기 혼합 추출물을 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark), 계지 및 작약(Peony Root), 또는 계지 및 적복령(Poria) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증(diabetic complications) 및 혈관부종(angioedema) 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark), 계지 및 작약(Peony Root), 또는 계지 및 적복령(Poria) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증(diabetic complications) 및 혈관부종(angioedema) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark), 계지 및 작약(Peony Root), 또는 계지 및 적복령(Poria) 혼합 추출물은 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며, 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고, 다양한 당뇨합병증 동물모델, 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성, 망막부종 및 하지부종을 지연, 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써, 상기 혼합 추출물을 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증 등을 포함하는 당뇨합병증(diabetic complications) 및 황반(망막)부종, 황반변성 및 하지정맥류를 포함하는 혈관부종(angioedema)의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 CMO4(계지 및 목단피(1:8) 추출물), 도1b는 CMO4-1(계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물), 도1c는 CPA4(계지 및 작약(1:8) 추출물) 및 도1d는 CPA4-1(계지 및 작약(1:8) 열수 추출물)의 HPLC 분석하여 성분을 분석하여 나타낸 도이다.
도 2는 글리코알데히드(glycoaldehyde)를 처리한 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에서 최종당화산물 생성 억제 효능을 확인한 도이다:
AGEs: 최종당화산물(advanced glycation endproducts);
CMO4: 계지 및 목단피(1:8) 추출물;
CMO4-1: 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물;
CPA4: 계지 및 작약(1:8) 추출물;
CPA4-1: 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물;
**p<0.01 vs Non-AGEs;
***p<0.001 vs Non-AGEs;
#p<0.05 vs AGEs;
##p<0.01 vs AGEs; 및
###p<0.001 vs AGEs.
도 3은 고혈당 환경에서 사람망막색소상피 세포주에서 계지 및 목단피(1:2) 추출물(CMO2), 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4), 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1), 계지 및 작약(2:1) 열수 추출물(CPA1-1), 계지 및 작약(1:2) 열수 추출물(CPA2-1), 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4), 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)의 최종당화산물의 생성 억제 효과를 확인한 도이다:
HG: 고혈당 처리군;
BSA: 소혈청알부민(bovine serum albumin) 처리군;
CMO2: 계지 및 목단피(1:2) 추출물(CMO2);
CMO4: 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4);
CMO4-1: 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1);
CPA1-1: 계지 및 작약(2:1) 열수 추출물(CPA1-1);
CPA2-1: 계지 및 작약(1:2) 열수 추출물(CPA2-1);
CPA4: 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4);
CPA4-1: 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1);
AG: 양성대조군인 아미노구아니딘(aminoguanidine) 처리군:
*p<0.05 vs CON;
**p<0.01 vs CON;
***p<0.001 vs CON;
#p<0.05 vs HG;
##p<0.01 vs HG; 및
###p<0.001 vs HG.
도 4는 제2형 당뇨모델 db/db 마우스에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 혈액망막장벽 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트(fenofibrate) 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-250: CMO4-1 250 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-250: CPA4-1 250 mg/kg/day 투여군.
도 5는 제2형 당뇨모델 db / db 마우스에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 무세포성 모세혈관 형성 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-250: CMO4-1 250 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-250: CPA4-1 250 mg/kg/day 투여군.
도 6은 제2형 당뇨모델 db / db 마우스에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 세포간 치밀이음부 단백질(tight-junction protein)인 오클루딘(occludin) 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-250: CMO4-1 250 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-250: CPA4-1 250 mg/kg/day 투여군.
도 7은 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민(metformin)을 12주 간 투여하면서 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 혈액망막장벽 손상 치료 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM.
도 8은 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 무세포성 모세혈관 형성 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM.
도 9는 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 세포간 치밀이음부 단백질의 손상 치료 효능을 확인한 도이며, 도 9a는 클라우딘(claudin)-5의 손상 여부를 염색으로 확인한 것이고, 도 9b는 웨스턴 블랏팅으로 오클루딘 단백질의 변화를 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM.
도 10 및 도 11은 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 신증개선 효과를 분석한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM(또는 db / db).
도 12는 MNU 유도설치류 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4), 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)의 광수용체 세포(photoreceptor cell)(황반변성)의 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
MNU: N-methyl-N-nitrosourea(MNU) 유도 동물모델;
CMO4-100: MNU 유도 동물모델 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-50: MNU 유도 동물모델 + CMO4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: MNU 유도 동물모델 + CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-50: MNU 유도 동물모델 + CPA4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: MNU 유도 동물모델 + CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs MNU.
도 13은 NaIO3 유도설치류 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)의 망막색소상피세포(황반변성)의 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
Normal: C57BL/6 정상 마우스;
NaIO3: NaIO3 유도 동물모델;
CMO4-1-50: NaIO3 유도 동물모델 + CMO4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: NaIO3 유도 동물모델 + CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-50: NaIO3 유도 동물모델 + CPA4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: NaIO3 유도 동물모델 + CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs NaIO3.
도 14는 Vldlr -/- 황반변성 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 망막신생혈관(Subretinal neovascula rization) 생성 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs CON; 및
#p<0.05 vs Vldlr -/- .
도 15는 Vldlr -/- 황반변성 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 망막색소상피 세포 손상 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군.
도 16은 Vldlr -/- 마우스의 망막에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 VEGF 발현(짙은 보라색 염색; 화살표 표시) 억제 효능을 확인한 도이다:
Nor: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군.
도 17은 Vldlr -/- 마우스의 망막에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 신생혈관 억제 효능을 확인한 도이다:
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-50: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-50: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 50 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군.
도 18은 레이저로 유도된 맥락막 신생혈관(choroidal neovascularization) 렛트의 망막하(subretinal)에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 신생혈관 억제 효능을 확인한 도이다:
CNV: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군; 및
#p<0.05 vs CNV.
도 19는 포르말린(formalin)으로 하지정맥을 유발한 동물모델에서 하지정맥 예방 및 치료 효능을 확인한 도이다.
Normal: 정상 동물군(SD rat);
Edema: 하지부종 유발 동물군;
CMO4-1-50: 하지부종 유발군 + CMO4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: 하지부종 유발군 + CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-50: 하지부종 유발군 + CPA4-1 50 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-100: 하지부종 유발군 + CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군.
도 2는 글리코알데히드(glycoaldehyde)를 처리한 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에서 최종당화산물 생성 억제 효능을 확인한 도이다:
AGEs: 최종당화산물(advanced glycation endproducts);
CMO4: 계지 및 목단피(1:8) 추출물;
CMO4-1: 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물;
CPA4: 계지 및 작약(1:8) 추출물;
CPA4-1: 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물;
**p<0.01 vs Non-AGEs;
***p<0.001 vs Non-AGEs;
#p<0.05 vs AGEs;
##p<0.01 vs AGEs; 및
###p<0.001 vs AGEs.
도 3은 고혈당 환경에서 사람망막색소상피 세포주에서 계지 및 목단피(1:2) 추출물(CMO2), 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4), 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1), 계지 및 작약(2:1) 열수 추출물(CPA1-1), 계지 및 작약(1:2) 열수 추출물(CPA2-1), 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4), 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)의 최종당화산물의 생성 억제 효과를 확인한 도이다:
HG: 고혈당 처리군;
BSA: 소혈청알부민(bovine serum albumin) 처리군;
CMO2: 계지 및 목단피(1:2) 추출물(CMO2);
CMO4: 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4);
CMO4-1: 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1);
CPA1-1: 계지 및 작약(2:1) 열수 추출물(CPA1-1);
CPA2-1: 계지 및 작약(1:2) 열수 추출물(CPA2-1);
CPA4: 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4);
CPA4-1: 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1);
AG: 양성대조군인 아미노구아니딘(aminoguanidine) 처리군:
*p<0.05 vs CON;
**p<0.01 vs CON;
***p<0.001 vs CON;
#p<0.05 vs HG;
##p<0.01 vs HG; 및
###p<0.001 vs HG.
도 4는 제2형 당뇨모델 db/db 마우스에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 혈액망막장벽 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트(fenofibrate) 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-250: CMO4-1 250 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-250: CPA4-1 250 mg/kg/day 투여군.
도 5는 제2형 당뇨모델 db / db 마우스에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 무세포성 모세혈관 형성 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-250: CMO4-1 250 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-250: CPA4-1 250 mg/kg/day 투여군.
도 6은 제2형 당뇨모델 db / db 마우스에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 세포간 치밀이음부 단백질(tight-junction protein)인 오클루딘(occludin) 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-250: CMO4-1 250 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-250: CPA4-1 250 mg/kg/day 투여군.
도 7은 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민(metformin)을 12주 간 투여하면서 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 혈액망막장벽 손상 치료 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM.
도 8은 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 무세포성 모세혈관 형성 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM.
도 9는 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 세포간 치밀이음부 단백질의 손상 치료 효능을 확인한 도이며, 도 9a는 클라우딘(claudin)-5의 손상 여부를 염색으로 확인한 것이고, 도 9b는 웨스턴 블랏팅으로 오클루딘 단백질의 변화를 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM.
도 10 및 도 11은 제2형 당뇨모델 동물인 db / db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 신증개선 효과를 분석한 도이다:
NOR: 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-100: 메트포민 및 CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CMO4-250: 메트포민 및 CMO4 250 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4 250 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM(또는 db / db).
도 12는 MNU 유도설치류 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4), 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)의 광수용체 세포(photoreceptor cell)(황반변성)의 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
MNU: N-methyl-N-nitrosourea(MNU) 유도 동물모델;
CMO4-100: MNU 유도 동물모델 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-50: MNU 유도 동물모델 + CMO4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: MNU 유도 동물모델 + CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-50: MNU 유도 동물모델 + CPA4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: MNU 유도 동물모델 + CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs MNU.
