KR20140004196A

KR20140004196A - 피부 외용제

Info

Publication number: KR20140004196A
Application number: KR1020137022690A
Authority: KR
Inventors: 타츠야 이시하라; 신페이 우시오; 로코 야마모토; 타카노리 오쿠라; 시게하루 후쿠다
Original assignee: 가부시기가이샤하야시바라
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2014-01-10
Also published as: CN103501757A; EP2671565A1; US20130309188A1; US9492368B2; WO2012105542A1; CN103501757B; EP2671565A4; EP2671565B1; JPWO2012105542A1; KR101967615B1; JP5913138B2

Abstract

본 발명은 피부에서의 케라티노사이트 증식 및 분화촉진 작용 및 콜라겐 산생증강 작용을 겸비하고, 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕고 뛰어난 피부개선 효과를 불러오는, 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제를 제공하는 것을 과제로 하고, α-D-글루코피라노실-(1→3')-아데노신 및/또는 α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제를 제공함으로써 해결하는 것이다.

Description

피부 외용제 {EXTERNAL PREPARATION FOR SKIN}

본 발명은 α-D-글루코피라노실-(1→3')-아데노신 및/또는 α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신(이하 각각 "3'-글루코실아데노신" 및 "5'-글루코실아데노신"이라고 하고, 또, 그들을 총칭하여 "글루코실아데노신"이라고 하는 경우가 있다)을 유효성분으로서 이루어지는 지속성 항주름용 피부 외용제에 관한 것이다.

피부는 몸의 최외층을 형성하고, 외부로부터 생체를 보호함과 동시에 체내의 수분과 영양분이 외부로 새어나가는 것을 막는 역할을 하는 외측의 얇은표피(상피조직)와, 주로 섬유아세포, 교원(콜라겐)섬유, 탄성섬유, 프로테오글리칸 등이 복합적으로 3차원 모양으로 퍼진 구조를 가지며, 피부에 강도, 신전성 및 탄력성 등을 가져오는 두툼한 진피(결합조직)로 구성된다. 피부의 상태는 표피와 진피가 각각의 건전한 조직구조 및 생리기능을 함께 유지함으로써 유지되고 있다.

피부의 표피는 진피측에서 "기저층", "유극층", "과립층" 및 "각질층(각층)"으로 나뉘고, 주로 케라티노사이트(각화세포)라고 불리는 세포로 구성된다. 케라티노사이트는 최하층의 기저층에서는 분열능력을 가지는 미숙한 세포로서 단층을 형성하고, 분열증식하여 상층으로 들어올려지면서 그 과정에서 분화("각화") 하며, 최종적으로 핵이 없는 죽은 세포인 각질세포가 되어 각질층을 형성하고, 그 표층부분에서 때가 되어 탈락한다. 피부표피에서는 이 케라티노사이트의 증식, 이동, 분화, 그리고 탈락과정이 일정주기로 원활하게 턴오버함으로써 그 항상성이 유지되고 있다.

그러나 피부는 노화, 건조, 산화, 태양광(자외선) 등의 갖가지 요인에 의하여 퇴화하고 수분을 잃으며, 주름발생을 비롯한 쳐짐발생, 팽팽함이나 탄력성의 저하 등 여러가지 현상을 보인다. 그런 피부의 열화는 진피에서의 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성이 저하하여 진피 중의 콜라겐양이 감소하는 것이 하나의 큰 원인으로 여겨지고 있고, 콜라겐량의 감소를 개선하기 위하여 콜라겐이나 콜라겐 산생 증강제를 배합한 다수의 피부 외용제나 음식품 등이 개발되고 있다(예를 들면, 특허 제3495217호 공보 및 특개2007-186471호 공보 참조).

한편, 몸의 최외층을 형성하고 있는 표피에서도 주름발생 등의 요인이 되는 바람직하지 않은 상태가 발생한다. 즉, 표피를 구성하는 케라티노사이트의 증식과 분화가 억제되고, 하층으로부터의 각질세포의 공급 및 상층에서의 각질층의 형성이 줄어 각질층의 턴오버가 늦어짐으로써 각질층의 비후화 및 수분량 감소 등이 발생하고, 또한 각질층에 의한 보습기능 및 보호기능이 저하된다. 또, 저습도 환경이나 지나친 피부세정, 노화, 체질 등에 따라 피부의 건조가 진행되면 각질층의 다중박리가 쉽게 일어나게 되고, 피부의 윤기는 저하되어 화장이 잘 먹지않는 등 폐해가 발생하며 나아가, 주름발생이나 피부 거칠어짐 등의 트러블이 발생한다. 이 문제를 개선하기 위하여 케라티노사이트의 증식이나 분화를 촉진하는 시도가 이루어지고 있고, 케라티노사이트 분화촉진 활성을 가지는 물질을 배합한 피부에 사용하는 조성물이 제안되고 있다(예를 들면, 특표 2001-510777호 공보나 특표 평8-507289호 공보 참조).

상술한 것처럼 주름발생을 비롯한 피부상태의 열화, 즉 진피의 콜라겐 산생능력의 저하 및 표피에서의 각질층의 턴오버의 열화를 개선하는 다양한 물질 및 피부에 사용하는 조성물이 다수 제안되고 있다. 그러나 이들은 모두 표피 또는 진피의 어느 한쪽의 증상의 개선에만 착안한 것이기 때문에, 그 항주름작용은 충분히 만족할 수 있는 것이 아니고, 표피와 진피의 두 증상을 개선하여 종합적으로 피부의 항상성을 유지할 수 있는, 높은 항주름작용을 초래하는 피부 외용제의 개발이 요구되고 있다. 이러한 기능을 가진 물질로서는, 특개 2009-149557호 공보에는 프로락틴이 개시되고 있지만, 프로락틴은 펩티드인 점에서 제제화했을 때나 피부에 외용제로 사용했을 경우의 안정성, 기저층으로의 침투성 등의 점에서 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 표피와 진피의 양쪽에 작용하여 뛰어난 항주름작용을 가짐과 동시에 그 효과의 지속성에도 뛰어난 신규성분 및 이것을 사용한 피부 외용제가 더욱 강력하게 요망되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 사정에 비추어, 표피와 진피 양쪽의 조직구조 및 생리기능의 개선을 돕고, 피부개선 효과를 가져와 피부의 정상적인 상태를 유지하는 작용을 가지면서, 또한 피부에 적용하여도 안정적으로 생체에 대하여 영향을 미치는 일 없이 안전한, 신규의 지속성 항주름용 피부 외용제를 제공하는 것을 과제로 여긴다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위하여 핵산관련 물질에 착안하여, 예의연구를 거듭하고, 여러 시행착오를 반복하던 중에 생체에 대한 안전성 문제에서, 생체 내에 원래 존재하는 성분인 아데노신을 선택하는 연구를 실시하였다. 아데노신 자체에 대해서는 진피에서의 콜라겐 산생증강 작용이나 모유두세포의 케라티노사이트 증식을 증강하는 작용을 갖는 것이 알려져 있지만(예를 들면, 국제공개 WO05/034902호 팜플렛이나 국제공개 WO05/044205호 팜플렛), 본 발명자들의 연구에 의하여 아데노신은 생체 내에 원래 존재하는 효소에 의하여 신속하게 대사되어, 그 효과가 지속되기 어려운 경우가 있는 것, 또한 아데노신은 친수성 용매에 대한 용해도가 낮고, 피부 외용제에 배합할 경우 취급에 어려움을 수반하는 것이 판명되었다. 본 발명자는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 더욱 연구를 거듭한 바, 아데노신의 3'번 위치 또는 5'번 위치(아데노신 분자 중의 리보스의 3번 위치 또는 5번 위치)의 수산기에 D-글루코스가 1분자 α 결합한 3'-글루코실아데노신 및/또는 5'-글루코실아데노신이 표피 케라티노사이트에 작용하여 아데노신보다도 우수한 케라티노사이트 증식 및 분화촉진 작용을 갖는 점을 발견하였다.

