WO2015178703A1 - 천연 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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김정현
김찬식
손은진
이윤미
최소진
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정동호
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정승현
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Definitions

  • composition for preventing or treating diabetic complications and angioedema containing natural mixed extract as an active ingredient
  • the present invention is a diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetic neuron, which contains as an active ingredient the sinamomi Twig and Mutan Root Bark, Peony Root, or a combination extract of Poin and Poria
  • the present invention relates to a composition for the prevention and treatment of diabetic compl icat ions, including macular degeneration, and macular (retinal) edema, macular degeneration and varicose vein (angi oedema).
  • diabetes Many of the current mechanisms for treating diabetes (metformin, rosiglitazone, gemiglo, zanubia, etc.) are diabetic complications that occur due to chronic progression due to inability to cure diabetes even though it controls blood glucose in the early stages of diabetes (diabetic eye disease, nephropathy) And neuropathy, foot ulcers, etc.) is not fundamentally prevented or treated. Diabetes complications begin with diabetes, but the mechanism of transition to diabetes complications is different from diabetes. Therefore, it is necessary to delay, prevent or treat diabetic complications by using drugs that can delay or prevent diabetic complications while controlling the glycemic agent quickly. Chronic diabetic nephropathy requires hemodialysis and organ transplantation. Diabetic cataracts and retinopathy lead to blindness.
  • Diabetic foot ulcers develop a serious situation in which the limbs must be amputated, and diabetic neuropathy is accompanied by a stabbing pain.
  • Diabetic heart disease causes sudden death. Therefore, delaying the onset of complications in diabetic patients for a few years will change the quality of life of patients and their families, and greatly aids national finances.
  • Representative factors for diabetic diabetes mellitus were reported to be the formation of final glycation end products, activation of aldose reductase, activation of PKC isomer, increase of nucleosamine pathway flux, etc. OVaii / re, 414, 813 -820, Diabetologia, 38: 357-3941, 1995). The irreversible reaction of these factors accelerates oxidative stress, making diabetic complications worse.
  • Non-enzymatic sugar protein Chiemistry banung (r nenzymat ic glycat ion of protein) is advanced glycation end products by a condensation banung (ms ad banung) the group of amino acids and reducing sugar, such as lysine residues in the protein enzyme-free operation (advanced glycat ion endproducts , AGEs). That is, they form a Schiff base, an early stage product, and a ketoamine adduct adjacent to the Schiff base Condensation with each other results in the production of reversible Amador i-type early glycosylated products.
  • the reversible Amadori-type early glycated products are not degraded and rearranged to yield an irreversible final glycated product. Is generated.
  • the final glycation products produced in this way.
  • proteins or lipids By combining or cross-linking with proteins or lipids, products such as irreversible glycosylated proteins or glycosylated lipids are produced.
  • the final glycosylated product (crosslinked) with proteins or lipids such as the basement membrane, plasma albumin, lens protein, fibrin, collagen, and the like, accumulate in the tissue during the survival of the protein or lipid, and abnormally change the structure and function of the tissue. causess complications.
  • Diabetic retinopathy is associated with blood vessels and nerve cells in the retina in chronic hyperglycemia.
  • I luvien f luocinolone acetonide intravi treal implant, Al imera Sc ience
  • I luvien f luocinolone acetonide intravi treal implant, Al imera Sc ience
  • Diabetic nephropathy is chronic in glycated albumin, which is a combination of final glycated product and protein
  • the diabetic acid acts as an important factor. Glycosylated albumin is more easily introduced into renal globular cells than normal albumin, and chronic high concentrations of glucose stimulate mesangium cells to increase extracellular matr ix synthesis. Due to excessively infused glycated albumin and increased extracellular matrix
  • Angioedema is a disease in which the permeability of blood vessels deep in the skin, under the skin, or under the mucous membrane increases, causing fluid to escape from the blood vessels and build up in surrounding tissue (ie, edema). It occurs in the area around the eyes, around the lips and hands, and also occurs in the mucous membranes of the tongue, mouth, larynx, and gastrointestinal wall. Macular edema or macular degeneration, especially due to damage of the retinal blood barrier, Or varicose veins.
  • Macular degeneration (Age-related macul ar degenerat ion) is one of the irreversible diseases that occurs in many seniors and is a representative ophthalmic disease leading to blindness. The incidence rate is increasing due to the aging of the world population. In the United States Macular degeneration is the leading cause of blindness, environmental and genetic factors also affect the onset, and smoking has been reported to be the most lethal cause. In addition, obesity, excessive antioxidants, and dietary fat intake also contribute to macular degeneration and further development. Therefore, healthy eating, weight control, proper exercise, and quitting smoking alleviate macular degeneration.
  • Macular degeneration is classified into dry macular degeneration and wet macular degeneration. Dry macular degeneration develops macular degeneration due to the accumulation of waste drusen in the macula, which damages the metabolic connection between the choroid and the upper part of the macular. If this continues, it develops into wet macular degeneration. In other words, waste products accumulate in the macular area, and blood vessels do not function properly, so nutrients and oxygen are not supplied, and new abnormal blood vessels begin to form (choroidal neovascu l ar i zat i on: CNV).
  • Retinal pigment epithelial cells play an important role in maintaining non-proliferative status and supporting Bruch's membrane (BrM) to maintain healthy vision.
  • Cystatin C secreted from retinal pigment epithelial cells, is a powerful cysteine proteinase (inhibitor) that plays an important role in regulating the normal circulation of proteins in BrM.
  • cysteine proteinase inhibitor
  • excessive accumulation of final glycation end products decreases the expression and secretion of cystatin C protein, leading to an imbalance in proteolytic activity at the base of RPE, resulting in macular degeneration. Therefore, it has been reported that macular degeneration can also be prevented (inhibited) when inhibiting the production of the final glycated product (KayP, et al., IOVS, 2014, 55 (2), 926-34).
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • BrM Bruch's membrane
  • VEGF secretion is very tightly controlled to prevent neovascularization.
  • VEGF secretion is not tightly controlled, it is a decisive factor leading to the late stage of macular degeneration. Abnormally increased VEGF secretion produces abnormal and weak blood vessels that destroy them (J. Cell. Mol. Med., 17, 7 833-843, 2013).
  • Varicose veins are diseases in which the veins are visible outside the skin, and the veins distributed in the limbs are large deep veins that lie between the muscles and superficial veins that look directly beneath the skin. It is classified as a perforating vein that connects veins, and the varicose veins of the lower extremities mean that the superficial veins extend and protrude out of the skin, and the valves that keep blood flow constant inside the vein at all times toward the heart. If the pressure in the lower extremity veins increases, the vein wall It is caused by the weakening of the valves, the backflow of blood to the heart, and the expansion of the veins.
  • Cinnamomi Twig is a young branch of cassia (or cinnamon), an evergreen arboreal plant of the berry family. It is spicy, sweet, warm, and works on the heart, lungs, and bladder. It is known to make the stomach soothe, suppress paralysis, have analgesic, strong feelings, expand the blood vessels, stimulate the gland, cause sweating, antipyretic effect, and suppress the virus, chills, fever, headache, body pain , Should not sweat or palpitations. Long columnar with many branches, 30-70 cm long, 0.3-1 cm thick. The surface is reddish brown or brown with vertical ridges, fine wrinkles and small shark-shaped leaves and branches. The quality is solid, brittle and easy to cut. Guangxi and Guangdong are the main production areas.
  • Moutan Root Bark is an important herbal medicine that has been used for a long time and is used as an anti-inflammatory oral anticoagulant in Chinese medicine. Its effect is used for inflammation of the lower abdominal organs, pain caused by congestion, fever, purulent and bleeding.
  • Peony Root is a perennial plant of the Buttercup family, the Earl Peony (Radix Paeon i ae Alba) and the Red Peony (Radi x Paeon i a Rubra). Earl and peony are determined by the presence or absence of shells, and the crusted and peeled crusts are called c4 / e /. Med. Rev.
  • earl pill inhibits contractile effects on gastric and intestinal smooth muscles and uterine smooth muscles. Prevent atherosclerosis, lower blood pressure and improve blood flow, antioxidant effects against dilated and vascular disease (Ohsugi M et al., J. Ethnopharmacol., 67, pplll— 119, 1999), inhibitory effect of platelet aggregation (Lin HC et al. , Planta Med, 65, pp595-599, 1999), antithrombotic effect (Ishida H et al., Chew. Pharm.
  • part-glycoside (glycoside) in the composition of Paeonia have been reported to be effective in the treatment of cerebral infarction (Yang J et al., Zhong Yao Cai, 23 (2), PP 95-97, 2000) '.
  • Poria is a fungal nucleus that grows from the roots of pine and has an empty or oval shape of 5 to 7 cm in diameter, and the bark on the ground is brown or dirty black with bark. The reddish spirit is corkized, hard, covered with a thickness of 0.2 to 0.5 mm, and radially cracked.
  • Red ox has almost no taste and smell, but sometimes spreads with mild mucus, and has a positive reaction to iodine.
  • Red Bok-Ryong is used as a stabilizer, and is said to not only have the effect of stabilizing heat, but also warms the body.
  • the present inventors endeavored to develop safe and effective natural medicine without toxicity and side effects for the prevention and treatment of diabetic complications and angioedema, resulting in chronic diabetes mellitus of the ginseng and the bark skin, ginseng and peony, or the ginseng and red ginseng mixed extract Inhibits excessive end glycation end product production, exhibits cross-linking crushing effect between end glycation product and matrix protein, and has excellent inhibitory effect on end glycation end product production in human retinal pigment epithelial cell line in hyperglycemic or aging environment.
  • the present invention and objectives are diabetic complications and angioedema (Cinnamomi Twig and Muton Root Bark), Peony Root, or a combination of Gye and Poria as an active ingredient. angioedema) to provide a composition for prevention and treatment.
  • angioedema Cinnamomi Twig and Muton Root Bark
  • Peony Root or a combination of Gye and Poria as an active ingredient. angioedema
  • the present invention is diabetic diabetic containing the extract (Cinnamomi Twig) and Moutan Root Bark, Peony and Peony (Peony Root), or a mixed extract of Pokja and Poria (Poria) as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of complications and angioedema.
  • the present invention provides a dietary supplement for preventing and improving diabetic complications and angioedema containing the mixed extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating diabetic complications and angioedema, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the combined extract to an individual suffering from diabetic complications and angioedema.
  • the present invention also provides a method for improving diabetic complications and angioedema, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the combined extract to an individual suffering from diabetic complications and angioedema.
  • the present invention provides a use of the combination extract for use as a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications and angioedema.
  • the present invention provides a use of the combination extract for use as a dietary supplement for preventing and improving diabetic complications and angioedema.
  • Cinnamomi Twig and Mutan Root Bark, Peony and Peony Root, or Cinnabar and Poria combined extracts of the present invention inhibit the production of excessive final glycation products that occur in chronic diabetes and It shows the cross-linking crushing effect between glycated products and matrix protein, and shows excellent efficacy in suppressing the end glycated product formation in human retinal pigment epithelial cell line in hyperglycemic or aging environment, animal models of diabetic complications, macular degeneration animal models and lower limb edema. Diabetes complications including diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, etc. angioedema, including diabetic complications and macular (retinal) edema, macular degeneration and varicose veins It can be usefully used as an active ingredient of the composition for the prevention and treatment of edema).
  • FIG. Lc is CPA4 (gave and peony (1: 8) extract)
  • FIG. Id is a diagram showing the components analyzed by HPLC analysis of CPA4-K-based and Peony (1: 8) hydrothermal extract).
  • Figure 2 is a diagram confirming the inhibitory effect of the end glycated product production in the extracellular matrix (ECM) treated with glycoaldehyde (glycoaldehyde):
  • CM04-1 basal and bark (1: 8) hydrothermal extract
  • CPA4 cold and peony (1: 8) extract
  • CPA4-1 cold and peony (1: 8) hydrothermal extract
  • FIG. 3 shows' Cage and Short Skin (1: 2) Extracts (CM02), Cage and Short Skin (1: 8) Extracts (CM04), Cage and Short Skin (1: 8) Hydrothermal Extracts in Human Retinal Pigment Epithelial Cell Lines in a Hyperglycemic Environment CM04-1), cocked and peony (2: 1) hydrothermal extract (CPA1-1), cocked and peony (1: 2) hydrothermal extract (CPA2-1), cocked and peony (1: 8) extract (CPA4), And confirming the inhibitory effect of the production of the final glycosylated product of Gyeji and Peony (1: 8) hydrothermal extract (CPA4-1):
  • HG hyperglycemic treatment group
  • BSA bovine serum albumin treated group
  • CM02 Basal and Bark Bark (1: 2) extract (CM02);
  • CM04 bastard and bark (1: 8) extract (CM04);
  • CM04-1 basal and bark skin (1: 8) hydrothermal extract (CM04-1);
  • CPA1-1 cold and peony (2: 1) hydrothermal extract (CPA1-1);
  • CPA2-1 cold and peony (1: 2) hydrothermal extract (CPA2-1);
  • CPA4 cold and peony (1: 8) extract (CPA4)
  • CPA4-1 cold and peony (1: 8) hydrothermal extract (CPA4-1);
  • FIG. 4 is a diabetic group of 12-week-old diabetic rats with dbedb (1: 8) hydrothermal extract (CM04-1) and basal and peony (1: 8) hydrothermal extract (CPA4-1). Efficacy in preventing retinopathy.
  • NOR normal fauna (nondi abet ic heterozygote db / + mice);
  • DM diabetic fauna (C57BL / KsJ-Lepr rfM diabetic mice);
  • FENO-100 fenofibrate 100 mg / kg / day administration group
  • CM04-1-100 CM04-1 100 mg / kg / day administration group
  • CM04- 1-250 CM04-1 250 mg / kg / day dose group;
  • CPA4- 1-100 CPA4-1 100 mg / kg / day dose group;
  • CPA4- 1-250 CPA4-1 250 mg / kg / day dose group.
  • FIG. 5 is administered 12-week hydrogel extract (CM04-1) and hydrogel extract (CM04-1) and hydrogel extract (1: 8) hydrothermal extract (CPA4-1) in type 2 diabetes model db / db mice.
  • This study confirmed the efficacy of preventing acellular capillary formation among post-diabetic retinopathy prevention effects:
  • N0R normal fauna (nondi abet ic heterozygote db / + mice);
  • DM Diabetic Fauna diabetic mice
  • FENO-100 fenofibrate 100 mg / kg / day dose group
  • CM04-1-100 CM04-1 100 mg / kg / day dose group
  • CM04- 1-250 CM04-1 250 mg / kg / day dose group;
  • CPA4- 1-100 CPA4-1 100 mg / kg / day dose group
  • CPA4- 1-250 CPA4-1 250 mg / kg / day dose group.
  • FIG. 6 shows administration of freshwater extract (CM04-1) and freshwater extract (CM04-1) and freshwater extract (C: 4) for 12 weeks in db / db mice of type 2 diabetes.
  • This figure shows the prevention of occludin damage, which is a tight-junction protein between diabetic retinopathy.
  • NOR normal fauna (nondi abet ic heterozygote db / + mice);
  • DM diabetic fauna (CS BL / KsJ-Lepr ⁇ diabetic mice);
  • FENO-100 fenofibrate 100 mg / kg / day dose group
  • CM04-1-100 CM04-1 100 mg / kg / day dose group
  • CM04- 1-250 CM04-1 250 mg / kg / day dose group;
  • CPA4- 1-100 CPA4-1 100 mg / kg / day dose group;
  • FIG. 7 is a 12-week administration of metformin (metformin) to db / db mice, a type 2 diabetes model animal, after controlling blood sugar, and for 12 weeks, extracts (CM04) and basal and peony extracts (CM04) (1: 8) A combination of metformin (1: 8) and metformin was used to confirm the effects of treating retinal barrier damage on diabetic retinopathy.
  • metformin metformin
  • N0R normal fauna (nondi abet ic heterozygote db / + mice);
  • DM diabetic fauna (CS BL / KsJ-Lepr 0 ⁇ 6 diabetic mice);
  • MET metformin 350 mg / kg / day dose group
  • Met + Feno metformin 350 mg / kg / day and fenofibrate 100 mg / kg / day;
  • Met + CM04-100 metformin and CM04 100 mg / kg / day;
  • Met + CM04-250 metformin and CM04 250 mg / kg / day dose group;
  • Met + CPA4-100 metformin and CPA4 100 mg / kg / day;
  • Met + CPA4-250 metformin and CPA4250 mg / kg / day;
  • FIG. 8 is a 12-week administration of metformin to db / db mice, a crab type 2 diabetic model animal to control blood glucose, and then for 12 weeks, extracts (CM04) and basins and peony (1: 8) 8)
  • This study confirmed the efficacy of inhibiting acellular capillary formation among the therapeutic effects of diabetic retinopathy after administration of the extract (CPA4) in combination with metformin: NOR: normal fauna (nondiabetic heterozygote db / + mice);
  • DM diabetic fauna (CSYBL / KsJ-Lepr ⁇ * diabetic mice);
  • MET metformin 350 mg / kg / day administration group
  • Met + Feno metformin 350 mg / kg / day and fenofibrate 100 mg / kg / day;
  • Met + CM04-100 metformin and CM04 100 mg / kg / day;
  • Met + CM04-250 metformin and CM04 250 mg / kg / day dose group;
  • Met + CPA4-100 metformin and CPA4 100 mg / kg / day;
  • Met + CPA4-250 metformin and CPA4250 mg / kg / day;
  • FIG. 9 is a 12-week administration of metformin to db / db mice, a type 2 diabetes model animal, to control blood glucose, and for 12 weeks, extracts of branch and bark (1: 8) (CM04) and branch and peony (1: 8) When the extract (CPA4) was administered in combination with metformin, the effect of treating the damage of intercellular compacted protein in diabetic retinopathy was shown.
  • FIG. 9A confirmed the staining of claudin-5 by staining.
  • 9B is a diagram confirming the change of ocludin protein by western blotting:
  • NOR normal fauna (nondiabetic heterozygote db / + mice);
  • DM diabetic fauna (CS BL / KsJ-Lepr / diabetic mice);
  • MET metformin 350 mg / kg / day dose group
  • Met + Feno metformin 350 mg / kg / day and fenofibrate 100 mg / kg / day;
  • Met + CM04-100 metformin and CM04 100 mg / kg / day;
  • Met + CMG4-250 metformin and CM04 250 mg / kg / day dose group;
  • Met + CPA4-100 metformin and CPA4 100 mg / kg / day;
  • Met + CPA4-250 metformin and CPA4250 mg / kg / day;
  • NOR normal fauna (nondiabetic heterozygote db / + mice);
  • DM diabetic fauna (CSYBL / KsJ-Lepr ⁇ diabetic mice);
  • MET metformin 350 mg / kg / day dose group; .
  • Met + Feno metformin 350 mg / kg / day and fenofibrate 100 mg / kg / day;
  • Met + CM04-100 metformin and CM04 100 mg / kg / day;
  • Met + CM04-250 metformin and CM04 250 mg / kg / day dose group;
  • Met + CPA4-100 metformin and CPA4 100 mg / kg / day;
  • Met + CPA4-250 metformin and CPA4250 mg / kg / day;
  • FIG. 12 shows the hydroponic extracts (C: 04) and hydroponic extracts (CM04-1);
  • Figure 1 shows the damage prevention efficacy of photoreceptor cells (macular degeneration) of:
  • MNU N-methyl-N-nitrosourea
  • CM04-100 MNU induced animal model + CM04 100 mg / kg / day dose group;
  • CM04-1-50 MNU derived animal model + CM04-1 50 mg / kg / day dose group;
  • CM04-1-100 MNU derived animal model + CM04-1 100 mg / kg / day dose group;
  • CPA4-1-50 Uli-derived animal model + CPA4—1 50 mg / kg / day dose group
  • CPA4-1-100 MNU induced animal model + CPA4—1 100 mg / kg / day dose group;
  • FIG. 13 shows hot water extract (CM04-1) and basal and bark skin (1: 8) in a NaI0 3 induced rodent animal model. Cinnamon and Peony (1: 8) hydrothermal extract (CPA4-1) confirmed the damage prevention effect of retinal pigment epithelial cells (macular degeneration):
  • NaI0 3 NaI0 3 derived animal model
  • CM04-1-50 NaI0 3 induced animal model + CM04-1 50 mg / kg / day dose group;
  • CM04-1-100 NaI0 3 induced animal model + CM04-1 100 mg / kg / day administration group;
  • CPA4-1-50 NaIO 3 induced animal model + CPA4-1 50 mg / kg / day dose group;
  • CPA4-1-100 NaIO 3 induced animal model + CPA4-1 100 mg / kg / day dose group;
  • FIG. 14 shows the retinal neovascularization (Subret inal neovascula rization) of basal and bark (1: 8) extract (CM04) and basal and peony (1: 8) extract (CPA4) in the / i // r _ / _ macular degeneration animal model.