도 13은 NaIO3 유도설치류 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)의 망막색소상피세포(황반변성)의 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
Normal: C57BL/6 정상 마우스;
NaIO3: NaIO3 유도 동물모델;
CMO4-1-50: NaIO3 유도 동물모델 + CMO4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: NaIO3 유도 동물모델 + CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-50: NaIO3 유도 동물모델 + CPA4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-100: NaIO3 유도 동물모델 + CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs NaIO3.
도 14는 Vldlr -/- 황반변성 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 망막신생혈관(Subretinal neovascula rization) 생성 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군;
*p<0.05 vs CON; 및
#p<0.05 vs Vldlr -/- .
도 15는 Vldlr -/- 황반변성 동물모델에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 망막색소상피 세포 손상 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군.
도 16은 Vldlr -/- 마우스의 망막에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 VEGF 발현(짙은 보라색 염색; 화살표 표시) 억제 효능을 확인한 도이다:
Nor: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군.
도 17은 Vldlr -/- 마우스의 망막에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 신생혈관 억제 효능을 확인한 도이다:
Vldlr -/- : 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4-50: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-100: Vldlr -/- 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-50: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 50 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-100: Vldlr -/- 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군.
도 18은 레이저로 유도된 맥락막 신생혈관(choroidal neovascularization) 렛트의 망막하(subretinal)에서 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 신생혈관 억제 효능을 확인한 도이다:
CNV: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 모델;
CMO4: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 + CMO4 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day 투여군; 및
#p<0.05 vs CNV.
도 19는 포르말린(formalin)으로 하지정맥을 유발한 동물모델에서 하지정맥 예방 및 치료 효능을 확인한 도이다.
Normal: 정상 동물군(SD rat);
Edema: 하지부종 유발 동물군;
CMO4-1-50: 하지부종 유발군 + CMO4-1 50 mg/kg/day 투여군;
CMO4-1-100: 하지부종 유발군 + CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-50: 하지부종 유발군 + CPA4-1 50 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-1-100: 하지부종 유발군 + CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 계지(Cinnamomi Twig) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증(diabetic complications) 및 혈관부종(angioedema) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 목단피(Moutan Root Bark), 작약(Peony Root) 및 적복령(Poria)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 혼합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄효능이 있으며, 또한 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제한다.
또한, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 심장병, 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 혈관부종은 황반변성, 황반부종, 망막변성 및 하지정맥류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령을 각각 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 계지, 목단피, 작약 및 적복령은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 목단피를 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 1:1 내지 1:8 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 작약은 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 2:1 내지 1:8 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 적복령은 2:1 내지 1:2 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 1:1 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 30% 에탄올, 50% 에탄올, 70% 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온추출, 초음파 추출 또는 증기 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 용매의 양은 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령의 분량의 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 30 내지 100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 내지 48시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 2 내지 5회인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령를 혼합하여 추출물을 제조할 수 있고, 계지, 목단피, 작약 또는 적복령을 각각 추출한 후 혼합하여 혼합 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령을 여러 비율로 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였고, 이의 성분을 분석하였으며(도 1a 내지 도 1d 참조), 각 추출물에서 패오니플로린(Paeoniflorin)의 함량을 확인하였고(표 1 참조), 이를 이용하여 시험관 내에서 최종당화산물 생성 억제 효능을 확인한 결과, 본 발명의 혼합 추출물이 양성대조군과 비교하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 현저하게 나타났으며, 특히, 양성대조군인 아미노구아니딘이 합성 단일화합물인 것을 감안할 때 본 발명의 혼합 추출물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 매우 우수함을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 글리코알데히드 처리 후 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피 추출물(CMO4, CMO4-1)과 계지 및 작약 추출물(CPA4, CPA4-1)들은 농도 의존적으로(1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖) 최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였고(도 2 참조), 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄 효능을 확인한 결과, 본 발명의 혼합 추출물이 양성대조군인 ALT-711보다 교차결합 파쇄 효능이 우수함을 나타냈으며, 특히, 양성대조군인 ALT-711이 합성 단일화합물인 것을 감안할 때 본 발명의 혼합 추출물은 교차결합 파쇄 효능이 매우 우수함을 확인하였다(표 3 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피 추출물(CMO2, CMO4, CMO4-1), 계지 및 작약 추출물(CPA1-1, CPA2-1, CPA4, CPA4-1)은 고혈당 환경에 있는 사람 망막색소 상피세포에서도 농도 의존적으로(10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖) 최종당화산물 생성을 억제함을 확인하였다(도 3 참조).
상기 결과들을 토대로 계지 및 목단피 추출물, 계지 및 작약 추출물, 계지 및 적복령 추출물은 최종당화산물 생성을 억제하고, 글리코알데히드로 코팅한 ECM에서 최종당화산물의 생성을 억제하였고, 또한, 이미 생성된 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄하며, 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물 투여군인 CMO4-1-100, CMO4-1-250 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물 투여군인 CPA4-1-100은 망막혈관으로부터 형광물질의 유출을 유의성 있게 예방하는 것을 확인하였고(도 4 참조), 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물 투여군인 CMO4-1-100, CMO4-1-250 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물 투여군인 CPA4-1-100은 무세포성 모세혈관의 형성을 유의성 있게 예방하는 것을 확인하였으며(도 5 참조), 세포간 치밀이음부 단백질인 오클루딘(occludin)의 손상 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물 투여군인 CMO4-1-100, CMO4-1-250은 오클루딘의 소실된 곳이 없음을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 18주와 24주에 망막혈관으로부터 형광물질의 유출을 유의성있게 막아 치료 효과가 있는 것을 확인하였고(도 7 참조), 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 유의성 있게 무세포성 모세혈관 형성을 억제하는 것을 확인하였으며(도 8 참조), 세포간 치밀이음부 단백질인 클라우딘(claudin)-5의 손상 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 클라우딘-5의 소실된 곳이 없음을 확인하였고(도 9a 참조), 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 클라우딘-5가 유의성있게 증가하는 것을 확인하였다(도 9b 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 고혈당에 의한 신기능 저하 예방 및 치료 효능을 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 알부민뇨 및 크레아틴 청소율을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였고(도 10 참조), 당뇨병성 신증에서 나타나는 형태학적 변화인 사구체 경화증을 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여가 이를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 11 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 황반변성 예방 및 치료 효능을 확인하기 위해 광수용체 세포(photoreceptor cell)의 손상 및 변성 여부를 망막 조직의 외과립층(outer nuclear layer)의 두께 변화로 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4, CMO4-1 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 MNU에 의한 광수용체 세포의 손상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였고(도 12 참조), 망막색소상피세포의 손상 및 변성을 망막 조직의 외과립층(outer nuclear layer)의 folding 개수로 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물인 CMO4-1 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 NaOI3에 의해 유도된 착색된 상피 세포의 손상을 억제하여 외과립층이 휘어지는 현상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 13 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 망막 혈관의 부종을 측정하여 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인한 결과, 신생혈관 생성을 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였고(도 14 참조), 망막색소상피세포의 형태학적 구조의 변성 유무를 확인한 결과, 망막색소상피세포의 변성을 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 투여에 의해 현저히 억제되는 것을 확인하였으며(도 15 참조), 망막에서의 VEGF 발현 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4의 투여로 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 16 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인한 결과, 신생혈관 생성을 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 100 mg/kg 투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였고(도 17 참조), 망막하 부위의 신생혈관 생성 억제 효과를 확인한 결과, 신생혈관 생성이 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4(100 ㎎/㎏) 투여에 의해 유의적으로 억제되었고, 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4(100 ㎎/㎏) 투여에 의해 억제되는 경향을 보이는 것을 확인하였으며(도 18 참조), 망막신경조직의 광수용체 세포의 손상에 의한 외과립층 두께의 변화를 확인한 결과, 패오니플로린의 함량이 가장 적은 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4(2.7%)의 효능이 매우 우수하다는 것은 계지 및 목단피 추출물, 또는 계지 및 작약 추출물의 효능이 단지 패오니플로린으로 인한 것이 아니라, 계지 및 목단피 추출물, 또는 계지 및 작약 추출물에 존재하는 수많은 성분들의 시너지 효과임을 확인하였다(표 4 내지 표 5 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 하지부종 유발 전 및 후의 부종 상태를 확인한 결과, 하지 부종에 의한 크기의 변화가 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4-1에 의해서는 크게 억제되지 않았고, 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4-1에 의해서는 농도 의존적이며 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 19 참조).
따라서, 본 발명의 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물이 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며, 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고, 다양한 당뇨합병증 동물모델, 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성, 망막부종 및 하지부종을 지연, 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써, 상기 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 혼합 추출물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 본 발명의 혼합 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당뇨합병증 또는 혈관부종 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 계지 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 추출물은 목단피, 작약 및 적복령으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 혼합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄효능이 있으며, 또한 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제한다.
또한, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 심장병, 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 혈관부종은 황반변성, 황반부종, 망막변성 및 하지정맥류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령을 각각 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 계지, 목단피, 작약 및 적복령은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 목단피를 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 1:1 내지 1:8 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 작약은 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 2:1 내지 1:8 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 적복령은 2:1 내지 1:2 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 1:1 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 30% 에탄올, 50% 에탄올, 70% 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온추출, 초음파 추출 또는 증기 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 용매의 양은 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령의 분량의 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 30 내지 100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 내지 48시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 2 내지 5회인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령를 혼합하여 추출물을 제조할 수 있고, 계지, 목단피, 작약 또는 적복령을 각각 추출한 후 혼합하여 혼합 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명의 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물이 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며, 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고, 다양한 당뇨합병증 동물모델, 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성, 망막부종 및 하지부종을 지연, 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써, 상기 계지 및 목단피, 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조, 가공될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다.
