ES2865478T3 - Composición farmacéutica para prevenir o tratar la degeneración macular que contiene extracto de mezcla natural como ingrediente activo - Google Patents

Composición farmacéutica para prevenir o tratar la degeneración macular que contiene extracto de mezcla natural como ingrediente activo Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de la degeneración macular, que contiene un ingrediente activo que consiste en un extracto de una mezcla de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, o ramita de canela y raíz de peonía.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica para prevenir o tratar la degeneración macular que contiene extracto de mezcla natural como ingrediente activo
[Campo técnico]
La presente descripción se refiere a una composición farmacéutica para prevenir y tratar complicaciones diabéticas que incluyen retinopatía diabética, nefropatía diabética y neuropatía diabética, y angioedema que incluye edema macular (retiniano), degeneración macular y venas varicosas, en donde la composición contiene un extracto de una mezcla de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de ramita de canela y raíz de peonía como ingrediente activo.
[Antecedentes de la técnica]
De acuerdo con un informe de la Journal of the American Medical Association (JAMA) en 2009, la población mundial con diabetes ya superó los 240 millones, y se espera que la cantidad de diabéticos a nivel mundial aumente a 380 millones en 2025, y entre ellos, aproximadamente 60 % ocurrirá en la región de Asia. En particular, con el advenimiento reciente de una sociedad que envejece y la disminución continua de la edad de inicio de la diabetes, la aparición de complicaciones diabéticas aumenta rápidamente. Recientemente, la tasa de prevalencia de diabetes ha alcanzado el 10 % en Corea. En particular, la aparición de la diabetes ha avanzado a los adultos jóvenes y el número de pacientes con complicaciones diabéticas aumenta de manera explosiva debido al aumento de la esperanza de vida.
La incidencia de complicaciones diabéticas ha aumentado en un 60 % en los últimos cinco años y los gastos médicos también han aumentado en un 54 %. Como resultado, los gastos médicos alcanzaron finalmente los 203,5 billones de wones coreanos (National Health Insurance Corporation; agosto de 2011). Es decir, casi todos los órganos del cuerpo se dañan de 10 a 15 años después del inicio de la diabetes, lo que da como resultado retinopatía diabética, catarata diabética, nefropatía diabética, neuropatía diabética, úlceras del pie diabético, cardiopatía diabética, osteoporosis diabética o arteriosclerosis diabética.
Aunque los fármacos para la diabetes tienen varios mecanismos, por ejemplo, Metformina, Rosiglitazona, Zemiglo, Januvia, etc., que se administran actualmente a un diabético para regular el nivel de glucosa en sangre en la diabetes temprana, los fármacos para la diabetes no pueden prevenir o tratar esencialmente la transición a la aparición de complicaciones diabéticas (oftalmopatía diabética, nefropatía diabética, neuropatía diabética, úlceras del pie diabético, etc.), que ocurren por progresos crónicos, debido a la imposibilidad de una recuperación completa. Las complicaciones diabéticas comienzan con la diabetes, pero los mecanismos de transición a la misma son diferentes a los de la diabetes en sí. Por lo tanto, es necesario retrasar, prevenir o tratar las complicaciones de la diabetes mediante el uso de fármacos capaces de retrasar o prevenir las complicaciones de la diabetes y, al mismo tiempo, regular rápidamente la glucosa en sangre.
La nefropatía diabética crónica requiere hemodiálisis y trasplante de órganos, y la catarata y la retinopatía diabética causan ceguera. En los Estados Unidos, se informó que la principal causa de ceguera en las edades de 25 a 74 años es la diabetes. Para los pacientes con úlceras del pie diabético, es posible que tengan que sufrir la horrible situación de la amputación de sus brazos y piernas, y la neuropatía diabética se acompaña de una sensación de dolor punzante. Además, la cardiopatía diabética causa muerte súbita. Por lo tanto, cuando la aparición de complicaciones diabéticas en pacientes diabéticos pueda retrasarse incluso varios años, la calidad de vida de los pacientes y sus familias cambiará, lo que ayudará enormemente a las finanzas nacionales.
Se informó que los factores representativos que inducen estas complicaciones diabéticas incluyen la producción de productos finales de la glicación avanzada, la activación de la aldosa reductasa, la activación de los isómeros de PKC y aumento del flujo de la vía de la hexosamina (Nature, 414, 813-820, 2000; Diabetologia, 38: 357-394, 1995). El estrés oxidativo se acelera por la reacción irreversible de estos factores, lo que agrava aún más las complicaciones diabéticas.
La glicación no enzimática de una proteína indica una reacción de condensación de un azúcar reductor y un grupo aminoácido, como un residuo de lisina de una proteína, sin estar mediada por una enzima (reacción de Maillard). Como resultado de esta reacción, se generan productos finales de la glicación avanzada (AGE). Es decir, se forma una base de Schiff como un producto de etapa temprana, y luego los aductos de cetoamina que residen cerca de la base de Schiff reaccionan con ella para producir productos reversibles de glicación temprana de tipo Amadori; y cuando persiste un estado hiperglucémico, los productos de glicación temprana reversibles de tipo Amadori no se degradan sino que solo se reorganizan para producir productos finales de la glicación avanzada irreversibles. Los productos finales irreversibles de glicación avanzada generados se conjugan o se reticulan con proteínas o lípidos, lo que lleva a la producción irreversible de glucoproteínas o glucolípidos. Los productos finales de la glicación avanzada se unen (se reticulan) a proteínas, tales como la membrana basal, albúmina plasmática, proteína del cristalino, fibrina y colágeno, o a lípidos. Por lo tanto, estos se acumulan en los tejidos durante el período de supervivencia de los mismos con el fin de cambiar anormalmente la estructura y las funciones de los tejidos, lo cual induce complicaciones. Adicionalmente, incluso si el nivel de glucosa en sangre vuelve a la normalidad, se desarrollarán complicaciones porque los productos finales de la glicación avanzada producidos reaccionan continuamente con proteínas y lípidos (N. Engl. Med., 1988, 318, 1315-1321). Adicionalmente, el estrés oxidativo se induce cuando la función del sistema de defensa contra los radicales libres de oxígeno disminuye en las condiciones descritas anteriormente (J. of Trad. Med. 2001, 18: 107-112). Se informó que es importante inhibir la producción de productos finales de la glicación avanzada con el fin de retrasar, prevenir o tratar la aparición de complicaciones diabéticas basadas en tales mecanismos (N. Engl. Med. 1998, 318, 1315-1321).
La retinopatía diabética daña los vasos sanguíneos y las células nerviosas en un estado hiperglucémico crónico y, de esa manera progresa a una retinopatía no proliferativa. Como resultado, eventualmente progresa a retinopatía proliferativa para causar ceguera. Es decir, en un estado hiperglucémico, los pericitos que envuelven los capilares de la retina comienzan a romperse, mientras ocurre un fenómeno de microaneurisma que conduce al daño de las células endoteliales. Como resultado, se producen numerosos capilares acelulares que no pueden funcionar como vasos sanguíneos. Las paredes de estos neovasos anormales son lo suficientemente débiles como para que se destruyan fácilmente y así, los componentes sanguíneos se escapan, lo que con el tiempo conduce a la pérdida de la visión. Ocurren varios fenómenos patológicos debido a que se dañan las proteínas de unión estrecha tales como la ocludina o la claudina, que se unen a células periféricas, células endoteliales y similares. Con el fin de prevenir tal retinopatía diabética, debe prevenirse el síntoma inicial, que es el daño a las células periféricas. Fenofibrato (Lipidil Abott) fue aprobado por la FDA australiana en diciembre de 2013 como agonista de PPARa, un fármaco para el tratamiento de la retinopatía diabética. El estudio ACCORD y el estudio FILD informaron que mientras que al 33 % de los pacientes con diabetes que tenían un control estricto de la glucosa en sangre se le impidió la transición a la retinopatía diabética, aproximadamente el 40 % de los pacientes se retrasó en la transición a la retinopatía diabética.
Iluvien (implante intravítreo de acetónido de fluocinolona, Alimera Science) fue aprobado por la FDA de EE. UU. en 2014 como fármaco para tratar el edema muscular diabético.
La nefropatía diabética actúa como un factor importante causante de la nefropatía diabética crónica por la albúmina glucosilada en la cual los productos finales de la glicación avanzada se acoplan con proteínas. La albúmina glucosilada se introduce más fácilmente en las células glomerulares en comparación con la albúmina normal, y una concentración crónicamente alta de glucosa estimula las células mesangiales con el fin de aumentar la síntesis de matriz extracelular. La albúmina glucosilada excesivamente introducida y el aumento de la matriz extracelular provocan la fibrosis de los glomérulos. Por estos mecanismos, los glomérulos se dañan continuamente, por lo que son necesarios tratamientos extremos como la hemodiálisis y el trasplante de órganos.
El angioedema se refiere a una enfermedad en la cual aumenta la permeabilidad de los vasos sanguíneos ubicados profundamente dentro de la piel o debajo de la piel, o debajo de la membrana mucosa, lo que hace que los fluidos corporales se filtren y se junten alrededor de los tejidos vecinos, por ejemplo, y se produce edema. El angioedema ocurre con frecuencia en tejidos relativamente laxos. Esto puede ocurrir fácilmente alrededor de los ojos y labios, o en las manos, membranas mucosas como la lengua, el interior de la boca, la laringe o las paredes del tracto gastrointestinal. En particular, el edema macular (retiniano), la degeneración macular o las venas varicosas se producen debido al angioedema que daña la barrera hemato-retiniana.
La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) se refiere a una enfermedad irreversible y es una enfermedad representativa que se desarrolla en numerosos adultos mayores e induce ceguera. Su tasa de incidencia está aumentando gradualmente debido al envejecimiento de la población mundial. En los Estados Unidos, se informó que la degeneración muscular relacionada con la edad es la principal causa de ceguera, y los factores ambientales y genéticos también afectan la aparición de la misma. En particular, se informó que el tabaquismo es el factor más fatal de la aparición. Además, la obesidad y la ingesta excesiva de antioxidantes y grasas en la dieta también inducen la degeneración macular e influyen en su progresión ulterior. Por lo tanto, la aparición de la degeneración macular disminuye con la ingesta de dieta saludable, la regulación del peso corporal, el ejercicio adecuado, el abandono del hábito de fumar y similares. En los Estados Unidos, la tasa de prevalencia de la degeneración macular temprana (seca) fue simplemente del 3,9 % en el grupo de edades de 40 a 50 años, mientras que la tasa de incidencia de la misma fue muy alta, 22,8 %, en el grupo de edad de 75 años o más (Beaver Dam Eye Study). Adicionalmente, las personas mayores de 75 años o más mostraron una tasa de incidencia del 5,4 %, y el 7,1 % eran pacientes con degeneración macular en etapa terminal. El 1,9 % de los caucásicos australianos son pacientes con degeneración macular en etapa terminal, y durante el período de cinco años, la tasa de incidencia de la misma en grupos de 55 años o menos fue del 0 %, pero el 18,5 % del grupo de ancianos de 85 años o más tenía degeneración macular. Además, las tasas de la misma fueron similares a las tasas de los malayos asiáticos, un grupo étnico de Australia (Blue Mountain Eye Study; Progress in retinal and eye research, 1-15, 2014). En Corea, la Sociedad Coreana de Retina informó que, el año pasado, el número de pacientes con degeneración macular húmeda se incrementó 7,4 veces y la tasa de incidencia en el grupo de edad de 40 a 50 años aumentó 9 veces. Sin embargo, el problema más grave es que no se ha encontrado un tratamiento para la degeneración macular. Lucentis, producido por Novartis, una compañía farmacéutica suiza, es un agente terapéutico de anticuerpos y es muy caro. Además, Lucentis tiene la desventaja de que la agudeza visual no puede recuperarse lo suficiente como para detener la progresión de la enfermedad.
La degeneración macular se clasifica como degeneración macular seca y degeneración macular húmeda. Las drusas, una masa de desechos, se acumula en la mácula y daña la conexión metabólica entre la coroides y la parte superior de la mácula, lo que desarrolla una degeneración macular seca. Además, cuando dicho proceso progresa continuamente, evoluciona hacia una degeneración macular húmeda. Es decir, dado que los desechos se acumulan en la región macular, los vasos sanguíneos no pueden funcionar correctamente y, por lo tanto, no se les pueden suministrar nutrientes, oxígeno y similares. Como resultado, esto conduce a un crecimiento anormal de neovasos, que se denomina neovascularización coroidea (CNV). Los vasos sanguíneos así generados tienen paredes muy débiles, de modo que las proteínas, eritrocitos o similares de los vasos sanguíneos se filtran hacia la región macular y la retina. Además, debido a una descarga de sangre desde los vasos sanguíneos, ocurren varios factores, como la muerte de los fotorreceptores (bastones y conos) y la capa de células epiteliales pigmentarias de la retina, etc., lo que conduce a la ceguera (Nutrition Research, 34, 95-105, 2014; Plos one, 8, e71064, 2013).
Las células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) desempeñan un papel importante en el mantenimiento de una vista sana al respaldar la membrana de Bruch (BrM) y al mantener un estado no proliferativo. La cistatina C secretada por las células epiteliales pigmentarias de la retina es un inhibidor potente de la cisteína proteinasa y desempeña un papel importante en la regulación adecuada de la circulación de proteínas en la BrM. Sin embargo, la acumulación excesiva de productos finales de la glicación avanzada disminuye la expresión y secreción de cistatina C, lo que da como resultado un desbalance de la degradación de proteínas en la parte base de las células epiteliales pigmentarias de la retina. Como resultado, con el tiempo ocurre la degeneración macular. En consecuencia, se informó que la degeneración macular también puede prevenirse (tratarse) mediante la inhibición de la producción de los productos finales de la glicación avanzada (Kay P y otros, IOVS, 2014, 55(2), 926-34).
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se secreta a desde la capa de células epiteliales pigmentarias de la retina para ajustar normalmente las partes alrededor de la membrana de Bruch (BrM) y regular el crecimiento y la compacidad de las células endoteliales capilares coroideas. En condiciones normales, la secreción de VEGF está muy regulada de modo que no se produce la neovascularización. Sin embargo, si la secreción de VEGF no está estrictamente regulada, actúa como un factor decisivo que conduce a alcanzar la etapa final de la degeneración macular. Cuando la secreción de VEGF aumenta anormalmente, se producen vasos sanguíneos anormales y débiles, y así se destruyen los vasos sanguíneos (J. Cell. Mol. Med., 17, 7, 833-843, 2013).
Las venas varicosas son una enfermedad en la cual aparece una vena hacia el exterior de la piel. Las venas distribuidas en las extremidades se clasifican como venas profundas, ubicadas entre los músculos, venas superficiales, que pueden verse debajo de la piel, y venas perforantes, que conectan estas dos. Entre estas, las venas varicosas se refieren a venas en las cuales las venas superficiales se estiran de modo que parecen sobresalir fuera de la piel. Además, cuando las válvulas que mantienen constantemente el flujo sanguíneo en las venas con el fin de dirigirse siempre hacia el corazón aumentan la presión en las venas varicosas, las paredes de las venas se debilitan y las válvulas se dañan. Como resultado, la sangre que se mueve hacia el corazón fluye hacia atrás, de modo que las venas se estiran, lo que provoca venas varicosas.