  • Vldlr ⁇ - wet macular degeneration mouse model
  • CM04-100 // r _ / —mouse + CM04 100 mg / kg / day dose group;
  • CPA4-100 / f / r _ / _ mouse + CPA4 100 mg / kg / day dose group;
  • Figure 15 shows retinal pigment epithelial cell damage of basal and bark (1: 8) extract (CM04) and basal and peony (1: 8) extract (CPA4) in macular degeneration animal models.
  • VJdJr v ' wet macular degeneration mouse model
  • CM04-100 W // r— / mice + CM04 100 mg / kg / day administration group;
  • FIG. 16 Inhibits VEGF expression (vaginal staining; arrowed) of / c — / — mouse and bark (1: 8) extract (CM04) and basal and peony (1: 8) extract (CPA4) in the mouse retina
  • VEGF expression vaginal staining; arrowed
  • CM04 basal and peony
  • CPA4 basal and peony
  • Vldlr ⁇ wet macular degeneration mouse model
  • CM04-100 V / c // r—mouse + CM04 100 mg / kg / day dose group;
  • CPA4-100 / i // r / _ mouse + CPA4 100 mg / kg / day dose group. 17 is 707, - / _ in the retina of mice retaining and mokdanpi (1: 8) extracts (CM04) and the locking and peony (1: 8) is also confirming the angiogenesis inhibitory effect of the extract (CPA4):
  • Vldl ⁇ wet macular degeneration mouse model
  • CM04-50 //// ⁇ — ⁇ mouse + CM04 50 mg / kg / day dose group;
  • CM04-100 / i / 7r —mouse + CM04 100 mg / kg / day dose group;
  • FIG. 18 shows the basal and pedicel (1: 8) extract (CM04) and the basal and peony (1: 8) extract (CPA4 neovascularization in the subret inal of laser induced choroidal neovascularization letts.
  • CM04 basal and pedicel
  • CPA4 neovascularization in the subret inal of laser induced choroidal neovascularization letts Figures confirming inhibitory efficacy:
  • CNV wet macular degeneration mouse model with laser treatment
  • CM04 wet macular degeneration mouse + CM04 100 mg / kg / day administration group by laser treatment
  • CPA4 wet macular degeneration mouse + CPA4100 mg / kg / day administration group by laser treatment
  • #P ⁇ 0.G5 vs CNV. 19 is a diagram confirming the efficacy of prevention and treatment of lower extremity veins in the animal model induced lower extremity veins with formalin (formalin).
  • Normal normal animal (SD rat);
  • Edema lower extremity edema causing animal population
  • CM04-1-50 lower limb edema induced group + CM04-1 50 mg / kg / day dose group;
  • CM04-1-100 lower limb edema induced group + CM04-1 100 mg / kg / day administration group;
  • CPA4 l-50: lower extremity edema induction group + CPA4-1 50 mg / kg / day administration group;
  • CPA4- 1-100 lower limb edema induced group + CPA4-1 100 mg / kg / day administration group.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic com lications and angioedema, which contains the extract of Chinnamomi Twig as an active ingredient.
  • the extract is characterized in that the extract extracted by further mixing any one selected from the group consisting of Mudan Root Bark, Peony Root and Red Pokyeongyeong (Poria).
  • the extract inhibits excessive end glycation end product production, has a disruptive effect on crosslinking of end glycation end product and matrix protein, and also inhibits end glycation end product formation in human retinal pigment epithelial cell line.
  • the diabetic complication is any one selected from the group consisting of diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic foot ulcer, diabetic heart disease, diabetic osteoporosis or diabetic arteriosclerosis Preferred but not limited to this.
  • angioedema zone macular degeneration, macular edema, retinal degeneration and varicose vein is preferably any one selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the gyeji and bark skin, gyeji and peony, or gyeji and red yeokyeong combined extract is preferably prepared in the following steps, but is not limited thereto.
  • the cage, bark skin, peony, and red bokjeyeong of step 1) can be used without limitation, such as grown or commercially available.
  • the mixed extract is preferably extracted with an extraction solvent after mixing kyeji and neck skin in a 2: 1 to 1:10 weight ratio, and more preferably mixed with a 1: 1 to 1: 8 weight ratio, then extracted with an extraction solvent desirable.
  • the mixed extract is preferably extracted from the extraction solvent after mixing the cheolji and peony in a 2: 1 to 1:10 weight ratio, and more than 2: 1 to 1: 8 and then extracted with an extraction solvent. desirable.
  • the mixed extract is preferably extracted from the extraction solvent after the mixing and the mixing ratio in the ratio of 2: 1 to 1: 2, and more preferably extracted with the extraction solvent after mixing in a 1: 1 weight ratio.
  • the extraction solvent is water alcohol or a mixture thereof.
  • the alcohol is preferably d to C 2 lower alcohol, and the lower alcohol is 30% ethane, 50% ethane, 70%.
  • Extraction methods include, but are not limited to, reduced pressure, high temperature extraction, boiling water extraction, reflux extraction, hot water extraction, cold extraction, room temperature extraction, ultrasonic extraction, or steam extraction.
  • the amount of the extraction solvent is determined It is preferable to extract by adding 1 to 10 times the amount of bark bark, gyeji and peony, or gyeji and red yeokyeong.
  • Extraction temperature is preferably 30 to 100 ° C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 2 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the number of extraction is preferably 2 to 5 times, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) preferably uses a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but not always limited thereto.
  • the mixed extract may be prepared by mixing the kyeji and mokdanpi, kyeji and peony, or kyeji and red yeokyeong, and extract the kyeji, mokdanpi, peony or red yeokyeong respectively and then mixed to prepare a mixed extract.
  • the present inventors prepared a combination extract by mixing the gyeji and the bark skin, gyeji and peony, or gyeji and red yeokyeong in various ratios, and analyzed the components thereof (see Figure la to Figure Id), each The content of Paonioni (Paeoni f lor in) in the extract was confirmed (see Table 1), and as a result of confirming the inhibitory effect of the production of the final glycosylated product in vitro, the mixed extract of the present invention compared to the positive control final The inhibitory effect of glycation product production was remarkable, and particularly, considering that aminoguanidine, a positive control group, was a synthetic single compound, it was confirmed that the mixed extract of the present invention was very effective in inhibiting the production of final glycation product (see Table 2). .
  • the ginseng and bark skin extract of the present invention CM04, CM04-1
  • gage and peony extract CPA4, CPA4-1
  • Concentration dependent (1 / g / i, 5 g / i, 10 s / ml, 20 ug / mi composer50 // g /) was found to significantly inhibit the production of end glycosylated products (see FIG. 2).
  • the mixed extract of the present invention is a positive control.
  • the extracts of the present invention and the extracts of the present invention are also concentration dependent (10) in human retinal pigment epithelial cells in hyperglycemic environments. It was confirmed that the production of the final glycosylated product is inhibited (see FIG. 3).
  • the extracts of ginseng and bark peel, ginseng and peony, ginseng and red ginseng extract inhibited the production of final glycosylated products, inhibited the production of final glycosylated products in glycoaldehyde-coated ECM, and also produced final glycosylated products.
  • the cross-linking of the product with the matrix protein was disrupted and significantly inhibited the production of end glycosylated products in human retinal pigment epithelial cell line in hyperglycemic environment.
  • CM04-1-100, CM04- 1-250 and the branch and peony (1: 8) hot water extract administration group of the present invention (1: 8) : 8) CPA4-1-100, a group of hot water extract administration was found to significantly prevent fluorescence and leakage from retinal blood vessels (see FIG. 4), and as a result of confirming the effect of inhibiting acellular capillary formation, the glands and the bark of the present invention.
  • the clasp and neck skin of the present invention (1: 8) CM04-250, the extract-administered group, and the cochlear and peony (1: 8) group, the administration of the CPA4-250 and metformin co-administered with the extract, showed a significant increase in cladin-5 (see FIG. 9B).
  • CM04-100, CM04-250 and the branch and peony (1: 8), which are the administration group of the ginseng and the bark of the present invention (1: 8) ) CPA4-100, CPA4-250 and metformin in combination with the extract administration group significantly inhibited albuminuria and creatine clearance see Fig.
  • the present invention In addition, in order to confirm the efficacy of preventing and treating macular degeneration of the mixed extract of the present invention, as a result of confirming the damage and degeneration of photoreceptor cells by changing the thickness of the outer nuclear layer of the retinal tissue, the present invention In the group administered CM04 and CM04-1 extracts of Cinnabar and Bark skin (1: 8) and CPA4-1 extracts of Cinnabar and Peony (1: 8), all of them significantly inhibited the damage of photoreceptor cells by MNU. (Refer to FIG. 12), damage and degeneration of retinal pigment epithelial cells.
  • CM04 which is the extract of the present invention and the neck skin (1: 8) (Refer to Fig. 14), and confirming the presence or absence of degeneration of the morphological structure of retinal pigment epithelial cells, the degeneration of retinal pigment epithelial cells (1: 8)-extract —-GM04 administration the breakdown-sage Hi-suppressing dwa is - affirmed that - were eujjyeo o (see Fig.
  • CM04-1 which is the extract of Cajun and Bark skin (1: 8)
  • CPA4-1 concentration-dependent by CPA4-1
  • the extracts of the ginseng and the bark skin, gyeji and peony, or gyeji and red yeokyeong mixed extracts of the present invention inhibits the production of excessive final glycation products that occurs in chronic diabetes mellitus, It shows the cross-linking crushing effect between the final glycosylated product and the matrix protein, and shows the excellent effect of inhibiting the production of the final glycosylated product in human retinal pigment epithelial cell line in hyperglycemic or aging environment, animal models of diabetic complications, macular degeneration 1 and By delaying diabetic complications, macular degeneration, retinal edema and leg edema in the animal model of the lower limb edema, it is confirmed that the prevention and treatment effect is excellent, said stop and neck peel, stop and peony, or stop and red abduction.
  • the mixed extract may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes mellitus and angioedema.
  • Heunhap compositions containing extracts of the present invention may contain the active ingredient having the same or similar function in addition to the above components, at least one member.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate , Lactose, Manni, Peeled, Arabian rubber, Pregelatinized starch, Corn starch, Powdered cellulose, Hydroxypropyl cellulose, Opadry, Sodium starch glycolate, Carnauba lead, Synthetic aluminum silicate, Stearic acid, Stearic acid Magnesium, aluminum stearate, calcium stearate, white sugar, dextrose, sorbitol and talc may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in the composition of 0.1 to 90 parts by weight, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in a variety of oral and parenteral formulations in actual clinical administration, when formulated, the commonly used stratification agent, Diluents or excipients such as extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like can be prepared.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. Such solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate (Calcium carbonate), It can be prepared by mixing sucrose, lactose or gelatin.
  • lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, solution solutions, emulsions and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, etc. may be used.
  • As a base of suppositories wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally according to the desired method, the external or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intramuscular injection in parenteral administration It is preferable to select. Dosage varies depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of Xalhwan.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease, the daily dosage is a combination extract of the present invention It is 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg based on the amount of can be administered 1 to 6 times a day.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the prevention and treatment of diabetic complications or angioedema.
  • present invention provides a dietary supplement for preventing and improving diabetic complications and angioedema, which contains the extract as an active ingredient.
  • the extract is characterized in that the extract extracted by further mixing any one selected from the group consisting of ⁇ short, peony and red bokyongyeong.
  • the extract inhibits excessive end glycation end product production, has a disruptive effect on crosslinking of end glycation end product and matrix protein, and also inhibits end glycation end product formation in human retinal pigment epithelial cell line.
  • the diabetic complication is any one selected from the group consisting of diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic foot ulcer, diabetic heart disease, diabetic osteoporosis or diabetic arteriosclerosis Preferred but not limited to this.
  • angioedema is preferably any one selected from the group consisting of macular degeneration, macular edema, retinal degeneration and varicose veins.
  • the gyeji and bark skin, gyeji and peony, or gyeji and red yeokyeong combined extract is preferably prepared in the following steps, but is not limited thereto.
  • step 3 concentrating the filtered extract of step 2) under reduced pressure.
  • the cages, bark skins, peony, and red follicles of step 1) can be used without limitation, such as those grown or commercially available.
  • the mixed extract is preferably extracted with an extraction solvent after mixing the kyeji and the neck peel in a 2: 1 to 1:10 weight ratio, more preferably mixed with a 1: 1 to 1: 8 weight ratio and then extracted with an extraction solvent. Do.
  • the mixed extract is a geyyeo and peony mixed with a 2: 1 to 1:10 weight ratio, and then extracted with an extraction solvent, preferably 2: 1 to 1: 8 by weight ratio It is more preferable to extract with an extraction solvent.
  • the mixed extracts are preferably extracted with an extraction solvent after mixing at a weight ratio of 2: 1 to 1: 2, and more preferably at 1: 1 weight ratio and then extracted with an extraction solvent.
  • the extraction solvent is preferably water, alcohol or a combination thereof.
  • As the alcohol it is preferable to use d to C 2 lower alcohol, and as the lower alcohol, it is preferable to use 30% ethanol, 50% ethane, 70% ethanol or methanol.
  • As the extraction method it is preferable to use high pressure extraction, boiling water extraction, reflux extraction, hot water extraction, steam extraction, room temperature extraction, ultrasonic extraction, or steam extraction.
  • the amount of the extraction solvent is preferably extracted by adding 1 to 10 times the amount of bastard and bark peel, bastard and peony, or bastard and red ginseng age.
  • the extraction temperature is preferably 30 to ioo ° C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 2 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the number of extraction is preferably 2 to 5 times, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) preferably uses a vacuum decompression concentrator or a residual air evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the mixed extract may be prepared by mixing the kyeji and mokdanpi, kyeji and peony, or kyeji and bokbokyeong, and extract the kyeji, mokdanpi, peony or bokbokyeong after mixing, respectively, to prepare a mixed extract.
  • the ginseng and the bark skin, the ginseng and the peony, or the ginseng and the red ginseng mixed extract, the ginseng and the bark skin, the ginseng and the peony, or the ginseng and the red ginseng mixed extract inhibit the production of excessive final glycation products that occur in chronic diabetes mellitus, It has cross-linking crushing effect with substrate protein, and has excellent efficacy in suppressing the end glycated product formation in human retinal pigment epithelial cell line in hyperglycemic or aging environment, animal models of diabetic complications, macular degeneration and edema
  • the complex and extracts of the capillary skin, pedicel and peony, or the combination of red and red creeping age can be used to prevent diabetic complications and angioedema.
  • the health functional food may be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, and the like, but is not limited thereto and may be manufactured and processed in any form according to the law.
  • the mixed extract of the present invention may be added to a food as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the combined amount of active ingredients can be determined suitably according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of the mixed extract in the health food can be added from 0.1 to 90 parts by weight of the total food weight.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • the health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except for containing the above-mentioned mixed extract as essential ingredients in the indicated ratios, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and xylyl, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring crabs tautin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrzin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • natural flavoring crabs tautin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrzin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the extract of the present invention may be used in various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, such as flavoring agents, coloring agents and May contain enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. have.
  • the root extract of the present invention may contain natural fruit juice and fruit flesh for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. Such components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is usually selected in the range of from 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the combined extract of the present invention.
  • Gyeji and Mokpipi was purchased from Daejeon Baekje-Dang (Korea) and carried out the following examples, and stored in the lower room of the Diabetes complications research team of the Korean Institute of Oriental Medicine.
  • CM01 Cibi Extract
  • Cage and bark extract (CM01) was prepared by mixing 12 g of ginkgo and 12 g of bark skin in 1: 1, total 24 g was added to 144 ml of 50% ethanol, and repeated reflux extraction was repeated for about 3 hours at about 50 ° C. .
  • CM01-1 hydrothermal extract
  • Cinnabar and bark hot water extract (CM01-1) was prepared by mixing 90 g of goji and 90 g of bark skin with 1: 1, and a total of 180 g was added to 1080 ml of purified water for about 2 hours in hot water for extraction.
  • CM02 Basal and bark extract
  • CM02 ginseng and bark extract
  • CM02-1 ginseng and bark hot water extract
  • CM03 ginseng and bark skin extract
  • CM03-1 gyeji and bark hot water extract
  • 36 g gyeji and 144 g of the bark skin 1: 4 a total of 180 g in 1080 ml of purified water in about 2 Prepared by hydrothermal extraction for hours.
  • CM04 ginseng and bark skin extract
  • the hot water of the lock and neck Extract (CM04-1) is 1 to 20 g and the engagement mokdanpi 160 g: 180 g and put the gun in the "purified water 1080 ml was prepared by hot-water extraction from yaktanggi for about 2 hours to 8 combined common.
  • Gyeji and Peony was purchased from Daejeon Baekje-Dang (Korea) and the following examples were carried out, and stored in the cold room of the team of diabetic complications of the Korean Institute of Oriental Medicine.
  • Example ⁇ 1-1> the ginseng and peony extract (CPA1) were mixed with 16 g of ginseng and 8 g of peony 2: 1, and a total of 24 g was added to 144 ml of 50% ethanol at about 50 ° C. Prepared by repeated reflux extraction twice for about 3 hours.
  • Example ⁇ 1-2> the ginseng and peony hot water extract (CPA1-1) were mixed with 120 g of gage and 60 g of bark peel in a ratio of 2: 1, and a total of 180 g was added to 1080 ml of purified water in a medicine bath. Prepared by hot water extraction for 2 hours.
  • Example ⁇ 1-1> the ginseng and peony extract (CPA2) were mixed with 10 g of ginseng and 20 g of peony 1: 2, and a total of 30 g was added to 180 ml of 50% ethanol at about 50 ° C. Prepared by repeated reflux extraction twice for about 3 hours.
  • Example ⁇ 1-1> the ginseng and peony extract (CPA3) were mixed with 6 g of ginseng and 24 g of peony 1: 4, and a total of 30 g was added to 180 ml of 50% ethanol at about 50 ° C. Prepared by repeated reflux extraction twice for about 3 hours.
  • Example ⁇ 1-2> the ginseng and peony hot water extract (CPA3-1) were mixed with 36 g of ginseng and 144 g of peony 1: 4, and a total of 180 g was added to 1080 ml of purified water in a medicine bath. Prepared by hot water extraction for 2 hours.
  • the ginseng and peony extract (CPA4) was mixed with 3.5 g of ginseng and 28 g of peony as 1: 8, and a total of 31.5 g was added to 190 ml of 50% ethanol at about 50 ° C. Prepared by repeated reflux extraction twice for about 3 hours.
  • Example ⁇ 1-2> the ginseng and peony hot water extract (CPA4-1) were mixed with 20 g of gase and 160 g of peony at a ratio of 1: 8, and a total of 180 g was added to 1080 ml of purified water in a medicine bath. Prepared by hot water extraction for 2 hours.
  • Gyeji and Red Bok-Ryong were purchased from Daejeon Baekje-Dang (Korea) and carried out the following examples, and stored in the lower room of the Diabetes complications research team of the Korean Institute of Oriental Medicine.
  • the gyeji and red yeokyeong extract (CP0) is mixed with 12 g gyeji and 12 g of red yeokyeongyeong 1: 1 put a total of 24 g in 50% ethanol 144 ml It was prepared by repeated reflux extraction twice for about 3 hours at about 50 ° C.
  • the extract KBT used as a control was prepared by adding 10 times distilled water by mixing the same amount of Gyeji, Red Bokryong, Mokpipi, Red Pill and Doin. It was.
  • Example 5 Preparation of Keji, Peony, Licorice, Ginger, and Controlled Combination Extract (KJT)
  • KJT Controlled Combination Extract
  • the extract KJT, which was used as a control had a ratio of 3: 2: 1: 1: 1, respectively. 10 times of distilled water was added thereto, followed by pouring for about 2 hours with an ultrafast vacuum low temperature extractor, followed by drying under reduced pressure and high temperature.
  • Example 6 Analysis of the Components of Cajun and Bark Bark Extracts, Cajun and Peony Extracts
  • CM04 Cajun and Bark skin extracts
  • CM04-1 Cajun and Bark hot water extracts
  • CCA4 Cajun and Peony extracts
  • HPLC analysis was performed to identify the components of the hydrothermal extract (CPA4-1).
  • the index components of the cinnabar and bark extract (CM04), the cinnabar and bark hot water extract (CM04-1) are Gallic acid, Oxypaeonif lorin, Albiprorin ( Albi f lor in, Paeoniflorin, Benzoic acid, Cinnamic acid ⁇ Cinnamic aldehyde ! ⁇ ⁇ , It was confirmed that it is Paeonol (Fig.