본 발명의 혼합 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 혼합 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 혼합 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 혼합 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 자근 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 혼합 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 계지 ( Cinnamomi Twig ) 및 목단피( Moutan Root Bark ) 혼합 추출물의 제조
계지 및 목단피는 대전 백제당(대한민국)에서 구입하여 아래와 같이 실시예를 수행하였으며, 한국한의학연구원 당뇨합병증 연구팀의 저온실에 보관하였다.
<1-1>
계지
및 목단피(1:1) 추출물(
CMO1
)의 제조
계지 및 목단피 추출물(CMO1)은 계지 12 g과 목단피 12 g을 1:1로 혼합하여 총 24 g을 50% 에탄올 144 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<1-2>
계지
및 목단피(1:1)
열수
추출물(
CMO1
-1)의 제조
계지 및 목단피 열수 추출물(CMO1-1)은 계지 90 g과 목단피 90 g을 1:1로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<1-3>
계지
및 목단피(1:2) 추출물(
CMO2
)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 목단피 추출물(CMO2)은 계지 10 g과 목단피 20 g을 1:2로 혼합하여 총 30 g을 50% 에탄올 180 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<1-4>
계지
및 목단피(1:2)
열수
추출물(
CMO2
-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 계지 및 목단피 열수 추출물(CMO2-1)은 계지 60 g과 목단피 120 g을 1:1로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<1-5>
계지
및 목단피(1:4) 추출물(
CMO3
)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 목단피 추출물(CMO3)은 계지 6 g과 목단피 24 g을 1:4로 혼합하여 총 30 g을 50% 에탄올 180 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<1-6>
계지
및 목단피(1:4)
열수
추출물(
CMO3
-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 계지 및 목단피 열수 추출물(CMO3-1)은 계지 36 g과 목단피 144 g을 1:4로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<1-7>
계지
및 목단피(1:8) 추출물(
CMO4
)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 목단피 추출물(CMO4)은 계지 3.5 g과 목단피 28 g을 1:8로 혼합하여 총 31.5 g을 50% 에탄올 190 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<1-8>
계지
및 목단피(1:8)
열수
추출물(
CMO4
-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 계지 및 목단피 열수 추출물(CMO4-1)은 계지 20 g과 목단피 160 g을 1:8로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<
실시예
2>
계지
및 작약(
Peony
Root
) 혼합 추출물의 제조
계지 및 작약은 대전 백제당(대한민국)에서 구입하여 아래와 같이 실시예를 수행하였으며, 한국한의학연구원 당뇨합병증 연구팀의 저온실에 보관하였다.
<2-1>
계지
및 작약(2:1) 추출물(
CPA1
)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 작약 추출물(CPA1)은 계지 16 g과 작약 8 g을 2:1로 혼합하여 총 24 g을 50% 에탄올 144 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<2-2>
계지
및 작약(2:1)
열수
추출물(
CPA1
-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 계지 및 작약 열수 추출물(CPA1-1)은 계지 120 g과 목단피 60 g을 2:1로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<2-3>
계지
및 작약(1:2) 추출물(
CPA2
)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 작약 추출물(CPA2)은 계지 10 g과 작약 20 g을 1:2로 혼합하여 총 30 g을 50% 에탄올 180 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<2-4>
계지
및 작약(1:2)
열수
추출물(
CPA2
-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 계지 및 작약 열수 추출물(CPA2-1)은 계지 60 g과 작약 120 g을 1:2로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<2-5>
계지
및 작약(1:4) 추출물(
CPA3
)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 작약 추출물(CPA3)은 계지 6 g과 작약 24 g을 1:4로 혼합하여 총 30 g을 50% 에탄올 180 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<2-6>
계지
및 작약(1:4)
열수
추출물(
CPA3
-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 계지 및 작약 열수 추출물(CPA3-1)은 계지 36 g과 작약 144 g을 1:4로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
*<2-7> 계지 및 작약(1:8) 추출물( CPA4 )의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 작약 추출물(CPA4)은 계지 3.5 g과 작약 28 g을 1:8로 혼합하여 총 31.5 g을 50% 에탄올 190 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<2-8>
계지
및 작약(1:8)
열수
추출물(
CPA4
-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 계지 및 작약 열수 추출물(CPA4-1)은 계지 20 g과 작약 160 g을 1:8로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<
실시예
3>
계지
및
적복령
(
Poria
) 혼합 추출물의 제조
계지 및 적복령은 대전 백제당(대한민국)에서 구입하여 아래와 같이 실시예를 수행하였으며, 한국한의학연구원 당뇨합병증 연구팀의 저온실에 보관하였다.
<3-1>
계지
및
적복령
(1:1) 추출물(
CPO
)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로, 계지 및 적복령 추출물(CPO)은 계지 12 g과 적복령 12 g을 1:1로 혼합하여 총 24 g을 50% 에탄올 144 ml에 넣어 50℃ 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<
실시예
4>
계지
,
적복령
, 목단피, 적작약 및 도인 혼합 추출물(
KBT
)의 제조
대조군으로 사용된 추출물 KBT는 계지, 적복령, 목단피, 적적약 및 도인을 각각 동량을 혼합하여 10배의 증류수를 가한 다음, 초고속 진공 저온 농축 추출기로 약 2시간 정도 전탕하여 감압고온 추출 후 건조하여 제조하였다.
<
실시예
5>
계지
, 작약, 감초, 생강 및 대조 혼합 추출물(
KJT
)의 제조
대조군으로 사용된 추출물 KJT는 계지, 작약, 감초, 생강 및 대조를 각각 3:2:1:1:1의 비율로 혼합하여 10배의 증류수를 가한 다음, 초고속 진공 저온 농축 추출기로 약 2시간 정도 전탕하여 감압고온 추출 후 건조하여 제조하였다.
<
실시예
6>
계지
및 목단피 추출물,
계지
및 작약 추출물의 성분 분석
본 발명자들은 계지 및 목단피 추출물(CMO4), 계지 및 목단피 열수 추출물(CMO4-1), 계지 및 작약 추출물(CPA4), 계지 및 작약 열수 추출물(CPA4-1)의 성분을 확인하기 위해 HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 계지 및 목단피 추출물(CMO4), 계지 및 목단피 열수 추출물(CMO4-1)의 지표성분이 갈릭산(Gallic acid), 옥시패오니플로린(Oxypaeoniflorin), 알비프로린(Albiflorin), 패오니플로린(Paeoniflorin), 벤조익산(Benzoic acid), 신남산(Cinnamic acid), 신남알데하이드(Cinnamaldehyde), 패오눌(Paeonol)인 것을 확인하였고(도 1a 내지 도 1b), 계지 및 작약 추출물(CPA4), 계지 및 작약 열수 추출물(CPA4-1)의 지표성분은 갈릭산, 옥시패오니플로린, 알비프로린, 패오니플로린, 벤조익산, 신남산, 신남알데하이드인 것을 확인하였으며(도 1c 내지 도 1d), 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 각 추출물에서 패오니플로린의 함량을 확인하였다(표 1).
| 패오니플로린(Paeoniflorin, PF) 함량(%) | |
| 계지 및 목단피 추출물(CMO4) | 2.7 |
| 계지 및 목단피 열수 추출물(CMO4-1) | 2.3 |
| 계지 및 작약 추출물(CPA4) | 12.3 |
| 계지 및 작약 열수 추출물(CPA4-1) | 8.9 |
< 실험예 1> 최종당화산물 ( advanced glycation endproducts , AGEs ) 생성 억제 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 5>에서 제조한 계지를 포함한 혼합 추출물의 시험관 내 최종당화산물 생성 억제 효능을 분석하였다.
구체적으로, 단백질원은 50 mM 인산완충용액(phosphate buffer; pH 7.4)에 용해한 10 mg/ml 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA, Sigma, 미국)을, 당원으로는 0.2 M 과당 및 0.2 M 글루코스가 혼합된 용액을 사용하였다. 상기<실시예>의 추출물과 양성대조군(아미노구아니딘)을 0.2% 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해한 후 15% 트윈(tween) 80에 다시 용해하였다. 이와 같이 제조한 단백질원, 당원 및 추출물을 혼합하여 총 1 ml로 조제한 후 37℃에서 7일간 배양하여 당화 반응을 시켰다. 이때, 항박테리아제 0.02% 소디움 아자이드(sodium azide)를 넣어 박테리아 생성을 방지하였다. 배양 후 형광도를 spectrofluorometric detector(Bio-TEK, 미국)을 이용하여 흡수파장 350 nm, 방출파장 450 nm로 측정하였다. 이를 하기 수학식 1과 같이 계산하였고, 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
그 결과 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 계지 및 목단피 추출물인 CMO1, CMO2, CMO3, CMO4는 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 각각 17배, 21.3배, 21.3배, 22.7배 우수함을 확인하였고, 계지 및 작약 추출물인 CPA1, CPA2, CPA3, CPA4는 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 각각 8배, 10.9배, 10.1배, 12.1배 우수함을 확인하였으며, 계지 및 적복령 추출물(CPO)은 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 4배 정도 우수함을 확인하였다(표 2).
