KR20150126026A - 효소 정지 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오티드 상에서 헬리카제가 스페이서를 지나도록 이동시키고, 헬리카제의 폴리뉴클레오티드 상에의 로딩을 제어하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 헬리카제를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 신규한 방법에 관한 것이다.

Description

효소 정지 방법 {ENZYME STALLING METHOD}
본 방법은 폴리뉴클레오티드 상에서 헬리카제가 스페이서를 지나도록 이동시키고, 헬리카제의 폴리뉴클레오티드 상에의 로딩을 제어하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 헬리카제를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 신규한 방법에 관한 것이다.
현재 다양한 적용에 걸쳐 신속하고, 저렴한 폴리뉴클레오티드 (예컨대, DNA 또는 RNA) 서열분석 및 확인 기술이 요구되고 있다. 현재 기술은 주로 다량의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 신호 검출을 위해 전문가용 형광성 화학 물질을 다량으로 필요로 하기 때문에, 속도가 느리고, 고가이다.
막횡단 포어 (나노포어)는 중합체 및 다양한 소형 분자에 대한 직접적인 전기 바이오센서로서의 큰 잠재능을 가지고 있다. 특히, 최근에는 나노포어가 잠재적인 DNA 서열분석 기술로서 주목을 받아오고 있다.
전위가 나노포어를 통해 인가되면, 분석물, 예컨대, 뉴클레오티드가 일정 기간 동안 장벽에 일시적으로 존재할 때 전류는 변화하게 된다. 뉴클레오티드의 나노포어 검출이 공지된 시그니처 및 지속 기간의 전류 변화를 일으킨다. "가닥 서열분석" 방법에서, 단일 폴리뉴클레오티드 가닥은 포어를 통해 통과되고, 뉴클레오티드의 동일성가 유도된다. 가닥 서열분석은 포어를 통과하는 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위해 뉴클레오티드 취급 단백질, 예컨대, 헬리카제를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 중 스페이서는 전형적으로 헬리카제를 정지시킬 수 있고, 즉, 헬리카제가 스페이서를 지나 폴리뉴클레오티드를 따라 추가로 이동하지 못하도록 막을 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 헬리카제 및 폴리뉴클레오티드를 막횡단 포어와 접촉시키고, 전위를 인가함으로써 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 정지된 헬리카제가 스페이서를 지나도록 이동시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 헬리카제는 전형적으로는 포어를 통과하기에는 너무 크기 때문에, 전위를 따라 포어를 통과하여 이동하는 폴리뉴클레오티드의 힘은 헬리카제가 스페이서를 지나도록 이동시킨다. 이는 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하고, 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 데, 예컨대, 서열분석하는 데 중요하게 적용된다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 하나 이상의 스페이서를 사용하여 하나 이상의 헬리카제의 폴리뉴클레오티드 상에의 로딩을 제어할 수 있는 것 또한 입증하였다.
그러므로, 본 발명은 (a) 하나 이상의 정지된 헬리카제 및 표적 폴리뉴클레오티드를 막횡단 포어와 접촉시키는 단계, 및 (b) 전위를 포어를 통해 인가하여 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 정지된 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
- (a) 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공하는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서에서 정지하도록 하는 단계; (c) 표적 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 정지된 헬리카제를 포어와 접촉시키는 단계; 및 (d) 포어를 통해 전위를 인가하여 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하도록 하고, 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 단계를 포함하는, 막횡단 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 방법;
- (a) 본 발명의 막횡단 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 방법을 수행하는 단계; 및 (b) 폴리뉴클레오티드가 포어와 관련하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 측정하여 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하고, 여기서 측정치는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법;
- (a) 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공하는 단계; 및 (b) (a)에서 제공받은 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 하나 이상의 헬리카제가 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 각 스페이서에서 정지하도록 하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 헬리카제의 표적 폴리뉴클레오티드 상에의 로딩을 제어하는 방법;
- 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위한 어댑터로서, 여기서, 어댑터는 5'→3' 방향으로 (a) (L-S-D)n 또는 (D-S-L)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, D는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, n은 정수임), 및 (b) 각 어댑터 상에서 정지된 하나 이상의 헬리카제를 포함하는 것인, 어댑터; 및
- 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위한 키트로서, 여기서, 키트는 (a) 하나 이상의 스페이서, (b) 하나 이상의 헬리카제 및 (c) 막횡단 포어를 포함하는 것인 키트를 제공한다.
도 1은 실시예 1에서 사용된 람다 DNA 구축물의 다이어그램을 보여주는 것이다. 서열 9 (A로 표지)는 그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서 (B로 표지)에 부착되어 있다. 4개의 iSpC3 스페이서는 서열 10 (C로 표지)의 5' 말단에 부착되어 있다. 서열 10은, 서열 11 (E로 표지) 그의 5' 말단에 부착되어 있는 4개의 iSpC3 스페이서 (D로 표지)에 부착되어 있다. 서열 10은 서열 12 (F로 표지, 3' 콜레스테롤 테더를 가진다)에 혼성화된다.
도 2는 헬리카제 (T4 Dda - E94C/A360C (돌연변이 E94C/A360C, 및 이어서, (ΔM1)G1G2를 포함하는 서열 8))가 나노포어 (MS(B1- G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (MspA - B2C) (돌연변이 G75S/G77S/L88N/Q126R을 포함하는 서열 2))를 통과하는 (기술된 바와 같이 0.2 nM이고, 도 1에 도시된 것과 같은) 람다 DNA 구축물의 전위를 제어할 때의, 예시적인 전류 트레이스 (y축 표지 = 전류 ((pA), 20 내지 120), x축 표지 = 시간 ((s), 3,500 내지 8,000))를 보여주는 것이다.
도 3은 도 2의 전류 트레이스에 제시된 헬리카제 제어형 DNA 이동에 대한 확대된 영역을 보여주는 것이다 (상단 및 하단 트레이스, 둘 모두에 대하여 y축 표지 = 전류 ((pA), 상단 트레이스 20 내지 80, 하단 트레이스 20 내지 60), x축 표지 = 시간 ((s), 상단 트레이스 2,995 내지 3,020, 하단 트레이스 8,140 내지 8,170)). a)는 헬리카제 제어형 DNA 이동 시작점을 보여주는 것이고, b)는 헬리카제 제어형 DNA 이동 종점을 보여주는 것이다. 화살표로 표지된 1은 (나노포어에 의해 포획되기 이전에 효소의 이동을 정지시키는 데 사용되는) 첫번째 4개의 iSpC3 스페이서가 나노포어를 통해 이동할 때의 것에 상응한다. 화살표로 표지된 2는 나노포어를 통해 이동하는 두번째 4개의 iSpC3 스페이서 기의 것에 상응한다.
도 4(a)는 실시예 2에서 사용되는 헤어핀 및 Y형 MuA 기질 디자인을 보여주는 것이다. 서열 19의 dUMP는 삼각형으로 강조 표시되어 있고, iSpC3 스페이서는 x로 제시되어 있다. 도 4(b)는 실시예 2에서 설명되는 샘플 제조 방법 동안 제조된 람다 DNA 구축물을 보여주는 것이다. 람다 DNA의 5-10 kB 단편은 X로 표지되어 있고, 폴리머라제에 의해 충전되고, 리가제에 의해서 구축물 나머지 부분에 연결되는 DNA 단편은 y로 표지되어 있고 (점선으로 제시되어 있고), iSpC3 스페이서는 x로 제시되어 있다. 테더 서열 (서열 16)은 제시된 DNA 구축물에 혼성화된다. 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG (회색 동그라미로 제시)에 부착된 6개의 iSp18 스페이서는 서열 16의 3' 말단에 부착되어 있다.
도 5는 헬리카제 (Trwc Cba (서열 9))가 나노포어 (MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (돌연변이 G75S/G77S/L88N/Q126R을 포함하는 서열 2))를 통과하는 (도 4b에 제시된) 람다 DNA 구축물의 전위를 제어할 때의, 예시적인 전류 트레이스 (상단 및 하단 트레이스, 둘 모두에 대하여 y축 표지 = 전류 (pA), x축 표지 = 시간 (s))를 보여주는 것이다. 상단 트레이스는 나노포어를 통한 전체 람다 DNA 구축물의 헬리카제 제어형 DNA 이동을 보여주는 것이고, X1로 표지된 첫번째 iSpC3 스페이서는 1로 표지된 전류 스파이크를 생성하고, X2로 표지된 두번째 iSpC3 스페이서는 2로 표지된 전류 스파이크를 생성한다. 하단 트레이스는 나노포어를 통한 헬리카제 제어형 DNA 이동 종점에 대한 확대된 영역을 보여주는 것이고, X3으로 표지된 세번째 iSpC3 스페이서는 3으로 표지된 전류 스파이크를 생성한다.
도 6(a)는 실시예 3에서 사용되는 헤어핀 및 Y형 MuA 기질 디자인을 보여주는 것이다. 5' 포스페이트는 동그라미로 표지화되어 있고, 서열 18 중의 이노신은 직사각형으로 강조 표시되어 있고, iSpC3 스페이서는 x로 제시되어 있다. 도 6(b)는 실시예 3에서 설명되는 샘플 제조 방법 동안 제조된 람다 DNA 구축물을 보여주는 것이다. 람다 DNA의 5-10 kB 단편은 X로 표지화되어 있고, x에 부착되지 않은 이노신은 직사각형으로 표지화되어 있고, iSpC3 스페이서는 x로 제시되어 있다. 테더 서열 (서열 16)은 제시된 DNA 구축물에 혼성화된다. 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG (회색 동그라미로 제시)에 부착된 6개의 iSp18 스페이서는 서열 16의 3' 말단에 부착되어 있다.
도 7은 헬리카제 (Trwc Cba (서열 17))가 나노포어 (MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (돌연변이 G75S/G77S/L88N/Q126R을 포함하는 서열 2))를 통과하는 (도 6b에 제시된) 람다 DNA 구축물의 전위를 제어할 때의, 예시적인 전류 트레이스 (상단 및 하단 트레이스, 둘 모두에 대하여 y축 표지 = 전류 (pA), x축 표지 = 시간 (s))를 보여주는 것이다. 상단 트레이스는 나노포어를 통한 전체 람다 DNA 구축물의 헬리카제 제어형 DNA 이동을 보여주는 것이고, X1로 표지된 첫번째 iSpC3 스페이서는 1로 표지된 전류 스파이크를 생성하고, X2로 표지된 두번째 iSpC3 스페이서는 2로 표지된 전류 스파이크를 생성하고, X3으로 표지된 세번째 iSpC3 스페이서는 3으로 표지된 전류 스파이크를 생성한다. 하단 트레이스는 나노포어를 통한 헬리카제 제어형 DNA 이동의 후반부에 대한 확대된 영역을 보여주는 것이고, X2로 표지된 두번째 iSpC3 스페이서는 2로 표지된 전류 스파이크를 생성하고, X3으로 표지된 세번째 iSpC3 스페이서는 3으로 표지된 전류 스파이크를 생성한다.
도 8은 효소 활성을 시험하기 위한 형광 검정법이다. 시판용 형광성 기질을 사용하여 혼성화된 dsDNA를 치환할 수 있는 헬리카제 (a로 표지)의 능력에 대해 검정하였다. 1) 형광성 기질 가닥 (최종 48.75 nM, 서열 25 및 26)은 3' ssDNA 오버행 (20개의 염기), 및 혼성화된 dsDNA의 40개의 염기 섹션을 가진다. 상단 가닥 (b)는 서열 25의 5' 말단에 카르복시플루오레세인 염기 (c)를 가지고, 혼성화된 상보체 (d)는 서열 26의 3' 말단에 블랙-홀 소광제 (BHQ-1) 염기 (e)를 가진다. 혼성화되면, 플루오레세인으로부터의 형광은 국소 BHQ-1에 의해 소광되고, 기질은 본질적으로 비형광성이 된다. 형광성 기질의 하단 가닥과 부분적으로 상보적인, 0.975 μM의 포획 가닥 (f, 서열 27)이 본 검정에 포함된다. 2) ATP (0.975 mM) 및 MgCl2 (10 mM)의 존재하에서, 헬리카제 Hel308 Mbu (12 nM, 서열 28)는 제시된 바와 같이 형광성 기질의 3' 오버행에 결합하여 상단 가닥을 따라 이동하여 상보성 가닥 (d)을 치환시킨다. 3) 일단 BHQ-1을 포함하는 상보성 가닥이 완전하게 치환되고 나면, 주요 가닥 상의 플루오레세인은 형광을 발한다 (별표 표시). 4) 치환된 하단 가닥 (d)은 과량의 포획 가닥 (f)에 어닐링하여 초기 기질의 재어닐링 및 형광 손실을 막는다.
도 9는 효소 활성을 시험하기 위한 형광 검정법이다. 2가지 가능한 형광성 기질을 사용하여 혼성화된 dsDNA를 치환할 수 있는 헬리카제 (a로 표지)의 능력에 대해 검정하였으며, 이는 도 9에 제시되어 있는데, (a) (1C-3C로 표지)는 서열 27의 3' 말단을 서열 29의 3' 말단에 연결하는 4개의 Sp9 스페이서 (검은색 삼각형으로 제시)를 가지고, (b) (1B-3B로 표지)는 서열 27의 3' 말단을 서열 29의 3' 말단에 연결하는 1개의 Sp9 스페이서 (검은색 삼각형으로 제시)를 가진다. 형광성 기질 가닥 (최종 48.75 nM, 앞서 기술된 a) 또는 b))은 3' ssDNA 오버행 (20개의 염기), 및 혼성화된 dsDNA의 40개의 염기 섹션을 가진다. 상단 가닥 (b)는 서열 27의 5' 말단에 카르복시플루오레세인 염기 (c)를 가지고, 혼성화된 상보체 (d)는 서열 26의 3' 말단에 블랙-홀 소광제 (BHQ-1) 염기 (e)를 가진다. 혼성화되면, 플루오레세인으로부터의 형광은 국소 BHQ-1에 의해 소광되고, 기질은 본질적으로 비형광성이 된다. 형광성 기질의 하단 가닥과 부분적으로 상보적인, 1 μM의 포획 가닥 (f, 서열 27)이 본 검정에 포함된다. 2 a 및 b). ATP (0.975 mM) 및 MgCl2 (10 mM)의 존재하에서, 헬리카제 Hel308 Mbu (서열 28)는 형광성 기질의 3' 오버행에 결합하여 상단 가닥을 따라 최대 Sp9 기(들)까지 이동한다. sp9 기 (B에서 1개, 및 C에서 4개)는 헬리카제가 그를 지나 이동하지 못하게 막고, 헬리카제는 상보성 가닥 (서열 26)을 치환하지 못한다. 그러므로, 플루오레세인 및 블랙 홀 소광제는 서로 매우 인접한 상태 그대로 유지되며, 형광은 관찰되지 않는다.
도 10은 400 mM의 KCl에서 Hel308 Mbu 헬리카제 (A로 표지, 서열 28)에 대한, 완충제 용액 (100 mM HEPES (pH 8), 0.975 mM ATP, 10 mM MgCl2, 1 mg/mL BSA, 48.75 nM 형광성 기질 DNA (A = 서열 25 및 26, B = 1개의 Sp9 스페이서에 의해 그의 3' 말단에서 서열 29의 5' 말단에 부착되고, 서열 26에 혼성화된 서열 27, C = 4개의 Sp9 스페이서에 의해 그의 3' 말단에서 서열 29의 5' 말단에 부착되고, 서열 26에 혼성화된 서열 27), 0.975 μM 포획 DNA (서열 27)) 중에서의 상대적인 dsDNA 교체율의 그래프 (y축 = 상대적인 dsDNA 교체율, x축 = 형광성 기질)를 보여주는 것이다.
도 11은 400 mM의 KCl에서 Hel308 Mbu 헬리카제 (A로 표지, 서열 28)에 대한, 완충제 용액 (100 mM HEPES (pH 8), 0.975 mM ATP, 10 mM MgCl2, 1 mg/mL BSA, 48.75 nM 형광성 기질 DNA (D = 서열 32 및 26, E = 1개의 idSp 기에 의해 그의 3' 말단에서 서열 30의 5' 말단에 부착되고, 서열 26에 혼성화된 서열 27, F = 4개의 idSp 기에 의해 그의 3' 말단에서 서열 31의 5' 말단에 부착되고, 서열 26에 혼성화된 서열 27, 및 G = 서열 26에 혼성화된 서열 33), 0.975 μM 포획 DNA (서열 27)) 중에서의 상대적인 dsDNA 교체율의 그래프 (y축 = 상대적인 dsDNA 교체율, x축 = 형광성 기질)를 보여주는 것이다.
도 12는 헬리카제 (1로 표지)를 정지시키는 iSpC3 또는 iSp18 스페이서를 함유하지 않는 대조군 가닥에 대한 실험 단계를 보여주는 것이다. 대조군 가닥 (서열 34)은 스페이서 또는 차단 기를 함유하지 않고, DNA의 더 짧은 상보성 가닥 (서열 35, 그의 5' 말단에 회색 동그라미로 제시된 카르복시플루오레세인이 부착되어 있다)에 혼성화된다. 이는 50개의 뉴클레오티드로 된 오버행을 갖는 부분적으로 이중 가닥 구축물을 제조한다. 구축물 (서열 35에 혼성화된 서열 34)을 T4 Dda - E94C/A360C와 함께 미리 인큐베이션시켜 상기 효소가 오버행에 결합할 수 있도록 한다. 제시된 바와 같이, 오버행의 길이로 인해, 1 초과의 효소가 그에 결합할 수 있다. 이어서, 헬리카제 이동을 촉진시키기 위해 효소에 필요한 성분을 제공한다 (ATP 및 MgCl2). ATP 및 MgCl2와 함께 추가의 포획 가닥 (서열 37) 또한 첨가한다. 이어서, 헬리카제는 대조군 가닥을 따라 전위되어 더 짧은 상보성 가닥을 치환하고, 대조군 가닥은 헬리카제를 함유하지 않게 되거나, 또는 상보성 가닥에 결합된 상태로 남게 된다 (A로 표지). 이어서, 상보성 가닥은 헤어핀을 형성함으로써, 이는 대조군 가닥에 재어닐링할 수 없다 (B로 표지). 이어서, 용액 중에 유리 상태이거나, 또는 대조군 DNA를 따라 이동하고, 말단에서 떨어진 헬리카제는 제시된 바와 같은 과량의 포획 가닥 (서열 37, C로 표지된 복합체)에 의해 결합된다. 헬리카제에 결합하지 않은 임의의 DNA는 무손상 상태 그대로 유지된다 (F 종 그대로 유지). 이어서, 샘플 혼합물을 겔 상에 전개시키고, 그를 통해 겔 상에 생성된 밴드에 의해 별개의 종을 확인한다.
도 13은 헬리카제 (1로 표지)를 정지시키기 위한 iSpC3 또는 iSp18 스페이서 (도에서 X로 표시)를 함유하는 가닥에 대한 실험 단계를 보여주는 것이다. 도 12에 제시된 것과 같은 방법을 수행하였고, 효소를 DNA 구축물과 미리 인큐베이션시켰다 (더 짧은 상보성 가닥에는 그의 5' 말단에 카르복시플루오레세인이 부착되어 있다). 스페이서 기는 이중 가닥 영역의 앞쪽에 위치하고, 헬리카제는 제시된 바와 같이 DNA에 결합할 수 있다. ATP, MgCl2 및 포획 DNA (2로 표지) 첨가시, 이때 헬리카제는 헬리카제 이동을 촉진시키는 필요 성분을 제공받게 된다. 스페이서가 헬리카제를 정지시킬 수 있다면, 이때는 짧은 상보성 가닥을 여전히 함유하는 DNA 구축물에 결합한 상태 그대로 유지될 것이다 (D로 표지). 스페이서가 헬리카제를 정지시킬 수 없다면, 이때는 스페이서를 지나 이동하여 상보성 가닥을 치환하게 되고 (B로 표지), 어떤 헬리카제도 결합되어 있지 않은 A 종이 남게 된다. 이어서, 유리 효소는 과량의 포획 가닥 (C로 표지)에 결합하고, 치환된 상보성 가닥은 헤어핀을 형성하게 될 것이다 (B로 표지). 스페이서가 2개의 헬리카제가 아닌, 1개의 헬리카제를 정지시킬 수 있다면, 이때 제1 헬리카제는 뒤쪽에 있는 헬리카제에 의해서 스페이서를 지나도록 인출될 것이며, 상보성 가닥을 치환하게 될 것이다. 그러나, 제2 헬리카제는 스페이서를 지나 이동할 수 없고, E로 표지된 복합체로 형성된다. 헬리카제에 결합하지 않은 임의의 DNA는 어떤 헬리카제도 결합되어 있지 않은 무손상 상태 그대로 유지된다 (F 종). 이어서, 샘플 혼합물을 겔 상에 전개시키고, 그를 통해 겔 상에 생성된 밴드에 의해 별개의 종을 확인한다.
도 14는 대조군 가닥 (하기 표 11에서 1)에 대하여 실행된 겔 검정법을 보여주는 것이다. M으로 표지된 레인은 참조에 대한 DNA 래더이다 (밴드는 최저 질량 (겔의 하단)에서부터 최고 질량 (겔의 상단)으로 200 bp (염기쌍), 300 bp, 400 bp, 500/517 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1,200 bp 및 1,517 bp에 상응하는 것임). 레인 1은 오직 어닐링된 DNA (서열 35에 혼성화된 서열 34)만을 함유한다. 레인 2는 대조군 가닥에 미리 결합된 헬리카제 (T4 Dda - E94C/A360C)를 함유한다 (연료 비첨가). 레인 3은 완충제 1에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 대조군 가닥을 보여주는 것이다. 레인 4는 완충제 2에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 대조군 가닥을 보여주는 것이다. 밴드 X는 오직 서열 34에만 상응하고, 밴드 Y는 서열 35에 혼성화된 서열 34에 상응한다. 1Y로 표지된 영역은 서열 35에 혼성화된 서열 34에 결합된 1개의 헬리카제에 상응한다. 2Y로 표지된 영역은 서열 35에 혼성화된 서열 34에 결합된 2개의 헬리카제에 상응한다. 3Y로 표지된 영역은 서열 35에 혼성화된 서열 34에 결합된 3개의 헬리카제에 상응한다. 4Y로 표지된 영역은 서열 35에 혼성화된 서열 34에 결합된 4개의 헬리카제에 상응한다. 5Y로 표지된 영역은 서열 35에 혼성화된 서열 34에 결합된 5개의 헬리카제에 상응한다.
도 15는 ssDNA와 dsDNA 사이의 연접부에 3개 (하기 표 11에서 7, 레인 = 1-4에 상응), 4개 (하기 표 11에서 8, 레인 = 5-8에 상응) 및 5개 iSp18 스페이서 (하기 표 11에서 9, 레인 = 9-12에 상응)를 함유하는 DNA 구축물에 대하여 실행된 겔 검정법을 보여주는 것이다. M으로 표지된 레인은 참조에 대한 DNA 래더이다 (밴드는 최저 질량 (겔의 하단)에서부터 최고 질량 (겔의 상단)으로 200 bp (염기쌍), 300 bp, 400 bp, 500/517 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1,200 bp 및 1,517 bp에 상응하는 것임). 레인 1은 오직 어닐링된 DNA (그의 3' 말단에서 3개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)만을 함유한다. 레인 2는 연료가 첨가되지 않은 상태에서, DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 3개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)에 미리 결합된 헬리카제 (T4 Dda - E94C/A360C)를 함유한다. 레인 3은 완충제 1에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 3개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)을 보여주는 것이다. 레인 4는 완충제 2에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 3개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)을 보여주는 것이다. 레인 5는 오직 어닐링된 DNA (그의 3' 말단에서 4개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)만을 함유한다. 레인 6은 연료가 첨가되지 않은 상태에서, DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 4개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)에 미리 결합된 헬리카제 (T4 Dda - E94C/A360C)를 함유한다. 레인 7은 완충제 1에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 4개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)을 보여주는 것이다. 레인 8은 완충제 2에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 4개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)을 보여주는 것이다. 레인 9는 오직 어닐링된 DNA (그의 3' 말단에서 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)만을 함유한다. 레인 10은 연료가 첨가되지 않은 상태에서, DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)에 미리 결합된 헬리카제 (T4 Dda - E94C/A360C)를 함유한다. 레인 11은 완충제 1에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)을 보여주는 것이다. 레인 12는 완충제 2에 연료 (ATP 및 MgCl2)를 첨가한 이후의 DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)을 보여주는 것이다. 밴드 X는 오직 ssDNA 구축물 (예컨대, 그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)에만 상응하고, 밴드 Y는 dsDNA 구축물 (그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9, iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)에만 상응한다. 1X로 표지된 영역은 그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (iSp18 스페이서는 서열 36에 부착되어 있다)에 결합된 1개의 헬리카제에 상응한다. 1Y로 표지된 영역은 그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36에 부착되어 있다)에 결합된 1개의 헬리카제에 상응한다. 2Y로 표지된 영역은 그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36에 부착되어 있다)에 결합된 2개의 헬리카제에 상응한다. 3Y로 표지된 영역은 그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36에 부착되어 있다)에 결합된 3개의 헬리카제에 상응한다. 4Y로 표지된 영역은 그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36에 부착되어 있다)에 결합된 4개의 헬리카제에 상응한다. 5Y로 표지된 영역은 그의 3' 말단에서 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (iSp18 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36에 부착되어 있다)에 결합된 5개의 헬리카제에 상응한다.
도 16은 실시예 9에서 사용된 표준 DNA 구축물을 보여주는 것이다. x는 헬리카제가 결합할 수 없는 스페이서 기를 나타낸다. 1로 표지된 영역의 길이는 상기 영역에 결합할 수 있는 헬리카제의 개수를 제어하기 위해 변경될 수 있다. 실시예와 같이, 본 도면은 영역 1에 1 또는 2개의 헬리카제가 결합되어 있는 것을 보여준다.
도 17은 표 12에 3으로 표지된 DNA 구축물 (서열 9의 5' 말단에 부착되어 있는 5개의 iSpC3 스페이서, 서열 9는 그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서에 부착되어 있고, iSpC3 스페이서는 서열 35에 혼성화된 서열 36의 5' 말단에 부착되어 있다)의 예시적인 겔 검정법을 보여주는 것이다. M으로 표지된 레인은 참조에 대한 DNA 래더이다 (밴드는 최저 질량 (겔의 하단)에서부터 최고 질량 (겔의 상단)으로 200 bp (염기쌍), 300 bp, 400 bp, 500/517 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1,200 bp 및 1,517 bp에 상응하는 것임). 레인 1-6은 상이한 농도의 T4 Dda - E94C/A360C에 상응하는 것이다 (1 = 5,000 nM, 2 = 2,500 nM, 3 = 1,250 nM, 4 = 625 nM, 5 = 312.5 nM 및 6 = 0 nM). X 수준에서 관찰된 밴드는 비결합 dsDNA 구축물에 상응하는 것이다. 겔 좌측에 기재된 수치는 DNA에 결합된 효소의 개수에 관한 것이다. 상기 DNA 구축물의 경우, 첨가된 최고 농도의 효소에서 최대 6개까지의 헬리카제에 결합할 수 있다. 겔의 상단에 제시된 수치는 첨가된 T4 Dda - E94C/A360C의 농도에 상응하는 것이다.
도 18은 실시예 9에서 사용된 DNA 구축물을 보여주는 것이다. A 및 B로 표지된 영역은 디자인된 짧은 DNA 가닥 (서열 37)이며, 이로써, 1개의 헬리카제가 각 영역 (우측에 제시)에 결합할 수 있다. 영역 1은 25개의 SpC3 스페이서에 상응하고, 영역 2는 2개의 iSp18 스페이서에 상응하고, 영역 3은 2개의 iSp18 스페이서에 상응하고, 영역 4는 포크형 DNA로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 없는 또 다른 DNA 가닥 (예컨대, 서열 42 = 비포크형 (7로 표지된 단편 결실) 및 (7로 표지된 단편으로 제시된) 6개의 iSp18 스페이서에 부착된 서열 12 = 포크형)에 혼성화하는 DNA 섹션 (서열 10)에 상응하고, 영역 5는 4개의 5-니트로인돌에 상응하고, 영역 6은 그의 상보체 (서열 43)에 혼성화된 또 다른 DNA 영역 (서열 41)에 상응한다.
도 19는 도 18에 기술되고 제시된 DNA 구축물의 겔 검정법을 보여주는 것이다. X 수준에서 관찰된 밴드는 비결합 dsDNA 구축물에 상응하는 것이다. M으로 표지된 레인은 참조에 대한 DNA 래더이다 (밴드는 최저 질량 (겔의 하단)에서부터 최고 질량 (겔의 상단)으로 200 bp (염기쌍), 300 bp, 400 bp, 500/517 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1,200 bp 및 1,517 bp에 상응하는 것임). 겔 좌측에 기재된 수치는 DNA에 결합된 효소의 개수에 관한 것이다. 상기 DNA 구축물의 경우, 475 nM 이상인 농도의 효소로부터 2개의 헬리카제 (도 18에 제시된 바와 같이, 하나는 영역 A에, 및 또 다른 하나는 영역 B에)의 결합을 관찰할 수 있었다. 겔의 상단에 제시된 수치는 첨가된 T4 Dda - E94C/A360C의 농도에 상응하는 것이다.
도 20은 실시예 10에서 사용된 DNA 구축물 (DNA 구축물 X1로 지칭)을 보여주는 것이다. 서열 38의 5' 말단에 부착된 25개의 SpC3 스페이서 (x로 표시)가 존재하고, 서열 38은 그의 3' 말단에서 4개의 iSp18 스페이서 (검은색 사각형으로 표시)에 부착되어 있다. 4개의 iSp18 스페이서는 서열 10의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 10은 그의 3' 말단에서 4개의 5-니트로인돌 (회식 삼각형으로 표시)에 부착되어 있다. 이어서, 4개의 니트로인돌은 서열 41의 5' 말단에 부착되어 있다. 서열 41에 혼성화되는 상보성 DNA 가닥은 서열 43이다. 서열 10에 혼성화되는 상보성 DNA 가닥은 서열 12 (서열 12의 3' 말단에는 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG (회색 동그라미로 제시)에 부착된 6개의 iSp18 스페이서가 부착되어 있다)이다. A로 표지된 영역은 T4 Dda - E94C/A360C가 결합할 수 있는 구축물의 영역에 상응한다.
