KR20140090920A - 천연 추출물을 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아이비엽(송악) 추출물 및 황련 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 더 자세하게는 아이비엽(송악) 추출물 및 황련 혼합 추출물에 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 유효성분으로 추가로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

Description

천연 추출물을 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물{Pharmaceutical composition and functional food for prevention or treatment of diabetic complications or angioedema comprising natural extract}
본 발명은 아이비엽과 황련 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 더 자세하게는 아이비엽과 황련 혼합 추출물에 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 유효성분으로 추가로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 전 세계적으로 중요한 성인병 중의 하나로서, 최근 우리나라에서도 급속한 경제 성장과 더불어 당뇨병 유병률이 10%에 달하며, 현재 전 세계적으로 2억 4천만 명이 넘었으며, 2025년에는 전 세계적으로 3억 8천만 명으로 증가하고, 이중 60%가 아시아 지역에서 발병할 것이라고 2009년 미국의사협회(JAMA)에서 발표하였다. 특히, 당뇨병 발병시기가 중장년으로 당겨졌으며, 또한 수명이 연장됨으로서 합병증으로 진전되는 것을 피할 수 없는 상황이 되었다.
당뇨병의 이환 기간이 길어짐에 따라 전신의 다양한 합병증을 동반하게 되는데, 대표적으로 심혈관계 질환, 당뇨신증, 당뇨신경병증, 당뇨망막병증이 발생하게 된다. 당뇨망막병증(Diabetic Retinopathy, DR)은 당뇨 환자에게서 당뇨 진단 10년 내에 60% 이상에서, 20년 내에 90% 이상에서 나타난다. 모든 연령대에서 당뇨병보다는 당뇨합병증 환자 증가율이 높아졌다. 특히 40~50대의 경우 말초순환장애 당뇨합병증 환자 증가율이 당뇨환자보다 6.5배, 당뇨성 망막병증은 2.2배나 높았다. 말초순환장애 당뇨합병증의 진료비는 2006년 807억 원에서 2010년 1530억 원으로 당뇨병성 망막증은 327억 원에서 505억 원으로 54.4% 증가했다(중앙일보 2011년 8월 29일자). 이는 평균 수명율이 늘어나면서 당뇨병 병력이 오래된 환자가 늘고 있기 때문이다. 이는 당뇨병 환자가 당뇨합병증으로 발병되지 않도록 사전에 조치를 취하는 것이 얼마나 중요한가를 나타낸다.
당뇨합병증의 종류 중 특히, 당뇨망막병증은 당뇨병의 미세혈관 합병증 (microangiopathy)의 하나로 망막 혈관의 투과성 변화와 혈관 폐쇄, 허혈 변화(ischemia), 신생혈관 생성(neovascularization), 그리고 이에 따른 섬유혈관 증식(fibrovascular proliferation)을 특징으로 한다.
당뇨망막병증은 성인의 최대의 후천적 실명 원인으로, 미국의 경우 매년 12,000명에서 24,000명이 당뇨로 인해 실명에 이르고 있다. 미국의 연구에서, 당뇨망막병증의 유병률은 당뇨 환자의 40% 정도로 추산되며 8% 정도는 실명에 이를 수 있는 심각한 상태인 것으로 보고되고 있다.
레이저 치료 혹은 유리체 수술적 치료에도 불구하고 병증이 계속 진행되어 실명에 이르는 환자가 많아, 당뇨망막병증의 조기발견과 진행 억제, 고위험 군에 대한 조기 치료에 대한 필요성이 증가하고 있으나 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않아, 효과적인 치료도 한정적인 실정이다.
또한, 병적인 상황으로는 혈관과 림프관이 늘어져 그 기능에 이상을 일으켜 조직액 및 혈액이 정체되게 된다. 이 증상이 정맥에 나타나면 정맥류, 림프관에 나타나면 림프부종을 유발한다. 조직학적으로 하지에 나타나면 하지정맥류가 병발된다. 이로 인해 하지둔감증, 통증, 감각이상, 야간 통증이 수반된다. 그러나 이를 치료, 개선할 수 있는 효과적인 치료약이 없어 항산화제 수준의 약이 투여되고 있는 실정이다. 이와 같은 증상이 망막의 혈관에 나타나면 황반부종 및 황반변성이 유발되기도 한다.
황반은 망막 가운데에 있는 신경조직으로, 만성 당뇨 및 혈류부종으로부터 많은 영향을 받는다. 즉, 드루젠(drusen), 망막색소상피위축(retinal pigment epithelial atrophy), 맥락막신생혈관(choroidal neovascua;rization) 등의 변화로 인해 황반변증이 발병한다. 망막모세혈관으로부터 단백질, 적혈구 등이 망막으로 빠져 나가 황반에 모일 경우에도 황반 부종, 황반변성이 발생하여 시력장애를 일으킨다(당뇨병학제 4개정판, 대한당뇨병학회, 고려의학, 2011년, 577쪽).
황반변성의 효과적인 치료법은 아직 없으며, 최근까지의 치료법으로는 고가의 안구 내 항체주사(antivascular endothelial growth factor therapy) 방법만 있는 실정이다. 이외 국소레이저 치료 등이 있으나, 완치되는 것은 아니며, 개선이 된다 하여도 여전히 불편한 시력을 감수해야 하는 문제점이 있다.
또한, 당뇨신경증은 당뇨병의 가장 일반적인 합병증으로 80% 이상의 당뇨환자에서 발생하는데, 대사 부산물의 축적과 신경세포의 마이엘린 부위의 손실과 미세혈관의 변화에 의해 신경증상이 발병한다. 신경증의 치료는 일반적으로 쉽게 이루어지지 않고 있으며, 혈당조절을 통한 예방이나, 통증과 같은 증상의 경감이 이루어지고 있다. 당뇨에 의한 말초혈관 질환은 약 20년의 유병기간 후 45%의 환자에서 발견되는 질환으로 혈관의 경화 등이 동반되며, 혈액순환 장애가 일반적인 증상이며, 완전한 치유는 어렵다고 알려져 있다. 일례로, 족부궤양의 경우 사지절단이라는 치명적인 결과를 초래하는 당뇨합병증이다.
한편, 최종당화산물 생성이 상기와 같은 당뇨합병증을 유발하는 대표적인 인자 중의 하나로 알려져 있다. 단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of protein)이란, 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소 작용 없이 축합반응(밀리아드 반응)으로 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs)이 생성된다.
가역적인 아미도리형의 조기당화물과는 달리 최종당화산물은 비가역적인 반응 산물이므로, 일단 생성되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 조직 곳곳에서 당뇨성 망막병증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 암, 당뇨성 심장병, 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증 등의 합병증을 유발한다(Vinson, J. A. et al., 1996, J. Nutritional Biochemistry 7: 559-663; Smith, P. R. et al., 1992, Eur. J. Biochem., 210: 729-739).