La ramita de canela es una ramita joven del árbol de corteza Casia (árbol de canela) que es un árbol de hoja perenne, una de las varias especies de Cinnamomum. El sabor de la ramita de canela es picante y dulce, la propiedad de la misma es cálida y afecta el corazón, los pulmones y la vejiga. Se sabe que fortalece el estómago, inhibe el accidente cerebrovascular, tiene acciones analgésicas y cardiotónicas, expande los vasos sanguíneos cutáneos, estimula las glándulas sudoríparas para inducir la transpiración, de modo que se aplica una acción antipirética al cuerpo y tiene una acción inhibidora contra los virus. Además, la ramita de canela se usa para tratar escalofríos, fiebre, dolor de cabeza, dolores corporales, palpitaciones, etc., o se usa cuando la transpiración no se produce correctamente. La ramita de canela tiene una forma cilíndrica larga y tiene numerosas ramas, cuya longitud es de 30 cm a 70 cm, mientras que el diámetro de las partes más gruesas es de 0,3 cm a 1 cm. La superficie tiene una cresta vertical de color rojizo marrón o marrón, y tiene rastros de hojas y ramas en forma de finas arrugas y pequeños bultos. Su calidad es dura, frágil y fácil de cortar. Guangxi y la provincia de Guangdong son las principales áreas de producción, y Vietnam, Sri Lanka e India son las naciones donde se cultivan las ramitas de canela. De acuerdo con los resultados de los experimentos farmacológicos con la ramita de canela, se reveló que la ramita de canela tiene efectos sobre la transpiración, antipiréticos, analgésicos, cardiotónicos, antialérgicos y antivirales. Sin embargo, no se han revelado efectos de la ramita de canela relacionados con las complicaciones diabéticas o el angioedema.
La corteza de raíz de peonía es una importante medicina herbal que se ha usado desde hace mucho tiempo y se usa en la medicina oriental como coagulante antiflogístico en el tratamiento de la extravasación de sangre debido a su propiedad de frío. Además, su efecto medicinal se usa para la inflamación de los sistemas vasculares de los órganos abdominales inferiores, dolores por congestión, fiebre, supuración, sangrado y similares. En particular, la corteza de raíz de peonía tiene efectos antiinflamatorios, contracción, espasmólisis por irregularidad menstrual, inflamación en el útero y anexos, congestión y dolor de arrastre, y también se aplica para tratar hemorroides y apendicitis.
La raíz de peonía es una planta perenne perteneciente a la familia Ranunculaceae, y se clasifica como radix paeoniae alba y radix paeoniae rubra. Radix paeoniae alba y radix paeoniae rubra están determinadas por la presencia de una cáscara; radix paeoniae rubra es una planta perenne con cáscara; y radix paeoniae alba es una planta perenne de cáscara desprendida (Altern. Med. Rev., 6(5), pp495-499, 2001). Radix paeoniae alba y radix paeoniae rubra tienen efectos anti-contráctiles y de dilatación coronaria para los músculos lisos del estómago, intestino y útero; efectos de prevenir la aterosclerosis, disminuir la presión arterial, mejorar el torrente sanguíneo y un efecto antioxidante para las enfermedades vasculares (Ohsugi M y otros, J. Ethnopharmacol., 67, pp111-119, 1999.); un efecto inhibidor de la agregación plaquetaria (Lin HC y otros, Planta Med, 65, pp 595-599, 1999.); un efecto antitrombótico Ishida H y otros, Chem. Pharm. Bull, 35(2), pp 849-852, 1987); y prevención de la hiperlipidemia (Yang HO y otros, Fitoterapia, 75(1), pp45-49, 2004). Además, se informó que el glucósido, que forma parte de los componentes de la raíz de peonía, es eficaz para tratar el infarto cerebral (Yang J y otros, Zhong Yao Cai, 23(2), pp 95-97, 2000).
Por lo tanto, se han realizado esfuerzos para desarrollar un fármaco natural seguro y eficaz para prevenir y tratar las complicaciones diabéticas y el angioedema, en donde el fármaco natural no tiene toxicidad ni efectos secundarios. Como resultado, se confirmó que el extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de ramita de canela y raíz de peonía, inhibe la generación excesiva de productos finales de la glicación avanzada, que ocurre en condiciones de diabetes crónica, exhibe el efecto de fragmentar una reticulación entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz, tiene un efecto excelente en la inhibición de la generación de productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana sometidas a un entorno hiperglucémico o de envejecimiento, y tiene excelentes efectos en retrasar, prevenir y tratar las complicaciones diabéticas, la degeneración macular, la conmoción retinal y el edema de las extremidades inferiores en varios modelos animales de complicaciones diabéticas, degeneración macular y edema de las extremidades inferiores, y de esa manera, el extracto mixto puede usarse eficazmente como una composición para prevenir y tratar las complicaciones diabéticas y el angioedema.
[Descripción]
[Problema técnico]
Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición para prevenir y tratar la degeneración macular que contiene el extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o ramita de canela y raíz de peonía como ingrediente activo.
[Solución técnica]
Con el fin de lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para prevenir y tratar la degeneración macular que contiene el extracto de una mezcla de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de ramita de canela y raíz de peonía como ingrediente activo.
Adicionalmente, la presente invención proporciona un alimento funcional saludable para prevenir y mejorar la degeneración macular que contiene el extracto mixto como ingrediente activo.
Adicionalmente, la presente invención proporciona el uso del extracto mixto como composición farmacéutica para prevenir y tratar la degeneración macular.
Adicionalmente, la presente invención proporciona un uso del extracto mixto para su uso como alimento funcional saludable para prevenir y mejorar la degeneración macular.
[Efectos ventajosos]
Se ha confirmado que el extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de ramita de canela y raíz de peonía, para su uso de acuerdo con la presente invención, inhibe la generación excesiva de los productos finales de la glicación avanzada, lo cual se produce en condiciones de diabetes crónica, exhibe el efecto de fragmentar un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz, tienen un efecto excelente en la inhibición de la generación de productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana sometidas a un entorno hiperglucémico o de envejecimiento, y tienen excelentes efectos para retrasar, prevenir y tratar las complicaciones diabéticas, la degeneración muscular, la conmoción retinal y el edema de las extremidades inferiores en varios modelos animales de complicaciones diabéticas, degeneración macular y edema de las extremidades inferiores, y de esa manera el extracto mixto puede usarse eficazmente como un ingrediente activo de una composición para prevenir y tratar las complicaciones diabéticas, incluida la retinopatía diabética, la nefropatía diabética y la neuropatía diabética y el angioedema, incluido el edema macular (retiniano), la degeneración macular y las venas varicosas.
[Breve descripción de los dibujos]
La Figura 1a es un gráfico que muestra un resultado de análisis de ingredientes para CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)); Figura 1b para CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)); Figura 1c para CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)); y Figura 1d para CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), todos analizados por HPLC. La Figura 2 son gráficos que confirman un efecto de inhibición de la producción de productos finales de la glicación avanzada sobre la matriz extracelular (ECM) tratada con glucoaldehído:
AGE: productos finales de la glicación avanzada;
CMO4: extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8);
CMO4-1: extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8);
CPA4: extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8);
CPA4-1: extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8);
** p <0,01 vs. No AGE;
*** p <0,001 vs. No AGE;
#p <0,05 vs. AGE;
## p <0,01 vs. AGE; y
### p <0,001 vs. AGE.
La Figura 3 son gráficos que confirman un efecto de inhibición de la producción de productos finales de la glicación avanzada de CMO2 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:2)), CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), CPA1-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (2:1)), CPA2-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:2)), CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana en un entorno hiperglucémico:
HG: grupo tratado con hiperglucemia;
BSA: grupo tratado con albúmina de suero bovino;
CMO2: extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:2);
CMO4: extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8);
CMO4-1: extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8);
CPA1-1: extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (2:1);
CPA2-1: extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:2);
CPA4: extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8);
CPA4-1: extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8);
AG: grupo tratado con aminoguanidina como grupo control positivo;
* p <0,05 vs. CON;
** p <0,01 vs. CON;
*** p <0,001 vs. CON;
#p <0,05 vs. HG;
## p <0,01 vs. HG; y
### p <0,001 vs. HG.
La Figura 4 son diagramas que confirman un efecto preventivo contra el daño de la barrera hemato-retiniana, como parte de los efectos de prevenir la retinopatía diabética, después de administrar CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db, durante 12 semanas:
NOR: grupo de animales normales (ratones heterocigotos no diabéticos db/+);
DM: grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db);
FENO-100: un grupo al que se le administró fenofibrato 100 mg/kg/día;
CMO4-1-100: un grupo al que se le administró CMO4-1 100 mg/kg/día;
CMO4-1-250: un grupo al que se le administró CMO4-1 250 mg/kg/día;
CPA4-1-100: un grupo al que se le administró CPA4-1 100 mg/kg/día; y
CPA4-1-250: un grupo al que se le administró CPA4-1 250 mg/kg/día.
La Figura 5 son diagramas que confirman un efecto preventivo contra la formación de capilares acelulares, como parte de los efectos de prevención de la retinopatía diabética, después de administrar CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db, durante 12 semanas:
NOR: grupo de animales normales (ratones heterocigotos no diabéticos db/+);
DM: grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db);
FENO-100: UN grupo al que se le administró fenofibrato 100 mg/kg/día;
CM04-1-100: un grupo al que se le administró CMO4-1 100 mg/kg/día;
CMO4-1-250: un grupo al que se le administró CMO4-1 250 mg/kg/día;
CPA4-1-100: un grupo al que se le administró CPA4-1 100 mg/kg/día; y
CPA4-1-250: un grupo al que se le administró CPA4-1 250 mg/kg/día.
La Figura 6 son diagramas que confirman un efecto preventivo contra el daño de la ocludina, una proteína de la unión estrecha, como parte de los efectos preventivos contra la retinopatía diabética, después de administrar CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db, durante 12 semanas:
NOR: grupo de animales normales (ratones heterocigotos no diabéticos db/+);
DM: grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db);
FENO-100: un grupo al que se le administró fenofibrato 100 mg/kg/día;
CMO4-1-100: un grupo al que se le administró CMO4-1 100 mg/kg/día;
CMO4-1-250: un grupo al que se le administró CMO4-1 250 mg/kg/día;
CPA4-1-100: un grupo al que se le administró CPA4-1 100 mg/kg/día; y
CPA4-1-250: un grupo al que se le administró CPA4-1 250 mg/kg/día.
La Figura 7 son diagramas que confirman un efecto del tratamiento del daño de la barrera hemato-retiniana, como parte de los efectos del tratamiento de la retinopatía diabética, en los que CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se coadministran con metformina durante 12 semanas, después de regular los niveles de glucosa en sangre durante 12 semanas mientras se administra metformina en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db:
NOR: grupo de animales normales (ratones heterocigotos no diabéticos db/+);
DM: grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db);
MET: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día;
Met+Feno: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día y fenofibrato 100 mg/kg/día;
Met+CMO4-100: un grupo al que se le administró metformina y CMO4100 mg/kg/día;
Met+CMO4-250: un grupo al que se le administró metformina y CMO4250 mg/kg/día;
Met+CPA4-100: un grupo al que se le administró metformina y CPA4100 mg/kg/día;
Met+CPA4-250: un grupo al que se le administró metformina y CPA4250 mg/kg/día; * p<0,05 vs. NOR; y #p<0,05 vs. DM.
La Figura 8 son diagramas que confirman un efecto de inhibición de la formación de capilares acelulares, como parte de los efectos para el tratamiento de la retinopatía diabética, en los que CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se coadministran con metformina durante 12 semanas, después de regular los niveles de glucosa en sangre durante 12 semanas mientras se administra metformina en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db:
NOR: grupo de animales normales (ratones heterocigotos no diabéticos db/+);
DM: grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db);
MET: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día;
Met+Feno: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día y fenofibrato 100 mg/kg/día;
Met+CMO4-100: un grupo al que se le administró metformina y CMO4100 mg/kg/día;
Met+CMO4-250: un grupo al que se le administró metformina y CMO4250 mg/kg/día;
Met+CPA4-100: un grupo al que se le administró metformina y CPA4100 mg/kg/día;
Met+CPA4-250: un grupo al que se le administró metformina y CPA4250 mg/kg/día;
*p<0,05 vs. NOR; y
#p<0,05 vs. DM.
La Figura 9 son diagramas que confirman un efecto de tratar el daño a la proteína de la unión estrecha, como parte de los efectos del tratamiento de la retinopatía diabética, en los que CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se coadministran con metformina durante 12 semanas, después de regular los niveles de glucosa en sangre durante 12 semanas mientras se administra metformina en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db; La Figura 9a confirma el daño de la claudina-5 por tinción; y la Figura 9b es un diagrama que confirma el cambio de ocludina mediante el uso de una transferencia de Western:
NOR: grupo de animales normales (ratones heterocigotos no diabéticos db/+);
DM: grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db);
MET: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día;
Met+Feno: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día y fenofibrato 100 mg/kg/día;
Met+CMO4-100: un grupo al que se le administró metformina y CMO4100 mg/kg/día;
Met+CMO4-250: un grupo al que se le administró metformina y CMO4250 mg/kg/día;
Met+CPA4-100: un grupo al que se le administró metformina y CPA4100 mg/kg/día;
Met+CPA4-250: un grupo al que se le administró metformina y CPA4250 mg/kg/día; * p<0,05 vs. NOR; y #p<0,05 vs. DM.
Las Figuras 10 y 11 son diagramas que analizan un efecto de mejora de la nefropatía diabética, en el cual CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se coadministran con metformina durante 12 semanas, después de regular los niveles de glucosa en sangre durante 12 semanas mientras se administra metformina en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db: NOR: grupo de animales normales (ratones heterocigotos no diabéticos db/+);
DM: grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db);
MET: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día;
Met+Feno: un grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día y fenofibrato 100 mg/kg/día;
Met+CMO4-100: un grupo al que se le administró metformina y CMO4100 mg/kg/día;
Met+CMO4-250: un grupo al que se le administró metformina y CMO4250 mg/kg/día;
Met+CPA4-100: un grupo al que se le administró metformina y CPA4100 mg/kg/día;
Met+CPA4-250: un grupo al que se le administró metformina y CPA4250 mg/kg/día;
*p<0,05 vs. NOR; y
#p<0.05 vs. DM (o db/db).
La Figura 12 son diagramas que confirman un efecto preventivo de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) contra el daño a las células fotorreceptoras (degeneración macular) en un modelo de roedor inducido por MNU.
NOR: Ratones normales C57BL/6;
MNU: Modelo animal inducido por N-metil-N-nitrosourea (MNU);
CMO4-100: Modelo animal inducido por MNU al que se le administró CMO4100 mg/kg/día;
CMO4-1-50: Modelo animal inducido por MNU al que se le administró CMO4-1 50 mg/kg/día;
CMO4-1-100: Modelo animal inducido por MNU al que se le administró CMO4-1 100 mg/kg/día;
CPA4-1-50: Modelo animal inducido por MNU al que se le administró CPA4-1 50 mg/kg/día;
CPA4-1-100: Modelo animal inducido por MNU al que se le administró CPA4-1 100 mg/kg/día;
*p<0,05 vs. NOR; y
#p<0,05 vs. MNU.
La Figura 13 son diagramas que confirman un efecto preventivo de CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) contra el daño a las células epiteliales del pigmento de la retina (degeneración macular) en un NaIO3-modelo de roedor inducido;
Normal: Ratones normales C57BL/6;
NaIO3: NaIO3-modelo animal inducido;
CMO4-1-50: NaIO3-modelo animal inducido al que se le administró CMO4-1 50 mg/kg/día;
CMO4-1-100: NaIO3-modelo animal inducido al que se le administró CMO4-1 100 mg/kg/día;
CPA4-1-50: NaIO3-modelo animal inducido al que se le administró CPA4-1 50 mg/kg/día;
CPA4-1-100: NaIO3-modelo animal inducido al que se le administró CPA4-1 100 mg/kg/día;
*p<0,05 vs. NOR; y
#p<0,05 vs. NaIO3.
La Figura 14 son diagramas que confirman un efecto inhibidor de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (un extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) contra la neovascularización subretiniana en un modelo animal con degeneración macular Vidir/-:
NOR: Ratones normales C57BL/6;
Vidir-/-: modelo de ratón con degeneración macular húmeda;
CMO4-100: Ratones VidiR- a los que se les administró CMO4100 mg/kg/día;
CPA4-100: Ratones Vidir/- a los que se administró CPA4100 mg/kg/día;
*p<0,05 vs. CON; y
#p<0,05 vs. Vidir/-.