  • the index components of the ginseng and peony extract (CPA4), the ginseng and peony hot water extract (CPA4-1) are gallic acid, oxyphaoniflorin, albiproline, paoniflorin, benzoic acid, cinnamic acid, cinnamic aldehyde It was confirmed that (Fig. Lc to Id), as shown in Table 1 below, the content of the pheoniflorin in each extract was confirmed (Table 1). [Table 1]
  • the present inventors analyzed the efficacy of inhibiting the production of final glycosylated product in vitro of the mixed extract prepared in the above ⁇ Example 1> to ⁇ Example 5>.
  • the protein source is 10 mg / ml bovine serum albumin (BSA, Sigma, USA) dissolved in 50 mM phosphate buffer (7.4), and the sugar source is 0.2 M fructose and 0.2 M glucose. Mixed solution was used.
  • the extract and positive control group (aminoguanidine) of ⁇ Example> were dissolved in 0.2% dimethyl sulfoxide (DMS0), and then dissolved in 15% tween 80 again.
  • CM01, CM02, CM03, and CM04 which were extracts of gages and bark skin, showed 17-fold, 21.3-fold, 21.3-fold, and 22.7-fold superior efficacy in the final glycation product production, respectively, compared to aminoguanidine, a positive control group.
  • CPAl, CPA2, CPA3, and CPA4 extracts were 8-fold, 10.9-fold, 10.1-fold, and 12.1-fold more effective than aminoguanidine, a positive control, respectively.
  • the red ginseng extract (CP0) was confirmed to be four times more effective in inhibiting the production of the final glycation product than the amino guanidine positive control group (Table 2).
  • the ginseng and bark skin extract, ginseng and peony extract, or ginseng and red ginseng mixed extract of the present invention were found to have a very good effect of inhibiting final glycation product formation. It was confirmed that the ginseng and bark extract, ginseng and peony extract, or ginseng and red ginseng mixed extract of the invention was much better than the extract of Example 4 (KBT) or the extract of Example 5 (KJT).
  • the extracellular matrix (ECMX Sigma-Aldrich, cat.no.c-3867) was dispensed in 96 black well plates at 10 / zg / cm 2 and coated overnight at 4 ° C. It was. The next day the ECM of the coated plate was removed, dried completely at room temperature and then total amount with 100 mM glycoaldehyde (Sigma-Aldrich) and extracts of various concentrations (1, 5, 10, 20, 50 g /) pre-diluted To 100 ⁇ and reacted at 37 ° C for 4 hours to obtain the final glycated product (advanced glycation) endproducts, AGEs).
  • ECMX Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich, cat.no.c-3867
  • the extract of the ginseng and the bark of the present invention (CM04, CM04-1) and the extract and the peony extract (CPA4, CPA4-1) is concentration-dependent 5 ⁇ g / m «, lO g /, 20 g / mi, 50 / /) was found to significantly inhibit the production of the final glycated product (Fig. 2).
  • gyeji and bark extract, gyeji and peony extract, or gyeji and red bokyeongryeong extract is more effective than ALT-711, a positive control.
  • the positive control group ALT-711 was confirmed that the mixed extract of the present invention has excellent efficacy when referring to the synthetic single compound.
  • Cajun and Peel Extracts (CM02, CM04, CM04-1), Cajun and Peony Extracts prepared in ⁇ Example 1> to ⁇ Example 2> (CPA1-1, CPA2-1, CPA4, Inhibition of final glycation endogenous product production in human retinal pigment epithelial cell line was observed in the hyperglycemic environment of CPA4-1).
  • the human retinal pigment epithelial cell line (ARPE-19: ATCC No. CRL-2302) was cultured in a 5% C0 2 incubator with Dulbeccos modi fied Eagles medium medium (DMEM, Gibco, USA) in a hyperglycemic environment. After incubating at a final concentration of BSA of 500 ⁇ g / ml, hyperglycemia 25 mM, the ginseng and bark extract of the present invention (CM02, CM04, CM04-1), ginseng and peony extract (CPAl-1, CPA2-1, CPA4 and CPA4-1) were treated by concentration (10, 20, 50. Also, the positive control group was treated with aminoguanidine (AG, 10 mM).
  • DMEM Dulbeccos modi fied Eagles medium medium
  • the ginseng and the bark extract of the present invention (CM02, CM04, CM04-1), the ginseng and peony extract (CPAl-l, CPA2-1, CPA4, CPA4-1) is a hyperglycemic white
  • the concentration-dependent (10 ug / mi, 20 ug / mi, 50 / ig / nrf) it was confirmed that inhibits the production of the final glycosylated product (Fig. 3).
  • mice Ten 7-week-old male mice, a type 2 diabetes animal model in which diabetes develops from leptin receptor mutations, are given in each group as follows.
  • Experimental Groups (1) and (2) were orally administered with the same amount of vehicle solution, 0.5% methylcellose solution. Body weight, feed, and drinking intake were measured during the drug administration.
  • CM04-1 and hydrogel extract (CM04-1) and the hydrogel extract (1: 8) hydrogel extract (CPA4-1) prepared in ⁇ Example 1> to ⁇ Example 2> were administered. After the acellular capillary formation inhibitory effect was confirmed.
  • the eyeball in the mouse in the same manner as in Experimental Example ⁇ 5-2> After extraction, the retina was removed from the eye, washed with running water, and then put in 3% trypsin and incubated at 37 ° C for 1 hour. The digested retina was transferred to PBS and the internal membrane (membrane of organelles present in the cells) was removed. The vascular frame was separated from the retinal background using glass rods, placed on 5 slides, and dried. PAS staining and hematoxyl in staining confirmed cell wall and nucleus changes.
  • NOR normal group
  • DM diabetic group
  • FEN0 fenofibrate administration group
  • the primary antibody was diluted 1: 200 and treated for 1 hour or overnight. After washing with PBS for 1 hour, apply abeled streptoavidin biot in (LSAB) kit (Dako, USA) and develop with DAB Observation was carried out with an optical microscope. In the case of fluorescent staining, the FITOconjugated secondary antibody was diluted 1: 200 and reacted for 1 hour, and then stained with DAPI, and observed under a fluorescence microscope.
  • LSAB abeled streptoavidin biot in
  • Diabetes caused by leptin receptor mutants was performed by dividing the 7-week-old male db / db mice of the type 2 diabetes animal model into 8 groups as follows.
  • Groups (3) to (8) were administered metformin 350 mg / kg for 12 weeks in order to lower the blood sugar level. Metformin and extracts were suspended orally in 0.5% methylcel lulose and administered orally once a day for 12 weeks. Experimental group (1) and (2) group orally administered only 0.5% methylcellose solution, which is a vehi cle solution. After 12 weeks of treatment with meptformin, the extract corresponding to each group was administered in combination with metformin daily by a fixed dose. Body weight, feed and drinking water intake were measured during drug administration, and blood glucose was measured at four week intervals. ⁇ 6-2> Confirmation of inhibitory effect on blood—retinal barrier breakage
  • Diabetes induction was confirmed at 12 weeks, 18 weeks, and 24 weeks, respectively.
  • the normal group (N0R) fluorescence was not observed until 24 weeks
  • the positive control group metformin-treated group (MET) showed a significant decrease in fluorescence leakage by 18 weeks compared to the diabetic group (DM). Fluorescence was not prevented and metformin and fenofibrate combination group (MET + FEN0) prevented the release of fluorescent material at 18 weeks, but found no effect at 24 weeks.
  • Diabetic retinopathy and one of the earliest symptoms are acellular capillary formation, which kills the nuclei of pericyte, a peripheral cell, leading to retinopathy.
  • the eye was extracted from the mouse in the same manner as in Experimental Example ⁇ 6-2>, the retina was removed from the eye, washed with running water, and then put in 3% trypsin and incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • the digested retina was transferred to PBS and the internal membrane (membrane of organelles present in the cells) was removed.
  • the vascular frame was separated from the retinal background using glass rods, placed on a slide, and dried. PAS staining and hematoxylin staining confirmed cell wall and nuclear changes.
  • the eye was removed from the mouse in the same manner as in Experimental Example ⁇ 6-2>, fixed in 10% evaporated formalin overnight, and then replaced with xylene three times through dehydration and embedded in paraffin.
  • Embedded tissue blocks were used to make continuous sections 4 mm thick and rolled onto slides.
  • the deparaffinized and hydrolyzed slides were reacted with 3> hydrogen peroxide solution for 10 minutes to remove endogenous peroxidase activity and washed three times with PBS containing 0.05% tween 20. After blocking with 5% casein to remove nonspecific reaction, the primary antibody was diluted 1: 200 and treated for 1 hour or overnight.
  • the claudein (claudin-5) was expressed in various places in the blood vessel.
  • the connection line such as thread, was broken, CM04-100, which was administered with the gage and bark skin (1: 8) extract of the present invention
  • urine discharge proteinuria, albuminuria, creatine clearance, urine nephrin amount, urinary 8-OHd amount, and AGE amount in urine were checked.
  • Amount and AGE amount showed significant efficacy, but metformin alone group did not inhibit urine volume, albuminuria amount and creatine clearance rate, and CM04-100 and CM04, which were the administration group of the paschal and pagoda (1: 8) extract of the present invention.
  • the administration of metformin alone does not inhibit the progression to diabetic nephropathy
  • the combination administration of metformin and the gage and bark extract of the present invention or the gage and peony extracts is a treatment for the development of diabetic nephropathy. Confirmed.
  • Glomerulosclerosis a morphological change in diabetic nephropathy, was confirmed by mesangial and extracellular matrix expansion by PAS staining and Trichrome staining.
  • the eye was extracted from the mouse in the same manner as in Experimental Example ⁇ 6-2> and fixed overnight in 10% neutralized formalin, followed by a dehydration process. After replacing 3 times with xylene Embedded in paraffin.
  • the embedded tissue block was used to prepare a continuous section of 4 urn thickness on a slide. Deparaffinization process and hydrous process The coarse slides were reacted with 3% hydrogen peroxide solution for 10 minutes to remove endogenous peroxidase activity and washed three times with PBS containing 0.05% Twen 20.
  • the slide sections were stained with hematoxyl in & Eosin (H & E) and observed under an optical microscope.
  • the normal group was administered only the same amount of saline solution, 0.5% carboxymethyl cellulose with CM04-1, the hydrothermal extract (1: 8) hydrothermal extract of the present invention, and CPA4-1, the hydrothermal extract (1: 8) Suspension preparation in sodium carboxymethyl cel lulose (CMC) was administered orally once a day before NaOI 3 at a concentration of 50 mg / kg and 100 mg / kg, and orally once daily for 7 days after NaOI 3. .
  • Normal group and control group were orally administered only 0.5% CMC in the same amount.
  • Retinal neovascularization a clinical symptom of wet macular degeneration, is a model animal that appears from 3 weeks of age.
  • Vldlr Muses were purchased from Jacson labratory from male and female pairs to obtain young 2-week-old mice for breeding. It was.
  • C57BL / 6 mice of the same age were used.
  • CM04 and CPA4 which are extracts of the cauliflower and bark skin (1: 8) of the present invention, were prepared in a suspension of 0.5% CMC and were 100 mg / kg. The dose was intraperitoneally administered once daily for 7 days. In the normal group and the control group, only 0.5% CMC was orally administered.
  • Edema of the retinal vessels was measured to determine the effect of retinal neovascularization.
  • CM04 which is the extract of the present invention and the neck skin (1: 8). It was confirmed that significantly inhibited (Fig. 14).
  • the retina was separated from the ocular tissue extracted at the time of necropsy, the conjunctival tissue was fixed in 4% paraformaldehyde for 3 hours, and washed with PBS. Stir for 3 hours in PBS containing% Triton X-100 and 1% BSA. After washing again, lectin (L2140, sigma) dissolved in PBS at 1 mg / ml Diluted to 1:50 and reacted overnight at 4 ° C.
  • streptavidin TRITC was diluted 1: 500 and reacted at 37 ° C for 4 hours, followed by 30 minutes of washing with PBS, followed by fluorescence microscopy (BX51, Olympus, Japan). Observed.
  • retinal pigment epithelial cells of normal mice As a result, as shown in Figure 15, retinal pigment epithelial cells of normal mice
  • CM04 is an extract of the basal and bark of the present invention (1 : 8 ) (FIG. 15).
  • the slad section was prepared in the same manner as in Experimental Example ⁇ 7-2-2>.
  • the slide sections were H & E stained to quantitatively analyze neovascularization lesions in the subretinal area under an optical microscope.
  • VEGF an important factor involved in the permeability of neovascularization and blood vessels, was severely expressed (stained dark purple) in Vlc! Lr ⁇ -mice, : 8) It was confirmed that the administration of the extract CM04 and CPA4 extract and the peony (1: 8) extract significantly inhibited (Fig. 16).
  • Retinal neovascularization a clinical symptom of wet macular degeneration, is a model animal from 3 weeks of age VI dh ⁇ —A mouse was purchased from Jacson labratory for breeding males and females at 2 weeks of age through breeding (breeding). Mice were obtained and used for the experiment. As normal animals, C57BL / 6 mice of the same age were used. CM04 and CPA4 extract, which is the extract of Cinnabar and Bark Peel (1: 8) of the present invention, was prepared in suspension at 0.5% CMC, and the concentration was 50, 100 mg / kg, respectively, from 3 weeks of age. Intraperitoneally once daily. In the normal group and the control group, only 0.5% CMC was orally administered.
  • the retinal tissue slices were used to determine the effects of retinal neovascularization on macular degeneration.
  • CM04 100 mg / kg administration was confirmed to be significantly inhibited (Fig. 17).
  • CM04 and CPA4 extract which is the extract of Cinnabar and Bark Bark (1: 8) of the present invention, was prepared in a suspension of 0.5% CMC, and each extract was administered at a concentration of 100 mg / kg for 10 days Once oral administration. Only 0.5% CMC was orally administered in the control group.
  • Retinal tissue slices were used to determine the effects of neovascularization on the subretinal region of macular degeneration.
  • the retina was detached and the conjunctival tissue including the subretinal region was prepared under a fluorescence microscope (BX51, Olympus, Japan). The size of neovascularization site was analyzed using Image J software (NIH, USA).
  • CM04 100 mg / kg
  • the bark skin (1: 8) the extract of the present invention
  • the release and peony (1: 8) It was confirmed that the extract showed a tendency to be suppressed by administration of CPA4 (100 mg / kg) (FIG. 18).
  • the content of phoniflorin in the CM04, CM04-1, CJ4 and CJ4 extracts CPA4 and CPA4-1, which are extracts of the ginseng and the bark of the present invention (1: 8), respectively 2.7%, 2.3%, 12.3%, and 8.9%. It may be effective for ophthalmic diseases such as macular degeneration, since pheonyflorin has the ability to inhibit 3 ⁇ 40 2 cell death and oxidative stress in human retinal pigment epithelial cell line (ARPE-19). Reported (Molecular Vis ion 2011; 17: 3512-3522).
  • the animal model does not prove whether it is effective in preventing and treating macular degeneration, and the only cause of macular degeneration in retinal pigment epithelial cell line is not aging condition; After adding 3 ⁇ 40 2 , a toxic substance, only antioxidant and inhibition of apoptosis were confirmed. It has not been demonstrated in animal models to determine whether it is really effective in macular degeneration.
  • the extract of the present invention contains the pheoniflorin, but the extracts are not the sole efficacy of the pheoniflorin, the efficacy of the phenoniflorin and each extract (100 mg) contained in 100 mg of each extract was confirmed in the animal model.
  • CM04U00 mg / kg extract of Cinnabar and Bark Skin (1: 8), CPA4 (100 mg / kg) extract of Cinnamon and Peony (1: 8), Paoniflorin -2.7 (2.7 mg / kg), Paoni Florin-12.3 (12.3 mg / kg) was suspended in 0.5% CMC, orally administered once a day before MNU administration, and orally administered once daily for 7 days after u administration. Normal group and MNU induction group was orally administered 0.5% CMC.
  • Normal Normal control group
  • Edema Lower limb edema group
  • CM04-1-50 Lower limb edema group + CM04-K50 mg / kg / day)
  • Administration group CM04-1-100: Lower limb edema group + CM04-K 100 mg
  • CPA4-1-50 lower limb edema + CPA4-1 (50 mg / kg / day) administration group
  • CPA4- 1-100 lower limb edema + CPA4- 1 (100 mg / kg / day) group.
  • CM04-1 extracts of the cadaver and bark skin (1: 8) and CPA4-1 extracts of the lancet and peony (1: 8) were prepared by suspending in 0.5% CMC.
  • Administration of the lower limb edema was induced by the administration of 2 53 ⁇ 4 formalin-containing saline (fomalin in saline) 0.1 to the sole of the right hind limb, and the normal group was injected with the same amount of normal saline.
  • the present invention is not only pharmaceutically usable as a natural mixed extract composition effective for the prevention and treatment of diabetic complications and angioedema, but also useful as a health functional food.

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Abstract

본 발명의 계지(Cinnamomi Twig) 및 목단피(Moutan Root Bark), 계지 및 작약(Peony Root), 또는 계지 및 적복령(Poria) 혼합 추출물은 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며, 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고, 다양한 당뇨합병증 동물모델, 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성, 망막부종 및 하지부종을 지연, 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써, 상기 혼합 추출물을 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증 등을 포함하는 당뇨합병증(diabetic complications) 및 황반(망막)부종, 황반변성 및 하지정맥류를 포함하는 혈관부종(angioedema)의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
천연 흔합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 또는 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 계지 (Cinnamomi Twig) 및 목단피 (Moutan Root Bark) , 계지 및 작약 (Peony Root), 또는 계지 및 적복령 (Poria) 흔합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 망막증， 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증 둥을 포함하는 당뇨합병증 (diabetic compl icat ions)과 황반 (망막)부종， 황반변성 및 하지정맥류를 포함하는 혈관부종 (angi oedema) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
[배경기술】
당뇨병 환자는 현재 전 세계적으로 2억 4천만 명을 넘었으며， 2025년에는
3억 8천만 명으로 증가하고 이중 60%가 아시아 지역일 것이라고 2009년 미국의사협회 (JAMA)에서 발표하였다. 특히 전 세계적으로 (초)고령화 사회로의 진입과 당뇨 발병 연령이 계속 낮추어짐에 따라 당뇨합병증 발병이 급속도로 증가하고 있다. 최근 우리나라도 당뇨병 유병를이 10%에 달하며， 특히 당뇨발병 시기가 청장년으로 당겨지고， 수명이 연장됨으로 인해서 당뇨 합병증 환자가 폭발적으로 증가하는 상황이다.
당뇨합병증 (diabetic complications)0! 지난 5년 새 60%가 늘었고, 진료비도 54% 늘어난 2,035억 원에 달했다고 보고하였다 (국민건강보험공단， 2011. 08.). 즉， 당뇨병 발병 10~15년 후 신체 거의 모든 기관이 손상을 받아 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장 (diabetic cataract), 당뇨성 신증 (diabetic nephropathy) , 당뇨성 신경병증 (diabetic neuropathy) , 당뇨성 족부궤양 (diabetic foot ulcers) , 당뇨성 심장병 (diabetic heart disease) , 당뇨성 골다공증 (diabetic osteoposis) 또는 당뇨성 동맥경화증 (diabet ic arteriosclerosis) 등으로 '나타난다.
현재 투약되고 있는 여러 기전의 당뇨병 치료약들은 (메트포르민， 로지글리타존， 제미글로， 자누비아 등) 당뇨 초기의 혈당을 조절할지라도， 완치가 불가능하여 만성적으로 진행되어 발병되는 당뇨병성 합병증 (당뇨성 안구질환， 신증， 신경병증, 족부궤양 등)으로의 이행을 근본적으로 예방 또는 치료하지 못한다. 당뇨합병증이 당뇨로 시작되지만， 당뇨합병증으로 이행 기전은 당뇨병과 다름올 의미한다. 그러므로 신속히 혈당조절제로 조절하면서 당뇨합병증올 지연 또는 예방할 수 있는 약을 병용하여 당뇨합병증을 지연， 예방 또는 치료하는 것이 필요하다. 만성 당뇨성 신증은 혈액 투석 및 장기 이식치료를 요구하며， 당뇨성 백내장과 망막증은 실명을 초래한다. 미국의 경우 25세에서 74세 연령대의 실명의 주원인이 당뇨병으로 보고되었다. 당뇨성 족부궤양으로 인하여 팔 다리를 절단해야하는 끔직한 상황이 전개되며, 당뇨성 신경병증은 칼로 찌르는 듯한 고통을 수반한다. 당뇨성 심장병은 급격한 죽음을 일으킨다. 그러므로 당뇨환자의 합병증 발병이 몇 년만 지연되더라도 환자와 가족의 삶의 질이 달라질 것이며， 국가재정에도 커다란 도움을 준다. 이러한 당뇨함병증을 유발하는 대표적인 인자는 최종당화산물 생성， 알도즈 리덕테이즈 (aldose reductase)의 활성화, PKC isomer의 활성화， 핵소사민 경로 flux의 증가 등으로 보고되었다 OVaii/re, 414, 813-820,
Figure imgf000004_0001
Diabetologia, 38： 357-3941, 1995). 이러한 인자들의 비가역적인 반웅으로 산화적 스트레스가 가속화됨으로 당뇨합병증이 더욱 악화된다.