상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 아이비엽과 황련 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물, 또는 아이비엽과 황련 혼합 추출물에 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 추가로 첨가하여 제조한 혼합 조성물이 최종당화산물 생성 억제, 혈관내피성장인자 생성 억제, 망막혈액장벽 붕괴 억제, 신경전도 개선 및 신증 개선 등에 우수한 효과를 보임으로써, 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 당뇨합병증 또는 혈관부종을 예방 또는 치료할 수 있는 아이비엽과 황련 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 아이비엽과 황련의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 조성물은 아이비엽과 황련의 혼합 추출물에 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아이비엽과 황련의 혼합 추출물"은, 아이비엽 추출물과 황련 추출물의 혼합물, 또는 아이비엽과 황련의 혼합물을 추출하여 제조된 추출물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아이비엽"은, 상록성 덩굴식물로 가지에서 기근이 나와 다른 물체에 붙어 자라는 식물인 아이비(Ivy)의 잎을 의미하며, 한국에서는 송악(Hedera rhombea)으로 불리기도 한다. 잎의 길이는 3~6 ㎝로 혁질이며 광채가 있고 진녹색이다. 잎은 고대에 중독 치료제로 사용되었으며, 신경통, 류마티즘, 좌골통의 통증 완화 효과가 있다고 알려져 있다. 본 발명의 아이비엽 추출물은 아이비엽을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들 혼합용매로 추출하여 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "황련(Coptis chinensis)"은, 미나리아재비과에 속하는 여러해살이 초본식물을 의미하는 것으로, 한방에서는 황련 및 왜황련의 뿌리를 채취하여 햇볕에 말린 것을 황련이라고 한다. 건위, 진정, 소염 및 항균 등의 효능이 있어 소화불량, 위염, 장염, 복통, 구토, 이질, 심계, 번열, 정신불안, 인후종통, 토혈, 코피, 하혈, 화상 등의 치료약으로 사용되고 있다. 본 발명의 황련 추출물은 황련을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들 혼합용매로 추출하여 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “호장근(Polygonun cuneata)"은, 마디풀과의 다년초를 의미하는 것으로, 완화이뇨 및 통경제로 사용하고 민간에서는 진정제로 쓰이고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “대황(Rheum palmatum)"은, 쌍떡잎식물 이판화군 마디풀목 마디풀과의 여러해살이풀을 의미하는 것으로, 한방에서는 소염성의 하제(下劑)로 쓰이고 있으며, 소량을 섭취하면 건위작용을 나타내고 다량의 경우는 완화제로 상습 변비나 소화불량에 좋으며, 민간약으로는 화상에 쓰이기도 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “갈근"은 콩과에 속한 다년생 등본인 칡(Pueraria thynbergiana)의 주피를 제거한 근을 의미하며, 중국에서는 야갈(Pueraria lobata) 혹은 감갈등(분갈, Pueraria thomsonii)의 근을 의미한다. 갈근은 소화불량, 두통, 빈혈, 이질, 복통, 술독, 감기, 구토와 부인들의 하혈에 쓰이고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “은행잎(Ginkgo leaf)"은 은행나무과의 낙엽교목인 은행나무(Ginkgo biloba)의 잎을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “결명자”는 콩과에 속하는 일년생 초본식물인 긴강남차(Cassia tora L.), 결명(Cassia obtusifolia)의 종자를 의미하는 것으로, 양명, 양각, 마제결명, 초결명, 야녹두, 가녹두라고 불리기도 한다. 혈압강하, 이뇨, 통변, 자궁수축작용과 피부진균 억제, 콜레스테롤 강아 작용 등의 기능이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “블루베리(Vaccinium spp., Blueberry)"는 쌍떡잎식물 진달래목 진달래과의 관목을 의미하는 것으로, 항산화작용, 항궤양 활성 및 항염증 작용, 정장 작용(식이섬유) 등의 기능이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “빌베리(Bilberry)"는 쌍떡잎식물 진달래목 진달래과의 상록 소관목인 월귤(Vaccinium vitis-idaea)의 열매를 의미하는 것으로, 시력보호, 콜레스테롤 저하, 변비예방 등의 기능이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “복분자”는 장미과의 복분자딸기(Rubus coreanus)의 열매를 건조한 것을 의미하며, 항염작용, 항산화작용, 항 헬리코박터 파이로리 작용 등이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “감초"는 감초(Glycyrrhiza uralensis, Glycyrrhiza glabra) 또는 기타 동속식물의 뿌리와 줄기를 의미하며, 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 효과가 있으며, 진해거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염작용, 소화성궤양 억제작용이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “포도씨”는 포도나무(Vitis vinifera)의 열매인 포도의 종자를 의미하는 것으로, 피로회복, 항바이러스 등에 효과가 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 “알로에(Aloe)"는 백합과의 알로에속에 속하는 다년생 식물을 의미하며, 면역력 증강, 위장 보호, 혈액순환 촉진 등의 기능이 있다.
본 발명의 상기 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물은 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에를 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들 혼합용매로 추출하여 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 아이비엽 추출물 및 황련 추출물을 10:1 내지 1:10으로 혼합하여 제조한 것, 또는 아이비엽과 황련을 10:1 내지 1:10으로 혼합하여 추출한 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 아이비엽 추출물 및 황련 추출물 이외에 상기 조성물에 메트포르민(metformin)을 추가로 포함하는 것도 바람직하다. 메트포르민이 추가될 경우, 본 발명의 조성물의 효능이 현저히 상승하는 효과가 있다. 메트포르민은 아이비엽과 황련의 혼합 추출물의 총 중량 대비 1배 내지 7배로 추가되는 것이 바람직하다.
상기 추출은 상온 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 초임계 또는 증기 추출인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 아이비엽 추출물은 아이비엽 추출물의 분획물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "분획물"은, 아이비엽 추출물을 물에 현탁시킨 후 극성을 달리하는 용매로 순차적으로 분획하여 얻어진 특정 성분을 의미한다. 상기 용매는 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물일 수 있다.
구체적으로, 상기 아이비엽 추출물의 분획물은 아이비엽 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 얻은 것일 수 있으며, 물에 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 얻은 물 분획물을 부탄올로 분획하여 얻은 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것일 수 있다.
또한, 아이비엽 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후 부탄올로 분획하여 얻은 부탄올 분획물 또는 물 분획물일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "당뇨합병증"은, 당뇨병이 장기간 지속되는 경우 유발되는 증상을 의미한다. 당뇨합병증은, 당뇨병의 발병 기준 및 판단 기준과 상이하며 당뇨합병증 치료제는 당뇨병 치료제와는 별개로 사용되고 있다. 당뇨합병증 질환은 대표적으로 당뇨망막병증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 관상동맥질환, 말초동맥질환, 뇌혈관질환 등의 당뇨에 의한 말초혈관질환 등이 있다. 또한, 혈관부종의 예로는, 하지정맥류, 황반부종 또는 황반병반 등이 있다.