La Figura 15 son diagramas que confirman un efecto inhibidor de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) contra el daño a las células del epitelio pigmentario de la retina en un modelo animal con degeneración macular Vidir-/-:
NOR: Ratones normales C57BL/6; Vidir-/-: modelo de ratón con degeneración macular húmeda;
CMO4-100: Ratones Vidi-/- a los que se les administró CMO4100 mg/kg/día; y
CPA4-100: Ratones Vidir/- a los que se administró CPA4100 mg/kg/día.
La Figura 16 son diagramas que confirman un efecto inhibidor de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) contra la expresión de VEGF (tinción púrpura oscura; indicado por flechas) en la retina de Vldlr-/- ratones:
Nor: Ratones normales C57BL/6;
Vldlr/-: modelo de ratón con degeneración macular húmeda;
CMO4-100: Ratones Vldlr/- a los que se les administró CMO4100 mg/kg/día; y
CPA4-100: Ratones Vldlr/- a los que se administró CPA4100 mg/kg/día.
La Figura 17 es un gráfico que confirma un efecto inhibidor de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) contra la neovascularización en la retina de ratones Vldlr/-:
Vldlr/-: modelo de ratón con degeneración macular húmeda;
CMO4-50: Ratones Vldlr/- a los que se les administró CMO450 mg/kg/día;
CMO4-100: Ratones Vldlr/- a los que se les administró CMO4100 mg/kg/día;
CPA4-50: Ratones Vldlr/- a los que se administró CPA450 mg/kg/día; y
CPA4-100: Ratones Vldlr/- a los que se administró CPA4100 mg/kg/día.
La Figura 18 es un gráfico que confirma un efecto inhibidor de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) contra la neovascularización en un área subretiniana de ratas con neovascularización coroidea inducida por láser:
CNV: modelo de ratón tratado con láser con degeneración macular húmeda;
CMO4: ratones con degeneración macular húmeda tratados con láser, a los ratones se les administra 100 mg/kg/día de CMO4;
CPA4: ratones con degeneración macular húmeda tratados con láser, a los ratones se les administra CPA4 100 mg/kg/día; y
#p<0,05 vs. CNV.
La Figura 19 es un gráfico que confirma un efecto de prevenir y tratar las venas varicosas en un modelo animal en el cual las venas varicosas son inducidas por formalina.
Normal: grupo de animales normales (rata SD);
Edema: grupo de animales con várices inducidas;
CMO4-1-50: grupo con venas varicosas inducidas al que se administró CMO4-1 50 mg/kg/día;
CMO4-1-100: grupo con venas varicosas inducidas al que se administró CMO4-1 100 mg/kg/día;
CPA4-1-50: grupo con venas varicosas inducidas al que se administró CPA4-1 50 mg/kg/día; y
CPA4-1-100: grupo con venas varicosas inducidas al que se le administró CPA4-1 100 mg/kg/día.
[Mejor modo]
La presente invención se discutirá con más detalle más abajo.
La presente descripción proporciona una composición farmacéutica para prevenir y tratar las complicaciones diabéticas y el angioedema, que contiene un extracto de ramita de canela como ingrediente activo.
El extracto se extrae al mezclar adicionalmente uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en corteza de raíz de peonía o raíz de peonía.
El extracto inhibe la producción excesiva de productos finales de la glicación avanzada, exhibe un efecto de fragmentar un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz, e inhibe la producción de productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana.
Adicionalmente, las complicaciones diabéticas son preferentemente cualquiera que se selecciona del grupo que consiste en retinopatía diabética, catarata diabética, nefropatía diabética, neuropatía diabética, úlceras del pie diabético, cardiopatía diabética, osteoporosis diabética o arteriosclerosis diabética, pero no se limita a las mismas. Adicionalmente, el angioedema es preferentemente cualquiera seleccionado del grupo que consiste en degeneración macular, edema macular, degeneración retiniana y venas varicosas, pero no se limita a los mismos. El extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de ramita de canela y raíz de peonía se prepara preferentemente de acuerdo con las siguientes etapas, pero no se limita a ellas:
1) una etapa de extracción de la ramita de canela y la corteza de raíz de peonía o la ramita de canela y la raíz de peonía, mediante la adición de un solvente de extracción a cada una de ellas;
2) una etapa de filtrar el extracto de la etapa 1); y
3) una etapa de concentración del extracto filtrado de la etapa 2) a presión reducida;
en donde, en el método anterior, la ramita de canela, la corteza de raíz de peonía, la raíz de peonía usadas en el paso 1) pueden usarse sin restricción; y pueden cultivarse o comprarse.
Es preferible que el extracto mixto se mezcle con ramitas de canela y corteza de raíz de peonía en una relación en peso de 2:1 a 1:10 y luego se extraiga con un solvente de extracción. Con mayor preferencia, se mezclan en una relación en peso de 1:1 a 1:8 y luego se extraen con un solvente de extracción.
Es preferible que el extracto mixto se mezcle con ramitas de canela y raíz de peonía en una relación en peso de 2:1 a 1:10 y luego se extraiga con un solvente de extracción. Con mayor preferencia, se mezclan en una relación en peso de 2:1 a 1:8 y luego se extraen con un solvente de extracción.
Es preferible usar agua, un alcohol o una mezcla de los mismos como solvente de extracción. Como alcohol, es preferible usar alcoholes inferiores C1 a C2. Además, es preferible usar etanol al 30 %, etanol al 50 %, etanol al 70 % o metanol como alcoholes inferiores. Como método de extracción, es preferible usar un método de descompresión a alta temperatura, un método de extracción con agua caliente, un método de extracción por reflujo, un método de extracción hidrotérmico, un método de extracción por maceración, un método de extracción a temperatura ambiente, un método de extracción por ultrasonido, o un método de extracción con vapor, pero el método de extracción no se limita a ellos. La cantidad de solvente de extracción se extrae preferentemente al añadir de 1 a 10 veces la cantidad de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o ramita de canela y raíz de peonía. La temperatura de extracción es preferentemente de 30 °C a 100 °C, pero no se limita a ello. Además, el tiempo de extracción es preferentemente de 2 horas a 48 horas, pero no se limita a ello. Además, la frecuencia de extracción es preferentemente de 2 a 5 veces, pero no se limita a ello.
En el método anterior, la concentración a presión reducida de la etapa 3) se logra preferentemente mediante el uso de un concentrador de presión reducida al vacío o un evaporador rotatorio al vacío, pero no se limita a ello. Además, el concentrado se seca preferentemente mediante el uso de un método de secado a presión reducida, un método de secado al vacío, un método de secado por ebullición, un método de secado por pulverización o un método de secado por congelación, pero no se limita a los mismos.
El extracto mixto puede prepararse al mezclar ramita de canela y corteza de raíz de peonía o ramita de canela y raíz de peonía. Además, cada ramita de canela, corteza de raíz de peonía, raíz de peonía puede extraerse y luego mezclarse para preparar el extracto mixto.
En una modalidad específica de la presente invención, los presentes inventores mezclaron ramita de canela y corteza de raíz de peonía o ramita de canela y raíz de peonía, en diversas proporciones para preparar el extracto mixto, y se analizaron los ingredientes del mismo (ver las Figuras 1a a 1d). Además, se confirmó el contenido de peoniflorina en cada extracto (ver Tabla 1), y al usar el mismo, se confirmó un efecto para inhibir la producción de los productos finales de la glicación avanzada in vitro. Como resultado, el extracto mixto para uso de la presente invención exhibió un efecto inhibidor notable contra la producción de productos finales de la glicación avanzada en comparación con un grupo de control positivo. En particular, al considerar que la aminoguanidina, un grupo de control positivo, es un solo compuesto sintético, se confirmó que el extracto mixto para uso de la presente invención exhibe un efecto inhibidor notablemente excelente contra la producción de los productos finales de la glicación avanzada (ver Tabla 2).
Además, después de tratar el extracto mixto para uso de la presente invención con glucoaldehído, se confirmó el efecto de inhibir la producción de los productos finales de la glicación avanzada. Como resultado, se confirmó que los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (CMO4 y CMO4-1) y los extractos de ramita de canela y raíz de peonía (CPA4 y CPA4-1) para su uso de acuerdo con la presente invención inhibieron significativamente la producción de los productos finales de la glicación avanzada de una manera dependiente de la concentración (1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 20 pg/mL, y 50 pg/mL) (ver Figura 2). Además, como resultado de confirmar el efecto de fragmentar un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz, el extracto mixto para uso de la presente invención exhibió un efecto superior de fragmentar el retículo en comparación con el de ALT-711, que es un grupo de control positivo. En particular, al considerar que ALT-711, un grupo de control positivo, es un solo compuesto sintético, se confirmó que el extracto mixto para uso de la presente invención exhibió un efecto notablemente excelente de fragmentación del retículo (ver Tabla 3).
Adicionalmente, se confirmó el efecto inhibidor del extracto mixto para uso de la presente invención contra la producción de los productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana en un entorno hiperglucémico. Como resultado, se confirmó que los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (CMO2, CMO4 y CMO4-1) y los extractos de ramita de canela y raíz de peonía (CPA1-1, CPA2-1, CPA4 y CPA4-1) para su uso de acuerdo con la presente invención inhibieron la producción de los productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana en un entorno hiperglucémico, de una manera dependiente de la concentración (10 pg/mL, 20 pg/mL, y 50 pg/mL) (ver Figura 3).
Con base en los resultados anteriores, se confirmó que el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o el extracto de ramita de canela y raíz de peonía, inhibió la producción de los productos finales de la glicación avanzada, inhibió los productos finales de la glicación avanzada en ECM recubierto con glucoaldehído, fragmentó un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada ya producidos y las proteínas de la matriz ya producidas, y suprimió significativamente la producción de los productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana en un entorno hiperglucémico.
Adicionalmente, como resultado de confirmar un efecto inhibidor del extracto mixto para uso de la presente invención contra el daño a la barrera hemato-retiniana, se confirmó que CMO4-1-100 y CMO4-1-250, grupos a los que se administraron extractos en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1-100, un grupo al que se le administró el extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para uso de acuerdo con la presente invención impidió significativamente el escape de un material fluorescente de los vasos de la retina (ver Figura 4). Además, como resultado de confirmar un efecto inhibidor contra a la formación de capilares acelulares, se confirmó que CMO4-1-100 y CMO4-1-250, grupos a los que se administró el extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1-100, un grupo al que se le administró el extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para su uso según la presente invención previno significativamente la formación de capilares acelulares (ver Figura 5). Además, como resultado de confirmar un efecto inhibidor contra el daño a la ocludina, una proteína de la unión estrecha entre células, se confirmó que no hubo pérdida de ocludina en CMO4-1-100 y CMO4-1-250, grupos a los que se administró el extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8) (ver Figura 6).
Adicionalmente, como resultado de confirmar un efecto inhibidor del extracto mixto para uso según la presente invención contra al daño a la barrera hemato-retiniana, se confirmó que cuando CMO4-100 y CMO4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-100 y CPA4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se les coadministró respectivamente metformina, mostraron un efecto terapéutico al prevenir significativamente el escape de material fluorescente de los vasos sanguíneos de la retina a las 18 y 24 semanas (ver Figura 7). Como resultado de la confirmación de un efecto inhibidor contra la formación de capilares acelulares, se confirmó que cuando CMO4-100 y CMO4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) se les coadministró respectivamente metformina, ambos inhibieron significativamente la formación de capilares acelulares (ver Figura 8). Como resultado de confirmar un efecto inhibidor contra el daño a la claudina-5, una proteína de la unión estrecha entre las células, se confirmó que cuando CMO4-100 y CMO4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), y CPA4-100 y CPA4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se les coadministró respectivamente con metformina, no hubo pérdida de claudina-5 en los mismos (ver Figura 9a). Adicionalmente, se confirmó que cuando tanto CMO4-250 (grupo al que se le administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) como CPA4-250 (grupo al que se le administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se les coadministró respectivamente metformina, ambos grupos mostraron un aumento significativo en la cantidad de claudina-5 (ver Figura 9b).
Adicionalmente, como resultado de confirmar un efecto del extracto mixto para uso según la presente invención para prevenir y tratar la disminución de la función renal, se confirmó que cuando CMO4-100 y CMO4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-100 y CPA4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se les coadministró metformina, estos inhibieron significativamente el aclaramiento de albúmina y creatinina (ver Figura 10). Como resultado de la confirmación de la glomeruloesclerosis, un cambio morfológico causado por la nefropatía diabética, se confirmó que cuando CMO4-100 y CMO4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), y CPA4-100 y CPA4-250 (grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se les coadministró metformina, estos grupos inhibieron significativamente la glomeruloesclerosis (ver Figura 11).
Adicionalmente, con el fin de confirmar los efectos preventivos y terapéuticos del extracto mixto para uso de la presente invención contra la degeneración macular, se confirmó el daño y la desnaturalización de las células fotorreceptoras mediante el uso del espesor de una capa nuclear externa en los tejidos de la retina. Como resultado, el daño de las células fotorreceptoras causado por MNU se inhibió significativamente en los grupos a los que se les administró CMO4, CMO4-1 (extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) (ver Figura 12). El daño y la desnaturalización de las células epiteliales pigmentarias de la retina se confirmaron mediante el número de veces de una capa nuclear externa en los tejidos de la retina. Como resultado, el daño a las células epiteliales inducido y pigmentado por NaOÍ3 fue inhibido en grupos a los que se administró CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), e inhibió así significativamente el fenómeno en el cual la capa nuclear exterior se dobla (ver Figura 13).
Adicionalmente, se confirmó un efecto inhibidor del extracto mixto para uso de la presente invención contra la neovascularización subretiniana al medir el tamaño del edema en los vasos sanguíneos de la retina. Como resultado, la neovascularización subretiniana se inhibió significativamente mediante la administración de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) (ver Figura 14). Se confirmó la desnaturalización de la estructura morfológica de las células epiteliales pigmentarias de la retina. Como resultado, su desnaturalización se inhibió significativamente mediante la administración de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) (ver Figura 15). Además, se confirmó un efecto inhibidor de la expresión de VEGF en la retina. Como resultado, la expresión de VEGF se inhibió significativamente al administrar CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) (ver Figura 16).
Adicionalmente, se confirmó un efecto inhibidor del extracto mixto para uso de la presente invención contra la neovascularización subretiniana. Como resultado, la neovascularización se inhibió significativamente al administrar 100 mg/kg de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) (ver Figura 17). Como resultado de confirmar un efecto inhibidor contra la neovascularización subretiniana en un área subretiniana, la neovascularización se inhibió significativamente al administrar 100 mg/kg de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)). Además, la neovascularización tendió a inhibirse al administrar 100 mg/kg de CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) (ver Figura 18). Como resultado de confirmar el cambio en el grosor de una capa nuclear externa, que se debió al daño a las células fotorreceptoras en los tejidos nerviosos de la retina, CMO4 al 2.7 % (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), que tiene el contenido más bajo de peoniflorina, mostró un efecto notablemente excelente. Este resultado mostró que el efecto del extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, o el extracto de ramita de canela y raíz de peonía no se debe únicamente a la peoniflorina, sino que el efecto del mismo es, de hecho, un efecto sinérgico de los numerosos ingredientes presentes en el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, o en el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (ver Tablas 4 y 5).
Adicionalmente, como resultado de confirmar la condición de edema antes y después de inducir el edema de las extremidades inferiores mediante el uso del extracto mixto para el uso de la presente invención, el cambio en el tamaño del edema debido al edema de las extremidades inferiores no se inhibió en gran medida por CMO4-1 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), pero se inhibió significativamente con CPA4-1 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) de una manera dependiente de la concentración (ver Figura 19).
