KR102212158B1 - 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 감초 추출물을 포함하여 망막색소상피세포의 DNA 손상 및 세포사멸을 억제하는 효과가 우수함과 동시에 Nrf2 및 HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하고 천연 추출물을 포함하여 부작용의 문제가 없으며, 주기적 또는 장기적으로 사용할 수 있는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 감초 추출물을 포함하여 망막색소상피세포의 DNA 손상 및 세포사멸을 억제하는 효과가 우수함과 동시에 Nrf2 및 HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하고 천연 추출물을 포함하여 부작용의 문제가 없으며, 주기적 또는 장기적으로 사용할 수 있는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
정상 시력은 빛이 눈의 앞쪽으로 들어올 때 발생하는데 이는 광수용체(photoreceptors)라 불리는 눈 뒤쪽 내부에 있는 매우 민감하고 약한 세포의 위로 초점이 맞춰지는 것이다. 광수용체는 다른 신경세포(neurons)와 함께 눈의 망막을 구성한다. 황반(macula)은 선명한 중심시력을 담당하는 중심와(fovea)를 포함하는 눈의 뒤쪽 중심 부근에 위치하는 망막의 일부이다. 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직을 황반이라고 하는데, 빛 자극에 반응하는 시세포의 대부분이 이곳에 모여 있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다.
망막은 다양한 원인에 의하여 망막염, 황반변성, 당뇨병성 망막증, 황반부종, 망막 손상, 녹내장, 시신경병증, 망막 혈관 질환, 안혈관 질환, 녹내장 등의 다양한 질환을 앓을 수 있는데, 특히, 황반부(망막색소상피와 부르크막 및 맥락막 모세혈관 복합체)에 여러 가지 원인에 의해 변성이 일어나 시력 장애를 일으키는 안과 질환을 황반 변성(증)이라 하고, 황반 변성은 녹내장, 당뇨병성 망막 질환과 더불어 3대 실명 질환의 하나로 알려져 있다.
이러한 황반 변성은 중심 시력에 영향을 주어 시야 가운데가 흐릿하게 보이고, 중심 암점, 변시증(사물이 찌그러져 보이는 증상) 또는 국소 부분의 시력 상실로 인해 독서, 운전 등의 정교한 활동 수행을 곤란하게 할 수 있으며, 심할 경우 실명으로까지 이어지는 매우 심각한 질병이다.
황반 변성을 일으키는 가장 대표적인 원인으로는 연령 증가를 들 수 있으며, 그 밖에 가족력, 인종, 흡연 등과도 어느 정도 연관성이 있다고 알려져 있다. 특히, 노인성(퇴행성) 황반 변성(AMD; age-related macular degeneration)은 이미 서구 사회에서 55세 이상의 노인에게서 실명을 일으키는 가장 흔한 질환이 된지 오래이며, 미국에서는 이미 노인 실명의 1위를 차지하고 있고, 국내에서도 고령화가 급속히 진행되면서 환자가 크게 늘고 있다. 이는 서구화된 식습관과 더불어 오존층 파괴로 인한 자외선 노출 증가로 인한 결과로 예측된다. 특히, 황반 변성은 본래 노인층에서 주로 발생하는 질환이었으나, 최근 들어 국내에서도 발명 연령대가 60대 노년층에서 4, 50대 중장년층으로 낮아지고 있는 추세로서, 중장년층 발병률 또한 최근 수년 동안 급속히 증가하고 있다.
황반 변성은 크게 건성과 습성 두 유형으로 분류할 수 있으며, 황반 변성 환자 중 약 90% 정도는 건성 황반 변성 환자이다. 황반 변성의 한가지 형태인 건성 황반 변성은 위축성(비삼출성)으로 분류되어 지리적 위축(geographical atrophy)으로 불리우며, 드루젠(drusen)이 망막하 수준으로 망막상에 침착되는 초기 단계의 질병이다. 이러한 드루젠의 침착은 황반 조직의 노화 또는 박막화를 일으킬 수 있다. 이러한 드루젠 침착의 결과로서, 중심 시력의 손상이 점차 발생할 수 있다. 빈번히, 노인성 황반 변성은 건성 황반 변성과 함께 개시한다.