단백질의 비효소적 당'화반웅 (r nenzymat ic glycat ion of protein)은 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소 작용 없는 축합반웅 (밀리아드 반웅)에 의해 최종당화산물 (advanced glycat ion endproducts, AGEs)이 생성하는 것을 말한다. 즉 초기 단계 산물인 쉬프염기 (schiff base)를 형성하고， 이 쉬프염기와 인접한 케토아민 어닥트 (ketoamine adduct)가 서로 축합하여 가역적인 아마도리 (Amador i)형의 조기당화산물이 생성하며, 고혈당 상태가 지속되면 가역적인 아마도리형의 조기당화산물이 분해되지 않고 재배열 (rearrangement)되어 비가역산물인 최종당화산물이 생성된다. 이렇게 생성된 최종당화산물들이 . 단백질 또는 지질 등과 결합 또는 교차결합 (cross-linking)하여 비가역적인 당화단백질 또는 당화지질 등의 산물이 생성된다. 이 최종당화산물은 기저막， 혈장 알부민， 수정체 단백질， 피브린， 콜라겐 등의 단백질 또는 지질과 (교차)결합하여， 그 단백질이나 지질의 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 합병증을 유발시킨다. 또한 혈당이 다시 정상으로 회복이 되더라고 이미 생성된 최종당화산물은 단백질이나 지잘과의 반웅은 계속 진행되므로 합병증은 발병한다 ( Engl. ,1988, 318, 1315-1321). 또한, 이러한 상태에서 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다 (J. of Trad. Med. 2001, 18： 107-112). 이러한 기전에 기초해서 당뇨합병증의 발병을 지연하거나 예방 (치료)하기 위해 최종당화산물 생성 억제하는 것이 중요함이 보고되었다 OV. Engl. Med. 1998, 318, 1315-1321).
당뇨병성 망막증은 만성적 고혈당 상태에서 망막의 혈관과 신경세포가
C .
손상되어 비증식성 망막증으로 진행되어 결국엔 증식성 망막증으로 진전되어 실명하게 된다. 즉 고혈당 환경에서 망막의 모세혈관을 싸고 있는 주변세포 (pericyte)가 손상되기 시작하면서 미세동맥류 (microaneurysm) 현상이 생기고 이여서 내피세포의 손상으로 이어져， 혈관으로서 기능을 할 수 없는 무세포성 모세혈관 (acellular capillary)이 많이 생성된다. 이러한 비정상적인 신생혈관의 벽이 매우 약하여 쉽게 파괴되어 혈액성분 등이 밖으로 유출되어 결국엔 실명에 이르게 된다. 오클루딘 (occludin)이나 클라우딘 (claudin) 등과 같은 주변세포와 내피세포 등과 연결하는 세포간 치밀이음부 단백질 (tight-junction protein)이 손상되므로 여러 병리적인 현상이 일어난다. 이러한 당뇨병성 망막증을 예방하기 위하여 초기증상인 주변세포 손상을 막아야할 것이다. 2013년 12월에 호주 FDA 승인은 받은 페노파이브레이트^ ^ ^ ^^ᄂ八^ ：！는 PPAR a agoni st로 당뇨병성 망막증 치료제로 승인되었다. ACCORD study와 FILD study는 엄격한 혈당 조절한 당뇨환자의 33%는 당뇨병성 망막증으로 전이되는 것을 막았으나， 약 40% 정도 당뇨병성 망막증으로 전이되는 것올 지연하였다고 보고하였다.
5
2014년 미국 FDA승인을 받은 일루비엔 ( I luvien, f luocinolone acetonide intravi treal implant , Al imera Sc ience)은 당뇨병성 황반부종 치료제로 승인되었다.
10 당뇨병성 신증은 최종당화산물과 단백질이 결합한 당화 알부민이 만성
——당뇨성 산중을 ―일으카는 중요한 -요인—으로 작용한다. 당화 알부민은 정상 알부민에 비해 더 용이하게 신사구체 세포 내로 유입되고， 만성적인 고농도의 포도당은 메산지움 세포를 자극하여 세포외기질 (extracel lular matr ix)합성을 증가시킨다. 과도하게 유입된 당화 알부민과 증가된 세포외기질로 인하여
15 신사구체의 섬유화가 야기된다. 이와 같은 기전으로 신사구체가 계속 손상 받게 되어 혈액투석 또는 장기이식 등의 극단적인 치료방법을 쓸 수밖에 없는 단계에 이르게 되는 것이다. 혈관부종 (angioedema)은 피부 깊숙한 곳이나 피부 아래， 혹은 점막 밑에 20 있는 혈관의 투과성이 증가하여 체액이 혈관에서 빠져 나와 주위 조직에 고이는 (즉 부종이 생기는) 질환을 말하는 것으로, 비교적 느슨한 조직에서 잘 발생하는데 눈 주위， 입술 주위, 손에 생기는 경우가 흔하고， 혀， 입 안， 후두， 위장관 벽 같은 점막에도 발생하며， 특히 망막혈액장벽의 손상으로 안한 혈관부종으로 황반 (망막)부종 또는 황반변성， 또는 하지정맥류 등이 발생한다.
25
황반변성 (Age-related macul ar degenerat ion : AMD)은 비가역적인 질병 중 하나로 많은 연장자에게 발병하며 실명으로 유도하는 대표적인 안과 질환이다. 전 세계적으로 인구 노령화로 인해 발병율이 점점 증가하고 있다. 미국에서는 황반변성은 실명의 주된 원인으로， 환경적인 요소 및 유전자적 요소도 발병에 영향을 끼치며， 특히 흡연은 가장 치명적인 발병요인으로 보고되었다. 뿐만 아니라 비만， 과도한 항산화제 및 식이 지방의 섭취도 황반변성을 유발하고 더욱 진전시키는 영향을 준다. 그러므로 건강한 식이섭취， 체중조절， 적절한 운동， 금연 등이 황반변성 발병을 저하시킨다. 미국 내 조기 (건식) 황반변성 유병율이 40 50연령대에서는 3.9%정도이나， 75세 이상의 연령대에는 22.8%로 발병 비율이 매우 큼을 보였다 (Beaver Dam Eye Study) . 또한， 75세 이상 노령층에서는 5.4% 발병율을 보였고， 7. 1%는 말기 황반변성 환자이다. 호주에 사는 코카시안 민족의 1.9%가 말기 황반변성이며， 5년 기간 동안 55세 이하의 젊은 연령대에는 발병율 0% 이나 85세 이상 노령층에서는 18.5%나 발병하였다. 또한， 아시아 말레이 민족의 경우에도 비슷하였다 (Blue Mountain Eye Study ; Progress in retinal' and eye research, 1-15 , 2014) . 한국의 경우, 최근 1년간 습성 황반변성 환자가 7.4배 증가했고, 40 50대 연령대에서의 발병율은 9배나 증가했음을 망막학회가 보고하였다 (2011년) . 그러나 무엇보다도 심각한 것은 황반변성 치료제가 없다는 것이다. 스위스 노바티스의 루센티스는 항체 치료제이며 매우 고가이고 또한 병 진행을 멈추는 정도로 시력이 회복 불가능하다는 단점이 있다. 황반변성은 건식 황반변성과 습식 황반변성으로 분류된다. 건식 황반변성은 황반에 노폐물 덩어리인 두루젠 (drusen)이 쌓여 맥락막 (choroid)과 황반 윗부분 사이의 대사 연결 (metabo l i c connect i on)을 손상시켜 건식 황반변성이 발병한다. 이것이 계속 진행되면 습식 황반변성으로 진전된다. 즉 황반 부위에 노폐물이 쌓여 혈관이 정상적인 기능을 하지 못해 영양분이나 산소 등 필요한 것들이 공급되지 못하므로， 새로운 비정상적인 혈관들이 생성되기 시작한다 (choroidal neovascu l ar i zat i on : CNV) . 이렇게 생성되는 혈관들은 벽이 매우 약해 혈관 속의 단백질 또는 적혈구 등이 황반 부위와 망막으로 스며 나오고 결국엔 혈관 출혈으로 광수용체 ( rod- . cone photoreceptor )와 망막색소 상피세포층이 사멸되는 등 여러 요인이 발생하여 결국 실명에 0、른 ¼Nutr i t i on Research， 34, 95-105 2014； Plos one, 8 e71064, 2013).
망막색소 상피세포 (retinal pigment epithelial cell: RPE)는 비증식성 상태를 유지하고 Bruch' s membrane(BrM)을 지지하여 건강한 시력을 유지하는 중요한 역할을 한다. 망막색소 상피세포에서 분비되는 시스타틴 (cystatin) C는 강력한 시스테인 단백분해 억제제 (cysteine proteinase, inhibitor)로 BrM에서 단백질의 순환 등을 정상적으로 조절하는 중요한 역할을 한다. 그러나 최종당화산물이 과도하게 축적이 되면 시스타틴 C 단백질의 발현과 분비가 저하되어 RPE 기저부분에서 단백질 분해 작용의 불균형을 일으켜 결국 황반변성이 생긴다. 그러므로 최종당화산물의 생성을 억제할 때 황반변성도 예방 (치료)할 수 있음이 보고되었다 (KayP, et al. , IOVS, 2014, 55(2)， 926-34) .
VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)는 망막색소 상피세포층에서 분비되어 Bruch' s membrane (BrM) 주위 부분을 정상적으로 조절하고 맥락 모세혈관 내피세포의 성장과 치밀도를 조절한다. 정상상태에서는 신생혈관생성이 되지 않도록 VEGF 분비가 매우 엄격하게 조절된다. 그러나 VEGF 분비가 엄격하게 조절이 안되면 황반변성의 말기 단계에 이르는 결정적인 인자로 작용한다. VEGF 분비가 비정상적으로 증가하면 비정상적이고 약한 혈관이 생성되어 혈관이 파괴된다 (J. Cell. Mol. Med. , 17, 7 833-843, 2013). 하지정맥류 (varicose vein)는 정맥이 피부 밖으로 보이는 질환으로， 팔다리에 분포되어 있는 정맥은 근육 사이에 놓여있는 큰 심부 정맥 (Deep vein)과 피부 바로 밑으로 보이는 표재 정맥 (Superficial vein), 그라고 이들 두 정맥을 연결하는 관통 정맥 (Perforating vein)으로 분류되며， 이중 하지정맥류는 표재 정맥이 늘어나서 피부 밖으로 돌출되어 보이는 것을 의미하며, 정맥 내부에 혈액의 흐름을 항상 심장 쪽으로 일정하게 유지하게 만드는 판막 (Valve)이 하지 정맥 내의 압력이 높아지는 경우 정맥 벽이 약해지면서 판막이 손상되어 심장으로 가는 혈액이 역류하여 정맥이 늘어남으로써 발생한다 . 계지 (Cinnamomi Twig)는 장나무과의 상록교목 식물인 계수나무 (또는 계피나무라고도 함)의 어린 가지로， 맵고 달며 성질은 따뜻하고 심과 폐와 방광에 작용한다. 위를 른른하게 하고， 중풍올 억제하며 진통， 강심작용이 있고 피부혈관을 확장시키고 한선을 자극하여 땀을 내어 해열작용을 하며 바이러스의 억제작용을 한다고 알려져 있으며， 오한， 발열, 두통， 몸의 통증， 땀이 나지 않는 경우나 심계항진 등에 사용한다. 긴 원주형으로 많은 가지가 있으며 길이는 30 내지 70 cm , 굵은 쪽의 지름은 0.3 내지 1 cm이다. 표면은 홍갈색이나 갈색으로 세로의 능선이 있고 가는 주름과 작은 명어리 모양의 잎과 가지가 붙어있던 흔적이 있으며， 질은 단단하고 부서지기 쉬우며 절단하기 쉽고， 광서， 광동성이 주산지이며 월남， 스리랑카, 인도 등지에서도 재배된다. 계지의 약리실험 결과로 발한작용, 해열작용, 진통작용, 강심작용， 항알레르기작용 및 항바이러스작용 등이 밝혀졌으나， 현재까지 계지의 당뇨합병증 또는 혈관부종 관련 효과가 개시된 바는 없다. 목단피 (Moutan Root Bark)는 오래전부터 사용한 중요한 한약재로서 그 성질이 차서 한방에서 소염성 구어혈약으로서 사용되며， 그 약효는 하복부 장기의 혈관계의 염증, 울혈에 의한 동통， 발열， 화농, 출혈 등에 이용되고， 특히 부인과 영역에서 월경불순, 자궁 및 부속기의 염증, 을혈， 견인통에 대해 소염， 진통， 진경의 효과가 있으며， 치질， 충수염에도 웅용되고 있다. 작약 (Peony Root )은 미나리아재비과의 여러해살이풀로， 백작약 (Radix Paeon i ae Alba)과 적작약 (Radi x Paeon i ae Rubra)이 있다. 백작약과 적작약은 껍질의 유무로 결정하고 있으며， 껍질이 있는 것을 적작약， 껍질을 벗겨낸 것을 백작약이라고 한다 C4/ e/ . Med. Rev. , 6( 5) , ρρ495-499 , 2001) . 백작약은 적작약과 더불어 위， 장의 평활근 및 자궁 평활근에 대해 수축억제효과， 관동맥 확장 효과 및 혈관질환에 대해 죽상경화증 방지， 혈압강하 및 혈류 개선， 항산화 효과 (Ohsugi M et al. , J. Ethnopharmacol . , 67， pplll— 119, 1999)， 혈소판웅집억제효과 (Lin HC et al. , Planta Med, 65, pp595-599, 1999)， 항혈전효과 (Ishida H et al. , Chew. Pharm. Bull, 35(2), pp849-852, 1987) , 고지혈증 방지 (Yang HO et al . , Fitoterapia, 75(1), pp45-49, 2004) 등이 있다. 또한， 작약의 구성성분 중의 일부인 글리코시드 (glycoside)가 뇌경색의 치료에 효과가 있는 것으로 보고되었다 (Yang J et al. , Zhong Yao Cai, 23(2)， PP95-97, 2000)'. 적복령 (Poria)은 소나무 뿌리에서 자라난 균핵으로， 지름 5 내지 7 cm의 공£양 혹은 타원형을 띄—며, 땅 위쎄서는 나무껍질—조각과-함께— -밤색 또는 더러운 흑색을 띤다. 적복령은 코르크화되어 단단하고 0.2 내지 0.5 mm의 두께로 덮여 있고， 방사상으로 균열이 생긴다. 적복령은 거의 맛과 냄새가 없으나， 때로는 연한 점액과 함께 펴지며 요오드에 양성 반웅을 나타낸다. 또한， 적복령은 안정제로 쓰이며， 태열안정의 효과가 있을 뿐만 아니라 몸을 따뜻하게 한다고 전해지고 있다. 이에， 본 발명자들은 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료를 위한 독성 및 부작용이 없이 안전하고 효과적인 천연 약재를 개발하기 위해 노력한 결과， 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물이 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고， 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며， 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고， 다양한 당뇨합병증 동물모델， 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성， 망막부종 및 하지부종을 지연， 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써， 상기 흔합 추출물을 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 밝힘으로써， 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】
[기술적 과제]
본 발명와 목적은 계지 (Cinnamomi Twig) 및 목단피 (Moutan Root Bark) , 계지 및 작약 (Peony Root), 또는 계지 및 적복령 (Poria) 흔합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 (diabetic complications) 및 혈관부종 (angioedema) 예방 및 치료용조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적올 달성하기 위하여， 본 발명은 계지 (Cinnamomi Twig) 및 목단피 (Moutan Root Bark) , 계지 및 작약 (Peony Root), 또는 계지 및 적복령 (Poria) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 (diabetic complications) 및 혈관부종 (angioedema) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 흔합 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 흔합 추출물을 당뇨합병증 및 혈관부종에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 및 혈관부종 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 흔합 추출물을 당뇨합병증 및 혈관부종에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 및 혈관부종 개선 방법올 제공한다.
또한， 본 발명은 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 상기 흔합 추출물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 상기 흔합 추출물의 용도를 제공한다.
【유리한 효과】 본 발명의 계지 (Cinnamomi Twig) 및 목단피 (Moutan Root Bark) , 계지 및 작약 (Peony Root), 또는 계지 및 적복령 (Poria) 흔합 추출물은 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고， 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며， 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고， 다양한 당뇨합병증 동물모델， 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성, 망막부종 및 하지부종을 지연， 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써, 상기 흔합 추출물을 당뇨병성 망막증， 당뇨병성 신증， 당뇨병성 신경병증 등을 포함하는 당뇨합병증 (diabetic complications) 및 황반 (망막)부종， 황반변성 및 하지정맥류를 포함하는 혈관부종 (angioedema)의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명]
도 la는 CM04 계지 및 목단피 (1:8) 추출물)， 도 lb는 CM04-1(계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물)， 도 lc는 CPA4(계지 및 작약 (1:8) 추출물) 및 도 Id는 CPA4-K계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물)의 HPLC 분석하여 성분을 분석하여 나타낸 도이다. 도 2는 글리코알데히드 (glycoaldehyde)를 처리한 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)에서 최종당화산물 생성 억제 효능을 확인한 도이다:
AGEs: 최종당화산물 (advanced glycation endproducts)；
CM04: 계지 및 목단피 (1:8) 추출물；
CM04-1: 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 ;
CPA4: 계지 및 작약 (1:8) 추출물;
CPA4-1: 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물;
**p<0.01 vs Non-AGEs； ***p<0.001 vs Non-AGEs；
#p<0.05 vs AGEs；
##p<0.01 vs AGEs; 및
, ###p<0.001 vs AGEs. 도 3은 '고혈당 환경에서 사람망막색소상피 세포주에서 계지 및 목단피 (1:2) 추출물 (CM02), 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04), 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1), 계지 및 작약 (2:1) 열수 추출물 (CPA1-1), 계지 및 작약 (1:2) 열수 추출물 (CPA2-1), 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4), 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)의 최종당화산물의 생성 억제 효과를 확인한 도이다:
HG: 고혈당 처리군;
BSA: 소혈청알부민 (bovine serum albumin) 처리군;
CM02: 계지 및 목단피 (1:2) 추출물 (CM02);
CM04: 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04);
CM04-1: 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1);
CPA1-1: 계지 및 작약 (2:1) 열수 추출물 (CPA1-1);
CPA2-1: 계지 및 작약 (1:2) 열수 추출물 (CPA2-1);
CPA4: 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4);
CPA4-1: 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1);
AG: 양성대조군인 아미노구아니딘 (aminoguanidine) 처리군:
*p<0.05 vs CON;
**p<0.01 vs CON;
***p<0.001 vs CON;
#p<0.05 vs HG;
##p<0.01 vs HG; 및
###p<0.001 vs HG. 도 4는 제 2형 당뇨모델 dbldb 마우스에서 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 증 혈액망막장벽 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군 (nondi abet ic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군 (C57BL/KsJ-LeprrfM diabetic 마우스);
FENO-100： 페노파이브레이트 (ienofibrate) 100 mg/kg/day투여군； CM04- 1-100： CM04-1 100 mg/kg/day투여군;
CM04- 1-250： CM04-1 250 mg/kg/day투여군;
CPA4- 1-100： CPA4-1 100 mg/kg/day투여군； 및
CPA4- 1-250： CPA4-1 250 mg/kg/day투여군.
도 5는 제 2형 당뇨모델 db/db 마우스에서 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4— 1)을 12주 동안.투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 무세포성 모세혈관 형성 예방 효능을 확인한 도이다：
N0R: 정상 동물군 (nondi abet ic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군
Figure imgf000014_0001
diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트 100 mg/kg/day투여군;
CM04- 1-100： CM04-1 100 mg/kg/day투여군;
CM04- 1-250： CM04-1 250 mg/kg/day투여군;
CPA4- 1-100： CPA4-1 100 mg/kg/day투여군; 및
CPA4- 1-250： CPA4-1 250 mg/kg/day투여군.