또한, 상기 <실시예 4>의 추출물(KBT)과 비교하였을 때, 계지 및 목단피 추출물인 CMO1, CMO2, CMO3, CMO4, 계지 및 작약 추출물인 CPA1, CPA2, CPA3, CPA4, 및 계지 및 적복령 추출물(CPO)은 각각 4.8배, 5.9배, 5.9배, 6.3배, 2.3배, 3.0배, 2.8배, 3.4배, 1.1배 최종당화산물 생성 억제 효능이 우수한 것을 확인하였고, 상기 <실시예 5>의 추출물(KJT)과 비교하였을 때, 계지 및 목단피 추출물인 CMO1, CMO2, CMO3, CMO4, 계지 및 작약 추출물인 CPA1, CPA2, CPA3, CPA4, 및 계지 및 적복령 추출물(CPO)은 각각 8.5배, 10.4배, 10.4배, 10.4배, 11.1배, 4.1배, 5.4배, 8.6배, 2.0배 최종당화산물 생성 억제 효능이 우수한 것을 확인하였다(표 2).
따라서, 양성대조군인 아미노구아니딘이 합성단일화합물인 것을 감안할 때 본 발명의 계지 및 목단피 추출물, 계지 및 작약 추출물, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 매우 우수함을 확인하였고, 동시에 본 발명의 계지 및 목단피 추출물, 계지 및 작약 추출물, 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 상기 <실시예 4>의 추출물(KBT) 또는 상기 <실시예 5>의 추출물(KJT) 보다 매우 우수한 것을 확인하였다.
| 시료 | IC50(ug/ml) | 효능 비교 | ||
| 양성대조군(AG) 대비 | <실시예 4>의 추출물(KBT) 대비 | <실시예 5>의 추출물(KJT) 대비 | ||
| <실시예 4>의 추출물(KBT) | 22.96±0.49 | ×3.6 | ||
| <실시예 5>의 추출물(KJT) | 40.43±2.20 | ×2.0 | ||
| 실시예 <1-1>의 계지 및 목단피(1:1) 추출물(CMO1) | 4.78±0.12 | ×17 | ×4.8 | ×8.5 |
| 실시예 <1-2>의 계지 및 목단피(1:2) 추출물(CMO2) | 3.87±0.09 | ×21.3 | ×5.9 | ×10.4 |
| 실시예 <1-3>의 계지 및 목단피(1:4) 추출물(CMO3) | 3.87±0.12 | ×21.3 | ×5.9 | ×10.4 |
| 실시예 <1-4>의 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) | 3.63±0.17 | ×22.7 | ×6.3 | ×10.4 |
| 실시예 <2-1>의 계지 및 작약(2:1) 추출물(CPA1) | 9.94±0.20 | ×8.0 | ×2.3 | ×11.1 |
| 실시예 <2-2>의 계지 및 작약(1:2) 추출물(CPA2) | 7.54±0.18 | ×10.9 | ×3.0 | ×4.1 |
| 실시예 <2-3>의 계지 및 작약(1:4) 추출물(CPA3) | 8.16±0.23 | ×10.1 | ×2.8 | ×5.4 |
| 실시예 <2-4>의 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4) | 6.84±0.08 | ×12.1 | ×3.4 | ×8.6 |
| 실시예 <3-1>의 계지 및 적복령(1:1) 추출물(CPO) | 20.46±0.36 | ×4.0 | ×1.1 | ×2.0 |
| 아미노구아니딘(양성대조군, AG) | 82.50±1.10 | - | ||
<
실험예
2>
글리코알데히드
(
glycoaldehyde
)를 처리한
세포외기
질(
extracellular
matrix
,
ECM
)에서
최종당화산물
생성 억제 효능 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 혼합 추출물의 글리코알데히드 처리 후 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인하였다.
세포외기질(Extracellular Matrix, ECM)(Sigma-Aldrich, cat. no. c-3867)을 10 ㎍/cm2로 하여 96 검은색 웰 플레이트(black well plate)에 분주한 후, 밤새 4℃에서 코팅하였다. 다음날 코팅된 플레이트의 ECM을 제거하고, 실온에서 완전히 건조시킨 후 100 mM 글리코알데히드(Sigma-Aldrich)와 미리 희석된 다양한 농도(1, 5, 10, 20, 50 ㎍/㎖)의 추출물과 함께 전체 양이 100 ㎕가 되도록 하여 37℃에서 4시간 반응시켜 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs)의 생성을 억제하는지 확인하였다. 양성대조군으로는 100 mM 글리코알데히드(Sigma-Aldrich)만 넣어 최종당화산물 생성을 확인하였다. PBS로 2번 세척한 후, 50 mM 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)(Sigma-Aldrich) 100 ㎕를 넣고, 5분 동안 남아있는 알데히드 그룹(aldehyde group)을 중화시켰다. 중화반응 후, PBS로 2번 세척하고, 다시 PBS 100 ㎕를 넣어 형광분석기(Ex. 370 nm/Em 440 nm)로 확인하였다. 통계처리는 Prism 5.0 프로그램(GraphPad)을 이용하여 p<0.05 이상을 유의적인 값으로 하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 계지 및 목단피 추출물(CMO4, CMO4-1)과 계지 및 작약 추출물(CPA4, CPA4-1)들은 농도 의존적으로(1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖) 최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였다(도 2).
<
실험예
3>
최종당화산물의
교차결합 파쇄 효능 확인(
Breaking
effect
on
already
formed
cross
-
linked
AGE
and
protein
complex
)
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 3>에서 제조한 혼합 추출물의 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차 결합 파쇄 효능을 확인하였다. 양성대조군은 ALT-711(Alteon Inc., Ramsey, NJ)을 사용하였다.
구체적으로, 1.0 ㎍ AGE-BSA(Transgenic Inc. Kobe, 일본)를 콜라겐 코팅된 96 웰 마이크로타이터 플레이트(Greiner Bio-One, 독일)에 분주한 후 37℃에서 4시간 배양하여 AGE-BSA와 콜라겐을 교차결합시킨다. 0.05% PBST에 3번 세척하여 결합하지않은 AGE-BSA를 제거한 후, 혼합 추출물과 ALT-711을 가한 후 37℃에서 4시간 배양하였다. 이 후 0.05% PBST로 세척하고, 콜라겐과 교차결합하여 남아있는 AGE-BSA를 검출하기 위하여 mouse monoclonal anti-AGE-BSA 항체(6D12, Transgenic Inc. Kobe, 일본)를 1:250으로 희석하여 분주한 후 37℃에서 1시간 배양하였다. 1시간 후 0.05% PBST로 세척하고, HRP-linked goat anti-mouse IgG 항체(SantaCruz, 미국)를 반응시켜 TMB(3.3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 기질로 하여 발색한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. AGE-BSA의 교차결합 파쇄 효능(%)은 하기 수학식 2와 같이 계산하였다.
그 결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 계지 및 목단피 추출물들인 CMO1, CMO1-1, CMO2, CMO2-1, CMO3, CMO3-1, CMO4 및 CMO4-1은 양성대조군인 ALT-711에 비하여 최종당화산물의 교차결합 파쇄 효능이 각각 1183배, 12362배, 16726배, 4352배, 13225배, 3419배, 11685배 및 3281배로 매우 우수하였고, 계지 및 작약 추출물들인 CPA1, CPA1-1, CPA2, CPA2-1, CPA3, CPA3-1, CPA4 및 CPA4-1은 양성대조군인 ALT-711에 비하여 최종당화산물의 교차결합 파쇄 효능이 각각 2221배, 13124배, 1965배, 12362배, 2093배, 11373배, 1977배 및 7515배로 매우 우수하였으며, 계지 및 적복령 추출물(CPO)은 양성대조군인 ALT-711에 비하여 최종당화산물의 교차결합 파쇄 효능이 3495배 우수한 것을 확인하였다(표 3).
따라서, 계지 및 목단피 추출물, 계지 및 작약 추출물, 또는 계지 및 적복령 추출물은 양성대조군인 ALT-711보다 그 효능이 우수한 것을 확인하였다. 특히 양성대조군인 ALT-711은 합성단일 화합물인 것을 참고할 때 본 발명의 혼합 추출물이 효능이 뛰어남을 확인하였다.