또한, 본 발명자는 상기 글루코실아데노신이 진피의 섬유아세포에도 작용하여, 아데노신보다도 유의적으로 뛰어난 콜라겐 산생(産生)증강 작용을 갖는 점을 발견하였다.

또한, 본 발명자는 상기 글루코실아데노신이 아스코르빈산 2-글루코시드 등의 배당체와는 달리 의외로 생체 내에 존재하는 분해효소 등의 작용을 받기 어렵고, 생체 내 환경에서 아데노신보다도 안정적으로 그 효과의 지속성에서도 뛰어난 점을 발견하였다.

또한, 본 발명자는 상기 글루코실아데노신은 아데노신보다도 친수성 용매로의 가용성에 뛰어난 점을 발견하였다.

또한, 본 발명자는 상기 글루코실아데노신은 아데노신보다도 세포장해를 일으키기 어렵고, 또한 상기와 같이 생체 내에서 아데노신보다도 안정적이기는 하지만, 서서히 분해되고, 생성된 아데노신은 신속히 대사되는 점에서, 인간에 적용하여도 안전한 물질인 것을 발견하고, 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 성분으로서 효과의 강도, 지속성 및 안전성 모두에 있어서도 아데노신보다도 유용한 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 3'-글루코실아데노신 및/또는 5'-글루코실아데노신을 유효성분으로 함유하며 지속성 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제를 제공함으로써 상기 과제를 해결하는 것이다.

참고로, 3'-글루코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신 자체는 예를 들면, 스즈키 유키오, 우치다 케이, 『과학과 공업』, 65권 6호, 265~274쪽(1991년)나 타카하시 슈지 등 『더·저널·오브·안티비오틱스(The Journal of Antibiotics)』, 47권, 1호, 95~100쪽(1994년)에 개시된 것과 같이 공지된 물질이기는 하지만, 그 표피 케라티노사이트의 증식 및 분화를 촉진하는 효과나 진피의 섬유아세포에 대한 콜라겐 생성을 증강하는 효과를 가지며 항주름작용을 보유하는 점, 그 효과들이 배당화 전의 아데노신보다 증강되는 점이나, 생체 내에 원래 존재하는 효소에 의한 분해를 아데노신보다 받기 어렵고, 안정적으로 상기 효과의 지속성이 높다는 점은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명의 글루코실아데노신을 유효성분으로 하는 본 발명의 피부 외용제는, 표피 케라티노사이트의 증식과 분화촉진 작용과 진피의 섬유아세포의 콜라겐 생성증강 작용을 동시에 가지기 때문에, 여러 요인에 의하여 저하한 표피의 각질층의 턴오버를 촉진시켜 각질층의 비후화, 수분량 감소 등을 개선하고, 보습기능 및 보호기능을 개선하며, 진피 중의 콜라겐량을 증가시켜 피부의 팽팽함이나 탄력성을 높일 수 있다는 점에서 뛰어난 항주름작용을 발휘하고, 또, 피부 거칠어짐, 칙칙함, 팽팽함이나 탄력성 저하, 건피증 등의 여러 피부증상을 보다 효과적으로 개선하여 피부를 정상적인 상태로 유지할 수 있다.

또한, 본 발명의 글루코실아데노신은 아데노신보다도 친수성 용매로의 용해성이 뛰어나, 피부 외용제에 배합할 경우 아데노신보다도 취급이 용이하다.

또한, 본 발명의 글루코실아데노신은 아데노신보다도 안정적이고, 또,아스코르빈산2-글루코시드 등의 다른 배당체보다도 효소에 의하여 분해되기 어렵기는 하지만, 생체 내에 존재하는 분해효소의 작용에 의하여 서서히 D-글루코오스와 아데노신으로 분해되고, 생성한 아데노신이 신속히 대사되는 점에서, 사람에 적용하여도 안전한 물질인데다가 아데노신보다도 효과가 지속성에 있어서도 뛰어나다.

또, 본 발명의 글루코실아데노신은 효과의 지속성이 뛰어난 항주름작용을 가진 점에서, 특히 비교적 장시간 피부에 적용하는 피부 외용제에 사용하는 것이 매우 적합하며, 이러한 피부 외용제에 사용하는 방부 또는 정균작용(靜菌作用)을 갖는 항균제로서는, 연속 사용해도 피부에 자극이 적으면서, 또한 본 발명의 글루코실아데노신의 효과를 저해하지 않은 것이 바람직하고, 그들과 병용함으로써 본 발명의 효과를 크게 발휘할 수 있다.

또, 본 발명의 글루코실아데노신은 효소 등에 대하여 안정적이라는 점에서, 피부 외용제로 사용되는 다른 성분과 병용하여도 그 영향을 받기 어렵고, 특히 식물 추출물 등 천연성분과 병용한 경우, 이들에 포함되는 효소 등에 의하여 분해될 우려가 적기 때문에, 이들 이외의 성분이 갖는 활성과 함께 글루코실아데노신이 가진 항주름작용도 안정적으로 발휘할 수 있는, 뛰어난 피부 외용제를 제조할 수 있다.

상기대로, 본 발명은 3'-글루코실아데노신 및/또는 5'-글루코실아데노신을 유효성분으로 함유하여 이루어지는 지속성 항주름작용을 가진 피부 외용제에 관한 것이다.

본 발명에서 말하는 피부 외용제는, 상기 글루코실아데노신을 함유하는 점에서, 표피 케라티노사이트의 증식 및 분화촉진 작용과 콜라겐 생성증강 작용 양쪽의 작용을 가지며, 그 효과의 지속성에도 뛰어난 점에서, 주름발생을 비롯한 피부의 열화를 억제하고, 피부 거칠어짐, 칙칙함, 팽팽함이나 탄력성의 저하, 건피증 등의 다양한 피부증상의 개선에 사용할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제의 유효성분으로서 사용하는 글루코실아데노신은 3'-글루코실아데노신과 5'-글루코실아데노신의 어느 한쪽 혹은 그 양쪽을 함유하기는 하지만 어느 것이라도 좋다. 또한, 후술하는 바와 같이 5'-글루코실아데노신은 생체 내에 존재하는 효소 등의 생체성분에 대한 안정성이 우수하고, 물 등의 친수성 용매에 대한 용해성이 높은 것, 또, 3'-글루코실아데노신은 비교적 낮은 농도로 효과를 발휘하기 쉬운 점에서 피부 외용제의 제형이나 목적에 따라 그들을 적절히 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 피부 외용제는 상기 글루코실아데노신의 글루코스에 더욱 D-글루코스가 1분자 이상 α-1,4, α-1,6 및/또는 α-1,3 결합한 α-글리코실아데노신을 함유하고 있어도 좋다.

본 발명의 피부 외용제에 사용하는 글루코실아데노신은 효소법으로 조제할 수 있다. 또, 필요에 따라 발효법이나 합성법에 의하여 조제할 수도 있다. 경제성을 문제 삼는 것이라면, 당전이효소를 사용하는 효소법이 유리하다.

본 발명에서 사용하는 글루코실아데노신은 반드시 고도로 정제될 필요는 없고, 피부에 악영향을 미치는 불순물을 함유하는 등의 안전성에 문제가 없으며, 소기의 효과를 방해받지 않는 한, 그 순도에 대해서는 특별히 제한은 없다. 본 발명의 피부 외용제의 투여형태나 제형에 따라 제조원료로서 사용하는 아데노신을 함유하는 효소반응 후의 반응액체 그것이라도, 그 제조방법에 특유의 다른 물질과의 미분리 조성물의 형태라도 좋고, 부분정제한 것, 혹은 고도로 정제한 것이라도 좋다. 또, 고도로 정제한 3'-글루코실아데노신과 5'-글루코실아데노신을 목적에 따라 적당히 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 말하는 표피 케라티노사이트의 증식 및 분화촉진 작용은 표피의 기저층에 존재하는 케라티노사이트의 분열증식 및 이러한 세포가 상층으로 들어올려지면서 유극층, 과립층, 각질층을 형성하는 세포로 분화하고, 최종적으로 핵이 없는 죽은세포인 각질세포에 이르는 과정의 어느 것이든, 혹은 그 전 과정을 촉진하여 건강한 표피를 유지하는 작용을 말한다. 또한, 본 발명에서 말하는 콜라겐 산생증강 작용이란, 진피에 존재하는 섬유아세포의 콜라겐 산생을 항진하는 작용을 말한다.