본 발명에서는 아이비엽과 황련의 혼합 추출물 또는 아이비엽과 황련 추출물에 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 추가로 혼합한 추출물을 함유하는 조성물이 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 아이비엽 추출물과 황련의 혼합 추출물에 포도씨, 은행잎, 갈근, 결명자, 대황 또는 빌베리 추출물을 첨가하여 제조한 혼합 조성물이 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 2배에서 최대 10배까지 최종당화산물 생성 억제 효과를 나타내었다. 또한, 상기 아이비엽과 황련의 혼합 추출물이 혈액망막장벽 손상 억제, 혈관내피성장인자 생성억제, 무세포성 모세혈관형성 억제, 운동신경 전도 개선 및 신증 개선 효과를 확인함으로써 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 아이비엽과 황련의 혼합 추출물의 일일 투여량은 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 내지 1500 ㎎/㎏이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 아이비엽과 황련의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 조성물은 아이비엽과 황련 혼합 추출물에 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 아이비엽 추출물 및 황련 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량%에 1 중량% 내지 15 중량%로 포함되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명은 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료에 효과적인 천연 추출물로서, 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 조성물로 약학적으로 이용 가능할 분 아니라 건강기능식품으로서도 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 송악 추출물 및 송악 추출물의 분획물의 제조과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 투여에 의한 STZ-당뇨유발 동물모델의 혈관망막장벽 손상에 의한 형광유출의 (a) 형광현미경 및 (b) 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 투여에 의한 STZ-당뇨유발 동물모델의 (a) 단백뇨, (b) 최종당화산물 뇨배출량(AGEs) 및 (c) 8-OHdG 뇨배출량의 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 형광물질의 망막 혈관 외 유출 현상 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 망막조직에서의 혈청 알부민의 혈관 외 유출 현상 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 치밀이음부 단백질인 occludin 소실 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 망막조직에서의 기질단백분해효소(MMP2) 발현 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른, COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 망막혈관 내에 최종당화산물 생성 억제 (a) 형광현미경 및 (b) ELISA 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 망막에서의 혈관내피생성인자(VEGF) 생성 억제 (a) 형광현미경 및 (b) ELISA 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 무세포성 망막 모세혈관 형성 (a) 형광현미경 및 (b) ELISA 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 망막신경세포 손상 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 또는 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 망막조직에서의 활성산소 생성 억제 및 활성산화질소 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은, 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 투여에 의한 당뇨 유발 동물모델의 운동신경전도(MNCV)의 (a) 정성 분석 및 (b) 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는, 본 발명의 일 실시예에 따른 송악 추출물(HR), 송악 추출물의 에틸아세테이트 분획물(EA), 송악 추출물의 부탄올 분획물(Bu) 및 송악 추출물의 물 분획물(W) 처리에 의한 제브라피쉬 모델에서의 유리체 망막 혈관 변화 (a) 형광실체현미경 및 (b) 혈관 두께 변화 분석 결과를 나타낸 것이다(이때, ###는 정상군에 비하여 p<0.001인 것을 의미하며, ***는 고혈당유도군에 대하여 p<0.001인 것을 의미한다.).
도 15는, 본 발명의 일 실시예에 따른 송악 추출물(HR), 호장근 추출물(호장근) 및 송악 추출물과 호장근 추출물 혼합 조성물(HR+호장근) 처리에 의한 제브라피쉬 모델에서의 유리체 망막 혈관 변화 (a) 형광실체현미경 및 (b) 혈관 두께 변화 분석 결과를 나타낸 것이다(이때, ###는 정상군에 대하여 p<0.001인 것을 의미하며, ***는 고혈당유도군에 대하여 p<0.001인 것을 의미한다.).
도 16은, 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 투여에 의한 VEGF 유발 동물모델의 혈액망막장벽 손상에 의한 형광유출 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은, 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 투여에 의한 VEGF 유발 동물모델의 망막 혈액망막장벽 손상에 의한 형광유출 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 분 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 아이비엽 추출물 및 황련 추출물을 포함하는 조성물 제조
건조 아이비엽(300 g)에 30%(v/v) 에탄올 수용액을 가한 후 1차 환류냉각 추출하고 여과하여 여액을 모으고 남은 아이비엽 잔사에 다시 30% 에탄올을 가한 후 2차 환류냉각 추출하여 얻어진 여액을 1차 추출 시 얻어진 여액과 합하여 감압농축하였다. 이를 재차 물을 가하여 공비 농축한 후 건조하여 아이비엽(송악) 추출물을 얻었다.
또한, 건조 황련(300 g)에 50%(v/v) 에탄올 수용액을 가한 후 1차 환류냉각 추출하고 여과하여 여액을 모으고 남은 황련 잔사에 다시 50% 에탄올을 가한 후 2차 환류 추출하여 얻어진 여액을 1차 추출 시 얻어진 여액과 합하여 감압농축하였다. 이를 물을 가하여 현탁시킨 후 수포화 부탄올을 첨가하여 부탄올 분획만을 모아 감압농축하였다. 여기에 물을 가하여 공비 농축한 후 동결건조하여 황련 추출물을 얻었다.
상기의 방법으로 얻어진 아이비엽(송악) 추출물 및 황련 추출물을 3:1의 중량비로 혼합하여 시료 COPH를 제조하였다.
실시예 2: 천연 약재 추출물을 포함하는 혼합 조성물 제조
상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽(송악) 추출물 및 황련 추출물 혼합물(COPH)에 포도씨, 은행잎, 갈근, 결명자, 대황 또는 빌베리 추출물을 일정비율로 혼합하여 각 천연약재 추출물 혼합 조성물 시료 15개를 제조하였다.
1) 아이비엽 추출물, 황련 추출물 및 포도씨 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조
건조 포도씨 추출물은 한림제약의 엔테론®을 구입하여 사용하였다. 구입한 상기 포도씨 추출물을 상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽 추출물 및 황련 추출물 혼합 조성물(COPH)에 1:1, 1:2 또는 1:3의 중량비로 혼합하여 시료 COPH+포도씨1(1:1), COPH+포도씨2(2:1) 및 COPH+포도씨3(3:1)을 제조하였다.
2) 아이비엽 추출물, 황련 추출물 및 은행잎 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조
은행잎 추출물은 SK 케미칼의 기넥신·에프®을 구입하여 사용하였다. 구입한 상기 은행잎 추출물을 상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽 추출물 및 황련 추출물 혼합 조성물(COPH)에 1:3의 중량비로 혼합하여 시료 COPH+은행잎(3:1)을 제조하였다.
3) 아이비엽 추출물, 황련 추출물 및 갈근 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조
건조 갈근에 80%(v/v) 에탄올 수용액을 가한 후 1차 추출하고 여과하여 여액을 모으고 남은 갈근 잔사에 다시 80% 에탄올을 가한 후 2차 추출하여 얻어진 여액을 1차 추출 시 얻어진 여액과 합하여 감압농축하였다. 얻어진 갈근 추출물을 상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽 추출물 및 황련 추출물 혼합 조성물(COPH)에 1:1 또는 1:3의 중량비로 혼합하여 시료 COPH+갈근1(1:1) 및 COPH+갈근2(3:1)을 제조하였다.
4) 아이비엽 추출물, 황련 추출물 및 결명자 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조
건조 결명자에 80%(v/v) 에탄올 수용액을 가한 후 1차 추출하고 여과하여 여액을 모으고 남은 결명자 잔사에 다시 80% 에탄올을 가한 후 2차 추출하여 얻어진 여액을 1차 추출 시 얻어진 여액과 합하여 감압농축하였다. 얻어진 결명자 추출물을 상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽 추출물 및 황련 추출물 혼합 조성물(COPH)에 1:1, 1:2 또는 1:3의 중량비로 혼합하여 시료 COPH+결명자1(1:1), COPH+결명자2(2:1) 및 COPH+결명자3(3:1)을 제조하였다.
5) 아이비엽 추출물, 황련 추출물 및 대황 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조
건조 대황에 40%(v/v) 에탄올 수용액을 가한 후 1차 환류냉각 추출하고 여과하여 여액을 모으고 남은 대황 잔사에 다시 40% 에탄올을 가한 후 2차 환류냉각 추출하여 얻어진 여액을 1차 추출 시 얻어진 여액과 합하여 감압농축하였다. 얻어진 대황 추출물을 상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽 추출물 및 황련 추출물 혼합 조성물(COPH)에 1:1, 1:2 또는 1:3의 중량비로 혼합하여 시료 COPH+대황1(1:1), COPH+대황2(1:2) 및 COPH+대황3(1:3)을 제조하였다.