| 시료 | IC50(ug/ml) | 효능 비교 |
| ALT-711 대비 | ||
| 실시예 <1-1>의 계지 및 목단피(1:1) 추출물(CMO1) | 14.41±8.94 | ×1183 |
| 실시예 <1-2>의 계지 및 목단피(1:1) 열수 추출물(CMO1-1) | 1.38±0.37 | ×12362 |
| 실시예 <1-3>의 계지 및 목단피(1:2) 추출물(CMO2) | 1.02±0.15 | ×16725.5 |
| 실시예 <1-4>의 계지 및 목단피(1:2) 열수 추출물(CMO2-1) | 3.92±1.09 | ×4352 |
| 실시예 <1-5>의 계지 및 목단피(1:4) 추출물(CMO3) | 1.29±0.70 | ×13224.8 |
| 실시예 <1-6>의 계지 및 목단피(1:4) 열수 추출물(CMO3-1) | 4.99±2.53 | ×3419 |
| 실시예 <1-7>의 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) | 1.46±0.65 | ×11685 |
| 실시예 <1-8>의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) | 5.20±1.18 | ×3281 |
| 실시예 <2-1>의 계지 및 작약(2:1) 추출물(CPA1) | 7.68±3.78 | ×2221 |
| 실시예 <2-2>의 계지 및 작약(2:1) 열수 추출물(CPA1-1) | 1.30±0.37 | ×13124 |
| 실시예 <2-3>의 계지 및 작약(1:2) 추출물(CPA2) | 8.68±0.90 | ×1965 |
| 실시예 <2-4>의 계지 및 작약(1:2) 열수 추출물(CPA2-1) | 1.38±0.24 | ×12362 |
| 실시예 <2-5>의 계지 및 작약(1:4) 추출물(CPA3) | 8.15±0.39 | ×2093 |
| 실시예 <2-6>의 계지 및 작약(1:4) 열수 추출물(CPA3-1) | 1.50±1.64 | ×11373 |
| 실시예 <2-7>의 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4) | 8.63±0.70 | ×1977 |
| 실시예 <2-8>의 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1) | 2.27±0.38 | ×7515 |
| 실시예 <3-1>의 계지 및 적복령(1:1) 추출물(CPO) | 4.88±1.34 | ×3495 |
| ALT-711(양성대조군) | 17,060±2.35 | - |
<
실험예
4> 고혈당 환경에서 사람
망막색소상피
세포주에서
최종당화산물
생성 억제 효과 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피 추출물(CMO2, CMO4, CMO4-1), 계지 및 작약 추출물(CPA1-1, CPA2-1, CPA4, CPA4-1)의 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주(ARPE-19: ATCC No. CRL-2302)를 Dulbeccos modified Eagles medium 배지(DMEM, Gibco, USA)로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. BSA의 최종 농도 500 ㎍/㎖, 고혈당을 25 mM의 조건에서 배양한 후, 본 발명의 계지 및 목단피 추출물(CMO2, CMO4, CMO4-1), 계지 및 작약 추출물(CPA1-1, CPA2-1, CPA4, CPA4-1)을 농도별(10, 20, 50 ㎍/㎖)로 처리하였다. 또한, 양성대조군은 아미노구아니딘(AG, 10 mM)을 처리하였다. 시료는 1×PBS로 세척 후 Laemmli Sample Buffer(cat. no. 161-0737, Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 처리한 후 100℃에서 5분간 끓인 후, BCA(Pierce Biotechnology, IL, USA)로 단백질 정량 후 사용하였다. SDS가 포함된 10% polyacrylamide gel(PAGE)에 단백질을 전기영동(120 V, 2hr) 후 transfer buffer(0.25 M Tris, 1.92 M Glycine, pH 8.3-8.4)로 PVDF 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 단백질을 이동시켰다(250 mA, 1.5). TBS-T(200 mM Tris, 1.37 M NaCl, 0.05% Tween 20) 용액에 5% non fat milk로 blocking한 후, AGEs 항체(Anti-AGEs monoclonal Ab, Clone No. 6D12)를 4℃에서 반응하였다. 세척 후 HRP-conjugated된 이차 항체를 반응시키고 다시 세척한 후, enhanced chemiliuminescence(ECL)으로 반응시켜 LAS-3000(Fuji film, JPN)으로 분석하고, GraphPad Prism 5(San Diego)로 통계 처리하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 계지 및 목단피 추출물(CMO2, CMO4, CMO4-1), 계지 및 작약 추출물(CPA1-1, CPA2-1, CPA4, CPA4-1)은 고혈당 환경에 있는 사람 망막색소 상피세포에서도 농도 의존적으로(10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖) 최종당화산물 생성을 억제함을 확인하였다(도 3).
상기 결과들을 토대로 계지 및 목단피 추출물, 계지 및 작약 추출물, 계지 및 적복령 추출물은 최종당화산물 생성을 억제하고, 글리코알데히드로 코팅한 ECM에서 최종당화산물의 생성을 억제하였고, 또한, 이미 생성된 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄하며, 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였다.
<
실험예
5> 동물모델에서 당뇨합병증 예방 효과 확인
제2형 당뇨모델 db / db 마우스에서 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)의 당뇨합병증 예방 효과를 확인하기 위하여, 12주 동안 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 투여하여 확인하였다. 양성대조군으로 당뇨망막병증 치료제로 호주에서 승인받은 약물인 페노파이브레이트(fenofibrate)를 사용하였다.
<5-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
렙틴(leptin) 수용체 돌연변이로 당뇨가 발생하는 제2형 당뇨 동물모델인 7주령의 수컷 db / db 마우스를 각 군당 10마리씩 하기와 같이 7군으로 나누어 실험을 진행하였다:
(1) 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스, NOR), (2) 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db 당뇨 마우스, DM), (3) 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군(Feno), (4) CMO4-1 100 mg/kg/day 투여군(CMO4-1-100), (5) CMO4-1 250 mg/kg/day 투여군(CMO4-1-250), (6) CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군(CPA4-1-100), (7) CPA4-1 250 mg/kg/day 투여군(CPA4-1-250).
모든 약물은 0.5% 메틸셀룰로스(methylcellulose)에 현탁하여 매일 1회, 12주간 경구로 투여하였다. 실험군 (1)군 및 (2)군은 vehicle 용액인 0.5% 메틸셀룰로스 용액만 동량으로 경구 투여하였다. 약물투여기간 동안 체중과 사료 및 음수 섭취량을 측정하였다.
<5-2> 혈액망막장벽 손상(
Blood
-
retinal
barrier
breakage
) 억제 효과 확인
고혈당이 지속되면 안구의 망막혈관의 기능 이상으로 혈액망막장벽이 손상을 입게된다. 이에, 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 투여한 후 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <5-1>과 같이 디자인한 실험군의 마우스에 펜토바비탈나트륨(pentobarbital sodium) 25 mg/kg 복강 주사하여 마취시킨 후, 복강 및 흉강을 열어 심장을 확보하고, 1 ㎖의 멸균된 PBS에 녹여 준비한 50 mg/㎖ 플루오레세인-덱스트란(fluorescein-dextran)(2×106 분자량)을 좌심실에 주사하였다. 10분 후, 안구를 적출하고, 좌측 안구를 안배(eyecup)에 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aqueous mounting medium으로 마운팅(mounting)하였다. 이를 충분히 건조시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상군(NOR)은 형광의 유출이 관찰되지 않았으나, 당뇨군(DM)은 혈액망막장벽 손상으로 인한 유출된 형광물질이 유의성 있게 증가하였고, 양성대조군인 페노파이브레이트 투여군(Feno)은 형광물질의 유출을 막지 못하였으나, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물 투여군인 CMO4-1-100, CMO4-1-250 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물 투여군인 CPA4-1-100은 망막혈관으로부터 형광물질의 유출을 유의성있게 예방하는 것을 확인하였다(도 4).
<5-3> 무세포성 모세혈관 형성(
acellular
capillary
formation
) 억제 효능 확인
당뇨병성 망막증의 초기 증상 중의 하나는 무세포성 모세혈관 형성으로 인해 주변세포인 페리사이트(pericyte)의 핵이 사멸되어 망막증으로 진행된다. 이에, 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 투여한 후 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <5-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하고, 안구에서 망막을 적출하여 흐르는 물에 수세한 후, 3% 트립신에 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다이제스트된 망막을 PBS에 옮긴 후 internal membrane(세포 안에 존재하는 소기관들의 막)을 제거하였다. vascular frame은 유리 막대를 이용하여 망막 background로부터 분리하여 슬라이드에 올려놓고 건조시켰다. PAS 염색과 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색하여 세포벽과 핵의 변화를 확인하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 정상군(NOR)은 무세포성 모세혈관이 관찰되지 않았으나, 당뇨군(DM)은 무세포성 모세혈관이 유의하게 증가하였고, 페노파이브레이트 투여군(FENO)은 무세포성 모세혈관 형성을 막지 못했으나, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물 투여군인 CMO4-1-100, CMO4-1-250 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물 투여군인 CPA4-1-100은 무세포성 모세혈관의 형성을 유의성 있게 예방하는 것을 확인하였다(도 5).
<5-4>
세포간
치밀이음부
단백질(
Tight
-
junction
protein
) 손상 억제 효능 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물(CMO4-1) 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물(CPA4-1)을 투여한 후 세포간 치밀이음부 단백질인 오클루딘(occludin)의 손상 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <5-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후, 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 ㎛ 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드레 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다아제(peroxidase) 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반응시킨 후 0.05% 트윈(tween) 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 반응을 제거하기 위하여 5% 카세인(casein)을 이용하여 blocking한 후, 1차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 또는 하룻밤동안 처리하였다. 1시간 PBS로 세척한 후 labeled streptoavidin biotin(LSAB) 키트(Dako, USA)를 적용한 후 DAB로 발색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 형광염색의 경우 FITC-conjugated된 2차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 반응시킨 후, DAPI로 염색한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 당뇨군(DM)에서 오클루딘의 실타래 같은 연결선이 끊어진 것을 확인하였으나, 페노파이브레이트 투여군(FENO), 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물 투여군인 CMO4-1-100, CMO4-1-250은 오클루딘의 소실된 곳이 없음을 확인하였다(도 6).
<
실험예
6> 동물모델에서 당뇨합병증 치료 효과 확인
계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)과 메트포민(metformin)과의 병용투여시 치료 효과를 확인하기 위하여, 제2형 당뇨모델 db/db 마우스에 메트포민을 12주간 투여하여 혈당을 조절한 후, 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 12주간 더 메트포민과 병용투여하여 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)의 당뇨병성 망막증 및 신증에 대한 치료 효과를 확인하였다. 양성대조군으로 당뇨망막병증 치료제로 호주에서 승인받은 약물인 페노파이브레이트(fenofibrate)를 사용하였다.