Por lo tanto, se ha confirmado que el extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de ramita de canela y raíz de peonía, para su uso de acuerdo con la presente invención, inhibe la producción excesiva de productos finales de la glicación avanzada, que ocurre en condiciones de diabetes crónica, exhibe el efecto de fragmentar un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz, tiene un efecto excelente en la inhibición de la producción de los productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana sometidas a un entorno hiperglucémico o de envejecimiento, y tienen excelentes efectos para retrasar, prevenir y tratar las complicaciones diabéticas, la degeneración muscular, la conmoción retinal y el edema de las extremidades inferiores en varios modelos animales de complicaciones diabéticas, degeneración macular y edema de las extremidades inferiores y, de esa manera, el extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de la ramita de canela y la raíz de peonía pueden usarse eficazmente como composición farmacéutica para prevenir y tratar las complicaciones diabéticas y el angioedema.
Una composición que contiene el extracto mixto de la presente invención puede contener al menos un tipo de ingredientes activos que exhiben funciones iguales o similares, además de los ingredientes anteriores.
La composición de la presente invención puede incluir adicionalmente aditivos farmacéuticamente aceptables tales como almidón, almidón gelatinizado, celulosa microcristalina, azúcar de leche, povidona, dióxido de silicio coloidal, hidrogenofosfato de calcio, lactosa, manitol, malta, goma arábiga, almidón pregelatinizado, almidón de maíz, celulosa en polvo, hidroxipropilcelulosa, opadry, almidón de glicolato de sodio, cera de carnauba, silicato de aluminio sintético, ácido esteárico, estearato de magnesio, estearato de aluminio, estearato de calcio, sacarosa, dextrosa, sorbitol y talco, entre otros. Es preferible que los aditivos farmacéuticamente aceptables de la presente invención se incluyan en una cantidad de 0,1 % en peso a 90 % en peso basado en la composición, pero los aditivos no se limitan a los mismos.
Es decir, la composición para uso de la presente invención puede administrarse en diversas formulaciones orales y parenterales en el momento de realizar la administración clínica real. Cuando se formula la composición, puede prepararse mediante el uso de diluyentes o excipientes convencionales tales como rellenos, extensores, aglutinantes, agentes humectantes, desintegrantes, tensioactivos, etc. Las formulaciones sólidas para administración oral incluyen tabletas, píldoras, gránulos, cápsulas, etc., y estas formulaciones sólidas pueden prepararse al mezclar al menos un excipiente, por ejemplo, almidón, carbonato cálcico, sacarosa, lactosa o gelatina, con el extracto mixto de la presente invención. Adicionalmente, pueden usarse lubricantes tales como estearato de magnesio, talco, entre otros, además de excipientes simples. Las formulaciones líquidas para administración oral incluyen suspensiones, líquido para uso interno, emulsiones y jarabes, entre otros, y también pueden incluirse diversos excipientes tales como humectantes, agentes edulcorantes, agentes aromáticos y conservantes, entre otros, así como agua y parafina líquida, que son diluyentes simples. Las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas estériles, solventes no acuosos, suspensiones, emulsiones, liofilizantes y supositorios. Como solventes no acuosos y suspensiones pueden usarse propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva, y ésteres inyectables tales como oleato de etilo, entre otros. Como compuesto base de supositorios pueden usarse Witepsol, macrogol, tween 61, manteca de cacao, laurinum y glicerogelatina, entre otros.
La composición para uso de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral en dependencia de los métodos previstos. La inyección seleccionada entre inyecciones dermatológicas o intraperitoneales, inyección intrarrectal, inyección hipodérmica, inyección venosa, inyección intramuscular o inyección intratorácica es preferible cuando se aplica la administración parenteral. La dosificación varía en dependencia del peso, la edad, el sexo, la salud, la dieta, el tiempo de administración, el método de administración, la tasa de excreción y la gravedad de la enfermedad del paciente.
La dosificación de la composición para uso de la presente invención varía en dependencia del peso, la edad, el sexo, la salud, la dieta, el tiempo de administración, el método de administración, la tasa de excreción y la gravedad de la enfermedad del paciente, y la dosificación diaria es de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg basado en cantidades del extracto mixto de la presente invención. Preferentemente, la dosis diaria es de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg y puede administrarse de 1 a 6 veces al día.
La composición para uso de la presente invención puede usarse sola o junto con cirugía, radioterapia, terapia hormonal, terapia química y métodos que usan modificadores de la respuesta biológica para prevenir y tratar complicaciones diabéticas o angioedema.
Adicionalmente, la presente descripción proporciona un alimento funcional saludable para su uso en la prevención y mejora de las complicaciones diabéticas y el angioedema, que contiene un extracto de ramitas de canela como ingrediente activo.
El extracto se extrae al mezclar adicionalmente cualquier selección del grupo que consiste en corteza de raíz de peonía, raíz de peonía.
El extracto inhibe la producción excesiva de productos finales de la glicación avanzada, exhibe un efecto de fragmentar un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz, e inhibe la producción de productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana.
Adicionalmente, las complicaciones diabéticas son preferentemente cualquiera que se selecciona del grupo que consiste en retinopatía diabética, catarata diabética, nefropatía diabética, neuropatía diabética, úlceras del pie diabético, cardiopatía diabética, osteoporosis diabética o arteriosclerosis diabética, pero no se limita a las mismas. Adicionalmente, el angioedema es preferentemente cualquiera seleccionado del grupo que consiste en degeneración macular, edema macular, degeneración retiniana y venas varicosas, pero no se limita a los mismos. El extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, ramita de canela y raíz de peonía, se prepara preferentemente de acuerdo con las siguientes etapas, pero no se limita a ellas:
1) una etapa de extracción de la ramita de canela y la corteza de raíz de peonía, la ramita de canela y la raíz de peonía, o la ramita de canela y poria mediante la adición de un solvente de extracción a cada una de ellas; 2) una etapa de filtrar el extracto de la etapa 1); y
3) una etapa de concentración del extracto filtrado de la etapa 2) a presión reducida;
en donde, en el método anterior, la ramita de canela, la corteza de raíz de peonía, la raíz de peonía y la poria usadas en la etapa 1) pueden usarse sin restricción; y puede cultivarse o comprarse.
Es preferible que el extracto mixto se mezcle con ramitas de canela y corteza de raíz de peonía en una relación en peso de 2:1 a 1:10 y luego se extraiga con un solvente de extracción. Con mayor preferencia, se mezclan en una relación en peso de 1:1 a 1:8 y luego se extraen con un solvente de extracción.
Es preferible que el extracto mixto se mezcle con ramitas de canela y raíz de peonía en una relación en peso de 2:1 a 1:10 y luego se extraiga con un solvente de extracción. Con mayor preferencia, se mezclan en una relación en peso de 2:1 a 1:8 y luego se extraen con un solvente de extracción.
Es preferible usar agua, un alcohol o una mezcla de los mismos como solvente de extracción. Como alcohol, es preferible usar alcoholes inferiores C1 a C2. Además, es preferible usar etanol al 30 %, etanol al 50 %, etanol al 70 % o metanol como alcoholes inferiores. Como método de extracción, es preferible usar un método de descompresión a alta temperatura, un método de extracción con agua caliente, un método de extracción por reflujo, un método de extracción hidrotérmico, un método de extracción por maceración, un método de extracción a temperatura ambiente, un método de extracción por ultrasonido, o un método de extracción con vapor, pero el método de extracción no se limita a ellos. La cantidad de solvente de extracción se extrae preferentemente al añadir de 1 a 10 veces la cantidad de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o ramita de canela y raíz de peonía. La temperatura de extracción es preferentemente de 30 °C a 100 °C, pero no se limita a ello. Además, el tiempo de extracción es preferentemente de 2 horas a 48 horas, pero no se limita a ello. Además, la frecuencia de extracción es preferentemente de 2 a 5 veces, pero no se limita a ello.
En el método anterior, la concentración a presión reducida de la etapa 3) se logra preferentemente mediante el uso de un concentrador de presión reducida al vacío o un evaporador rotatorio al vacío, pero no se limita a ello. Además, el concentrado se seca preferentemente mediante el uso de un método de secado a presión reducida, un método de secado al vacío, un método de secado por ebullición, un método de secado por pulverización o un método de secado por congelación, pero no se limita a los mismos.
El extracto mixto puede prepararse al mezclar ramita de canela y corteza de raíz de peonía o ramita de canela y raíz de peonía. Además, cada ramita de canela, corteza de raíz de peonía, raíz de peonía puede extraerse y luego mezclarse para preparar el extracto mixto.
Se ha confirmado que el extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía o de ramita de canela y raíz de peonía para su uso de acuerdo con la presente invención inhibe la producción excesiva de productos finales de la glicación avanzada, que ocurre en condiciones de diabetes crónica, exhibe el efecto de fragmentar una reticulación entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz, tienen un efecto excelente en la inhibición de la producción de los productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana sometidas a un entorno hiperglucémico o de envejecimiento, y tienen excelentes efectos para retrasar, prevenir y tratar las complicaciones diabéticas, la degeneración muscular, la conmoción retinal y el edema de las extremidades inferiores en varios modelos animales de complicaciones diabéticas, degeneración macular y edema de las extremidades inferiores y, de esa manera, el extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, de ramita de canela y raíz de peonía, o de ramita de canela y poria pueden usarse como alimento funcional saludable para prevenir y mejorar las complicaciones diabéticas y el angioedema.
Los alimentos funcionales saludables pueden prepararse y procesarse en forma de tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, líquidos, píldoras, etc., pero no se limitan a ello. Además, pueden prepararse y procesarse en cualquier forma conforme a la ley.
El extracto mixto para uso de la presente invención puede añadirse a los alimentos solo o en combinación con diferentes alimentos o ingredientes alimentarios. Además, puede usarse apropiadamente de acuerdo con métodos convencionales. La cantidad mezclada del ingrediente activo puede determinarse adecuadamente en dependencia del propósito (prevención o mejora) del uso del ingrediente activo. Generalmente, la cantidad del extracto mixto en los alimentos funcionales saludables puede agregarse en 0,1 a 90 partes en peso del peso total del alimento. Sin embargo, en el caso de una ingesta a largo plazo para la salud y la higiene o el control de la salud, la cantidad puede ser menor que el intervalo anterior. Alternativamente, dado que no hay ningún problema en términos de seguridad, el ingrediente activo puede usarse en una cantidad mayor que el intervalo anterior.
La composición para una bebida funcional para la salud de la presente descripción puede contener el extracto mixto descrito anteriormente como ingrediente esencial en una relación predeterminada y varios agentes saborizantes o carbohidratos naturales como ingredientes adicionales sin limitación particular, como en una bebida convencional. Los ejemplos de los carbohidratos naturales descritos anteriormente incluyen azúcares convencionales, tales como un monosacárido, por ejemplo, glucosa, fructosa, etc., un disacárido, por ejemplo, maltosa, sacarosa, etc., y un polisacárido, por ejemplo, dextrina, ciclodextrina, etc., y alcoholes de azúcar tales como xilitol, sorbitol, eritritol, etc. Además de los ingredientes descritos anteriormente, pueden usarse favorablemente como agentes saborizantes un agente saborizante natural (taumatina, un extracto de stevia (por ejemplo., rebaudiósido A, glicirricina, etc.) y un saborizante sintético (porejemplo, sacarina, aspartamo, etc.).
Además de los ingredientes descritos anteriormente, el extracto mixto para uso de la presente invención puede contener además varios suplementos nutricionales, vitaminas, minerales (electrolitos), agentes saborizantes tales como un agente saborizante sintético y un agente saborizante natural, un agente colorante y un potenciador por ejemplo, queso, chocolate, etc.), ácido péctico y una sal del mismo, ácido algínico y una sal del mismo, un ácido orgánico, un coloide espesante protector, un regulador de pH, un estabilizador, un conservante, glicerina, un alcohol y un agente carbonatante usado en bebidas no alcohólicas. Además, el extracto para uso de la presente invención puede contener pulpas para fabricar zumos de frutas naturales, zumos de frutas y bebidas vegetales. Tales ingredientes pueden usarse independientemente o en combinación con otros ingredientes. La relación de estos aditivos no es muy importante, pero generalmente se selecciona en el intervalo de 0,1 a aproximadamente 20 partes en peso por 100 partes en peso del extracto mixto de la presente invención.
Ejemplo 1: Preparación de extracto mixto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía
La ramita de canela y la corteza de raíz de peonía se compraron en Baekjedang, una tienda de hierbas medicinales en Daejeon, Corea, y los Ejemplos se llevaron a cabo como sigue. Además, la ramita de canela comprada y la corteza de raíz de peonía que se compraron, se mantuvieron en una cámara fría del equipo de investigación de complicaciones diabéticas del Instituto de Medicina Oriental de Corea.
1-1 Preparación de CMO1, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:1)
Se mezclaron ramitas de canela (12 g) y corteza de raíz de peonía (12 g) en una relación de 1:1, y luego se añadió un total de 24 g de las mismas a etanol al 50 % (144 mL). Después de eso, el resultante se extrajo repetidamente dos veces a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CMO1, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía.
1-2 Preparación de CMO1-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:1) Se mezclaron ramitas de canela (90 g) y corteza de raíz de peonía (90 g) en una relación de 1:1, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). A continuación, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CMO1-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía.
1-3 Preparación de CMO2, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:2)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1 anterior, se mezclaron ramitas de canela (10 g) y corteza de raíz de peonía (20 g) en una relación de 1:2, y luego se añadió un total de 30 g de las mismas a etanol al 50 % (180 mL). A continuación, el resultante se extrajo repetidamente dos veces a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CMO2, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía. 1-4 Preparación de CMO2-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:2) De la misma manera que en el Ejemplo 1-2 anterior, se mezclaron ramitas de canela (60 g) y corteza de raíz de peonía (120 g) en una relación de 1:1, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). Posteriormente, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CMO2-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía.
1-5 Preparación de CMO3, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:4)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1 anterior, se mezclaron ramitas de canela (6 g) y corteza de raíz de peonía (24 g) en una relación de 1:4, y luego se añadió un total de 30 g de las mismas a etanol al 50 % (180 mL). Después de eso, el resultante se extrajo repetidamente a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CMO3, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía. 1-6 Preparación de CMO3-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:4) De la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se mezclaron ramitas de canela (36 g) y corteza de raíz de peonía (144 g) en una relación de 1:4, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). Posteriormente, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CMO3-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía.
1-7 Preparación de CMO4, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1, se mezclaron ramitas de canela (3,5 g) y corteza de raíz de peonía (28 g) en una relación de 1:8, y luego se añadió un total de 31,5 g de las mismas a etanol al 50 % (190 mL). Después de eso, el resultante se extrajo repetidamente a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CMO4, un extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía.
1-8 Preparación de CMO4-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8) De la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se mezclaron ramitas de canela (20 g) y corteza de raíz de peonía (160 g) en una relación de 1:8, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). Posteriormente, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CMO4-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía.
Ejemplo 2: Preparación de extracto mixto de ramita de canela y raíz de peonía
La ramita de canela y la raíz de peonía se compraron en Baekjedang, una tienda de hierbas medicinales en Daejeon, Corea, y los Ejemplos se llevaron a cabo de la siguiente manera. Además, la ramita de canela y la raíz de peonía compradas se mantuvieron en una cámara fría del equipo de investigación de complicaciones diabéticas del Instituto de Medicina Oriental de Corea.
2-1 Preparación de CPA1, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía (2:1)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1, se mezclaron ramitas de canela (16 g) y raíz de peonía (8 g) en una relación de 2:1, y luego se añadió un total de 24 g de las mismas a etanol al 50 % (144 mL). Después de eso, el resultante se extrajo repetidamente dos veces a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CPA1, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía.