6) 아이비엽 추출물, 황련 추출물 및 빌베리 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조
건조 빌베리 추출물은 국제약품의 타겐-에프®를 구입하여 사용하였다. 구입한 상기 빌베리 추출물을 상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽 추출물 및 황련 추출물 혼합 조성물(COPH)에 1:1, 1:2, 1:3 또는 3:1의 중량비로 혼합하여 시료 COPH+빌베리1(1:1), COPH+빌베리2(2:1), COPH+빌베리3(3:1) 및 COPH+포도씨4(1:3)를 제조하였다.
실시예 3: 아이비엽 (송악) 추출물, 황련 추출물 및 메트포르민을 포함하는 조성물 제조
상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽(송악) 추출물 및 황련 추출물 혼합 조성물(COPH) 50 중량부에 메트포르민 350 중량부를 첨가하여 시료 COPH+MET를 제조하였다.
실시예 4: 송악 추출물 및 송악 추출물의 분획물의 제조
송악 추출물 및 송악 추출물의 분획물을 하기 방법에 따라 제조하였으며, 제조 과정의 모식도를 도 1에 나타내었다.
1) 송악 추출물(HR)의 제조
음건·세절한 송악을 분쇄한 후 80% 에탄올 1ℓ로 반복 추출한 후, 40℃에서 감압농축하고 감압건조시켜 아이비엽 에탄올 추출물(HR)을 수득하였다.
2) 송악 추출물의 에틸아세테이트 분획물(EA)의 제조
상기 실시예 4-1)에서 제조한 송악 에탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후 에틸아세테이트를 혼합하여 계통분리하였다. 분리된 에틸아세테이트층을 감압농축하여 송악 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(EA)을 수득하였다.
3) 송악 추출물의 부탄올 분획물(Bu)의 제조
상기 실시예 4-2)에서 남은 물층에 n-부탄올을 혼합하여 부탄올 용해층을 분리하였다. 분리된 부탄올층을 감압농축하여 송악 추출물의 부탄올 분획물(Bu)을 수득하였다.
4) 송악 추출물의 물 분획물(W)의 제조
상기 실시예 4-3)에서 남은 물층을 감압농축하여 송악 추출물의 물 분획물(W)을 수득하였다.
실시예 5: 송악 추출물 및 호장근 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조
음건·세절한 호장근을 분쇄한 후 80% 에탄올 1ℓ로 반복 추출한 후, 40℃에서 감압농축하고 감압건조시켜 호장근 추출물을 수득하였다. 수득한 호장근 추출물을 상기 실시예 4와 동일한 순서로 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 계통분획하여 호장근 부탄올 분획물을 제조하고 이를 상기 실시예 4-1)에서 제조한 송악 추출물과 혼합하여 송악 추출물 및 호장근 추출물 혼합 조성물을 제조하였다.
실험예 1: 최종당화산물 ( advanced glycation end - products : AGEs ) 생성 억제 효능 실험
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 각 조성물의 최종당화산물 생성 억제 효능 실험을 실시하였다.
단백질은 소혈청알부민(bovine serum albuminl BSA, Sigma, USA)를 이용하여 과당 및 글루코스와의 결합 정도를 지표로 이용하고, 최종당화산물 생성 억제에 우수한 효능을 갖는 아미노구아니딘(aminoguanidine: AG)를 양성대조군으로 사용하였다.
단백질원은 소혈청알부민(BSA)을 10 ㎎/㎖의 농도로 50 mM 인산완충용액(phosphate buffer; pH 7.4)에 혼합하여 제조하였다. 당원은 0.2 M 과당과 0.2 M 글루코스의 혼합액을 사용하였다. 상기 실시예 1의 COPH(25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 70 ㎍/㎖) 및 양성대조군인 아미노구아니딘(55.505 ㎍/㎖, 74.75 ㎍/㎖ 및 92.5 ㎍/㎖)을 다양한 농도로 DMSO에 녹인 후 15% tween 80을 첨가하였다. 이때 총 DMSO의 함량은 0.2%이었다. 이를 상기 소혈청알부민과 당의 혼합액에 첨가하고 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 이때, 0.02% 소듐아자이드(sodium azide)를 항-박테리아제로서 첨가하였다. 소혈청알부민과 당 혼합액을 대조군으로 사용하였다. 각 시험군과 대조군의 공시험군(blank)은 각각 조제한 후 배양하지 않았으며, 모든 배양액은 3개씩 준비하여 최대한 오차를 피하였다. 배양 7일 후, 각각의 배양액에서 생성된 최종당화산물의 함량을 분석하였다. 최종당화산물의 양을 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Excitation; 350 nm, Emission; 450 nm)로 측정하여 생성 억제효능을 하기 수학식 1로 계산하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[수학식 1]
Figure pat00001

구분 농도(㎍/㎖) 저해효과(%) IC50(㎍/㎖)
COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물) 25 35.53±4.48 46.05±3.02
50 43.06±2.82
70 51.08±0.79
COPH+포도씨1(COPH:포도씨=1:1) 2.5 15.12±1.20 7.29±0.10
5 42.02±1.28
10 65.10±0.36
COPH+포도씨2(COPH+포도씨=2:1) 2.5 17.09±4.48 18.80±0.07
5 39.15±1.32
10 60.85±0.76
COPH+포도씨3(COPH+포도씨=3:1) 2.5 18.03±3.91 21.27±0.58
5 39.15±1.32
10 60.85±0.76
COPH+은행잎(COPH:은행잎=3:1) 2.5 25.09±0.06 8.15±0.14
50 43.98±1.56
10 58.49±1.30
COPH+갈근1(COPH:갈근=1:1) 10 9.41±0.33 47.78±1.24
25 23.73±1.57
50 52.98±2.06
COPH+갈근2(COPH:갈근=3:1) 25 22.02±2.13 73.53±0.79
50 33.28±1.86
75 52.13±0.49
COPH+결명자1(COPH:결명자=1:1) 10 19.54±0.69 39.37±0.60
25 31.18±0.34
50 62.85±0.98
COPH+결명자2(COPH:결명자=2:1) 10 21.80±2.20 46.08±1.22
25 29.94±1.57
50 54.21±0.93
COPH+결명자3(COPH:결명자=3:1) 75 48.39±0.39 77.79±1.24
100 56.32±0.23
125 57.76±0.15
COPH+대황1(COPH:대황=1:1) 5 3.19±1.25 21.50±0.23
10 26.22±0.94
25 57.61±0.76
COPH+대황2(COPH:대황=2:1) 10 7.57±0.26 42.58±1.02
25 29.50±1.10
50 58.78±1.75
COPH+빌베리1(COPH:빌베리=1:1) 10 18.37±0.82 48.13±1.12
25 32.85±0.66
50 50.92±0.91
COPH+빌베리2(COPH:빌베리=2:1) 10 13.62±0.09 51.69±0.21
25 20.08±0.53
50 50.18±0.09
COPH+빌베리3(COPH:빌베리=3:1) 10 12.26±0.37 42.01±0.29
25 33.49±0.77
50 58.01±0.27
COPH+빌베리4(COPH:빌베리=1:3) 5 23.85±1.36 25.19±0.67
10 28.66±0.51
25 50.05±0.70
아미노구아니딘ㆍHCl(양성대조군) 55.5 43.92±0.37 76.47±4.81
74.8 50.86±2.17
92.5 54.91±0.75
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 아이비엽 추출물과 황련 추출물을 포함하는 조성물인 COPH가 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 2배 높은 최종당화산물 생성 억제 효능이 있는 것을 확인하였다.