도 21은 헬리카제 (T4 Dda - E94C/A360C)가 나노포어 (MspA - B2C)를 통과하는 DNA 구축물 (0.1 nM, 도 20 설명 참조의 전위를 제어할 때의, 예시적인 전류 트레이스 (y축 표지 = 전류 ((pA), 50 내지 250), x축 표지 = 시간 ((s), 238 내지 252))를 보여주는 것이다. 1로 표지된 영역은 나노포어를 통과하는 폴리T 영역 (서열 38, 그 위에 효소가 결합되어 있는 것)의 헬리카제 제어형 전위를 보여주는 것이다. 2로 표지된 영역은 나노포어를 통과하는 나노포어를 통과하는 iSp18 스페이서의 헬리카제 제어형 전위를 보여주는 것이다.
도 22는 실시예 4에서 사용된 DNA 구축물의 다이어그램을 보여주는 것이다. 2개의 티민이 28개의 iSpC3 스페이서 (A로 표지)의 3' 말단에 부착되어 있다. 28개의 iSpC3 스페이서는 나머지 다른 한쪽 말단에서 서열 23의 5' 말단에 부착되어 있다 (서열은 영역 B = 폴리T 섹션, 및 영역 C = 테더 서열 (서열 12에 상보적인 서열에 상응한다). 서열 23의 3' 말단은 4개의 iSpC3 스페이서 (D로 표지)에 부착되어 있다. 4개의 iSpC3 스페이서의 나머지 다른 한쪽 말단은 서열 24의 5' 말단에 부착되어 있다. 테더 서열 (서열 12)은 그의 3' 말단에서, 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착되어 있는 6개의 iSp18 스페이서에 부착되어 있다.
서열 목록 설명
서열 1은 MS-B1 돌연변이체 MspA 단량체를 코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 상기 돌연변이체에는 신호 서열이 결실되어 있으며, 하기 돌연변이: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K를 포함한다.
서열 2는 MspA 단량체의 MS-B1 돌연변이체의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 상기 돌연변이체에는 신호 서열이 결실되어 있으며, 하기 돌연변이: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K를 포함한다.
서열 3은 α-헤몰리신-E111N/K147N (α-HL-NN; 문헌 [Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707])의 한 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 4는 α-HL-NN의 한 단량체의 아미노산 서열을 보여주는 것이다.
서열 5 내지 7은 MspB, C 및 D의 아미노산 서열을 보여주는 것이다.
서열 8은 엔테로박테리아파지 T4로부터의 헬리카제 Dda 1993의 아미노산 서열을 보여주는 것이다.
서열 9는 실시예 1, 2, 3, 7 및 8에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 10은 실시예 1 및 9에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 11은 실시예 1에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 서열 11은 그의 5' 말단에 의해, 서열 10의 3' 말단에 부착된 3개의 iSpC3 스페이서에 부착된다.
서열 12는 실시예 1 및 9에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 실시예 1에서, 서열 12는 그의 3' 말단에서, 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착된 6개의 iSp18 스페이서에 부착된다. 실시예 9에서, 서열 12는 그의 3' 말단에서 오직 6개의 iSp18 스페이서에만 부착된다.
서열 13은 엔테로박테리아파지 λ의 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 서열은 센스 가닥의 5' 말단에 부착된 추가의 12개의 염기 오버행을 함유한다. 본원에 제시된 서열은 오직 센스 가닥의 것이다.
서열 14는 실시예 2 및 3에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 서열 14는 그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서 유닛에 의해 서열 15의 5' 말단에 부착된다.
서열 15는 실시예 2 및 3에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 서열 15는 그의 5' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서 유닛에 의해 서열 14의 3' 말단에 부착된다.
서열 16은 실시예 2 및 3에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것으로서, 상기 서열은 그의 3' 말단에서, 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착된 6개의 iSp18 스페이서를 가진다.
서열 17은 Trwc Cba 헬리카제의 아미노산 서열을 보여주는 것이다.
서열 18은 실시예 3에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 서열 18은 그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서 유닛에 의해 서열 9의 5' 말단에 부착된다. 상기 서열은 그의 5' 말단에 부착된 포스페이트, 및 1 내지 5번 위치에 5 데옥시이노신을 가진다.
서열 19는 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 20은 실시예 2에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 21 및 22는 하기 서열의 번호매김을 유지시키기 위한 플레이스 홀더이다.
서열 23은, 실시예 4에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 마지막의 것이 스페이서 기의 5' 말단에 부착된 추가의 2개의 T를 갖는 것인 28개의 iSpC3 스페이서 유닛은 상기 서열의 5' 말단에 부착되어 있다. 서열 24의 5' 말단에 부착된 4개의 iSpC3 스페이서 유닛은 상기 서열의 3' 말단에 부착되어 있다.
서열 24는 실시예 9에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 마지막의 것이 서열 23에 부착되어 있는 것인 4개의 iSpC3 스페이서 유닛은 상기 서열의 5' 말단에 부착되어 있다. 마지막의 것이 스페이서 기의 5' 말단에 부착된 추가의 2개의 T를 갖는 것인 28개의 iSpC3 스페이서 유닛은 서열 23의 5' 말단에 부착되어 있다.
서열 25는 실시예 5에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 이는 그의 5' 말단에 카르복시플루오레세인 (FAM) 염기를 가진다.
서열 26은 실시예 5 및 6에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 이는 그의 3' 말단에 블랙-홀 소광제 (BHQ-1) 염기를 가진다.
서열 27은 실시예 5 및 6에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 28은 Hel308 Mbu의 아미노산 서열을 보여주는 것이다.
서열 29는 실시예 5에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 상기 서열은 그의 5' 말단에서 1 또는 4개의 iSp9 스페이서 기에 의해 서열 27에 연결된다.
서열 30은 실시예 6에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 상기 서열은 그의 5' 말단에서 1개의 idSp 기에 의해 서열 27에 연결된다.
서열 31은 실시예 6에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 상기 서열은 그의 5' 말단에서 4개의 idSp 기에 의해 서열 27에 연결된다.
서열 32는 실시예 6에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 이는 그의 5' 말단에 카르복시플루오레세인 (FAM) 염기를 가진다.
서열 33은 실시예 6에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 이는 그의 5' 말단에 카르복시플루오레세인 (FAM) 염기를 가진다.
서열 34는 실시예 7에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 35는 실시예 7 및 8에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 이는 그의 5' 말단에 카르복시플루오레세인 (FAM) 염기를 가진다.
서열 36은 실시예 7 및 8에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 37은 실시예 7, 8 및 9에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 38은 실시예 8 및 10에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 39는 실시예 8에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 40은 실시예 8에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 41은 실시예 9에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 42는 실시예 9에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
서열 43은 실시예 9에서 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다.
개시된 생성물 및 방법의 상이한 적용은 관련 기술분야에서의 구체적인 요구에 맞게 적합화될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적의 것이며, 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.
추가로, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나"("a", "an") 및 "그"라는 것은 내용상 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 폴리뉴클레오티드"라고 지칭하는 것은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이고, "하나의 스페이서"라고 지칭하는 것은 2개 이상의 스페이서를 포함하는 것이며, "1개의 헬리카제"라고 지칭하는 것은 2개 이상의 헬리카제를 포함하는 것이고, "하나의 막횡단 포어"라고 지칭하는 것은 2개 이상의 포어를 포함하는 것이며, 다른 것도 그러하다.
상기에서든 또는 하기에서든 상관없이, 본원에서 인용된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
헬리카제가 스페이서를 지나도록 이동시키는 방법
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 정지된 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 방법을 제공한다. 헬리카제는 그가 폴리뉴클레오티드를 따라 이동하는 것을 중단하였다면, 정지된 것이다. 각 스페이서는 전형적으로 하나 이상의 헬리카제를 정지시킨다. 하나 이상의 헬리카제가 정지되었는지 여부를 측정하는 방법은 하기에서 논의된다. 하나 이상의 헬리카제는 스페이서 앞에서 정지될 수 있다. 하나 이상의 헬리카제는 스페이서에 의해 정지될 수 있다. 하나 이상의 헬리카제는 스페이서 상에서 정지될 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 정지된 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록, 즉, 그를 넘도록 이동시키는 것에 관한 것이다.
하나 이상의 정지된 헬리카제 및 표적 폴리뉴클레오티드를 막횡단 포어와 접촉시키고, 전위를 인가하다. 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드는 인가된 전위로부터 생성된 장을 이용하여 포어를 통해 이동한다. 하나 이상의 헬리카제는 전형적으로는 너무 크기 때문에 포어를 통해 이동하지 못한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 일부가 포어에 진입하고, 인가된 전위로부터 생성된 장을 따라 포어를 통해 이동할 때, 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동함에 따라 하나 이상의 헬리카제는 포어에 의해 스페이서를 지나 이동하게 된다. 이는 (하나 이상의 스페이서를 포함하는) 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동하고, 하나 이상의 헬리카제가 포어의 상단에 그대로 남아있기 때문이다.
이를 통해 표적 폴리뉴클레오티드 상의 하나 이상의 헬리카제의 위치는 제어될 수 있다. 하나 이상의 정지된 헬리카제 및 표적 폴리뉴클레오티드가 막횡단 포어와 접촉하고, 전위가 인가되기 전에는, 하나 이상의 헬리카제는 그가 정지된 위치에 그대로 남아있다. 심지어 헬리카제 이동을 촉진시키는 데 필요한 성분 (예컨대, ATP 및 Mg2 +)이 존재하는 경우에도, 하나 이상의 헬리카제는 표적 폴리뉴클레오티드 상의 스페이서를 지나 이동하지 못할 것이며, 그가 막횡단 포어 및 인가된 전위의 존재하에 놓일 때까지는 스페이서의 다른 쪽 상의 표적 폴리뉴클레오티드 일부를 따라 이동하지 못할 것이다.
하나 이상의 헬리카제 또한 막횡단 포어의 존재하에, 그러나, 인가된 전위의 부재하에서 정지된 위치에 그대로 남아있게 될 것이다. 이러한 경우, 전위 인가를 통해 하나 이상의 헬리카제는 스페이서를 지나 이동하게 된다. 그러므로, 하나 이상의 헬리카제가 스페이서를 지나 스페이서의 다른 쪽 상의 표적 폴리뉴클레오티드 일부를 따라 이동하도록 조장하는 데에는 전위 인가가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 헬리카제가 스페이서를 지나 이동하도록 하는 데에는 전압 증가가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 막횡단 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 방법을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시키고, 하나 이상의 헬리카제는 하나 이상의 스페이서에서 정지한다. 이를 통해 확실하게 하나 이상의 헬리카제가 폴리뉴클레오티드 상의 하나 이상의 특정 위치에 그대로 남게 된다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 표적 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 정지된 헬리카제를 막횡단 포어와 접촉시킨다. 일단 전위를 인가하고 나면, 하나 이상의 헬리카제는 하나 이상의 스페이서를 지나 스페이서(들)의 다른 쪽 상의 표적 폴리뉴클레오티드 일부를 따라 이동하게 된다. 이로써, 하나 이상의 헬리카제는 포어를 통과하는 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어할 수 있다. 또한 전위는 폴리뉴클레오티드를 포어로 트레딩(thread)하는 데에도 사용된다.
헬리카제는 적어도 2가지 활성 작동 모드로 (이동을 촉진시키는 데 필요한 모든 성분, 예컨대, ATP 및 Mg2 +를 헬리카제에 제공하였을 때) 및 1가지 불활성 작동 모드로 (이동을 촉진시키는 데 필요한 성분을 헬리카제에 제공하지 않았을 때) 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어할 수 있다. 이동을 촉진시키는 데 필요한 모든 성분을 제공받은 경우, 헬리카제는 (헬리카제에 따라) 5'→3' 또는 3'→5' 방향으로 폴리뉴클레오티드를 따라 이동하지만, (폴리뉴클레오티드의 어느 말단이 포어에 의해 포획되었는지에 의존하는) 포어 중 폴리뉴클레오티드의 배향은 폴리뉴클레오티드를 인가된 장에 반하여 포어 밖으로 이동시키거나, 또는 폴리뉴클레오티드를 인가된 장에 따라 포어 안으로 이동시키는 데 헬리카제가 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 헬리카제가 이동하는 방향 쪽의 폴리뉴클레오티드의 말단이 포어에 포획되었을 때, 헬리카제는 인가된 전위로부터 생성된 장의 방향에 반대로 작용하여 트레딩된 폴리뉴클레오티드를 포어 밖으로 및 시스 챔버 안으로 인입한다. 그러나, 헬리카제가 이동하는 방향 쪽으로부터 떨어져 있는 말단이 포어에 포획되었을 때, 헬리카제는 인가된 전위로부터 생성된 장의 방향에 따라 작용하여 트레딩된 폴리뉴클레오티드를 포어 안으로 및 트랜스 챔버 안으로 인출한다.
이동을 촉진시키는 데 필요한 성분을 제공받지 못한 경우, 헬리카제는 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 폴리뉴클레오티드가 인가된 전위로부터 생성된 전에 의해 포어 안으로 인입될 때, 폴리뉴클레오티드의 이동을 저속화시키는 브레이크로서 작용할 수 있다. 불활성 모드에서, 폴리뉴클레오티드의 어느 말단이 포획되었는지는 중요하지 않고, 브레이크로서 작용하는 헬리카제와 트랜스 쪽인 방향인 포어 내로 폴리뉴클레오티드를 인입하는 인가된 전위가 중요하다. 불활성 모드일 때, 헬리카제에 의한 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 것은 라체팅, 슬라이딩 및 브레이킹을 비롯한 다수의 방식으로 기술될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 하나 이상의 헬리카제는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드는 인가된 전위로부터 생성된 장을 이용하여 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어한다. 한 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 헬리카제는 활성 모드로 사용되고, 하나 이상의 헬리카제가 이동하는 방향 쪽으로부터 떨어져 있는 말단이 포어에 포획되고, 이로써, 하나 이상의 헬리카제는 인가된 전위로부터 생성된 장의 방향에 따라 작용하여 폴리뉴클레오티드가 포어를 통과하도록 인출한다. 하나 이상의 헬리카제가 5'→3' 방향으로 이동할 때, 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 말단은 바람직하게 포어에 의해 포획된다. 상기 실시양태에서, 하나 이상의 헬리카제는 5'→3' 방향으로 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하게 된다. 하나 이상의 헬리카제가 3'→5' 방향으로 이동할 때, 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 바람직하게 포어에 의해 포획된다. 상기 실시양태에서, 하나 이상의 헬리카제는 3'→5' 방향으로 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하게 된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 헬리카제는 불활성 모드로 사용되고, 이로써, 인가된 장은 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통과하도록 인입하고, 하나 이상의 헬리카제는 브레이크로서 작용하게 된다. 본 발명의 방법에서, 하나 이상의 헬리카제는 바람직하게 인가된 전위로부터 생성된 장을 이용하여 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 저속화시키거나, 또는 제동을 건다. 어느 경우에서든, 하나 이상의 헬리카제는 전형적으로는 포어를 통해 이동하기에는 너무 크고, 폴리뉴클레오티드가 인가된 전위로부터 생성된 장을 이용하여 포어를 통해 이동함에 따라, 포어는 폴리뉴클레오티드 상에서 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 인출한다.
막횡단 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 방법은 포어를 사용하여 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 동안, 예를 들어, 가닥 서열분석을 수행하는 동안 도움이 될 수 있다. 본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시키고, 하나 이상의 헬리카제는 하나 이상의 스페이서에서 정지한다. 이를 통해 확실하게 하나 이상의 헬리카제가 폴리뉴클레오티드 상의 하나 이상의 특정 위치에 그대로 남게 된다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 표적 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 정지된 헬리카제를 막횡단 포어와 접촉시킨다. 일단 전위를 인가하고 나면, 하나 이상의 헬리카제는 하나 이상의 스페이서를 지나 스페이서(들)의 다른 쪽 상의 폴리뉴클레오티드 일부를 따라 이동하게 된다. 이로써, 하나 이상의 헬리카제는 포어를 통과하는 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어할 수 있다. 본 방법은 또한 폴리뉴클레오티드가 포어와 관련하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 측정하는 단계를 포함한다. 측정치는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타낸다.
막횡단 포어 및 인가된 전위를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 상의 하나 이상의 헬리카제를 정지시키고, 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시킬 수 있는 능력은 이를 통해 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 효과적으로 규명할 수 있기 때문에, 서열분석할 수 있기 때문에 이롭다. 예를 들어, 하나 이상의 헬리카제는 (하기 기술되는 바와 같이) 포어에 의해 포획되도록 디자인되고, 특징 규명될 필요가 없는 리더 서열 중의 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 말단 쪽의 방향으로 정지될 수 있다. 리더 서열 중 하나 이상의 헬리카제의 정지란 하나 이상의 헬리카제는 그(들)가 포어와 접촉하고, 전위가 인가될 때까지는 리더 서열로부터 출발하여 폴리뉴클레오티드의 일부를 따라 이동하지 못한다는 것을 의미한다. 일단 1개 이상의 헬리카제 및 폴리뉴클레오티드가 포어와 접촉하게 되고, 전위가 인가되고 나면, 리더 서열은 전형적으로 포어에 의해 포획되고, 포어를 통해 이동하게 된다. (상기 기술된 바와 같이) 이러한 이동은 하나 이상의 헬리카제가 스페이서(들)를 지나 특징 규명하고자 하는 폴리뉴클레오티드 일부를 따라 움직이게 한다. 이어서, 하나 이상의 헬리카제는 특징 규명하고자 하는 폴리뉴클레오티드 일부의 이동을 제어할 수 있다.
리더 서열에서 하나 이상의 헬리카제가 정지되지 않으면, 그(들)는 리더 서열로부터 출발하여 폴리뉴클레오티드를 따라, 및 특징 규명하고자 하는 폴리뉴클레오티드 일부를 따라 이동하게 될 것이다. 상기 환경하에서 하나 이상의 헬리카제 및 폴리뉴클레오티드가 포어와 접촉하게 되고, 전위가 인가되면, 리더 서열, 및 특징 규명하고자 하는 폴리뉴클레오티드는 그 모두가 아니더라도, 그 중 일부는 인가된 전위로부터 생성된 장을 따라 제어되지 않는 방식으로 포어를 통해 이동하게 될 것이다. 오직 일단 1개 이상의 헬리카제가 포어와 접촉하게 된 경우에만, 상기 논의된 바와 같이, 그(들)는 특징 규명하고자 하는 폴리뉴클레오티드의 일부의 이동을 제어하기 시작할 것이다. 제어되지 않는 방식으로 포어를 통해 이동하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 일부분은 하기 기술되는 바와 같이 특징 규명될 수 없다. 하나 이상의 헬리카제가 리더 서열로부터 출발하여 남은 표적 폴리뉴클레오티드 대부분을 따라 이동하게 되다면, 있다해도 극소수의 폴리뉴클레오티드만이 특징 규명될 것이다.
하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명에 따른 하나 이상의 스페이서를 사용함으로써 표적 폴리뉴클레오티 상의 하나 이상의 헬리카제의 개수 및 위치는 제어될 수 있다. 예를 들어, 특정 개수의 헬리카제는, 특징 규명 이전에 표적 폴리뉴클레오티드에 결찰될 수 있는 어댑터 상의 특정 위치에서 정지될 수 있다. 상기 어댑터는 본 발명에 의해 제공되며, 이는 특징 규명을 이한 키트에 제공될 수 있다. 하나 이상의 스페이서를 사용함에 따라 확실하게 헬리카제는, 특징 규명 이전에 어댑터 및/또는 표적 폴리뉴클레오티드가 헬리카제 이동을 촉진시키는 데 필요한 성분 (예컨대, ATP 및 Mg2 +)의 존재하에 있는 경우에도, 특징 규명이 시작될 때까지 존재하게 되는 위치에 그대로 남게 된다.
폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드, 예컨대, 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대분자이다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 자연적으로 발생된 것이거나, 또는 인공의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 산화되거나, 메틸화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 피리미딘 이량체를 포함할 수 있다. 상기 이량체는 전형적으로 자외선에 의한 손상과 관련이 있으며, 이는 피부 흑색종의 주요 원인이다. 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 예를 들어, 표지 또는 태그로 변형될 수 있다. 적합한 표지는 하기 기술한다.
뉴클레오티드는 전형적으로 뉴클레오염기, 당 및 1개 이상의 포스페이트 기를 함유한다. 뉴클레오염기 및 당은 뉴클레오시드를 형성한다.
뉴클레오염기는 전형적으로 헤테로시클릭이다. 뉴클레오염기로는 퓨린 및 피리미딘, 및 더욱 구체적으로, 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U) 및 시토신 (C)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
당은 전형적으로 펜토스 당이다. 뉴클레오티드 당은 리보스 및 데옥시리보스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당은 바람직하게 데옥시리보스이다.
폴리뉴클레오티드 중 뉴클레오티드는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드는 하기 뉴클레오시드: 아데노신, 우리딘, 구아노신 및 시티딘을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 바람직하게 데옥시리보뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 하기 뉴클레오시드: 데옥시아데노신 (dA), 데옥시우리딘 (dU) 및/또는 티미딘 (dT), 데옥시구아노신 (dG) 및 데옥시시티딘 (dC)을 포함한다.
뉴클레오티드 전형적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 포함한다. 포스페이트는 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측 상에 부착될 수 있다.
적합한 뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP) 및 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드는 바람직하게 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP, dCMP 및 dUMP로부터 선택된다. 뉴클레오티드는 가장 바람직하게 dAMP, dTMP, dGMP, dCMP 및 dUMP로부터 선택된다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 하기 뉴클레오티드: dAMP, dUMP 및/또는 dTMP, dGMP 및 dCMP를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 중 뉴클레오티드는 임의 방식으로 서로에게 부착될 수 있다. 뉴클레오티드는 전형적으로 핵산에서와 같이 그의 당 및 포스페이트 기에 의해 부착된다. 뉴클레오티드는 피리미딘 이량체에서와 같이 그의 뉴클레오염기를 통해 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 합성 핵산, 예컨대, 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄를 포함하는 다른 합성 중합체일 수 있다. PNA 백본은 펩티드 결합에 의해 연결된, 반복 N-(2-아미노에틸)-글리신으로 구성된다. GNA 백본은 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된, 반복 글리콜 단위로 구성된다. TNA 백본은 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 반복 트레오스 당으로 구성된다. LNA는 리보스 모이어티 중 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가의 브릿지를 가지는, 상기 논의된 리보뉴클레오티드로부터 형성된다.
폴리뉴클레오티드는 가장 바람직하게 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)이다.
폴리뉴클레오티드는 바람직하게 하나 이상의 스페이서를 제외하면, 어떤 무염기 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오염기가 결실된 뉴클레오티드)도 포함하지 않는다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 하나 이상의 스페이서를 제외하면, 어떤 C3 스페이서 (즉, 뉴클레오염기 및 당이 결실된 뉴클레오티드)도 포함하지 않는다.
폴리뉴클레오티드의 길이는 임의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 길이는 10개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 또는 500개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 길이는 1,000개 이상의 뉴클레오티드, 5,000개 이상의 뉴클레오티드 길이, 또는 100,000개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
헬리카제는 본 발명의 방법에서 전체 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 또는 그의 오직 일부분만을 따라 이동할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 전체 표적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 오직 일부분만을 특징 규명할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부는 바람직하게 이중 가닥이다. 헬리카제는 전형적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 결합한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부는 이중 가닥일 경우, 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 단일 가닥 영역 또는 비혼성화된 영역을 포함한다. 하나 이상의 헬리카제는 단일 가닥 영역에, 또는 비혼성화된 영역의 한 가닥에 결합할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역을 포함한다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게 표적 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥 영역 또는 비혼성화된 영역에 포함된다. 표적 폴리뉴클레오티드는 1 초과의 단일 가닥 영역 또는 1 초과의 비혼성화된 영역을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 그의 서열 내에 및/또는 한쪽 말단 또는 양측 말단에 단일 가닥 영역 또는 비혼성화된 영역을 포함할 수 있다. 하나 이상의 스페이서는 표적 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역에 포함될 수 있다.
본 방법에서 사용되는 하나 이상의 헬리카제가 5'→3' 방향으로 이동할 경우, 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 그의 5' 말단에 단일 가닥 영역 또는 비혼성화된 영역을 포함한다. 본 방법에서 사용되는 하나 이상의 헬리카제가 3'→5'방향으로 이동할 경우, 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 그의 3' 말단에 단일 가닥 영역 또는 비혼성화된 영역을 포함한다. 하나 이상의 헬리카제가 불활성 모드로 (즉, 브레이크로서) 사용될 경우, 단일 가닥 영역 또는 비혼성화된 영역이 어디 위치하는지는 중요하지 않다.
단일 가닥 영역은 바람직하게 우선적으로 포어로 트레딩하는 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 본 발명의 방법을 촉진시킨다. 리더 서열은 우선적으로 막횡단 포어로 트레딩하여 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 촉진시키도록 디자인된다. 리더 서열은 전형적으로 중합체를 포함한다. 중합체는 바람직하게 음으로 하전된 것이다. 중합체는 바람직하게 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA 또는 RNA, 변형된 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 무염기 DNA), PNA, LNA, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리펩티드이다. 리더는 바람직하게 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 더욱 바람직하게 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열은 상기 논의된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 단일 가닥 리더 서열은 가장 바람직하게 DNA의 단일 가닥, 예컨대, 폴리 dT 섹션을 포함한다. 리더 서열은 바람직하게 하나 이상의 스페이서를 포함한다.
리더 서열의 길이는 임의 길이일 수 있지만, 전형적으로는 10 내지 150개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 20 내지 150개의 뉴클레오티드 길이이다. 리더의 길이는 전형적으로 본 방법에서 사용되는 막횡단 포어에 의존한다.
표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부가 이중 가닥일 경우, 이중 가닥부의 두 가닥은 바람직하게 예컨대, 헤어핀과 같은 가교 모이어티를 사용하여 연결되어 있다. 이는 본 발명의 특징 규명 방법을 촉진시킨다. 가교 모이어티에 의한 표적 폴리뉴클레오티드의 두 가닥의 연결은 폴리뉴클레오티드의 두 가닥 모두 막횡단 포어에 의해 특징 규명할 수 있게, 예컨대, 서열분석할 수 있게 한다. 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥 폴리뉴클레오티드와 같이 포어를 통해 이동함에 따라 두 가닥은 탈혼성화된다. 본 방법은 단일의 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오티드로부터 수득되는 정보의 양을 배가시키기 때문에 이롭다. 또한, 상보적인 '안티 센스' 가닥 중 서열은 '센스' 가닥의 서열에 대하여 반드시 오르소고날성이기 때문에, 두 가닥으로부터의 정보는 정보화 방식으로 조합될 수 있다. 따라서, 이러한 메커니즘은 신뢰성이 더 높은 관찰 결과를 제공하는 오르소고날성 프루프 리딩 능력을 제공한다.
국제 출원 번호 PCT/GB2012/051786 (공보 WO 2013/014451)에 개시된 실시양태 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 가교 모이어티는 전형적으로 폴리뉴클레오티드의 두 가닥을 공유적으로 연결시킨다. 가교 모이어티는 표적 폴리뉴클레오티드의 두 가닥을 연결시킬 수 있는 임의의 것일 수 있지만, 단, 가교 모이어티는 막횡단 포어를 통과하는 폴리뉴클레오티드의 이동을 방해하지는 않는다. 적합한 가교 모이어티로는 중합성 링커, 화학 링커, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게, 가교 모이어티는 DNA, RNA, 변형된 DNA (예컨대, 무염기 DNA), RNA, PNA, LNA 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 가교 모이어티는 더욱 바람직하게 DNA 또는 RNA이다. 가교 모이어티는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다.
가교 모이어티는 가장 바람직하게 헤어핀 루프이다. 헤어핀 루프는 상기 논의된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것으로부터 형성될 수 있다. 헤어핀 루프 또는 헤어핀 루프의 루프의 길이는 전형적으로 약 4 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게, 약 4 내지 약 8개의 뉴클레오티드 길이이다.
가교 모이어티는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 두 가닥에 연결된다. 가교 모이어티는 별개로 합성되고, 표적 폴리뉴클레오티드에 화학적으로 부착되거나, 또는 효소적으로 결찰될 수 있다. 대안적으로, 가교 모이어티는 표적 폴리뉴클레오티드의 프로세싱에서 생성될 수 있다.
가교 모이어티는 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 말단에 또는 그 부근에서 표적 폴리뉴클레오티드에 연결된다. 가교 모이어티는 바람직하게 폴리뉴클레오티드의 말단으로부터 10개 이내의 뉴클레오티드 범위 내에서 표적 폴리뉴클레오티드에 연결된다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게 그(들)가 하나 이상의 헬리카제를 정지시키고, 헬리카제가 제어하고자 하거나, 또는 특징 규명하고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 이동하지 못하게 위치한다. 예를 들어, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 리더 서열과 제어하고자 하거나, 또는 특징 규명하고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드 사이에, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 한쪽 말단의 리더 서열 범위 내에 위치한다. 리더 서열은 전형적으로 인가된 전위로부터 생성된 장을 이용하여 포어에 진입하고, 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동함에 따라 하나 이상의 헬리카제는 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하게 된다. 이어서, 하나 이상의 헬리카제는 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 나머지 부분의 이동을 제어할 수 있고, 그의 특징 규명을 촉진시킬 수 있다.