황반 변성 중 건성 형태일 경우, 초기에는 징후가 없어 자가진단이 어려운 것이 특징이고 서서히 진행되어 실명 위험성이 상대적으로 적지만, 건성 황반 변성은 아직까지 확립된 치료법이 없는 실정이므로, 예방의 필요성이 더욱 강조되고 있다. 습성 황반 변성은 불완전한 혈관이 망막하에서 비정상적으로 성장하고 누출을 개시하는 신생혈관 형태의 변성으로, 삼출성으로 분류된다. 이러한 누출의 결과로서, 영구적 손상이 망막의 광수용체 세포에서 발생하고, 이는 궁극적으로 이들 세포의 사멸 및 이에 따라 맹점(blind spot)을 유발한다. 시야 손실이 작을 수 있는 건성 황반 변성과는 달리, 습성 황반 변성에서 발생하는 시야 손실은 심각할 수 있다. 실제로, 노인성 황반 변성을 갖는 환자 중의 10%만이 습성 황반 변성을 겪지만, 현저한 시야 손실을 겪고 있는 노인성 황반 변성 환자 중의 66%는 당해 손실이 습성 황반 변성에 직접 기인할 수 있다고 보고되었다. 습성 황반 변성은 망막 내 또는 그 아래에 노폐물이 쌓여 신생혈관이 성장해 약한 신생혈관의 파열로 황반부에 손상을 주어 시력손실이 발생하는 반면, 건성 황반 변성은 황반부 조직이 얇아지거나 위축되어 노폐물이 쌓여 망막세포를 사멸시킨다.
한편, 글로벌데이터 사에 따르면, 현재 노인성 황반 변성 치료제는 대부분 타겟을 혈관내피세포 성장인자(VEGF)로 하고 있고, VEGF 저해제인 '루센티스 (라니비주맙)'와 '아바스틴 (베바시주맙)' 및 '아일리아 (애플리버셉트)'에 의해 전체 황반 변성 치료제 시장의 98%가 점유된 것으로 집계된다. 그러나 상기 노바티스의 '루센티스'는 약가가 매우 고가일 뿐만 아니라, 제넨테크 사에 따르면 라니비주맙이 뇌졸증 발생 위험을 높일 수도 있다고 경고한 바 있으며, 안 내에 주사하는 제제로 투여의 불편함이 단점으로 지적되고 있다.
또한, 식약처에서 개별 인정형으로서 승인된 루테인은 망막의 황반을 보호하는 성분으로 황반색소밀도를 유지시켜 황반의 변성을 예방할 수 있지만 루테인과 같은 카로티노이드를 함유한 보충제를 장시간 사용하면 폐암 발명 위험이 높아진다는 연구결과가 있고, 특히, 흡연자에게는 더 위험한 것으로 나타났다.
더욱이, 이들 모두는 습성 황반 변성 치료제이고, 건성 황반 변성에 대한 치료제는 아직까지 없는 실정이다.
본 발명의 목적은 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 망막색소상피세포의 DNA 손상 및 세포사멸을 억제하는 효과가 우수함과 동시에 Nrf2 및 HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하는 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 천연 추출물을 포함하여 부작용의 문제가 없으며, 주기적 또는 장기적으로 사용할 수 있는 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물은 감초 추출물을 포함한다.
상기 조성물은 망막색소상피세포의 DNA 손상 및 세포사멸 억제 효과를 나타내는 것이다.
상기 조성물은 Nrf2 및 HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하는 것이다.
상기 망막 질환은 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 증식성 망막병증 및 미숙아 망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환이다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출하는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 기능성 식품은 상기 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 이용하여 제조한 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 의약품은 상기 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 이용하여 제조한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당엽계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.
본 명세서의 용어 "예방"은, 예를 들어, 질환 원인에의 노출에 의해, 질병이 생길 위험이 있는 무증상 대상체에서, 질병 또는 질병과 관련된 증상의 출현을 차단함을 지칭한다.
본 명세서의 용어 "치료"는 발병된 후에 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개재를 지칭한다. 상기 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상과 관련한 "개선" 및 “완화”는 치료의 관찰 가능한 이로운 효과를 지칭한다. 이로운 효과는 걸리기 쉬운 대상에서 질병의 임상적인 증상의 지연된 발병, 질병의 일부 또는 모든 임상 증상의 중증도의 감소, 질병의 보다 느린 진행, 대상의 전반적인 건강 또는 복지의 개선, 또는 특정 질병에 특이적인 것으로 당업계에 널리 공지된 다른 변수에 의해 증명될 수 있다. 망막 질환의 치료는, 예를 들어, 시력의 개선, 망막 질환으로 인한 임상 증상의 감소, 또는 안구의 건조 정도, 예를 들어 망막 질환에 특이적인 것으로 당업계에 널리 공지된 다른 변수에 의해 증명될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물은 감초(Glycyrrhiza uralensis) 추출물을 포함하는 것이다.
감초(Glycyrrhiza uralensis)는 Glycyrrhiza 속에 속하는 다년생 초본으로 오랫동안 천연 감미료 또는 다양한 질환의 예방과 치료를 위한 처방에 널리 사용되어 왔다. 감초의 뿌리와 줄기에는 다양한 glycyrrhizin, 플라보노이드(flavonoid) 및 다당류(polysaccharide) 등이 풍부하게 함유되어 있으며, 최근 감초의 항산화능이 Nrf2 전사 인자의 활성과 연관이 있음이 보고된 바 있으나, 산화적 스트레스에 대한 DNA 손상 또는 apoptosis 차단 효과에서 Nrf2의 역할에 대해서는 조사된 바 없다.