또한, 아이비엽 추출물과 황련 추출물을 포함하는 조성물 COPH에 포도씨, 은행잎, 갈근, 결명자, 대황 또는 빌베리 추출물을 첨가하여 제조한 혼합 조성물도 양성대조군인 아미노구아니딘에 비하여 2배에서 최대 10배까지 우수한 최종당화산물 생성 억제 효능을 나타내었다.
실험예 2: STZ -유도 당뇨 동물모델(제1형 당뇨)에서 당뇨병성 망막부종 및 신증에 대한 효과 분석
상기 실시예 1에서 제조한 조성물이 당뇨병성 망막부종 및 신증에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 제1형 당뇨 동물모델인 STZ-유도 마우스에 상기 실시예 1의 조성물을 경구투여하여 정상군 및 대조군과 비교하여 효능을 확인하였다.
1) 실험동물
실험동물은 생후 6주령의 male SD rat을 (주) 오리엔트바이오에서 구입하여 1주일 동안 적응시킨 후 사용하였다. 당뇨 유도를 위하여 STZ 60 mg/kg을 복강주사로 rat에 주입한 뒤 일주일 후 혈당을 체크하여 350 ㎎/㎗ 이상의 혈당을 보이는 개체들만 선별하여 당뇨군과 약물 투여군으로 분리하였으며, 사료와 음용수는 자유 급식하였다. 실험군은 정상군(NOR), 당뇨유도군(DM), 상기 실시예 1의 조성물 COPH 25 mg/kg/day 투여군(COPH-25) 및 상기 실시예 1의 조성물 COPH 50 mg/kg/day 투여군(COPH-50)으로 구분하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 조성물 COPH는 0.5% carboxymethylcellulose(CMC)에 현탁하여 조제하였으며, 각 군별로 3주 동안 매일 경구투여 하였다.
2) 혈액망막장벽 손상 분석(Blood-retinal barrier breakage)
혈액망막장벽 손상(망막 부종)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 당뇨를 유발시킨 3주 동안 매주 망막을 분리하여 망막 혈관의 혈관유출현상을 분석하였다.
1주일 마다 각 군별로 무작위로 8마리의 당뇨 유발 동물모델을 부검하였다. 10 mg/kg zolazepam(Zoletil, Virbac, France)과 10 mg/kg xylazine hydrochloride(Rumpun, Bayer, Germany)를 복강 주사하여 마취시킨 후, 흉강을 열러 심장을 확보하고 1 ㎖의 멸균 PBS에 녹여 준비한 10 mg/㎖ fluorescein-dextran(분자량 2×106 ) 및 1 mg/㎖ hochest 33342(Simga, USA)를 좌심실에 주사하였다. 5분 후 안구를 적출하고 망막을 eyecup에서 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aqueous mounting medium으로 mounting하였다. 충분히 건조시킨 후 형광현미경에서 관찰하였다. 정량분석을 위하여, fluorescein-dextran(분자량 2×106 ) 좌심실에 주사한 5분 후 심장으로부터 혈액을 채취하고, 멸균 PBS로 perfusion하여 혈관내 잔류 fluorescein-dextran를 제거한 후 안구를 적출하여 망막을 분리하였다. 분리된 망막은 100 ㎕의 PBS에 균질화하고 원심분리하여 상층액만을 분광형광광도계(Spectrofluorophotometer)로 FITC-dextran 양을 측정하였다. 또한, 앞서 채취한 혈액에서도 FITC-dextran 양을 측정하여 망막의 형광값을 보정하여 tracer의 유출량을 정량하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 정상군(NOR)에서는 혈관내 주사한 형광물질이 망막 혈관 밖으로 유출되는 현상이 보이지 않았으나, 당뇨유도군(DM)에서는 시간이 경과에 따라 혈액망막장벽의 손상에 의해 혈관 밖으로 유출되는 형광물질 양이 증가하여 망막조직이 밝게 관찰되었다. 반면, 상기 실시예 1에서 제조한 조성물인 COPH를 투여한 군에서는 농도의존적으로 형광유출현상이 현저히 억제되었다(도 2a). 또한 정량분석 결과에서도 상기 실시예 1에서 제조한 조성물인 COPH를 투여한 군에서는 농도의존적으로 혈관유출에 의한 망막조직 내 형광물질의 양이 감소하는 것을 확인하였다(도 2b).
3) 신기능지표 변화 분석(신증에 대한 효과 분석)
신증에 미치는 영향을 확인하이 위하여, 단백뇨, 최종당화산물(AGEs) 뇨배출량, 산화스트레스 마커인 8-OHdG 뇨배출량을 분석하였다.
매주 각 군별로 뇨(urine)을 수집하였으며 뇨에 포함되어 있는 불순물을 제거하기 위하여 spin-down 시킨 후 상층액을 실험에 사용하였다. 신장 기능 확인을 위하여 상기 불순물을 제거한 뇨로 소변내 단백질(protein) 농도를 확인하였으며, 단백질 농도는 Bio-Rad kit(Bio-Rad Laboratories Inc, USA)를 이용한 Bradford 방법으로 정량하였다.
Albumin 뇨배출량, 최종당화산물(AGEs) 뇨배출량, 산화스트레스 마커인 8-OHdG 뇨배출량 및 synaptopodin 뇨배출량은 ELISA 방법으로 측정하였다. 먼저, 뇨(urine) 100 ㎕를 96-well plate에 분주한 다음 코팅을 위하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, PBS로 3번 세척하고 blocking을 37℃에서 40분간 배양하고 세척한 다음 각 항체(albumin, AGEs, 8-OHdG, Synaptopodin) 100 ㎕(1:2000 희석)를 희석하여 분주하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 각 well을 PBS로 세 번 세척하고 각각 Horseradish peroxidase conjugated second antibody(1:2000 희석) 100 ㎕를 분주하여 반응시켰다. 그 후, 세 번 세척하고 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)로 발색하고 0.5N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤 450 nm 흡광도로 측정하였다. 측정결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 당뇨 유발군(DM)은 당뇨 유발 6주 만에 3가지 신기능 지표 모두 정상군(NOR)에 비하여 현저하게 증가하였다. 반면, 상기 실시예 1의 조성물인 COPH 투여군은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이는, 상기 실시예 1의 COPH가 당뇨병성 신증을 예방하는 효능이 있음을 의미한다.
실험예 3: db / db 마우스(2형 당뇨) 동물모델에 대한 당뇨성 안구질환 효과 분석
상기 실시예 1 및 실시예 3에서 제조한 조성물이 당뇨성 안구질환에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 2형 당뇨 동물모델인 db/db 마우스에 상기 실시예 1의 COPH(아이비엽 추출물+황련 추출물)와 실시예 3의 COPH+MET(아이비엽 추출물+황련 추출물+메트포르민)을 경구투여 하였다. 실험동물은 생후 6주령 male db/db 마우스를 SLC Japan에서 구입하여 1주일 동안 적응시킨 후 사용하였다. 약물 투여 전 군당 평균혈당 및 체중이 유사하도록 무작위로 군을 분리하였으며, 사료와 음용수는 자유 급식하였다. 실험군은 정상군(NOR), 당뇨군(DM), 메트포르민 350 ㎎/㎏ 투여군(MET-350), COPH 25 ㎎/㎏ 투여군(COPH-25), COPH 50 ㎎/㎏ 투여군(COPH-50) 및 COPH 50 ㎎/㎏+MET 350 ㎎/㎏ 혼합 투여군((COPH-50)+(MET-350))으로 나누었으며, 각각 군별로 12주 동안 매일 1회 약물을 경구투여 하였다. 부검 하루 전에 16시간 동안 절식하였으며, 적출한 장기는 -80℃에 보관하였다.