가장 바람직한 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 한쪽 말단에서 가교 모이어티, 예컨대, 헤어핀 루프에 의해 연결된 이중 가닥부, 및 리더 서열을 포함하며, 가교 모이어티로부터 나머지 다른 한쪽 말단에 위치하는 단일 가닥부를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 리더 서열 및/또는 가교 모이어티에 존재할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 샘플 중에 존재한다. 본 발명은 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것으로 공지되어 있거나, 또는 그러할 것으로 의심되는 샘플에 대해 수행된다. 본 발명은 샘플 중 그의 존재가 공지되어 있거나, 또는 예상되는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 동일성를 확인하기 위한 샘플에 대해 수행될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 본 발명은 임의의 유기체 또는 미생물로부터 수득된, 또는 그로부터 추출된 샘플에 대해 시험관내에서 수행될 수 있다. 유기체 또는 미생물은 전형적으로 고세균성, 원핵성 또는 진핵성이고, 전형적으로는 5가지의 계; 식물계, 동물계, 진균계, 모네라계 및 원생 생물계 중 하나에 속한다. 본 발명은 임의의 바이러스로부터 수득된, 또는 그로부터 추출된 샘플에 대해 시험관내에서 수행될 수 있다. 샘플은 바람직하게 유체 샘플이다. 샘플은 전형적으로 환자의 체액을 포함한다. 샘플은 뇨, 림프, 타액, 점액, 또는 양수일 수 있지만, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청이다. 전형적으로, 샘플은 인간 기원의 것이지만, 대안적으로, 또 다른 포유동물로부터의 것, 예컨대, 상업상 사육 동물, 예컨대, 말, 소, 양 또는 돼지로부터의 것일 수 있거나, 또는 대안적으로, 애완동물, 예컨대, 고양이 또는 개로부터의 것일 수 있다. 대안적으로, 식물 기원의 샘플은 전형적으로 상업상 작물, 예컨대, 시리얼, 콩과 식물, 과일 또는 야채, 예를 들어, 밀, 퀴노아, 보리, 귀리, 카놀라, 옥수수, 대두, 쌀, 바나나, 사과, 토마토, 감자, 포도, 담배, 콩, 렌틸, 사탕수수, 코코아, 목화로부터 수득되는 것이다.
샘플은 비생물학적 샘플일 수 있다. 비생물학적 샘플은 바람직하게 유체 샘플이다. 비생물학적 샘플의 예로는 수술 유체, 물, 예컨대, 식수, 해수, 또는 강물 및 실험실 시험용 시약을 포함한다.
샘플은 전형적으로 검정되기 이전에, 예를 들어, 원심분리에 의해 또는 원치 않는 분자 또는 세포, 예컨대, 적혈구를 여과하는 막을 통해 통과시킴으로써 프로세싱된다. 샘플은 채취 즉시 측정될 수 있다. 샘플은 또한 전형적으로는 검정 이전에 바람직하게는 -70℃에서 보관될 수 있다.
스페이서 (들)
하나 이상의 스페이서는 표적 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 표적 폴리뉴클레오티드의 일부이고, 예를 들어, 그(들)는 폴리뉴클레오티드 서열을 방해한다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화된, 하나 이상의 차단 분자, 예컨대, 과속 방지턱의 일부가 아니다.
표적 폴리뉴클레오티드 중 임의 개수의 스페이서, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 스페이서가 존재할 수 있다. 바람직하게, 표적 폴리뉴클레오티드 중 2, 4, 또는 6개의 스페이서가 존재한다. 스페이서는 표적 폴리뉴클레오티드의 상이한 영역에 존재할 수 있고, 예컨대, 스페이서는 리더 서열에 및 스페이서는 헤어핀 루프에 존재할 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 각각 하나 이상의 헬리카제기 심지어는 활성 모드에서도 극복하지 못하는 에너지 장벽을 제공한다. 하나 이상의 스페이서는 헬리카제의 견인을 감소시킴으로써 (예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드 중 뉴클레오티드로부터 염기를 제거함으로써), 또는 (예를 들어, 벌키한 화학적 기를 사용하여) 하나 이상의 헬리카제의 이동을 물리적으로 차단함으로써 하나 이상의 헬리카제를 정지시킬 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 하나 이상의 헬리카제를 정지시키는 임의의 분자 또는 분자 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 스페이서는 하나 이상의 헬리카제가 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 이동하지 못하도록 막는 임의의 분자 또는 분자 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 헬리카제가 막횡단 포어 및 인가된 전위의 부재하에서 하나 이상의 스페이서에서 정지되는지 여부를 측정하는 것은 간단하다. 예를 들어, 실시예에 제시된 바와 같이 검정될 수 있다. 예를 들어, 스페이서를 지나 이동하고, DNA의 상보성 가닥을 치환할 수 있는 헬리카제의 능력은 PAGE에 의해 측정될 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 전형적으로 선형 분자, 예컨대, 중합체를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드와 상이한 구조를 가진다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드가 DNA일 경우, 하나 이상의 스페이서는 전형적으로 DNA가 아니다. 특히, 표적 폴리뉴클레오티드가 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 경우, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄를 포함하는 합성 중합체를 포함한다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게 하나 이상의 니트로인돌, 예컨대, 하나 이상의 5-니트로인돌, 하나 이상의 이노신, 하나 이상의 아크리딘, 하나 이상의 2-아미노퓨린, 하나 이상의 2-6-디아미노퓨린, 하나 이상의 5-브로모-데옥시우리딘, 하나 이상의 역 티미딘 (역 dT), 하나 이상의 역 디데옥시-티미딘 (ddT), 하나 이상의 디데옥시-시티딘 (ddC), 하나 이상의 5-메틸시티딘, 하나 이상의 5-히드록시메틸시티딘, 하나 이상의 2'-O-메틸 RNA 염기, 하나 이상의 이소-데옥시시티딘 (이소-dC), 하나 이상의 이소-데옥시구아노신 (이소-dG), 하나 이상의 iSpC3 기 (즉, 당 및 염기가 결실된 뉴클레오티드), 하나 이상의 광절단가능한 (PC) 기, 하나 이상의 헥산디올 기, 하나 이상의 스페이서 9 (iSp9) 기, 하나 이상의 스페이서 18 (iSp18) 기, 중합체 또는 하나 이상의 티올 연결부를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 상기 기들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 기 중 다수는 IDT® (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)®)로부터 상업적으로 이용가능하다.
하나 이상의 스페이서는 임의 개수의 상기 기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 2-아미노퓨린, 2-6-디아미노퓨린, 5-브로모-데옥시우리딘, 역 dT, ddT, ddC, 5-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 2'-O-메틸 RNA 염기, 이소-dC, 이소-dG, iSpC3 기, PC 기, 헥산디올 기 및 티올 연결부인 경우, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 초과의 iSp9 기를 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 2, 3, 4, 5 또는 6개 또는 그 초과의 iSp18 기를 포함한다. 가장 바람직한 스페이서는 4개의 iSp18 기이다.
중합체는 바람직하게 폴리펩티드 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 폴리펩티드는 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의 아미노산을 포함한다. PEG는 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의 단량체 단위를 포함한다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게 하나 이상의 무염기 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오염기가 결실된 뉴클레오티드), 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의 무염기 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오염기는 무염기 뉴클레오티드 중 -H(idSp) 또는 -OH에 의해 치환될 수 있다. 무염기 스페이서는 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드로부터 뉴클레오염기를 제거함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 3-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 1,N6-에테노아데닌 이노신 또는 히포크산틴을 포함하도록 변형될 수 있고, 뉴클레오염기는 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라제 (hAAG)를 사용하여 상기 뉴클레오티드로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 우라실을 포함하도록 변형될 수 있고, 뉴클레오염기는 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 사용하여 제거될 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 스페이서는 임의의 무염기 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
하나 이상의 헬리카제는 각각의 선형 분자 스페이서에 의해 (즉, 그 앞에서), 또는 그 상에서 정지될 수 있다. 선형 분자 스페이서가 사용될 때, 표적 폴리뉴클레오티드에는 바람직하게, 하나 이상의 헬리카제가 지나서 이동하게 되는 각 스페이서의 말단에 인접한 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역이 제공된다. 이중 가닥 영역은 전형적으로 인접한 스페이서 상에서의 하나 이상의 헬리카제의 정지를 돕는다. 이중 가닥 영역(들)의 존재는 특히 본 방법이 염 농도가 약 100 mM 이하일 때 수행되는 경우에 바람직하다. 각 이중 가닥 영역의 길이는 전형적으로 10개 이상, 예컨대, 12개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명에서 사용되는 표적 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥일 경우, 이중 가닥 영역은 더 짧은 폴리뉴클레오티드를 스페이서에 인접한 영역에 혼성화시킴으로써 형성될 수 있다. 더 짧은 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드로부터 형성되지만, 상이한 뉴클레오티드로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 더 짧은 폴리뉴클레오티드는 LNA로부터 형성될 수 있다.
선형 분자 스페이서가 사용되는 경우, 표적 폴리뉴클레오티드에는 바람직하게, 하나 이상의 헬리카제가 지나서 이동하게 되는 말단 반대편의 각 스페이서의 말단에 차단 분자가 제공된다. 이는 확실하게 하나 이상의 헬리카제가 각 스페이서 상에 정지된 상태 그대로 유지될 수 있도록 하는 데 도움을 줄 수 있다. 이는 또한 그(들)가 용액 중에서 확산되는 경우, 표적 폴리뉴클레오티드 상에 하나 이상의 헬리카제를 유지시키는 데 도움을 줄 수 있다. 차단 분자는 하나 이상의 헬리카제를 물리적으로 정지시키는, 하기 논의되는 화학적 기 중 임의의 것일 수 있다. 차단 분자는 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역일 수 있다.
하나 이상의 스페이서는 바람직하게 하나 이상의 헬리카제를 물리적으로 정지시키는 하나 이상의 화학적 기를 포함한다. 하나 이상의 화학적 기는 바람직하게 하나 이상의 펜던트 화학적 기. 하나 이상의 화학적 기는 표적 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오염기에 부착될 수 있다. 하나 이상의 화학적 기는 표적 폴리뉴클레오티드 백본에 부착될 수 있다. 상기 화학적 기는 임의 개수로, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과로 존재할 수 있다. 적합한 기로는 형광단, 스트렙트아비딘 및/또는 비오틴, 콜레스테롤, 메틸렌 블루, 디니트로페놀 (DNP), 디곡시게닌 및/또는 항-디곡시게닌 및 디벤질시클로옥틴 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표적 폴리뉴클레오티드 중 상이한 스페이서는 상이한 정지 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 스페이서는 상기 논의된 선형 분자 중 하나를 포함할 수 있고, 또 다른 스페이서는 하나 이상의 헬리카제를 물리적으로 정지시키는 하나 이상의 화학적 기를 포함할 수 있다. 스페이서는 상기 논의된 선형 분자 중 하나, 및 하나 이상의 헬리카제를 물리적으로 정지시키는 하나 이상의 화학적 기, 예컨대, 하나 이상의 무염기 및 형광단을 포함할 수 있다.
적합한 스페이서는 표적 폴리뉴클레오티드의 유형, 및 본 발명의 방법이 수행되는 조건에 따라 디자인될 수 있다. 대부분의 헬리카제는 DNA에 결합하여 그를 따라 이동하며, 이로써, DNA가 아닌 임의의 것을 사용하여 정지될 수 있다. 적합한 분자는 상기에 논의된 것이다.
본 발명의 방법은 바람직하게 유리 뉴클레오티드의 존재, 및/또는 헬리카제 보조인자의 존재 하에 수행된다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 막횡단 포어 및 인가된 전위의 부재하에서, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 유리 뉴클레오티드의 존재, 및/또는 헬리카제 보조인자의 존재 하에 하나 이상의 헬리카제를 정지시킬 수 있다.
하기 논의되는 바와 같이 본 발명의 방법이 (하나 이상의 헬리카제가 활성 모드이도록) 유리 뉴클레오티드 및 헬리카제 보조인자의 존재 하에 수행되는 경우, 확실하게 하나 이상의 헬리카제가 막횡단 포어와 접촉하기 전 및 전위가 인가되기 전에 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 정지되게 하는 데에는 전형적으로 하나 이상의 더 긴 장쇄의 스페이서가 사용된다. 하나 이상의 더 짧은 단쇄의 스페이서는 (하나 이상의 헬리카제가 불활성 모드이도록) 유리 뉴클레오티드 및 헬리카제 보조인자의 부재하에서 사용될 수 있다.
염 농도 또한 하나 이상의 헬리카제를 정지시킬 수 있는 하나 이상의 스페이서의 능력에 영향을 미친다. 막횡단 포어 및 인가된 전위의 부재하에서, 하나 이상의 스페이서는 바람직하게 염 농도 약 100 mM 이하에서 하나 이상의 헬리카제를 정지시킬 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 염 농도가 높을수록, 전형적으로 사용되는 하나 이상의 스페이서의 길이는 더 짧아지고, 그 반대의 경우도 그러하다.
특징의 바람직한 조합은 하기 표 1에 제시되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 방법은 2개 이상의 헬리카제가 스페이서를 지나도록 이동시키는 것에 관한 것이다. 상기 경우에서, 스페이서의 길이는 전형적으로는, 포어 및 인가된 전위의 부재하에서 트레일링 헬리카제가 리딩 헬리카제가 스페이서를 지나도록 인출하지 못하도록 막기 위해서는 증가된다. 본 방법이 2개 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 것에 관한 것인 경우, 상기 논의된 스페이서의 길이는 1.5배 이상, 에서, 2배, 2.5배 또는 3배로 증가될 수 있다. 예를 들어, 본 방법이 2개 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 것에 관한 것인 경우, 상기 표 1의 세번째 칸의 스페이서 길이는 1.5배, 2배, 2,5배 또는 3배로 증가될 수 있다.
2개 이상의 헬리카제는 또한 각각이 그 자체의 하나 이상의 스페이서를 가지도록 이격될 수 있다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
헬리카제 (들)
임의의 헬리카제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 헬리카제는 Hel308 헬리카제, RecD 헬리카제, 예컨대, TraI 헬리카제 또는 TrwC 헬리카제, XPD 헬리카제 또는 Dda 헬리카제이거나, 또는 그로부터 유래된 것일 수 있다. 헬리카제는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/052579 (공보 WO 2013/057495); PCT/GB2012/053274 (공보 WO 2013/098562); PCT/GB2012/053273 (공보 WO2013098561); PCT/GB2013/051925; PCT/GB2013/051924 및 PCT/GB2013/051928; 및 UK 출원 번호 1318464.3 (2013년 10월 18일 출원)에서 개시된, 헬리카제, 변형된 헬리카제 또는 헬리카제 구축물 중 임의의 것일 수 있다.
헬리카제는 바람직하게 서열 17에 제시된 서열 (Trwc Cba) 또는 그의 변이체, 서열 28에 제시된 서열 (Hel308 Mbu) 또는 그의 변이체, 또는 서열 8에 제시된 서열 (Dda) 또는 그의 변이체를 포함한다. 변이체는 막횡단 포어에 대해 하기에 논의되는 방식 중 임의의 것으로 자연 서열과 상이할 수 있다. 서열 8의 바람직한 변이체는 E94C/A360C 및 이어서, (ΔM1)G1G2 (즉, M1 결실, 및 이어서, G1 및 G2 부가)를 포함한다.
본 발명에 따라 임의 개수의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나 이동할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나 이동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 개수의 헬리카제가 각 스페이서를 지나 이동할 수 있다. 예를 들어, 2개의 별개의 스페이서를 사용하여 2개의 헬리카제를 정지시키는 경우, 1개의 헬리카제 (제1 헬리카제)는 제1 스페이서를 지나 이동할 수 있지만, 2개의 헬리카제 (제1 및 제2 헬리카제)는 제2 스페이서를 지나 이동할 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게 2개 이상, 예컨대, 3개 이상 또는 4개 이상의 정지된 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 것을 포함한다. 2개 이상의 헬리카제는 전형적으로 동일한 헬리카제이다. 2개 이상의 헬리카제는 상이한 헬리카제이다.
2개 이상의 헬리카제는 상기 언급된 헬리카제의 임의의 조합일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 2개 이상의 Dda 헬리카제일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 하나 이상의 Dda 헬리카제 및 하나 이상의 TrwC 헬리카제일 수 있다. 2개 이상의 헬리카제는 동일한 헬리카제의 상이한 변이체일 수 있다.
2개 이상의 헬리카제는 바람직하게 서로 부착되어 있다. 2개 이상의 헬리카제는 더욱 바람직하게 서로 공유 부착되어 있다. 헬리카제는 임의의 순서로 및 임의의 방법을 이용하여 부착되어 있을 수 있다. 본 발명에서 사용하는 데 바람직한 헬리카제 구축물은 국제 출원 번호 PCT/GB2013/051925; PCT/GB2013/051924 및 PCT/GB2013/051928; 및 UK 출원 번호 1318464.3 (2013년 10월 18일 출원)에 기술되어 있다.
조건 및 막횡단 포어
본 방법은 포어를 통해 전위를 인가하는 것을 포함한다. 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 본 방법은 포어를 통해 전압 전위를 인가하는 것을 포함할 수 있다. 본 방법은 포어를 통해 인가되는 전압을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 본 실시양태에서, 초기 전압 전위는 전형적으로는 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 데에는 충분하지 않고, 증가된 전압 전위는 전형적으로 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 데 충분하다. 대안적으로, 인가된 전위는 화학 전위일 수 있다. 그의 예는 양친매성 층을 통한 염 구배를 사용하는 것이다. 염 구배는 문헌 [Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5]에 개시되어 있다. 일부 경우에서, 포어와 관련하여 표적 폴리뉴클레오티드가 이동함에 따라 포어를 통과하는 전류는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 데 사용된다. 이것이 가닥 서열분석이다.
막횡단 포어는 어느 정도 막을 횡단하는 구조이다. 이는 인가된 전위에 의해 유도된, 수화된 이온이 막을 통해 또는 막 내에서 유동할 수 있도록 허용한다. 막횡단 포어는 전형적으로 전체 막을 횡단하며, 이로써 수화된 이온은 막의 한쪽에서부터 막의 다른 쪽으로 유동할 수 있다. 그러나, 막횡단 포어이 막을 횡단할 필요는 없다. 이는 한쪽 다부에 가깝게 존재할 수 있다. 예를 들어, 포어는 그를 따라 또는 그 내부로 수화된 이온이 유동하는 막 내의 웰일 수 있다.
임의의 막횡단 포어가 본 발명에서 사용될 수 있다. 포어는 생물학적인 것 또는 인공인 것일 수 있다. 적합한 포어로는 단백질 포어, 폴리뉴클레오티드 포어 및 고체 상태 포어를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
임의의 막이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 적합한 막은 관련 기술분야에 주지되어 있다. 막은 바람직하게 양친매성 층이다. 양친매성 층은 1개 이상의 친수성 부분 및 1개 이상의 친유성 또는 소수성 부분, 둘 모두를 포함하는, 양친매성 분자, 예컨대, 인지질로부터 형성되는 층이다. 양친매성 분자는 합성 분자이거나, 또는 자연적으로 발생된 것일 수 있다. 비-자연적으로 발생된 양친매성 물질 및 단일층을 형성하는 양친매성 물질은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 블록 공중합체를 포함한다 (Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009. 25, 10447-10450). 블록 공중합체는 2개 이상의 단량체 서브유닛이 함께 중합화되어 단일 중합체 쇄를 생성하는 중합성 물질이다. 블록 공중합체는 전형적으로 각 단량체 서브유닛이 기여하는 특성을 가진다. 그러나, 블록 공중합체는 개별 서브유닛으로부터 형성된 중합체는 가지지 않는 독특한 특성을 가질 수 있다. 블록 공중합체는, 수성 매질 중에 있는 동안 단량체 서브유닛 중 하나는 소수성 (즉, 친유성)이고, 나머지 서브유닛(들)은 친수성이도록 조작될 수 있다. 이러한 경우, 블록 공중합체는 양친매성 특성을 가질 수 있고, 생물학적 막을 모방하는 구조를 형성할 수 있다. 블록 공중합체는 (2개의 단량체 서브유닛으로 이루어진) 디블록일 수 있지만, 이는 또한 2개 초과의 단량체 서브유닛으로부터 구축될 수 있고, 이로써 양친매성 물질로서의 작용하는 더욱 복잡한 배열을 형성할 수 있다. 공중합체는 트리블록, 테트라블록 또는 펜타블록 공중합체일 수 있다.
양친매성 층은 단일층 또는 이중층일 수 있다. 양친매성 층은 전형적으로 평면 지질 이중층 또는 지지형 이중층일 수 있다.
양친매성 층은 전형적으로 지질 이중층이다. 지질 이중층은 세포막 모델이고, 광범위한 실험 연구를 위한 탁월한 플랫폼으로서의 역할을 한다. 예를 들어, 지질 이중층은 단일 채널 기록에 의한 막 단백질에 관한 시험관내 연구에 사용될 수 있다. 대안적으로, 지질 이중층은 다양한 물질의 존재를 검출하기 위한 바이오센서로서 사용될 수 있다. 지질 이중층은 임의의 지질 이중층일 수 있다. 적합한 지질 이중층으로는 평면 지질 이중층, 지지형 이중층 또는 리포솜을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 지질 이중층은 바람직하게 평면 지질 이중층이다. 적합한 지질 이중층은 국제 출원 번호 PCT/GB08/000563 (공보 WO 2008/102121), 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (공보 WO 2009/077734) 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (공보 WO 2006/100484)에 개시되어 있다.
지질 이중층을 형성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 방법은 실시예에 개시되어 있다. 지질 이중층은 보편적으로는, 지질 단일층이 수용액/대기 계면에 수직인 개구의 양측을 지나 상기 계면에서 계속 이어지는, 몬탈(Montal) 및 뮐러(Mueller) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566)의 방법에 의해 형성된다.
몬탈 및 뮐러의 방법은 단백질 포어를 삽입시키는 데 적합한 우수한 품질의 지질 이중층을 형성할 수 있는 방법으로서 비용면에서 효율적이고, 상대적으로 간단하기 때문에 인기가 많다. 다른 일반적인 이중층 형성 방법으로는 팁-디핑, 이중층 페인팅 및 리포솜 이중층 패치-클램핑을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 지질 이중층은 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (공보 WO 2009/077734)에 기술된 바와 같이 형성된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 막은 고체 상태 층이다. 고체 상태 층은 생물학적 기원의 것이 아니다. 다시 말해, 고체 상태 층은 생물학적 환경, 예컨대, 유기체 또는 세포, 또는 합성적으로 제조된 생물학적으로 이용가능한 구조체 버전으로부터 유래된 것이 아니거나, 또는 그로부터 단리된 것이 아니다. 고체 상태 층은 마이크로전자 물질, 절연 물질, 예컨대, 예컨대, Si3N4, Al2O3, 및 SiO를 비롯한, 유기 물질 및 무기 물질, 둘 모두, 유기 및 무기 중합, 예컨대, 폴리아미드, 플라스틱, 예컨대, 테플론(Teflon)® 또는 엘라스토머, 예컨대, 2 성분 부가 경화형 실리콘 곱, 및 유리로부터 형성될 수 있다. 고체 상태 층은 단원자 층, 예컨대, 그래핀, 또는 단지 몇 안되는 원자 두께인 층으로부터 형성될 수 있다. 적합한 그래핀 층은 국제 출원 번호 PCT/US2008/010637 (공보 WO 2009/035647)에 개시되어 있다.
본 방법은 전형적으로 (i) 포어를 포함하는 인공 양친매성 층, (ii) 포어를 포함하는 단리된, 자연적으로 발생된 지질 이중층, 또는 (iii) 그 안에 포어가 삽입되어 있는 세포를 사용하여 수행된다. 본 방법은 전형적으로 인공 양친매성 층, 예컨대, 인공 지질 이중층을 사용하여 수행된다. 층은 포어 이외에도, 다른 막횡단 및/또는 막내 단백질 뿐만 아니라, 다른 분자를 포함할 수 있다. 적합한 장치 및 조건은 하기에서 논의된다. 본 발명의 방법은 전형적으로 시험관내에서 수행된다.
표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 막에 커플링된다. 이는 임의의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 막이 양친매성 층, 예컨대, (상기에서 상세하게 논의된 바와 같은) 지질 이중층일 경우, 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 막에 존재하는 폴리펩티드를 통해, 또는 막에 존재하는 소수성 앵커를 통해 막에 커플링된다. 소수성 앵커는 바람직하게 지질, 지방산, 스테롤, 탄소 나노튜브 또는 아미노산이다.
표적 폴리뉴클레오티드는 막에 직접 커플링될 수 있다. 이는 국제 출원 번호 PCT/GB2012/051191 (공보 WO 2012/164270)에 개시된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 막에 커플링될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 링커를 통해 막에 커플링된다. 바람직한 링커로는 중합체, 예컨대, 폴리뉴클레오티드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 표적 폴리뉴클레오티드가 막에 직접 커플링될 경우, 이때, 막과 포어 및/또는 헬리카제 사이의 거리에 기인하여 특징 규명 실행이 폴리뉴클레오티드 말단으로까지 계속 진행되지 못하기 때문에 일부 데이터는 손실될 것이다. 링커가 사용되는 경우, 이때 표적 폴리뉴클레오티드는 완전하게 프로세싱될 수 있다. 링커가 사용되는 경우, 링커는 표적 폴리뉴클레오티드의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 링커는 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드 꼬리 중합체에 부착된다.
커플링은 안정적이거나, 또는 일시적인 것일 수 있다. 특정 적용의 경우, 커플링의 일시적인 성질이 바람직하다. 안정한 커플링 분자가 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나에 직접 부착된다면, 이때, 막과 포어 및/또는 헬리카제 사이의 거리에 기인하여 특징 규명 실행이 폴리뉴클레오티드 말단으로까지 계속 진행되지 못하기 때문에 일부 데이터는 손실될 것이다. 커플링이 일시적인 경우, 이때 커플링된 말단이 무작위적으로 막에 존재하지 않게 되었을 때, 이때 표적 폴리뉴클레오티드는 완전하게 프로세싱될 수 있다. 막과 안정적인 또는 일시적인 결합을 형성하는 화학적 기는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 폴리뉴클레오티드는 콜레스테롤 또는 지방 아실 쇄를 이용하여 양친매성 층, 예컨대, 지질 이중층에 일시적으로 커플링될 수 있다. 길이가 6 내지 30개의 탄소 원자로 이루어진 임의의 지방 아실 쇄, 예컨대, 헥사데카노산이 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 양친매성 층에 커플링된다. 폴리뉴클레오티드를 합성 지질 이중층에 커플링시키는 것은 다양한 상이한 테더링 전략법을 이용하여 앞서 수행된 바 있다. 이는 하기 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
Figure pct00002
폴리뉴클레오티드는 합성 반응에서 반응성 기, 예컨대, 티올, 콜레스테롤, 지질 및 비오틴 기의 부가를 위해 쉽게 화합성을 띠는 변형된 포스포르아미다이트를 사용하여 관능화될 수 있다. 상기의 상이한 부착 화학법은 폴리뉴클레오티드에 대한 한 벌의 부착 옵션을 제공한다. 각각의 변형 기는 약간 상이한 방식으로 폴리뉴클레오티드를 테더링하고, 커플링은 항상 영구적인 것은 아니기 때문에, 폴리뉴클레오티드가 막에 존재하는 지속 시간은 상이하다. 일시적인 커플링이 갖는 장점은 상기에서 논의하였다.
폴리뉴클레오티드의 커플링은 또한, 반응성 기가 폴리뉴클레오티드에 부가될 수 있다면 다수의 다른 수단에 의해서도 달성될 수 있다. 반응성 기를 DNA의 말단에 부착시키는 것은 앞서 보고된 바 있다. 폴리뉴클레오티드 키나제 및 ATPγS를 사용하여 티올 기를 ssDNA의 5'에 부가할 수 있다 (Grant, G. P. and P. Z, Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77). 변형된 올리고클레오티드를 ssDNA의 3'에 도입하는 데 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 더욱 다양하게 선택될 수 있는 화학적 기, 예컨대, 비오틴, 티올 및 형광단을 부가할 수 있다 (Kumar, A., P. Tchen, et al. (1988). "Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2): 376-82).
대안적으로, 반응성 기는 이미 막에 커플링된 것에 대하여 폴리뉴클레오티드 중 짧은 단쇄 영역인 것으로 간주될 수 있고, 이로써, 부착은 혼성화를 통해 달성될 수 있다. 영역은 폴리뉴클레오티드의 일부이거나, 또는 그에 결찰될 수 있다. T4 RNA 리가제 I를 사용하여 이루어지는 짧은 ssDNA 조각의 결찰은 보고된 바 있다 (Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al. (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5).
가장 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 콜레스테롤 태깅된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 막에 커플링된다.
막횡단 포어는 바람직하게 막횡단 단백질 포어이다. 막횡단 단백질 포어는 수화된 이온, 예컨대, 분석물이 막의 한쪽으로부터 막의 나머지 다른 한쪽으로 유동할 수 있도록 허용하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 집합이다. 본 발명에서, 막횡단 단백질 포어는 인가된 전위에 의해 유도된 수화된 이온이 막의 한쪽으로부터 나머지 다른 한쪽으로 유동할 수 있도록 허용하는 포어를 형성할 수 있다. 막횡단 단백질 포어는 바람직하게 분석물, 예컨대, 뉴클레오티드가 막, 예컨대, 지질 이중층의 한쪽으로부터 나머지 다른 한쪽으로 유동할 수 있도록 허용한다. 막횡단 단백질 포어를 통해 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA는 포어를 통과하여 이동할 수 있다.
막횡단 단백질 포어는 단량체 또는 올리고머일 수 있다. 포어는 바람직하게 수개의 반복 서브유닛, 예컨대, 6, 7, 8 또는 9개의 서브유닛으로 구성된다. 포어는 바람직하게 육량체, 칠량체, 팔량체 또는 구량체 포어이다.
막횡단 단백질 포어는 전형적으로 이동이 그를 통해 유동할 수 있는 것인 장벽 또는 채널을 포함한다. 포어의 서브유닛은 전형적으로 중축을 둘러싸고, 가닥을 막횡단 β 장벽 또는 채널 또는 막횡단 α 나선 번들 또는 채널을 제공한다.