도 6은 제 2형 당뇨모델 db/db 마우스에서 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)을 12주 동안 투여 후 당뇨병성 망막증 예방 효능 중 세포간 치밀이음부 단백질 (tight-junction protein)인 오클루딘 (occludin) 손상 예방 효능을 확인한 도이다: NOR: 정상 동물군 (nondi abet ic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군 (CS BL/KsJ-Lepr ^ diabetic 마우스);
FENO-100: 페노파이브레이트 100 mg/kg/day투여군;
CM04- 1-100： CM04-1 100 mg/kg/day투여군;
CM04- 1-250： CM04-1 250 mg/kg/day투여군;
CPA4- 1-100： CPA4-1 100 mg/kg/day투여군； 및
CPA4- 1-250：. CPA4-1 250 mg/kg/day투여군. 도 7은 제 2형 당뇨모델 동물인 db/db 마우스에 메트포민 (metformin)을 12주 간 투여하면서 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 혈액망막장벽 손상 치료 효능을 확인한 도이다:
N0R: 정상 동물군 (nondi abet ic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군 (CS BL/KsJ-Lepr0^6 diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day투여군； -
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CM04-100: 메트포민 및 CM04 100 mg/kg/day투여군;
Met+CM04-250: 메트포민 및 CM04250 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4250 mg/kg/day투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM. 도 8은 게 2형 당뇨모델 동물인 db/db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 무세포성 모세혈관 형성 억제 효능을 확인한 도이다: NOR: 정상 동물군 (nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군 (CSYBL/KsJ-Lepr^^* diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day 투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CM04-100: 메트포민 및 CM04 100 mg/kg/day투여군;
Met+CM04-250: 메트포민 및 CM04250 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4250 mg/kg/day투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM. 도 9는 제 2형 당뇨모델 동물인 db/db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후， 12주 동안 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 망막증 치료효과 중 세포간 치밀이음부 단백질의 손상 치료 효능을 확인한 도이며， 도 9a는 클라우딘 (claudin)-5의 손상 여부를 염색으로 확인한 것이고， 도 9b는 웨스턴 블랏팅으로 오클루딘 단백질의 변화를 확인한 도이다:
NOR: 정상 동물군 (nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군 (CS BL/KsJ-Lepr / diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day투여군;
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CM04-100: 메트포민 및 CM04 100 mg/kg/day투여군;
Met+CMG4-250: 메트포민 및 CM04250 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4250 mg/kg/day투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및 #p<0.05 vs DM. 도 10 및 도 11은 게 2형 당뇨모델 동물인 db/db 마우스에 메트포민을 12주 간 투여하여 혈당을 조절한 후, 12주 동안 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)을 메트포민과 병용투여한 후 당뇨병성 신증개선 효과를 분석한 도이다:
NOR: 정상 동물군 (nondiabetic heterozygote db/+ 마우스);
DM: 당뇨 동물군 (CSYBL/KsJ-Lepr^^ diabetic 마우스);
MET: 메트포민 350 mg/kg/day투여군; .
Met+Feno: 메트포민 350 mg/kg/day 및 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군;
Met+CM04-100: 메트포민 및 CM04 100 mg/kg/day투여군;
Met+CM04-250: 메트포민 및 CM04250 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-100: 메트포민 및 CPA4 100 mg/kg/day투여군;
Met+CPA4-250: 메트포민 및 CPA4250 mg/kg/day투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs DM (또는 db/db) . 도 12는 丽 U유도설치류 동물모델에서 계지 및 목단피 (1:8)추출물 (CM04) 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)의 광수용체 세포 (photoreceptor cell) (황반변성)의 손상 예방 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
MNU: N-methyl-N-nitrosourea(MNU) 유도 동물모델;
CM04-100: MNU유도 동물모델 + CM04 100 mg/kg/day투여군;
CM04-1-50: MNU 유도 동물모델 + CM04-1 50 mg/kg/day투여군;
CM04- 1-100： MNU 유도 동물모델 + CM04-1 100 mg/kg/day투여군;
CPA4-1-50: 丽 U유도 동물모델 + CPA4— 1 50 mg/kg/day투여군; CPA4-1-100: MNU유도 동물모델 + CPA4— 1 100 mg/kg/day투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs MNU. 도 13은 NaI03 유도설치류 동물모델에서 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및. 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)의 망막색소상피세포 (황반변성)의 손상 예방 효능을 확인한 도아다:
Normal: C57BL/6 정상 마우스;
NaI03: NaI03 유도 동물모델;
CM04-1-50: NaI03 유도 동물모델 + CM04-1 50 mg/kg/day 투여군;
CM04- 1-100： NaI03 유도 동물모델 + CM04-1 100 mg/kg/day 투여군;
CPA4-1-50: NaI03 유도 동물모델 + CPA4-1 50 mg/kg/day투여군;
CPA4-1-100: NaI03 유도 동물모델 + CPA4-1 100 mg/kg/day투여군;
*p<0.05 vs NOR; 및
#p<0.05 vs NaI03. 도 14는 /i//r_/_ 황반변성 동물모델에서 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)의 망막신생혈관 (Subret inal neovascula rization) 생성 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr^-: 습성 황반변성 마우스 모델;
CM04-100: //r_/—마우스 + CM04 100 mg/kg/day투여군;
CPA4-100: /f/r_/_마우스 + CPA4 100 mg/kg/day투여군;
*p<0.05 vs CON; 및
#p<0.05 vs Vldlr^'. 도 15는 황반변성 동물모델에서 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)의 망막색소상피 세포 손상 억제 효능을 확인한 도이다:
NOR: C57BL/6 정상 마우스;
VJdJrv': 습성 황반변성 마우스 모델;
CM04-100: W//r— /_마우스 + CM04 100 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4-100: /ΰ교 마우스 + CPA4 100 mg/kg/day투여군. 도 16은 /c — /—마우스의 망막에서 계지 및 목단피 (1:8)추출물 (CM04)및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)의 VEGF 발현 (질은 보라색 염색; 화살표 표시) 억제 효능을 확인한 도이다:
Nor: C57BL/6 정상 마우스;
Vldlr^: 습성 황반변성 마우스 모델;
CM04-100: V/c//r— 마우스 + CM04 100 mg/kg/day투여군; 및
CPA4-100: /i//r/_마우스 + CPA4 100 mg/kg/day투여군. 도 17은 707 ·— /_마우스의 망막에서 계지 및 목단피 (1:8)추출물 (CM04)및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)의 신생혈관 억제 효능을 확인한 도이다:
Vldl ^: 습성 황반변성 마우스 모델;
CM04-50: ////ᅳ— Λ마우스 + CM04 50 mg/kg/day투여군;
CM04-100: /i/7r —마우스 + CM04 100 mg/kg/day투여군;
CPA4-50: /o7 v—마우스 + CPA4 50 mg/kg/day 투여군； 및
CPA4-100: i//r_/—마우스 + CPA4 100 mg/kg/day투여군. 도 18은 레이저로 유도된 맥락막 신생혈관 (choroidal neovascularization) 렛트의 망막하 (subret inal )에서 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4 의 신생혈관 억제 효능을 확인한 도이다:
CNV: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 모델;
CM04: 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 + CM04100 mg/kg/day투여군; CPA4： 레이저 처리로 습성 황반변성 마우스 + CPA4100 mg/kg/day투여군; 및 ' '
- #P<0.G5 vs CNV. , 도 19는 포르말린 (formalin)으로 하지정맥을 유발한 동물모델에서 하지정맥 예방 및 치료 효능을 확인한 도이다.
Normal: 정상 동물군 (SD rat);
Edema: 하지부종 유발 동물군;
CM04-1-50: 하지부종 유발군 + CM04-1 50 mg/kg/day투여군;
CM04- 1-100： 하지부종 유발군 + CM04-1 100 mg/kg/day투여군;
CPA4=l-50: 하지부종 유발군 + CPA4-1 50 mg/kg/day 투여군; 및
CPA4- 1-100： 하지부종 유발군 + CPA4-1 100 mg/kg/day투여군.
【발명와실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다: 본 발명은 계지 (Cinnamomi Twig) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 (diabetic com lications) 및 혈관부종 (angioedema) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 목단피 (Moutan Root Bark) , 작약 (Peony Root) 및 적복령 (Poria)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 흔합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고， 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄효능이 있으며， 또한 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제한다.
또한， 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증， 당뇨성 백내장， 당뇨성 신증， 당뇨성 신경병증， 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 심장병， 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한， 상기 혈관부종죤 황반변성， 황반부종, 망막변성 및 하지정맥류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령 흔합 추출물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 계지 및 목단피， 계치 및 작약， 또는 계지 및 적복령을 각각 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계 ; 및
3 단계一 2)와 여과한—추출물을왐압농축하는—단계 .——―
상기 방법에 있어서， 단계 1)의 계지, 목단피， 작약 및 적복령은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 흔합 추출물은 계지 및 목단피를 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 1:1 내지 1:8 중량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 흔합 추출물은 계지 및 작약은 2:1내지 1:10중량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고， 2:1 내지 1:8 증량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 적복령은 2:1 내지 1:2 중량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고， 1:1 중량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 추출용매는 물 알코올 또는 이들의 흔합물을 사용하는 것이 바람직하다ᅳ 상기 알코올로는 d 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며， 저급 알코올로는 30%에탄을， 50%에탄을， 70%에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 감압고은 추출， 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출， 냉침 추출，상온추출，초음파 추출 또는 증기 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 용매의 양은 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령의 분량의 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 30 내지 100 °C인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 추출시간은 2 내지 48시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아을러， 추출 회수는 2 내지 5회인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서， 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 건조는 감압건조， 진공건조， 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 흔합 추출물은 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령를 흔합하여 추출물을 제조할 수 있고， 계지， 목단피， 작약 또는 적복령을 각각 추출한 후 흔합하여 혼합 추출물을 제조할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령을 여러 비율로 흔합하여 흔합 추출물을 제조하였고， 이의 성분을 분석하였으며 (도 la 내지 도 Id 참조)， 각 추출물에서 패오니플로린 (Paeoni f lor in)의 함량을 확인하였고 (표 1 참조)， 이를 이용하여 시험관 내에서 최종당화산물 생성 억제 효능을 확인한 결과， 본 발명의 흔합 추출물이 양성대조군과 비교하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 현저하게 나타났으며， 특히， 양성대조군인 아미노구아니딘이 합성 단일화합물인 것을 감안할 때 본 발명의 흔합 추출물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 매우 우수함을 확인하였다 (표 2 참조) .
또한, 본 발명의 흔합 추출물의 글라코알데히드 처리 후 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 추출물 (CM04 , CM04-1)과 계지 및 작약 추출물 (CPA4, CPA4-1)들은 농도 의존적으로 ( 1 / g/i , 5 g/i , 10 s/ml , 20 ug/mi„ 50 //g/ ) 최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였고 (도 2 참조) , 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄 효능을 확인한 결과， 본 발명의 흔합 추출물이 양성대조군인 ALT— 711보다 교차결합 파쇄 효능이 우수함을 나타냈으며， 특히， 양성대조군인 ALT-711이 합성 단일화합물인 것을 감안할 때 본 발명의 혼합 추출물은 교차결합 파쇄 효능아 매우 우수함을 확인하였다 (표 3 참조).
또한, 본 발명의 흔합 추출물의 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인한 결과 본 발명의 계지 및 목단피 추출물 (CM02, CM04, CM04-1) , 계지 및 작약 추출물 (CPAl-l, CPA2-1, CPA4 CPA4-1)은 고혈당 환경에 있는 사람 망막색소 상피세포에서도 농도 의존적으로 (10
Figure imgf000023_0001
최종당화산물 생성을 억제함을 확인하였다 (도 3 참조).
상기 결과들을 토대로 계지 및 목단피 추출물， 계지 및 작약 추출물， 계지 및 적복령 추출물은 최종당화산물 생성을 억제하고， 글리코알데히드로 코팅한 ECM에서 최종당화산물의 생성을 억제하였고， 또한， 이미 생성된 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄하몌 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 흔합 추출물의 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CM04-1-100, CM04- 1-250 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CPA4-1-100은 망막혈관으로부터 형광물질와 유출을 유의성 있게 예방하는 것을 확인하였고 (도 4 참조)， 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CM04-1-100, CM04- 1-250 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CPA4-1-100은 무세포성 모세혈관의 형성을 유의성 있게 예방하는 것을 확인하였으며 (도 5 참조)， 세포간 치밀이음부 단백질인 오클루딘 (occludin)의 손상 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CM04-1-100, CM04-1-250은 오클루딘의 소실된 곳이 없음을 확인하였다 (도 6 참조).
또한， 본 발명의 흔합 추출물의 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 18주와 24주에 망막혈관으로부터 형광물질의 유출을 유의성있게 막아 치료 효과가 있는 것을 확인하였고 (도 7 참조), 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04ᅳ 100, CM04-250과 메트포민을 병용투여한 군은 유의성 있게 무세포성 모세혈관 형성을 억제하는 것을 확인하였으며 (도 8 참조)， 세포간 치밀이음부 단백질인 클라우딘 (claudin)ᅳ 5의 손상 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 클라우딘 -5의 소실된 곳이 없음을 확인하였고 (도 9a참조)， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 클라우딘 -5가 유의성있게 증가하는것을 확인하였다 (도 9b 참조).
또한， 본 발명의 흔합 추출물의 고혈당에 의한 신기능 저하 예방 및 치료 효능을 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 알부민뇨 및 크레아틴 청소율을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였고 (도 10 참조), 당뇨병성 신증에서 나 나는 형태학적 변화인 사구체 경화증을 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여가 이를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 11 참조).
또한， 본 발명의 흔합 추출물의 황반변성 예방 및 치료 효능을 확안하기 위해 광수용체 세포 (photoreceptor cell)의 손상 및 변성 여부를 망막 조직의 외과립층 (outer nuclear layer)의 두께 변화로 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04, CM04-1 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 MNU에 의한 광수용체 세포의 손상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였고 (도 12 참조)， 망막색소상피세포의 손상 및 변성을 망막조직의 외과립층 (outer nuclear layer)의 folding개수로 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물인 CM04-1 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 NaOI3에 의해 유도된 착색된 상피 세포의 손상을 억제하여 외과립층이 휘어지는 현상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 13 참조).
또한, 본 발명의 혼합 추출물의 망막 혈관의 부종을 측정하여 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인한 결과， 신생혈관 생성을 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04 투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였고 (도 14 참조)， 망막색소상피세포의 형태학적 구조의 변성 유무를 확인한 결과, 망막색소상피세포의 변성을 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) —추출물ᅳ인— GM04투여에 와해——현자히—억—제—돠는—것을 확언—하였ᅩ으쪄 (도 -15—참조—)，—— 망막에서의 VEGF 발현 억제 효과를 확인한 결과， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4의 투여로 현저히 억제되는 것을 확인하였다 (도 16 참조).
또한. 본 발명의 흔합 추출물의 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인한 결과，신생혈관 생성을 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8)추출물인 CM04100mg/kg 투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였고 (도 17참조)， 망막하 부위의 신생혈관 생성 억제 효과를 확인한 결과， 신생 ί관 생성이 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04U00 nig/kg) 투여에 의해 유의적으로 억제되었고， 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4(100 mg/kg) 투여에 의해 억제되는 경향을 보이는 것을 확인하였으며 (도 18 참조)， 망막신경조직의 광수용체 세포의 손상에 의한 외과립층 두께의 변화를 확인한 결과， 패오니플로린의 함량이 가장 적은 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04(2.7<¾)의 효능이 매우 우수하다는 것은 계지 및 목단피 추출물， 또는 계지 및 작약 추출물의 효능이 단지 패오니플로린으로 인한 것이 아니라， 계지 및 목단피 추출물， 또는 계지 및 작약 추출물에 존재하는 수많은 성분들의 시너지 효과임을 확인하였다 (표 4 내지 표 5 참조).
또한， 본 발명의 흔합 추출물의 하지부종 유발 전 및 후의 부종 상태를 확인한 결과， 하지 부종에 의한 크기의 변화가 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 추출물인 CM04-1에 의해서는 크게 억제되지 않았고， 계지 및 작약 ( 1 : 8) 추출물인 CPA4-1에 의해서는 농도 의존적이며 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 19 참조) .
따라서, 본 발명의 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물이 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며， 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고， 다양한 당뇨합병증 동물모델， 황반변성 동물모 1 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성， 망막부종 및 하지부종을 지연， 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써， 상기 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령. 혼합 추출물은 당뇨합방증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 흔합 추출물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을' 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정셀를로오스， 유당， 포비돈， 콜로이달실리콘디옥사이드， 인산수소칼슘， 락토스， 만니를, 엿, 아라비아고무， 전호화전분， 옥수수전분， 분말셀를로오스, 히드록시프로필셀를로오스， 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄， 스테아린산， 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄， 스테아린산칼슘， 백당， 덱스트로스， 소르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0. 1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉， 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제, 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정쎄， 환제, 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 본 발명의 흔합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트 (Calc ium carbonate) , 수크로스 (Sucrose)， 락토오스 (Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한， 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제 , 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제 ,현탁제，유쎄，동결건조제제，좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골, 트원 ( tween) 61， 카카오지， 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며， 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사， 직장내주사， 피하주사, 정맥주사， 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령， 성별, 건강상태， 식이, 투여시간， 투여방법， 배설율 및 잘환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중， 연령， 성별， 건강상태, 식이， 투여시간， 투여방법， 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며， 일일 투여량은 본 발명의 흔합 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 mg/kg이고， 바람직하게는 0.001내지 10 mg/kg이며， 하루 1내지 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당뇨합병증 또는 혈관부종 예방 및 치료를 위하여 ' 단독으로, 또는 수술， 방사선 치료， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 계지 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 추출물은 ^단피， 작약 및 적복령으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를추가적으로 흔합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄효능이 있으며， 또한 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제한다.
또한, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증， 당뇨성 백내장， 당뇨성 신증， 당뇨성 신경병증， 당뇨성 족부궤양， 당뇨성 심장병， 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한， 상기 혈관부종은 황반변성， 황반부종， 망막변성 및 하지정맥류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령 흔합 추출물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령을 각각 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하는 단계 .
상기 방법에 있어서， 단계 1)의 계지, 목단피， 작약 및 적복령은 재배한 것.또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 혼합 추출물은 계지 및 목단피를 2:1 내지 1:10 중량비율로 혼합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고， 1:1 내지 1:8 중량비을로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 흔합 추출물은 계지 및 작약은 2:1내지 1:10중량비을로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고， 2:1 내지 1:8 중량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 흔합 추출물은 계지 및 적복령은 2 : 1 내지 1 : 2 중량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 바람직하고, 1 : 1 중량비율로 흔합한 후 추출용매로 추출된 것이 보다 바람직하다.
상기 추출용매는 물， 알코을 또는 이들의 흔합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 d 내지 C2 저급 알코을을 이용하는 것이 바람직하며，저급 알코올로는 30%에탄올， 50%에탄을 ·, 70%에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 감압고온 추출， 열탕 추출, 환류 추출， 열수 추출， 넁침 추출，상온추출，초음파 추출 또는 증기 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 용매의 양은 계지 및 목단피， 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령의 분량의 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 30 내지 ioo°c인 것아 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 추출시간은 2 내지 48사간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아을러， 추출 회수는 2 내지 5회인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 잔공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 건조는 감압건조, 진공건조， 비등건조， 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 흔합 추출물은 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령를 흔합하여 추출물을 제조할 수 있고, 계지， 목단피， 작약 또는 적복령을 각각추출한 후 흔합하여 흔합 추출물을 제조할 수 있다.
본.발명의 계지 및 목단피， 계지 및 작약, 또는 계지 및 적복령 흔합 추출물은 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령 흔합 추출물이 만성적 당뇨상태에서 발생하는 과도한 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합 파쇄효능을 나타내며, 고혈당 환경 또는 노화 환경에 처한 사람망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성억제 효능이 우수하고， 다양한 당뇨합병증 동물모델， 황반변성 동물모델 및 하지부종 동물모델에서 당뇨합병증과 황반변성， 망막부종 및 하지부종을 지연, 예방 및 치료 효능이 우수한 것을 확인함으로써， 상기 계지 및 목단피， 계지 및 작약， 또는 계지 및 적복령 흔합 추출물은 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품으로사용될 수 있다. . 상기 건강기능식품은 정제， 캡슐， 분말， 과립, 액상， 환 등의 형태로 제조， 가공될 수 있으나， 이메 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조， 가공될 수 있다.