1) 혈액망막장벽 손상(Blood-retinal barrier breakage) 억제 효과 분석
고혈당이 지속되면, 안구의 망막혈관의 기능이상으로 혈액망막장벽이 손상을 입게 된다. 이에, 상기 실시예 1의 COPH 및 실시예 3의 COPH+MET의 혈액망막장벽 손상 방지 효과를 확인하였다. 각 실험군의 마우스에 pentobarbital sodium(25 ㎎/㎏ 체중)을 복강 주사하여 마취시킨 후, 복강 및 흉강을 열어 심장을 확보하고, 1 ㎖/㎖ 멸균 PBS에 녹여 준비한 50 ㎎/㎖ fluorescein-dextran(2×106 분자량)을 좌심실에 주사하였다. 10분 후, 안구를 적출하고, 좌측 안구를 eyecup에 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aquious mounting medium으로 mounting하였다. 충분히 건조시킨 후 형광현미경으로 관찰하였으며, 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, 망막혈관 유출현상을 고배율에서 관찰하기 위하여, 망막절편조직을 이용하여 혈액 내에 존재하는 물질인 혈청 알부민을 염색하였으며, 결과를 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 정상군(NOR)에서는 별다른 형광의 유출 소견이 관찰되지 않았으나, 당뇨군(DM)에서는 대다수 개체에서 혈액망막장벽 손상으로 형광물질이 혈관 밖으로 새어 나오는 현상이 관찰되었으며, 전반적으로 새어나온 형광물질이 축적되어 정상군(NOR)보다 밝게 나타났다. 반면, 메트포르민 투여군(MET)에서는 형광물질 유출소견이 당뇨군(DM)에 비하여 감소되었으며, 전반적인 밝기도 당뇨군(DM)에 비하여 감소한 양상을 보였다. 실시예 1의 COPH 투여군(COPH)에서는 농도의존적으로 형광유출에 의한 밝기가 감소되었으며, 특히 고농도의 COPH 투여군에서는 형광유출 현상이 현저히 감소되었다. 또한, COPH+MET 혼합 투여군에서는 억제효과가 가장 우수하게 나타났다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 당뇨군(DM)에서는 혈관 주변에 알부민이 새어나와 갈색으로 염색된 양상(화살표)이 관찰되었다. 그러나, 고농도 COPH 투여군과 COPH+MET 혼합 투여군에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다.
2) 면역조직화학 염색 분석
세포간 치밀이음부 단백질 손상, 기질분해효소 발현억제, 최종당화산물 축적 및 혈관내피성장인자 생성억제 효능 확인을 위하여, 면역조직화학 염색 분석을 실시하였다. 부검 시 안구를 적출하여 10% 중성화 포르말린에 하룻밤 고정한 후 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 3회 치환한 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직 블록을 4 ㎛ 두께로 연속 절편을 제작하여 슬라이드에 올려 사용하였다. 탈파라핀 과정과 함수과정을 거친 슬라이드를 내인성 peroxidase 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소 용액에 10분간 반응시킨 후 0.05% tween 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 반응을 제거하기 위하여 5% casein을 이용하여 blocking한 후, 1차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 또는 하룻밤 동안 처리하였다. 1시간 PBS로 세척한 후 labeled streptoavidin biotin(LSAB) 키트(Dako, USA)를 적용한 후 DAB로 발색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 형광염색의 경우 FITC-conjugated된 2차 항체를 각각 1:200으로 희석하여 1시간 반응 시킨 후, DAPI로 염색한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다. 각 분석 결과를 도 6 내지 도 9에 나타내었다.
(1) 세포간 치밀이음부 단백질(tight junction protein) 손상 억제 효능 분석
도 6에 나타난 바와 같이, 당뇨군(DM)의 경우 혈관의 여러 곳에서 occludin의 실타래 같은 연결선이 끊어져 보이는 것을 확인하였다(화살표). 그러나, COPH 투여군과 COPH+MET 혼합 투여군에서는 occludin 소실이 억제되어 있는 것을 확인하였다.
(2) 기질분해효소(Matrix metalloproteinase-2, MMP2) 발현 억제 효능 분석
도 7에 나타난 바와 같이, 당뇨군(DM)에서는 MMP2의 발현이 증가(화살표)되어 있는 반면, COPH 투여군 및 COPH+MET 혼합 투여군에서는 MMP2 발현이 억제되어 있는 것을 볼 수 있다.
(3) 망막혈관 내의 최종당화산물 생성억제 효능
도 8에 나타난 바와 같이, 당뇨군(DM)은 정상(NOR)에 비하여 약 2배 이상 최종당화산물이 생성되었으나, COPH 투여군 및 COPH+MET 혼합 투여군에서는 유의성 있는 억제 효능을 나타내었다.
(4) 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 생성 억제 효능 분석
일반적으로 혈관내피성장인자인 VEGF는 새로운 혈관의 형성을 유도하며, 혈관의 투과도를 증가시키는 역할을 한다. 또한, 기질분해 단백질의 생성을 유도하는 기능도 있다. 따라서, 실시예의 COPH와 COPH+MET의 혈관투과도 억제 효능이 혈관내피생성인자의 생성을 억제함으로써 나타내는 효능인지 확인하기 위하여, VEGF 염색 분석을 수행하고 ELISA로 확인하였다. 이때, ELISA는 -70℃에 보관한 망막을 homogenization buffer(pH 7.6)로 균질화하여 lowry 원리를 이용하여 단백 정량한 뒤 망막 내 VEGF 농도를 확인하기 위하여 VFGF ELISA kit(R&D system, USA)를 이용하여 정량화하였다. 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 당뇨군(DM)에서 망막조직 내 VEGF의 생성이 확연히 증가한 것이 관찰되는 반면, COPH 투여군(COPH) 및 메트포르민 투여군(MET)에서는 VEGF의 발현이 현저히 억제된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 망막조직 내 VEGF 농도를 ELISA로 확인한 결과에서도, COPH 투여군(COPH)에서 농도의존적으로 VEGF의 생성이 억제되었으며, COPH+MET 혼합 투여군에서도 우수한 VEGF 생성 억제 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
3) 무세포성 모세혈관 형성(acellular capillary formation) 억제 효능 분석
당뇨병성 망막증의 초기 증상 중의 하나가 무세포성 모세혈관형성으로 인한 주변세포인 페리사이트(pericyte)의 핵이 사멸되어 망막증으로 진행되는 것이다. 따라서, 무세포성 모세혈관 형성 억제 효능 확인 실험을 수행하였다. 안구에서 망막을 적출하여 흐르는 물에 수세한 후 3% 트립신에 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다이제스트된 망막을 PBS에 옮긴 후 internal membrane(세포 안에 존재하는 소기관들의 막)을 제거하였다. vascular frame은 유리 막대를 이용하여 망막 background로부터 분리하여 슬라이드에 올려놓고 건조시켰다. PAS 염색과 hematoxylin으로 염색하여 세포벽과 핵의 변화를 관찰하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 각 군의 무세포성 모세혈관의 개수를 분석한 결과 당뇨군(DM)은 약 5배 정도 무세포성 모세혈관이 증가한 반면, COPH 투여군 및 COPH+MET 혼합 투여군에서는 유의성 있게 무세포성 모세혈관이 형성이 억제되었다.