2-2 Preparación de CPA1-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (2:1)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se mezclaron ramitas de canela (120 g) y corteza de raíz de peonía (60 g) en una relación de 2:1, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). Posteriormente, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CPA1-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía.
2-3 Preparación de CPA2, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:2)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1, se mezclaron ramitas de canela (10 g) y raíz de peonía (20 g) en una relación de 1:2, y luego se añadió un total de 30 g de las mismas a etanol al 50 % (180 mL). A continuación, el resultante se extrajo repetidamente dos veces a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CPA2, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía.
2-4 Preparación de CPA2-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:2)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se mezclaron ramitas de canela (60 g) y raíz de peonía (120 g) en una relación de 1:2, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). A continuación, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CPA2-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía.
2-5 Preparación de CPA3, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:4)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1, se mezclaron ramitas de canela (6 g) y raíz de peonía (24 g) en una relación de 1:4, y luego se añadió un total de 30 g de las mismas a etanol al 50 % (180 mL). Después de eso, el resultante se extrajo repetidamente dos veces a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CPA3, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía.
2-6 Preparación de CPA3-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:4)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se mezclaron ramitas de canela (36 g) y raíz de peonía (144 g) en una relación de 1:4, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). Posteriormente, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CPA3-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía.
2-7 Preparación de CPA4, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1, se mezclaron ramitas de canela (3,5 g) y raíz de peonía (28 g) en una relación de 1:8, y luego se añadió un total de 31,5 g de las mismas a etanol al 50 % (190 mL). Posteriormente, el resultante se extrajo repetidamente dos veces a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CPA4, un extracto de ramita de canela y raíz de peonía.
2-8 Preparación de CPA4-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-2, se mezclaron ramitas de canela (20 g) y raíz de peonía (160 g) en una relación de 1:8, y luego se añadió un total de 180 g de las mismas a agua purificada (1080 mL). Después de eso, el resultante se extrajo con agua caliente durante aproximadamente dos horas en una máquina de decocción de hierbas, y así se preparó CPA4-1, un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía.
Ejemplo Comparativo 3: Preparación de extracto mixto de ramita de canela y poria
La ramita de canela y la poria se compraron en Baekjedang, una tienda de hierbas medicinales en Daejeon, Corea, y los Ejemplos se llevaron a cabo como sigue. Además, la ramita de canela y la poria compradas se mantuvieron en una cámara fría del equipo de investigación de complicaciones diabéticas del Instituto de Medicina Oriental de Corea.
3-1 Preparación de CPO, un extracto de ramita de canela y poria (1:1)
De la misma manera que en el Ejemplo 1-1, se mezclaron ramitas de canela (12 g) y poria (12 g) en una relación de 1:1, y luego se añadió un total de 24 g de las mismas a etanol al 50 % (144 mL). Después de eso, el resultante se extrajo repetidamente dos veces a reflujo a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente tres horas, y así se preparó CPO, un extracto de ramita de canela y poria.
Ejemplo 4: Preparación de KBT, un extracto mixto de ramita de canela, poria, corteza de raíz de peonía, radix paeoniae rubra y pepita de melocotón
Se mezcló la misma cantidad de ramita de canela, de poria, de corteza de raíz de peonía, de radix paeoniae rubra y de pepita de melocotón, y se añadieron 10 volúmenes de agua destilada. Después de eso, el resultante se sometió a decocción durante aproximadamente dos horas mediante el uso de una máquina de extracción de vacío de alta velocidad a baja temperatura, se extrajo a alta temperatura a presión reducida y se secó, y así se preparó KBT, que es el extracto que se usa como grupo de control.
Ejemplo 5: Preparación de KJT, un extracto mixto de ramita de canela, raíz de peonía, regaliz, jengibre y azufaifo Se mezclaron ramitas de canela, raíz de peonía, regaliz, jengibre y azufaifo en una relación de 3:2:1:1:1, y se añadieron 10 volúmenes de agua destilada. Posteriormente, el resultante se sometió a decocción durante aproximadamente dos horas mediante el uso de una máquina de extracción de súper velocidad a baja temperatura al vacío, se extrajo a alta temperatura a presión reducida y se secó, y así se preparó KJT, que es el extracto que se usa como grupo de control.
Ejemplo 6: Análisis de ingredientes en el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía y en el extracto de ramita de canela y raíz de peonía
Con el fin de confirmar los ingredientes de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía), CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía), CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía), se realizó un análisis por HPLC.
Como resultado, como se muestra en la Figura 1, se confirmó que los ingredientes índice de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía) y CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía) eran ácido gálico, oxipeoniflorina, albiflorina, peoniflorina, ácido benzoico, ácido cinámico, cinamaldehído y peonol (Figuras 1a a 1b). Además, también se confirmó que los ingredientes índice de CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía) fueron ácido gálico, oxipeoniflorina, albiflorina, peoniflorina, ácido benzoico, ácido cinámico y cinamaldehído (Figuras 1c a 1d). Además, como se muestra en la Tabla 1 más abajo, se confirmó el contenido de peoniflorina en cada extracto (Tabla 1).
[Tabla 1]
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Ejemplo Experimental 1: Inhibición de la producción de productos finales de la glicación avanzada (AGE)
Los presentes inventores analizaron un efecto inhibidor de la producción in vitro de productos finales de la glicación avanzada del extracto mixto que contiene ramita de canela, que se preparó en los Ejemplos 1 a 5.
Específicamente, se usó 10 mg/mL de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma, EE. UU.) disuelta en tampón fosfato 50 mM (pH 7,4) como fuente de proteína, y la solución mezclada con fructosa 0,2 M y glucosa 0,2 M se usó como fuente de azúcar. Los extractos de los Ejemplos y la aminoguanidina (grupo de control positivo) se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,2 %, seguido de disolución de nuevo en Tween 80 al 15 %. La fuente de proteína, la fuente de azúcar y los extractos así preparados se mezclaron, se prepararon a 1 mL en total, se cultivaron a 37 °C durante siete días y se dejó que ocurriera la glicación. En la presente descripción, se añadió azida sódica al 0,02 %, un agente antibacteriano, para prevenir la producción bacteriana. Después del cultivo, se midió la fluorescencia a una longitud de onda de absorción de 350 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm mediante el uso de un detector espectrofluorométrico (Bio-TEK, EE. UU.). Se calculó como se muestra en la Ecuación 1 más abajo, y los resultados se muestran en la Tabla 2 más abajo.
Figure imgf000018_0001
Como resultado, como se muestra en la Tabla 2 más abajo, se confirmó que CMO1, CMO2, CMO3 y CMO4, que son los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, exhibieron un efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada. Es decir, el efecto inhibidor de CMO1, CMO2, CMO3 y c MO4 contra la producción de productos finales de la glicación avanzada fue, respectivamente, 17 veces, 21,3 veces, 21,3 veces y 22,7 veces mayor que el del grupo de control positivo de aminoguanidina. Además, CPA1, CPA2, CPA3 y CPA4, que son los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, exhibieron respectivamente un efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada de 8 veces, 10,9 veces, 10,1 veces y 12,1 veces más alto que el grupo de control positivo de aminoguanidina. Además, el CPO, que es el extracto de ramita de canela y poria, exhibió un efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada 4 veces mayor que el grupo de control positivo de aminoguanidina (Tabla 2).
Adicionalmente, se confirmó que CMO1, CMO2, CMO3 y CMO4, que son los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, y CPA1, CPA2, CPA3 y CPA4, que son los extractos de ramita de canela y poria, respectivamente exhibieron un efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada de 4,8 veces, 5,9 veces, 5,9 veces, 6,3 veces, 2,3 veces, 3,0 veces, 2,8 veces, 3,4 veces y 1,1 veces más alto que el efecto inhibidor de KBT, el extracto del Ejemplo 4. Además, también se confirmó que CMO1, CMO2, CMO3 y CMO4, que son los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, y CPA1, CPA2, CPA3 y CPA4, que son los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, y CPO, que es el extracto de ramita de canela y poria, exhibieron respectivamente un efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada de 8,5 veces, 10,4 veces, 10,4 veces, 10,4 veces, 11,1 veces, 4,1 veces, 5,4 veces, 8,6 veces y 2,0 veces más alto que el efecto inhibidor de KJT, el extracto del Ejemplo 5 (Tabla 2).
En consecuencia, se considera que la aminoguanidina, que es el grupo de control positivo, es un solo compuesto sintético, se confirmó que los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, para usar de acuerdo con la presente invención exhibieron un efecto inhibidor notablemente superior contra la producción de productos finales de la glicación avanzada. Al mismo tiempo, también se confirmó que los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, eran notablemente superiores en comparación con KBT (el extracto del Ejemplo 4) o KJT (el extracto del Ejemplo 5).
[Tabla 2]
Figure imgf000018_0002
(continuación)
Figure imgf000019_0001
Ejemplo Experimental 2: Efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada en la matriz extracelular (ECM) tratada con glucoaldehído
Después de tratar los extractos mixtos preparados en los Ejemplos 1 y 2 con glucoaldehído, se confirmó un efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada.
La matriz extracelular (ECM) (Sigma-Aldrich, Cat. No. c-3867) se estableció en 10 pg/cm2, se dispensó en una placa de 96 pocillos negros y luego se revistió durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se retiró la ECM de la placa recubierta, se secó completamente a temperatura ambiente y luego se mezcló con glucoaldehído 100 mM (Sigma-Aldrich) y extractos ya diluidos a diversas concentraciones (1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 20 pg/mL y 50 pg/mL), de modo que el volumen total de los mismos se convirtió en 100 pL. Posteriormente, el resultante se hizo reaccionar a 37 °C durante cuatro horas, y se confirmó que inhibe la producción de productos finales de la glicación avanzada (AGE). Para el grupo de control positivo, solo se añadió glucoaldehído 100 mM (Sigma-Aldrich) a la placa revestida para confirmar la producción de productos finales de la glicación avanzada. Después de lavar el grupo resultante y positivo dos veces con PBS, se añadió borohidruro de sodio 50 mM (Sigma-Aldrich) y el grupo aldehído restante se neutralizó luego durante cinco minutos. Después de la neutralización, se lavaron dos veces con PBS, y luego se añadió nuevamente PBS (100 pl) para confirmar mediante el uso de espectroscopía de fluorescencia (Ex. 370 nm/Em 440 nm). Para el análisis estadístico, se estableció p <0.05 como valor significativo mediante el uso del programa Prism 5.0 (GraphPad).
Como resultado, como se muestra en la Figura 2, se confirmó que CMO4 y CMO4-1, los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, y CPA4 y CPA4-1, los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, para usar de acuerdo con la presente invención inhibió significativamente la producción de productos finales de la glicación avanzada de una manera dependiente de la concentración (1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 20 pg/mL y 50 pg/mL) (Figura 2).
Ejemplo Experimental 3: Efecto de la fragmentación de retículos de productos finales de la glicación avanzada
Se confirmó un efecto del extracto mixto preparado en los Ejemplos 1 a 3, en el cual se fragmentó un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de la matriz. Se usó ALT-711 (Alteon Inc., Ramsey, NJ) para un grupo de control positivo.
Específicamente, se dispensó 1,0 pg de AGE-BSA (Transgenic Inc. Kobe, Japón) en una placa de microtitulación de 96 pocillos recubierta de colágeno (Greiner Bio-One, Alemania) y se cultivó a 37 °C durante cuatro horas, y luego dejó que el AGE-BSA y el colágeno se reticularan. Después de lavar el resultante tres veces con PBST (0,05 %) para eliminar el AGE-BSA no conectado, se añadieron un extracto mixto y ALT-711 y se cultivó a 37 °C durante cuatro horas. A continuación, el resultante se lavó con PBST (0,05 %) y, con el fin de detectar el AGE-BSA remanente debido a la reticulación con el colágeno, se diluyeron anticuerpos monoclonales de ratón anti-AGE-BSA (6D12, Transgenic Inc. Kobe, Japón) a 1:250 y se distribuyeron, seguido de cultivo a 37 °C durante una hora. Después de una hora, el resultante se lavó con PBST (0,05 %) y se hizo reaccionar con anticuerpos IgG anti-ratón de cabra unidos a HRP (SantaCruz, EE.UU.) para desarrollar TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) como sustrato. A continuación, se midió la absorbancia a 450 nm. El efecto de fragmentación del retículo (%) de AGE-BSA se calculó como se muestra en la siguiente Ecuación 2.
[Ecuación 2]
absorbancia del pocilio al que
se añadió el fármaco
Efecto de fragmentación (%) - ___________________________________________ ^ ^QQ absorbancia del pocilio al que
no se añadió el fármaco
Como resultado, como se muestra en la Tabla 3 más abajo, se confirmó que CMO1, CMO1-1, CMO2, CMO2-1, CMO3, CMO3-1, CMO4 y CMO4-1, que son los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, exhibieron respectivamente un efecto de fragmentación del retículo de los productos finales de la glicación avanzada, 1183 veces, 12362 veces, 16726 veces, 4352 veces, 13225 veces, 3419 veces, 11685 veces y 3281 veces mayor que el de ALT-711, el grupo de control positivo. Además, también se confirmó que CPA1, CPA1-1, CPA2, CPA2-1, CPA3, CPA3-1, CPA4 y CPA4-1, que son los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, respectivamente, exhibieron un efecto de fragmentación del retículo de los productos finales de la glicación avanzada, 2221 veces, 13124 veces, 1965 veces, 12362 veces, 2093 veces, 11373 veces, 1977 veces y 7515 veces más alto que el de ALT-711, el grupo de control positivo. Además, el CPO, que es el extracto de ramita de canela y poria, exhibió un efecto de fragmentación del retículo de productos finales de la glicación avanzada 3495 veces mayor que el de ALT-711, el grupo de control positivo (Tabla 3).
En consecuencia, se confirmó que los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, tienen un efecto de fragmentación del retículo superior en comparación con ALT-711, el grupo de control positivo. En particular, si se considera que ALT-711, el grupo de control positivo, es un solo compuesto sintético, se confirmó que los extractos mixtos para usar de la presente invención tienen un efecto notablemente superior.
[Tabla 3]
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Ejemplo Experimental 4: Efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada en la línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana en un entorno hiperglucémico
El efecto inhibidor contra la producción de productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana en un entorno hiperglucémico se confirmó a partir de CMO2, CMO4 y CMO4-1, que son extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, y CPA1-1, CPA2-1, CPA4 y CPA4-1, que son extractos de ramita de canela y raíz de peonía, preparados en los Ejemplos 1 y 2.
Específicamente, se cultivó una línea de células epiteliales pigmentarias humanas (ARPE-19: ATCC No. CRL-2302) en una incubadora con CO2 al 5 % mediante el uso de medio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, EE.UU.) en un entorno hiperglucémico. Después de cultivar la línea de células epiteliales pigmentarias humanas bajo una condición hiperglucémica (25 mM) que contiene la concentración final de BSA (500 pg/mL), se trataron c Mo2, CMO4 y CMO4-1, que son los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, y CPA1-1, CPA2-1, CPA4 y CPA4-1, que son los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, en cada concentración (10 pg/mL, 20 pg/mL y 50 pg/mL). Además, también se trató aminoguanidina (AG, 10 mM) para el grupo de control positivo. Después de lavar con 1*PBS, las muestras se trataron con tampón de muestra de LaemmLi (Cat. No. 161-0737, Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.), se hirvieron a 100 °C durante cinco minutos y luego se usaron después de que se cuantificaron las proteínas para las muestras mediante el uso de BCA (Pierce Biotechnology, IL, EE. UU.). Las proteínas se sometieron a electroforesis a 120 V durante dos horas en gel de poliacrilamida al 10 % que contenía SDS (PAGE), y luego la proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.) a 250 mA durante 1,5 horas mediante tampón de transferencia (Tris 0,25 M, glicina 1,92 M, pH 8,3 a 8,4). Después de bloquear con leche desgrasada al 5 % en TBS-T (Tris 200 mM, NaCl 1,37 M, Tween 20 al 0,05 %), se hicieron reaccionar anticuerpos AGE (Ac monoclonal Anti-AGE, Clon No. 6D12) a 4°C. Después del lavado, los anticuerpos secundarios conjugados con HRP se hicieron reaccionar, se lavó de nuevo y se hicieron reaccionar mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL) para análisis mediante el uso de LAS-3000 (Fuji film, Japón). Posteriormente, los resultados se analizaron estadísticamente mediante el uso de GraphPad Prism 5 (San Diego).