막횡단 단백질 포어의 장벽 또는 채널은 전형적으로 분석물, 예컨대, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산과의 상호작용을 촉진시키는 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산은 바람직하게 장벽 또는 채널의 압축 수렴부 근처에 위치한다. 막횡단 단백질 포어는 전형적으로 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 리신 또는 히스티딘, 또는 방향족 아미노산, 예컨대, 티로신 또는 트립토판을 포함한다. 이러한 아미노산은 전형적으로 포어와 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 사이의 상호작용을 촉진시킨다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 막횡단 단백질 포어는 β 장벽 포어 또는 α 나선 번들 포어로부터 유도될 수 있다. β 장벽 포어는 β 가닥으로부터 형성되는 장벽 또는 채널을 포함한다. 적합한 β 장벽 포어로는 β 독소, 예컨대, α 헤몰리신, 탄저균 독소 및 류코시딘, 및 박테리아의 외막 단백질/포린, 예컨대, 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 포린 (Msp), 예를 들어, MspA, MspB, MspC 또는 MspD, 리세닌, 외막 포린 F (OmpF), 외막 포린 G (OmpG), 외막 포스포리파제 A 및 나이세리아(Neisseria) 자가수송체 지단백질 (NalP)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. α 나선 번들 포어는 α 나선으로부터 형성되는 장벽 또는 채널을 포함한다. 적합한 α 나선 번들 포어로는 내막 단백질 및 외막 단백질, 예컨대, WZA 및 ClyA 독소를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 막횡단 포어는 리세닌으로부터 유래될 수 있다. 리세닌으로부터 유래된 적합한 포어는 국제 출원 번호 PCT/GB2013/050667 (공보 WO 2013/153359)에 개시되어 있다. 막횡단 포어는 Msp로부터 또는 α 헤몰리신 (α-HL)으로부터 유래될 수 있다.
막횡단 단백질 포어는 바람직하게 Msp로부터, 바람직하게, MspA로부터 유래된다. 상기 포어는 올리고머가 될 것이며, 전형적으로는 Msp로부터 유래된 7, 8, 9 또는 10개의 단량체를 포함한다. 포어는 동일한 단량체를 포함하는, Msp로부터 유래된 동종올리고머 포어일 수 있다. 대안적으로, 포어는 나머지 다른 것과 상이한 1개 이상의 단량체를 포함하는, Msp로부터 유래된 이종올리고머 포어일 수 있다. 바람직하게, 포어는 MspA, 또는 그의 호모로그 또는 파라로그로부터 유래된 것이다.
Msp로부터 유래된 단량체는 전형적으로 서열 2에 제시된 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 서열 2는 MspA 단량체의 MS-(B1)8 돌연변이체이다. 이는 하기 돌연변이: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K를 포함한다. 서열 2의 변이체는 서열 2와 다르고, 포어를 형성할 수 있는 그의 능력은 유지하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 포어를 형성할 수 있는 변이체의 능력은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 검정될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 다른 적절한 서브유닛을 따라 양친매성 층 내로 삽입될 수 있고, 중합화하여 포어를 형성할 수 있는 그의 능력은 측정될 수 있다. 서브유닛을 막, 예컨대, 양친매성 층 내로 삽입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 서브유닛은 지질 이중층을 함유하는 용액 중 정제된 형태로 현탁될 수 있고, 이로써, 서브유닛이 지질 이중층으로 확산되고, 지질 이중층에의 결합 및 기능성 상태로의 조립에 의해 삽입된다. 대안적으로, 서브유닛은 문헌 [M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503] 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (공보 WO 2006/100484)에 기술된, "픽 앤 플레이스(pick and place)" 방법을 이용하여 막으로 직접 삽입될 수 있다.
서열 2의 아미노산 서열의 전장에 걸쳐, 변이체는 바람직하게 아미노산 동일성에 기초하여 상기 서열과 50% 이상 상동성일 것이다. 더욱 바람직하게, 변이체는 아미노산 동일성에 기초하여 전체 서열에 걸쳐 서열 2의 아미노산 서열과 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 더욱 바람직하게, 95%, 97% 또는 99% 이상 상동성일 수 있다. 100개 이상, 예를 들어, 125, 150, 175 또는 200개 또는 그 초과의 인접한 아미노산으로 이루어진 스트레치에 걸쳐 80% 이상, 예를 들어, 85%, 90% 또는 95% 이상의 아미노산 동일성을 가질 수 있다 ("엄격한(hard) 상동성").
상동성을 측정하는 데 관련 기술분야의 표준 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는, 상동성을 계산하는 데, 예를 들어, 그의 디폴트 설정 환경에서 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들어, 문헌 [Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300]; [Altschul, S.F et al., (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기술된 바와 같이, 상동성을 계산하는 데 또는 서열을 정렬하는 데 (예컨대, (전형적으로 그의 디폴드 설정 환경에서) 등가인 잔기 또는 상응하는 서열을 확인하는 데) 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용가능하다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
서열 2는 MspA 단량체의 MS-(B1)8 돌연변이체이다. 변이체는 MspA와 비교하여 MspB, C 또는 D 단량체에 돌연변이 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 성숙한 형태의 MspB, C 및 D는 서열 5 내지 7에 제시되어 있다. 특히, 변이체는 MspB 중에 존재하는 하기 치환을 포함할 수 있다: A138P. 변이체는 MspC 중에 존재하는 하기 치환 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다: A96G, N102E 및 A138P. 변이체는 MspD 중에 존재하는 하기 치환 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다: G1 결실, L2V, E5Q, L8V, D13G, W21A, D22E, K47T, I49H, I68V, D91G, A96Q, N102D, S103T, V104I, S136K 및 G141A. 변이체는 Msp B, C 및 D로부터의 돌연변이 및 치환 중 하나 이상의 것의 조합을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게 돌연변이 L88N을 포함한다. 서열 2의 변이체는 MS-(B1)8의 모든 돌연변이 이외에도 돌연변이 L88N을 가지며, 이는 MS-(B2)8로 명명된다. 본 발명에서 사용되는 포어는 바람직하게 MS-(B2)8이다. 추가로 바람직한 변이체는 돌연변이 G75S/G77S/L88N/Q126R을 포함한다. 서열 2의 변이체는 MS-(B1)8의 모든 돌연변이 이외에도 돌연변이 G75S/G77S/L88N/Q126R을 가지며, 이는 MS-(B2C)8로 명명된다. 본 발명에서 사용되는 포어는 바람직하게 MS-(B2)8 또는 MS-(B2C)8이다.
상기 논의된 것 이외에도, 서열 2의 아미노산 서열에 대하여 아미노산 치환, 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30개의 치환이 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 아미노산을, 화학 구조가 유사한, 화학적 특성이 유사한, 또는 측쇄 부피가 유사한 다른 아미노산으로 대체한다. 도입되는 아미노산은 그가 대체하는 아미노산과 유사한 극성, 친수성, 소수성, 염기도, 산도, 중성도 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 기존 방향족 또는 지방족 아미노산 대신 방향족 또는 지방족인 또 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변이는 관련 기술분야에 주지되어 있고, 이는 하기 표 3에 정의된 바와 같은 20종의 주요 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 가질 경우, 이는 또한 하기 표 4의 아미노산 측쇄에 대한 소수친수성(hydropathy) 등급을 참조로 하여 결정될 수 있다.
[표 3]
아미노산의 화학적 특성
Figure pct00003
[표 4]
소수친수성 등급
Figure pct00004
서열 2의 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기는 추가로 상기 기술된 폴리펩티드로부터 결실될 수 있다. 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30개 또는 그 초과의 잔기가 결실될 수 있다.
변이체는 서열 2의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 포어 형성 활성을 유지한다. 단편의 길이는 50, 100, 150 또는 200개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 상기 단편은 포어를 제조하는 데 사용될 수 있다. 단편은 바람직하게 서열 2의 포어 형성 도메인을 포함한다. 단편은 서열 2의 잔기 88, 90, 91, 105, 118 및 134 중 하나를 포함하여야 한다. 전형적으로, 단편은 서열 2의 잔기 88, 90, 91, 105, 118 및 134 모두를 포함한다.
하나 이상의 아미노산은 대안적으로 또는 추가로 상기 기술된 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 신장부는 서열 2 또는 그의 폴리펩티드 변이체 또는 단편의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 제공될 수 있다. 신장부는 매우 짧은 단쇄일 수 있고, 예를 들어, 길이는 1 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 대안적으로, 신장부는 더 긴 장쇄일 수 있고, 예를 들어, 최대 50 또는 100개의 아미노산일 수 있다. 캐리어 단백질은 본 발명에 따라 아미노산 서열에 융합될 수 있다. 다른 융합 단백질은 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
상기에서 논의된 바와 같이, 변이체는 서열 2의 것과는 다른 아미노산 서열을 가지고, 그의 포어를 형성할 수 있는 능력을 갖는 폴리펩티드이다. 변이체는 전형적으로 포어 형성을 담당하는 서열 2의 영역을 함유한다. β 장벽을 함유하는 Msp의 포어 형성 능력은 각 서브유닛 중의 β 시트에 의해 제공된다. 서열 2의 변이체는 전형적으로 β 시트를 형성하는, 서열 2 중의 영역을 포함한다. 생성된 변이체가 포어를 형성할 수 있는 그의 능력을 유지하는 한, β 시트를 형성하는, 서열 2 중의 영역에 대하여 하나 이상의 변형이 이루어질 수 있다. 서열 2의 변이체는 바람직하게 그의 α 나선 및/또는 루프 영역 내에 하나 이상의 변형, 예컨대, 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
Msp로부터 유래된 단량체는 그의 확인 또는 정제를 돕기 위해, 예를 들어, 히스티딘 잔기 (his 태그), 아스파르트산 잔기 (asp 태그), 스트렙트아비딘 태그 또는 플래그 태그의 부가에 의해, 또는 폴리펩티드가 자연적으로 하기 신호 서열을 함유하지 않는 세포로부터 그의 분비를 촉진시키는 신호 서열의 부가에 의해 변형될 수 있다. 유전자 태그를 도입하는 대안은 포어 상의 자연 또는 조작된 위치 상에서 태그를 화학적으로 반응시키는 것이다. 그의 일례는 포어 바깥쪽에서 조작된 시스테인에 대하여 겔 이동 시약을 반응시키는 것이 될 것이다. 이는 헤몰리신 이종올리고머를 분리시키는 방법으로서 입증되었다 (Chem Biol. 1997 Jul; 4(7):497-505).
Msp로부터 유래된 단량체는 시현 표지로 표지화될 수 있다. 시현 표지는 포어가 검출될 수 있도록 하는 임의의 적합한 표지일 수 있다. 적합한 표지는 하기 기술된다.
Msp로부터 유래된 단량체는 또한 D-아미노산을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, Msp로부터 유래된 단량체는 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 관련 기술분야에서 상기 단백질 또는 펩티드를 제조하는 데 통상적인 것이다.
Msp로부터 유래된 단량체는 뉴클레오티드 구별을 촉진시키기 위해 하나 이상의 특이적인 변형을 함유한다. Msp로부터 유래된 단량체는 또한 포어 형성을 하지 않는 한, 다른 비특이적인 변형을 함유할 수 있다. 다수의 비특이적인 측쇄 변형은 관련 기술분야에 공지되어 있고, Msp로부터 유래된 단량체의 측쇄에 대해 상기와 같은 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 변형으로는 예를 들어, 알데히드와 반응시킨 후, NaBH4로 환원시키는 아미노산의 환원적 알킬화, 메틸아세트이미데이트에 의한 아미딘화 또는 아세트산 무수물에 의해 아실화를 포함한다.
Msp로부터 유래된 단량체는 관련 기술분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. Msp로부터 유래된 단량체는 합성적으로 또는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 포어는 시험관내 번역 및 전사 (IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 포어를 제조하는 데 적합한 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (공보 WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (공보 WO 2010/004265) 또는 PCT/GB10/000133 (공보 WO 2010/086603)에서 논의된 바와 있다. 포어를 막 내로 삽입하는 방법이 논의된다.
막횡단 단백질 포어는 또한 바람직하게 α-헤몰리신 (α-HL)으로부터 유래된다. 야생형 α-HL 포어는 7개의 동일한 단량체 또는 서브유닛으로 형성된다 (즉, 이는 칠량체성을 띤다). α-헤몰리신-NN의 한 단량체 또는 서브유닛의 서열은 서열 4에 제시되어 있다. 막횡단 단백질 포어는 바람직하게 , 각각이 서열 4 또는 그의 변이체에 제시된 서열을 포함하는 것인, 7개의 단량체를 포함한다. 서열 4의 아미노산 1, 7 내지 21, 31 내지 34, 45 내지 51, 63 내지 66, 72, 92 내지 97, 104 내지 111, 124 내지 136, 149 내지 153, 160 내지 164, 173 내지 206, 210 내지 213, 217, 218, 223 내지 228, 236 내지 242, 262 내지 265, 272 내지 274, 287 내지 290 및 294가 루프 영역을 형성한다. 서열 4의 잔기 113 내지 147이 α-HL의 장벽 또는 채널의 압축 수렴부의 일부를 형성한다.
상기 실시양태에서, 각각이 서열 4에 제시된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는, 7개의 단백질 또는 단량체를 포함하는 포어가 바람직하게 본 발명의 방법에서 사용된다. 7개의 단백질은 동일하거나 (동종칠량체) 또는 상이할 수 있다 (이종칠량체).
서열 4의 변이체는 서열 4의 것과는 다른 아미노산 서열을 가지고, 그의 포어를 형성할 수 있는 능력을 유지하는 단백질이다. 포어를 형성할 수 있는 변이체의 능력은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 검정될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 임의의 적절한 서브유닛과 함께 양친매성 층, 예컨대, 지질 이중층 내로 삽입될 수 있고, 올리고머화하여 포어를 형성할 수 있는 그의 능력이 측정될 수 있다. 양친매성 층, 예컨대, 지질 이중층 내로 서브유닛을 삽입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 방법은 상기에서 논의된 바와 같다.
변이체는 헬리카제에의 공유 부착 또는 그와의 상호작용을 촉진시키는 변형을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게 헬리카제에의 부착을 촉진시키는 하나 이상의 반응성 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 서열 4의 8, 9, 17, 18, 19, 44, 45, 50, 51, 237, 239 ? 287번 위치 중 하나 이상에서 및/또는 아미노 또는 카르복시 말단 상에 시스테인을 포함할 수 있다. 바람직한 변이체는 서열 4의 8, 9, 17, 237, 239 및 287번 위치의 잔기를 시스테인으로 치환하는 것 (A8C, T9C, N17C, K237C, S239C 또는 E287C)을 포함한다. 변이체는 바람직하게 국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (공보 WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (공보 WO 2010/004265) 또는 PCT/GB 10/000133 (공보 WO 2010/086603)에 기술된 변이체 중 어느 하나이다.
변이체는 또한 뉴클레오티드와의 임의의 상호작용을 촉진시키는 변형을 포함할 수 있다.
변이체는 유기체에 의해, 예를 들어, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 박테리아에 의해 자연적으로 발현되는, 자연적으로 발생된 변이체일 수 있다. 대안적으로, 변이체는 박테리아에 의해, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 의해 시험관내에서 또는 재조합적으로 발현될 수 있다. 변이체는 또한 재조합 기술에 의해 제조된 비자연적으로 발생된 변이체를 포함한다. 서열 4의 아미노산 서열의 전장에 걸쳐, 변이체는 바람직하게 아미노산 동일성에 기초하여 상기 서열과 50% 이상 상동성일 것이다. 더욱 바람직하게, 변이체 폴리펩티드는 전체 서열에 걸쳐 서열 4의 아미노산 서열과 아미노산 동일성에 기초하여 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 및 더욱 바람직하게, 95%, 97% 또는 99% 이상 상동성일 수 있다. 200개 이상, 예를 들어, 230, 250, 270 또는 280개 또는 그 초과의 것으로 이루어진 스트레치에 걸쳐 80% 이상, 예를 들어, 85%, 90% 또는 95% 이상의 아미노산 동일성을 가질 수 있다 ("엄격한 상동성"). 상동성은 상기 논의된 바와 같이 측정될 수 있다.
상기 논의된 것 이외에도 서열 4의 아미노산 서열에 대하여 아미노산 치환, 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30개 또는 그 초과의 치환이 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 상기 논의된 바와 같이 이루어질 수 있다.
서열 4의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기는 추가로 상기 기술된 폴리펩티드로부터 결실될 수 있다. 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30개 또는 그 초과의 잔기가 결실될 수 있다.
변이체는 서열 4의 단편일 수 있다. 상기 단편은 포어 형성 활성을 유지한다. 단편의 길이는 50, 100, 200 또는 250개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 단편은 바람직하게 서열 4의 포어 형성 도메인을 포함한다. 단편은 전형적으로 서열 4의 잔기 119, 121, 135, 113 및 139를 포함한다.
하나 이상의 아미노산은 대안적으로 또는 추가로 상기 기술된 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 신장부는 서열 4 또는 그의 변이체 또는 단편의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 제공될 수 있다. 신장부는 매우 짧은 단쇄일 수 있고, 예를 들어, 길이는 1 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 대안적으로, 신장부는 더 긴 장쇄일 수 있고, 예를 들어, 최대 50 또는 100개의 아미노산일 수 있다. 캐리어 단백질은 포어 또는 변이체에 융합될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 서열 4의 변이체는 서열 4의 것과는 다른 아미노산 서열을 가지고, 그의 포어를 형성할 수 있는 능력을 갖는 서브유닛이다. 변이체는 전형적으로 포어 형성을 담당하는 서열 4의 영역을 함유한다. β 장벽을 함유하는 α-HL의 포어 형성 능력은 각 서브유닛 중의 β 가닥에 의해 제공된다. 서열 4의 변이체는 전형적으로 β 가닥을 형성하는, 서열 4 중의 영역을 포함한다. β 가닥을 형성하는 서열 4의 아미노산은 상기에서 논의된 바와 같다. 생성된 변이체가 포어를 형성할 수 있는 그의 능력을 유지하는 한, β 가닥을 형성하는, 서열 4 중의 영역에 대하여 하나 이상의 변형이 이루어질 수 있다. 서열 4의 β 가닥 영역에 대하여 이루어질 수 있는 구체적인 변형은 상기에서 논의된 바와 같다.
서열 4의 변이체는 바람직하게 그의 α 나선 및/또는 루프 영역 내에 하나 이상의 변형, 예컨대, 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. α-나선 및 루프를 형성하는 아미노산은 상기 논의되어 있다.
변이체는 상기 논의된 바와 같이 그의 확인 또는 정제를 돕기 위해 변형될 수 있다.
α-HL로부터 유래된 포어는 Msp로부터 유래된 포어를 참조로 하여 상기 논의된 바와 같이 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 막횡단 단백질 포어는 화학적으로 변형된다. 포어는 임의의 방식으로 및 임의의 부위에서 화학적으로 변형될 수 있다. 막횡단 단백질 포어는 바람직하게 분자의 하나 이상의 시스테인 (시스테인 연결부)에의 부착에 의해, 분자의 하나 이상의 리신에의 부착에 의해, 분자의 하나 이상의 비자연 아미노산에의 부착에 의해, 에피토프의 효소적 변형에 의해, 또는 말단 변형에 의해 화학적으로 변형된다. 상기 변형을 수행하는 데 적합한 방법은 관련 기술분야에 주지되어 있다. 막횡단 단백질 포어는 임의의 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 포어는 염료 또는 형광단의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
포어 중 임의 개수의 단량체가 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 단량체는 바람직하게 상기 논의된 바와 같이 화학적으로 변형된다.
시스테인 잔기의 반응성은 인접한 잔기의 변형에 의해 증진될 수 있다. 예를 들어, 측면에 위치하는 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 잔기의 염기성 기는 시스테인 티올 기의 pKa를 반응성이 더 큰 S- 기의 것으로 변화시킬 것이다. 시스테인 잔기의 반응성은 티올 보호기, 예컨대, dTNB에 의해 보호될 수 있다. 이는 링커 부착 이전에 포어의 하나 이상의 시스테인 잔기와 반응할 수 있다.
국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (공보 WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (공보 WO 2010/004265) 또는 PCT/GB10/000133 (공보 WO 2010/086603)에 개시된 바와 같이, (포어가 화학적으로 변형된 것인) 분자는 포어에 직접 부착될 수 있거나, 링커를 통해 부착될 수 있다.
헬리카제는 포어에 공유 부착될 수 있다. 헬리카제는 바람직하게 포어에 공유 부착되지 않는다.
본원에 기술된 단백질 중 임의의 것은 그의 확인 또는 정제를 돕기 위해, 예를 들어, 히스티딘 잔기 (his 태그), 아스파르트산 잔기 (asp 태그), 스트렙트아비딘 태그 또는 플래그 태그, SUMO 태그, GST 태그 또는 MBP 태그의 부가에 의해, 또는 폴리펩티드가 자연적으로 하기 신호 서열을 함유하지 않는 세포로부터 그의 분비를 촉진시키는 신호 서열의 부가에 의해 변형될 수 있다. 유전자 태그를 도입하는 대안은 헬리카제 또는 포어 상의 자연 또는 조작된 위치 상에서 태그를 화학적으로 반응시키는 것이다. 그의 일례는 포어 바깥쪽에서 조작된 시스테인에 대하여 겔 이동 시약을 반응시키는 것이 될 것이다. 이는 헤몰리신 이종올리고머를 분리시키는 방법으로서 입증되었다 (Chem Biol. 1997 Jul; 4(7):497-505).
표적 폴리뉴클레오티드, 헬리카제 또는 포어는 시현 표지로 표지화될 수 있다. 시현 표지는 검출될 수 있는 임의의 적합한 표지일 수 있다. 적합한 표지로는 형광성 분자, 방사성 동위 원소, 예컨대, 125I,35S, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오티드 및 리간드, 예컨대, 비오틴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
단백질은 합성적으로 또는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 시험관내 번역 및 전사 (IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은 비자연적으로 발생된 아미노산을 포함하도록, 또는 단백질의 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 단백질이 합성 수단에 의해 제조될 때, 상기 아미노산은 제조되는 동안 도입될 수 있다. 단백질은 또한 합성 또는 재조합 제조 이후에 변경될 수 있다.
단백질은 또한 D-아미노산을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 포어 또는 헬리카제는 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 관련 기술분야에서 단백질 또는 펩티드를 제조하는 데 있어 통상적인 것이다.
본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 단백질의 기능을 방해하지 않는 한, 다른 비특이 변형을 포함할 수 있다. 다수의 비특이 측쇄 변형이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 단백질(들)의 측쇄에 대해 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 변형으로는 예를 들어, 알데히드와 반응시킨 후, NaBH4로 환원시키는 환원적 알킬화, 메틸아세트이미데이트에 의한 아미딘화 또는 아세트산 무수물에 의해 아실화를 포함한다.
단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야의 표준 방법을 이용하여 유래될 수 있고, 복제될 수 있다. 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야의 표준 기법을 사용하여 박테리아 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 단백질은 재조합 발현 벡터로부터의 폴리펩티드의 계내 발현에 의해 세포에서 제조될 수 있다. 발현 벡터는 임의적으로 폴리펩티드의 발현을 제어하는 유도성 프로모터를 보유한다. 이러한 방법은 문헌 [Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기술되어 있다.
관심 서열을 코딩하는 유전자는 특이 프라이머를 포함하는 PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이어서, 증폭된 서열을 재조합 복제가능한 벡터, 예컨대, 클로닝 벡터 내로 도입할 수 있다. 벡터는 화합성인 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 복제시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 서열은 관심 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터 내로 도입하고, 벡터를 화합성인 숙주 세포 내로 도입하고, 벡터를 복제시키는 조건하에서 숙주 세포를 성장시킴으로써 제조될 수 있다. 벡터를 숙주 세포로부터 회수할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는 데 적합한 숙주 세포는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
폴리뉴클레오티드 서열을 적합한 발현 벡터로 클로닝할 수 있다. 발현 벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 상기 발현 벡터를 사용하여 구축물을 발현시킬 수 있다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 기술된 성분이 그가 의도하는 방식으로 작용할 수 있도록 허용하는 관계에 있는 것인 병렬 배치를 의미한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 화합성인 조건하에서 달성될 수 있도록 하는 방식으로 결찰된다. 다중 카피수의 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드가 벡터 내로 도입될 수 있다.
이어서, 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 구축물은 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 벡터를 화합성인 박테리아 숙주 세포 내로 도입하고, 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키는 조건하에서 숙주 세포를 성장시킴으로써 제조될 수 있다.
벡터는 예를 들어, 복제 기점, 임의적으로 상기 폴리뉴클레오티드 서열 의 발현을 위한 프로모터, 및 임의적으로 프로모터의 조절 인자가 장착된 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자, 예를 들어, 암피실린 저항성 유전자를 하?할 수 있다. 프로모터 및 다른 발현 조절 신호는 발현 벡터의 디자인 대상이 되는 숙주 세포와 화합성인 것으로 선택될 수 있다. T7, trc, lac, ara 또는 λL 프로모터가 전형적으로 사용된다.
숙주 세포는 전형적으로 구축물을 고수준으로 발현한다. 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포를 형질전환시키는 데 사용된 발현 벡터와 화합성인 것으로 선택될 것이다. 숙주 세포는 전형적으로 박테리아 세포 및 바람직하게 E. 콜라이(E. coli) 세포이다. λ DE3 리소겐을 포함하는 임의의 세포, 예를 들어, Rosetta2(DE3)pLys, C41 (DE3), BL21 (DE3), JM109 (DE3), B834 (DE3), TUNER, Origami 및 Origami B가 T7 프로모터를 포함하는 벡터를 발현시킬 수 있다.
단백질은 단백질 생산 유기체로부터 임의의 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 정제 후, 또는 재조합 발현 후에 대규모로 제조될 수 있다. 전형적인 단백질 액체 크로마토그래피 시스템으로는 FPLC, AKTA 시스템, 바이오-캐드(Bio-Cad) 시스템, 바이오-래드 바이오로직(Bio-Rad BioLogic) 시스템 및 길슨(Gilson) HPLC 시스템을 포함한다.
본 발명의 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 측정하는 단계를 포함한다. 본 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 초과의 특징을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 특징은 바람직하게 (i) 표적 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 동일성, (iii) 표적 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 표적 폴리뉴클레오티드의 2차 구조, 및 (v) 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 여부로부터 선택된다. (i) 내지 (v)의 임의 조합이 본 발명에 따라 측정될 수 있다.
(i)의 경우, 표적 폴리뉴클레오티드의 길이는 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드 및 포어 사이의 상호작용 회수, 또는 표적 폴리뉴클레오티드 및 포어 사이의 상호작용 지속 기간을 측정함으로써 측정될 수 있다.
(ii)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 동일성는 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 동일성는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 측정하면서 함께, 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 측정하지 않으면서 측정될 수 있다. 전자의 경우가 간단하다; 폴리뉴클레오티드를 서열분석함으로써 확인한다. 후자는 여러 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 중 특정 모티프의 존재를 (폴리뉴클레오티드의 남은 서열은 측정하지 않고) 측정될 수 있다. 대안적으로, 본 방법에서 특정의 전기 및/또는 광학 신호를 측정함으로써 특정 공급원으로서 기원하는 바, 표적 폴리뉴클레오티드를 확인할 수 있다.
(iii)의 경우, 폴리뉴클레오티드의 서열은 앞서 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 적합한 서열분석 방법, 특히, 전기적 측정을 사용하는 것은 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7], [Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010; 132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO 2000/28312에 기술되어 있다.
(iv)의 경우, 2차 구조는 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 방법인 전기적 측정을 포함할 경우, 2차 구조는 지속 시간 변화 또는 포어를 통해 흐르는 전류의 변화를 사용하여 측정될 수 있다. 이를 통해 단일 가닥 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 영역이 구별될 수 있다.
(v)의 경우, 임의의 변형의 존재 또는 부재가 측정될 수 있다. 본 방법은 바람직하게 하나 이상의 단백질을 이용하여, 또는 하나 이상의 표지, 태그, 또는 스페이서를 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드가 메틸화에 의해, 산화에 의해, 산화에 의해 변형되었는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 특이적인 변형을 통해 포어와의 특이적인 상호작용이 이루어질 것이며, 이는 하기 기술되는 방법을 이용하여 특정될 수 있다. 예를 들어, 메틸시토신은 각 뉴클레오티드와 포어의 상호작용 동안 포어를 통해 흐르는 전류에 기반하여 시토신과 구별될 수 있다.
다양한 상이한 유형의 측정 방식으로 측정될 수 있다. 이는 제한 없이 전기적 측정 및 광학적 측정을 포함한다. 가능한 전기적 측정으로는 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정 (Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12; 11(1):279-85), 및 FET 측정 (국제 출원 WO 2005/124888)을 포함한다. 광학적 측정은 전기적 측정과 조합될 수 있다 (Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81 (1):014301). 측정은 막횡단 전류 측정, 예컨대, 포어를 통해 흐르는 이온 전류 측정일 수 있다.
전기적 측정은 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12; 106(19):7702-7], [Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO-2000/28312에 기술된 바와 같이, 표준 단일 채널 기록 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 전기적 측정은 예를 들어, 국제 출원 WO2009/077734 및 국제 출원 WO-2011/067559에 기술된 바와 같이, 다채널 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
본 방법은 포어가 막에 존재하는 것인 막/포어 시스템을 조사하는 데 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 본 방법은 막횡단 포어 감지에 적합한 임의의 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 장치는 수용액을 포함하는 챔버, 및 챔버를 2개의 섹션으로 분리하는 장벽을 포함한다. 장벽은 전형적으로 포어를 함유하는 막이 형성되는 개구부를 가진다. 대안적으로, 장벽은 포어가 존재하는 막을 형성한다.
본 방법은 국제 출원 번호 PCT/GB08/000562 (WO 2008/102120)에 기술된 장치를 사용하여 수행될 수 있다.