본 발명의 피부 외용제 투여량은 본 발명의 소기의 효과를 얻을 수 있다면, 특별히 제한은 없고, 통상 하루에 1회 내지 여러번으로 나누어 하루당 소정량을 투여하면 좋다. 하루의 투여량은 통상 유효성분인 글루코실아데노신으로서 피부 1cm²당 0.001 내지 100mg을 도포하면 좋고, 0.05 내지 10mg이 바람직하며, 0.01내지 1mg이 보다 바람직하다. 경피에 의한 투여량이 피부 1cm²당 0.001mg보다 적으면 소기의 효과를 얻을 수 없는 경우가 있고, 100mg을 초과하여 투여해도 투여량에 알맞는 효과를 얻을 수 없는 경우가 있다.

본 발명의 글루코실아데노신은 단독으로 피부 외용제의 유효성분으로서 사용할 수도 있지만, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 그 외 피부개선 작용, 콜라겐 생성증강 작용, 케라티노사이트의 증식 및 분화촉진 작용을 갖는 그 외 약제, 또한 미백제, 항산화제, 항염증제, 보습제 등 임의의 약효성분을 적당하게 배합한 형태로 사용하는 것도 자유롭고, 이들 작용과 동시에 상기 글루코실아데노신의 효과도 불러일으키는 피부 외용제로 할 수 있다. 또, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한, 그 형태나 제형에 따라 통상, 화장품, 의약품, 의약부외품 등에 사용할 수 있는 적절한 담체, 부형제, 안정제, 완충제, pH조정제, 용매 등 임의의 보조제 등을 첨가하여 분말상, 과립상, 용액 등 임의의 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제에서의 글루코실아데노신의 배합량은 그 형태나 제형 등에 따라 그 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 통상 제제 전량 중 0.001 내지 30질량%가 되도록 배합하면 좋고 0.01 내지 10질량%가 바람직하며, 0.1내지 5질량%가 특히 바람직하다. 본 발명의 글루코실아데노신은 피부 외용제에 30질량%를 초과하여 배합하여도 배합량에 맞는 효과를 얻을 수 없는 경우가 있고, 0.001질량%보다도 적은 경우 소기의 효과를 얻을 수 없는 경우가 있다.

본 발명의 피부 외용제는 표피에 존재하는 케라티노사이트의 증식 및 분화를 촉진시켜 각질세포의 공급을 높여 각질층의 턴오버를 촉진시킴으로써 기능저하를 초래한 피부의 상태를 개선하여 적정한 상태로 유지할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제는 표피 케라티노사이트에 의하여 세라마이드 합성이나 진피의 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성에 관한 유전자 발현을 증강시키고, 표피의 세라마이드량이나 진피의 콜라겐량을 증가시킴으로써 피부의 탄력성, 팽팽함, 보호기능 등을 높여 기능저하를 초래한 피부의 상태를 개선하여 적정한 상태로 유지할 수 있다.

따라서, 본 발명의 피부 외용제는 피부보습 기능을 향상시키고, 피부 거칠어짐, 주름, 피부의 팽팽함이나 탄력성 저하, 피부의 보호기능의 저하, 피부건조, 건피증, 건선 등, 임의의 피부증상을 예방 또는 개선할 수 있다. 또, 글루코실아데노신은 케라티노사이트 증식 및 분화촉진 작용, 콜라겐 생성증강 작용, 세라마이드 합성촉진 작용에 추가로 보습작용을 지니고 있으므로, 본 발명의 피부 외용제는 케라티노사이트 증식 및 분화 촉진제, 콜라겐 생성 증강제, 세라마이드 합성 촉진제의 제조를 위한 것 뿐만 아니라, 보습제 제조에 사용하는 것도 유리하다. 심지어 세라마이드 합성에 관여하는 효소인 β 글루코세레브로시다아제(GCase)나 스핑고미엘리나제(SMase)의 유전자 발현 증강제 제조에 사용하는 것도 자유롭다.

이러한 본 발명의 피부 외용제는 효과의 지속성이 뛰어난 항주름작용을 가지며, 비교적 장시간 피부에 적용되는 것이기 때문에, 방부 또는 정균작용을 갖는 항균제를 배합하는 것이 바람직하다. 항균제로서는 안식향산 및 그 염류, 살리실산 및 그 염류, 소르빈산 및 그 염류, 데히드로초산 및 그 염, 파라옥시안식향산알킬에스테르를 비롯한 파라옥시안식향산에스테르, 에데트산, 2,4,4'-트리클로로-2'-히드록시디페닐에테르, 3,4,4'-트리클로로카르바닐리드, 헥사클로로펜, 염화 벤잘코늄, 페녹시에탄울, 히노키티올, 레졸신, 에탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 감광소 201호, 젖산, 1,2-알칸디올, 치자 진액, 고삼 진액, 세이지 진액, 타임 진액, 쑥 진액, 황벽나무 진액 등의 항균작용을 가진 식물 추출물이 있다.

특히, 본 발명의 피부 외용제는 연속 사용하여도 피부에 자극이 적으면서, 또한 본 발명의 글루코실아데노신의 효과를 해치지 않는 항균제를 배합함으로써 본 발명의 효과를 크게 발휘할 수 있다. 상기 항균제 중, 1,2-알칸디올이나 1,3-부틸렌글리콜과 같은 비(非) 파라옥시안식향산에스테르계의 성분은 낮은 피부자극, 높은 방부효과 및 보습성 면에서 바람직하다. 1,2-알칸디올로서는 탄소수 4 내지 10의 1,2-알칸디올이 바람직하고, 특히 1,2-펜탄디올, 1,2-헥산디올, 1,2-헵탄디올 또는 1,2-옥탄디올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 1,2-알칸디올이 특히 바람직하다. 또한, 본 발명의 글루코실아데노신과 이들 항균제를 피부 외용제에 있어서 균질하게 배합하기 위하여, 본 발명의 효과를 해치치 않는 한, 적당량의 계면활성제를 사용하는 것도 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제는 글루코실아데노신과 함께 통상 화장품, 의약부외품과 의약품 등에 사용되는 그 외 임의성분 1종 또는 2종 이상을 필요에 따라 적의배합한 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 피부 외용제에서 글루코실아데노신과 함께 사용되는 그 밖의 임의성분으로서는, 예를 들면, 미백제, 항산화제, 항염증제, 보습제, 자외선흡수제, 유화제, 증점제를 비롯한 하기 성분을 들 수 있다.

또, 본 발명의 글루코실아데노신은 효소 등의 생체성분에 대하여 비교적 안정적인 점에서, 다른성분과 함께 배합하여도 그 영향을 받기 어렵고, 특히 상기와 같은 활성을 가진 식물 추출물 등 천연성분을 배합한 경우도 그 성분에 포함되는 효소 등에 의하여 분해될 염려가 작아, 당해 활성성분에 의한 효과와 함께 본 발명의 글루코실아데노신의 항주름작용을 발휘할 수 있는 뛰어난 피부 외용제로 할 수 있다.

미백제로는 예를 들면, L-아스코르빈산 또는 그 유도체, 알부틴, 코지산, 엘라그산, 태반 추출물, 히드로퀴논 배당체, 트라넥삼산 또는 그 유도체, 레졸신, 4-n-부틸레졸시놀 등의 알킬레졸시놀 및 이러한 염과 같은 레졸신 및 그 유도체, 글루타티온, 쪽풀 추출물, 감초 진액, 황금(黃芩) 진액, 은행잎 진액, 찔레나무 열매 진액, 목련 진액, 작약 진액, 치자 진액, 세이지 진액, 당귀 진액, 아이리스 진액, 아선약(阿仙藥) 진액 등의 식물 추출물을 들 수 있다. 특히, L-아스코르빈산 2-글루코시드나 트라넥삼산은 글루코실아데노신의 생리활성을 증강하는 효과가 뛰어나서 바람직하다.