상기 조성물은 망막색소상피세포의 DNA 손상 및 세포사멸 억제 효과를 나타내는 것이다.
망막(retina)은 척추동물의 중추 신경계 내에서 가장 잘 연구된 기관으로, 과거 수십 년 동안 이루어진 연구에 의해 세포의 상세한 모양, 신경의 시냅스 연결, 각 망막 신경세포들의 생리적 현상이 자세히 규명되었다. 망막은 신체 내에서 대사 작용이 가장 활발한 조직 중의 하나로 산소요구량이 높으며 지속적으로 빛에 노출되고 고농도의 불포화 지방산을 포함하고 있어 이러한 요소들이 산화적 손상의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.
망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cell)는 망막 감각신경 부분의 바깥에 존재하며, 색소가 있는 세포들을 지칭한다. 망막과 맥락모세혈관 망막의 가장 바깥에서 단층으로 존재하며, 망막의 발달에 관여하고 간상세포와 원추세포를 보호하는 역할을 수행한다. 망막색소상피세포는 망막과 맥락모세혈관 사이에 단일층을 이루고 있는 세포로서 생리적으로 광수용체의 영양공급과 대사물질의 배출 및 세포탈락물의 탐식 등 시력의 유지에 중요한 역할을 하며 산소 소모량이 많아 산화스트레스에 노출되어 있다.
산화 스트레스(oxidative stress)는 활성산소가 많아져서 몸에서 이를 관리할 수 있는 정도를 벗어나 세포에 지속적인 위협을 가하게 되는 상태로 미토콘드리아의 DNA 손상, 호흡 사슬 전이를 억제, 세포막 투과증과 같은 여러 기전으로 세포 사멸을 일으킬 수 있다.
세포 내 에너지 생산에 핵심적으로 관여하는 미토콘드리아는 ROS 생성에 관여하는 주요 기관이면서 ROS에 의해 손상을 받는 대표적인 기관이다. 특히 미토콘드리아는 산화적 스트레스에 취약하며, 과도한 ROS는 미토콘드리아의 기능 손상을 유발하여 에너지 항상성의 불균형을 야기한다. 특히 망막색소상피세포에서도 ROS 및 자유 라디칼에 의한 산화적 스트레스는 미토콘드리아 손상을 일으키며, 이는 심각한 망막색소상피세포의 기능 장애를 유발하여 AMD에서 맥락막 신생 혈관 형성의 위축을 유발하는 원인이 된다.
망막색소상피세포에서 과도한 ROS의 생성은 주요 세포 구성 단백질의 변성뿐 만 아니라 심각한 DNA 손상을 유발하여 AMD의 발병 원인으로 작용하므로 ROS의 생성 억제는 망막색소상피세포의 항상성 유지에 필수적이다. 산화적 스트레스에 의하여 DNA 이중 나선이 절단되면 히스톤 변이체 γH2AX 단백질의 인산화(serine 139)가 유발되며, 이는 DNA 손상을 평가하기 위한 바이오 마커로서 광범위하게 사용되고 있다.
세포사멸(apoptosis)은 세포괴사(necrosis)와는 구별되는 세포 내의 자발적이고 계획된 세포사 (programmed cell death)이며, 세포사멸을 유발하는 다양한 기전들이 제시되어 있다. 세포사멸의 대표적인 유발인자는 산화 스트레 스(oxidative stress), 질소산화물 합성효소 (nitric oxide synthase), 미토콘드리아 (mitochondria)를 매개로 하는 케스페이즈 의존적 (caspase-dependent) 또는 비의존적 (caspase-independent) 기전 등이다. 대다수의 망막 질환은 특정 세포의 세포사멸로 인해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 연령 관련 황반 변성(age related macular degeneration) 또는 녹내장 (glaucoma)이 대표적이다.
특히, 황반변성(age-related macular degeneration, AMD) 환자에서 시력의 손실은 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cell)의 이상과 함께, 광 수용체(photoreceptor) 손상, Bruch 막의 비대 및 맥락막 모세혈관층의 전관류 등을 동반한다. 특히 산화적 스트레스에 의한 과도한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성은 망막색소상피세포의 주요 세포 구성 성분을 산화시키고 미토콘드리아 기능 저하 및 DNA 손상과 연계된 내재적 세포사멸(intrinsic apoptosis) 경로를 활성화하여 AMD뿐만 아니라 당뇨성 망막병증, 증식성 망막병증 등 다양한 망막 질환의 주요 원인 중 하나로 작용한다. 따라서 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하는 것은 AMD를 포함한 망막 질환의 예방과 치료를 위한 중요한 접근법이 될 수 있다.