본 발명의 혼합 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 흔합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 작합하게 결정될 수 있다. 일반적으로， 건강식품 중의 상기 혼합 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0. 1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며， 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 흔합 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어， 포도당， 과당 등; 디사카라이드， 예를 들어 말토스， 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당， 및 자일리를， 소르비를, 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미게 (타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 흔합 추출물은 여러 가지 영양제， 비타민, 광물 (전해질)， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 증진제 (치즈， 초콜릿 등)， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산, 보호성 콜로이드 증점제， pH 조절제， 안정화제， 방부제， 글리세린， 알코올， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 자근 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이라한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 흔합 추출물 100 중량부 당 0. 1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단 하겨——살시—예一및ᅳ실험—예는본——발명을—예시—하는—것—일——뿐—,—본—발명의 -—— 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. .
<실시예 1> 계지 (Cinnamomi Twig) 및 목단피 (Moutan Root Bark) 흔합 추출물의 제조
계지 및 목단피는 대전 백제당 (대한민국)에서 구입하여 아래와 같이 실시예를 수행하였으며， 한국한의학연구원 당뇨합병증 연구팀의 저은실에 보관하였다. <1-1> 계지 및 목단피 (1: 1) 추출물 (CM01)의 제조
계지 및 목단피 추출물 (CM01)은 계지 12 g과 목단피 12 g을 1 : 1로 흔합하여 총 24 g을 50%에탄올 144 ml에 넣어 50 °C정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다. <1-2> 계지 및 목단피 (1: 1) 열수 추출물 (CM01-1)의 제조
계지 및 목단피 열수 추출물 (CM01— 1)은 계지 90 g과 목단피 90 g을 1 : 1로 흔합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다. <l-3>계지 및 목단피 (1:2) 추출물 (CM02)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로， 계지 및 목단피 추출물 (CM02)은 계지 10 g과 목단피 20 g을 1 : 2로 흔합하여 총 30 g을 50%에탄올 180 ml에 넣어 501 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<1-4>계지 및 목단피 (1:2) 열수추출물 (CM02-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 계지 및 목단피 열수 추출물 (CM02-1)은 계지 60 g과 목단피 120 g을 1 : 1로 흔합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<1-5>계지 및 목단피 (1:4) 추출물 (CM03)의 제조
상기 실시예 <1_1>과 동일한 방법으로， 계지 및 목단피 추출물 (CM03)은 계지 6 g과 목단피 24 g을 1 : 4로 흔합하여 총 30 g을 50%에탄올 180 ml에 넣어 50 °C 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<1-6>계지 및 목단피 (1:4) 열수추출물 (CM03-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 계지 및 목단피 열수 추출물 (CM03-1)은 계지 36 g과 목단피 144 g을 1 : 4로 흔합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<1-7>계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04)의 제조
상기 실시예 <1_1>과 동일한 방법으로， 계지 및 목단피 추출물 (CM04)은 계지 3.5 g과 목단피 28 g을 1 : 8로 흔합하여 총 31.5 g을 50% 에탄올 190 ml에 넣어 50°C 정도에사 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<1-8>계지 및 목단피 (1:8) 열수추출물 (CM04-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로， 계지 및 목단피 열수 추출물 (CM04-1)은 계지 20 g과 목단피 160 g을 1 : 8로 흔합하여 총 180 g을' 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<실시예 2>계지 및 작약 (Peony Root ) 흔합추출물의 제조
계지 및 작약은 대전 백제당 (대한민국)에서 구입하여 아래와 같미 실시예를 수행하였으며， 한국한의학연구원 당뇨합병증 연구팀의 저온실에 보관하였다.
<2-1>계지 및 작약 (2: 1) 추출물 (CPA1)의 제조
상기 실시예 <1-1〉과 동일한 방법으로， 계지 및 작약 추출물 (CPA1)은 계지 16 g과 작약 8 g을 2 : 1로 흔합하여 총 24 g을 50% 에탄올 144 ml에 넣어 50 °C 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<2-2>계지 및 작약 (2: 1) 열수추출물 (CPA1-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 계지 및 작약 열수 추출물 (CPA1— 1)은 계지 120 g과 목단피 60 g을 2 : 1로 흔합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
<2-3>계자및 작약 (1:2) 추출물 (CPA2)의 제조
상기 실시예 <1-1〉과 동일한 방법으로， 계지 및 작약 추출물 (CPA2)은 계지 10 g과 작약 20 g을 1 : 2로 흔합하여 총 30 g을 50% 에탄올 180 ml에 넣어 50 °C 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<2-4>계지 및 작약 (1:2) 열수추출물 (CPA2-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 계지 및 작약 열수 추출물 (CPA2-1)은 계지 60 g과 작약. 120 g을 1 : 2로 흔합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다. <2-5>계지 및 작약 (1:4) 추출물 (CPA3)의 제조
상기 실시예 <1-1〉과 동일한 방법으로， 계지 및 작약 추출물 (CPA3)은 계지 6 g과 작약 24 g을 1 : 4로 흔합하여 총 30 g을 50% 에탄올 180 ml에 넣어 50 °C 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
5
<2-6>계지 및 작약 (1:4) 열수추출물 (CPA3-1)의 제조
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로， 계지 및 작약 열수 추출물 (CPA3-1)은 계지 36 g과 작약 144 g을 1 : 4로 혼합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수 추출하여 제조하였다.
0
<2-7>계지 및 작약 (1:8)專출물 (CPA4)의 제조
상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로， 계지 및 작약 추출물 (CPA4)은 계지 3.5 g과 작약 28 g을 1 : 8로 흔합하여 총 31.5 g을 50% 에탄올 190 ml에 넣어 50°C 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
5
<2-8>계지 및 작약 (1:8) 열수추출물 (CPA4-1)와제조
상기 실시예 <1-2〉와 동일한 방법으로， 계지 및 작약 열수 추출물 (CPA4-1)은 계지 20 g과 작약 160 g을 1 : 8로 흔합하여 총 180 g을 정제수 1080 ml에 넣어 약탕기에서 약 2시간 동안 열수추출하여 제조하였다.
:0
<실시예 3>계지 및 적복랑 (Poria) 흔합추출물의 제조
계지 및 적복령은 대전 백제당 (대한민국)에서 구입하여 아래와 같이 실시예를 수행하였으며， 한국한의학연구원 당뇨합병증 연구팀의 저은실에 보관하였다.
:5
<3-1>계지 및 적복령 (1: 1) 추출물 (CP0)의 제조
상기 실시예 <1ᅳ 1>과 동일한 방법으로， 계지 및 적복령 추출물 (CP0)은 계지 12 g과 적복령 12 g을 1 : 1로 흔합하여 총 24 g을 50%에탄올 144 ml에 넣어 50 °C 정도에서 약 3시간 동안 2회 반복 환류추출하여 제조하였다.
<실시예 4> 계지， 적복령， 목단피， 적작약 및 도인 흔합 추출물 (KBT)의 제조
대조군으로 사용된 추출물 KBT는 계지， 적복령， 목단피， 적적약 및 도인을 각각 동량을 혼합하여 10배의 증류수를 가한 다음， 초고속 진공 저온 농축 추출기로 약 2시간 정도 전탕하여 감압고온 추출 후 건조하여 제조하였다. <실시예 5> 계지， 작약， 감초， 생강 및 대조 흔합추출물 (KJT)의 제조 대조군으로 사용된 추출물 KJT는 계지 , 작약， 감초, 생강 및 대조를 각각 3:2: 1:1:1의 비율로 흔합하여 10배의 증류수를 가한 다음， 초고속 진공 저온 농축 추출기로 약 2시간 정도 전탕하여 감압고온 추출 후 건조하여 제조하였다.
-
<실시예 6> 계지 및 목단피 추출물， 계지 및 작약추출물의 성분 분석 본 발명자들은 계지 및 목단피 추출물 (CM04), 계지 및 목단피 열수 추출물 (CM04-1), 계지 및 작약 추출물 (CPA4), 계지 및 작약 열수 추출물 (CPA4— 1)의 성분을 확인하기 위해 HPLC분석을 수행하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이， 계지 및 목단피 추출물 (CM04), 계지 및 목단피 열수 추출물 (CM04-1)의 지표성분이 갈릭산 (Gallic acid), 옥시패오니플로린 (Oxypaeonif lorin), 알비프로린 (Albi f lor in)， 패오니플로린 (Paeoniflorin), 벤조익산 (Benzoic acid)， 신남산 (Cinnamic acid)ᅳ 신남알데하이드띠！！！！ ^ ^ ^， 패오눌 (Paeonol)인 것을 확인하였고 (도 la 내지 도 lb), 계지 및 작약 추출물 (CPA4), 계지 및 작약 열수 추출물 (CPA4-1)의 지표성분은 갈릭산, 옥시패오니플로린， 알비프로린, 패오니플로린， 벤조익산， 신남산， 신남알데하이드인 것을 확인하였으며 (도 lc 내지 도 Id), 하기 표 1에 나타낸 바와 같이， 각 추출물에서 패오니플로린의 함량을 확인하였다 (표 1). 【표 1]
Figure imgf000036_0002
<실험예 1> 최종당화산물 (advanced glycat ion endproducts , AGEs) 생성 억제 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 5〉에서 제조한 계지를 포함한 흔합 추출물의 시험관 내 최종당화산물 생성 억제 효능을 분석하였다. 구체적으로， 단백질원은 50 mM인산완충용액 (phosphate buf fer ; 7.4)에 용해한 10 mg/ml 소혈청알부민 (bovine serum albumin; BSA, Sigma , 미국)을， 당원으로는 0.2 M 과당 및 0.2 M 글루코스가 혼합된 용액을 사용하였다. 상기 <실시예〉의 추출물과 양성대조군 (아미노구아니딘)을 0.2% 디메틸설폭사이드 (Dimethyl sul foxide , DMS0)에 용해한 후 15%트윈 ( tween) 80에 다시 용해하였다. 이와 같이 제조한 단백질원， 당원 및 추출물을 흔합하여 총
1 ml로 조제한 후 37°C에서 7일간 배양하여 당화 반웅을 시켰다. 이때， 항박테리아제 0.02% 소디움 아자이드 (sodium azide)를 넣어 박테리아 생성을 방지하였다. 배양 후 형광도를 spectrof luorometr i c detector (Bio-TE , 미국)을 이용하여 흡수파장 350 rai , 방출파장 450 nm로 측정하였다. 이를 하기 수학식 1과 같이 계산하였고, 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
【수학식 11
Figure imgf000036_0001
그 결과 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 , 계지 및 목단피 추출물인 CM01, CM02, CM03, CM04는 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 각각 17배， 21.3배, 21.3배， 22.7배 우수함을확인하였고， 계지 및 작약 추출물인 CPAl, CPA2, CPA3, CPA4는 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 각각 8배， 10.9배， 10.1배， 12.1배 우수함을 확인하였으며， 계지 및 적복령 추출물 (CP0)은 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 최종당화산물 생성 억제 효능이 4배 정도 우수함을 확인하였다 (표 2).
또한, 상기 <실시예 4>의 추출물 (KBT)과 비교하였을 때， 계지 및 목단피 추출물인 CMOl, CM02, CM03, CM04, 계지 및 작약 추출물인 CPAl, CPA2, CPA3, CPA4, 및 계지 및 적복령 추출물 (CP0)은 각각 4.8배， 5.9배， 5.9배' 6.3배， 2.3배， 3.0배, 2.8배, 3.4배, 1.1배 최종당화산물 생성 억제 효능이 우수한 것을 확인하였고， 상기 <실시예 5>의 추출물 (KJT)과 비교하였을 때， 계지 및 목단피 추출물인 CMOl, CM02, CM03, CM04, 계지 및 작약 추출물인 CPAl, CPA2, CPA3, CPA4, 및 계지 및 적복령 추출물 (CP0)은 각각 8.5배, 10.4배， 10.4배, 10.4배， 11· 1배， 4.1배， 5.4배， 8.6배， 2.0배 최종당화산물 생성 억제 효능이 우수한 것을 확인하였다 (표 2).
따라서， 양성대조군인 아미노구아니딘이 합성단일화합물인 것을 감안할 때 본 발명의 계지 및 목단피 추출물， 계지 및 작약 추출물, 또는 계지 및 적복령 흔합 추출물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 매우 우수함을 확인하였고， 동시에 본 발명의 계지 및 목단피 추출물， 계지 및 작약 추출물， 또는 계지 및 적복령 혼합 추출물은 상기 <실시예 4>의 추출물 (KBT) 또는 상기 <실시예 5>의 추출물 (KJT) 보다 매우 우수한 것을 확인하였다.
【표 2】
시료 IC50(ug/ml ) 효능 비교
양성대조군 (AG) <실시예 4>의 <실시예 5>의 대비 추출물 (KBT) 추출물 (KJT)
대비 대비
Figure imgf000038_0001
<실험예 2> 글리코알데히드 (glycoaldehyde)흩 처리한 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)에서 최종당화산물 생성 억제 효능 확인 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2〉에서 제조한 혼합 추출물의 글리코알데히드 처리 후 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인하였다.
세포외기질 (Extracellular Matrix, ECMXSigma-Aldrich, cat. no. c-3867)을 10/zg/cm2로 하여 96검은색 웰 플레이트 (black wel 1 plate)에 분주한 후， 밤새 4°C에서 코팅하였다. 다음날 코팅된 플레이트의 ECM을 제거하고， 실온에서 완전히 건조시킨 후 100 mM 글리코알데히드 (Sigma-Aldrich)와 미리 희석된 다양한 농도 (1， 5， 10， 20， 50 g/ )의 추출물과 함께 전체 양이 100 ^가 되도록 하여 37°C에서 4시간 반웅시켜 최종당화산물 (advanced glycation endproducts, AGEs)의 생성을 억제하는지 확인하였다. 양성대조군으로는 100 mM 글리코알데히드 (Sigma-Aldrich)만 넣어 최종당화산물 생성을 확인하였다. PBS로 2번 세척한 후， 50 mM 수소화붕소나트륨 (sodium borohydrideK Sigma-Aldrich) 100 ^를 넣고， 5분 동안 남아있는 알데히드 그룹 (aldehyde group)을 중화시켰다. 중화반웅 후， PBS로 2번 세척하고， 다시 PBS 100 ^를 넣어 형광분석기 (Ex.370nm/Em440nm)로 확인하였다. 통계처리는 Prism 5.0 프로그램 (GraphPad)을 이용하여 p<0.05 이상을 유의적인 값으로 하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 계지 및 목단피 추출물 (CM04, CM04-1)과 계지 및 작약 추출물 (CPA4, CPA4-1)들은 농도 의존적으로 5^g/m«, lO g/ , 20 g/mi, 50/ / )최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였다 (도 2).
<실험예 3>최종당화산물의 교차결합 파쇄 효능 확인 (Breaking effect on already formed cross-linked AGE and protein complex)
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 3>에서 제조한 흔합 추출물의 최종당화산물과 기질 단백잘과의 교차 결합 파쇄 효능을 확인하였다. 양성대조군은 ALT-711(Alteon Inc. , Ramsey, NJ)을 사용하였다.
구체적으로， 1.0 AGE-BSA(Transgenic Inc. Kobe, 일본)를 콜라겐 코팅된 96 웰 마이크로타이터 플레이트 (Greiner Bio-One, 독일)에 분주한 후 37°C에서 4시간 배양하여 AGE-BSA와 콜라겐을 교차결합시킨다. 0.05% PBST에 3번 세척하여 결합하지않은 AGE-BSA를 제거한 후， 흔합 추출물과 ALT-711을 가한 후 37°C에서 4시간 배양하였다. 이 후 0.05% PBST로 세척하고， 콜라겐과 교차결합하여 남아있는 AGE-BSA를 검출하기 위하여 mouse monoclonal ant i -AGE-BSA 항체 (6D12, Transgenic Inc. Kobe, 일본)를 1:250으로 회석하여 분주한 후 37°C에서 1시간 배양하였다. 1시간 후 0.05% PBST로 세척하고， HRP- linked goat ant i -mouse IgG 항체 (SantaCruz， 미국)를 반웅시켜 ΤΜΒ(3.3' ,5,5'-tetramethylbenzidine)를 기질로 하여 발색한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. AGE-BSA의 교차결합 파쇄 효능 W은 하기 수학삭 같이 계산하였다.
Figure imgf000040_0001
그 결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이， 계지 및 목단피 추출물들인 CMOl , CM01-1 , CM02 , CM02-1 , CM03 , CM03-1 , CM04 및 CM04-1은 양성대조군인 ALT— 711에 비하여 최종당화산물의 교차결합 파쇄 효능이 각각 1183배， 12362배，16726배， 4352배， 13225배， 3419배， 11685배 및 3281배로 매우 우수하였고， 계지 및 작약 추출물들인 CPAl , CPA1-1 , CPA2 , CPA2-1 , CPA3 , CPA3-1 , CPA4 및 CPA4-1은 양성대조군인 ALT-711에 비하여 최종당화산물의 교차결합 파쇄 효능이 각각 2221배， 13124배， 1965배 , 12362배， 2093배， 11373배， 1977배 및 7515배로 매우 우수하였으며， 계지 및 적복령 추출물 (CP0)은 양성대조군인 ALT-711에 비하여 최종당화산물의 교차결합 파쇄 효능이 3495배 우수한 것을 확인하였다 (표 3) .
따라서, 계지 및 목단피 추출물, 계지 및 작약 추출물， 또는 계지 및 적복령 추출물은 양성대조군인 ALT-711보다 그 효능이 우수한 것을 확인하였다. 특히 양성대조군인 ALT-711은 합성단일 화합물인 것을 참고할 때 본 발명의 혼합 추출물이 효능이 뛰어남을 확안하였다.
【표 3]
Figure imgf000040_0002
실시예 <1-2>의 계지 및 목단피 (1:1) 열수 추출물 (CM01-1)
1.38±0.37 12362 실시예 <1-3>의 계지 및 목단피 (1:2) 추출물 (CM02)
1.02±0.15 16725.5 실시예 <1-4>의 계지 및 목단피 (1:2) 열수 추출물 (CM02-1) '
3.92±1.09 χ4352 실시예 <1-5>의 계지 및 목단피 (1:4) 추출물 (CM03)
1.29+0.70 13224.8 실시예 <1— 6>의 계지 및 목단피 (1:4) 열수 추출물 (CM03-1)
4.99±2.53 χ3419 실시예 <1— 7>의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04)
1.46±0.65 11685 실시예 <1-8>의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04— 1)
5.20±1.18 χ3281 실시예. <2-1>의 계지 및 작약 (2:1) 추출물 (CPA1)
7.68+3.78 χ2221 실시예 <2— 2>의 계지 및 작약 (2:1) 열수 추출물 (CPA1-1)
1.30±0.37 X 13124 실시예 <2-3>의 계지 및 작약 (1:2) 추출물 (CPA2)
8.68±0.90 1965 실시예 <2— 4>의 계지 및 작약 (1:2) 열수 추출물 (CPA2-1)
1.38+0.24 12362 실시예 <2-5>의 계지 및 작약 (1:4) 추출물 (CPA3)
8.15±0.39 2093 실시예 <2-6>의 계지 및 작 (1:4) 열수 추출물 (CPA3-1).
1.50±1.64 X 11373 실시예 <2— 7>의 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4) .