<6-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
렙틴(leptin) 수용체 돌연변이로 당뇨가 발생하는 제2형 당뇨 동물모델인 7주령의 수컷 db / db 마우스를 각 군당 10마리씩 하기와 같이 8군으로 나누어 실험을 진행하였다:
(1) 정상 동물군(nondiabetic heterozygote db/+ 마우스, NOR), (2) 당뇨 동물군(C57BL/KsJ-Lepr db / db 당뇨 마우스, DM), (3) 메트포민 350 mg/kg/day 투여군(MET), (4) 메트포민+페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군(MET+FENO), (5) 메트포민+CMO4 100 mg/kg/day 투여군(MET+CMO4-100), (6) 메트포민+CMO4 250 mg/kg/day 투여군(MET+CMO4-250), (7) 메트포민+CPA4 100 mg/kg/day 투여군(MET+CPA4-100), (8) 메트포민+CPA4 250 mg/kg/day 투여군(MET+CPA4-250).
(3) 내지 (8)군은 일정수준 혈당을 낮추기 위하여 메트포민 350 mg/kg을 12주간 투여하였다. 메트포민 및 추출물은 0.5% 메틸셀룰로스(methylcellulose)에 현탁하여 매일 1회, 12주간 경구로 투여하였다. 실험군 (1)군 및 (2)군은 vehicle 용액인 0.5% 메틸셀룰로스 용액만 동량으로 경구 투여하였다. 12주 동안 메트포민 투여 후, 각 군에 해당하는 추출물을 정해진 용량만큼 매일 메트포민에 추가하여 병용투여하였다. 약물투여기간 동안 체중과 사료 및 음수 섭취량을 측정하였고, 4주 간격으로 혈당을 측정하였다.
<6-2> 혈액망막장벽 손상(
Blood
-
retinal
barrier
breakage
) 억제 효과 확인
고혈당이 지속되면 안구의 망막혈관의 기능 이상으로 혈액망막장벽이 손상을 입게된다. 이에, 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 투여한 후 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <6-1>과 같이 디자인한 실험군의 마우스에 펜토바비탈나트륨(pentobarbital sodium) 25 mg/kg 복강 주사하여 마취시킨 후, 복강 및 흉강을 열어 심장을 확보하고, 1 ㎖의 멸균된 PBS에 녹여 준비한 50 mg/㎖ 플루오레세인-덱스트란(fluorescein-dextran)(2×106 분자량)을 좌심실에 주사하였다. 10분 후, 안구를 적출하고, 좌측 안구를 안배(eyecup)에 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aqueous mounting medium으로 마운팅(mounting)하였다. 이를 충분히 건조시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다. 당뇨 유발 12주, 18주, 24주에 각각 확인하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군(NOR)은 24주까지 별다른 형광의 유출이 관찰되지 않았으나, 당뇨군(DM)은 12주, 18주, 24주의 대다수 개체에서 혈액망막장벽 손상으로 형광물질이 혈관 밖으로 세어나오는 현상이 확인되었고, 양성대조군인 메트포민 투여군(MET)은 형광물질 유출 소견이 18주까지는 당뇨군(DM)에 비하여 유의성있게 감소하였으나, 24주에는 형광물질의 유출을 막지 못하였으며, 메트포민과 페노파이브레이트 병용 투여군(MET+FENO)은 18주에는 형광물질 유출을 막았으나, 24주에는 전혀 효능이 없음을 확인하였고, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 18주와 24주에 망막혈관으로부터 형광물질의 유출을 유의성있게 막아 치료 효과가 있는 것을 확인하였다(도 7).
상기 결과로 메트포민은 어느 기간 동안에는 망막 혈관이 손상되는 것을 막을 수 있으나, 한계가 있어 결국엔 망막 혈관 손상을 막지 못함을 확인하였다.
<6-3> 무세포성 모세혈관 형성(
acellular
capillary
formation
) 억제 효능 확인
당뇨병성 망막증의 초기 증상 중의 하나는 무세포성 모세혈관 형성으로 인해 주변세포인 페리사이트(pericyte)의 핵이 사멸되어 망막증으로 진행된다. 이에, 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 투여한 후 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <6-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하고, 안구에서 망막을 적출하여 흐르는 물에 수세한 후, 3% 트립신에 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다이제스트된 망막을 PBS에 옮긴 후 internal membrane(세포 안에 존재하는 소기관들의 막)을 제거하였다. vascular frame은 유리 막대를 이용하여 망막 background로부터 분리하여 슬라이드에 올려놓고 건조시켰다. PAS 염색과 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색하여 세포벽과 핵의 변화를 확인하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 각 군의 무세포성 모세혈관의 개수를 분석하였을 때, 당뇨군(DM)은 약 5배 정도 무세포성 모세혈관이 증가한 반면, 메트포민 투여군(MET)이나 메트포민과 페노파이브레이트 병용 투여군(MET+FENO)은 무세포성 모세혈관의 증가를 막지못했으나, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 유의성 있게 무세포성 모세혈관 형성을 억제하는 것을 확인하였다(도 8).
<6-4>
세포간
치밀이음부
단백질(
Tight
-
junction
protein
) 손상 억제 효능 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피(1:8) 추출물(CMO4) 및 계지 및 작약(1:8) 추출물(CPA4)을 투여한 후 세포간 치밀이음부 단백질의 손상 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <6-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후, 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 ㎛ 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다아제(peroxidase) 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반응시킨 후 0.05% 트윈(tween) 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 반응을 제거하기 위하여 5% 카세인(casein)을 이용하여 blocking한 후, 1차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 또는 하룻밤동안 처리하였다. 1시간 PBS로 세척한 후 labeled streptoavidin biotin(LSAB) 키트(Dako, USA)를 적용한 후 DAB로 발색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 형광염색의 경우 FITC-conjugated된 2차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 반응시킨 후, DAPI로 염색한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 9a 내지 9b에 나타낸 바와 같이, 당뇨군(DM), 메트포민 투여군(MET)이나 메트포민과 페노파이브레이트 병용 투여군(MET+FENO)의 경우 혈관의 여러 곳에서 클라우딘(claudin)-5의 실타래 같은 연결선이 끊어진 것을 확인하였으나, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 클라우딘-5의 소실된 곳이 없음을 확인하였고(도 9a), 당뇨군(DM)은 오클루딘 단백질이 유의성있게 감소하였고, 메트포민 투여군(MET)이나 메트포민과 페노파이브레이트 병용 투여군(MET+FENO)은 유의성 있는 증가가 없었으나, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 오클루딘이 유의성있게 증가하는 것을 확인하였다(도 9b).
<6-5> 신기능 및 단백뇨에 대한 효과 확인
고혈당에 의한 신기능 저하 예방 및 치료 효능을 확인하기 위해 24시간 뇨 배출량, 단백뇨, 알부민뇨, 크레아틴 청소율, 뇨 중 네프린(nephrin) 양, 뇨 중 8-OHd 양, 뇨 중 AGE 양 등을 확인하였다.
그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, 모든 군에서 뇨 중 네프린 양, 8-OHd 양, AGE 양이 유의성 있는 효능을 보였지만, 메트포민 단독 투여군은 뇨 량, 알부민뇨의 양 및 크레아틴 청소율을 억제하지 못하였고, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 알부민뇨 및 크레아틴 청소율을 유의적으로 억제하였으나, 메트포민과 페니파이브레이트 병용 투여군(MET+FENO)은 크레아틴 청소율 효능이 없는 것을 확인하였다(도 10).
상기 결과로 메트포민 단독 투여만으로는 당뇨성 신증으로 진전되는 것을 억제하지 못하고, 메트포민과 본 발명의 계지 및 목단피 추출물 또는 계지 및 작약 추출물의 병용 투여가 당뇨성 신증으로 진전되는 것을 유의성 있게 치료한다는 것을 확인하였다.
<6-6> 사구체 경화증의 변화 확인
당뇨병성 신증에서 나타나는 형태학적 변화인 사구체 경화증을 PAS 염색과 Trichrome 염색으로 메산지움(mesangial) 및 세포외 기질 확장을 확인하였다.
그 결과 도 11에 나타낸 바와 같이, 당뇨군의 사구체에서는 세포외 기질 물질이 생성, 축적되어 메산지움 영역이 확장, 팽대되는 사구체 경화증 소견이 관찰되었고, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물 투여군인 CMO4-100, CMO4-250 및 계지 및 작약(1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여가 이를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 11).
<
실험예
7> 설치류 동물모델에서
황반변성
치료 효과 확인
<7-1>
MNU
유도(
MNU
-
induced
age
-
related
macular
degeneration
) 동물모델에서
황반변성
예방 및 치료 효과 확인
<7-1-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
6주령 수컷 C57BL/6 마우스를 1주일 동안 순화 후 사용하였다. 황반변성에서 나타나는 망막조직의 형태학적인 변화 중 광수용체 세포(photoreceptor cell)의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 1%(0.05% 아세트산(acetic acid)) N-methyl-N-nitrosourea(MNU, Sigma, 미국)을 7주령 수컷 C57BL/6 마우스에 복강 주사하였다(60 mg/kg). 정상군에는 동량의 0.05% 아세트산을 복강투여하였고, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4, CMO4-1 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4-1을 0.5% 카복시메틸셀룰로스나트륨(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)에 현탁 조제하여, 50 mg/kg 및 100 mg/kg 또는 100 mg/kg 단독 농도로 MNU 투여 하루 전에 1회 경구 투여하고, MNU 투여 후 7일 동안 매일 1회 경구 투여하였다. 정상군 및 MNU 유도군에는 0.5% CMC만 동량으로 경구 투여하였다.