항산 산화제로는 예를 들면, 부틸히드록시톨루엔, 토코페롤, 피틴, 레티놀이나 그 유도체 등의 비타민 A류, 비타민 B₆염산염, 비타민 B₆트리팔미테이트, 비타민 B₆디옥타노에이트, 비타민 B₂및 그 유도체, 비타민 B₁₂, 비타민 B₁₅ 및 그 유도체 등의 비타민 B류, 아스코르빈산이나 그 유도체 등의 비타민 C류, α-토코페롤, β-토코페롤, δ-토코페롤, 비타민 E아세테이트 등의 비타민 E류, 비타민 D류, 글루타티온, 루틴, 헤스페리딘, 나린진이나 그 유도체, 서양고추나물 진액, 찔레나무 열매 진액, 황금 진액, 우롱차, 홍차, 녹차 등의 차 진액, 송이버섯 진액 등 항산화작용을 갖는 식물의 추출물을 들 수 있다.

항염증제로는, 알란토인 또는 그 유도체, 글리시레틴 또는 그 유도체인 글리시레틴산, 글리시리진산, 그리틸레틴산 알란토인, 그리틸레틴산 글리세린, 그리틸레틴산 스테아릴, 스테아린산 글리시레티닐, 3-숙시닐옥시글리시레틴산 이나트륨, 글리시리진산 디칼륨, 글리시리진산 모노암모늄 등, 판토텐산 및 그 유도체, 비타민 E 및 그 유도체, L-아스코르빈산, L-아스코르빈산-2-글루코시드, 아스코르빈산-토코페롤인산디에스테르, L-아스코르빈산 황산에스테르, 디팔미트산 아스코르 빌, 팔미트산 아스코르빌, L-아스코르빈산 스테아릴, 인산 L-아스코르빌, L-아스코르빈산 에틸 등의 L-아스코르빈산의 유도체, 염산 피리독신, 멘톨, 비오틴, 캠퍼, 텔레핀유, 산화아연, 아줄렌, 구아이아줄렌 및 그 유도체, 메테남산 및 그 유도체, 페닐부타존 및 그 유도체, 인도메타신 및 그 유도체, 이부프로펜 및 그 유도체, 케토프로펜 및 그 유도체, ε-아미노카프로산, 디클로페낙트륨, 디펜히드라민, 트라넥삼산 및 그 유도체, 덱사메타존, 코르티손 및 그 에스테르, 히드로코르티손 및 그 에스테르, 프리드니손, 프레드니솔론 등의 부신피질 호르몬, 항히스타민제, 찔레나무 열매, 고추나물, 황벽나무, 감초, 물냉이, 컴프리, 사루비아, 자근(紫根), 자작나무, 차, 당금잔화, 딱총나무, 포황, 무환자나무, 유칼리투스 진액, 브로콜리, 토우들, 시소, 카밀레, 쑥, 알로에, 당근, 황벽나무 분말, 카모마일 분말, 아선약, 아마챠, 양아욱, 아르니카, 에키나시아, 연명초, 황금, 보리, 오렌지, 쥐오줌풀, 카밀레, 치자, 얼룩조릿대, 용담, 이질풀, 우엉, 산초, 시소, 보리수나무, 작약, 상록담쟁이, 주니퍼베리, 서양톱풀, 천궁, 천진, 세이지, 상백피, 대조, 타임, 당참나무, 복숭아씨, 삼백초, 토르멘티라, 파슬리, 박하, 쐐기풀, 백단향, 비파나무, 부쳐블룸, 포도, 홍화, 단추, 보리수, 복숭아, 수레국화초, 쑥, 라벤더, 로즈마리 등의 식물 또는 식물에서 유래하는 성분 등을 예시할 수 있다.

보습제로는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜,헥실렌글리콜, 자일리톨, 소르비톨, 말티톨, 콘드로이틴황산, 히알루론산, 무코이틴황산, 괄루인산, 아테로콜라겐, 콜레스테릴-12-하이드록시스테아레이트, 젖산나트륨, 담즙산염, dl-피롤리돈 카르본산염, 단쇄 가용성 콜라겐, 디글리세린(EO)PO부가물, 노르말리스장미 추출물, 서양톱풀 추출물, 전동싸리 추출물, 알로에 진액, 쓴풀 진액, 고삼 진액, 수세미 진액, 마로니에 진액, 바위취 진액, 타임 진액, 당귀 진액, 백합 진액, 치자 진액, 회향풀 진액, 광대수염 진액, 페퍼민트 진액 등의 식물 추출물, 트라넥삼산 등이 있다.

자외선 흡수제로는 예를 들면, 파라아미노 안식향산(이하,"PABA"로 약기한다), PABA 모노글리세린에스테르, N,N-디프로폭시 PABA에틸에스테르, N,N-디에톡시 PABA에틸에스테르, N,N-디메틸 PABA에틸에스테르, N,N-디메틸 PABA부틸에스테르, N,N-디메틸 PABA메틸에스테르 등의 안식향산계 자외선 흡수제, 호모멘틸-N-아세틸안트라닐레이트 등의 안트라닐산계 자외선 흡수제, 아밀살리실레이트, 멘틸살리실레이트, 호모멘틸살리실레이트, 옥틸살리실레이트, 페닐살리실레이트, 벤질살리실레이트, p-이소프로판올 페닐살리실레이트 등의 살리실산계 자외선 흡수제, 옥틸신나메이트, 에틸-4-이소프로필신나메이트, 메틸-2,5-디이소프로필신나메이트, 에틸-2,4-디이소프로필신나메이트, 메틸-2,4-디이소프로필신나메이트, 프로필-p-메톡시신나메이트, 이소프로필-p-메톡시신나메이트, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 옥틸-p-메톡시신나메이트(2-에틸헥실-p-메톡시신나메이트), 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트, 시클로헥실-p-메톡시신나메이트, 에틸-α-시아노-β-페닐신나메이트, 2-에틸헥실-α-시아노-β-페닐신나메이트, 글리세릴모노-2-에틸헥사노일-디파라메톡시신나메이트, 트리메톡시신남산메틸비스(트리메틸 실록산)시릴이소펜틸 등의 신남산계 자외선 흡수제, 3-(4'-메틸벤질리덴)-d,1-캄포, 3-벤질리덴-d,1-캄포, 유로카닌산, 유로카닌산에틸, 2-페닐-5-메틸벤조옥사졸, 2,2&apos,-히드록시-5-메틸페닐 벤조트리아졸, 2-(2&apos,-히드록시-5'-t-옥틸페닐)벤조트리아졸, 2-(2&apos,-히드록시-5'-메틸페닐벤조트리아졸, 디벤자라딘, 디아노조일메탄, 4-메톡시-4'-t-부틸디벤조일메탄, 5-(3,3-디메틸-2-노르보닐리덴)-3-펜탄-2-온, 디모르폴리노피리다지논 등이 있고, 임의의 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다.

자외선 산란제로는, 산화티탄, 미립자 산화티탄, 산화아연, 미립자 산화아연, 산화철, 미립자 산화철, 산화세륨 등의 분말을 들 수 있다. 이들 자외선 산란제는 통상, 침상(針狀), 방추상, 구상, 입상(粒狀)의 분말이 사용된다. 또, 입자 지름이 01μm 이하의 미립자 분말이 바람직하다. 메틸하이드로젠 폴리실록산이나 실란커플링제 등의 실리콘 처리;금속비누 처리;퍼플루오로알킬인산 디에탄올아민 염이나 퍼플루오로알킬실란 등의 불소 처리, 덱스트린 지방산 에스테르 처리 등에 의하여 소수화 처리한 자외선 산란제도 바람직하다.

액체유지로는 예를 들면, 아보카도유, 동백유, 거북이유, 마카다미아너트유, 옥수수유, 밍크유, 올리브유, 유채씨유, 난황유, 참기름, 퍼식유(Persic oil), 밀배아유, 쌀배아유, 산다화유, 피마자유, 아마씨유, 홍화유, 면실유, 들기름, 콩기름, 땅콩기름, 차실유, 카야유, 쌀겨유, 오동유, 일본오동유, 호호바유, 트리글리세린 등을 들 수 있다.