본 방법은 폴리뉴클레오티드가 포어와 관련하여 이동함에 따라 포어를 통과하는 전류를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 그러므로, 장치는 또한 전위를 인가할 수 있고, 막 및 포어를 통과하는 전기 신호를 측정할 수 있는 전기 회로를 포함할 수 있다. 본 방법은 패치 클램프 또는 전압 클램프를 사용하여 수행될 수 있다. 본 방법은 바람직하게 전압 클램프를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드가 포어와 관련하여 이동함에 따라 포어를 통과하는 전류를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 막횡단 단백질 포어를 통과하는 이온 전류를 측정하는 데 적합한 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 실시예에 개시되어 있다. 본 방법은 전형적으로 막 및 포어를 통해 인가되는 전압을 이용하여 수행된다. 사용되는 전압은 전형적으로 +2 V 내지 -2 V, 전형적으로 -400 mV 내지 +400 mV이다. 사용되는 전압은 바람직하게 -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20 mV 및 0 mV로부터 선택되는 하한 및 +10 mV, + 20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV 및 +400 mV로부터 독립적으로 선택되는 상한을 갖는 범위이다. 사용되는 전압은 더욱 바람직하게 100 mV 내지 240 mV 범위이고, 가장 바람직하게는 120 mV 내지 220 mV 범위이다. 인가되는 전위 증가를 사용함으로써 포어에 의한 상이한 뉴클레오티드 사이의 차이를 증가시킬 수 있다.
본 방법은 전형적으로 임의의 전하 캐리어, 예컨대, 금속 염, 예를 들어, 알칼리 금속 염, 할라이드 염, 예를 들어, 클로라이드 염, 예컨대, 알칼리 금속 할라이드 염의 존재 하에 수행된다. 전하 캐리어로는 이온성 액체 또는 유기 염, 예를 들어, 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 트리메틸페닐 암모늄 클로라이드, 페닐트리메틸 암모늄 클로라이드, 또는 1-에틸-3-메틸 이미다졸리움 클로라이드를 포함할 수 있다. 상기 논의된 예시적인 장치에서, 염은 챔버내 수용액 중에 존재한다. 염화칼륨 (KCl), 염화나트륨 (NaCl), 염화세슘 (CsCl) 또는 페로시안화 칼륨 및 페리시안화 칼륨의 혼합물이 전형적으로 사용된다. KCl, NaCl 및 페로시안화 칼륨 및 페리시안화 칼륨의 혼합물이 바람직한다. 염 농도는 포화 상태일 수 있다. 염 농도는 3 M 이하일 수 있고, 전형적으로 0.1 내지 2.5 M, 0.3 내지 1.9M, 0.5 내지 1.8 M, 0.7 내지 1.7 M, 0.9 내지 1.6 M, 또는 1 M 내지 1.4 M이다. 염 농도는 바람직하게 150 mM 내지 1 M이다. Hel308, XPD, RecD, TraI 및 Dda 헬리카제가 놀랍게도 높은 염 농도에서도 작용한다. 본 방법은 바람직하게 0.3 M 이상, 예컨대, 0.4 M 이상, 0.5 M 이상, 0.6 M 이상, 0.8 M 이상, 1.0 M 이상, 1.5 M 이상, 2.0 M 이상, 2.5 M 이상, 또는 3.0 M 이상의 염 농도에서 수행된다. 높은 염 농도는 높은 신호 대 잡음비를 제공하고, 이를 통해 뉴클레오티드의 존재를 나타내는 전류는 정상적인 전류 변동의 배경에 대해 확인될 수 있다.
본 방법은 전형적으로 완충제의 존재 하에 수행된다. 상기 논의된 예시적인 장치에서, 상기 논의된 예시적인 장치에서, 완충제는 챔버내 수용액 중에 존재한다. 임의의 완충제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로, 완충제는 포스페이트 완충제이다. 다른 적합한 완충제는 HEPES 및 트리스(Tris)-HCl 완충제. 본 방법은 전형적으로 pH 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5에서 수행된다. 사용되는 pH는 바람직하게 약 7.5이다.
본 방법은 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있다. 본 방법은 전형적으로 실온에서 수행된다. 본 방법은 임의적으로 헬리카제 기능을 지지하는 온도, 예컨대, 약 37℃에서 수행된다.
본 방법은 유리 뉴클레오티드 또는 유리 뉴클레오티드 유사체 및/또는 헬리카제 작용을 촉진시키는 헬리카제 보조인자의 존재 하에 수행될 수 있다. 본 방법은 또한 유리 뉴클레오티드 또는 유리 뉴클레오티드 유사체의 부재하에서 및 헬리카제 보조인자의 부재하에서 수행될 수 있다. 유리 뉴클레오티드는 하나 이상의, 상기 논의된 개별 뉴클레오티드 중 임의의 것일 수 있다. 유리 뉴클레오티드로는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 구아노신 디포스페이트 (GDP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 티미딘 디포스페이트 (TDP), 티미딘 트리포스페이트 (TTP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 우리딘 디포스페이트 (UDP), 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시티딘 디포스페이트 (CDP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트 (dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트 (dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트 (dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트 (dUDP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP), 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP), 데옥시시티딘 디포스페이트 (dCDP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유리 뉴클레오티드는 바람직하게 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP로부터 선택된다. 유리 뉴클레오티드는 바람직하게 아데노신 트리포스페이트 (ATP)이다. 헬리카제 보조인자는 헬리카제 또는 구축물이 작용할 수 있도록 하는 인자이다. 헬리카제 보조인자는 바람직하게 2가 금속 양이온이다. 2가 금속 양이온은 바람직하게 Mg2 +, Mn2 +, Ca2 + 또는 Co2 +이다. 헬리카제 보조인자는 가장 바람직하게 Mg2 +이다.
하나 이상의 헬리카제의 표적 폴리뉴클레오티드 상에의 로딩을 제어하는 방법
본 발명은 또한 하나 이상의 헬리카제의 표적 폴리뉴클레오티드 상에의 로딩을 제어하는 방법 또한 제공한다. 본 방법은 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공하는 단계를 포함한다. 본 방법은 바람직하게 하나 이상의 스페이서를 포함하도록 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 상기에서 논의된 스페이서 실시양태 모두 본 방법에 동등하게 적용된다.
본 방법은 또한 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 하나 이상의 헬리카제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 하나 이상의 헬리카제가 각 스페이서에서 정지하도록 하는 단계를 포함한다. 스페이서에서 헬리카제가 정지하는 것은 상기 논의된 바와 같이 검정될 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 상기 논의된 바와 같이 임의 개수의 스페이서를 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 2개 이상의 스페이서, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 스페이서를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이 임의 개수의 헬리카제가 각 스페이서에서 정지될 수 있다. 이러한 방식으로, 얼마나 많은 헬리카제가 표적 폴리뉴클레오티드 상의 어느 위치에 로딩되는지 제어할 수 있고, 이로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 특징 규명을 촉진할 수 있다. 상기 논의된 본 방법 중 임의의 것을 사용하여 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시킬 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 하나 이상의 스페이서 S 및 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역 L (L은 로딩 부위에 대한 것임)을 제공받는다. 각 영역 L의 길이는 각 L에 결합하여야 하고, 각 스페이서 S에서 정지되어야 하는 헬리카제의 개수에 의존한다. 하나 이상의 스페이서 S 및 하나 이상의 영역 L은 서로 인접해 있을 수 있거나 (즉, 바로 옆에 있을 수 있거나), 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 일부만큼 이격되어 있을 수 있다. 각 스페이서는 전형적으로 헬리카제 이동 방향으로 각 영역 L의 말단에 또는 그 근처에 위치한다. 예를 들어, 헬리카제가 5'→3' 헬리카제일 경우, 각 스페이서는 전형적으로 각 영역의 3' 말단에 또는 그 근처에 위치하고, 즉, 5'-L-S-3'이다. 헬리카제가 3'→5' 헬리카제일 경우, 각 스페이서는 전형적으로 각 영역의 5' 말단에 또는 그 근처에 위치하고, 즉, 5'-S-L-3'이다.
표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 5'→3' 방향으로 (L-S)n 또는 (S-L)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받는다. 5'→3' 방향은 표적 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 각각이 양 말단에 또는 그 근처에 스페이서 S를 갖는 것인, 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역 L을 제공받으며, 즉, (S-L-S)n을 제공받는다.
바람직한 실시양태에서, 스페이서는 상기 논의된 바와 같이 이중 가닥 영역 D에 인접해 있으며, 즉, 5'→3' 헬리카제 또는 불활성 모드로 사용되는 헬리카제인 경우, 5'-L-S-D-3'이거나, 또는 3'→5' 헬리카제 또는 불활성 모드로 사용되는 헬리카제인 경우, 5'-D-S-L-3'이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 5'→3' 방향으로 (L-S-D)n 또는 (D-S-L)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, D는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드이고, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받는다. L은 D와 동일한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, D와 상이한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. L 및/또는 D는 표적 폴리뉴클레오티드와 동일한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 표적 폴리뉴클레오티드와 상이한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 차단 분자 B는 하나 이상의 헬리카제가 지나 이동하는 말단 반대쪽의 각 스페이서의 말단에 제공되고, 즉, 5'→3' 헬리카제 또는 불활성화 모드로 사용되는 헬리카제인 경우, 5'-B-L-S-3'이거나, 3'→5' 헬리카제인 경우, 5'-S-L-B-3'이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 5'→3' 방향으로 (B-L-S)n 또는 (S-L-B)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, B는 차단 분자이고, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받는다.
가장 바람직한 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 D 및 B, 둘 모두를 제공하고, 즉, 5'→3' 헬리카제 또는 불활성화 모드로 사용되는 헬리카제인 경우, 5'-B-L-S-D-3'이거나, 또는 3'→5' 헬리카제인 경우, 5'-D-S-L-B-3'이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 가장 바람직하게 5'→3' 방향으로 (B-L-S-D)n 또는 (D-S-L-B)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, B는 차단 분자이고, D는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드이고, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받는다.
표적 폴리뉴클레오티드는 임의 개수의 상기 스페이서 함유 유닛을 제공받을 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 (5'-L-S-3')n, (5'-S-L-3')n, (S-L-S)n, (5'-L-S-D-3')n, (5'-D-S-L-3')n, (5'-B-L-S-3')n, (5'-S-L-B-3')n, (5'-B-L-S-D-3')n 또는 (5'-D-S-L-B-3')n (여기서, n은 2 또는 그 초과이고, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과임)을 제공받을 수 있다. 상기 실시양태를 통해 다중의 헬리카제는 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 정지될 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 어댑터를 표적 폴리뉴클레오티드에 결찰시킴으로써 L, S, D 및 B를 참조하여 상기 논의된 실시양태 모두를 제공받을 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 1개의 헬리카제 (즉, 단 1개의 헬리카제)가 각 스페이서에서 정지하도록 한다. 이는 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서 S, 및 각각이 단 1개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는, 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역 L1을 제공함으로써 달성될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 5'→3' 방향으로 (L1-S)n 또는 (S-L1)n (여기서, L1은 단 1개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받는다.
영역 L1의 길이는 헬리카제의 풋프린트에 의존하고, 간단한 방법으로 계산될 수 있다. 영역 L1은 표적 폴리뉴클레오티드의 일부일 수 있거나, 또는 예를 들어, 본 발명의 어댑터의 일부로서 표적 폴리뉴클레오티드에 부가될 수 있다. 영역 L1의 길이는 전형적으로 8, 9, 10, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 하나 이상의 스페이서 S 및 하나 이상의 L1 영역은 서로 인접해 있을 수 있거나 (즉, 바로 옆에 있을 수 있거나), 또는 표적 폴리뉴클레오티드의 일부만큼 이격되어 있을 수 있다. 각 스페이서 S는 전형적으로 헬리카제 이동 방향으로 각 영역 L1의 말단에 또는 그 근처에 위치한다. 예를 들어, 헬리카제가 5'→3' 헬리카제일 경우, 각 스페이서 S는 전형적으로 각 영역 L1의 3' 말단에 또는 그 근처에 위치하고, 즉, 5'-L1-S-3'이다. 헬리카제가 3'→5' 헬리카제일 경우, 각 스페이서 S는 전형적으로 각 영역 L1의 5' 말단에 또는 그 근처에 위치하고, 즉, 5'-S-L1-3'이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 각각이 단 1개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이이고, 각각이 양 말단에 또는 그 근처에 스페이서 S를 갖는 것인, 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역 L1을 제공받으며, 즉, (S-L1-S)n을 제공받는다.
표적 폴리뉴클레오티드는 (5'-L1-S-3')n, (5'-S-L1-3')n, (S-L1-S)n, (5'-L1-S-D-3')n, (5'-D-S-L1-3')n, (5'-B-L1-S-3')n, (5'-S-L1-B-3')n, (5'-B-L1-S-D-3')n 또는 (5'-D-S-L1-B-3')n (여기서, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받을 수 있다. 상기 실시양태를 통해 n개의 헬리카제는 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 정지될 수 있다. 1개의 헬리카제가 각 스페이서에 의해 정지된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 2개의 헬리카제 (즉, 단 2개의 헬리카제)가 각 스페이서에서 정지하도록 한다. 이는 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서 S, 및 각각이 단 2개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는, 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역 L2를 제공함으로써 달성될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 5'→3' 방향으로 (L2-S)n 또는 (S-L2)n (여기서, L은 단 2개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받는다.
영역 L2의 길이는 헬리카제의 풋프린트에 의존하고, 간단한 방법으로 계산될 수 있다. 영역 L2는 표적 폴리뉴클레오티드의 일부일 수 있거나, 또는 예를 들어, 본 발명의 어댑터의 일부로서 표적 폴리뉴클레오티드에 부가될 수 있다. 영역 L2의 길이는 전형적으로 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 뉴클레오티드 길이이다. 하나 이상의 스페이서 S 및 하나 이상의 영역 L2는 서로 인접해 있을 수 있거나 (즉, 바로 옆에 있을 수 있거나), 또는 폴리뉴클레오티드의 일부만큼 이격되어 있을 수 있다. 각 스페이서는 전형적으로 헬리카제 이동 방향으로 각 영역의 말단에 또는 그 근처에 위치한다. 예를 들어, 헬리카제가 5'→3' 헬리카제일 경우, 각 스페이서는 전형적으로 각 영역의 3' 말단에 또는 그 근처에 위치한다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 각각이 단 2개의의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이이고, 각각이 양 말단에 또는 그 근처에 스페이서 S를 갖는 것인, 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역 L2를 제공받으며, 즉, (S-L2-S)n을 제공받는다.
표적 폴리뉴클레오티드는 (5'-L2-S-3')n, (5'-S-L2-3')n, (S-L2-S)n, (5'-L2-S-D-3')n, (5'-D-S-L2-3')n, (5'-B-L2-S-3')n, (5'-S-L2-B-3')n, (5'-B-L2-S-D-3')n 또는 (5'-D-S-L2-B-3')n (n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 제공받을 수 있다. 상기 실시양태를 통해 2n개의 헬리카제는 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 정지될 수 있다. 2개의 헬리카제가 각 스페이서에 의해 정지된다.
각 스페이서에서 정지된 2개의 헬리카제는 바람직하게는 서로 상이한 것이다. 이는 여러 방식으로 제어될 수 있다. 예를 들어, 2개의 상이한 헬리카제는 서로 부착될 수 있고, 예컨대, 서로 공유 부착될 수 있고, 이어서, 각 스페이서에서 정지될 수 있다. 적합한 구축물은 상기에서 논의된 바와 같다. 대안적으로, 차단 폴리뉴클레오티드를 사용하여 확실하게 상이한 헬리카제가 각 스페이서에서 정지되도록 할 수 있다. 본 방법이 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서 S, 및 각각이 단 2개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는, 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역 L2를 제공하는 단계를 포함할 경우, 본 방법은 바람직하게 차단 폴리뉴클레오티드를 각 영역 L2의 부분에 혼성화시켜 각 영역의 남은 (즉, 비차단) 부분이 단 1개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이가 되도록 하는 단계를 포함한다. 차단 폴리뉴클레오티드의 길이는 전형적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 뉴클레오티드 길이이다. 차단 폴리뉴클레오티드는 2개의 헬리카제가 동시에 같은 영역에 결합하지 못하도록 막는다. 차단 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 바람직하게 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 1개의 헬리카제가 각 영역 L2의 남은 (즉, 비차단) 부분에 결합하게 한다. 이어서, 각 헬리카제를 사용하여 차단 폴리뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 하나 이상의 결합된 헬리카제에 바람직하게 유리 뉴클레오티드 및 헬리카제 보조인자를 제공하여 헬리카제가 각 차단 폴리뉴클레오티드를 제거하고, 각 스페이서 S에서 정지할 수 있도록 한다. 이어서, 상기 방법으로 제조된 폴리뉴클레오티드를 바람직하게는, 본 방법에서 먼저 사용된 헬리카제와는 상이한 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 1개의 상이한 헬리카제가 각 영역에 결합하고, 스페이서 및 나머지 다른 정지된 헬리카제에 의해 정지되도록 한다.
본 방법은 바람직하게 (a) 표적 폴리뉴클레오티드에 5'→3' 방향으로 (L2-S)n 또는 (S-L2)n (여기서, L은 단 2개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수임)을 제공하는 단계; (b) 차단 폴리뉴클레오티드를 각 영역 L2의 부분에 혼성화시켜 각 영역 L2의 남은 부분이 단 1개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이가 되도록 하는 단계; (c) (b)에서 제조된 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 1개의 헬리카제가 각 영역 L2의 남은 부분에 결합하도록 하는 단계; (d) (c)의 하나 이상의 결합된 헬리카제에 유리 뉴클레오티드 및 헬리카제 보조인자를 제공하여 헬리카제가 각 차단 폴리뉴클레오티드를 제거하고, 각 스페이서 S에서 정지할 수 있도록 하는 단계; 및 (e) (d)에서 제조된 표적 폴리뉴클레오티드를 (c)에서 사용된 것과 상이한 것인 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 1개의 상이한 헬리카제가 각 영역 L2에 결합하고, 각 스페이서 및 (d)에서 정지된 각 헬리카제에 의해 정지되도록 하는 것인 단계를 포함한다. n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4이다. S 및 L2의 다른 배열, 예컨대, 상기 논의된 바와 같은, (S-L2-S)n, (5'-L2-S-D-3')n, (5'-D-S-L2-3')n, (5'-B-L2-S-3')n, (5'-S-L2-B-3')n, (5'-B-L2-S-D-3')n 및 (5'-D-S-L2-B-3')n 또한 본 실시양태에서 사용될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 스페이서의 길이를 사용하여 정지되는 헬리카제의 개수, 및/또는 스페이서를 지나 이동할 수 있는 헬리카제의 개수를 제어할 수 있다. 보다 긴 장쇄의 스페이서를 사용하여 더 많은 헬리카제를 정지시킬 수 있다. 트레일링 헬리카제가 리딩 헬리카제가 스페이서를 지나도록 인출할 수 있기 때문에, 일련의 2개 이상의 헬리카제, 예컨대, 3, 4 또는 5개의 헬리카제 또한 보다 긴 장쇄의 스페이서를 지나 이동할 수 있다. 상기 L1 및 L2를 참조하여 본 실시양태는 3, 4 또는 5개의 헬리카제가 각 스페이서에서 정지되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 스페이서 S, 및 각각이 단 3개 (L3), 4개 (L4) 또는 5개 (L5)의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는, 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 하나 이상의 비혼성화된 영역을 제공받을 수 있다.
어댑터
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위한 어댑터를 제공한다. 어댑터는 바람직하게 표적 폴리뉴클레오티드의 특징 규명을 위한 것이다. 어댑터는 (a) 5'→3' 방향으로 (L-S-D)n 또는 (D-S-L)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, D는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수임), 및 (b) 각 어댑터 상에서 정지되는 하나 이상의 헬리카제를 포함한다. n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4이다. 5'→3' 방향은 어댑터에서 L 및 D 폴리뉴클레오티드의 방향을 나타낸다.
하나 이상의 헬리카제는 스페이서 S 앞에서, 스페이서 S 옆에서, 또는 스페이서 S 상에서 정지될 수 있다.
어댑터는 표적 폴리뉴클레오티드가 상기 논의된 방법 중 임의의 것에 사용될 수 있도록 표적 폴리뉴클레오티드에 결찰될 수 있다.
L은 상기 논의된 바와 같이 L1 또는 L2일 수 있다. 어댑터는 L1 및 L2의 조합을 포함할 수 있다.
상기에서 논의된 스페이서 실시양태 모두 본 방법에 동등하게 적용된다.
L, S 및 D를 참조하여 상기에서 논의된 본 실시양태 중 임의의 것은 본 발명의 어댑터에 동등하게 적용된다. 어댑터는 5'→3' 방향으로 (5'-L1-S-D-3')n, (5'-D-S-L1-3')n, (5'-B-L1-S-D-3')n 또는 (5'-D-S-L1-B-3')n, (5'-L2-S-D-3')n, (5'-D-S-L2-3')n, (5'-B-L2-S-D-3')n 또는 (5'-D-S-L2-B-3')n (여기서, n은 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과인 정수이고, n은 바람직하게 1, 2, 3 또는 4임)을 포함할 수 있다. L1 또는 L2는 L3, L4 또는 L5로 대체될 수 있다.
가장 바람직하게, n은 1이고, 1 또는 2개의 헬리카제가 어댑터 상에서 정지된다.
키트
본 발명은 또한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 바람직하게 표적 폴리뉴클레오티드의 특징 규명을 위한 것이다. 키트는 (a) 하나 이상의 스페이서, (b) 하나 이상의 헬리카제 및 (c) 막횡단 포어를 포함한다. 본 방법을 참조하여 상기 논의된 스페이서 실시양태 모두 본 발명의 키트에 동등하게 적용된다. 예를 들어, 하나 이상의 스페이서는, 표적 폴리뉴클레오티드에 결찰될 수 있고, 우선적으로 포어로 트레딩하는 리더 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 어댑터, 바람직하게, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 어댑터의 일부일 수 있다. 키트는 상기 논의된 헬리카제 및 포어 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 스페이서 및 하나 이상의 헬리카제는 본 발명의 어댑터의 일부일 수 있다.
키트는 막 성분, 예컨대, 양친매성 층, 예컨대, 지질 이중층을 형성하는 데 필요한 인지질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것을 수행할 수 있게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 시약 또는 장치로는 하기: 적합한 완충제(들) (수용액), 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단 (예컨대, 니들을 포함하는 베쓸 또는 장치), 폴리뉴클레오티드를 증폭 및/또는 발현시키기 위한 수단, 상기 정의된 바와 같은 막 또는 전압 또는 패치 클램프 장치 중 하나 이상의 것을 포함한다. 시약은 유체 샘플이 시약을 재현탁시킬 수 있도록 건식 상태로 키트 중에 존재할 수 있다. 키트는 또한 임의적으로 키트가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있도록 하는 설명서, 또는 본 발명이 어떤 환자를 위해 사용될 수 있는지에 관한 세부 사항을 포함할 수 있다. 키트는 임의적으로 헬리카제 이동을 촉진시키는 데 필요한 성분 (예컨대, ATP 및 Mg2 +)을 포함할 수 있다. 하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 T4 Dda - E94C/A360C (돌연변이 E94C/A360C, 및 이어서, (ΔM1)G1G2를 포함하는 서열 8) 헬리카제가 단일 MspA 나노포어 (MS(B1- G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (MspA - B2C) (돌연변이 G75S/G77S/L88N/Q126R을 포함하는 서열 2))를 통과하는 무손상 DNA 가닥의 이동을 어떻게 제어할 수 있는지를 기술하는 것이다. 람다 DNA 구축물 중 iSpC3 스페이서 (그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (상기 4개의 iSpC3 스페이서는 서열 10의 5' 말단에 부착되어 있고, 상기 서열 10은 3개의 iSpC3 스페이서에 부착되어 있고, 상기 3개의 iSpC3 스페이서는 서열 11에 3' 말단에 부착되어 있고, 상기 구축물의 서열 10 영역은 서열 12에 혼성화된다(서열 12는 그의 3' 말단에 부착되고, 6개의 iSp18 스페이서는 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착되어 있다)))를 사용하여, 구축물이 나노포어에 의해 포획될 때까지 효소를 정지시킨다. 포획시, 인가된 전위력이 효소 T4 Dda - E94C/A360C가 정지 스페이서를 지나도록 이동시키고, 나노포어를 통과하는 람다 구축물의 효소 제어형 DNA 이동을 가능하게 한다.
물질 및 방법
실험을 세팅하기 전, 람다 DNA 구축물 (그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서에 부착되어 있는 서열 9 (상기 4개의 iSpC3 스페이서는 서열 10의 5' 말단에 부착되어 있고, 상기 서열 10은 서열 11에 3' 말단에 부착되어 있고, 상기 구축물의 서열 10 영역은 서열 12에 혼성화된다(서열 12는 3' 콜레스테롤 테더를 가진다))) 및 T4 Dda - E94C/A360C를 함께 완충제 (20 mM CAPS, pH 10.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 2 mM DTT) 중에서 23℃에서 15분 동안 미리 인큐베이션시켰다.
전기적 측정은 (냉각기 플레이트 상에 실험 시스템을 배치함으로써) 20℃에서 완충제 (600 mM KCl, 25 mM 인산칼륨, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8) 중 블록 공중합체에 삽입된 단일 MspA 나노포어 (MspA - B2C)로부터 획득하였다. 블록 공중합체에 삽입된 단일 포어를 수득한 후, 이어서, 완충제 (1 mL, 600 mM KCl, 25 mM 인산칼륨, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)를 시스템을 통해 유동시켜 임의의 과량의 MspA 나노포어 (MspA - B2C)를 제거하고, 최종적으로 실험 완충제 (2 mL 960 mM KCl, 25 mM 인산칼륨, 3 mM 페로시안화 칼륨 (II), 1 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)를 시스템 내로 유동시켰다. MgCl2 (10 mM 최종 농도) 및 ATP (1 mM 최종 농도)를 완충제 (960 mM KCl, 25 mM 인산칼륨, 3 mM 페로시안화 칼륨 (II), 1 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)와 함께 혼합한 후, 람다 DNA 구축물 (0.2 nM 최종 농도), T4 Dda - E94C/A360C (10 nM 최종 농도) 완충제 (20 mM CAPS, pH 10.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 2 mM DTT) 프리 믹스에 첨가하였다. 이어서, 프리 믹스를 단일 나노포어 실험 시스템에 첨가하였다. 전위 플립 프로세스 (2 s 동안 +100 mV, 이어서, 2 s 동안 0 V, 및 이어서, 14,500 s 동안 -120 mV로 시스 측에서 인가) 후 4시간 동안 실험을 수행하고, 헬리카제 제어형 DNA 이동을 모니터링하였다.
결과 및 논의
DNA 구축물은 도 1에 제시되어 있다. T4 Dda - E94C/A360C는 DNA 구축물과 미리 인큐베이션되었을 때 구축물 영역 (A로 표지) (서열 9)에 결합할 수 있다. 그러나, 상기 효소는 유리 용액 중에 존재할 경우에는 정지 기를 지나 이동하지 못한다 (도 1에서 B 및 D로 표지). 그러므로, DNA 구축물이 나노포어에 의해 포획될 때까지 효소는 iSpC3 스페이서 (도 1에서 B로 표지)에서 정지되어 있다. 일단 나노포어에 의해 포획되고 나면, 인가된 전위력은 효소 T4 Dda - E94C/A360C가 정지 스페이서를 지나도록 이동시키고, 나노포어를 통과하는 람다 구축물의 효소 제어형 DNA 이동을 가능하게 한다. 헬리카제 제어형 DNA 이동의 일례가 도 2에 제시되어 있다. 헬리카제 제어형 DNA 이동 기간은 5,170초였고, 이는 나노포어를 통과하는 대략 30 kB의 람다 구축물의 전위에 상응한다. 도 3은 헬리카제 제어형 DNA 이동의 시작점 (a) 및 종점 (b)에 대한 확대된 영역을 보여주는 것이다. 1 및 2는 iSpC3 스페이서가 헬리카제의 제어하에서 나노포어를 통해 전위할 때를 보여주는 것이다.
실시예 2
MuA를 사용하여 람다 DNA를 ~5-10 kB 단편으로 단편화함으로써 본 실시예에서 사용되는 DNA 구축물을 제조하였다. 이어서, 샘플 제조에 의해 제조된 단편을 나노포어를 통해 통과시켰고, 그의 이동은 헬리카제 효소에 의해 제어되었다. 헬리카제는 나노포어를 통해 인가된 전위력에 의해 dsDNA 영역 (여기서, 테더는 구축물에 혼성화된다) 및 스페이서를 지나 이동하였다. 나노포어를 통과하는 마커의 헬리카제 제어형 이동에 의해 형성되는 특징적인 차단 관찰 결과는 샘플 제조 방법이 성공적이었으며, 효소는 도 4(b)에 제시된 바와 같이 정지되었다는 것을 나타내었다. 이는 효소는 정의된 출발점을 가졌고, 나노포어에 의해 포획될 때까지는 dsDNA 영역 (여기서, 테더는 구축물에 혼성화된다) 및 스페이서를 지나 이동하지는 못하였다는 것을 의미하였다.
물질 및 방법
2.1 Y형 및 헤어핀 MuA 기질 형성을 위한 DNA 가닥의 어닐링
하기 표 5에 제시된 바와 같이 Y형 및 헤어핀 MuA 기질을 제조하였다. 이어서, Y형 및 헤어핀 MuA 기질을 형성하기 위해 DNA를 함유하는 샘플 혼합물을 2분 동안 95℃로 가열한 후, 분당 2℃의 비율로 16℃까지로 냉각시켰다. 이를 통해 서열 14 및 15 (여기서, 서열 14는 그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서 유닛만큼 서열 15의 5' 말단에 부착되어 있다)가 서열 19 및 9 (여기서, 서열 19는 그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서 유닛만큼 서열 9의 5' 말단에 부착되어 있다)에 어닐링하여 Y형 MuA 기질을 형성하였고, 서열 19 및 20 (여기서, 서열 19는 그의 3' 말단에서 4개의 iSpC3 스페이서 유닛만큼 서열 15의 5' 말단에 부착되어 있다)의 경우에는 헤어핀 루프 MuA 기질을 형성하였다. 형성된 2개의 MuA 기질의 DNA 기질 디자인은 도 4(a)에 제시되어 있다.