<7-1-2> 조직병리학적 평가
황반변성에서 나타나는 망막조직의 형태학적인 변화 중 광수용체 세포(photoreceptor cell)의 손상 및 변성 여부는 망막 조직의 외과립층(outer nuclear layer)의 두께 변화로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-1-1>에서 제조한 마우스를 가지고, 상기 실험예 <6-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후, 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 ㎛ 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다아제 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반응시킨 후 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 슬라이드 절편은 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin, H&E) 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이, 망막에서 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어있는 외과립층(*)의 두께가 MNU 투여에 의한 손상으로 세포수가 감소하여 얇아진 것을 확인하였으나, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4, CMO4-1 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 MNU에 의한 광수용체 세포의 손상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 12).
<7-2>
NaIO
3
유도 동물모델에서 망막색소상피세포(
retinal
pigmented
epithelial
cell
)의 손상 예방 효과 확인
<7-2-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
6주령 수컷 SD 렛트를 1주일 동안 순화 후 사용하였다. 황반변성에서 나타나는 변화 중 하나로 망막색소상피세포의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 3.5% NaOI3(Sigma, 미국)을 7주령 렛트의 혀 밑에 정맥주사하였다(35 mg/kg). 정상군은 동량의 생리식염수만 투여하였고, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물인 CMO4-1 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물인 CPA4-1을 0.5% 카복시메틸셀룰로스나트륨(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)에 현탁 조제하여, 50 mg/kg 및 100 mg/kg의 농도로 NaOI3 투여 하루 전에 1회 경구 투여하고, NaOI3 투여 후 7일 동안 매일 1회 경구 투여하였다. 정상군 및 대조군에는 0.5% CMC만 동량으로 경구 투여하였다.
<7-2-2> 조직병리학적 평가
황반변성에서 나타나는 변화 중 하나인 망막색소상피세포의 손상 및 변성 여부는 망막 조직의 외과립층(outer nuclear layer)의 folding 개수로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-2-1>에서 제조한 마우스를 가지고, 상기 실험예 <6-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후, 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 ㎛ 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다아제 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반응시킨 후 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 슬라이드 절편은 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin, H&E) 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이, NaOI3 투여로 인하여 착색된 상피 세포(pigmented epithelial cell)가 손상을 받아 바로 위에 위치하는 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층이 휘어지는 현상이 육안으로 관찰되었으나, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 열수 추출물인 CMO4-1 및 계지 및 작약(1:8) 열수 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 NaOI3에 의해 유도된 착색된 상피 세포의 손상을 억제하여 외과립층이 휘어지는 현상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 13).
<7-3>
VLDLR
(
Very
-
low
-
density
lipoprotein
receptor
)
낙아웃
(
knockout
) 마우스에서의
황반변성
예방 효과 확인
<7-3-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
습성 황반변성의 임상증상인 망막 신생혈관 생성(subretinal neovascularization)을 3주령부터 보이는 모델동물인 Vldlr -/- 마우스를 암수 쌍을 Jacson labratory로부터 구입하여 번식(breeding)을 통하여 어린 2주령 마우스를 얻은 후 실험에 사용하였다. 정상동물로는 동일주령의 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4는 0.5% CMC에 현탁 조제하였으며, 100 mg/kg의 농도로 7일 동안 매일 1회 복강 투여하였다. 정상군 및 대조군에서는 0.5% CMC만 동량 경구투여하였다.
<7-3-2> 망막 신생혈관 생성의 억제 확인
망막 혈관의 부종을 측정하여 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-3-1>의 동물 모델을 이용하여, 부검 시 Zoletil 50(Virbac 30 mg/kg)과 Rompun(바이엘코리아, 10 mg/kg)을 3:2로 혼합해 10배 희석(saline) 후 50 ㎕ 복강 주사하여 마취하였다. 개복 후 심장에 5 mg의 fluorescein isothiocyanate-dextran(FD40S-1G, sigma)을 PBS에 녹여 100 ㎕를 주사한 후 5분 후 안구를 적출하여 한쪽은 망막조직 절편 제작을 위해 10% 중성화 포르말린에 고정하였고, 다른 한쪽은 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 10분간 고정 후 망막(retina) 분리 후 flat-mounted 망막 슬라이드를 제작하여 형광형미경(BX51, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다.
그 결과 도 14에 나타낸 바와 같이, Vldlr -/- 마우스에서는 외과립층 아래인 망막하(subretinal) 부위에서 신생혈관이 생성되어 망막 조직이 위로 휘어지는 현상이 관찰되었으나, 이러한 신생혈관 생성은 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 14).
<7-3-3>
망막색소상피세포
손상 억제 확인
망막색소상피세포의 형태학적 구조의 변성 유무를 확인하기 위하여, ZO-1 염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-3-1>의 동물 모델을 이용하여, 부검 시 적출한 안구조직에서 망막을 분리한 후 결막 조직을 4% 파라포름알데히드에 3시간 고정 후 PBS로 세척하여 5% Triton X-100과 1% BSA를 포함한 PBS에 3시간 동안 교반하였다. 다시 세척 후 PBS에 1 mg/ml로 녹인 렉틴(L2140, sigma)을 1:50으로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS로 2시간 동안 세척한 후 streptavidin TRITC를 1:500으로 희석하여 37℃에서 4시간 반응시킨 후 PBS로 30분 세척하여 형광형미경(BX51, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과 도 15에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 망막색소상피세포는 ZO-1로 염색되어 가지런히 정렬된 형태가 관찰되는 반면, Vldlr -/- 마우스에서는 세포에 손상이 일어나고 신생혈관이 자라나와 변성된 부위(화살표)가 다수 관찰되었으나, 망막색소상피세포의 변성은 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 투여에 의해 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 15).
<7-3-4> 망막에서의
VEGF
발현 억제 효과 확인
망막에서의 VEGF 발현 억제 효과를 염색으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-3-1>의 동물 모델을 이용하여, 상기 실험예 <7-2-2>와 동일한 방법으로 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 H&E 염색하여 광학현미경 하에서 망막하 부위의 신생혈관 생성 병변을 정량적으로 분석하였다.
그 결과 도 16에 나타낸 바와 같이, 신생혈관 및 혈관의 투과성에 관여하는 중요한 인자인 VEGF가 Vldlr -/- 마우스에서는 심하게 발현(짙은 보라색으로 염색되었음)된 반면, 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4의 투여로 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 16).
<7-4> VLDLR ( Very - low - density lipoprotein receptor ) 낙아웃 ( knockout ) 마우스에서의 황반변성 치료 효과 확인
<7-4-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
습성 황반변성의 임상증상인 망막 신생혈관 생성(subretinal neovascularization)을 3주령부터 보이는 모델동물인 Vldlr -/- 마우스를 암수 쌍을 Jacson labratory로부터 구입하여 번식(breeding)을 통하여 어린 2주령 마우스를 얻은 후 실험에 사용하였다. 정상동물로는 동일주령의 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4는 0.5% CMC에 현탁 조제하였으며, 3주령부터 각각 50, 100 mg/kg의 농도로 7일 동안 매일 1회 복강 투여하였다. 정상군 및 대조군에서는 0.5% CMC만 동량 경구투여하였다.
<7-4-2> 망막 신생혈관 생성의 억제 확인
망막 조직 절편을 이용하여 황반변성에서 나타나는 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-4-1>의 동물 모델을 이용하여, 상기 실험예 <7-3-2>와 동일한 방법을 이용하여 형광형미경(BX51, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다.
그 결과 도 17에 나타낸 바와 같이, Vldlr -/- 마우스에서는 외과립층 아래인 망막하 부위에서 신생혈관이 생성되어 망막 조직이 위로 휘어지는 현상이 관찰되었으나, 이러한 신생혈관 생성은 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 100 mg/kg 투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 17).
<7-5> 레이저 유도 맥락막 신생혈관 생성
렛트
모델에서의 신생혈관 생성 억제 효과 확인
<7-5-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
7주령 수컷 Long-Evans 렛트(SLC Japan, Tokyo, Japan)을 Zoletil 50(Virbac 30 mg/kg)과 Rompun(바이엘코리아, 10 mg/kg)를 복강 주사하여 마취하였다. 이후 1% tropicamide eye drop으로 동공을 확장시킨 후, 다이오드 레이저(diode laser)(파장: 532 nm, 지름: 100 μm, 파워: 150 mW, 기간: 0.1 sec)를 이용하여 시각신경원반(optic nerve head) 주위로 4군데 광응고 spot을 만들었다. Bruch’s membrane의 파괴는 특징적인 버블(bubble)의 형성으로 검증하였다. 마취에서 깨어난 렛트들은 무작위로 군분리하여 약물을 투여하였다. 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 및 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4는 0.5% CMC에 현탁 조제하였으며, 각각의 추출물을 100 mg/kg의 농도로 10일 동안 매일 1회 경구투여 하였다. 대조군에서는 0.5% CMC만 동량 경구투여하였다.
<7-5-2> 망막 신생혈관 생성의 억제 확인
망막 조직 절편을 이용하여 황반변성에서 나타나는 망막하 부위의 신생혈관 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-5-1>의 동물 모델을 이용하여, 10일 후 부검 시 Zoletil 50(Virbac 30 mg/kg)과 Rompun(바이엘코리아, 10 mg/kg)를 3:2로 혼합액을 복강 주사하여 마취하였다. 개복 후 심장에 5 mg의 fluorescein isothiocyanate-dextran(MW 2 x 106, sigma)을 PBS에 녹여 100 ㎕를 주사한 후 10분 후 안구를 적출하여 4% 파라포름알데히드에 10분간 고정 후 망막을 떼어낸 후 망막하 부위가 포함된 결막조직을 flat-mounted 슬라이드를 제작하여 형광형미경(BX51, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다. 신생혈관 생성 부위의 크기는 Image J software(NIH, USA)를 이용하여 분석하였다.