고체지방으로는 예를 들면, 카카오 버터(cacao butter), 야자유, 말기름, 경화야자유, 팜유, 우지, 양지, 경화우지, 팜핵유, 돈지, 우골지, 목랍핵유(木蠟核油), 경화유, 소각지(牛脚脂), 목랍, 경화피마자유 등을 들 수 있다.

납류(蠟類)로는 예를 들면, 밀납, 칸테릴라 왁스, 면납, 카르나우바 왁스, 베이베리납, 백랍, 경랍, 몬탄왁스, 쌀겨왁스, 라놀린, 케이폭왁스, 초산 라놀린, 액상 라놀린, 사탕수수납, 라놀린 지방산 이소프로필, 라우린산헥실, 환원 라놀린, 호호바납, 경질 라놀린, 쉘락왁스, POE 라놀린알코올에테르, POE 라놀린알코올아세테이트, POE 콜레스테롤에테르, 라놀린지방산폴리에틸렌글리콜, POE 수소첨가 라놀린알코올에테르 등을 들 수 있다.

탄화수소유로는 예를 들면, 유동 파라핀, 오조케라이토, 스쿠알렌, 프리스탄, 파라핀, 세레신, 스쿠알렌, 바셀린, 마이크로 크리스털린 왁스, 폴리에틸렌 왁스, 피셔-트로프슈 왁스 등을 들 수 있다.

고급 지방산으로는 예를 들면, 라우린산, 미리스틴산, 팔미트산, 스테아린산, 베헤닌산, 올레인산, 운데실레산, 톨산, 리놀산, 리놀렌산, 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA)등이 있다.

고급 알코올로는 예를 들면, 직쇄 알코올(예를 들면, 라우릴알콜, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 베헤닐 알코올, 미리스틸 알코올, 올레일 알코올, 세토스테아릴알코올 등), 분기쇄 알코올(예를 들면, 모노스테아릴글리세린에테르(바틸 알코올), 2-데실테트라데시놀, 라놀린 알코올, 콜레스테롤, 피토스테롤, 헥실데카놀, 옥틸도데카놀 등)등이 있다.

합성 에스테르유로는, 미리스틴산이소프로필, 옥탄산세틸, 미리스틴산옥틸도데실, 팔미트산이소프로필, 스테아린산부틸, 라우린산헥실, 미리스틴산미리스틸, 올레인산데실, 디메틸옥탄산헥실데실, 젖산세틸, 젖산미리스틸, 초산라놀린, 스테아린산이소세틸, 이소스테아린산이소세틸, 12-히드록시스테아린산콜레스테릴, 디-2-에틸헥산산에틸렌글리콜, 디펜타에리스리톨 지방산에스테르, 모노이소스테아린산 N-알킬글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 사과산 디이소스테아릴, 디-2-헵틸운데칸산글리세린, 트리-2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아린산트리메틸롤프로판, 테트라-2-에틸헥산산펜타에리스리톨, 트리-2-에틸헥산산글리세린, 트리옥탄산글리세린, 트리이소팔미트산글리세린, 트리이소스테아린산트리메틸롤프로판, 세틸2-에틸헥사노에이트, 2-에틸헥실팔미테이트, 트리미리스틴산글리세린, 트리-2-헵틸운데칸산글리세라이드, 피마자유지방산메틸에스테르, 올레인산오레일, 아세토글리세라이드, 팔미트산2-헵틸운데실, 아지핀산디이소부틸, N-라우로일-L-글루타민산-2-옥틸도데실에스테르, 아지핀산디-2-헵틸운데실, 에틸라우레이트, 세바신산디-2-에틸헥실, 미리스틴산2-헥실데실, 팔미틴산2-헥실데실, 아지핀산2-헥실데실, 호박산2-에틸헥실, 구연산트리에틸, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 랜덤 중합체 메틸에테르 등을 들 수 있다.

실리콘유로는 예를 들면, 쇄상 폴리실록산(예를 들면, 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 디페닐폴리실록산 등);환상 폴리실록산(예를 들면, 옥타 메틸시클로테트라실록산, 데카메틸시클로펜타실록산, 도데카메틸시클로헥사실록산 등), 3차원 망목(網目)구조를 형성하고 있는 실리콘 수지, 실리콘 고무, 각종 변성 폴리실록산(아미노 변성 폴리실록산, 폴리에테르 변성 폴리실록산, 알킬 변성 폴리실록산, 불소 변성 폴리실록산 등)등을 들 수 있다.

그밖에는, 에탄올 등의 저급 알코올;아실살코신산(예를 들면, 라우로 일살코싱나트륨), 구연산, 사과산, 주석산, 젖산 등의 유기산, 비타민 H, 판토텐산, 판테틴 등의 비타민류; 니코틴산 아미드, 니코틴산 벤질, γ-올리자놀, 알란토인, 글리시리진산(염), 글리시레틴산 및 그 유도체, 히노키티올, 비사볼올, 유카르프톤, 티몰, 이노시톨, 사이코사포닌, 인삼 사포닌, 수세미 사포닌, 무환자나무 사포닌 등의 사포닌류, 판토테닐에틸에테르,에티닐에스트라디올, 세파란친, 플라센털 익스트랙트 등의 각종 약제, 참소리쟁이, 당아욱, 등피, 쇠뜨기, 백합, 쑥, 삼치, 서양산사나무 진액, 백리향 진액, 워터릴리 진액, 서하류 진액, 토르멘티라 진액, 페퍼민트 진액 등의 식물유래의 추출물과 생약, 로얄젤리 진액, 색소, 모노라우린산소르비탄, 모노팔미트산 소르비탄, 세스키올레인산 소르비탄, 트리올레인산 소르비탄, 모노라우린산 폴리옥시에틸렌소르비탄, 모노스테아린산 폴리옥세틸렌소르비탄, 폴리에틸렌글리콜모노올레이트, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리글리콜디에테르, 라우로일디에탄올아마이드, 지방산 이소프로판올아마이드, 말티톨히드록시 지방산 에테르, 알킬화 다당, 알킬글루코시드, 슈가에스테르 등의 비이온성 활성제, 스테아릴트리메틸암모늄클로라이드, 염화벤잘코늄, 라우릴아민옥사이드 등의 양이온성 계면활성제, 팔미틴산 나트륨, 라우린산 나트륨, 라우릴산 나트륨, 라우릴 황산칼륨, 알킬황산 트리에탄올아민에테르, 로드유, 리니어도데실벤젠황산, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유말레인산, 아실메틸타우린 등의 음이온성 계면활성제, 양성 계면활성제, 중화제, pH조정제, 완충제, δ-토코페롤, 부틸히드록시톨루엔 등의 산화 방지제, 페녹시에탄올, 파라벤, 알칸디올류, 감광색소 201호 등의 방부제를 들 수 있다. 또, 그 외, 에디트산 이나트륨, 에디트산 삼나트륨, 에디트산 사나트륨, 구연산 나트륨, 폴리인산 나트륨, 메타인산 나트륨, 글루콘산 등의 금속 봉쇄제, 카페인, 탄닌, 베라파밀, 트라넥삼산 및 그 유도체, 루틴, 헤스페리딘, 나린진이나 그 유도체를 비롯한 폴리페놀류, 감초 추출물, 글라브리딘, 피라칸타 열매의 열수추출물, 카르니틴, 코엔자임 Q₁₀, 각종 생약, 초산토코페롤, 히드록시데센 산, 글리시리진산 및 그 유도체 또는 그 염 등, 글루코스, 과당, 만노스, 자당, α, α-트레할로스, α, α-트레할로스의 당질유도체, 환상4당, 덱스트린, 시클로 덱스트린, 분기덱스트린, 전분, 분기전분, 풀루란 등의 당질, 감광색소 101호, 감광색소 301호, 감광색소 401호 등의 감광색소류, 향료, 색소 등도 적당히 배합할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제는, 화장품, 의약품, 의약부외품을 포함, 그 제형도 수용액계, 가용화계, 유화계, 유액계, 젤계, 페이스트계, 연고계, 에어졸계, 물-기름 2층계, 물-기름-분말 3층 등, 임의의 것을 포함한다. 또, 시트상 기제나 분말상 기제에 담지된 것도 포함한다.