[표 5]
Figure pct00005
2.2 MuA 트랜스포사제를 이용한 DNA 주형 단편화
MuA 트랜스포사제를 이용하여 이중 가닥 람다 DNA (서열 13은 센스 가닥의 서열에 상응한다)를 길이가 대략 5-10 kB인 가닥으로 단편화시켰다. MuA 트랜스포사제는 섹션 3.1에서 어닐링된 MuA 기질 (Y형 및 헤어핀 MuA 기질)을 삽입하였고, 샘플은 하기 표 6에 제시된 바와 같이 제조하였다. 이어서, 샘플을 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 75℃에서 10분 동안 가열하여 불활성화시켰다. 이어서, 퀴아퀵(QIAquick)™ PCR 정제용 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 샘플을 추가로 정제하고, 26 ㎕ 중에서 용리시켰다.
[표 6]
Figure pct00006
2.3 삽입된 MuA 기질을 이용한 단편화된 람다 DNA의 USER 분해
서열 19로부터 dUMP를 제거하기 위해 단계 3.2로부터의 정제된 샘플 부피 1을 USER™ 분해물로 처리하였다. 적절한 부피 및 농도에 대해서는 하기 표 7을 참조할 수 있다. 이어서, 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 얼음 덩어리에서 냉각시켰다.
[표 7]
Figure pct00007
2.4 이중 가닥 람다 DNA 구축물 단편 중 단일 가닥 갭의 수복
이어서, 단일 가닥 갭을 폐쇄하기 위해 USER™ 처리 후에 제조된 샘플 부피 2를 DNA 폴리머라제 및 리가제로 처리하였다. 샘플 부피 3 (적절한 부피 및 농도에 대해서는하기 표 8 참조)을 16℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, EDTA (0.5M, 10 ㎕)를 샘플 부피 3에 첨가하였다. 이어서, 퀴아퀵™ PCR 정제용 키트를 사용하여 각 샘플을 정제하고, 50 ㎕ 물 중에서 용리시켰다. 분취량의 정제된 샘플 (1 ㎕)을 애질런트(Agilent) 12000 칩 상에서 전개시켜 샘플을 정량화하고, 트리스-HCl 및 NaCl (pH 7.5)을 각각 그 농도가 10 mM 및 50 mM이 될 때까지 나머지 샘플에 첨가하였다. 최종적으로, 서열 16 (서열의 3' 말단은 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착된 6개의 iSp18 스페이서를 가진다, 0.5 μM)을 정제된 샘플에 어닐링시켰다.
[표 8]
Figure pct00008
2.5 정제되고, 단편화된 람다 DNA 구축물의 헬리카제 제어형 DNA 이동을 보여주는 전기생리학적 실험
실험을 세팅하기 전, 람다 DNA 구축물 (0.2 nM, MuA 트랜스포사제에 의해 Y형 MuA 기질 및 헤어핀 MuA 기질이 단편의 양단에 부착되어 있는, 5-10 kB의 람다 DNA 단편 (예시적인 구축물에 대해서는 도 4 (b) 참조)) 및 Trwc Cba (서열 9, 1 μM)를 완충제 (50 mM CAPS, pH 10.0 (NaOH를 첨가함으로써 pH를 pH 10.0으로 변경), 100 mM NaCl) 중에서 1시간 동안 함께 미리 인큐베이션시켰다.
전기적 측정은 완충제 (600 mM KCl, 25 mM KH2PO4, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8) 중 블록 공중합체에 삽입된 단일 MspA 나노포어 (MspA - B2C)로부터 획득하였다. 이중층 중에서 단일 포어를 수득한 후, 이어서, 완충제 (1 mL, 600 mM KCl, 25 mM KH2PO4, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)를 시스템을 통해 유동시켜 임의의 과량의 MspA 나노포어 (MspA - B2C)를 제거하고, 8℃로 설정된 냉각기 플레이트 상에 실험 시스템을 배치시킴으로써 시스템 온도가 ~15℃가 되도록 만들었다. MgCl2 (10 mM) 및 dTTP (5 mM)를 함께 완충제 (600 mM KCl, 25 mM KH2PO4, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)와 혼합한 후, 이어서, 람다 DNA 구축물 (0.2 nM), Trwc Cba (서열 9, 1 μM) 완충제 (50 mM CAPS, pH 10.0 (NaOH를 첨가함으로써 pH를 pH 10.0으로 변경), 100 mM NaCl) 프리 믹스에 첨가하였다. 이어서, 프리 믹스를 단일 나노포어 실험 시스템에 첨가하였다. 전위 플립 프로세스 (30 min 동안 +120 mV, 이어서, 2초 동안 -100 mV, 및 이어서, 2초 동안 0 mV) 후 2시간 동안 실험을 수행하고, 헬리카제 제어형 DNA 이동을 모니터링하였다.
2.6 결과 및 논의
람다 DNA 구축물에 대한 헬리카제 제어형 DNA 이동을 관찰하였고, 헬리카제 제어형 DNA 이동의 예는 도 5에 제시되어 있다. 람다 DNA 구축물에 존재하는 iSpC3 스페이서는 도 5에서 번호 1, 2, 및 3으로 강조 표시된 특징적인 차단 수준을 나타내었다. Y형 MuA 기질은 양 가닥에 4개의 iSpC3 스페이서를 가지고, 헤어핀 MuA 기질 또한 4개의 iSpC3 스페이서를 가지는데, 각 iSpC3 스페이서는, 람다 DNA 구축물의 상기 영역이 나노포어를 통해 전위됨에 따라 더 많은 전류가 흐르게 할 수 있다. 샘플이 성공적으로 제조되었다면, 이때 iSpC3 스페이서 이벤트는 람다 DNA 구축물의 시작점, 중간 (센스 및 안티센스 서열 사이의 전이를 표시) 및 종점에서 관찰될 것이다. 도 5는 iSpC3 스페이서 영역에 상응하는 전류 흐름 증가에 대한 3가지 예시를 명확하게 보여준다. 그러므로, 샘플 제조 방법은 도 4 (b)에 제시된 람다 DNA 구축물을 제조하기 위해 람다 DNA 내로 MuA 기질을 효과적으로 도입하였다. 나노포어에 의해 DNA가 포획되었을 때, 효소 (A로 표지)는 나노포어를 통해 인가된 전위력에 의해 dsDNA 영역 (여기서, 테더는 구축물에 혼성화된다) 및 스페이서를 지나 이동한다.
실시예 3
본 실시예에서 사용된 DNA 구축물은 MuA를 이용하여 람다 DNA를 ~5-10 kB 단편으로 단편화시켜 제조하였다. 본 실시예는 실시예 2에 기술된 것과 유사하지만, 본 실시예에서는 트랜스포사제 서열이 이노신을 함유하는 바, 샘플 제조 방법은 상이하다 (상기 기술된 단계 2.3 및 2.4가 필요하지 않다). 효소는 나노포어를 통해 인가된 전위력에 의해 dsDNA 영역 및 스페이서를 지나 이동하였다.
물질 및 방법
3.1 Y형 및 헤어핀 MuA 기질 형성을 위한 DNA 가닥의 어닐링
상기 실시예 2.1에 기술된 바와 같이 Y형 2 및 헤어핀 2 MuA 기질을 제조하였다. 본 실시예에서 사용된 부피, 농도 및 서열은 하기 표 9에 상세히 기술되어 있다. 형성된 2개의 구축물의 DNA 기질 디자인은 도 6 (a)에 제시되어 있다.
[표 9]
Figure pct00009
3.2 MuA 트랜스포사제를 이용한 DNA 주형 단편화
MuA 트랜스포사제를 이용하여 이중 가닥 람다 DNA (서열 13은 센스 가닥의 서열만을 나타낸다)를 길이가 대략 5-10 kB인 가닥으로 단편화시켰다. MuA 트랜스포사제는 섹션 3.1에서 어닐링된 MuA 기질 (Y형 2 및 헤어핀 2 MuA 기질)을 삽입하였다. 섹션 2.2 및 상기 표 6에 기술된 것과 유사한 방법으로 샘플을 제조하였는데, 단, 예외적으로, 사용된 MuA 기질은 Y형 2 및 헤어핀 2 MuA 기질였다. 본 경우에서, 정제된 샘플 X를 20 ㎕ 부피에서 용리시켰다.
3.3 이중 가닥 람다 DNA 구축물 단편에서의 닉 수복
일단 Y형 2 및 헤어핀 2 MuA 기질이 단편화된 람다 DNA 내로 삽입되고 나면, 가닥 중의 닉을 수복시키고, 이노신을 람다 DNA 단편에 결합시켜 완전한 이중 가닥 람다 DNA 단편을 제조하는 것이 필요하다. 한 반응물을 하기 표 10에 기술된 바와 같이 얼음 상에서 조립시켰다. EDTA (10 ㎕, 0.5 M)를 샘플에 첨가하기 전, 샘플을 16℃에서 60 min 동안 인큐베이션시켰다. 생성된 샘플 혼합물을 퀴아퀵™ 정제를 사용하여 정제하고, 50 ㎕ 물 중에서 용리시켰다. 분취량의 정제된 샘플 (1 ㎕)을 애질런트 12000 칩 상에서 전개시켜 샘플을 정량화하고, 트리스-HCl 및 NaCl (pH 7.5)을 각각 그 농도가 10 mM 및 50 mM이 될 때까지 나머지 샘플에 첨가하였다. 최종적으로, 서열 16 (서열의 3' 말단은 2개의 티민 잔기 및 3' 콜레스테롤 TEG에 부착된 6개의 iSp18 스페이서를 가진다, 0.5 μM)을 정제된 람다 DNA 구축물에 어닐링시켰다.
[표 10]
Figure pct00010
3.4 정제되고, 단편화된 람다 DNA 구축물의 헬리카제 제어형 DNA 이동을 보여주는 전기생리학적 실험
실험을 세팅하기 전, 람다 DNA 구축물 (0.2 nM, MuA 트랜스포사제에 의해 Y형 2 및 헤어핀 2 MuA 기질이 단편의 양단에 부착되어 있는, 5-10 kB의 람다 DNA 단편 (예시적인 구축물에 대해서는 도 6 (b) 참조)) 및 Trwc Cba (서열 17, 1 μM)를 완충제 (50 mM CAPS, pH 10.0 (NaOH를 첨가함으로써 pH를 pH 10.0으로 변경), 100 mM NaCl) 중에서 1시간 동안 함께 미리 인큐베이션시켰다.
전기적 측정은 완충제 (600 mM KCl, 25 mM KH2PO4, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8) 중 블록 공중합체에 삽입된 단일 MspA 나노포어 (MspA - B2C)로부터 획득하였다. 이중층 중에서 단일 포어를 수득한 후, 이어서, 완충제 (3 mL, 600 mM KCl, 25 mM KH2PO4, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)를 시스템을 통해 유동시켜 임의의 과량의 MspA 나노포어 (MspA - B2C)를 제거하고, 8℃로 설정된 냉각기 플레이트 상에 실험 시스템을 배치시킴으로써 시스템 온도가 ~15℃가 되도록 만들었다. MgCl2 (10 mM) 및 dTTP (5 mM)를 함께 완충제 (600 mM KCl, 25 mM KH2PO4, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)와 혼합한 후, 이어서, 람다 DNA 구축물 (0.2 nM), Trwc Cba (서열 17, 1 μM) 완충제 (50 mM CAPS, pH 10.0 (NaOH를 첨가함으로써 pH를 pH 10.0으로 변경), 100 mM NaCl) 프리 믹스에 첨가하였다. 이어서, 프리 믹스를 단일 나노포어 실험 시스템에 첨가하였다. 전위 플립 프로세스 (30 min 동안 +120 mV, 이어서, 2초 동안 -100 mV, 및 이어서, 2초 동안 0 mV) 후 2시간 동안 실험을 수행하고, 헬리카제 제어형 DNA 이동을 모니터링하였다.
3.5 결과 및 논의
람다 DNA 구축물에 대한 헬리카제 제어형 DNA 이동을 관찰하였고, 헬리카제 제어형 DNA 이동의 예는 도 7에 제시되어 있다. 람다 DNA 구축물에 존재하는 iSpC3 스페이서는 도 7에서 번호 1-3으로 강조 표시된 특징적인 차단 수준을 나타내었다. Y형 2 MuA 기질은 양 가닥에 4개의 iSpC3 스페이서를 가지고, 헤어핀 2 MuA 기질 또한 4개의 iSpC3 스페이서를 가지는데, 각 iSpC3 스페이서는, 람다 DNA 구축물의 상기 영역이 나노포어를 통해 전위됨에 따라 더 많은 전류가 흐르게 할 수 있다. 샘플이 성공적으로 제조되었다면, 이때 iSpC3 스페이서 이벤트는 람다 DNA 구축물의 시작점, 중간 (센스 및 안티센스 서열 사이의 전이를 표시) 및 종점에서 관찰될 것이다. 도 7은 iSpC3 스페이서 영역에 상응하는 전류 흐름 증가에 대한 3가지 예시를 명확하게 보여준다. 그러므로, 샘플 제조 방법은 도 6 (b)에 제시된 람다 DNA 구축물을 제조하기 위해 람다 DNA 내로 MuA 기질을 효과적으로 도입하였다. 나노포어에 의해 DNA가 포획되었을 때, 효소 (A로 표지)는 나노포어를 통해 인가된 전위력에 의해 dsDNA 영역 (여기서, 테더는 구축물에 혼성화된다) 및 스페이서를 지나 이동한다. Y형 2 및 헤어핀 2 MuA 기질에서 이노신이 사용되기 때문에, 일단 MuA 기질이 삽입되고 나면, 그 모두는 이중 가닥 DNA 구축물 중 닉을 폐쇄시키는 데 필요하였는 바, 샘플 제조 방법의 단계는 축소되었다.
실시예 4
본 실시예는 나노포어를 통한 무손상 DNA 가닥 (마지막의 것이 스페이서 기의 5' 말단에 부착된 추가의 2개의 T를 갖는 것인 28개의 iSpC3 스페이서 유닛은 서열 23의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 24의 5' 말단에 부착된 추가의 4개의 iSpC3 스페이서는 서열 23의 3' 말단에 부착되어 있고, 여기서, 서열 12는 서열 23의 영역에 혼성화된다)의 이동을 제어할 수 있는 TrwC Cba 단량체 (서열 17)의 능력을 TrwC Cba Q276C-3.4 kDa 이량체 (각 단량체 유닛은 돌연변이 Q276C를 포함하는 서열 17을 포함하며, 여기서, 한 단량체 유닛은 3.4 kDa PEG 링커를 사용하여 각 단량체 유닛의 276번 위치를 통해 나머지 다른 한 유닛에 연결되어 있다)의 능력과 비교한다. 본 실시예에서 사용된 DNA 구축물은 도 22에 제시되어 있다 (헬리카제는 B로 표지된 영역에 결합할 수 있다). DNA 구축물이 나노포어에 의해 포획되고 나면, 나노포어를 통한 인가된 전위는 효소가 dsDNA 영역 (여기서, 테더는 구축물에 혼성화된다) 및 스페이서를 지나도록 이동시키고, 헬리카제 제어형 DNA 이동이 관찰된다.
단량체의 헬리카제 제어형 이동을 이량체의 것과 비교하였을 때, 단량체보다 이량체의 경우에 더 큰 비율로 장시간의 지속 헬리카제 제어형 DNA 이동 (장시간의 지속 이동은 주요 집단의 헬리카제 제어형 DNA 이동의 평균치로부터의 표준 편차는 3을 초과하는 것인 헬리카제 제어형 DNA 이동임)이 이루어진 것으로 관찰되었다.
물질 및 방법
실험을 세팅하기 전, DNA (1 nM, 마지막의 것이 스페이서 기의 5' 말단에 부착된 추가의 2개의 T를 갖는 것인 28개의 iSpC3 스페이서 유닛은 서열 23의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 24의 5' 말단에 부착된 추가의 4개의 iSpC3 스페이서는 서열 23의 3' 말단에 부착되어 있고, 여기서, 서열 12는 서열 23에 혼성화된다) 및 효소 (TrwC Cba 단량체 (1 nM, 서열 17) 또는 TrwC Cba Q276C-3.4 kDa 이량체 (0.3 nM, 각 단량체 유닛은 돌연변이 Q276C를 포함하는 서열 17을 포함하고, 여기서, 한 단량체 유닛은 3.4 kDa PEG 링커를 사용하여 각 단량체 유닛의 276번 위치를 통해 나머지 다른 한 유닛에 연결되어 있다))를 >16시간 동안 함께 미리 인큐베이션시켰다.
전기적 측정은 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8) 중 블록 공중합체에 삽입된 단일 MspA 나노포어 MS(G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA (돌연변이 G75S/G77S/L88N/Q126R을 포함하는 서열 2)로부터 획득하였다. MgCl2 (10 mM) 및 dTTP (5 mM)를 완충제 (625 mM KCl, 100 mM Hepes, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)와 함께 혼합한 후, DNA (앞서 기술된 구축물), 효소 프리 믹스 (TrwC Cba 단량체 (1 nM, 서열 17) 또는 TrwC Cba Q276C-3.4 kDa 이량체 (1 nM, 각 단량체 유닛은 돌연변이 Q276C를 포함하는 서열 17을 포함하고, 여기서, 한 단량체 유닛은 3.4 kDa PEG 링커를 사용하여 각 단량체 유닛의 276번 위치를 통해 나머지 다른 한 유닛에 연결되어 있다))에 첨가하였다. 이중층 중에서 단일 포어를 수득한 후, 프리 믹스를 단일 나노포어 실험 시스템에 첨가하였다. +120 mV의 정전위에서 실험을 수행하고, 헬리카제 제어형 DNA 이동을 모니터링하였다.
결과 및 논의
헬리카제 TrwC Cba 단량체 (서열 17) 및 TrwC Cba Q276C-3.4 kDa 이량체 (각 단량체 유닛은 돌연변이 Q276C를 포함하는 서열 17을 포함하고, 여기서, 한 단량체 유닛은 3.4 kDa PEG 링커를 사용하여 각 단량체 유닛의 276번 위치를 통해 나머지 다른 한 유닛에 연결되어 있다)에 대한 헬리카제 제어형 DNA 이동을 관찰하였다. 나노포어에 의한 DNA 구축물 포획시, 헬리카제는 나노포어를 통해 인가된 전위력에 의해 dsDNA 영역 (여기서, 테더는 구축물에 혼성화된다) 및 스페이서를 지나 이동하였고, 헬리카제 제어형 이동이 관찰되었다.
관찰된 헬리카제 제어형 DNA 이동 중 주요 집단은 검출된 이동의 약 95%를 차지하였지만, 적은 비율의 이동은 지속 시간이 유의적으로 더 길었다 (주요 집단의 헬리카제 제어형 DNA 이동의 평균치로부터의 표준 편차는 3을 초과한다). 이와 같이 이동 시간이 길어짐에 따라 데이터 분석은 개선될 수 있다. TrwC Cba Q276C-3.4 kDa 이량체 (1 nM)를 사용하여 DNA 이동을 제어하였을 때, 훨씬 더 높은 비율 (TrwC Cba 단량체의 경우, 5%인 것과 비교하여, TrwC Cba Q276C-3.4 kDa 이량체의 경우, 20%)의 상기와 같이 더욱 긴 지속 시간의 이동 (주요 집단의 헬리카제 제어형 DNA 이동의 평균치로부터의 표준 편차는 3을 초과한다)이 관찰되었다. 이량체 헬리카제를 통해 나노포어 서열분석 시스템에서 개선된 데이터 분석을 수행할 수 있는 바, 이량체 헬리카제를 사용하는 것이 단량체보다 우수한 이점을 제공한다.
실시예 5
본 실시예는 효소 활성을 시험하기 위한 형광 기반 검정법에서 (ATP 및 MgCl2, 둘 모두를 제공받았을 때) Hel308 Mbu (서열 28)의 이동을 정지시키는 데 Sp9 스페이서 유닛이 사용될 수 있다는 것을 예시한다.
물질 및 방법
3개의 상이한 시판용 형광성 기질 (A = (스페이서를 함유하지 않는 대조군 가닥) 서열 25 및 26, B = (단일 Sp9 스페이서를 함유하는 가닥) 그의 3' 말단에서 1개의 Sp9 스페이서에 의해 서열 29의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27, C = (4개의 Sp9를 함유하는 가닥) 그의 3' 말단에서 4개의 Sp9 스페이서에 의해 서열 29의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27)을 사용하여 혼성화된 dsDNA를 치환할 수 있는 Hel308 Mbu (서열 28)의 능력을 검정하였다. FAM 표지된 DNA (형광성 기질을 위해, A = 서열 25, B = 서열 29의 3' 말단에 부착된 1개의 sp9 스페이서에 그의 3' 말단에 의해 부착된 서열 27, C = 서열 29의 3' 말단에 부착된 4개의 sp9 스페이서에 그의 3' 말단에 의해 부착된 서열 27)를, 그의 3' 말단에 블랙-홀 소광제가 부착되어 있는 부분적으로 상보성인 가닥 (서열 26)에 1:1 비율로 (각 가닥 1 uM씩) 400 mM KCl, 100 mM HEPES pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA 중에서 어닐링시켰다. 가닥을 실온에서 30분 동안 어닐링시켰다. 어닐링된 DNA (A = 서열 25 및 26, B = 그의 3' 말단에서 1개의 Sp9 스페이서에 의해 서열 29의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27, C = 그의 3' 말단에서 4개의 Sp9 스페이서에 의해 서열 29의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27)를 400 mM KCl, 100 mM HEPES pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 1 mM ATP (1 uM 포획 DNA (서열 27 또한 존재)) 중에서 50 nM으로 희석시켰다. Hel308 Mbu (서열 28)의 샘플을 400 mM KCl, 100 mM HEPES pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA 중에서 475 nM로 희석시켰다. 이어서, Hel308 Mbu (12 nM)를 400 mM KCl, 100 mM HEPES pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.975 mM ATP (0.975 uM 포획 DNA 또한 존재) 중에서 48.75 nM의 어닐링된 DNA에 대하여 (하기 기술되고, 도 8 및 9에 제시된 바와 같이) 검정하였다.
대조군 가닥 A는 도 8에 제시되어 있으며, 여기서, 1A)에서 형광성 기질 가닥 (48.75 nM 최종)은 3' ssDNA 오버행, 및 40개의 염기로 된 혼성화된 dsDNA 섹션을 가진다. 3' ssDNA 오버행을 함유하는 상단 가닥은 서열 25의 5' 말단에 부착된 카르복시플루오레세인 염기를 가지고, 혼성화된 상보체는 서열 26의 3' 말단에 부착된 블랙-홀 소광제 (BHQ-1) 염기를 가진다. 혼성화되면, 플루오레세인으로부터의 형광은 국소 BHQ-1에 의해 소광되고, 기질은 본질적으로 비형광성이 된다. 형광성 기질의 하단 가닥과 부분적으로 상보적인, 1 μM의 포획 가닥 (서열 27)이 본 검정에 포함된다. 2A)에 제시된 바와 같이, ATP (0.975 mM) 및 MgCl2 (10 mM)의 존재하에서, 기질에 첨가된 헬리카제 (12 nM)는 형광성 기질의 3' 꼬리에 결합하여 상단 가닥을 따라 이동하여 상보성 가닥을 치환시킨다. 3A)에 제시된 바와 같이, 일단 BHQ-1을 포함하는 상보성 가닥이 완전하게 치환되고 나면, 주요 가닥 상의 플루오레세인은 형광을 발한다. 4A)에 제시된 바와 같이, 치환된 가닥은 과량의 포획 가닥에 우선적으로 어닐링하여 초기 기질의 재어닐링 및 형광 손실을 막는다. 도 9는 가닥 B (1B-3B) 및 C (1C-3C)에 대한 검정 단계를 보여주는 것으로서, 이들 가닥의 경우, Sp9 스페이서는 헬리카제를 정지시키고, 헬리카제가, 플루오레세인이 부착된 가닥을 블랙-홀 소광제가 부착되어 있는 가닥으로부터 분리시키지 못하도록 막는다.
결과 및 논의
도 10의 그래프는 400 mM의 KCl에서 Hel308 Mbu (도 8 및 9에서 A로 표지; 서열 28)에 대한 완충제 용액 (100 mM Hepes pH 8.0, 0.975 mM ATP, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 48.75 nM 형광성 기질 DNA (상기 논의된 기질 A, B 및 C), 0.975 μM 포획 DNA (서열 27)) 중에서의 활성의 초기 속도를 보여주는 것이다. 조사된 염 농도에서, Hel308 Mbu (서열 28)는 대조군 가닥 A의 dsDNA 교체를 보였다. 그러나, 도 10은 서열 (B (1개의 Sp9 스페이서) 및 C (4개의 Sp9 스페이서))에 Sp9 스페이서를 갖는 2개의 구축물 모두, dsDNA 교체는 폐기되었다는 것을 명확하게 나타낸다. 이는 ATP 및 MgCl2의 존재 하에 Sp9 스페이서가 유리 용액 중에서 Hel308 Mbu 효소를 정지시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 6
본 실시예는 효소 활성을 시험하기 위한 형광 기반 검정법에서 (ATP 및 MgCl2, 둘 모두를 제공받았을 때) Hel308 Mbu (서열 28)의 이동을 정지시키는 데 idSp 기가 사용될 수 있다는 것을 예시한다.
물질 및 방법
4개의 상이한 시판용 형광성 기질 (D = (스페이서를 함유하지 않는 대조군 가닥) 서열 32 및 26, E = (단일 idSp 스페이서를 함유하는 가닥) 그의 3' 말단에서 1개의 idSp 기에 의해 서열 30의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27, F = (4개의 idSp를 함유하는 가닥) 그의 3' 말단에서 4개의 idSp 기에 의해 서열 31의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27 및 G = (스페이서를 함유하지 않는 제2 대조군 가닥) 서열 33 및 26)을 사용하여 혼성화된 dsDNA를 치환할 수 있는 Hel308 Mbu (서열 28)의 능력을 검정하였다. FAM 표지된 DNA (형광성 기질을 위해, D - 서열 32, E = 서열 30의 3' 말단에 부착된 1개의 idSp 기에 그의 3' 말단에 의해 부착된 서열 27, F = 서열 31의 3' 말단에 부착된 4개의 idSp 기에 그의 3' 말단에 의해 부착된 서열 27 및 G = 서열 33)를, 그의 3' 말단에 블랙-홀 소광제가 부착되어 있는 부분적으로 상보성인 가닥 (서열 26)에 1:1.2 비율로 (1:1.2 μM) 400 mM KCl, 100 mM HEPES pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA 중에서 어닐링시켰다. 가닥을 실온에서 15분 동안 어닐링시켰다. 어닐링된 DNA (D = 서열 32 및 26, E = 그의 3' 말단에서 1개의 idSp 기에 의해 서열 30의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27, F = 그의 3' 말단에서 4개의 idSp 기에 의해 서열 31의 5' 말단에 부착되어 있고, 서열 26에 혼성화되는 서열 27 및 G = 서열 33 및 26)를 400 mM KCl, 100 mM HEPES pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 1 mM ATP (1 uM 포획 DNA (서열 27 또한 존재)) 중에서 50 nM으로 희석시켰다. 이어서, Hel308 Mbu (12 nM)를 400 mM KCl, 100 mM HEPES pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.975 mM ATP (0.975 uM 포획 DNA 또한 존재) 중에서 48.75 nM의 어닐링된 DNA에 대하여 (실시예 5에 기술된 바와 같이 (단, 예외적으로, DNA 구축물은 상이하고, Sp9 스페이서 대신 idSp 기를 함유한다), 및 도 8 및 9에 제시된 바와 같이 (또한, 본 도면에서 Sp9 기는 idSp 기로 대체된다)) 검정하였다.
결과 및 논의
도 11의 그래프는 400 mM의 KCl에서 Hel308 Mbu (도 8 및 9에서 A로 표지)에 대한 완충제 용액 (100 mM Hepes pH 8.0, 0.975 mM ATP, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 48.75 nM 형광성 기질 DNA (상기 논의된 기질 D, E, F 및 G), 0.975 μM 포획 DNA (서열 27)) 중에서의 활성의 초기 속도를 보여주는 것이다. 조사된 염 농도에서, Hel308 Mbu (서열 28)는 대조군 가닥 D 및 G의 dsDNA 교체를 보였다. 그러나, 도 11은 서열 (F)에 4개의 idSp 스페이서를 갖는 구축물의 경우, dsDNA 교체는 폐기되었다는 것을 명확하게 나타낸다. 이는 ATP 및 MgCl2의 존재 하에 4개의 idSp 기가 유리 용액 중에서 Hel308 Mbu 효소를 정지시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 7
본 실시예는 T4 Dda - E94C/A360C의 이동을 정지시킬 수 있는 iSpC3 스페이서 및 iSp18 스페이서의 능력을 측정하는 데 사용된 겔 기반 검정법을 예시하는 것이다.
물질 및 방법
어닐링된 DNA 복합체 (시험된 서열은 하기 표 11에 제시되어 있다)를 25 mM 포스페이트 (pH 8.0), 200 mM KCl 중 T4 Dda - E94C/A360C와 (1:1, v/v)의 비로 혼합하여 최종 농도의 T4 Dda - E94C/A360C (2,000 nM) 및 DNA (100 nM)를 수득하였다. 헬리카제를 주변 온도에서 2시간 동안 DNA에 결합하게 하였다. 포획 가닥 (서열 37, 20 μM)을 각 샘플에 첨가하여 임의의 비결합 효소에 결합시키고, 샘플을 주변 온도에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 완충제를 샘플에 첨가하고 (하기 표 11로부터의 DNA 구축물 = 50 nM, 포획 DNA (서열 37) = 10 μM 및 T4 Dda - E94C/A360C = 1,000 nM), 주변 온도에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다 (완충제 1 = 25 mM 포스페이트 (pH 8.0), 200 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM ATP 또는 완충제 2 = 25 mM 포스페이트 (pH 8.0), 1 M KCl, 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), 75 mM 페로시안화 칼륨, 20 mM MgCl2, 10 mM ATP). 로딩 완충제 (25 mM 포스페이트 (pH 8.0), 151.5 mM KCl, 25% 글리세롤, 125 mM EDTA)를 각 샘플에 첨가하여 헬리카제 활성을 켄칭시켰다. 샘플을 4-20% TBE 겔 상에 로딩하고, 겔을 1.5시간 동안 160 V에서 전개시켰다. 이어서, DNA 밴드를 관찰하기 위해 겔을 SYBR 골드로 염색시켰다.