그 결과 도 18에 나타낸 바와 같이, 신생혈관 생성이 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4(100 ㎎/㎏) 투여에 의해 유의적으로 억제되었고, 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4(100 ㎎/㎏) 투여에 의해 억제되는 경향을 보이는 것을 확인하였다(도 18).
<
실험예
8>
MNU
유도
황반변성
설치류 동물모델에서
황반변성
예방 및 치료
효과 확인
상기 표 1의 분석결과와 같이 본 발명의 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4, CMO4-1, 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4, CPA4-1 중의 패오니플로린의 함량은 각각 2.7%, 2.3%, 12.3%, 8.9%임을 확인하였다. 패오니플로린이 사람 망막색소상피 세포주(ARPE-19)에서 H2O2로 인한 세포사멸과 산화성 스트레스 억제효능이 있으므로 황반변성과 같은 안과 질환에 유효할 것이라고 보고하였다(Molecular Vision 2011; 17: 3512-3522). 그러나 동물모델에서 황반변성의 예방 및 치료효능이 있는지 증명하지 않고, 단지 망막색소상피 세포주에서 일반적인 황반변성의 원인이 노화조건이 아니라, 독성물질인 H2O2를 가한 후 항산화 효능과 세포사멸 억제만 확인하였을 뿐. 황반변성에 정말로 효능이 있는지 확인하기 위한 동물모델에서 증명하지 못했다. 이에 본 발명의 추출물 중에 패오니플로린이 함유되었으나, 추출물들이 단지 패오니플로린의 단독 효능이 아님을 증명하기 위하여, 각 추출물 100 mg에 함유된 함량의 패오니플로린과 각각의 추출물(100 mg)들의 효능을 동물모델에서 확인하였다.
<8-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
6주령 수컷 C57BL/6 마우스를 1주일 동안 순화 후 사용하였다. 황반변성에서 나타나는 망막조직의 형태학적인 변화 중 광수용체 세포의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 1%(0.05% 아세트산) N-methyl-N-nitrosourea(MNU, Sigma, 미국)을 7주령 수컷 C57BL/6 마우스의 60 mg/kg의 농도로 복강주사하였다. 정상군에는 동량의 0.05% 아세트산을 복강투여하였다. 시료로 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4(100 mg/kg), 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4(100 mg/kg), 패오니플로린-2.7(2.7 mg/kg), 패오니플로린-12.3(12.3 mg/kg)들을 0.5% CMC에 현탁조제하여, MNU 투여 하루 전에 1회 경구투여하고, MNU 투여 후 7일 동안 매일 1회 각각 경구투여 하였다. 정상군 및 MNU 유도군에는 0.5% CMC를 동량 경구투여하였다.
<8-2> 망막신경조직의
외과립층
두께 변화 확인
망막신경조직의 광수용체 세포의 손상에 의한 외과립층 두께의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <8-1>과 동일한 방법으로 샘플을 처리한 실험군들을 투여 종료 후 부검하여 안구 적출한 후, 10% 중성화 포르말린에 하루 동안 고정한 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 H&E 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4 투여군은 MNU 투여군보다 50%나 높은 효능이 증명되었지만(1.23±0.20AU→1.61±0.32AU), CMO4 100 mg 속에 들어있는 패오니플로린 함량 투여군(PF-2.7)은 MNU 투여군과 비교할 때 전혀 효능이 없는 것을 확인하였다(1.23±0.20AU→1.23±0.21AU)(표 4).
또한, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 망막에서 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층 손상 정도가 MNU 투여군은 거의 50% 이상 악화되었으나(1.99±0.21AU→0.92±0.17AU), 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4 투여군은 MNU 투여군과 비교 시 21.4% 효능이 개선되었으며(0.92±0.17AU→1.14±0.21AU), CPA4 100 mg 속에 들어있는 패오니플로린 함량 투여군(PF-12.4)은 17.5% 개선되는 것을 확인하였고(0.92±0.17AU→1.11±0.19AU), CPA4 투여군이 패오니플로린 12.4㎎/㎏ 투여군(PF-12.4) 보다 4% 효능을 개선시키는 것을 확인하였다(표 5).
| 실험군 | 외과립층 두께(AU) | 외과립층 두께(%) |
| NOR | 1.99±0.21 | 100.00±27.72 |
| MNU | 1.23±0.20* | 0.00±25.55 |
| CMO4 | 1.61±0.32# | 50.31±42.41 |
| PF-2.7 | 1.23±0.21 | 0.76±27.23 |
(*p<0.05 vs NOR; #p<0.05 vs MNU)
| 실험군 | 외과립층 두께(AU) | 외과립층 두께(%) |
| NOR | 1.99±0.21 | 100.00±10.92 |
| MNU | 0.92±0.17* | 0.57±15.64 |
| CPA4 | 1.14±0.25# | 21.38±23.30 |
| PF-12.4 | 1.11±0.19# | 17.46±17.39 |
(*p<0.05 vs NOR; #p<0.05 vs MNU)
상기 결과는 패오니플로린의 함량이 매우 적은 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4(2.7%)의 효능이 매우 우수하다는 것은 계지 및 목단피 추출물의 효능이 단지 패오니플로린으로 인한 것이 아니라, 계지 및 목단피 추출물에 존재하는 수많은 성분들의 시너지 효과임을 검증하였고, 계지 및 작약 추출물의 경우도 계지 및 목단피 추출물의 결과를 토대로 패오니플로린으로 인한 것이 아니라, 계지 및 작약 추출물에 존재하는 수많은 성분들의 시너지 효과임을 확인하였다.
또한, 계지 및 작약 추출물인 CPA4 또는 CPA4-1보다 패오니플로린의 함량이 더 낮은 계지 및 목단피 추출물인 CMO4 또는 CMO4-1의 효능이 더 우수함이 이미 앞의 실험예에서도 확인되었다(도 13 내지 도 18). 이는 본 발명의 혼합 추출물의 효능이 단지 패오니플로린으로 인함이 아니라, 혼합 추출물에 존재하는 수많은 구성 성분들의 시너지 효과임을 증명하는 것이다.
<
실험예
9>
하지부종
억제 및 치료 효과 확인
<9-1> 실험동물 사육 및 실험 디자인
6주령 수컷 SD 렛트를 (주)오리엔트(성남, 대한민국)에서 구입하여 1주일 동안 순화 후 사용하였다. 1주일 순화 후 각각의 동물들을 하기와 같이 무작위로 그룹핑 하였다:
Normal: 정상대조군, Edema: 하지부종유발군, CMO4-1-50: 하지부종유발군 + CMO4-1(50 mg/㎏/day) 투여군, CMO4-1-100: 하지부종유발군 + CMO4-1(100 mg/㎏/day) 투여군, CPA4-1-50: 하지부종유발군 + CPA4-1(50 mg/㎏/day) 투여군, CPA4-1-100: 하지부종유발군 + CPA4-1(100 mg/㎏/day) 투여군.
각 군별로 하지부종 유발 3일 전부터 매일 오전에 1회씩 경구투여 하였으며, 4일간 전처리 후 오후에 하지부종을 유발하였다. 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4-1, 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4-1은 0.5% CMC에 현탁하여 조제하였으며, 정상군과 하지부종 유발군에는 0.5 CMC만을 동량 경구투여하였다. 하지부종의 유발은 2.5% 포르말린이 포함된 생리식염수(fomalin in saline)을 우측뒷다리 발바닥에 0.1 ㎖ 투여하여 유발하였고, 정상군에는 생리식염수만을 동량 주사하였다.
<9-2>
하지부종
상태 변화 확인
하지부종 유발 전 및 후의 부종 상태를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <10-1>의 실험군을 가지고, 포르말린 투여 직전 및 투여 1시간 후에 부종에 의한 발 크기(paw volume) 증가는 부종측정기(phethysmometer, Ugo Basile, Milan, Italy)를 이용하여 측정하였다. 부종의 수치(edema index)는 하기 수학식 3으로 계산하였다.
그 결과 도 19에 나타낸 바와 같이, 각 군별 부종 유발전과 1시간 후에 부종 상태를 확인한 결과, 정상군에서는 멸균 생리식염수를 주사하여 약간의 하지 크기의 증가가 있었지만, 경미한 정도였고, 포르말린을 투여한 하지부종 유발군의 경우 크기가 약 20% 유의적으로 증가하였으나, 이러한 하지 부종에 의한 크기의 변화는 계지 및 목단피(1:8) 추출물인 CMO4-1에 의해서는 크게 억제되지 않았고, 계지 및 작약(1:8) 추출물인 CPA4-1에 의해서는 농도 의존적이며 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 19).
상기 결과를 토대로, 계지 및 작약 혼합 추출물이 하지정맥의 예방 및 치료효능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명은 당뇨합병증 및 혈관부종의 예방 및 치료에 효과적인 천연 혼합 추출물 조성물로 약학적으로 이용 가능할 뿐 아니라 건강기능식품으로서도 유용하게 이용될 수 있다.
Claims (8)
- 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 망막증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 계지 및 목단피는 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합하는 것인, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 메탄올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것인, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출 또는 증기 추출방법으로 추출한 것인, 약학적 조성물.
- 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 망막증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제5항에 있어서, 계지 및 목단피는 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합하는 것인, 건강기능식품.
- 제5항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 메탄올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것인, 건강기능식품.
- 제5항에 있어서, 상기 추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출 또는 증기 추출방법으로 추출한 것인, 건강기능식품.
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