Como resultado, como se muestra en la Figura 3, se confirmó que CMO2, CMO4 y CMO4-1, que son los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, y CPA1-1, CPA2-1, CPA4 y CPA4-1, que son los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, también exhibieron la producción de productos finales de la glicación avanzada en una línea celular epitelial pigmentaria de la retina humana bajo un ambiente hiperglucémico, de una manera dependiente de la concentración (10 pg/mL, 20 pg/mL y 50 pg/mL) (Figura 3).
Con base en los resultados anteriores, se confirmó que los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, los extractos de ramita de canela y raíz de peonía, inhibieron la producción de productos finales de la glicación avanzada, inhibieron la producción de productos finales de la glicación avanzada en ECM recubierto con glucoaldehído, fragmentó un retículo entre los productos finales de la glicación avanzada y las proteínas de matriz ya producidos, e inhibieron significativamente la producción de productos finales de la glicación avanzada en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana en un entorno hiperglucémico.
Ejemplo experimental 5: Efecto preventivo de las complicaciones diabéticas en modelo animal
Para confirmar un efecto preventivo de CMO4-1, que es el extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1, que es el extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), contra las complicaciones diabéticas en un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db se administraron CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) a ratones db/db durante 12 semanas. El fenofibrato, un fármaco aprobado en Australia para el tratamiento de la retinopatía diabética, se usó como grupo de control positivo.
5-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
Ratones macho de 7 semanas db/db, un modelo animal de diabetes tipo 2 en el cual la diabetes se desarrolló debido a una mutación en un receptor de leptina, se dividieron en siete grupos al proporcionar 10 ratones en cada grupo de la siguiente manera:
(1) grupo de animales normales (ratones db/+ heterocigotos no diabéticos, NOR); (2) Grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos, DM C57BL/KsJ-Leprdb/db); (3) FENO (grupo al que se le administró fenofibrato 100 mg/kg/día); (6) CMO4-1-100 (grupo al que se le administró CMO4-1 100 mg/kg/día); (5) CMO4-1-250 (grupo al que se le administró CMO4-1 250 mg/kg/día); (6) CPA4-1-100 (grupo al que se le administró CPA4-1 100 mg/kg/día); y (7) CPA4-1-250 (grupo al que se le administró CPA4-1 250 mg/kg/día).
Todos los fármacos se suspendieron en metilcelulosa al 0,5 % y se administraron por vía oral una vez al día durante 12 semanas. La misma cantidad de sólo 0,5 % de solución de metilcelulosa, una solución vehículo, se administró por vía oral en los grupos experimentales (1) y (2). Se midieron el peso corporal y la ingesta de alimento y agua durante el período de administración del fármaco.
5-2 Efecto inhibidor contra el daño a la barrera hemato-retiniana
Si la hiperglucemia persiste, la barrera hemato-retiniana se dañará debido a la disfunción de los vasos sanguíneos de la retina en el globo ocular. Con respecto a esto, después de administrar CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), se confirmó un efecto de inhibición del daño a la barrera hemato-retiniana.
Específicamente, los ratones del grupo experimental diseñado como en el Ejemplo Experimental 5-1 se anestesiaron por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (25 mg/kg) y se abrieron la cavidad peritoneal y la cavidad torácica para sujetar el corazón. Además, en el ventrículo izquierdo se inyectó 50 mg/mL de fluoresceína-dextrano (peso molecular 2*106) que se preparó al disolver en PBS esterilizado (1 mL). Después de 10 minutos, se enuclearon los globos oculares y se colocó el globo ocular izquierdo en una copa ocular. La retina separada se colocó en un portaobjetos y luego se montó mediante el uso de un medio de montaje acuoso. Después de que se secó lo suficiente, se usó un microscopio de fluorescencia para observarla.
Como resultado, como se muestra en la Figura 4, se confirmó que aunque no se observó flujo de salida de fluorescencia en el grupo normal (NOR), las sustancias fluorescentes liberadas debido al daño a la barrera hematoretiniana aumentaron significativamente en el grupo diabético (DM). Además, también se confirmó que no se evitó la salida de sustancias fluorescentes en el grupo al que se administró fenofibrato (FENO), el grupo de control positivo. Sin embargo, CMO4-1-100 y CMO4-1-250, que son los grupos a los que se administró un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1-100, que es el grupo al que se le administró un extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para uso de acuerdo con la presente invención, evitó significativamente la salida de sustancias fluorescentes de los vasos de la retina (Figura 4).
5-3 Efecto inhibidor contra la formación de capilares acelulares
Uno de los síntomas iniciales de la retinopatía diabética es la formación de capilares acelulares, que matan los núcleos de los pericitos para causar retinopatía. Al respecto, se confirmó un efecto inhibidor de la formación de capilares acelulares tras la administración de CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y de CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) preparado en los Ejemplos 1 y 2.
Específicamente, se enuclearon globos oculares de ratones de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 5­ 2, y se enuclearon las retinas de los globos oculares y se lavaron con agua corriente. Posteriormente, se colocaron en tripsina al 3 % y se cultivaron a 37 °C durante una hora. Las retinas digeridas se transfirieron a PBS y se eliminó la membrana interna (membrana del orgánulo presente en las células). El marco vascular se separó del fondo de la retina mediante el uso de una varilla de vidrio, se colocó en un portaobjetos y se secó. El marco vascular seco se tiñó luego con PAS y hematoxilina, y se confirmaron las variaciones en las paredes celulares y los núcleos.
Como resultado, como se muestra en la Figura 5, se confirmó que aunque no se observó la formación de capilares acelulares en el grupo normal (NOR), el número de capilares acelulares aumentó significativamente en el grupo diabético (DM). Además, también se confirmó que no se evitó la formación de capilares acelulares en el grupo al que se administró fenofibrato (FENO). Sin embargo, CMO4-1-100 y CMO4-1-250, que son los extractos en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1-100, que es el extracto en agua caliente de la ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para uso de acuerdo con la presente invención, previno significativamente la formación de capilares acelulares (Figura 5).
5-4 Efecto inhibidor contra el daño de la proteína de unión estrecha entre células
Se confirmó un efecto inhibidor contra el daño a la ocludina, una proteína de la unión estrecha entre células, después de administrar CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), que se prepararon en los Ejemplos 1 y 2.
Específicamente, los globos oculares en ratones se enuclearon de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 5-2 y se fijaron en formalina neutralizada al 10 % durante la noche. Además, el resultante se deshidrató y se sustituyó tres veces con xileno, y se incluyó en parafina. Se prepararon bloques del tejido incluido como cortes seriados con un grosor de 4 pm y se colocaron en portaobjetos para su uso. Con el fin de eliminar una actividad peroxidasa endógena, se dejó reaccionar un portaobjetos que se sometió a procesos de desparafinización y función con una solución de peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos, y luego se lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Con el fin de eliminar las reacciones inespecíficas, se usó caseína al 5 % para bloquear y luego se diluyeron los anticuerpos primarios en una relación de 1:200, respectivamente. Posteriormente, los anticuerpos primarios diluidos se trataron durante una hora o durante toda la noche. Después de lavar con PBS durante una hora, se aplicó un kit marcado con estreptoavidina biotina (LSAB) (Dako, EE. u U . ) a los resultantes, se reveló con DAB y luego se observó mediante el uso de un microscopio óptico. En el caso de la tinción fluorescente, los anticuerpos secundarios conjugados con FITC se diluyeron en una relación de 1:200, respectivamente, y se hicieron reaccionar durante una hora. Posteriormente, los resultantes se tiñeron con DAPI y se observaron mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.
Como resultado, como se muestra en la Figura 6, aunque se confirmó que las líneas de conexión como los hilos de ocludina se rompieron en el grupo de diabéticos (DM), no hubo pérdida de ocludina en el grupo administrado de fenofibrato (FENO) y el grupos administrados con un extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), que son CMO4-1-100 y CMO4-1-250 (Figura 6).
Ejemplo Experimental 6: Efecto terapéutico de las complicaciones diabéticas en modelo animal
Con el fin de confirmar el efecto terapéutico de la coadministración de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) y metformina, se administró metformina a un modelo de diabetes tipo 2, ratones db/db, durante 12 semanas para regular el nivel de glucosa en sangre. Posteriormente, CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) se coadministraron con metformina durante 12 semanas adicionales para confirmar el efecto terapéutico de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) sobre la retinopatía y la nefropatía diabética. El fenofibrato, un fármaco aprobado en Australia para el tratamiento de la retinopatía diabética, se usó como grupo de control positivo.
6-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
Los ratones machos db/db de 7 semanas, un modelo animal de diabetes tipo 2 en el cual la diabetes se desarrolló debido a una mutación en un receptor de leptina, se dividieron en ocho grupos al proporcionar 10 ratones en cada grupo de la siguiente manera:
(1) grupo de animales normales (ratones db/+ heterocigotos no diabéticos, NOR); (2) Grupo de animales diabéticos (ratones diabéticos C57BL/KsJ-Leprdb/db, DM); (3) MET (grupo al que se le administró metformina 350 mg/kg/día); (4) MET+FENO (grupo al que se le administró metformina y fenofibrato 100 mg/kg/día); (5) MET+CMO4-100 (grupo al que se le administró metformina y CMO4 100 mg/kg/día); (6) MET+CMO4-250 (grupo al que se le administró metformina y CMO4250 mg/kg/día); (7) MET+CPA4-100 (grupo al que se le administró metformina y CPA4100 mg/kg/día); y (8) MET+CPA4-250 (grupo al que se le administró metformina y CPA4250 mg/kg/día).
En los grupos (3) a (8), se administró metformina (350 mg/kg) durante 12 semanas con el fin de reducir el nivel de glucosa en sangre a un cierto nivel. La metformina y los extractos se suspendieron en metilcelulosa al 0,5 % y se administraron por vía oral una vez al día durante 12 semanas. La misma cantidad de sólo 0,5 % de solución de metilcelulosa, una solución vehículo, se administró por vía oral en los grupos experimentales (1) y (2). Después de administrar metformina durante 12 semanas, se añadió diariamente a la metformina una determinada cantidad de extractos correspondientes a cada grupo para su coadministración. Se midieron el peso corporal y la ingesta de alimento y agua durante el período de administración del fármaco, y se midieron los niveles de glucosa en sangre a intervalos de cuatro semanas.
6-2 Efecto inhibidor contra el daño a la barrera hemato-retiniana
Si la hiperglucemia persiste, la barrera hemato-retiniana se dañará debido a la disfunción de los vasos sanguíneos de la retina en el globo ocular. Con respecto a esto, después de administrar CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), se confirmó un efecto de inhibición del daño a la barrera hemato-retiniana.
Específicamente, los ratones del grupo experimental diseñado como en el Ejemplo Experimental 6-1 se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (25 mg/kg) y se abrió la cavidad peritoneal y la cavidad torácica para sujetar el corazón. Además, en el ventrículo izquierdo se inyectó 50 mg/mL de fluoresceína-dextrano (peso molecular 2*106) que se preparó al disolver en PBS esterilizado (1 mL). Después de 10 minutos, se enuclearon los globos oculares y se colocó el globo ocular izquierdo en una copa ocular. La retina separada se colocó en un portaobjetos y luego se montó mediante el uso de un medio de montaje acuoso. Después de que se secó lo suficiente, se usó un microscopio de fluorescencia para observarla. Los resultados se confirmaron a las 12, 18 y 24 semanas de inducir diabetes, respectivamente.
Como resultado, como se muestra en la Figura 7, se confirmó que aunque no se observó flujo de salida de fluorescencia hasta las 24 semanas en el grupo normal (NOR), el grupo diabético (DM) exhibió un fenómeno en el cual sustancias fluorescentes se escaparon de los vasos sanguíneos debido al daño a la barrera hemato-retiniana, y que se confirmó en la mayoría de los sujetos a las 12, 18 y 24 semanas. Además, en MET, el grupo al que se administró metformina, que es el grupo de control positivo, el escape de las sustancias fluorescentes se redujo significativamente a las 18 semanas en comparación con el grupo de diabéticos (DM), pero no se evitó el escape de las sustancias fluorescentes a las 24 semanas. En MET+FENo , el grupo al que se le administró metformina y fenofibrato, se evitó el escape de las sustancias fluorescentes a las 18 semanas, pero no hubo efecto de prevenir el escape de las sustancias fluorescentes a las 24 semanas. Además, cuando CMO4-100 y CMO4-250 (grupos a los que se administró ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-100 y CPA4-250 (grupos a los que se administró ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) para su uso de acuerdo con la presente invención se le coadministró metformina, respectivamente, se confirmó que estos grupos tienen el efecto terapéutico al prevenir significativamente el escape de las sustancias fluorescentes de los vasos sanguíneos de la retina a las 18 y 24 semanas (Figura 7).
Con base en los resultados anteriores, se confirmó que la metformina puede prevenir el daño a los vasos sanguíneos de la retina durante un cierto período de tiempo, pero la metformina tiene la limitación de que, en última instancia, no se previene el daño a los vasos sanguíneos de la retina.
6-3 Efecto inhibidor contra la formación de capilares acelulares
Uno de los síntomas iniciales de la retinopatía diabética es la formación de capilares acelulares, que matan los núcleos de los pericitos para causar retinopatía. Con respecto a esto, el efecto inhibidor frente a la formación de capilares acelulares se confirmó tras la administración de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) preparados en los Ejemplos 1 y 2.
Específicamente, se enuclearon globos oculares de ratones de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 6­ 2, y se enuclearon retinas de los globos oculares y se lavaron con agua corriente. Posteriormente, se colocaron en tripsina al 3 % y se cultivaron a 37 °C durante una hora. Las retinas digeridas se transfirieron a PBS y se eliminó la membrana interna (membrana del orgánulo presente en las células). El marco vascular se separó del fondo de la retina mediante el uso de una varilla de vidrio, se colocó en un portaobjetos y se secó. El marco vascular seco se tiñó luego con PAS y hematoxilina, y se confirmaron las variaciones en las paredes celulares y los núcleos.
Como resultado, como se muestra en la Figura 8, cuando se analizó el número de capilares acelulares en cada grupo, el número de capilares acelulares se multiplicó por 5 en el grupo de diabéticos (DM), mientras que en el grupo que recibió metformina (MET) y el grupo (m Et+f En O) al que se le coadministró metformina y fenofibrato no pudieron prevenir la proliferación de los capilares acelulares. Sin embargo, se confirmó que cuando CMO4-100 y CMO4-250, que son los grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), para su uso según la presente invención se coadministraron con metformina, respectivamente, estos grupos para uso de la presente invención inhibieron significativamente la formación de los capilares acelulares (Figura 8).
6-4 Efecto inhibidor contra el daño de la proteína de unión estrecha entre células
Se confirmó un efecto inhibidor contra el daño a una proteína de unión estrecha entre células después de administrar CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) que se prepararon en los Ejemplos 1 y 2.