상기 조성물은 Nrf2 및 HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하는 것이다.
nuclear factor erythroid-derived-2-like 2 (Nrf2)와 항산화 반응 요소(antioxidant responsive element, ARE) 시스템은 다양한 망막 질환에서 필수 항산화 경로로 중요한 역할을 한다. 생리적 조건에서 Nrf2는 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)과 결합하여 세포질에 비활성의 형태로 존재한다. 그러나 세포가 산화적 스트레스를 방어해야 할 환경에 노출되면, Nrf2는 Keap1로부터 분리되어 핵으로 이동하여 antioxidant response elements (ARE)에 결합하고 ARE 의존성 항산화 효소들의 전사 활성을 촉진한다. 그중 대표적인 Nrf2 의존적 유전자인 heme oxygenase-1 (HO-1)은 heme의 분해뿐만 아니라 산화적 손상을 받는 세포를 보호하기 위한 핵심적인 항산화 효소로 작용한다. 아울러 항산화 효능을 갖는 다양한 천연물들이 Nrf2/HO-1 신호 경로를 활성화시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호할 수 있음이 입증되고 있다.
상기 망막 질환은 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 증식성 망막병증 및 미숙아 망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환이다.
황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 눈 안쪽 망막 중심부에 위치한 황반부에 변화가 생겨 시력장애가 생기는 질환으로 황반은 망막이라는 안구내 신경층에서 가장 중요한 역할을 수행하는 부위이다. 약 1.5mm의 반지름을 가지는 망막의 중심부위이며, 이 부위에는 빛을 느낄 수 있는 광수용체가 밀집되어 있다. '황반'은 망막의 중심부로 시력의 대부분을 담당한다. 황반의 변성에는 여러 가지 종류가 있으며, 일반적으로 황반변성이라는 용어는 대개 연령관련 황반변성 즉, 망막의 노화에 의해서 발생하는 변성을 말한다. 그러나 넓은 의미로는 여러가지 원인으로 황반에 변성이 오는 질환들을 통틀어서 지칭하기도 한다.
당뇨병성 망막병증은 당뇨병 환자에서 오랜 기간 고혈당에 노출된 망막이 손상을 입는 안과 합병증이다. 정확한 원인은 알려져 있지 않지만, 장기간 고혈당에 노출된 조직의 단백질이 당화가 되면서, 혈관 내피세포가 손상을 입어 생기는 것으로 알려져 있다. 망막의 가는 혈관이 약해지면서 혈관 내 혈액성분이 빠져나가 부종이 생기거나, 망막에 지방 성분이 쌓이거나, 계속 진행되면 망막 주변에 비정상적인 신생혈관이 나타나는 경우 등이 생긴다.
미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity, ROP)은 망막혈관형성이 완성되기 이전에 출산된 미숙아에서 망막혈관 이상이 발생하는 질환군을 말한다. 1950년대에는 과도한 산소투여가 원인이 될 수 있다고 하여 산소투여를 절제하여 발생률이 급격히 감소한 바 있으나, 1980년대부터 신생아 의학이 발전함에 따라 미숙아의 생존율이 높아져 왔고 미숙아망막병증의 발생률도 다시 증가하여 지금은 소아 실명의 주요 원인이 되고 있다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출하는 것이다.
구체적으로, 감초 추출물을 제조하기 위해서는 천연물을 분쇄하는 단계; 유기 용매를 사용하여 상기 분쇄물을 침출시키는 단계; 시료를 침출 후 건조시키는 단계; 건조된 시료를 유기 용매를 사용하여 재 침출시키는 단계; 시료를 침출 후 건조시키는 단계; 물을 이용하여 침출시키는 단계; 및 침출하는 단계를 포함하여 천연 추출물을 획득할 수 있다.
상기 유기 용매를 사용하여 추출한 천연 추출물을 유기 용매를 사용하여 분획을 실시하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 침출법 및 환류 추출법 등 당업계의 통상적인 추출 방법일 수 있다. 구체적으로 세척 및 건조로 이물질이 제거된 천연물을 물, 탄소수 1내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 용매들을 순차적으로 시료에 적용하여 추출한 추출물일 수 있다.
상기 환류 추출법은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 100 mL기준으로, 천연물의 분쇄물 10 내지 30g, 환류 시간 1 내지 3시간 및 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 물에 의한다. 보다 구체적으로, 탄소수 1 내지 6의 알코올 100 mL 또는 물 100 mL 기준으로, 천연물의 분쇄물 10 내지 20g, 환류 시간 1 내지 2시간 및 70 내지 90%의 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 물에 의한 것이다.