8.63±0.70 χ1977 실시예 <2-8>의 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4一 1)
2.27±0.38 χ7515 실시예 <3-1>의 계지 및 적복령 (1:1) 추출물 (CP0)
4.88±1.34 3495
ALT-71K양성대조군) ―
17，060±2.35
<실험예 4> 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성 억제 효과 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2〉에서 제조한 계지 및 목단피 추출물 (CM02, CM04, CM04-1), 계지 및 작약 추출물 (CPA1-1, CPA2-1, CPA4, CPA4-1)의 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주 (ARPE-19: ATCC No. CRL-2302)를 Dulbeccos modi fied Eagles medium배지 (DMEM, Gibco, USA)로 5% C02 배양기에서 배양하였다. BSA의 최종 농도 500 μg/ml, 고혈당흘 25 mM의 조건에서 배양한 후, 본 발명의 계지 및 목단피 추출물 (CM02, CM04, CM04-1), 계지 및 작약 추출물 (CPAl-l, CPA2-1, CPA4, CPA4-1)을 농도별 (10， 20， 50 로 처리하였다. 또한， 양성대조군은 아미노구아니딘 (AG, 10 mM)을 처리하였다. 시료는 1XPBS로 세척 후 Lae画 li Sample Buffer(cat. no. 161-0737, Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 처리한 후 100°C에서 5분간 끓인 후， BCA(Pierce Biotechnology, IL, USA)로 단백질 정량 후 사용하였다. SDS가 포함된 10% polyacrylamide gel(PAGE)에 단백질을 전기영동 (120 V， 2hr) 후 transfer buffer (0.25 M Tris, 1.92 M Glycine, pH 8.3—8.4)로 PVDF 멤브레인 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 단백질을 이동시켰다 (250 mA, 1.5). TBS-T(200mMTris, 1.37MNaCl, 0.05%Tween20)용액에 5% non fat mi lk로 blocking한 후， AGEs항체 (Anti-AGEs monoclonal Ab, Clone No. 6D12)를 4°C에서 반웅하였다. 세척 후 HRP-conjugated된 이차 항체를 반웅시키고 다시 세척한 후， enhanced chemi 1 iuminescence(ECL)으로 반응시켜 LAS-3000(Fuj i film, JPN)으로 분석하고， GraphPad Prism 5 (San Diego)로 통계 처리하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 계지 및 목단피 추출물 (CM02, CM04, CM04-1) , 계지 및 작약 추출물 (CPAl-l, CPA2-1, CPA4, CPA4-1)은 고혈당 흰「경에 있는 사람 망막색소 상피세포에서도 농도 의존적으로 (10 ug/mi, 20 ug/mi, 50 /ig/nrf) 최종당화산물 생성을 억제함을 확인하였다 (도 3). 상기 결과들을 토대로 계지 및 목단피 추출물， 계지 및 작약 추출물, 계지 및 적복령 추출물은 최종당화산물 생성을 억제하고， 글리코알데히드로 코팅한 ECM에서 최종당화산물의 생성을 억제하였고， 또한， 이미 생성된 최종당화산물과 기질 단백질과의 교차결합을 파쇄하며, 고혈당 환경에서 사람 망막색소상피 세포주에서 최종당화산물 생성을 유의성 있게 억제하는 것을 확인하였다. <실험예 5>동물모델에서 당뇨합병증 예방효과확인
제 2형 당뇨모델 db/db 마우스에서 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)의 당뇨합병증 예방 효과를 확인하기 위하여， 12주 동안 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)을 투여하여 확인하였다. 양성대조군으로 당뇨망막병증 치료제로 호주에서 승인받은 약물인 페노파이브레이트 (fenofibrate)를 사용하였다.
<5-1>실험동물사육 및 실험 디자인
렙틴 (leptin) 수용체 돌연변이로 당뇨가 발생하는 제 2형 당뇨 동물모델인 7주령의 수컷 마우스를 각 군당 10마리씩 하기와 같이
7군으로 나누아 실험을 진행하였다:
(1) 정상 동물군 (nondi abet ic heterozygote db/ + 마우스， NOR), (2) 당뇨 동물군 (CSyBL/KsJ-Lepr1*^ 당뇨 마우스， DM), (3) 페노파이브레이트 100 mg/kg/day 투여군 (Feno), (4) CM04-1 100 mg/kg/day 투여군 (CM04-1— 100)， (5) CM04-1 250 mg/kg/day 투여군 (CM04-l-250 (6) CPA4-1 100 mg/kg/day 투여군 (CPA4-1-100), (7) CPA4-1 250 mg/kg/day투여군 (CPA4-1-250).
모든 약물은 0.5% 메틸셀를로스 (methylcellulose)에 현탁하여 매일 1회， 12주간 경구로 투여하였다. 실험군 (1)군 및 (2)군은 vehicle 용액인 0.5% 메틸셀를로스 용액만 동량으로 경구 투여하였다. 약물투여기간 동안 체중과 사료 및 음수 섭취량을 측정하였다.
<5-2> 혈액망막장벽 손상 (Blood-retinal barrier breakage) 억제 효과 확인 고혈당이 지속되면 안구의 망막혈관의 기능 이상으로 혈액망막장벽이 손상을 입게된다. 이에 ,상기 <실시예 1>내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)을 투여한 후 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <5-1>과 같이 디자인한 실험군의 마우스에 펜토바비탈나트륨 (pentobarbital sodium) 25 mg/kg복강 주사하여 마취시킨 후， 복강 및 흉강을 열어 심장을 확보하고, 1 의 멸균된 PBS에 녹여 준비한 50 mg/mt 플루오레세인-덱스트란 (fluorescein-dextran)(2xi06분자량)을 좌심실에 주사하였다. 10분 후， 안구를 적출하고， 좌측 안구를 안배 (eyecup)에 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aqueous mounting med i霍―으로— —마운탕 (moi t—i ng— )하였다 .— 아를 —충분히——견조사 —―후 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이， 정상군 (N0R)은 형광의 유출이 관찰되지 않았으나， 당뇨군 (DM)은 혈액망막장벽 손상으로 인한 유출된 형광물질이 유의성 있게 증가하였고， 양성대조군인 페노파이브레이트 투여군 (Feno)은 형광물질의 유출을 막지 못하였으나， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CM04-1— 100， CM04- 1-250 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CPA4-1-100은 망막'혈관으로부터 형광물질의 유출을 유의성있게 예방하는 것을 확인하였다 (도 4).
<5-3>무세포성 모세혈관 형성 (acel hilar capi llary formation)억제 효능 확인
당뇨병성 망막증의 초기 증상 중의 하나는 무세포성 모세혈관 형성으로 인해 주변세포인 페리사이트 (pericyte)의 핵이 사멸되어 망막증으로 진행된다. 이에， 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 (CM04-1) 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물 (CPA4-1)을 투여한 후 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <5-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하고, 안구에서 망막을 적출하여 흐르는 물에 수세한 후， 3%트립신에 넣어 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 다이제스트된 망막을 PBS에 옮긴 후 internal membrane (세포 안에 존재하는 소기관들의 막)을 제거하였다. vascular frame은 유리 막대를 이용하여 망막 background로부터 분리하여 5 슬라이드에 올려놓고 건조시켰다. PAS 염색과 해마톡실린 (hematoxyl in)으로 염색하여 세포벽과 핵의 변화를 확인하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이， 정상군 (NOR)은 무세포성 모세혈관이 관찰되지 않았으나， 당뇨군 (DM)은 무세포성 모세혈관이 유의하게 증가하였고， 페노파이브레이트 투여군 (FEN0)은 무세포성 모세혈관 형성을 막지 못했으나， 10 본 발명의 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 열수 추출물 투여군인 CM04-1-100 , CM04- 1-250 ——및—쳬지 ―및― 작약 (—1 : 8)— —열수 ——추출물 여군언— εΡΑ4-1-1θθ은— 무세포상— 모세혈관의 형성을 유의성 있게 예방하는 것을 확인하였다 (도 5) .
<5-4>세포간치밀이음부단백질 (Tight-junction protein)손상 억제 효능
15 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 열수 추출물 (CM04-1)및 계지 및 작약 ( 1 : 8)열수 추출물 (CPA4-1)을 투여한 후 세포간 치밀이음부 단백질인 오클루딘 (occ ludin)의 손상 억제 효과를 확인하였다.
구쎄적으로， 상기 실험예 <5-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를
20 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후， 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 1 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드레 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다아제 (peroxidase) 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반웅시킨 후 0.05% 트원 ( tween)
25 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 반웅을 제거하기 위하여
카세인 (casein)을 이용하여 blocking한 후， 1차 항체를 각각 1 : 200으로 희석하여 1시간 또는 하룻밤동안 처리하였다. 1시간 PBS로 세척한 후 l abeled streptoavidin biot in(LSAB) 키트 (Dako , USA)를 적용한 후 DAB로 발색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 형광염색의 경우 FITOconjugated된 2차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 반웅시킨 후， DAPI로 염색한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이， 당뇨군 (DM)에서 오클루딘의 실타래 같은 연결선이 끊어진 것을 확인하였으나, 페노파이브레이트 투여군 (FEN0), 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물 투여군인 CM04-1-100, CM04-1-250은 오클루딘의 소실된 곳이 없음을 확인하였다 (도 6).
<실험예 6>동물모델에서 당뇨합병증치료효과확인
계지 및 목단괴 l:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8)추출물 (CPA4)과 메트포민 (metformin)과의 병용투여시 치료 효과를 확인하기 위하여, 제 2형 당뇨모델 db/db마우스에 메트포민을 12주간 투여하여 혈당을 조절한 후， 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)을 12주간 더 메트포민과 병용투여하여 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)의 당뇨병성 망막증 및 신증에 대한 치료 효과를 확인하였다. 양성대조군으로 당뇨망막병증 치료제로 호주에서 승인받은 약물인 페노파이브레이트 (fenofibrate)를 사용하였다.
<6-1>실험동물사육및 실험 디자인
렙틴 (leptin) 수용체 돌연변이로 당뇨가 발생하는 게 2형 당뇨 동물모델인 7주령의 수컷 db/db 마우스를 각 군당 10마리씩 하기와 같이 8군으로 나누어 실험을 진행하였다:
(1) 정상 동물군 (nondiabetic heterozygote db/+마우스， NOR), (2) 당뇨 동물군 (CS BL/KsJ-Lepr ^* 당뇨 마우스， DM), (3) 메트포민 350 mg/kg/day 투여군 (MET), (4) 메트포민 +페노파이브레이트 100 mg/kg/day투여군 (MET+FEN0), (5) 메트포민 +CM04100 mg/kg/day투여군 (MET+CM04-100)， (6) 메트포민 +CM04250 mg/kg/day 투여군 (MET+CM04-250)， (7) 메트포민 +CPA4 100 mg/kg/day 투여군 (MET+CPA4-100), (8)메트포민 +CPA4250 mg/kg/day투여군 (MET+CPA4-250) . (3) 내지 (8)군은 일정수준 혈당을 낮추기 위하아 메트포민 350 mg/kg을 12주간 투여하였다. 메트포민 및 추출물은 0.5% 메틸셀를로스 (methylcel lulose)에 현탁하여 매일 1회， 12주간 경구로 투여하였다. 실험군 ( 1)군 및 (2)군은 vehi cle 용액인 0.5% 메틸셀를로스 용액만 동량으로 경구 투여하였다. 12주 동안 쩨트포민 투여 후， 각 군에 해당하는 추출물을 정해진 용량만큼 매일 메트포민에 추가하여 병용투여하였다. 약물투여기간 동안 체중과 사료 및 음수 섭취량을 측정하였고， 4주 간격으로 혈당을 측정하였다. <6-2> 혈액망막장벽 손상 (Blood— ret inal barrier breakage) 억제 효과 확인
고할당이 지속되면 안구의 망막혈관의 기능 이상으로 혈액망막장벽이 손상을 입게된다. 이에，상기 <실시예 1>내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 ( 1 : 8) 추출물 (CPA4)을 투여한 후 혈액망막장벽 손상 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <6-1>과 같이 디자.인한 실험군의 마우스에 펜토바비탈나트륨 (pentobarbi tal sodium) 25 mg/kg복강 주사하여 마취시킨 후， 복강 및 흉강을 열어 심장을 확보하고， 1 의 멸균된 PBS에 녹여 준비한 50 mg/ηώ 풀루오레세인-텍스트란 ( f luorescein-dextran) (2 x i06분자량)을 좌심실에 주사하였다. 10분 후, 안구를 적출하고, 좌측 안구를 안배 (eyecup)에 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aqueous mount ing medium으로 마운팅 (mount ing)하였다. 아를 충분히 건조시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다. 당뇨 유발 12주， 18주， 24주에 각각 확인하였다. 그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군 (N0R)은 24주까지 별다른 형광의 유출이 관찰되지 않았으나， 당뇨군 (DM)은 12주， 18주， 24주의 대다수 개체에서 혈액망막장벽 손상으로 형광물질이 혈관 밖으로 세어나오는 현상이 확인되었고， 양성대조군인 메트포민 투여군 (MET)은 형광물질 유출 소견이 18주까지는 당뇨군 (DM)에 비하여 유의성있게 감소하였으나， 24주에는 형광물질의 유출을 막지 못하였으며, 메트포민과 페노파이브레이트 병용 투여군 (MET+FEN0)은 18주에는 형광물질 유출을 막았으나， 24주에는 전혀 효능이 없음을 확인하였고，. 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민올 병용투여한 군은 18주와 24주에 망막혈관으로부터 형광물질의 유출을 유의성있게 막아 치료 효과가 있는 것을 확인하였다 (도 7). 상기 결과로 메트포민은 어느 기간 동안에는 망막 혈관이 손상되는 것을 막을 수 있으나， 한계가 있어 결국엔 망막 혈관 손상을 막지 못함을 확인하였다.
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<6-3>무세포성 모세혈관 형성 (acel hilar capillary formation)억제 효능 확인
당뇨병성 망막증와 초기 증상 중의 하나는 무세포성 모세혈관 형성으로 인해 주변세포인 페리사이트 (pericyte)의 핵이 사멸되어 망막증으로 진행된다. 이에， 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)을 투여한 후 무세포성 모세혈관 형성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <6-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하고， 안구에서 망막을 적출하여 흐르는 물에 수세한 후， 3%트립신에 넣어 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 다이제스트된 망막을 PBS에 옮긴 후 internal membrane (세포 안에 존재하는 소기관들의 막)을 제거하였다. vascular frame은 유리 막대를 이용하여 망막 background로부터 분리하여 슬라이드에 올려놓고 건조시켰다. PAS 염색과 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 염색하여 세포벽과 핵의 변화를 확인하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이， 각 군의 무세포성 모세혈관의 개수를 분석하였을 때， 당뇨군 (DM)은 약 5배 정도 무세포성 모세혈관이 증가한 반면， 메트포민 투여군 (MET)이나 메트포민과 페노파이브레이트 병용 투여군 (MET+FEN0)은 무세포성 모세혈관의 증가를 막지못했으나， 본 발명의 계지 및 목단괴 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250과 메트포민을 병용투여한 군은 유의성 있게 무세포성 모세혈관 형성을 억제하는 것을 확인하였다 (도 8). <6-4>세포간치밀이음부 단백질 (Tight -junction protein)손상억제 효능 확인
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 2>에서 제조한 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 (CM04) 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 (CPA4)을 투여한 후 세포간 치밀이음부 단백질의 손상 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <6-2〉와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하여 10% 증성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후， 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 m 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 을려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 쩨록시다아제 (peroxidase) 활성을 제가하기 위하여 3 > 과산화수소 용액에 10분간 반웅시킨 후 0.05% 트윈 (tween) 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 반웅을 제거하기 위하여 5% 카세인 (casein)을 이용하여 blocking한 후， 1차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 또는 하룻밤동안 처리하였다 1시간 PBS로 세척한 후 labeled streptoavidin biotin(LSAB) 키트 (Dako, USA)를 적용한 후 DAB로 발색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 형광염색의 경우 FITC-conjugated된 2차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 반웅시킨 후， DAPI로 염색한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 9a 내지 9b에 나타낸 바와 같이， 당뇨군 (DM), 메트포민 투여군 (MET)이나 메트포민과.페노파이브레이트 병용 투여군 (MET+FEN0)의 경우 혈관의 여러 곳에서 클라우딘 (claudin)-5의 실타래 같은 연결선이 끊어진 것올 확인하였으나, 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100,
CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 클라우딘 -5의 소실된 곳이 없음을 확인하였고 (도 9a), 당뇨군 (DM)은 오클루딘 단백질이 유의성있게 감소하였고， 메트포민 투여군 (MET)이 — 메트포민과 페노파이브레이트 병용 투여군 (MET+FEN0)은 유의성 있는 증가가 없었으나， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8)추출물 투여군인 CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 오클루딘이 유의성있게 증가하는 것을 확인하였다 (도 9b).
<6-5>신기능 및 단백뇨에 대한효과확인
고혈당에 의한 신기능 저하 예방 및 치료 효능을 확인하기 위해 24시간 뇨 배출량， 단백뇨, 알부민뇨， 크레아틴 청소율， 뇨 중 네프린 (nephrin) 양, 뇨 증 8-OHd 양， 뇨 중 AGE 양 등을 확인하였다.
크——결—과—도—— 1Q에——나타낸—바와 같어，ᅳ모—든—군쎄—서— -뇨——중 ^네^
양， AGE 양이 유의성 있는 효능을 보였지만, 메트포민 단독 투여군은 뇨 량， 알부민뇨의 양 및 크레아틴 청소율을 억제하지 못하였고， 본 발명의 계지 및 목단파 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여한 군은 알부민뇨 및 크레아틴 청소율을 유의적으로 억제하였으나， 메트포민과 페니파이브레이트 병용 투여군 (MET+FEN0)은 크레아틴 청소율 효능이 없는 것을 확인하였다 (도 10).
상기 결과로 메트포민 단독 투여만으로는 당뇨성 신증으로 진전되는 것을 억제하지 못하고, 메트포민과 본 발명의 계지 및 목단피 추출물 또는 계지 및 작약 추출물의 병용 투여가 당뇨성 신증으로 진전되는 것을 유와성 있게 치료한다는 것을 확인하였다.
<6-6>사구체 경화증의 변화확인
당뇨병성 신증에서 나타나는 형태학적 변화인 사구체 경화증을 PAS 염색과 Trichrome 염색으로 메산지움 (mesangial) 및 세포외 기질 확장을 확인하였다.
그 결과 도 11에 나타낸 바와 같이， 당뇨군의 사구체에서는 세포외 기질 물질이 생성， 축적되어 메산지움 영역이 확장， 팽대되는 사구체 경화증 소견이 관찰되었고, 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물 투여군인 CM04-100, CM04-250 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물 투여군인 CPA4-100, CPA4-250과 메트포민을 병용투여가 이를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 11).
<실험예 7>설치류동물모델에서 황반변성 치료효과확인
<7-1> M U 유도 (MNU— induced age-related macular degeneration) 동물모델에서 황반변성 예방및 치료효과확인
<7-1-1>실험동물사육 및 실험 디자안
6주령 수컷 C57BL/6 마우스를 1주일 동안 순화 후 사용하였다.황—받ᅳ변—성에 4— -나타나늗 -망돠조직의 —형—태학
세포 (photoreceptor cell)의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 1%(0.05% 아세트산 (acetic acid)) N-me t hy 1 -N-n i t r osour ea (MNU , Sigma, 미국)을 7주령 수컷 C57BL/6 마우스에 복강 주사하였다 (60 mg/kg) . 정상군에는 동량의 0.05% 아세트산을 복강투여하였고 본 발명의 계지ᅵ 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04, CM04-1 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4-1을 0.5% 카복시메틸셀를로스나트륨 (sodium carboxymethyl cellulose, CMC)에 현탁 조제하여， 50 mg/kg및 100 mg/kg또는 100 mg/kg단독 농도로 MNU투여 하루 전에 1회 경구 투여하고， 丽 U 투여 후 7일 동안 매일 1회 경구 투여하였다. 정상군 및 MNU유도군에는 0.5% CMC만 동량으로 경구 투여하였다.
<7-1-2>조직병리학적 평가
황반변성에서 나타나는 망막조직의 형태학적인 변화 중 광수용체 세포 (photoreceptor cell)의 손상 및 변성 여부는망막 조직의 외과립층 (outer nuclear layer)의 두께 변화로 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <7-1-1>에서 제조한 마우스를 가지고， 상기 실험예 <6-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후， 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 urn 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정올 거친 슬라이드를 내인성 페록시다아제 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반웅시킨 후 0.05% 트원 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 슬라이드 절편은 헤마록실린 & 에오신 (Hematoxyl in & Eosin, H&E) 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이， 망막에서 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어있는 외과립충 0)의 두께가 應 U 투여에 의한 손상으로 세포수가 감소하여 얇아진 것을 확인하였으나， 본 발명의 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 추출물인 CM04, CM04-1 및 계지 및 작약 ( 1 : 8) 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 MNU에 의한 광수용체 세포의 손상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 12) .
<7-2> NalOs 유도 동물모델에서 망막색소상피세포 (retinal pigmented epithel ial cel l)의 손상 예방효과확인
<7-2-1>실험동물사육 및 실험 디자인
6주령 수컷 SD 렛트를 1주일 동안 순화 후 사용하였다. 황반변성에서 나타나는 변화 중 하나로 망막색소상피세포의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 3.5% NaOI3(Sigma, 미국)을 7주령 렛트의 혀 밑에 정맥주사하였다 (35 mg/kg) . 정상군은 동량의 생리식염수만 투여하였고, 본 발명의 계지 및 목단피 (1 :8) 열수 추출물인 CM04-1 및 계지 및 작약 ( 1 : 8) 열수 추출물인 CPA4-1을 0.5% 카복시메틸셀를로스나트륨 (sodium carboxymethyl cel lulose , CMC)에 현탁 조제하여， 50 mg/kg 및 100 mg/kg의 농도로 NaOI3 투여 하루 전에 1회 경구 투여하고, NaOI3 투여 후 7일 동안 매일 1회 경구 투여하였다. 정상군 및 대조군에는 0.5% CMC만 동량으로 경구 투여하였다.