[표 11]
Figure pct00011
결과 및 논의
도 12는, DNA 구축물이 헬리카제 (T4 Dda - E94C/A360C)를 정지시키는 스페이서를 함유하지 않는 양성 대조군 실험의 겔을 보여주는 것이다. 도 14의 레인 2는 최대 5개의 헬리카제 효소가 서열 34의 단일 가닥 섹션 상에 결합할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. ATP 및 MgCl2 첨가시, 다중 효소에 결합한 dsDNA 구축물에 상응하는 더 높은 고역 밴드는 소실되었고, ssDNA 구축물에 상응하는 밴드 (X로 표시 및 단 서열 34에 상응)는 강도가 증가하였다. 이는 헬리카제가 연료를 받았을 때에는 DNA를 따라 이동하여 혼성화된 상보성 가닥 (서열 35)을 치환한다는 것을 나타낸다.
도 15는 표 11의 DNA 구축물 7-9 (예컨대, 예컨대, ssDNA/dsDNA 연접부 바로 앞에 3, 4, 또는 5개의 iSp18 스페이서를 갖는 DNA)에 대한 효소 활성 실험을 보여주는 겔 실시예를 보여주는 것이다. 레인 1-4는 3개의 iSp18 스페이서에 상응하고, 레인 5-7은 4개의 iSp18 스페이서에 상응하고, 레인 9-12는 5개의 iSp18 스페이서에 상응한다. 레인 2, 6 및 10은 대조군과 유사하게, 최대 5개의 헬리카제 효소가 표 11의 DNA 구축물 7-9의 단일 가닥 섹션에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. ATP 및 MgCl2 첨가시, 헬리카제는 DNA 가닥을 따라 이동하기 위해 필요한 성분을 제공받을 것이다. 레인 3-4, 7-8 및 11-12는 ATP 및 MgCl2 첨가 첨가 후 상이한 2가지 완충제 조건 (완충제 1 및 2) 하에서의 다양한 DNA 구축물을 보여주는 것이다. 1Y 및 1X로 표지된 영역에서 2개의 밴드가 뚜렷이 보인다. 1Y는 1개의 헬리카제가 정지되어 있고, 결합되어 있는 dsDNA 구축물에 상응한다. 이는 3, 4, 및 5개의 iSP18 스페이서가 시험된 조건하에서 헬리카제를 정지시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 1X는 1개의 헬리카제가 정지되어 있고, 결합되어 있는 ssDNA 구축물에 상응한다. 상기 밴드는 DNA 구축물에 결합하는 다중 헬리카제, 및 앞쪽 헬리카제가 정지 기를 지나도록 인출하여 짧은 단쇄 상보성 가닥 (서열 35)을 치환하도록 하는 헬리카제로부터 생성된 결과이다. 그러나, 단일 헬리카제는 iSp18 스페이서를 지나 이동할 수 없는 바, 상기 밴드는 여전히 1개의 헬리카제가 결합되어 있는 것이다 (예컨대, 도 13 결과에서 종 E). 헬리카제를 정지시키는 데 4 및 5개의 iSp18 스페이서가 사용된 경우, 2Y 수준에 희미한 밴드가 존재한다. 이는 시험된 조건하에서 4/5개의 iSp18 스페이서가 사용되었을 때, 최대 2개의 헬리카제의 이동을 정지시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
1개 이상의 시험된 완충제 조건에서 조사된 다른 스페이서 조합 (표 11의 엔트리 2-6) 중 iSpC3 및 iSp18 스페이서, 둘 모두 1개의 헬리카제를 정지시킬 수 있었다. 시험된 2가지 완충제 조건 중에서 일반적으로는 완충제 1보다는 완충제 2의 경우에 더욱 효율적으로 정지된 것이 관찰되었다. 포함된 스페이서 개수가 많을수록, 시험된 조건하에서 헬리카제는 더욱 효율적으로 정지되었다.
실시예 8
본 실시예는 특정 영역에서 단 1개 또는 2개의 T4 Dda - E94C/A360C 헬리카제의 결합을 제어하는 데 필요한 염기의 개수를 조사한다.
물질 및 방법
하기 표 12에 상세하게 기술된 DNA 구축물 (1 μM 또는 100 nM 최종 농도)을 적절한 완충제 중에서 일련으로 희석된 T4 Dda - E94C/A360C와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 4-20% TBE 겔 상에 로딩하고, 90분 동안 160 V에서 전개시켰다. 이어서, 엔트리 1-6을 함유하는 겔을 SYBR로 염색시켰다. 도 16은 본 실험에서 사용된 DNA 구축물의 유형을 보여주는 것이다. 1로 표지된 영역의 길이는 DNA에 결합할 수 있는 T4 Dda - E94C/A360C 헬리카제의 개수를 제어할 수 있도록 조건을 최적화하기 위해 2 내지 50으로 가변된다.
[표 12]
Figure pct00012
Figure pct00013
결과 및 논의
2개의 염기 내지 50개의 염기로 가변된 영역 1 (도 16에 제시)에 몇개의 효소가 결합할 수 있는지 측정하기 위해 표 12에 열거되어 있는 각 DNA 구축물을 조사하였다. 시험된 각 DNA 구축물의 경우, 헬리카제가 첨가되지 않았을 때에는 오직 DNA에 비결합인 것에 대한 단일 밴드만이 관찰되었다. 조사된 조건하에서, (2개의 티민 염기로 이루어진 결합 영역을 가지는) 구축물 4 및 (4개의 티민 염기로 이루어진 결합 영역을 가지는) 구축물 5는 어느 농도에서도 임의의 헬리카제의 결합을 허용하지 않는 것으로 관찰되었다 (하기 표 14 참조). 구축물 6 (8개의 티민 염기로 이루어진 결합 영역을 갖는 것, 하기 표 14 참조) 및 (10개의 티민 염기로 이루어진 결합 영역을 가지는) 구축물 1은 오직 1개의 헬리카제만 결합하는 것으로 관찰되었다 (하기 표 13 참조). 20개의 티민 염기로 이루어진 결합 영역을 갖는 구축물 2는 시험된 더 높은 농도에서도 2개의 효소가 결합할 수 있게 하였고, 50개의 티민 염기로 이루어진 결합 영역을 갖는 구축물 3은 시험된 최고 농도에서 최대 6개까지의 효소가 결합할 수 있게 하였다 (본 실험을 보여주는 겔에 대해서는 도 17을 참조, 하기 표 13 참조). 구축물 1-6은 ssDNA/dsDNA 영역의 연접부에 헬리카제가 결합하지 못하도록 막는 데 iSpC3 스페이서를 사용하였다. 구축물 7 및 8은 ssDNA/dsDNA 영역의 연접부에 헬리카제가 결합하지 못하도록 막는 데 iSp18 스페이서를 사용하였다. (16개의 티민으로 이루어진 결합 영역을 가지는) 구축물 7 및 (18개의 티민으로 이루어진 결합 영역을 가지는) 구축물 8, 둘 모두 시험된 조건하에서 최대 2개까지의 헬리카제가 결합할 수 있게 하였다 (하기 표 15 참조). 그러므로, 길이가 8개 초과의 티민 염기 길이인 결합 영역을 통해서는 1개 이상의 효소가 DNA 구축물에 결합할 수 있다.
[표 13]
Figure pct00014
[표 14]
Figure pct00015
[표 15]
Figure pct00016
실시예 9
본 실시예는 (도 18에서 기술되고, 그에 제시된) DNA 구축물 X에 부가되었을 때, 2개의 헬리카제가 결합하도록 하는 T4 Dda - E94C/A360C 헬리카제의 농도를 조사한다.
물질 및 방법
포크형이 아닌 DNA의 상보성을 갖는 것 하나 (도 18에 제시된 바와 같이 서열 42는 DNA 구축물에 혼성화된다)와, 포크형인 것 하나 (도 18에 제시된 바와 같이 (6개의 iSp18 스페이서가 3' 말단에 부착되어 있는) 서열 12는 DNA 구축물에 혼성화된다)인, 2개의 DNA 구축물을 시험하였다. 하기 표 16에 제시된 DNA는 가닥을 25 mM 포스페이트 (pH 8.0), 1,515.5 mM KCl 중에서 1 μM로 어닐링하였다 (10% 과량의 상보성 가닥 서열 43 (하기에서 엔트리 9 및 10) 및 서열 12 (하기에서 엔트리 10) 또는 서열 42 (하기에서 엔트리 9)를 사용하였다).
[표 16]
Figure pct00017
T4 Dda - E94C/A360C를 25 mM 포스페이트 (pH 8.0), 151.5 mM KCl로 완충제 교환하고, 일련으로 희석시켰다. 이어서, 헬리카제 및 DNA (1:1, v/v)를 상기 기술된 DNA 구축물 샘플 9 및 10과 함께 혼합하였다 (DNA 최종 농도A = 100 nM, 조사된 헬리카제 농도 = 3,800 nM, 1,900 nM, 950 nM, 475 nM, 238 nM, 0 nM). 이어서, DNA 및 효소 부피를 주변 온도에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 염료 무함유 로딩 완충제 (5x, 7.5 ㎕)를 각 샘플 (30 ㎕)에 첨가하였다. 이어서, 샘플 (37.5 ㎕)을 4-20% TBE 겔 상에 로딩하고, 90분 동안 160 V에서 전개시켰다. 이어서, 겔을 SYBR로 염색시켰다.
결과 및 논의
표 16에 열거된 2개의 DNA 구축물을 조사하여 2개의 헬리카제의 결합을 촉진시키기 위해서는 어느 농도의 T4 Dda - E94C/A360C 헬리카제가 필요한지를 측정하였다. 시험된 각 DNA 구축물의 경우, 헬리카제가 첨가되지 않았을 때에는 오직 DNA에 비결합인 것에 대한 단일 밴드만이 관찰되었다. 조사된 조건하에서, 구축물 9 (비포크형 구축물) 및 10 (포크형), 둘 모두 238 nM 헬리카제로부터 한 헬리카제에, 및 475 nM 이상으로부터 2개의 효소의 결합이 관찰되었다. 효소 농도가 증가함에 따라, 2개의 효소 결합에 상응하는 밴드의 강도는 증가하였다. 도 18에 제시된 DNA 구축물의 디자인을 통해 3,800 nM만큼 높은 농도에서 단 2개의 효소가 결합할 수 있다. 그러므로, 구축물이 미리 인큐베이션된 때에는 조사된 스페이서에 의해서는 헬리카제가 그에 결합할 수 없다.
실시예 10
본 실시예는 구축물 (DNA 구축물 X1)이 나노포어에 의해 포획되었을 때, T4 Dda - E94C/A360C가 유리 용액 중 4개의 iSp18 스페이서에 의해 어떻게 정지되는지를 보여준다. 포획시, 인가된 전위력이 효소 T4 Dda - E94C/A360C가 정지 스페이서를 지나도록 이동시키고, 나노포어를 통과하는 람다 구축물의 효소 제어형 DNA 이동을 가능하게 한다.
물질 및 방법
실험을 세팅하기 전, DNA 구축물 X1 (0.13 ㎕, 100 nM) 및 T4 Dda - E94C/A360C (15.6 ㎕, 250 nM)를 함께 완충제 (50 mM 인산칼륨, 253 mM KCl, pH 8.0) 중에서 실온에서 1시간 동안 미리 인큐베이션시켰다.
전기적 측정은 (냉각기 플레이트 상에 실험 시스템을 배치함으로써) 30℃에서 완충제 (600 mM KCl, 25 mM 인산칼륨, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8) 중 블록 공중합체에 삽입된 단일 MspA 나노포어 (MspA - B2C)로부터 획득하였다. 블록 공중합체에 삽입된 단일 포어를 수득한 후, 이어서, 완충제 (1 mL, 600 mM KCl, 25 mM 인산칼륨, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)를 시스템을 통해 유동시켜 임의의 과량의 MspA 나노포어 (MspA - B2C)를 제거하였다. 페리시안화 칼륨 (III) (200 μM 최종 농도)을 DNA (0.1 nM 최종 농도) 효소 (3 nM 최종 농도) 프리 믹스에 첨가하고, 1분 동안 방치하여 인큐베이션시킨 후, MgCl2 (10 mM 최종 농도) 및 ATP (1 mM 최종 농도)를 함께 완충제 (1,260 ㎕, 600 mM KCl, 25 mM 인산칼륨, 75 mM 페로시안화 칼륨 (II), 25 mM 페리시안화 칼륨 (III), pH 8)와 혼합하였다. 이어서, 상기 실험 믹스를 단일 나노포어 실험 시스템에 첨가하였다. 전위 플립 프로세스 (2 s 동안 +180 mV, 이어서, 2 s 동안 0 V, 및 이어서, 3,600 s 동안 -120 mV로 시스 측에서 인가(x6회 반복)) 후 6시간 동안 실험을 수행하고, 헬리카제 제어형 DNA 이동을 모니터링하였다.
결과 및 논의
DNA 구축물은 도 20에 제시되어 있다. T4 Dda - E94C/A360C는 DNA 구축물과 미리 인큐베이션되었을 때 구축물 영역 (A로 표지) (서열 9)에 결합할 수 있다. 그러나, 상기 효소는 유리 용액 중에 존재할 경우에는 정지 기 (4개의 iSp18 스페이서)를 지나 이동하지 못한다 (검은색 박스로 표지). 그러므로, DNA 구축물이 나노포어에 의해 포획될 때까지 효소는 iSp18 스페이서 (도 1에서 B로 표지)에서 정지되어 있다. 일단 나노포어에 의해 포획되고 나면, 인가된 전위력은 효소 T4 Dda - E94C/A360C가 정지 스페이서 (4개의 iSp18 스페이서)를 지나도록 이동시키고, 나노포어를 통과하는 DNA 구축물 X1 구축물의 효소 제어형 DNA 이동을 가능하게 한다. 헬리카제 제어형 DNA 이동의 일례가 도 21에 제시되어 있다. 1로 표지된 섹션은 서열 38의 pT 영역이 헬리카제의 제어하에 나노포어를 통해 전위되었을 때를 나타낸 것이다. 2로 표지된 섹션은 iSp18 스페이서가 헬리카제의 제어하에 나노포어를 통해 전위되었을 때를 나타낸 것이다. 관찰된 헬리카제 이벤트는 헬리카제 제어형 DNA 이동 시작점에서 pT 영역 및 iSp18 신호를 보였는 바, 헬리카제는 (iSp18 스페이서에 의한 헬리카제의 정지로부터 생성되는) 정의된 출발점을 갖는 것으로 관찰되었다.
SEQUENCE LISTING <110> OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES LIMITED <120> ENZYME STALLING METHOD <130> N402011WO <150> 61/774,694 <151> 2013-03-08 <150> 1314695.6 <151> 2013-08-16 <150> 1318464.3 <151> 2013-10-18 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding the MS-B1 mutant MspA monomer <400> 1 atgggtctgg ataatgaact gagcctggtg gacggtcaag atcgtaccct gacggtgcaa 60 caatgggata cctttctgaa tggcgttttt ccgctggatc gtaatcgcct gacccgtgaa 120 tggtttcatt ccggtcgcgc aaaatatatc gtcgcaggcc cgggtgctga cgaattcgaa 180 ggcacgctgg aactgggtta tcagattggc tttccgtggt cactgggcgt tggtatcaac 240 ttctcgtaca ccacgccgaa tattctgatc aacaatggta acattaccgc accgccgttt 300 ggcctgaaca gcgtgattac gccgaacctg tttccgggtg ttagcatctc tgcccgtctg 360 ggcaatggtc cgggcattca agaagtggca acctttagtg tgcgcgtttc cggcgctaaa 420 ggcggtgtcg cggtgtctaa cgcccacggt accgttacgg gcgcggccgg cggtgtcctg 480 ctgcgtccgt tcgcgcgcct gattgcctct accggcgaca gcgttacgac ctatggcgaa 540 ccgtggaata tgaactaa 558 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the mature form of the MS-B1 mutant of the MspA monomer <400> 2 Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu 1 5 10 15 Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp 20 25 30 Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr 35 40 45 Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu 50 55 60 Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asn Asn Gly Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly 100 105 110 Val Ser Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val 115 120 125 Ala Thr Phe Ser Val Arg Val Ser Gly Ala Lys Gly Gly Val Ala Val 130 135 140 Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu 145 150 155 160 Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr 165 170 175 Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn 180 <210> 3 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence encoding one monomer of alpha-hemolysin-E111N/K147N <400> 3 atggcagatt ctgatattaa tattaaaacc ggtactacag atattggaag caatactaca 60 gtaaaaacag gtgatttagt cacttatgat aaagaaaatg gcatgcacaa aaaagtattt 120 tatagtttta tcgatgataa aaatcacaat aaaaaactgc tagttattag aacaaaaggt 180 accattgctg gtcaatatag agtttatagc gaagaaggtg ctaacaaaag tggtttagcc 240 tggccttcag cctttaaggt acagttgcaa ctacctgata atgaagtagc tcaaatatct 300 gattactatc caagaaattc gattgataca aaaaactata tgagtacttt aacttatgga 360 ttcaacggta atgttactgg tgatgataca ggaaaaattg gcggccttat tggtgcaaat 420 gtttcgattg gtcatacact gaactatgtt caacctgatt tcaaaacaat tttagagagc 480 ccaactgata aaaaagtagg ctggaaagtg atatttaaca atatggtgaa tcaaaattgg 540 ggaccatacg atcgagattc ttggaacccg gtatatggca atcaactttt catgaaaact 600 agaaatggtt ctatgaaagc agcagataac ttccttgatc ctaacaaagc aagttctcta 660 ttatcttcag ggttttcacc agacttcgct acagttatta ctatggatag aaaagcatcc 720 aaacaacaaa caaatataga tgtaatatac gaacgagttc gtgatgatta ccaattgcat 780 tggacttcaa caaattggaa aggtaccaat actaaagata aatggacaga tcgttcttca 840 gaaagatata aaatcgattg ggaaaaagaa gaaatgacaa attaa 885 <210> 4 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of one monomer of alpha-HL-NN <400> 4 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala 85 90 95 Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Asn Tyr 100 105 110 Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp 115 120 125 Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His 130 135 140 Thr Leu Asn Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro 145 150 155 160 Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn 165 170 175 Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp 195 200 205 Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe 210 215 220 Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys 225 230 235 240 Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr 245 250 255 Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp 260 265 270 Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys 275 280 285 Glu Glu Met Thr Asn 290 <210> 5 <211> 184 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 5 Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu 1 5 10 15 Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp 20 25 30 Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr 35 40 45 Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu 50 55 60 Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala 85 90 95 Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly 100 105 110 Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val 115 120 125 Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val 130 135 140 Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu 145 150 155 160 Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr 165 170 175 Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn 180 <210> 6 <211> 184 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 6 Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu 1 5 10 15 Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp 20 25 30 Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr 35 40 45 Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu 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Ile Glu Ala Glu Tyr 290 295 300 Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Arg Gly Val Pro Gly Glu Tyr Leu Ile 305 310 315 320 Arg His Trp Asp Leu Thr Val Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Tyr Tyr 325 330 335 Arg Glu Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ser Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Phe 340 345 350 Asn Leu Phe Leu Gly Lys Thr Ala Glu Thr Tyr Lys Asn Trp Asn Lys 355 360 365 Gly Gly Lys Ala Pro Trp Ser Asp Phe Trp Asp Ala Lys Ser Gln Phe 370 375 380 Ser Lys Val Lys Ala Leu Pro Ala Ser Thr Phe His Lys Ala Gln Gly 385 390 395 400 Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala 405 410 415 Asp Val Glu Leu Ala Gln Gln Leu Leu Tyr Val Gly Val Thr Arg Gly 420 425 430 Arg Tyr Asp Val Phe Tyr Val 435 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 1, 2, 3, 7 and 8 <400> 9 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 50 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 1 and 9 <400> 10 ggttgtttct gttggtgctg atattgc 27 <210> 11 <211> 97138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 1 <400> 11 gctccactaa agggccgatt gacgggcggc gacctcgcgg gttttcgcta tttatgaaaa 60 ttttccggtt taaggcgttt ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt tatttaaaat 120 accctctgaa aagaaaggaa acgacaggtg ctgaaagcga ggctttttgg cctctgtcgt 180 ttcctttctc tgtttttgtc cgtggaatga acaatggaag tcaacaaaaa gcagctggct 240 gacattttcg gtgcgagtat ccgtaccatt cagaactggc aggaacaggg aatgcccgtt 300 ctgcgaggcg gtggcaaggg taatgaggtg ctttatgact ctgccgccgt cataaaatgg 360 tatgccgaaa gggatgctga aattgagaac gaaaagctgc gccgggaggt tgaagaactg 420 cggcaggcca gcgaggcaga tctccagcca ggaactattg agtacgaacg ccatcgactt 480 acgcgtgcgc aggccgacgc acaggaactg aagaatgcca gagactccgc tgaagtggtg 540 gaaaccgcat tctgtacttt cgtgctgtcg cggatcgcag gtgaaattgc cagtattctc 600 gacgggctcc ccctgtcggt gcagcggcgt tttccggaac tggaaaaccg acatgttgat 660 ttcctgaaac gggatatcat caaagccatg aacaaagcag ccgcgctgga tgaactgata 720 ccggggttgc tgagtgaata tatcgaacag tcaggttaac aggctgcggc attttgtccg 780 cgccgggctt cgctcactgt tcaggccgga gccacagacc gccgttgaat gggcggatgc 840 taattactat ctcccgaaag aatccgcata ccaggaaggg cgctgggaaa cactgccctt 900 tcagcgggcc atcatgaatg cgatgggcag cgactacatc cgtgaggtga atgtggtgaa 960 gtctgcccgt gtcggttatt ccaaaatgct gctgggtgtt tatgcctact ttatagagca 1020 taagcagcgc aacaccctta tctggttgcc gacggatggt gatgccgaga actttatgaa 1080 aacccacgtt gagccgacta ttcgtgatat tccgtcgctg ctggcgctgg ccccgtggta 1140 tggcaaaaag caccgggata acacgctcac catgaagcgt ttcactaatg ggcgtggctt 1200 ctggtgcctg ggcggtaaag cggcaaaaaa ctaccgtgaa aagtcggtgg atgtggcggg 1260 ttatgatgaa cttgctgctt ttgatgatga tattgaacag gaaggctctc cgacgttcct 1320 gggtgacaag cgtattgaag gctcggtctg gccaaagtcc atccgtggct ccacgccaaa 1380 agtgagaggc acctgtcaga ttgagcgtgc agccagtgaa tccccgcatt ttatgcgttt 1440 tcatgttgcc tgcccgcatt gcggggagga gcagtatctt aaatttggcg acaaagagac 1500 gccgtttggc ctcaaatgga cgccggatga cccctccagc gtgttttatc tctgcgagca 1560 taatgcctgc gtcatccgcc agcaggagct ggactttact gatgcccgtt atatctgcga 1620 aaagaccggg atctggaccc gtgatggcat tctctggttt tcgtcatccg gtgaagagat 1680 tgagccacct gacagtgtga cctttcacat ctggacagcg tacagcccgt tcaccacctg 1740 ggtgcagatt gtcaaagact ggatgaaaac gaaaggggat acgggaaaac gtaaaacctt 1800 cgtaaacacc acgctcggtg agacgtggga ggcgaaaatt ggcgaacgtc cggatgctga 1860 agtgatggca gagcggaaag agcattattc agcgcccgtt cctgaccgtg tggcttacct 1920 gaccgccggt atcgactccc agctggaccg ctacgaaatg cgcgtatggg gatgggggcc 1980 gggtgaggaa agctggctga ttgaccggca gattattatg ggccgccacg acgatgaaca 2040 gacgctgctg cgtgtggatg aggccatcaa taaaacctat acccgccgga atggtgcaga 2100 aatgtcgata tcccgtatct gctgggatac tggcgggatt gacccgacca ttgtgtatga 2160 acgctcgaaa aaacatgggc tgttccgggt gatccccatt aaaggggcat ccgtctacgg 2220 aaagccggtg gccagcatgc cacgtaagcg aaacaaaaac ggggtttacc ttaccgaaat 2280 cggtacggat accgcgaaag agcagattta taaccgcttc acactgacgc cggaagggga 2340 tgaaccgctt cccggtgccg ttcacttccc gaataacccg gatatttttg atctgaccga 2400 agcgcagcag ctgactgctg aagagcaggt cgaaaaatgg gtggatggca ggaaaaaaat 2460 actgtgggac agcaaaaagc gacgcaatga ggcactcgac tgcttcgttt atgcgctggc 2520 ggcgctgcgc atcagtattt cccgctggca gctggatctc agtgcgctgc tggcgagcct 2580 gcaggaagag gatggtgcag caaccaacaa gaaaacactg gcagattacg cccgtgcctt 2640 atccggagag gatgaatgac gcgacaggaa gaacttgccg ctgcccgtgc ggcactgcat 2700 gacctgatga caggtaaacg ggtggcaaca gtacagaaag acggacgaag ggtggagttt 2760 acggccactt ccgtgtctga cctgaaaaaa tatattgcag agctggaagt gcagaccggc 2820 atgacacagc gacgcagggg acctgcagga ttttatgtat gaaaacgccc accattccca 2880 cccttctggg gccggacggc atgacatcgc tgcgcgaata tgccggttat cacggcggtg 2940 gcagcggatt tggagggcag ttgcggtcgt ggaacccacc gagtgaaagt gtggatgcag 3000 ccctgttgcc caactttacc cgtggcaatg cccgcgcaga cgatctggta cgcaataacg 3060 gctatgccgc caacgccatc cagctgcatc aggatcatat cgtcgggtct tttttccggc 3120 tcagtcatcg cccaagctgg cgctatctgg gcatcgggga ggaagaagcc cgtgcctttt 3180 cccgcgaggt tgaagcggca tggaaagagt ttgccgagga tgactgctgc tgcattgacg 3240 ttgagcgaaa acgcacgttt accatgatga ttcgggaagg tgtggccatg cacgccttta 3300 acggtgaact gttcgttcag gccacctggg ataccagttc gtcgcggctt ttccggacac 3360 agttccggat ggtcagcccg aagcgcatca gcaacccgaa caataccggc gacagccgga 3420 actgccgtgc cggtgtgcag attaatgaca gcggtgcggc gctgggatat tacgtcagcg 3480 aggacgggta tcctggctgg atgccgcaga aatggacatg gataccccgt gagttacccg 3540 gcgggcgcgc ctcgttcatt cacgtttttg aacccgtgga ggacgggcag actcgcggtg 3600 caaatgtgtt ttacagcgtg atggagcaga tgaagatgct cgacacgctg cagaacacgc 3660 agctgcagag cgccattgtg aaggcgatgt atgccgccac cattgagagt gagctggata 3720 cgcagtcagc gatggatttt attctgggcg cgaacagtca ggagcagcgg gaaaggctga 3780 ccggctggat tggtgaaatt gccgcgtatt acgccgcagc gccggtccgg ctgggaggcg 3840 caaaagtacc gcacctgatg ccgggtgact cactgaacct gcagacggct caggatacgg 3900 ataacggcta ctccgtgttt gagcagtcac tgctgcggta tatcgctgcc gggctgggtg 3960 tctcgtatga gcagctttcc cggaattacg cccagatgag ctactccacg gcacgggcca 4020 gtgcgaacga gtcgtgggcg tactttatgg ggcggcgaaa attcgtcgca tcccgtcagg 4080 cgagccagat gtttctgtgc tggctggaag aggccatcgt tcgccgcgtg gtgacgttac 4140 cttcaaaagc gcgcttcagt tttcaggaag cccgcagtgc ctgggggaac tgcgactgga 4200 taggctccgg tcgtatggcc atcgatggtc tgaaagaagt tcaggaagcg gtgatgctga 4260 tagaagccgg actgagtacc tacgagaaag agtgcgcaaa acgcggtgac gactatcagg 4320 aaatttttgc ccagcaggtc cgtgaaacga tggagcgccg tgcagccggt cttaaaccgc 4380 ccgcctgggc ggctgcagca tttgaatccg ggctgcgaca atcaacagag gaggagaaga 4440 gtgacagcag agctgcgtaa tctcccgcat attgccagca tggcctttaa tgagccgctg 4500 atgcttgaac ccgcctatgc gcgggttttc ttttgtgcgc ttgcaggcca gcttgggatc 4560 agcagcctga cggatgcggt gtccggcgac agcctgactg cccaggaggc actcgcgacg 4620 ctggcattat ccggtgatga tgacggacca cgacaggccc gcagttatca ggtcatgaac 4680 ggcatcgccg tgctgccggt gtccggcacg ctggtcagcc ggacgcgggc gctgcagccg 4740 tactcgggga tgaccggtta caacggcatt atcgcccgtc tgcaacaggc tgccagcgat 4800 ccgatggtgg acggcattct gctcgatatg gacacgcccg gcgggatggt ggcgggggca 4860 tttgactgcg ctgacatcat cgcccgtgtg cgtgacataa aaccggtatg ggcgcttgcc 4920 aacgacatga actgcagtgc aggtcagttg cttgccagtg ccgcctcccg gcgtctggtc 4980 acgcagaccg cccggacagg ctccatcggc gtcatgatgg ctcacagtaa ttacggtgct 5040 gcgctggaga aacagggtgt ggaaatcacg ctgatttaca gcggcagcca taaggtggat 5100 ggcaacccct acagccatct tccggatgac gtccgggaga cactgcagtc ccggatggac 5160 gcaacccgcc agatgtttgc gcagaaggtg tcggcatata ccggcctgtc cgtgcaggtt 5220 gtgctggata ccgaggctgc agtgtacagc ggtcaggagg ccattgatgc cggactggct 5280 gatgaacttg ttaacagcac cgatgcgatc accgtcatgc gtgatgcact ggatgcacgt 5340 aaatcccgtc tctcaggagg gcgaatgacc aaagagactc aatcaacaac tgtttcagcc 5400 actgcttcgc aggctgacgt tactgacgtg gtgccagcga cggagggcga gaacgccagc 5460 gcggcgcagc cggacgtgaa cgcgcagatc accgcagcgg ttgcggcaga aaacagccgc 5520 attatgggga tcctcaactg tgaggaggct cacggacgcg aagaacaggc acgcgtgctg 5580 gcagaaaccc ccggtatgac cgtgaaaacg gcccgccgca ttctggccgc agcaccacag 5640 agtgcacagg cgcgcagtga cactgcgctg gatcgtctga tgcagggggc accggcaccg 5700 ctggctgcag gtaacccggc atctgatgcc gttaacgatt tgctgaacac accagtgtaa 5760 gggatgttta tgacgagcaa agaaaccttt acccattacc agccgcaggg caacagtgac 5820 ccggctcata ccgcaaccgc gcccggcgga ttgagtgcga aagcgcctgc aatgaccccg 5880 ctgatgctgg acacctccag ccgtaagctg gttgcgtggg atggcaccac cgacggtgct 5940 gccgttggca ttcttgcggt tgctgctgac cagaccagca ccacgctgac gttctacaag 6000 tccggcacgt tccgttatga ggatgtgctc tggccggagg ctgccagcga cgagacgaaa 6060 aaacggaccg cgtttgccgg aacggcaatc agcatcgttt aactttaccc ttcatcacta 6120 aaggccgcct gtgcggcttt ttttacggga tttttttatg tcgatgtaca caaccgccca 6180 actgctggcg gcaaatgagc agaaatttaa gtttgatccg ctgtttctgc gtctcttttt 6240 ccgtgagagc tatcccttca ccacggagaa agtctatctc tcacaaattc cgggactggt 6300 aaacatggcg ctgtacgttt cgccgattgt ttccggtgag gttatccgtt cccgtggcgg 6360 ctccacctct gaatttacgc cgggatatgt caagccgaag catgaagtga atccgcagat 6420 gaccctgcgt cgcctgccgg atgaagatcc gcagaatctg gcggacccgg cttaccgccg 6480 ccgtcgcatc atcatgcaga acatgcgtga cgaagagctg gccattgctc aggtcgaaga 6540 gatgcaggca gtttctgccg tgcttaaggg caaatacacc atgaccggtg aagccttcga 6600 tccggttgag 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tcggcccttt agtggagc 97138 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 1 and 9 <400> 12 gcaatatcag caccaacaga aacaacct 28 <210> 13 <211> 48502 <212> DNA <213> Enterobacteria phage lambda <400> 13 gggcggcgac ctcgcgggtt ttcgctattt atgaaaattt tccggtttaa ggcgtttccg 60 ttcttcttcg tcataactta atgtttttat ttaaaatacc ctctgaaaag aaaggaaacg 120 acaggtgctg aaagcgaggc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt 180 ggaatgaaca atggaagtca acaaaaagca gctggctgac attttcggtg cgagtatccg 240 taccattcag aactggcagg aacagggaat gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa 300 tgaggtgctt tatgactctg ccgccgtcat aaaatggtat gccgaaaggg atgctgaaat 360 tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga agaactgcgg caggccagcg aggcagatct 420 ccagccagga actattgagt acgaacgcca tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca 480 ggaactgaag aatgccagag actccgctga agtggtggaa accgcattct gtactttcgt 540 gctgtcgcgg atcgcaggtg aaattgccag tattctcgac gggctccccc