상기 침출법은 15 내지 30℃, 24 내지 72시간 동안 진행하며, 추출 용매로 물 또는 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올을 이용한다. 보다 구체적으로는 20 내지 25℃, 30 내지 54시간 동안 진행하며, 추출 용매는 물 또는 70 내지 80%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다.
상기 초음파 추출법은 30 내지 50℃, 0.5 내지 2.5시간 동안 반응을 진행하며, 추출용매는 물 또는 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다. 구체적으로는 40 내지 50℃, 1 내지 2.5시간 동안 추출하며, 추출용매로 물 또는 70 내지 80%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다.
상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72 시간 동안 방치될 수 있으며, 보다 구체적으로 24 내지 48시간 동안 방치될 수 있다.
추출 후, 추출물은 새로운 분획 용매를 순차적으로 적용하여 분획할 수 있다. 분획시 사용하는 분획 용매는 물, 헥산, 부탄올, 에틸아세트산, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드이다.
추출물 또는 분획물을 얻은 후에는 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
상기 유기 용매를 사용하여 추출한 감초 추출물을 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 이용하는 경우 세포 독성이 낮아 상대적으로 높은 농도에서 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있으며, 해조류 특유의 이취로 인한 떨어지는 기호도를 상승시킬 수 있다.
바람직하게 본 발명의 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물은 상기 감초 추출물 이외에 검인 추출물 및 참비름 추출물을 추가로 더 포함한다.
상기 검인은 가시연꽃의 종자로, 가시연꽃의 종자 성숙기에 채취하여 종자만을 꺼내어 햇볕에 말린 것을 의미한다. 상기 가시연꽃(Euryale ferox Salisb.)은 늪이나 연못에 자라는 일년초로 가시가 있으며 수염뿌리가 많이 나온다. 종자가 발아해서 나오는 잎은 작으나 점차 큰 잎이 나오며 표면에 주름이 진다. 꽃은 7 내지 8월 가시가 돋는 긴 꽃자루가 자라서 끝에 1개 달린다. 열매는 액과로 둥글며 종자는 육질 종의에 싸인다.
참비름(Amaranthus mangostanus)은 비름과의 한해살이풀로서 줄기는 털이 없고 곧게 서며, 높이는 1 m가량이다. 잎은 마름모꼴의 달걀 모양으로 어긋나게 달리며 긴 잎자루가 있다. 참비름은 다른 종류의 비름에 비해 잎이 작으면서 윤기가 난다. 성질이 차고 맛이 달며 독이 없어 예로부터 지혈과 배앓이 등에 약으로 쓰였다. 또한, 청열과 해독작용으로 청맹을 주지하며 눈을 밝게 하며, 대소변을 통리하고 충독을 없애 주는 효과가 있다.
천연물은 일반적으로 비타민, 무기물, 색소 및 각종 특성 성분 등의 중요한 영양소를 풍부하게 함유하고 있어 건강의 유지, 개선, 질병 예방에 크게 기여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 저장성이 취약하기 때문에 독성을 제거하고 저장성과 활성성분의 기능성 증대를 위해 가공기술이 요구된다.
상기 감초 추출물에 검인 추출물 및 참비름 추출물을 혼합하여 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제조하며, 상기 혼합 사용에 따른 상승효과에 따라 감초 추출물만 사용한 경우에 비해 ROS 생성 및 세포사멸에 우수한 억제 효과를 동등 또는 상승시키고, 더 나아가 기호성 높은 조성물로 제공할 수 있다.
바람직하게 상기 조성물은 감초 추출물 100 중량부에 대하여, 검인 추출물 30 내지 40 중량부 및 참비름 추출물 30 내지 40 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다.
이에 더해, 천연 유래 물질의 식품 조성물로 복용량 및 복용기간이 증가하여도 부작용의 문제가 없다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 기능성 식품은 상기 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 이용하여 제조한 것이다.
본원에서 정의되는 "기능성 식품"은 기능성 식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 의약품은 상기 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 이용하여 제조한 것이다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 감초 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물에 의하면 망막색소상피세포의 DNA 손상 및 세포사멸을 억제하는 효과가 우수함과 동시에 Nrf2 및 HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하고 천연 추출물을 포함하여 부작용의 문제가 없으며, 주기적 또는 장기적으로 사용할 수 있는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물의 ROS의 생성 정도를 비교에 대한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물의 DNA 손상에 미치는 감초 추출물의 영향에 대한 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물의 미토콘드리아 기능 손상에 미치는 감초 추출물의 영향에 대한 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물의 세포사멸(apoptosis) 유도에 미치는 감초 추출물의 영향에 대한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물의 DNA 손상에 미치는 감초 추출물의 영향에 대한 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물의 미토콘드리아 기능 손상에 미치는 감초 추출물의 영향에 대한 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물의 세포사멸(apoptosis) 유도에 미치는 감초 추출물의 영향에 대한 실험 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예: 추출물의 제조]
1. 감초 추출물의 제조
㈜서경한방약업사(부산, 대한민국)로부터 받은 감초를 파쇄된 상태로 구입하였다. 100 g의 감초 분말을 2 L의 70% 에탄올을 혼합한 후 초음파 수조 바닥에 닿지 않도록 하여 40 KHZ 초음파를 가하여 2시간 동안 추출하였다.