Específicamente, los globos oculares de ratones se enuclearon de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 6-2 y se fijaron en formalina neutralizada al 10 % durante toda la noche. Además, el resultante se deshidrató y se sustituyó tres veces con xileno, y se incluyó en parafina. Se prepararon bloques del tejido incluido como cortes seriados con un grosor de 4 pm y se colocaron en portaobjetos para su uso. Con el fin de eliminar una actividad peroxidasa endógena, se dejó reaccionar un portaobjetos que se sometió a procesos de desparafinización y función con una solución de peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos, y luego se lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Con el fin de eliminar las reacciones inespecíficas, se usó caseína al 5 % para bloquear y luego se diluyeron los anticuerpos primarios en una relación de 1:200, respectivamente. Posteriormente, los anticuerpos primarios diluidos se trataron durante una hora o durante toda la noche. Después de lavar con PBS durante una hora, se aplicó un kit marcado con estreptoavidina biotina (LSAB) (Dako, EE. u U.) a los resultantes, se reveló con DAB y luego se observó mediante el uso de un microscopio óptico. En el caso de la tinción fluorescente, los anticuerpos secundarios conjugados con FITC se diluyeron en una relación de 1:200, respectivamente, y se hicieron reaccionar durante una hora. Posteriormente, los resultantes se tiñeron con DAPI y se observaron mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.
Como resultado, como se muestra en las Figuras 9a y 9b, se confirmó que las líneas de conexión como los hilos de claudina-5 se rompieron en varias regiones de los vasos sanguíneos en el grupo diabético (DM), el grupo al que se le administró metformina (MET) o el grupo (MET FENO) al que se coadministró metformina y fenofibrato. Sin embargo, cuando CMO4-100 y CMO4-250, que son los grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-100 y CPA4-250, que son los grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y la raíz de peonía (1:8), para uso de acuerdo con la presente invención, se coadministraron con metformina, respectivamente, no hubo pérdida de claudina-5 en estos grupos (Figura 9a). Además, la cantidad de ocludina se redujo significativamente en el grupo de diabéticos (DM), y no hubo un aumento significativo de la misma en el grupo al que se administró metformina (MET) y en el grupo (MET+FENO) al que se le coadministró metformina y fenofibrato. Sin embargo, se confirmó que cuando CMO4-250, el grupo al que se le administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8) y CPA4-250, el grupo al que se le administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para su uso de acuerdo con la presente invención se coadministraron con metformina, respectivamente, estos grupos aumentaron significativamente la cantidad de ocludina (Figura 9b).
6-5 Efecto sobre la función renal y la proteinuria
Con el fin de confirmar un efecto de prevención y tratamiento de la degradación de la función renal causada por la hiperglucemia, se confirmaron la diuresis de 24 horas, la proteinuria, la albuminuria y el aclaramiento de creatinina, y las cantidades de nefrina, 8-OHd y AGE en orina.
Como resultado, como se muestra en la Figura 10, las cantidades de nefrina, 8-OHd y AGE en la orina de todos los grupos mostraron un efecto significativo, pero las cantidades de orina y albuminuria y el aclaramiento de creatinina no se inhibieron en el grupo al que se administró solo metformina. Además, se confirmó cuando CMO4-100 y CMO4-250, que son los grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-100 y CPA4-250, que son los grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para su uso de acuerdo con la presente invención se coadministraron con metformina, respectivamente, estos grupos inhibieron significativamente la albuminuria y el aclaramiento de creatinina. Sin embargo, el efecto sobre el aclaramiento de creatinina no se mostró en MET+fEnO, el grupo al que se le coadministró metformina y fenofibrato (Figura 10).
Con base en los resultados anteriores, se confirmó que no es posible inhibir la progresión a nefropatía diabética al administrar únicamente metformina. Sin embargo, cuando el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, o el extracto de ramita de canela y raíz de peonía se coadministraron con metformina, puede tratar significativamente la progresión a la nefropatía diabética.
6- 6 Cambio de glomeruloesclerosis
Síntomas de glomeruloesclerosis, es decir, expansiones de la matriz mesangial y extracelular, fueron confirmadas por tinción PAS y tinción tricrómica.
Como resultado, como se muestra en la Figura 11, en el grupo de diabéticos se observó un síntoma de glomeruloesclerosis, es decir, regiones mesangiales agrandadas y expandidas debido a la producción y acumulación de sustancias de la matriz extracelular en un glomérulo. Además, se confirmó que cuando CMO4-100 y CMO4-250, que son los grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-100 y CPA4-250, que son los grupos a los que se administró el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para su uso de acuerdo con la presente invención se coadministraron con metformina, respectivamente, estos grupos inhibieron significativamente las expansiones de la matriz mesangial y extracelular (Figura 11).
Ejemplo Experimental 7: Efecto terapéutico sobre la degeneración macular en modelo animal de roedor
7- 1 Efecto de la prevención y el tratamiento de la degeneración macular en un modelo animal inducido por MNU con degeneración macular relacionada con la edad
7-1-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
Se usaron ratones machos C57BL/6 de 6 semanas de edad después de su purificación durante una semana. Entre los cambios morfológicos de los tejidos de la retina que aparecieron en la degeneración macular, se inyectaron por vía intraperitoneal 60 mg/kg de N-metil-N-nitrosourea al 1 % (ácido acético al 0,05 %) (MNU, Sigma, EE. UU.) a ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad con el fin de inducir daño y desnaturalización de células fotorreceptoras. Se administró por vía intraperitoneal la misma cantidad de ácido acético al 0,05 % al grupo normal. CMO4 y CMO4-1, que son los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1, que es el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), de acuerdo con la presente invención se suspendieron y se prepararon en carboximetilcelulosa sódica (CMC) al 0,5 %, y se administró por vía oral una vez a una concentración exclusiva de 50 mg/kg y 100 mg/kg, o 100 mg/kg antes del día de administración de MNU. Posteriormente, los resultantes se administraron por vía oral una vez al día durante siete días después de la administración de MNU. En el grupo normal y en el grupo inducido por MNU, sólo se administró CMC al 0,5 % por vía oral en la misma cantidad.
7-1-2 Evaluación histopatológica
Entre los cambios morfológicos de los tejidos de la retina que aparecieron en la degeneración macular, el daño y la desnaturalización de las células fotorreceptoras se confirmaron por el cambio en el grosor de las capas nucleares externas de los tejidos de la retina.
Específicamente, mediante el uso de los ratones preparados en el Ejemplo Experimental 7-1-1, se enuclearon los globos oculares de los ratones de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 6-2 y se fijaron en formalina neutralizada al 10 % durante toda la noche. Además, el resultante se deshidrató y se sustituyó tres veces con xileno, y se incluyó en parafina. Se prepararon bloques del tejido incluido como cortes seriados con un grosor de 4 pm y se colocaron en portaobjetos para su uso. Con el fin de eliminar una actividad peroxidasa endógena, se dejó reaccionar un portaobjetos que se sometió a procesos de desparafinización y función con una solución de peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos, y luego se lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Los cortes en los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se observaron con un microscopio óptico. Como resultado, como se muestra en la Figura 12, se confirmó que el grosor de las capas nucleares externas (*), en las cuales los núcleos de las células fotorreceptoras se formaron densamente en la retina, se volvió delgado porque el número de células disminuyó debido a el daño causado por la administración del MNU. Sin embargo, en los grupos a los que se administró CMO4 y CMO4-1 (extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)), y CPA4-1 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), el daño a las células fotorreceptoras causado por MNU se inhibió significativamente (Figura 12).
7-2 Efecto de la prevención del daño a las células epiteliales pigmentarias de la retina en el modelo animal inducido por NaIO3
7-2-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
Se usaron ratas SD machos de 6 semanas de edad después de su purificación durante una semana. 35 mg/kg de NaObal 3,5 % (Sigma, EE. UU.) se inyectó por vía intravenosa debajo de la lengua de las ratas de 7 semanas de edad con el fin de inducir daño y desnaturalización de las células epiteliales pigmentarias de la retina, que es uno de los cambios que aparecen en la degeneración macular. Se administró la misma cantidad de solución salina al grupo normal. CMO4-1, que es el extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1, que es el extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para uso de acuerdo con la presente invención, se suspendió y se preparó en carboximetilcelulosa sódica (CMC) al 0,5 %, y se administró por vía oral una vez a una concentración de 50 mg/kg y 100 mg/kg antes del día de la administración de NaOb. Posteriormente, los resultantes se administraron por vía oral una vez al día durante siete días después de la administración de NaOI3. En los grupos normal y de control, sólo se administró CMC al 0,5 % por vía oral en la misma cantidad.
7-2-2 Evaluación histopatológica
El daño y la desnaturalización de las células epiteliales pigmentarias de la retina, que fueron de los cambios que aparecieron en la degeneración macular, fueron confirmados por el número de pliegues de las capas nucleares externas en los tejidos de la retina.
Específicamente, mediante el uso de los ratones preparados en el Ejemplo Experimental 7-2-1, los globos oculares de los ratones se enuclearon de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 6-2 y se fijaron en formalina neutralizada al 10 % durante toda la noche. Además, el resultante se deshidrató y se sustituyó tres veces con xileno, y se incluyó en parafina. Se prepararon bloques del tejido incluido como cortes seriados con un grosor de 4 pm y se colocaron en portaobjetos para su uso. Con el fin de eliminar una actividad peroxidasa endógena, se dejó reaccionar un portaobjetos que se sometió a procesos de desparafinización y función con una solución de peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos, y luego se lavó tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Los cortes en los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se observaron con un microscopio óptico. Como resultado, como se muestra en la Figura 13, se observó a simple vista un fenómeno en el cual una capa nuclear externa, en la que los núcleos de las células fotorreceptoras ubicadas justo encima de las células epiteliales eran densos se dobló debido al daño de las células epiteliales pigmentadas por la administración de NaOI3. Sin embargo, en los grupos a los que se administró CMO4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4-1 (extracto en agua caliente de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)), se confirmó que el daño a las células epiteliales pigmentadas inducido por NaOI3 se suprimió con el fin de inhibir significativamente el fenómeno en el cual se dobla una capa nuclear exterior (Figura 13).
7-3 Efecto de la prevención de la degeneración macular en ratones con desactivación génica para el receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR)
7-3-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
En el laboratorio Jacson se adquirió una pareja de ratones Vidir1- macho y hembra, que son un modelo animal que tiene neovascularización subretiniana, un síntoma clínico de degeneración macular húmeda, expresado a partir de las 3 semanas de edad. Además, se obtuvieron ratones de 2 semanas de edad a través de la reproducción de los ratones anteriores y luego se usaron para el experimento. Para el animal normal, se utilizaron ratones C57BL/6 que tenían la misma edad en semanas. CMO4, que es el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4, que es el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para su uso de acuerdo con la presente invención se suspendieron y se prepararon en 0,5 % de CMC y luego se administró por vía intraperitoneal una vez al día durante siete días a una concentración de 100 mg/kg. En los grupos normal y de control, sólo se administró CMC al 0,5 % por vía oral en la misma cantidad.
7-3-2 Inhibición de la neovascularización subretiniana
Se midió el edema de los vasos sanguíneos de la retina para confirmar un efecto inhibidor contra la neovascularización subretiniana.
Específicamente, mediante el uso del modelo animal del Ejemplo Experimental 7-3-1, se mezclaron Zoletil 50 (Virbac, 30 mg/kg) y Rompun (Bayer Korea, 10 mg/kg) en una relación de 3:2 durante una autopsia y se diluyeron 10 veces para hacer solución salina, y luego la solución salina (50 pl) se inyectó por vía intraperitoneal para la anestesia. Después de la laparotomía, se disolvieron 5 mg de isotiocianato de fluoresceína-dextrano (FD40S-1G, Sigma) en PBS y se inyectó la mezcla de los mismos (100 pl) en el corazón. Después de cinco minutos, se enuclearon los globos oculares y se fijó un globo ocular en formalina neutralizada al 10 % para la preparación de cortes de tejido retiniano mientras que el otro globo ocular se fijó en paraformaldehído al 4 % durante 10 minutos. A continuación, se separaron las retinas de las mismas, se prepararon portaobjetos de montaje plano con las retinas y los portaobjetos se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (BX51, Olympus, Japón).
Como resultado, como se muestra en la Figura 14, se formaron neovasos en un área subretiniana debajo de una capa nuclear externa de modo que los tejidos de la retina se curvaron hacia arriba; este fenómeno se observó en los ratones Vidir/-. Sin embargo, se confirmó que dicha neovascularización se inhibía significativamente mediante la administración de CMO4 el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), para el uso de la presente invención (Figura 14).
7-3-3 Inhibición contra el daño a las células epiteliales pigmentarias de la retina
Se llevó a cabo una tinción con ZO-1 para confirmar la presencia o ausencia de desnaturalización de las estructuras morfológicas de las células epiteliales pigmentarias de la retina.
Específicamente, mediante el uso del modelo animal del Ejemplo Experimental 7-3-1, después de separar las retinas de los tejidos oculares extraídos en la autopsia, el tejido conjuntival se fijó en paraformaldehído al 4 % durante tres horas, se lavó con PBS y se agitó en PBS que contenía Triton al 5 %. X-100 y BSA al 1 % durante tres horas. Después de lavar de nuevo el resultante, se diluyó lectina (L2140, Sigma) en PBS a 1 mg/mL en una relación de 1:50 y se hizo reaccionar a 4 °C durante toda la noche. Después de lavar el resultante durante dos horas con PBS que contenía 0,05 % de Tween 20, se diluyó estreptavidina TRITC en una relación de 1:500, se hizo reaccionar a 37 °C durante cuatro horas, se lavó con PBS durante 30 minutos y se observó mediante el uso de un microscopio de fluorescencia (BX51, Olympus, Japón).
Como resultado, como se muestra en la Figura 15, las células epiteliales pigmentarias de la retina de los ratones normales se tiñeron con ZO-1 de modo que se observó una forma alineada de las mismas. Mientras tanto, en los ratones Vidir/- se observaron sitios (flechas) donde las células estaban dañadas y crecieron neovasos para desnaturalizarse. Sin embargo, se confirmó que la desnaturalización de las células epiteliales pigmentarias de la retina se inhibió significativamente mediante la administración de CMO4 para el uso de la presente invención, el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8) (Figura 15).
7-3-4 Efecto inhibidor contra la expresión de VEGF en retina
Se confirmó mediante tinción un efecto inhibidor contra la expresión de VEGF en las retinas.
Específicamente, se prepararon cortes de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 7-2-2 mediante el uso del modelo animal del Ejemplo Experimental 7-3-1. Los cortes en los portaobjetos se tiñeron con H&E y se analizaron cuantitativamente las lesiones neovasculares en un área subretiniana bajo un microscopio óptico.
Como resultado, como se muestra en la Figura 16, se confirmó que el VEGF, un factor importante involucrado en la permeabilidad de los neovasos y vasos sanguíneos, se expresó excesivamente (teñido de púrpura oscuro) en los ratones Vidir/-, mientras que la expresión de VEGF se inhibió significativamente por la administración de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) y CPA4 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) (Figura 16).
7-4 Efecto del tratamiento de la degeneración macular en ratones con desactivación génica para el receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR)
7-4-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
En el laboratorio Jacson se adquirió una pareja de ratones Vidir/- macho y hembra, un modelo animal que tiene neovascularización subretiniana, un síntoma clínico de degeneración macular húmeda, expresado a partir de las 3 semanas de edad. Además, se obtuvieron ratones de 2 semanas de edad a través de la reproducción de los ratones anteriores y luego se usaron para el experimento. Para el animal normal, se usaron ratones C57BL/6 que tenían la misma semana de edad. CMO4, que es el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4, que es el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para su uso de acuerdo con la presente invención se suspendieron y se prepararon en 0,5 % de CMC, y luego se administraron por vía intraperitoneal una vez al día durante siete días a una concentración de 50 mg/kg y 100 mg/kg a partir de las 3 semanas de edad, respectivamente. En los grupos normal y de control, sólo se administró CMC al 0,5 % por vía oral en la misma cantidad.
7-4-2 Inhibición de la neovascularización subretiniana
El efecto inhibidor de la neovascularización subretiniana aparecido en la degeneración macular se confirmó mediante el uso de cortes de tejido retiniano.