본 발명의 피부 외용제란, 피부 거칠어짐, 기미나 주름, 염증, 노화 등의 예방, 보습, 미용 등을 목적으로 하여, 얼굴이나 신체의 피부 등의 표피에 직접 사용되거나 혹은 그 사용시에 피부에 접촉하여 이들에 영향을 미칠 가능성 있는 화장 비누, 세안제, 일반크림·유액, 화장수, 오데코롱, 로션, 화장오일, 백분, 파우더, 파운데이션, 치크파우더·아이브로우, 아이크림·아이섀도·마스카라, 향수, 선탠크림·자외선차단 크림, 선탠로션·자외선차단 로션, 선탠오일·자외선차단 오일, 아이라이너, 립스틱, 립크림, 치약, 목욕용 화장품, 각종 질환 치료제 등 스킨케어 화장품, 메이크업 화장품, 보디케어 화장품, 구강케어 화장품, 향수 화장품 등 화장품, 의약부외품 혹은 의약품을 말한다. 또, 연고, 찜질제, 필름제 등처럼 피부나 점막에 도포 혹은 붙여 사용하는 의약부외품이나 구강청량제처럼 구강 내에서 그 사용시에 직접 피부에 접촉하여 사용되는 의약품과 의약부외품도 이에 포함된다.

참고로, 본 발명의 피부 외용제의 유효성분인 글루코실아데노신은 이미 기술한 대로, 특정방법, 수단에 의하여 제조된 것에 한정되지 않아도 된다는 것은 말할 필요도 없지만, 경제성을 문제 삼는 것이라면, 당전이효소를 이용하는 효소법이 유리하다. 예를 들면, 전분질과 아데노신을 포함하는 용액에 시클로말토덱스트린·글루카노트란스페라아제(CGTase), α-글루코시다아제, 아밀라아제, α-이소말토실글루코 당질생성효소(예를 들면, WO02/10361호 팜플렛 참조), 이소말토실 전달효소(예를 들면, 국제공개 WO01/90338호 팜플렛 참조), α-글루코실 전이효소(국제공개 WO2008/136331호 팸플릿), 및 전분을 가수분해함과 동시에 글리코실기의 전이를 촉매로 하여, 시클로덱스트린 생성하고, 풀루란에 작용하여 패노스를 생성하는 α-아밀라아제(국제공개 WO2008/136331호 팸플릿)등의 당전이 활성을 갖는 효소를 사용하는 효소법에 의하여 대용량이면서 염가로 제조할 수 있다. 특히, 국제공개 WO2008/136331호 팜플렛에서 공개한 α-글루코실 전이효소를 사용한 경우에는 수용성이 높은 5'-글루코실아데노신을 고수율로 얻을 수 있다. 또, CGTase를 사용한 경우에는 α-글루코실 전이효소를 사용한 경우보다도 3'-글루코실아데노신의 구성비율이 높은 글루코실아데노신을 높은 수율로 제조할 수 있다.

전분질과 아데노신을 포함하는 용액에, 당전이 활성을 갖는 α-글루코실 전이효소나 CGTase를 작용시킴으로써 아데노신의 3'번 위치 또는 5'번 위치의 수산기에 1분자 또는 2분자 이상의 D-글루코스가 전이하여, 상기 3'번 위치 또는 5'의 수산기에 1분자의 D-글루코스가 결합된 3'-글루코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신이 생성됨과 동시에, 상기 3'번 위치 또는 5'번 위치의 수산기에 2개 이상의 D-글루코스가 결합된, 예를 들면, 3'-말토실아데노신이나 3'-말토트리오실아데노신 등의 3'-글리코실아데노신, 또는 예를 들면, 5'-말토실아데노신이나 5'-말토트리오실아데노신 등의 5'-글리코실아데노신이 생성된다.

α-글루코실 전이효소나 CGTase는 통상 전분질 농도가 1 내지 40w/v%가 되도록 전분질과 아데노신을 용해한 수용액에 대하여 전분질 1g당 1 내지 2,000단위, 바람직하게는 1 내지 1,000단위의 비율로 첨가되고, 당해 용액을 pH 약 3 내지 10, 온도 30 내지 70℃로 유지하면서 6시간 이상, 바람직하게는 약 12 내지 96시간 반응시킨다.

용액 중의 전분질과 아데노신의 질량비는 통상 무수물 환산으로 1:2 내지 20:1, 바람직하게는 1:1 내지 10:1의 범위로 설정한다. 전분질의 비율이 이 범위보다 커지면 아데노신으로의 당전이는 효율적으로 진행되기는 하지만, 아데노신의 생성율이 아데노신의 시발농도에 의한 제약을 받아, 저레벨에서 멈추게 된다. 반대로 아데노신의 비율이 상술한 범위보다 커지면, 미반응의 아데노신이 저량(著量)잔존하게 되어 공업적 생산에는 바람직하지 않다. 따라서, 상술한 비율의 범위를 최량(最良)으로 하였다.

또한, α-글루코실 전이효소나 CGTase에 더하여 전분 탈분지 효소로서 이소아밀라아제를 병용할 때, 이소아밀라아제는 아데노신과 전분질을 함유하는 용액 중 α-글루코실 전이효소나 CGTase와 공존시킨 상태에서 전분질에 작용시키는 것이 바람직하다. 그 첨가량은 이소아밀라아제의 지적온도, 지적pH 등에 따라 다르지만 일반적으로 전분질 1g당 200 내지 2,500단위로, 55℃ 이하에서 반응시키는 것이 바람직하다. 또, 전분 탈분지 효소로서 풀루라나아제를 사용하는 경우도, 이소아밀라아제에 준하여 사용하면 된다.

α-글루코실 전이효소 및/또는 CGTase와 전분 탈분지 효소에 의한 효소반응이 대강 완료되면 효소반응액을 가열하고 이들 효소를 실활하여 효소반응을 정지시키고, 이어서 이 효소반응액에 글루코아밀라아제를 작용시킨다. 글루코아밀라아제를 작용시키면 아데노신의 3'번 위치 및/또는 5'번 위치의 수산기에 결합하고 있는 2분자 이상의 D-글루코스쇄의 대부분이 절단되고, 3'-글루코실아데노신 및/또는 5'-글루코실아데노신으로 변환되며, 이들 화합물의 생성률이 높아지게 된다. 이러한 3'-글루코실아데노신 및/또는 5'-글루코실아데노신의 함유율을 높인 반응액은, 늘 사용하는 방법에 따라 활성탄 등을 사용하여 탈색여과하고, 나아가 이온교환 수지, 합성 흡착제 수지, 다공성 수지 등을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 적용함으로써 용액 중의 글루코실아데노신을 정제하면 좋다. 더 필요하다면, 역상 크로마토그래피 등을 사용하여 3'-글루코실아데노신 및/또는 5'-글루코실아데노신의 순도를 높여도 좋고, 각각의 화합물을 단리, 정제하여 사용하는 것도 자유롭다. 이들 글루코실아데노신을 함유하는 용액은 그대로 본 발명의 피부 외용제의 원료로 사용하여도 좋고, 필요에 따라 농축하여 사용해도 좋고, 또한 감압건조 또는 분무건조 등의 적합한 방법에 따라 건조하고, 필요에 따라 분쇄하여 사용해도 좋다.

글루코실아데노신의 제조비용에서 본 전분질에 대한 비용배분 등에 비추어, 원료는 전분을 사용하는 것이 바람직하고, 그 경우에는 액화전분에서의 글루코스 중합도를 조정하고, 분지(分枝)부분을 절단하기 위하여 예를 들면, 이소아밀라아제(EC 3.2.1.68), 풀루라나아제(EC 3.2.1.41) 등의 전분 탈분지효소를 병용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 이들 전분 탈분지효소 중 이소아밀라아제는 효소 활성, 기질 특이성 등의 면에서 취급이 용이하므로, 특히 바람직하다. 전분으로는 감자 전분, 고구마 전분, 타피오카 전분, 옥수수 전분, 밀 녹말 등을 들 수 있다. 또, 덱스트린과 같은 이들 전분의 부분 분해물을 사용하여도 좋고, 분자 내에 실질적인 분지구조를 갖지 않으면서 또한 글루코스 중합도가 갖추어진, 예를 들면 시클로 말토덱스트린, 시클로아밀로스, 합성아밀로스 등의 전분질을 사용하는 것도 자유롭다.