이 후 추출물은 여과지로 여과한 후 용매를 회전증발 농축기(EYELA Co. Ltd., Shanghai, China)를 이용하여 농축하였으며, 동결 건조 한 감초 분말을 다이메틸설폭사이드(DMSO; Amresco, Solon, OH, USA)를 이용하여 100 mg/mL로 stock solution을 만들어 실험에 따라 적절하게 희석, 혼합하여 감초 추출물(GE)을 제조하였다.
2. 기타 천연 추출물의 제조
상기 감초 추출물(GE)과 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 검인 추출물(BE) 및 참비름 추출물(AE)을 제조하였다.
3. 복합 추출물의 제조
상기 제조된 감초 추출물(GE), 검인 추출물(BE) 및 참비름 추출물(AE)을 하기 표 1과 같은 중량 범위내로 혼합하여 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물로 제조하였다.
| MX1 | MX2 | MX3 | MX4 | MX5 | |
| GE | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| BE | - | 20 | 30 | 40 | 50 |
| AE | - | 20 | 30 | 40 | 50 |
(단위: 중량부)
[실험예1: ROS 생성에 미치는 감초 추출물의 영향]
1. 세포 배양
산화적 스트레스에 따른 ROS의 생성에 미치는 감초 추출물(GE)의 효능을 조사하기 위하여 6 well plate에 ARPE-19 세포를 분주하여 24시간 배양하였다.
2. 산화적 스트레스 유발
상기 배양된 ARPE-19 세포에 감초 추출물(GE)을 세포독성을 나타내지 않는 150 μg/ml 이하로 1시간 전 처리한 후 H2O2 (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 300 ㎛ 처리하였다.
3. ROS 생성에 미치는 감초 추출물의 영향
30분 후 세포들을 모아 10 ㎛의 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA; Invitrogen)를 37℃, 5% CO2 incubator에서 20분간 반응시킨 후, flow cytometer (Accuri Cytomerers, Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 ROS 생성 변화 여부를 평가하였다. ROS 생성 억제를 위한 대조군으로서 10 ㎛의 N-acetyl cysteine (NAC, Invitrogen)을 사용하였다.
그 결과를 도 1 A 및 B에 나타낸 바와 같이, H2O2 단독 처리된 세포는 정상 배지에서 배양된 세포에 비하여 ROS의 생성이 현저하게 증가되었으나, 감초 추출물(GE)이 전 처리된 조건에서는 감초 추출물(GE) 처리 농도 의존적으로 유의하게 ROS의 생성이 감소하는 것을 확인하였다.
이러한 ROS 생성 억제 효과는 대조군으로 사용된 대표적인 ROS 소거제인 NAC 전 처리군에서도 유사하게 나타나 감초 추출물은 강력한 ROS 생성 억제 효능을 지니고 있음을 확인하였다.
4. Nrf2 및 HO-1의 발현에 미치는 감초 추출물(GE)의 영향
감초 추출물(GE)과 NAC 및 H2O2를 동시 또는 단독 처리된 ARPE-19 세포에 lysis buffer [25 ㎛ Tris-Cl (pH 7.5), 250 ㎛ NaCl, 5 ㎛ ethylenediaminetetraacetic acid, 1% Nonidet P-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride, 5 ㎛ dithiothreitol]를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후 14,000 rpm, 4℃, 30분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량하였고, Laemilni sample buffer (Bio-Rad Lab.)를 혼합하였다. 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였고, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전이시켰다. 그 후 5% skim milk를 30분 처리하였고 1차 항체(Table 1)를 처리하여 4℃에서 over night 시킨 다음 1 X phosphate buffered saline (PBS)-T (PBS with Tween 20)로 10분간 3번 세척하였다. 그 다음 적정 2차 항체(Table 1)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 반응시킨 후 1 X PBS-T로 세척 후 Chemi-smart (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)하였다.
그 결과를 도 1C에 나타낸 바와 같이, 감초 추출물(GE)에 의한 ROS 생성의 차단에도 Nrf2 신호계의 활성이 관련이 있는지를 조사한 결과, H2O2 단독 처리군에 비하여 감초 추출물과 H2O2가 동시 처리된 세포에서 Nrf2의 생성이 증가되었으며, Nrf2의 대표적인 조절자인 HO-1의 발현도 매우 증가되었음을 확인하였다.