5) TUNEL 염색 분석
당뇨병성 망막증에서 실명에 이르는 원인으로는 여러 가지가 있으나, 시신경 소실도 그 중 하나이다. 일반적으로 고혈당에 의한 신경의 소실은 세포사멸에 의해서 일어나는 것으로 알려져 있다. 따라서, 망막절편을 이용하여 세포사멸을 확인할 수 있는 TUNEL 염색 분석을 실시하였다. 조직절편을 탈파라핀하여 수화시킨 후 PBS로 세척한 20 ㎍/㎖ 농도의 proteinase K 용액에 15분간 37℃에서 처리한 다음 다시 PBS로 세척하였다. TUNEL 반응 혼합 용액(Insitu cell death detection kit, AP, Roche, Germany)을 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 현미경로 관찰하였다. 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 당뇨군(DM)의 경우 망막조직 내 가장 안쪽에 존재하는 신경세포인 망막신경절세포(ganglion cell)의 핵에서 강한 형광반응(화살표)이 관찰되는 반면, COPH 투여군에서는 농도의존적으로 TUNEL 염색된 망막신경절 세포의 수가 감소하였으며, COPH+MET 혼합 투여군에서는 가장 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
6) 산화스트레스 억제 효능 분석
당뇨병성 망막증을 유발하는 주요 기전으로는 여러 가지가 있으나, 산화적 스트레스가 중요 원인의 하나로 여겨지고 있다. 고혈당에 의해 유발되는 활성산소(ROS)나 활성산화질소(RNS)는 망막에 존재하는 여러 세포의 손상을 야기한다. 따라서, 망막절편을 이용하여 ROS의 마커인 8-OHdG와 RNS 마커인 nitrotyrosine을 염색하여 억제 효과를 분석하였다. 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 8-OHdG, nitrotyrosine 모두 당뇨군(DM)에서는 망막조직 내 존재하는 망막신경절세포를 비롯한 대부분의 세포에서 강하제 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, COPH 투여군에서는 농도의존적으로 염색된 세포의 수가 감소하였으며, COPH+MET 혼합 투여군에서는 가장 현저히 억제된 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 4: db / db 마우스(제2형 당뇨) 동물모델에서의 당뇨병성 신경병증 억제 효능 분석
상기 실시예 1에서 제조한 아이비엽 추출물 및 황련 추출물의 혼합 조성물(COPH)이 당뇨 유발 동물모델의 신경병증에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 신경전도 지연현상을 측정하였다.
1) 실험동물
실험동물은 6주령의 male db/db 마우스(제2형 당뇨 동물 모델)를 SLC Japan에서 구입하여 1주일 동안 적응시킨 후 사용하였다. 일주일 후 혈당을 측정하여 350 mg/㎗ 이상인 개체들만 선별하여 무작위로 군을 분리하였으며, 사료와 음용수는 자유 급식하였다. 상기 실시예 1의 조성물인 COPH는 0.5% carboxymethylcellulose(CMC)에 현탁하여 조재하였으며, 6주 동안 매일 경구투여하였다. 실험군은 정상군(NOR), 당뇨유발군(DM), 상기 실시예 1의 조성물인 COPH 25 mg/kg/day 투여군(COPH-25) 및 상기 실시예 1의 조성물인 COPH 50 mg/kg/day 투여군(COPH-50)으로 구분하였다. 매주 1회 체중과 음수 및 사료 섭취량을 측정하였다.
2) 신경전도 측정(Mortor neuron conduction velocity, MNCV)
당뇨에 의한 말초시경의 신경전도 지연 현상 분석을 위하여 신경전도측정을 실시하였다. 상기 실험예 4-1)의 마우스를 isoflurane으로 마취하고 체온 유지를 위하여 37℃ 온열판 위에 고정한 후 신경전도측정기(AD Intrument, Australia)를 이용하여 미부신경에서 측정하였다. 꼬리 기시부에서 침전극을 이용하여 전기자극을 주고 5 cm 떨어진 부위에서 활동전위를 기록하였다. 활성전극과 대조전극 사이는 1 cm 이격하였다. 자극시간 0.1 msec, 여과주파수 10 Hz~10 kHz, 기록감응도 5 mV/div 및 기록속도 1 ms/div로 측정을 실시하였다. 총 10회 측정하여 평균값을 계산하였다. 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 당뇨유발군(DM)의 경우에는 당뇨 유발 6주 경과 후에 정상군(NOR)에 비하여 신경전도 속도가 유의적으로 감소하였다. 그러나 본 발명의 상기 실시예 1의 조성물인 COPH 투여군에서는 농도의존적으로 신경전도 속도의 감소가 개선되었으며, COPH 50 mg/kg/day 투여군인 COPH-50에서는 유의적인 신경전도 속도 개선 효과를 나타내었다. 이는, 본 발명의 상기 아이비엽(송악잎) 추출물 및 황련 추출물의 혼합 조성물이 당뇨병에 의한 신경병증 예방에 효과적임을 의미한다.
실험예 5: 제브라피시에서의 항당뇨합병증 효과 분석
상기 실시예 4 및 실시예 5에서 제조한 송악 추출물(HR), 송악 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(EA), 송악 추출물의 부탄올 분획물(Bu), 송악 에탄올 추출물의 물 분획물(W) 및 송악 추출물과 호장근 추출물 혼합 조성물(HR+호장근)의 항당뇨합병증 효과 확인을 위하여 제브라피시 발생배를 이용하여 유리체 혈관 변화 분석을 실시하였다.
1) 제브라피쉬 발생배 제조 및 약물처리
제브라피쉬(Zebrafish)는 척추동물 중의 하나로, 실험 기간이 상대적으로 짧으며 마우스 등의 설치류에 비해 가격이 비교적 낮은 장점으로 최근 동물 실험으로 각광을 받고 있는 In-vivo 시스템 모델이다. 제브라피쉬 발생배는 혈관내피세포에 특이적으로 형광단백질(green fluorescence protein)을 발현하는 형질전환 제브라피쉬(Tg(kdr:EGFP)) 암수를 교배하여 발생배(embryo)를 획득하였다.
수정 후 24시간에 형광을 발현하는 발생배를 선별하여 24 well plate에 분주한 후 30 mM glucose로 고혈당 환경을 유도하였다. 상기 실시예 4 및 실시예 5에서 제조한 각 조성물은 glucose 용액과 함께 희석하여 처리하였다. 이때, 실험군은 정상군(NOR), 고혈당유도군(HG), 송악 추출물 0.5 ㎍/㎖ 처리군(HR(0.5)), 송악 추출물 1 ㎍/㎖ 처리군(HR(1)), 송악 추출물 5 ㎍/㎖ 처리군(HR(5)), 송악 추출물의 에틸아세테이트 분획물 1 ㎍/㎖ 처리군(EA(1)), 송악 추출물의 에틸아세테이트 분획물 5 ㎍/㎖ 처리군(EA(5)), 송악 추출물의 부탄올 분획물 1 ㎍/㎖ 처리군(Bu(1)), 송악 추출물의 부탄올 분획물 5 ㎍/㎖ 처리군(Bu(5)), 송악 추출물의 물 분획물 1 ㎍/㎖ 처리군(W(1)), 송악 추출물의 물 분획물 5 ㎍/㎖ 처리군(W(5)), 호장근 추출물 0.5 ㎍/㎖ 처리군(호장근(0.5)), 호장근 추출물 1 ㎍/㎖ 처리군(호장근(1)), 송악 추출물과 호장근 추출물 혼합 조성물 0.5 ㎍/㎖ 처리군(HR+호장근(0.5)) 및 송악 추출물과 호장근 추출물 혼합 조성물 1 ㎍/㎖ 처리군(HR+호장근(1))로 구분하였다.