아데노신의 3'번 위치 및/또는 5'번 위치의 수산기에 결합하고 있는 2분자 이상의 D-글루코스쇄 절단에 사용하는 글루코아밀라아제는 그 공급원, 순도를 불문하고, 시판품이라도 상관없다. 예를 들면, 시판의 글루코아밀라아제제이며, 나가세켐텍스 주식회사가 상품명 『글루코팀 #20000』으로 판매하는 리조프스속에 속하는 미생물에서 유래하는 효소제나, 아마노엔자임 주식회사가 상품명 『글쿠자임』으로 판매하고 있는 아스페르길루스나 리조프스속의 미생물에서 유래하는 효소제를 사용할 수 있다.

이하, 실험에 의하여 본원발명을 더 상세히 설명한다.

<실험 1:α-글루코실 전이효소에 의한 글루코실아데노신의 조제>

<실험 1-1:α-글루코실 전이효소의 조제>

국제공개 WO2008/136331호 팜플렛의 실험 5의 방법에 의하여 녹말부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 마츠야화학공업 주식회사 제조) 1.5w/v(질량/용적)%, 효모 추출물(상품명 『폴리펩톤』, 일본제약 주식회사 제조)0.5w/v%, 효모 추출물(상품명 『효모 엑기스S』, 일본제약 주식회사 제조)0.1w/v%, 인산이칼륨 0.1w/v%, 인산일나트륨·2수화물 0.06w/v%, 황산마그네슘·7수화물 0.05w/v%, 황산망간·5수화물 0.001w/v%, 황산제일철·7수화물 0.001w/v% 및 물로 이루어진 액체배지에, 바실러스·서큘런스 PP710주(수탁번호 FERM BP-10771로서 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6소재의 독립행정법인산업기술종합연구소, 특허생물기탁센터에 기탁되었다)를 접종하고, 발효기에서 약 24시간 배양하였다. 배양 후, 원심분리하여 배양상청액을 회수하고, 80% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하여 4℃, 24시간 방치함으로써 염석하였다. 염석물을 원심분리하여 회수하고, 20mM 초산완충액(pH6.0)을 첨가하여 용해한 후, 동일 완충액에 대하여 투석하고, 막농축함으로써 농축 조효소액을 조제하였다. 본 농축 조효소액의 α-글루코실 전이효소 활성은 약 1300단위/ml였다. 또, 본 농축 효소액에는 약 140단위/ml의 아말라제 활성도 확인되었다.

또한, 상기 α-글루코실 전이효소의 활성은 다음과 같이 측정한다. 말 토스를 최종농도 1w/v%가 되도록 20mM 초산완충액(pH6.0)에 용해하여 기질(基質)로 한다. 이 기질액 5ml에 효소액 0.5ml를 추가하여 40℃에서 30분간 반응시킨 후,그 반응액 0.5ml과 5ml의 20mM 초산완충액(pH7.0)을 혼합하고, 비등수 중에서 10분간 가열함으로써 반응정지시킨 후, 반응액 중의 글루코스양을 상법에 따라 글루코스옥시다아제법으로 측정하고, 반응에 따라 생성된 글루코스양을 산출한다. α-글루코실 전이효소의 활성 1단위는 상기 조건하에서 1분간 1 마이크로몰의 글루코스를 생성하는 효소양으로 정의한다. 또, 혼재하는 아밀라아제의 활성은 다음과 같이 측정하였다. 즉, 단쇄 아밀로스(상품명 "아밀로스 EX-I" 주식회사 하야시바라 생물화학연구소 판매, 평균 중합도 17)를 최종농도 1w/v%가 되도록 1mM의 염화칼슘을 포함하는 50mM 초산완충액(pH6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 2ml에 효소액 0.2ml를 추가하여 35℃에서 30분간 효소반응시켜, 그 반응액체 0.2ml를 8ml의 0.02N황산 용액에 혼합하고, 반응정지시킨 후 0.2ml의 0.1N요오드 용액을 첨가하여 25℃에서 15분간 유지한 후에 660nm의 흡광도를 측정한다. 별도 반응 0시간의 반응액에 대하여 마찬가지로 측정하고, 반응시간당 요오드정색의 감소를 측정한다. 아밀라아제의 활성 1단위는 상기 조건 하에서 20mg의 단쇄 아밀로스 660nm에서의 흡광도(요오드정색)를 10% 저하시키는 효소양의 10배 분량이라고 정의하였다.

<실험 1-2:글루코실아데노신의 조제>

아데노신(와코쥰야꾸 주식회사 판매, 시약특급)의 농도가 10질량%가 되도록 0.3N의 염산에 용해하였다. 이 아데노신의 10질량% 용액 40ml와 덱스트린(마츠야화학 주식회사 판매, 상품명 『파인덱스 #1』, 고형물 약 92.3질량%) 12g을 2mM의 CaCl₂를 포함하는 50mM 초산완충액(pH6.0)336ml과 교반혼합하고, 실험 1-1에서 조제한 농축 조효소액을 50mM 초산완충액(pH6.0)으로 α-글루코실 전이효소의 활성이 20단위/ml가 되도록 희석한 효소액 9ml를 첨가하여 교반혼합하고 50℃에서 24시간 반응을 하였다. 반응종료 후의 반응액에 1N염산을 추가하여 pH3.5으로 조정 후, 글루코아밀라아제(나가세생화학공업사 판매, 상품명 『XL-4』, 3,800단위/ml)를, 덱스트린의 고형분 1g당 1,000단위 첨가하여 50℃에서 24시간 반응시키고, 100℃에서 10분간 처리하여 효소반응을 정지하였다. 이 효소반응을 정지한 반응액을 활성탄 컬럼(100mm×φ41mm)에 유속 SV=3(5ml/분)로 통액함으로써 글루코실아데노신을 칼럼에 흡착시킨 뒤 탈이온수(습윤수지용적의 5배량) 및 20용적% 에탄올용액(습윤수지용적의 3배량)으로 칼럼을 세정하고, 40용적% 에탄올용액으로 용출하였다. 용출액을 50ml씩 분획하고, 자외 흡수(260nm)가 0.15 이상의 획분을 회수하였다. 회수한 부분을 회전증발기(Rotary Evaporator)에서 농축하고, ODS컬럼을 사용한 분취용 고속 액체컬럼크로마토그래피(HPLC)에 제공하여, 글루코실아데노신의 용출획분의 메인피크를 회수하였다. ODS컬럼을 사용한 HPLC에 의한 분취를 2회로 나누어 실시하고, 고형물 환산으로 글루코실아데노신을 99질량%이상 함유한 표본을 합계로 약 0.8g 조제하였다. 또한, 분취용 HPLC는 이하의 조건으로 실시하였다.