Específicamente, mediante el uso del modelo animal del Ejemplo Experimental 7-4-1, los cortes de tejido de la retina se observaron de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 7-3-2 bajo un microscopio de fluorescencia (BX51, Olympus, Japón).
Como resultado, como se muestra en la Figura 17, se formaron neovasos en un área subretiniana debajo de una capa nuclear externa de modo que los tejidos de la retina se curvaron hacia arriba; este fenómeno se observó en ratones Vidir/-. Sin embargo, se confirmó que dicha neovascularización se inhibía significativamente mediante la administración de CMO4 (100 mg/kg) para el uso de la presente invención, el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8) (Figura 17).
7-5 Efecto inhibidor contra la neovascularización en membrana coroidea neovascular inducida por láser en modelo de rata
7-5-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
Se anestesiaron ratas macho Long-Evans de 7 semanas (SLC Japón, Tokio, Japón) mediante inyección por vía intraperitoneal Zoletil 50 (Virbac, 30 mg/kg) y Rompun (Bayer Corea, 10 mg/kg). Posteriormente, se usaron gotas oftálmicas de tropicamida al 1 % para dilatar las pupilas, y luego se formaron cuatro puntos de fotocoagulación alrededor de la cabeza del nervio óptico mediante el uso de un láser de diodo (longitud de onda: 532 nm, diámetro: 100 pm, potencia: 150 mW, duración: 0,1 s). La destrucción de la membrana de Bruch se verificó mediante la formación de burbujas distintivas. Las ratas despertadas de la anestesia se dividieron aleatoriamente en grupos y se les administraron fármacos. Se suspendieron CMO4, el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4, el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), para su uso según la presente invención y se prepararon en 0,5 % de CMC, y luego cada extracto se administró por vía oral una vez al día durante 10 días a una concentración de 100 mg/kg. En el grupo normal, sólo se administró por vía oral CMC al 0,5 % en la misma cantidad.
7-5-2 Inhibición de la neovascularización subretiniana
Se confirmó un efecto inhibidor de la neovascularización subretiniana que apareció en la degeneración macular mediante el uso de cortes de tejido retiniano.
Específicamente, mediante el uso del modelo animal del Ejemplo Experimental 7-5-1, después de 10 días, las ratas se anestesiaron con inyección intraperitoneal de una solución mixta de Zoletil 50 (Virbac, 30 mg/kg) y Rompun (Bayer Korea, 10 mg/kg) en una relación de 3:2 en una autopsia. Después de la laparotomía, se inyectó en el corazón una mezcla (100 pl) de 5 mg de isotiocianato-dextrano de fluoresceína (PM 2*106, Sigma) disuelta en PBS. Después de 10 minutos, los globos oculares se enuclearon y se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 10 minutos. A continuación, se separaron las retinas de las mismas y se prepararon tejidos conjuntivales que contenían el área subretiniana para montar como cortes planos. Los cortes de montaje plano se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (BX51, Olympus, Japón). Se analizó un tamaño de regiones producidas por neovasos mediante el uso del software Image J (NIH, EE. UU.).
Como resultado, como se muestra en la Figura 18, se confirmó que la neovascularización fue inhibida significativamente por la administración de CMO4 (100 mg/kg) para el uso de la presente invención, el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8). Además, la neovascularización tendió a inhibirse mediante la administración de CPA4 (100 mg/kg) para el uso de la presente invención, el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8) (Figura 18).
Ejemplo Experimental 8: Efecto de la prevención y el tratamiento de la degeneración macular en un modelo animal de roedor con degeneración macular inducida por MNU
Como se muestra en los resultados del análisis de la Tabla 1, se confirmó que el contenido de peoniflorina en los extractos de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8) (CMO4 y CMO4-1), y los extractos de ramita de canela y raíz de peonía (1:8) ( C p A 4 y CPA4-1) fue de 2,7 %, 2,3 %, 12,3 % y 8,9 %, respectivamente. Se informó que dado que la peoniflorina tiene un efecto inhibidor sobre la apoptosis causada por H2O2 en una línea de células epiteliales pigmentarias de la retina humana (ARPE-19), la peoniflorina puede usarse eficazmente para tratar una enfermedad oftalmológica, por ejemplo, la degeneración macular (Molecular Visión 2011; 17: 3512-3522). Sin embargo, en el modelo animal, no se demostraron efectos preventivos ni terapéuticos sobre la degeneración macular, sino que simplemente se confirmó un efecto antioxidante e inhibición de la apoptosis después de agregar H2O2 , una sustancia tóxica que es diferente de una condición de envejecimiento, y una causa general de degeneración macular en las líneas celulares del epitelio pigmentario de la retina. Es decir, el efecto de peoniflorina sobre la degeneración macular no se demostró en un modelo animal. En consecuencia, para demostrar que aunque los extractos de la presente invención contienen peoniflorina, los efectos de los extractos no fueron simplemente los efectos únicos de peoniflorina, los efectos de peoniflorina contenida en cada extracto (100 mg) se confirmaron en un modelo animal.
8-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
Se usaron ratones machos C57BL/6 de 6 semanas de edad después de su purificación durante una semana. Con el fin de inducir daño y desnaturalización de las células fotorreceptoras, entre los cambios morfológicos de los tejidos retinianos que aparecieron en la degeneración macular, se inyectó por vía intraperitoneal N-metil-N-nitrosourea (MNU, Sigma, e E.UU.) al 1 % (ácido acético al 0.05 %) a ratones macho C57BL/6 de 7 semanas de edad a una concentración de 60 mg/kg. Se administró por vía intraperitoneal la misma cantidad de ácido acético al 0,05 % al grupo normal. Como las muestras, CMO4 (100 mg/kg), que es el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4 (100 mg/kg), que es el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), peoniflorina -2,7 (2,7 mg/kg) y peoniflorina -12,3 (12,3 mg/kg) se suspendieron y se prepararon en CMC al 0,5 % y se administraron por vía oral una vez antes del día de administración de MNU. Después de la administración de MNU, estos resultantes se administraron por vía oral una vez al día durante siete días, respectivamente. En los grupos normales y en los inducidos por MNU, se administró por vía oral la misma cantidad de CMC al 0,5 %.
8-2 Cambio en el grosor de las capas nucleares externas en los tejidos nerviosos de la retina
Se confirmó el cambio en el grosor de las capas nucleares externas causado por el daño a las células fotorreceptoras en los tejidos nerviosos de la retina.
Específicamente, a los grupos experimentales en los que las muestras se trataron de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 8-1 se les realizó una autopsia después de la administración, y se enuclearon los globos oculares. A continuación, los globos oculares enucleados se fijaron en formalina neutralizada al 10 % durante un día y se incluyeron en parafina para preparar cortes en portaobjetos. Los cortes en los portaobjetos se tiñeron con H&E y se observaron con un microscopio óptico.
Como resultado, como se muestra en la Tabla 4, el grupo al que se le administró CMO4, que es el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), demostró tener efectos 50 % más altos que el grupo al que se administró MNU (1,23±0,20AU ^ 1,61±0,32Au ). Sin embargo, se confirmó que el grupo (PF-2,7) al que se le administró peoniflorina contenida en CMO4 (100 mg) no tuvo ningún efecto en comparación con el grupo al que se administró MNU (1,23±0,20AU^1,23±0,21AU) (Tabla 4).
Adicionalmente, como se muestra en la Tabla 5, el grado de daño a las capas nucleares externas en las que los núcleos de las células fotorreceptoras son densos en las retinas se deterioró aproximadamente en un 50 % o más en el grupo al que se administró MNU (1,99±0,21AU^0,92±0,17AU). Sin embargo, se confirmó que el efecto mejoró en un 21,4 % en el grupo al que se le administró CPA4, que es el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), en comparación con el grupo al que se le administró MNU (0,92±0,17AU^1,14±0,21AU). Además, también se confirmó que el efecto mejoró en un 17,5 % en el grupo (PF-12,4) al que se le administró peoniflorina contenida en CPA4 (100 mg) (0,92±0,i 7a U ^ 1,11±0,19AU), y que el al que se le administró CPA4 mejoró el efecto en un 4 % en comparación con el grupo (PF-12,4) al que se le administró peoniflorina (12,4 mg/kg) (Tabla 5).
[Tabla 4]
Figure imgf000030_0002
[Tabla 5]
Figure imgf000030_0001
Con base en los resultados anteriores, se confirmó que el efecto (2.7 %) de CMO4 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)) que tiene un contenido muy bajo de peoniflorina es notablemente superior no solo porque el efecto del extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía no es meramente causado por peoniflorina, sino porque el efecto del mismo fue, de hecho, un efecto sinérgico de numerosos ingredientes presentes en el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía. Además, en base a los resultados del extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, también se confirmó que el efecto del extracto de ramita de canela y raíz de peonía no fue causado por peoniflorina, sino que el efecto del mismo fue un efecto sinérgico de numerosos ingredientes presentes en el extracto de ramita de canela y raíz de peonía.
Adicionalmente, el efecto superior se confirmó en CMO4 o CMO4-1, que es el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía que tiene un contenido menor de peoniflorina en comparación con CPA4 o CPA4-1, que es el extracto de ramita de canela y raíz de peonía; tal efecto superior del mismo ya se confirmó en los Ejemplos Experimentales previos (Figuras 13 a 18). Estos resultados demostraron que el efecto de los extractos mixtos para uso de la presente invención no fue causado por peoniflorina, sino que fue un efecto sinérgico de numerosos ingredientes presentes en los extractos mixtos.
Ejemplo experimental 9: Efecto de inhibir y tratar el edema de las extremidades inferiores
9-1 Cría de animales experimentales y diseño experimental
Se adquirieron ratas SD machos de 6 semanas de edad de Orientbio Inc. (Seongnam, Corea) y se usaron después de su purificación durante una semana. Después de la purificación, los animales se agruparon aleatoriamente como sigue:
Normal: Grupo de control normal; Edema: Grupo de edema inducido de extremidades inferiores; CMO4-1-50: Grupo de edema inducido de extremidades inferiores grupo al que se le administró CMO4-1 (50 mg/kg/día); CMO4-1-100: Grupo de edema inducido de extremidades inferiores grupo al que se le administró CMO4-1 (100 mg/kg/día); CPA4-1-50: Grupo de edema inducido de extremidades inferiores grupo al que se le administró CPA4-1 (50 mg/kg/día); y CPA4-1-100: Grupo de edema inducido de extremidades inferiores grupo al que se le administró CPA4-1 (100 mg/kg/día).
A cada grupo se le administró por vía oral una vez al día desde tres días antes de la aparición del edema de las extremidades inferiores, se trató previamente durante cuatro días y luego se indujo el edema de las extremidades inferiores por la tarde. CMO4-1, que es el extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8), y CPA4-1, que es el extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8), se prepararon al suspenderlo en 0,5 % CMC. Además, en el grupo normal y en el grupo de edema inducido de las extremidades inferiores, solo se administró por vía oral la misma cantidad de CMC al 0,5 %. El edema de la extremidad inferior se indujo mediante la administración de solución salina que contenía formalina al 2,5 % (0,1 mL) en la pata trasera derecha de las ratas, y sólo se inyectó la misma cantidad de solución salina en el grupo normal.
9-2 Cambio en el estado del edema de las extremidades inferiores
Se confirmó un estado de edema antes y después de la inducción del edema de las extremidades inferiores.
Específicamente, con el grupo experimental del Ejemplo Experimental 9-1, se midió el aumento en el volumen de la pata antes de la administración de formalina y una hora después de la administración de la misma mediante el uso de un fetismómetro, un instrumento de medición de edemas (Ugo Basile, Milán, Italia). El índice de edema se calculó por la siguiente Ecuación 3.
[Ecuación 3]
Tamaño del pie por hora - tamaño del pie a la hora 0
Indice de
edema (%) -------------- T--a-m--a-ñ-o--- d-e-l-- p-ie-- a-- l-a-- h-o--ra-- 0------------------ X 100
Como se muestra en la Figura 19, como resultado de confirmar el estado de edema antes de la inducción del edema y una hora después del inicio del edema, hubo un pequeño aumento en el tamaño del edema cuando se inyectó solución salina esterilizada al grupo normal, pero se produjo un ligero aumento. Además, se confirmó que el tamaño aumentó significativamente en aproximadamente un 20 % en el grupo de edema inducido de las extremidades inferiores en el que se administró formalina, pero el cambio en el tamaño causado por el edema de las extremidades inferiores no aumentó mucho con CMO4-1 (extracto de ramita de canela y corteza de raíz de peonía (1:8)). Además, también se confirmó que el tamaño del edema de las extremidades inferiores dependía de la concentración y se inhibía significativamente cuando se administraba CPA4-1 (extracto de ramita de canela y raíz de peonía (1:8)) (Figura 19).
Con base en los resultados anteriores, se confirmó que los efectos preventivos y terapéuticos de los extractos mixtos de ramita de canela y raíz de peonía sobre el edema de las extremidades inferiores fueron notablemente excelentes.
[Aplicabilidad industrial]
La presente invención puede usarse como una composición o como un alimento funcional saludable de un extracto mixto natural para prevenir y tratar la degeneración macular.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de la degeneración macular, que contiene un ingrediente activo que consiste en un extracto de una mezcla de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, o ramita de canela y raíz de peonía.
2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde la ramita de canela y la corteza de raíz de peonía se mezclan en una relación en peso de 2:1 a 1:10, y luego se extraen con un solvente de extracción
3. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde la ramita de canela y la raíz de peonía se mezclan en una relación en peso de 2:1 a 1:10, y luego se extraen con un solvente de extracción.
4. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el extracto se extrae mediante el uso de agua, etanol, metanol o una mezcla de los mismos como solvente.
5. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el extracto se extrae mediante un método de descompresión a alta temperatura, un método de extracción con agua caliente, un método de extracción por reflujo, un método de extracción hidrotérmica, un método de extracción por maceración, un método de extracción a temperatura ambiente, un método de extracción por ultrasonido o un método de extracción con vapor.
6. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, que adicionalmente incluye aditivos farmacéuticamente aceptables tales como almidón, almidón gelatinizado, celulosa microcristalina, azúcar de leche, povidona, dióxido de silicio coloidal, hidrogenofosfato de calcio, lactosa, manitol, malta, goma arábiga, almidón pregelatinizado, almidón de maíz, celulosa en polvo, hidroxipropilcelulosa, opadry, almidón de glicolato de sodio, cera de carnauba, silicato de aluminio sintético, ácido esteárico, estearato de magnesio, estearato de aluminio, estearato de calcio, sacarosa, dextrosa, sorbitol y talco.
7. Un alimento funcional saludable para su uso en la prevención o mejoramiento de la degeneración macular, que contiene un ingrediente activo que consiste en un extracto de una mezcla de ramita de canela y corteza de raíz de peonía, o ramita de canela y raíz de peonía.
8. El alimento funcional saludable para el uso de la reivindicación 7, en donde la ramita de canela y la corteza de raíz de peonía se mezclan en una relación en peso de 2:1 a 1:10, y luego se extraen con un solvente de extracción.
9. El alimento funcional saludable para el uso de la reivindicación 7, en donde la ramita de canela y la raíz de peonía se mezclan en una relación en peso de 2:1 a 1:10, y luego se extraen con un solvente de extracción.
10. El alimento funcional saludable para el uso de la reivindicación 7, en donde el extracto se extrae mediante el uso de agua, etanol, metanol o una mezcla de los mismos como solvente.
11. El alimento funcional saludable para el uso de la reivindicación 7, en donde el extracto se extrae mediante un método de descompresión a alta temperatura, un método de extracción con agua caliente, un método de extracción por reflujo, un método de extracción hidrotérmica, un método de extracción por maceración, un método de extracción a temperatura ambiente, un método de extracción por ultrasonido o un método de extracción con vapor.
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