[실험예2: DNA 손상에 미치는 감초 추출물의 영향]
상기 실험예 1의 결과에서 관찰된 감초 추출물(GE)에 의한 ROS 생성의 억제 효과가 DNA 생성의 억제 효과가 DNA 손상의 차단과 연관성이 있는지를 γH2AX의 인산화 여부로 평가하였다.
이는 면역 형광 분석을 위해 다양한 조건에서 배양된 ARPE-19 세포에 100% 메탄올을 넣어 -20℃, 10분 동안 고정시킨 후 1 X PBS로 3번 세척하였다. Blocking buffer [5% bovine serum albumin (BSA) in 1 X PBS-T (0.1% Triton X)]로 1시간 상온에서 반응시키고 2.5% BSA로 희석한 p-γH2AX antibody (Table 1)를 첨가하여 4℃에서 over night 시킨 다음 1 X PBS-T로 2회 10분간 세척하였다. 그 후 2.5 μg/ml의 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액을 처리하여 암실에서 20분 동안 반응시키고 1X PBS로 3회 세척한 다음 형광현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 분석하였다.
그 결과를 도 2에 나타낸 바와 같이, H2O2에 노출된 ARPE-19 세포에서 DNA 손상 지표인 γH2AX 단백질의 인산화가 현저히 증가되어 산화성 DNA 손상이 유도되었음을 확인되었다. 그러나 H2O2의 이러한 DNA 손상 유발 효과는 감초 추출물이 전 처리된 조건에서는 유의적으로 차단되었다. 이러한 현상은 다양한 항산화 효능을 가지는 천연물들에 의한 ARPE-19 세포의 H2O2에 의한 DNA 손상 차단이 ROS 생성의 억제와 연관성이 있음을 확인하였다.
따라서 본 연구에 사용된 감초 추출물(GE)에 의한 ROS의 생성의 억제는 DNA 손상 보호와 직접 연관성이 있음을 알 수 있었다.
[실험예3: 미토콘드리아 기능 손상에 미치는 감초 추출물의 영향]
1. MMP 측정
감초 추출물의 항산화 효능이 H2O2에 의한 미토콘드리아 기능 손상을 차단할 수 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 미토콘드리아 기능을 평가하는 대표적인 지표인 MMP의 소실에 미치는 감초 추출물(GE)의 영향을 조사하였다.
먼저 H2O2 처리에 따른 ARPE-19 세포의 미토콘드리아 기능 손상에 미치는 감초 추출물의 효과를 조사하기 위하여 MMP 값의 변화를 측정하였다. 이를 위하여 H2O2를 처리하기 전에 감초 추출물을 1시간 전 처리하였다. 24시간 배양 후 10 μM의 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액을 처리하여 37℃, 20분 염색한 후 1 X PBS로 2-3회 세척한 후 형광현미경을 이용하여 형광 강도를 관찰하였다. 또한 동일한 조건에서 배양된 세포에 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 MMP의 변화를 정량적으로 평가하였다.
2. flow cytometry 분석
H2O2 처리에 의한 세포사멸 유발 및 감초 추출물(GE)에 의한 억제 효과를 정량적으로 분석하기 위하여 준비된 세포들을 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이들 세포에 1 X binding buffer를 첨가 후 annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC, Becton Dickinson) 및 propidium iodide (PI, Becton Dickinson)를 처리하여 암실에서 반응시켰다. 15분 후 1 X binding buffer 200 μl을 추가하여 flow cytometer를 이용하여 세포사멸이 유발된 세포를 형광 반응에 따라 분석하였다.
그 결과를 도 3A에 나타낸 바와 같이, JC-1 염색을 통한 면역 형광 분석 결과에 의하면, 선행 연구들과 유사하게 H2O2에 노출된 ARPE-19 세포에서 미토콘드리아 기능의 손상을 의미하는 JC-1 단량체(monomer)의 발현이 증가하였음을 확인하였으며, 감초 추출물(GE)이 전 처리된 조건에서 배양된 세포의 경우 대조군 수준을 유지하고 있음을 확인하였다. JC-1 다량체(aggregate)의 형성의 감소에 의한 단량체의 증가는 MMP의 소실을 의미하며, 도 3B의 flow cytometry 분석 결과에서도 이와 유사한 경향성을 확인하였다.
[실험예4: 세포사멸(apoptosis) 유도에 미치는 감초 추출물의 영향]
상기 실험예 3에서 실시한 flow cytometry 분석을 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 H2O2에 노출된 ARPE-19 세포에서 apoptosis 유발이 유의적으로 증가되었지만, 감초 추출물(GE)이 존재하는 조건에서는 처리 농도 의존적으로 H2O2에 의한 apoptosis 유도가 억제되었음을 알 수 있었다. 아울러 H2O2가 단독으로 처리된 ARPE-19 세포에서 증가되었던 caspase-3의 활성형 발현이 감초 추출물(GE)이 전 처리된 세포에서는 감소되었다(도 4 C).