tgtcggtgca 600 gcggcgtttt ccggaactgg aaaaccgaca tgttgatttc 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acaatatcgt cctgttcgga gggaagaacg cgggatgttc attcttcatc 48120 acttttaatt gatgtatatg ctctcttttc tgacgttagt ctccgacggc aggcttcaat 48180 gacccaggct gagaaattcc cggacccttt ttgctcaaga gcgatgttaa tttgttcaat 48240 catttggtta ggaaagcgga tgttgcgggt tgttgttctg cgggttctgt tcttcgttga 48300 catgaggttg ccccgtattc agtgtcgctg atttgtattg tctgaagttg tttttacgtt 48360 aagttgatgc agatcaatta atacgatacc tgcgtcataa ttgattattt gacgtggttt 48420 gatggcctcc acgcacgttg tgatatgtag atgataatca ttatcacttt acgggtcctt 48480 tccggtgatc cgacaggtta cg 48502 <210> 14 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 2 and 3 <400> 14 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ggttgtttct 60 gttggtgctg atattgc 77 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 2 and 3 <400> 15 gttttcgcat ttatcgtgaa acgctttcgc gtttttcgtg cgccgcttca 50 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 2 and 3 <400> 16 gcaatatcag caccaacaga aacaacctt 29 <210> 17 <211> 970 <212> PRT <213> Citromicrobium bathyomarinum <400> 17 Met Leu Ser Val Ala Asn Val Arg Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Tyr Ala Ser Ala Asp Ala Asp Arg Ser Gly 20 25 30 Gln Trp Ile Gly Asp Gly Ala Lys Arg Leu Gly Leu Glu Gly Lys Val 35 40 45 Glu Ala Arg Ala Phe Asp Ala Leu Leu Arg Gly Glu Leu Pro Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Val Gly Asn Pro Gly Gln Ala His Arg Pro Gly Thr Asp Leu 65 70 75 80 Thr Phe Ser Val Pro Lys Ser Trp Ser Leu Leu Ala Leu Val Gly Lys 85 90 95 Asp Glu Arg Ile Ile Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Val Val Glu Ala Leu 100 105 110 His Trp Ala Glu Lys Asn Ala Ala Glu Thr Arg Val Val Glu Lys Gly 115 120 125 Met Val Val Thr Gln Ala Thr Gly Asn Leu Ala Ile Gly Leu Phe Gln 130 135 140 His Asp Thr Asn Arg Asn Gln Glu Pro Asn Leu His Phe His Ala Val 145 150 155 160 Ile Ala Asn Val Thr Gln Gly Lys Asp Gly Lys Trp Arg Thr Leu Lys 165 170 175 Asn Asp Arg Leu Trp Gln Leu Asn Thr Thr Leu Asn Ser Ile Ala Met 180 185 190 Ala Arg Phe Arg Val Ala Val Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Pro Gly Pro 195 200 205 Val Leu Lys His Gly Asn Phe Glu Ala Arg Gly Ile Ser Arg Glu Gln 210 215 220 Val Met Ala Phe Ser Thr Arg Arg Lys Glu Val Leu Glu Ala Arg Arg 225 230 235 240 Gly Pro Gly Leu Asp Ala Gly Arg Ile Ala Ala Leu Asp Thr Arg Ala 245 250 255 Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asp Arg Ala Thr Leu Ser Lys Gln Trp Ser 260 265 270 Glu Ala Ala Gln Ser Ile Gly Leu Asp Leu Lys Pro Leu Val Asp Arg 275 280 285 Ala Arg Thr Lys Ala Leu Gly Gln Gly Met Glu Ala Thr Arg Ile Gly 290 295 300 Ser Leu Val Glu Arg Gly Arg Ala Trp Leu Ser Arg Phe Ala Ala His 305 310 315 320 Val Arg Gly Asp Pro Ala Asp Pro Leu Val Pro Pro Ser Val Leu Lys 325 330 335 Gln Asp Arg Gln Thr Ile Ala Ala Ala Gln Ala Val Ala Ser Ala Val 340 345 350 Arg His Leu Ser Gln Arg Glu Ala Ala Phe Glu Arg Thr Ala Leu Tyr 355 360 365 Lys Ala Ala Leu Asp Phe Gly Leu Pro Thr Thr Ile Ala Asp Val Glu 370 375 380 Lys Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Ser Gly Asp Leu Ile Ala Gly Lys 385 390 395 400 Gly Glu His Lys Gly Trp Leu Ala Ser Arg Asp Ala Val Val Thr Glu 405 410 415 Gln Arg Ile Leu Ser Glu Val Ala Ala Gly Lys Gly Asp Ser Ser Pro 420 425 430 Ala Ile Thr Pro Gln Lys Ala Ala Ala Ser Val Gln Ala Ala Ala Leu 435 440 445 Thr Gly Gln Gly Phe Arg Leu Asn Glu Gly Gln Leu Ala Ala Ala Arg 450 455 460 Leu Ile Leu Ile Ser Lys Asp Arg Thr Ile Ala Val Gln Gly Ile Ala 465 470 475 480 Gly Ala Gly Lys Ser Ser Val Leu Lys Pro Val Ala Glu Val Leu Arg 485 490 495 Asp Glu Gly His Pro Val Ile Gly Leu Ala Ile Gln Asn Thr Leu Val 500 505 510 Gln Met Leu Glu Arg Asp Thr Gly Ile Gly Ser Gln Thr Leu Ala Arg 515 520 525 Phe Leu Gly Gly Trp Asn Lys Leu Leu Asp Asp Pro Gly Asn Val Ala 530 535 540 Leu Arg Ala Glu Ala Gln Ala Ser Leu Lys Asp His Val Leu Val Leu 545 550 555 560 Asp Glu Ala Ser Met Val Ser Asn Glu Asp Lys Glu Lys Leu Val Arg 565 570 575 Leu Ala Asn Leu Ala Gly Val His Arg Leu Val Leu Ile Gly Asp Arg 580 585 590 Lys Gln Leu Gly Ala Val Asp Ala Gly Lys Pro Phe Ala Leu Leu Gln 595 600 605 Arg Ala Gly Ile Ala Arg Ala Glu Met Ala Thr Asn Leu Arg Ala Arg 610 615 620 Asp Pro Val Val Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Gly Asp Val 625 630 635 640 Arg Lys Ala Leu Arg His Leu Lys Ser His Thr Val Glu Ala Arg Gly 645 650 655 Asp Gly Ala Gln Val Ala Ala Glu Thr Trp Leu Ala Leu Asp Lys Glu 660 665 670 Thr Arg Ala Arg Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Gly Arg Ala Ile Arg Ser 675 680 685 Ala Val Asn Ala Ala Val Gln Gln Gly Leu Leu Ala Ser Arg Glu Ile 690 695 700 Gly Pro Ala Lys Met Lys Leu Glu Val Leu Asp Arg Val Asn Thr Thr 705 710 715 720 Arg Glu Glu Leu Arg His Leu Pro Ala Tyr Arg Ala Gly Arg Val Leu 725 730 735 Glu Val Ser Arg Lys Gln Gln Ala Leu Gly Leu Phe Ile Gly Glu Tyr 740 745 750 Arg Val Ile Gly Gln Asp Arg Lys Gly Lys Leu Val Glu Val Glu Asp 755 760 765 Lys Arg Gly Lys Arg Phe Arg Phe Asp Pro Ala Arg Ile Arg Ala Gly 770 775 780 Lys Gly Asp Asp Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Arg Lys Leu Glu Ile 785 790 795 800 His Glu Gly Asp Arg Ile Arg Trp Thr Arg Asn Asp His Arg Arg Gly 805 810 815 Leu Phe Asn Ala Asp Gln Ala Arg Val Val Glu Ile Ala Asn Gly Lys 820 825 830 Val Thr Phe Glu Thr Ser Lys Gly Asp Leu Val Glu Leu Lys Lys Asp 835 840 845 Asp Pro Met Leu Lys Arg Ile Asp Leu Ala Tyr Ala Leu Asn Val His 850 855 860 Met Ala Gln Gly Leu Thr Ser Asp Arg Gly Ile Ala Val Met Asp Ser 865 870 875 880 Arg Glu Arg Asn Leu Ser Asn Gln Lys Thr Phe Leu Val Thr Val Thr 885 890 895 Arg Leu Arg Asp His Leu Thr Leu Val Val Asp Ser Ala Asp Lys Leu 900 905 910 Gly Ala Ala Val Ala Arg Asn Lys Gly Glu Lys Ala Ser Ala Ile Glu 915 920 925 Val Thr Gly Ser Val Lys Pro Thr Ala Thr Lys Gly Ser Gly Val Asp 930 935 940 Gln Pro Lys Ser Val Glu Ala Asn Lys Ala Glu Lys Glu Leu Thr Arg 945 950 955 960 Ser Lys Ser Lys Thr Leu Asp Phe Gly Ile 965 970 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(5) <223> n is I <400> 18 nnnnntgaag cggcgcacga aaaacgcgaa agcgtttcac gataaatgcg aaaac 55 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 2 <400> 19 gatcugaagc ggcgcacgaa aaacgcgaaa gcgtttcacg ataaatgcga aaac 54 <210> 20 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 2 <400> 20 gaagcggcgc acgaaaaacg cgaaagcgtt tcacgataaa tgcgaaaac 49 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 4 <400> 23 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttggtt gtttctgttg 60 gtgctgatat tgc 73 <210> 24 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucelotide sequence used in Example 9 <400> 24 gccatcagat tgtgtttgtt agtcgctttt tttttttgga attttttttt tggaattttt 60 tttttgacgc tcagtaatgt gacgatagct gaaaactgta cgataaacgg tacgctgagg 120 gcggaaaaaa tcgtcgggga cattgtaaag gcggcgagcg cggcttttcc gcgccagcgt 180 gaaagcagtg tggactggcc gtcaggtacc cgtactgtca ccgtgaccga tgaccatcct 240 tttgatcgcc agatagtggt gcttccgctg acgtttcgcg gaagtaagcg tactgtcagc 300 ggcaggacaa cgtattcgat gtgttatctg aaagtactga tgaacggtgc ggtgatttat 360 gatggcgcgg cgaacgaggc ggtacaggtg ttctcccgta ttgttgacat gccagcgggt 420 cggggaaacg tgatcctgac gttcacgctt acgtccacac ggcattcggc agatattccg 480 ccgtatacgt ttgccagcga tgtgcaggtt atggtgatta agaaacaggc gctgggcatc 540 agcgtggtct gagtgtgaaa aaaaaggtac caaaaaaaac atcgtcgtga gtagtgaacc 600 gtaagc 606 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 5 <400> 25 ctattctgtt tatgtttctt gtttgttagc cctattctgt cccccccccc accccccccc 60 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 5 and 6 <400> 26 acagaatagg gctaacaaac aagaaacata aacagaatag 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 5 and 6 <400> 27 ctattctgtt tatgtttctt gtttgttagc cctattctgt 40 <210> 28 <211> 760 <212> PRT <213> Methanococcoides burtonii <400> 28 Met Met Ile Arg Glu Leu Asp Ile Pro Arg Asp Ile Ile Gly Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Asp Ser Gly Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Ile 20 25 30 Glu Met Gly Leu Leu Glu Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ala Ile Pro Thr 35 40 45 Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Leu Ala Met Ile Lys Ala Ile 50 55 60 Arg Glu Gly Gly Lys Ala Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala 65 70 75 80 Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ala Pro Phe Gly Ile Lys 85 90 95 Val Gly Ile Ser Thr Gly Asp Leu Asp Ser Arg Ala Asp Trp Leu Gly 100 105 110 Val Asn Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu 115 120 125 Arg Asn Gly Thr Ser Trp Met Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Val Asp 130 135 140 Glu Ile His Leu Leu Asp Ser Lys Asn Arg Gly Pro Thr Leu Glu Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Lys Leu Met Arg Leu Asn Pro Asp Val Gln Val Val Ala 165 170 175 Leu Ser Ala Thr Val Gly Asn Ala Arg Glu Met Ala Asp Trp Leu Gly 180 185 190 Ala Ala Leu Val Leu Ser Glu Trp Arg Pro Thr Asp Leu His Glu Gly 195 200 205 Val Leu Phe Gly Asp Ala Ile Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Lys Ile 210 215 220 Asp Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Asp Thr Ile 225 230 235 240 Lys Ala Glu Gly Gln Cys Leu Val Phe Glu Ser Ser Arg Arg Asn Cys 245 250 255 Ala Gly Phe Ala Lys Thr Ala Ser Ser Lys Val Ala Lys Ile Leu Asp 260 265 270 Asn Asp Ile Met Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ala Glu Glu Val Glu Ser 275 280 285 Thr Gly Glu Thr Asp Thr Ala Ile Val Leu Ala Asn Cys Ile Arg Lys 290 295 300 Gly Val Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn Ser Asn His Arg Lys Leu 305 310 315 320 Val Glu Asn Gly Phe Arg Gln Asn Leu Ile Lys Val Ile Ser Ser Thr 325 330 335 Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile 340 345 350 Arg Ser Tyr Arg Arg Phe Asp Ser Asn Phe Gly Met Gln Pro Ile Pro 355 360 365 Val Leu Glu Tyr Lys Gln Met Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu 370 375 380 Asp Pro Tyr Gly Glu Ser Val Leu Leu Ala Lys Thr Tyr Asp Glu Phe 385 390 395 400 Ala Gln Leu Met Glu Asn Tyr Val Glu Ala Asp Ala Glu Asp Ile Trp 405 410 415 Ser Lys Leu Gly Thr Glu Asn Ala Leu Arg Thr His Val Leu Ser Thr 420 425 430 Ile Val Asn Gly Phe Ala Ser Thr Arg Gln Glu Leu Phe Asp Phe Phe 435 440 445 Gly Ala Thr Phe Phe Ala Tyr Gln Gln Asp Lys Trp Met Leu Glu Glu 450 455 460 Val Ile Asn Asp Cys Leu Glu Phe Leu Ile Asp Lys Ala Met Val Ser 465 470 475 480 Glu Thr Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ser Lys Leu Phe Leu Arg Gly Thr 485 490 495 Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Met Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Ser Gly 500 505 510 Ser Lys Ile Val Asp Gly Phe Lys Asp Ile Gly Lys Ser Thr Gly Gly 515 520 525 Asn Met Gly Ser Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asp Asp Ile Thr Val Thr 530 535 540 Asp Met Thr Leu Leu His Leu Val Cys Ser Thr Pro Asp Met Arg Gln 545 550 555 560 Leu Tyr Leu Arg Asn Thr Asp Tyr Thr Ile Val Asn Glu Tyr Ile Val 565 570 575 Ala His Ser Asp Glu Phe His Glu Ile Pro Asp Lys Leu Lys Glu Thr 580 585 590 Asp Tyr Glu Trp Phe Met Gly Glu Val Lys Thr Ala Met Leu Leu Glu 595 600 605 Glu Trp Val Thr Glu Val Ser Ala Glu Asp Ile Thr Arg His Phe Asn 610 615 620 Val Gly Glu Gly Asp Ile His Ala Leu Ala Asp Thr Ser Glu Trp Leu 625 630 635 640 Met His Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu Leu Leu Gly Val Glu Tyr Ser 645 650 655 Ser His Ala Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Leu 660 665 670 Asp Leu Met Glu Leu Val Gly Ile Arg Gly Val Gly Arg Val Arg Ala 675 680 685 Arg Lys Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Val Ser Val Ala Lys Leu Lys Gly 690 695 700 Ala Asp Ile Ser Val Leu Ser Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Ala Tyr 705 710 715 720 Asn Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Arg Val Asn Asp Lys His Phe Asn 725 730 735 Ser Ala Pro Ile Ser Ser Asn Thr Leu Asp Thr Leu Leu Asp Lys Asn 740 745 750 Gln Lys Thr Phe Asn Asp Phe Gln 755 760 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 5 <400> 29 cccccccccc accccccccc 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 6 <400> 30 ccccccccca ccccccccc 19 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 6 <400> 31 ccccccaccc cccccc 16 <210> 32 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 6 <400> 32 ctattctgtt tatgtttctt gtttgttagc cctattctgt cccccccccc accccccccc 60 accccccccc accccccccc 80 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 6 <400> 33 ctattctgtt tatgtttctt gtttgttagc cctattctgt cccccccccc 50 <210> 34 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 7 <400> 34 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tcgctgctcc 60 acaggtctca gcttgagcag cga 83 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 7 and 8 <400> 35 tcgctgctca agctgagacc tgtggagcag cga 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 7 and 8 <400> 36 tcgctgctcc acaggtctca gcttgagcag cga 33 <210> 37 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 7, 8 and 9 <400> 37 tttttttttt 10 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Examples 8 and 10 <400> 38 tttttttttt tttttttttt 20 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 8 <400> 39 tttttttttt tttttt 16 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 8 <400> 40 tttttttttt tttttttt 18 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 9 <400> 41 gccatcagat tgtgtttgtt agtcgct 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 9 <400> 42 gcaatatcag caccaacaga aacaacc 27 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence used in Example 9 <400> 43 agcgactaac aaacacaatc tgatggc 27

Claims (51)

  1. (a) 하나 이상의 정지된 헬리카제 및 폴리뉴클레오티드를 막횡단 포어와 접촉시키는 단계, 및 (b) 전위를 포어를 통해 인가하여 폴리뉴클레오티드 상에서 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 정지된 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키는 방법.
  2. (a) 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공하는 단계;
    (b) 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서에서 정지하도록 하는 단계;
    (c) 표적 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 정지된 헬리카제를 포어와 접촉시키는 단계; 및
    (d) 포어를 통해 전위를 인가하여 하나 이상의 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하도록 하고, 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 단계를 포함하는, 막횡단 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 방법.
  3. (a) 제2항의 방법을 수행하는 단계; 및
    (b) 폴리뉴클레오티드가 포어와 관련하여 이동함에 따라 하나 이상의 측정치를 측정하여 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하고, 여기서 측정치는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 특징을 규명하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공하는 단계가 하나 이상의 스페이서를 포함하도록 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 하나 이상의 특징이 (i) 표적 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 동일성, (iii) 표적 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 표적 폴리뉴클레오티드의 2차 구조, 및 (v) 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 여부로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 메틸화에 의해, 산화에 의해, 손상에 의해, 하나 이상의 단백질로, 또는 하나 이상의 표지, 태그 또는 스페이서로 변형되는 것인 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징이 전기적 측정 및/또는 광학적 측정에 의해 측정되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 전기적 측정이 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정 또는 전계 효과 트랜지스터 (FET) 측정인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 헬리카제가 인가된 전위로부터 생성된 장을 이용하여 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 폴리뉴클레오티드와 상이한 구조를 갖는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)이고, 하나 이상의 스페이서가 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄를 포함하는 합성 중합체를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 하나 이상의 니트로인돌, 하나 이상의 이노신, 하나 이상의 아크리딘, 하나 이상의 2- 아미노퓨린, 하나 이상의 2-6-디아미노퓨린, 하나 이상의 5-브로모-데옥시우리딘, 하나 이상의 역 티미딘 (역 dT), 하나 이상의 역 디데옥시-티미딘 (ddT), 하나 이상의 디데옥시-시티딘 (ddC), 하나 이상의 5-메틸시티딘, 하나 이상의 5-히드록시메틸시티딘, 하나 이상의 2'-O-메틸 RNA 염기, 하나 이상의 이소-데옥시시티딘 (이소-dC), 하나 이상의 이소-데옥시구아노신 (이소-dG), 하나 이상의 C3 기, 하나 이상의 광절단가능한 (PC) 기, 하나 이상의 헥산디올 기, 하나 이상의 스페이서 9 (iSp9) 기, 하나 이상의 스페이서 18 (iSp18) 기, 중합체 또는 하나 이상의 티올 연결부를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 중합체가 폴리펩티드 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 하나 이상의 무염기 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 하나 이상의 헬리카제를 정지시키는 하나 이상의 화학적 기를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 화학적 기가 하나 이상의 형광단, 스트렙트아비딘 및/또는 비오틴, 콜레스테롤, 메틸렌 블루, 디니트로페놀 (DNP), 디곡시게닌 및/또는 항-디곡시게닌 또는 디벤질시클로옥틴 기인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 유리 뉴클레오티드의 존재, 및/또는 헬리카제 보조인자의 존재 하에 하나 이상의 헬리카제를 정지시킬 수 있는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 약 100 mM 이하의 염 농도에서 하나 이상의 헬리카제를 정지시킬 수 있는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 정지된 헬리카제가 각 스페이서를 지나도록 이동시키는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 2개 이상의 헬리카제가 서로 부착되어 있는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 2개 이상의 헬리카제가 서로 공유 부착되어 있는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 폴리뉴클레오티드에 포함되어 있고/거나, 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 하나 이상의 차단 분자의 일부가 아닌 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부가 이중 가닥인 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥 영역 또는 비혼성화된 영역에 포함되어 있는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 단일 가닥 영역이 포어로 우선적으로 트레딩하는 리더 서열을 포함하는 것인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥부의 두 가닥이 가교 모이어티를 사용하여 연결되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 가교 모이어티에 포함되는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 헬리카제가 (a) 하나 이상의 Hel308 헬리카제, 하나 이상의 RecD 헬리카제, 하나 이상의 XPD 헬리카제 또는 하나 이상의 Dda 헬리카제, (b) (a)의 헬리카제 중 임의의 것으로부터 유래된 하나 이상의 헬리카제; 또는 (c) (a) 및/또는 (b)의 헬리카제 중 임의의 것의 조합인 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 포어가 막횡단 단백질 포어 또는 고체 상태 포어인 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 막횡단 단백질 포어가 α 헤몰리신, 류코시딘, 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 포린 A (MspA), MspB, MspC, MspD, 리세닌, 외막 포린 F (OmpF), 외막 포린 G (OmpG), 외막 포스포리파제 A, 나이세리아(Neisseria) 자가수송체 지단백질 (NalP) 및 WZA로부터 유래되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 막횡단 단백질 포어가
    (a) 서열 2에 제시된 바와 같은 8개의 동일한 서브유닛로 형성된 것, 또는 (b) 8개의 서브유닛 중 하나 이상이 전체 서열에 걸쳐 아미노산 동일성에 기초하여 서열 2와 50% 이상의 상동성을 갖고 포어 활성을 유지하는 그의 변이체이거나; 또는
    (c) 서열 4에 제시된 바와 같은 7개의 동일한 서브유닛으로 형성된 α 헤몰리신, 또는 (d) 7개의 서브유닛 중 하나 이상이 전체 서열에 걸쳐 아미노산 동일성에 기초하여 서열 4와 50% 이상의 상동성을 갖고 포어 활성을 유지하는 그의 변이체인 방법.
  32. 폴리뉴클레오티드 상에서 하나 이상의 정지된 헬리카제가 하나 이상의 스페이서를 지나도록 이동시키기 위한 막횡단 포어 및 인가된 전위의 용도.
  33. 폴리뉴클레오티드를 막횡단 포어와 접촉시키기 이전에 폴리뉴클레오티드 상에서 하나 이상의 헬리카제를 정지시키기 위한 하나 이상의 스페이서의 용도.
  34. (a) 표적 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 스페이서를 제공하는 단계; 및
    (b) (a)에서 제공받은 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 하나 이상의 헬리카제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 각 스페이서에서 정지하도록 하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 헬리카제의 표적 폴리뉴클레오티드 상에의 로딩을 제어하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 단계 (a)가 하나 이상의 스페이서를 포함하도록 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드에 5'→3' 방향으로 (L-S)n 또는 (S-L)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수임)을 제공하는 것인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 (a)에서 제공받은 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 하나 이상의 헬리카제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 1개의 헬리카제가 각 스페이서에서 정지하도록 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 단계 (a)가 표적 폴리뉴클레오티드에 5'→3' 방향으로 (L1-S)n 또는 (S-L1)n (여기서, L은 단 1개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수임)을 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  39. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 (a)에서 제공받은 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 하나 이상의 헬리카제가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 2개의 헬리카제가 각 스페이서에서 정지하도록 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 단계 (a)가 표적 폴리뉴클레오티드에 5'→3' 방향으로 (L2-S)n 또는 (S-L2)n (여기서, L은 단 2개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수임)을 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 각 스페이서에서 정지된 2개의 헬리카제가 서로 상이한 것인 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 각 스페이서에서 정지된 2개의 헬리카제가 서로 부착되어 있거나, 또는 서로 공유 부착되어 있는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    (a) 표적 폴리뉴클레오티드에 5'→3' 방향으로 (L2-S)n 또는 (S-L2)n (여기서, L은 단 2개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이를 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, n은 정수임)을 제공하는 단계;
    (b) 차단 폴리뉴클레오티드를 각 영역 L2의 부분에 혼성화시켜 각 영역 L2의 남은 부분이 단 1개의 헬리카제가 결합하기에 충분할 정도의 길이가 되도록 하는 단계;
    (c) (b)에서 제조된 표적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 1개의 헬리카제가 각 영역 L2의 남은 부분에 결합하도록 하는 단계;
    (d) (c)의 하나 이상의 결합된 헬리카제에 유리 뉴클레오티드 및 헬리카제 보조인자를 제공하여 헬리카제가 각 차단 폴리뉴클레오티드를 제거하고, 각 스페이서 S에서 정지하도록 하는 단계; 및
    (e) (d)에서 제조된 표적 폴리뉴클레오티드를 (c)에서 사용된 것과는 다른 하나 이상의 헬리카제와 접촉시켜 1개의 상이한 헬리카제가 각 영역 L2에 결합하고, 각 스페이서 및 (d)에서 정지된 각 헬리카제에 의해 정지되도록 하는 것인 단계를 포함하는 방법.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드에 2개 이상의 스페이서를 제공하는 것인 방법.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정지된 헬리카제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 하나 이상의 스페이서를 지나 이동하는 것인 방법.
  46. (a) 5'→3' 방향으로 (L-S-D)n 또는 (D-S-L)n (여기서, L은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오티드이고, S는 스페이서이고, D는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, n은 정수임), 및 (b) 각 어댑터 상에서 정지된 하나 이상의 헬리카제를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위한 어댑터.
  47. 제46항에 있어서, L이 단 1개의 헬리카제에 결합할 수 있거나 (L1), 또는 단 2개의 헬리카제에 결합할 수 있는 (L2) 것인 어댑터.
  48. 제47항에 있어서, n이 1이고, 1개 또는 2개의 헬리카제가 어댑터 상에서 정지되는 것인 어댑터.
  49. (a) 하나 이상의 스페이서, (b) 하나 이상의 헬리카제 및 (c) 막횡단 포어를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위한 키트.
  50. 제49항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 것인 키트.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 키트가 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 어댑터를 포함하는 것인 키트.
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