<7-2-2>조직병리학적 평가
황반변성에서 나타나는 변화 증 하나인 망막색소상피세포의 손상 및 변성 여부는 망막 조직의 외과립충 (outer nuclear layer)의 folding 개수로 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <7-2-1>에서 제조한 마우스를 가지고， 상기 실험예 <6-2>와 동일한 방법으로 마우스에서 안구를 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후， 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록올 4 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 페록시다아제 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반웅시킨 후 0.05% 트원 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 슬라이드 절편은 헤마톡실린 & 에오신 (Hematoxylin & Eosin, H&E) 염색하여 광학현미경으로 관찰하였디-.
그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이， NaOI3 투여로 인하여 착색된 상피 세포 (pigmented epithelial cell)가 손상을 받아 바로 위에 위치하는 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층이 휘어지는 현상이 육안으로 관찰되었으나， 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 열수 추출물인 CM04-1 및 계지 및 작약 (1:8) 열수 추출물인 CPA4-1을 투여한 군에서는 모두 Na0I3에 의해 유도된 착색된 상피 세포의 손상을 억제하여 외과립층이 휘어지는 현상을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 13). <7-3> VLDLR( Very- low-density lipoprotein receptor) 낙아웃 (knockout) 마우스에서의 황반변성 예방효과확인
<7-3-1>실험동물사육 및 실험 디자인
습성 황반변성의 임상증상인 망막 신생혈관 생성 (subretinal neovascularization)을 3주령부터 보이는 모델동물인 Vldlr— 마우스를 암수 쌍을 Jacson labratory로부터 구입하여 번식 (breeding)을 통하여 어린 2주령 마우스를 얻은 후 실험에 사용하였다. 정상동물로는 동일주령의 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4는 0.5% CMC에 현탁 조제하였으며, 100 mg/kg의 농도로 7일 홍안 매일 1회 복강 투여하였다. 정상군 및 대조군에서는 0.5% CMC만 동량 경구투여하였다.
<7-3-2>망막신생혈관 생성의 억제 확인
망막 혈관의 부종을 측정하여 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <7-3-1>의 동물 모델을 아용하여， 부검 시 Zoletil 50(Virbac 30mg/kg)과 Rompun (바이엘코리아, 10mg/kg)을 3:2로 흔합해 10배 희석 (saline) 후 50 ≠ 복강 주사하여 마취하였다. 개복 후 심장에 5 mg의 fluorescein isothiocyanate-dextran(FD40S-lG, sigma)을 PBS에 녹여 100 —^를—주사한ᅳ후ᅳ 5분—후―안구를—적출하여一한쪽은—망-막조직—절편一제작을—위—해一
10% 중성화 포르말린에 고정하였고， 다른 한쪽은 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 10분간 고정 후 망막 (retina) 분리 후 flat -mounted 망막 슬라이드를 제작하여 형광형미경 (BX51, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다.
그 결과 도 14에 나타낸 바와 같이，
Figure imgf000054_0001
마우스에서는 외과립층 아래인 망막하 (subretinal) 부위에서 신생혈관이 생성되어 망막 조직이 위로 휘어지는 현상이 관찰되었으나， 이러한 신생혈관 생성은 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04 투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 14).
<7-3-3>망막색소상피세포 손상 억제 확인
망막색소상피세포의 형태학적 구조의 변성 유무를 확인하기 위하여， Z0-1 염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-3-1>의 동물 모델올 이용하여， 부검 시 적출한 안구조직에서 망막을 분리한 후 결막 조직을 4% 파라포름알데히드에 3시간 고정 후 PBS로 세척하여 5% Triton X- 100과 1% BSA를 포함한 PBS에 3시간 동안 교반하였다. 다시 세척 후 PBS에 1 mg/ml로 녹인 렉틴 (L2140, sigma)을 1:50으로 희석하여 4°C에서 밤새 반웅시켰다. 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS로 2시간 동안 세척한 후 streptavidin TRITC를 1:500으로 희석하여 37°C에서 4시간 반웅시킨 후 PBS로 30분 세척하여 형광형미경 (BX51, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과 도 15에 나타낸 바와 같이， 정상 마우스의 망막색소상피세포는
Z0-1로 염색되어 가지런히 정렬된 형태가 관찰되는 반¾， Z/r— A마우스에서는 세포에 손상이 일어나고 신생혈관이 자라나와 변성된 부위 (화살표)가 다수 관찰되었으나， 망막색소상피세포의 변성은 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04 투여에 와해 현저히 억제되는 것을 확인하였다 (도 15).
<73，4>망막에서의 VEGF발현 억제 효과확민
망막에서의 VEGF 발현 억제 효과를 염색으로 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <7-3-1>의 동물 모델을 이용하여， 상기 실험예 <7-2-2>와 동일한 방법으로 슬라아드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 H&E 염색하여 광학현미경 하에서 망막하 부위의 신생혈관 생성 병변을 정량적으로 분석하였다.
그 결과 도 16에 나타낸 바와 같이， 신생혈관 및 혈관의 투과성에 관여하는 중요한 인자인 VEGF가 Vlc!lr^- 마우스에서는 심하게 발현 (짙은 보라색으로 염색되었음)된 반면，본 발명의 계지 및 목단피 (1:8)추출물인 CM04 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4의 투여로 현저히 억제되는 것을 확인하였다 (도 16).
<7-4> VLDLR( Very一 low一 density lipoprotein receptor) 낙아웃 (knockout) 마우스에서의 황반변성 치료효과확인
<7-4-1>실험동물사육 및 실험 디자인
습성 황반변성의 임상증상인 망막 신생혈관 생성 (subretinal neovascularization)을 3주령부터 보이는 모델동물인 VI dh^— 마우스를 암수 쌍을 Jacson labratory로부터 구입하여 번식 (breeding)을 통하여 어린 2주령 마우스를 얻은 후 실험에 사용하였다. 정상동물로는 동일주령의 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 본 발명의 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 추출물인 CM04 및 계지 및 작약 ( 1 :8) 추출물인 CPA4는 0.5% CMC에 현탁 조제하였으며， 3주령부터 각각 50， 100 mg/kg의 농도로 7일 동안 매일 1회 복강 투여하였다. 정상군 및 대조군에서는 0.5% CMC만 동량 경구투여하였다.
<7-4-2> 망막신생혈관 생성의 억제 확인
망막 조직 절편을 이용하여 황반변성에서 나타나는 망막 신생혈관 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <7-4— 1〉의 동물 모델을 이용하여， 상기 실험예
<7-3-2>와 동일한 방법을 이용하여 형광형미경 (BX51 , Olympus , Japan) 하에서 관찰하였다.
그 결과 도 17에 나타낸 바와 같이， VkU 마우스에서는 외과립층 아래인 망막하 부위에서 신생혈관아 생성되어 망막 조직이 위로 휘어지는 현상이 관찰되었으나， 이러한 신생혈관 생성은 본 발명의 계지 및 목단피 ( 1 :8) 추출물인 CM04 100 mg/kg투여에 의해 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 17) .
<7-5> 레이저 유도 맥락막 신생혈관 생성 렛트 모델에서의 신생혈관 생성 억제 효과 확인
<7-5-1>실험동물 사육 및 실험 디자인
7주령 수컷 Long-Evans 렛트 (SLC Japan, Tokyo , Japan)을 Zolet i l 50(Virbac 30 mg/kg)과 Rompun (바이엘코리아 10 mg/kg)를 복강 주사하여 마취하였다. 이후 1% tropicamide eye drop으로 동공올 확장시킨 후， 다이오드 레이저 (diode laser) (파장: 532 nm,지름: 100 μ ιπ '파워 : 150 mW,기간: 0.1 sec)를 이용하여 시각신경원반 (opt ic nerve head) 주위로 4군데 광웅고 spot을 만들었다. Bruch' s membrane의 파괴는 특징적인 버블 (bubble)의 형성으로 검증하였다. 마취에서 깨어난 렛트들은 무작위로 군분리하여 약물을 투여하였다. 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04 및 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4는 0.5% CMC에 현탁 조제하였으며， 각각의 추출물을 100 mg/kg의 농도로 10일 등안 매일 1회 경구투여 하였다. 대조군에서는 0.5% CMC만 동량 경구투여하였다.
<7-5-2> 망막신생혈관 생성의 억제 확인
망막 조직 절편을 이용하여 황반변성에서 나타나는 망막하 부위의 신생혈관 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <7-5-1>의 동물 모델을 이용하여， 10일 후 부검 시 Zoletil 50(Virbac 30 mg/kg)과 Rompun (바이엘코리아， 10 mg/kg)를 3 :2로 흔합액을 복강 주사하여 마취하였다. 개복 후 심장에 5 mg의 fluorescein i sothi ocyanat e-dext ran(MW 2 x 106, sigma)을 PBS에 녹여 100 ^를 주사한 후 10분 후 안구를 적출하여 4% 파라포름알데히드에 10분간 고정 후 망막을 떼어낸 후 망막하 부위가 포함된 결막조직을 flat-mounted 슬라이드를 제작하여 형광형미경 (BX51, Olympus, Japan) 하에서 관찰하였다. 신생혈관 생성 부위의 크기는 Image J software(NIH, USA)를 이용하여 분석하였다.
그 결과 도 18에 나타낸 바와 같이, 신생혈관 생성이 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04(100 mg/kg) 투여에 의해 유의적으로 억제되었고， 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4(100 mg/kg) 투여에 의해 억제되는 경향을 보이는 것을 확인하였다 (도 18).
<실험예 8> MNU 유도 황반변성 설치류 동물모델에서 황반변성 예방 및 치료 효과 확인
상기 표 1의 분석결과와 같이 본 발명의 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04, CM04-1, 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4, CPA4-1 중의 패오니플로린의 함량은 각각 2.7%, 2.3%, 12.3%, 8.9%임을 확인하였다. 패오니플로린이 사람 망막색소상피 세포주 (ARPE-19)에서 ¾02로 인한 세포사멸과 산화성 스트레스 억제효능이 있으므로 황반변성과 같은 안과 질환에 유효할 것이라고 보고하였다 (Molecular Vi s ion 2011； 17： 3512-3522) . 그러나 동물모델에서 황반변성의 예방 및 치료효능이 있는지 증명하지 않고， 단지 망막색소상피 세포주에서 일반적인 황반변성의 원인이 노화조건이 아니라; 독성물질인 ¾02를 가한 후 항산화 효능과 세포사멸 억제만 확인하였을 뿐. 황반변성에 정말로 효능이 있는지 확인하기 위한 동물모델에서 증명하지 못했다. 이에 본 발명의 추출물 중에 패오니플로린이 함유되었으나， 추출물들이 단지 패오니플로린의 단독 효능이 아님을 증명하기 위하여， 각 추출물 100 mg에 함유된 함량의 패오니플로린과 각각와추출물 ( 100 mg)들의 효능을 동물모델에서 확인하였다. <8-1>실험동물사육및 실험 디자인
6주령—수컷 — G57BL— /6———마우스를— 1주일 동안 순화 -후 사용하—였다 황반변성에서 나타나는 망막조직의 형태학적인 변화 중 광수용체 세포의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 1 >(0.05% 아세트산) . N-methyl-N— ni trosourea(MNU, Sigma , 미국)을 7주령 수컷 C57BL/6 마우스의 60 mg/kg의 농도로 복강주사하였다. 정상군에는 동량의 0.05% 아세트산을 복강투여하였다. 시료로 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 추출물인 CM04U00 mg/kg) , 계지 및 작약 ( 1 : 8) 추출물인 CPA4( 100 mg/kg) , 패오니플로린 -2.7(2.7 mg/kg) , 패오니플로린 -12.3( 12.3 mg/kg)들을 0.5% CMC에 현탁조제하여， MNU 투여 하루 전에 1회 경구투여하고，顯 U투여 후 7일 동안 매일 1회 각각 경구투여 하였다. 정상군 및 MNU유도군에는 0.5% CMC를 동량 경구투여하였다.
<8-2>망막신경조직의 외과립층두께 변화확인
망막신경조직의 광수용체 세포의 손상에 의한 외과립층 두께의 변화를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <8-1>과 동일한 방법으로 샘플을 처리한 실험군들올 투여 종료 후 부검하여 안구 적출한 후， 10% 중성화 포르말린에 하루 동안 고정한 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 H&E 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였다. 그 결과 하기 표 4에 나타낸 바와 같이， 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04 투여군은 MNU 투여군보다 50%나 높은 효능이 증명되었지만 (1.23±0.20AU→1.61±0.32AU), CM04 100 mg 속에 들어있는 패오니플로린 함량 투여군 (PF-2.7)은 MNU 투여군과 비교할 때 전혀 효능이 없는 것을 확인하였다 (1.23±0.20AU→1.23±0.21AU) (표 4).
또한， 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 망막에서 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층 손상 정도가 丽 U 투여군은 거의 50% 이상 악화되었으나(1.99±0.21^→0.92±0.17^)， 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4 투여군은 MNU 투여군과 비교 시 21.4¾> 효능이 개선되었으며 (0.92±0.17AU→1.14±0.21AU), CPA4 100 mg 속에 들어있는 패오니플로린 함량 투여군 (PF-12.4)은 17.5% 개선되는 것을 확인하였고 (0.92±0.17AU→l.ll±0 9AU), CPA4 투여군이 패오니플로린 12.4nig/kg 투여군 (PF-12.4)보다 4%효능을 개선시키는 것을 확인하였다 (표 5).
【표 4】
Figure imgf000059_0001
(*p<0.05 vs NOR; #p<0.05 vs MNU)
【표 5】
실험군 외과립층 두께 (AU) 외과립층 두께 (%)
NOR
1.99±0.21 100.00±10.92
MNU
0.92+0.17* 0.57±15.64 CPA4
1. 14+0.25# 21.38±23.30
PF-12.4
1. 11±0. 19# 17.46+ 17.39
(*p<0.05 vs NOR; V0.05 vs 丽 U) 상기 결과는 패오니플로린의 함량이 매우 적은 계지 및 목단피 ( 1 : 8) 추출물안 CM04(2.7%)의 효능이 매우 우수하다는 것은 계지 및 목단피 추출물의 효능이 단지 패오니플로린으로 인한 것이 아니라， 계지 및 목단피 추출물에 존재하는 수많은 성분들의 시너지 효과임을 검증하였고, 계지 및 작약 추출물의 경우도 계지 및 목단피 추출물의 결과를 토대로 패오니플로린으로 인한 것이 아니라， 계지 및 작약 추출물에 존재하는 수많은 성분들의 시너지 효과임을 확인하였다.
또한， 계지 및 작약 추출물인 CPA4 또는 CPA4-1보다 패오니플로린의 함량이 더 낮은 계지 및 목단파 추출물인 CM04 또는 CM04-1의 효능이 더 우수함이 이미 앞의 실험예에서도 확인되었다 (도 13 내지 도 18) . 이는 본 발명의 혼합 추출물의 효능이 단지 패오니플로린으로 인함이 아니라， 흔합 추출물에 존재하는 수많은 구성 성분들의 시너지 효과임을 증명하는 것이다.
<실험예 9>하지부종 억제 및 치료 효과확인
<9-1>실험동물사육 및 실험 디자인
6주령 수컷 SD렛트를 (주)오리엔트 (성남， 대한민국)에서 구입하여 1주일 동안 순화 후 사용하였다. 1주일 순화 후 각각의 동물들을 하기와 같이 무작위로 그룹핑 하였다:
Normal : 정상대조군， Edema : 하지부종유발군， CM04-1-50 : 하지부종유발군 + CM04-K50 mg/ kg/day) 투여군， CM04- 1-100： 하지부종유발군 + CM04-K 100 mg/kg/day)투여군， CPA4-1-50 : 하지부종유발군 + CPA4-1(50 mg/kg/day)투여군， CPA4- 1-100： 하지부종유발군 + CPA4- 1( 100 mg/kg/day) 투여군.
각 군별로 하지부종 유발 3일 전부터 매일 오전에 1회씩 경구투여 하였으며， 4일간 전처리 후 오후에 하지부종을 유발하였다. 계지 및 목단피 (1:8)추출물인 CM04-1, 계지 및 작약 (1:8)추출물인 CPA4-1은 0.5%CMC에 현탁하여 조제하였으며， 정상군과 하지부종 유발군에는 0.5 CMC만을 동량 경구투여하였다ᅳ 하지부종의 유발은 2 5¾ 포르말린이 포함된 생리식염수 (fomalin in saline)을 우측뒷다리 발바닥에 0.1 투여하여 유발하였고, 정상군에는 생리식염수만을 동량 주사하였다.
<9-2>하지부종상태 변화확인
하지부종 유발 전 및 후의 부종 상태를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실험예 <10-1>의 실험군을 가지고， 포르말란 투여 직전 및 투여 1시간 후에 부종에 의한 발 크기 (paw volume) 증가는 부종측정기 (phethysmometer, UgoBasile, Milan, Italy)를 이용하여 측정하였다. 부종의 수치 (edema index)는 하기 수학식 3으로 계산하였다.
【수학식 3】
Figure imgf000061_0001
그 결과 도 19에 나타낸 바와 같이， 각 군별 부종 유발전과 1시간 후에 부종 상태를 확인한 결과， 정상군에서는 멸균 생리식염수를 주사하여 약간의 하지 크기의 증가가 있었지만, 경미한 정도였고， 포르말린을 투여한 하지부종 유발군의 경우 크기가 약 20% 유의적으로 증가하였으나， 이러한 하지 부종에 의한 크기의 변화는 계지 및 목단피 (1:8) 추출물인 CM04-1에 의해서는 크게 억제되지 않았고， 계지 및 작약 (1:8) 추출물인 CPA4— 1에 의해서는 농도 의존적이며 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 19).
상기 결과를 토대로， 계지 및 작약 혼합 추출물이 하지정맥의 예방 및 치료효능아우수한 것을 확인하였다.
【산업상 이용가능성]
본 발명은 당뇨합병증 및 혈관부종의 예방 및 치료에 효과적인 천연 흔합 추출물 조성물로 약학적으로 이용 가능할 뿐 아니라 건강기능식품으로서도 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
계지 (Cinnamomi Twig) 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 (diabetic com lications) 및 혈관부종 (angi oedema) 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 목단피 (Moutan Root Bark) , 작약 (Peony Root) 및 적복령 (Poria)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 흔합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 3】
제 2항에 있어서. 계지 및 목단피는 2:1 내지 1:10 증량비율로 흔합하는 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 2항에 있어서， 계지 및 작약은 2:1 내지 1:10 중량비율로 흔합하는 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 5】
제 2항에 있어서， 계지 및 적복령은 2:1 내지 1:2 증량비율로 흔합하는 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 6]
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 메탄을, 또는 이들의 흔합물을 용매로 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 7】
제 1항에 있어서， 상기 추출물은 감압고온 추출， 열탕 추출, 환류 추출， 열수 추출， 넁침 추출， 상온 추출， 초음파 추출 또는 증기 추출방법으로 추출한 5 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막증， 당뇨성 백내장， 당뇨성 신증， 당뇨성 신경병증， 당뇨성 족부궤양 당뇨성 심장병， 당뇨성 10 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 一ᅳ—하나인ᅳ것—을-—특짐 로——하 당뇨ᅳ합—병-증ᅳ및—혈관부좀一예쌓—및— -치료
조성물.
[청구항 9】
15 제 1항에 있어서， 상기 혈관부종은 황반변성 황반부종， 망막변성 및 하지정맥류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 10]
0 계지 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 11】
제 10항에 있어세 상기 추출물은 목단피， 작약 및 적복령으로 구성된 5 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 흔합하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품.
【청구항 12】 제 10항에 있어서, 상기 추출물은 물， 에탄올 또는 메탄올， 또는 이들의 흔합물을 용매로 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 13]
제 10항에 있어서， 상기 추출물은 감압고온 추출， 열탕 추출， 환류 추출， 열수 추출， 넁침 추출， 상은 추출， 초음파 추출 또는 증기 추출방법으로 추출한 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 14】
제— 4Q—항―에 —있—어서，——상—자 당뇨합병—증은 당뇨섬 막증 ——당뇨^—―^^ ^ 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증， 당뇨성 족부궤양， 당뇨성 심장병， 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품.
【청구항 15】
제 10항에 있어서， 상기 혈관부종은 황반변성， 황반부종， 망막변성 및 하지정맥류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품.
【청구항 16】
약학적으로 유효한 양의 계지 추출물을 당뇨합병증 및 혈관부종에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 및 혈관부종 치료 방법.
【청구항 17]
약학적으로 유효한 양의 계지 추출물을 당뇨합병증 및 혈관부종에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨합병증 및 혈관부종 개선 방법.
[청구항 18】
당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 계지 추출물의 용도.
【청구항 19】
당뇨합병증 및 혈관부종 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 계지 추출물의 용도.
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