2) 유리체 혈관 변화 분석
고혈당 유도 조건에서 5일간 처리한 후 4% paraformaldehyde를 이용하여 하루 동안 고정하였다. 고정된 개체에서 수정체를 분리하여 형광실체현미경 하에서 유리체 혈관의 변화를 분석하였다. 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 고혈당유도군(HG)는 정상군(NOR)에 비하여 혈관이 확장되었다. 그러나 상기 실시예 4의 송악 추출물(1 ㎍/㎖ 또는 5 ㎍/㎖)을 처리한 군에서는 고혈당에 의한 혈관 확장이 유의적으로 억제되었으며, 특히 송악 추출물 5 ㎍/㎖을 처리한 경우에는 정상군(NOR) 혈관과 거의 유사한 상태를 나타내었다. 또한, 송악 추출물의 에틸아세테이트 분획물(EA) 및 부탄올 분획물(Bu)는 전 실험 농도에서 고혈당으로 유도된 유리체 망막 혈관 확장을 유의성 있게 억제하였으며, 특히 송악 추출물의 에틸아세테이트 분획물 5 ㎍/㎖을 처리한 군에서는 거의 정상군(NOR)에 가까운 상태를 나타내었다.
또한, 도 15에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 5의 송악 추출물과 호장근 추출물 혼합 조성물을 처리한 경우에도 유리체 망막 혈관 직경이 정상군(NOR)과 유사하게 유지되는 것을 확인하였다.
실험예 6: VEGF 유도 동물모델에서의 망막혈액장벽 붕괴 억제 효능 분석
상기 실시예 1의 아이비엽 추출물과 황련 추출물의 혼합 조성물(COPH)의 혈관부종으로 인한 증식성 망막증의 예방 또는 치료 효과를 확인하기 위하여, VEGF를 안구 내에 주사하여 병을 유발하고 동시에 상기 실시예 1의 아이비엽 추출물과 황련 추출물의 혼합 조성물(COPH)을 안구 내 유리체에 투여하여 당뇨병성 망막증의 초기증상 중 하나인 망막혈액장벽(blood-retinal barrier) 붕괴 현상 예방 효능을 평가하였다. 혈액장벽이 붕괴되면 망막의 경우에는 혈관으로부터 단백질, 적혈구 등이 빠져나가 망막의 황반에 고이게 되고 더 나아가 증식성 망막증으로까지 진행되게 되며, 하지의 경우에는 정맥에 고이에 되어 하지정맥류로 이어지게 된다.
1) 실험동물
실험동물은 생후 7주령 male SD rat를 (주)오리엔트에서 구입하여 1주일 동안 적응시킨 후 사용하였다. 사료와 음용수는 자유 금식하였다. 혈액망막장벽의 붕괴를 유도하기 위하여 Rat VEGF protein(Vascular endothelial growth factor, R&D research, USA) 200 ng을 멸균 생리식염수에 녹여 hamilton syringe(Hamilton, USA)를 이용하여 좌측 안구 내에 5 ㎕를 투여하였다. 우측 안구에는 대조군으로 생리식염수만 동량 투여하였다. COPH 투여군의 경우 0.5 DMSO 용액에 녹여 준비한 후 안구 내 최종농도 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖가 되도록 좌우측 안구 모두에 5 ㎕씩 투여하였다. 일반적으로 rat의 안구 내 유리체 양은 대략 50~55 ㎕이므로, 안구 내 최종농도보다 12배 농축된 12 ㎍/㎖, 60㎍/㎖ 및 120 ㎍/㎖의 약물을 투여하여 최종농도를 맞추었다.
2) 혈액망막장벽 손상 분석
약물투여 24시간 후 각 rat를 pentobarbital sodium(25 ㎎/㎏ 체중)을 복강 주사하여 마취시켰다. 복강 및 흉강을 열어 심장을 확보하고, 1 ㎖/㎖ 멸균 PBS에 녹여 준비한 50 ㎎/㎖ fluorescein-dextran(2×106 분자량)을 좌심실에 주사하였다. 10분 후 안구를 적출하고, 좌측 안구의 경우 망막을 eyecup에서 분리하였다. 분리된 망막을 슬라이드 위에 올려놓고 aqueous mounting medium으로 mounting하였다. 충분히 건조시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다. 정량적인 분석을 위해서, 50 ㎎/㎖ fluorescein-dextran(2×106 분자량)을 좌심실에 주사한 10분 후 채혈을 하고 생리식염수를 이용하여 60 ㎖/min의 속도로 혈관 내 잔류하는 fluorescein-dextran을 제거한 후 안구를 적출 망막을 분리하였다. 분리된 망막은 무게를 측정한 후 50 ㎕의 PBS 용액에서 균질화하여 잘게 분쇄한 후 원심분리하여 얻은 상층액을 ELISA reader로 형광을 측정하였다. 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 망막의 혈관에 형광물질을 주입하여 혈액망막장벽손상에 의한 형관물질의 혈관 밖 유출 현상을 관찰해본 결과, 정상군(NOR)에서는 별다른 형광의 유출 소견이 관찰되지 않았으나, VEGF 안구 내 투여군에서는 모든 개체에서 혈액망막장벽 손상으로 형광물질이 혈관 밖으로 새어나오는 것을 관찰하였다. 반면, COPH 투여군에서는 VEGF에 의한 형광물질 유출현상이 감소되어, 형광 밝기가 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 17에 나타난 바와 같이, 정량적인 분석 결과에서도 VEGF 투여군에서는 정상군(NOR)에 비하여 5배 이상 형광물질이 혈관 밖으로 유출된 반면, COPH 투여군은 농도의존적으로 감소하였으며, 5 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖ 농도에서는 정상군과 동일할 정도로 혈액망막장벽 손상에 의한 형광 유출을 억제하는 것을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 아이비엽과 황련의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아이비엽 추출물과 황련 추출물을 10:1 내지 1:10으로 혼합하여 제조하거나, 또는 아이비엽과 황련을 10:1 내지 1:10으로 혼합한 후 추출하여 제조한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 메트포르민(metformin)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아이비엽 추출물 및 황련 추출물은 각각 아이비엽 및 황련을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 수득한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 추출은 상온 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 초임계 또는 증기 추출인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 암, 당뇨성 심장병, 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혈관부종은, 하지정맥류, 황반부종 또는 황반병반인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 아이비엽과 황련의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 또는 혈관부종의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 아이비엽 추출물과 황련 추출물을 10:1 내지 1:10으로 혼합하여 제조하거나, 또는 아이비엽과 황련을 10:1 내지 1:10으로 혼합한 후 추출하여 제조한 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 호장근, 대황, 갈근, 은행잎, 결명자, 블루베리, 빌베리, 복분자, 감초, 포도씨 또는 알로에 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 아이비엽 추출물 및 황련 추출물은 각각 아이비엽 및 황련을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들 혼합용매로 추출하여 수득한 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 추출은 상온 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 초임계 또는 증기 추출인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 당뇨합병증은 당뇨성 망막병증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 암, 당뇨성 심장병, 당뇨성 골다공증 또는 당뇨성 동맥경화증인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  15. 제9항에 있어서, 상기 혈관부종은, 하지정맥류, 황반부종 또는 황반병반인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
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