이는 H2O2에 의한 미토콘드리아의 기능 손상이 감초 추출물(GE)에 의해서 억제됨으로서 나타난 결과로서, ROS 생성의 억제에 기인된 것으로 확인하였다.
[실험예5: 복합 추출물의 효과]
상기 복합 추출물의 사용에 따른 상호작용에 의한 상승 효과를 확인하기 위하여 상기 감초 추출물(GE)의 효과를 확인한 실험으로 효과를 상기 실험과 동일한 방법으로 비교 평가하였다.
각 복합 추출물의 사용에 따른 효과가 직접 드러날 수 있도록 상기 감초 추출물(GE) 및 각 복합 추출물을 이전의 용량에 10%로 줄여 1일 1회 10 mg/kg의 용량으로 투여하였다.
또한 상기 감초 추출물(GE)의 효과를 지수 5로 고정하여 기준으로 삼고, 상기 복합 추출물 사용에 따른 결과를 이와 비교하여 1 내지 10의 지수로 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 효과가 우수한 것으로 망막 질환의 예방 및 치료가 가능한 것이다.
그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
| MX1 (FST) |
MX2 | MX3 | MX4 | MX5 | |
| ROS 생성 억제 효과 | 5 | 4 | 6 | 7 | 5 |
| Nrf2 및 HO-1의 발현 증가 | 5 | 5 | 6 | 7 | 6 |
| JC-1 단량체의 발현 증가 | 5 | 4 | 5 | 6 | 5 |
| 세포사멸(apoptosis) 억제 | 5 | 4 | 5 | 7 | 6 |
(단위: 지수)
상기 표 2를 참조하면 복합 추출물에 사용에 따른 상승효과가 나타난다는 사실을 알 수 있다. 특히 MX3 및 MX4에 의하는 경우 감초 추출물(GE)과 동등 또는 상승 효과를 나타내는 사실을 알 수 있다.
따라서 MX3 및 MX4 범위의 복합 추출물에 의하는 경우 각 추출물의 혼합에 의한 상승작용으로 감초 추출물(GE)만을 사용하는 것보다 단순 조합이상의 상승효과가 나타난다는 사실을 알 수 있다.
이에 따라 상기 복합 추출물을 사용하는 경우 보다 적은 함량으로 망막 질환의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서 이를 통하여 상대적으로 낮은 농도로서 부작용이 적으면서도 장기간 복용할 수 있는 망막 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
[실험예6: 기호성 평가]
1. 관능성 평가 시험
감초 추출물(GE) 복합 추출물 중 MX3 및 MX4를 희석하여 차음료를 제조하였다. 상기 차음료를 10인이 시음자가 시음하여 맛과 향을 1 내지 10의 지수로 표현하였고, 그 평균값(0.5 반올림 적용)을 하기 표 3에 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 기호도가 높은 것이다.
| MX1 (GE) |
MX3 | MX4 | |
| 맛 | 5.5 | 6 | 6 |
| 향 | 4.0 | 4 | 5 |
| 종합기호도(평균) | 5.0 | 5.5 | 6 |
(단위: 지수)
상기 표 3를 참조하면, MX1(GE)의 경우 감초 추출물의 맛은 좋게 평가되나, 특유의 향이 기호도를 저하시켰다. 그에 반면, 복합 추출물 MX3 및 MX4에 의하는 경우 감초 추출물 특유의 향과 맛이 중화되면서 기호도가 상승함을 확인하였다.
따라서 복합 추출물 MX3 및 MX4에 의하는 경우, 보다 기호도가 높은 향미와 맛으로 망막 질환의 예방 및 치료용 식품으로 제공할 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (7)
- 감초(Glycyrrhiza uralensis) 추출물을 포함하고,
감초 추출물 100 중량부에 대하여, 검인 추출물 30 내지 40 중량부; 및
참비름 추출물 30 내지 40 중량부를 포함하는
망막 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 망막색소상피세포의 DNA 손상 및 세포사멸 억제 효과를 나타내는
망막 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 Nrf2 및 HO-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 망막색소상피세포를 보호하는 것인
망막 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 망막 질환은 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 증식성 망막병증 및 미숙아 망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인
망막 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출하는
망막 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|---|
| KR101426356B1 (ko) | 2012-05-29 | 2014-08-14 | 한국과학기술연구원 | 감나무 추출물을 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR101571153B1 (ko) * | 2014-05-23 | 2015-11-24 | 한국 한의학 연구원 | 작약, 또는 작약 및 감초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관부종 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
-
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