<분취 HPLC조건>

장치:SHIMADZU Shodex RI-102(검출기), LC-10AD(펌프), SIL-10ADvp(오토 샘플러), C-R7Aplus(기록계)

칼럼:ODS컬럼(YMC사 판매, 상품명 『YMC-Pack R&D ODS-A』, φ20mm×250mm)

이동상(移動相):20mM 초산-초산암모늄완충액(pH3.5)/메탄올 84/16(용적/용적)

검출:RI

유속:3.0ml/분

칼럼 온도 35℃

<실험 2:CGTase에 의한 글루코실아데노신의 조제>

무수물 환산으로, 아데노신(도쿄화성공업 주식회사 판매, 시약특급)의 농도가 1w/v%, 덱스트린(마츠야화학 주식회사 판매, 상품명 『파인덱스 #1』)의 농도가 10w/v%가 되도록 10mM 초산나트륨 용액(pH5.5)에 첨가하여, 50℃로 가온하고, 교반하여 완전히 용해시켰다. 특개소50-63189호 공보(특공소53-27791호 공보)에 개시된 디오바실러스·스테아로테르모필루스(구분류에서는 바실러스·스테아로테르모필루스) Tc-91주(수탁번호 FERM BP-11273으로 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6소재의 독립행정법인산업기술종합연구소, 특허생물기탁센터에 기탁되어있다;수탁번호 FERM P-2225를 국제기탁으로 이관한 것) 유래의 CGTase(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조)를 덱스트린 1g당 1,000단위 첨가하여 50℃에서 24시간 반응 후, 100℃에서 15분간 가열하여 CGTase를 불활성화시킨 후, 글루코아밀라아제(나가세켐텍스 주식회사 판매, 상품명 『글루코팀 #20000』, 20,000단위/g)를 덱스트린 1g당 2,600단위 첨가하여 50℃에서 24시간 반응시켰다. 이 반응액을 100℃에서 10분간 가열한 후, 원심(11,500rpm)하고 상청을 회수하였다. 이 상청을 활성탄 칼럼 150ml(120mm×φ41mm)에 유속 SV=3(5ml/분)으로 통액함으로써 글루코실아데노신을 칼럼에 흡착시킨 뒤 탈이온수(습윤수지용적의 7배량) 및 20용적% 에탄올 용액(습윤수지용적의 6배량)으로 칼럼을 세정하고, 40용적% 에탄올 용액으로 용출하였다(습윤수지용적의 16배량). 용출액을 50ml씩 분획하고 자외선 흡수(260nm)가 0.15 이상인 획분을 회수하였다. 회수한 획분을 농축 후, ODS칼럼을 사용한 분취용 HPLC에 제공하고, 글루코실아데노신 함유획분의 메인피크를 회수하였다. 이 회수한 획분을 활성탄 칼럼에 흡착시켜 탈염하고, 40용적% 에탄올에 의하여 용출하고, 회전증발기에서 농축하여 글루코실아데노신의 용출획분을 회수하였다. 분취용 HPLC은 이동상에 20mM 초산-초산암모늄완충액(pH3.5)/메탄올 82/18(용적/용적)을 사용하여 칼럼 온도를 40℃로 한 것 이외는 상기 실험 1-2와 마찬가지로 글루코실아데노신의 분취와 같은조건에서 실시하고, 무수물환산 글루코실아데노신을 99질량%이상 함유하는 표본을 약 1.6g 조제하였다. 덧붙여, ODS컬럼을 사용한 분취용 HPLC에서 용출된 글루코실아데노신의 메인피크는 실험 1-2에서 용출된 글루코실아데노신의 메인피크와 는 다른 유지시간으로 용출되었다. 또한, 이러한 메인피크로 글루코실아데노신이 포함되어 있는 것은 미리 상법에 따른 매스스펙트럼(MS) 분석에 의한 분자량 측정에서도 확인하였다.

실험 1-2 및 실험 2에서 ODS칼럼을 사용한 분취용 HPLC에 의하여 조제한 2종의 글루코실아데노신의 구조를 상법에 따른 NMR분석에 의하여 결정하였다. NMR의 분석결과에 기초하여 2종의 글루코실아데노신의 카본 화학시프트값을 아데노신의 카본 화학시프트값과 함께 표 1에 나타낸다. 또한, NMR분석은 하기 조건에 의하여 실시하였다. 또, 아데노신의 카본 화학시프트값은 독립행정법인 산업종합기술 연구소 공개의 유기 화합물의 스펙트럼 데이터베이스(SDBS;http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi)에서 입수한 것을 표 1에 같이 나타낸다.

<NMR분석 조건>

장치:일본전자 주식회사 판매, 상품명 『JNM-AL300』, 1H:300.4MHz, 13C:75.45MHz

용매:중수(0.6ml)

내부표준:3-트리메틸실릴-1-프로판술폰산나트륨염(TPS)

적산횟수:1H-NMR 128회, 13C-NMR 4,000회, DEPT 400회, H-H COSY 32회, H-C COSY 36회

시료양:20mg

표 1에서 명확한 것처럼, 실험 1-2에서 조제한 글루코실아데노신은 리보스의 5'번 위치의 탄소δc값이, 실험 2에서 조제한 화합물은 리보스의 3'번 위치의 탄소δc값이 시프트하고 있는 점에서 각각 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신이라고 동정(同定)하였다.

<실험 3:글루코실아데노신의 물에 대한 용해성>

본 발명의 글루코실아데노신의 기본적인 성질로서, 물에 대한 용해성을 아데노신과 비교하였다. 실험 1-2에서 조제한 5'-글루코실아데노신 및 실험 2에서 조제한 3'-글루코실아데노신의 물에 대한 용해도를 다음과 같이 구하여, 아데노신의 용해도와 비교하였다. 즉, 500μl의 순수에 100mg의 5'-글루코실아데노신 또는 3'-글루코실아데노신(이하, 두 화합물을 총칭하여 "글루코실아데노신"라고 하는 경우가 있다.)을 각각 실온(25℃)에서 용해시켰다. 500μl의 순수에 5mg의 아데노신을 실온(25℃)에서 용해시켰다. 25℃의 항온실에 하루 정치 후, 원심분리에 의하여 녹고 남은 침전을 제거한 상청을 한외여과(일본미리포아사 판매, 상품명 『울트라프리 0.5 Biomax-5 Membrane』) 후, 이동상에서 희석하고 추가로 막여과(일본미리포아사 판매, 상품명 『Millex-LH』, 포어사이즈 0.45μm) 하였다. 이를 하기 조건의 HPLC에 제공하고, 자외선 검출기에 의한 크로마토그램에 출현한 피크의 면적에서 글루코실아데노신 및 아데노신 배출량을 각각 구하여, 농도를 계산하고 이를 실온(25℃)에서 최대 용해농도로 하였다. 같은 샘플을 4℃의 냉실에 1개월간 정치한 후, 다시 원심분리하여 마찬가지로 막여과 처리한 상청 중의 글루코실아데노신 및 아데노신 배출량을 각각 같은방법으로 측정하여, 이를 4℃에서 최대 용해농도로 하였. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

<HPLC분석 조건>

장치:SHIMADZU UV-VIS DETECTOR SPD-10AV(검출기), LC-10AT(펌프), C-R8A(기록계), SIL-20AC(오토 샘플러)

칼럼:ODS컬럼(YMC사 판매, 상품명 『YMC-Pack ODS-A』, φ4.6mm×250mm)

이동상:0.1용적%초산 수용액/메탄올=96/4(용적/용적)

검출파장:260nm

유속:1.0ml/분

주입량:20μl

칼럼온도:40℃

표 2에서 명확한 것처럼, 실온(25℃)의 물에는 아데노신이 0.8w/v% 밖에 용해되지 않은데 반해, 3'-글루코실아데노신은 물에 2w/v%까지 용해되어 아데노신보다도 물에 대한 용해성이 상승하였다. 또한, 5'-글루코실아데노신은 실온에서 물에 16.1w/v%를 초과하여 용해되어, 아데노신보다도 물에 대한 용해성이 현저하게 상승하였다. 또, 4℃의 물에는 아데노신이 0.4w/v%밖에 용해되지 않는 반면, 3'-글루코실아데노신은 2.0w/v%까지 용해되어 아데노신보다도 물에 대한 용해성이 상승하였다. 또한, 5'-글루코실아데노신은 4℃의 물에 15.7w/v%를 초과하여 녹아 아데노신보다도 물에 대한 용해성이 현저하게 상승하였다. 이 결과는 3'-글루코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신은 친수성 용매를 사용하는 피부 외용제 제조에 사용하는 경우, 예를 들면 용액상태로 조제할 수 있고, 조합시에 불용화하여 석출할 우려가 없는 등, 균질한 피부 외용제를 제조하는데 있어서의 가공적성이 향상하고 있는 것을 나타내고 있다.

<실험 4:글루코실아데노신의 지속성>

<실험 4-1:아데노신데아미나제에 대한 내성>

아데노신은 생체 내에 원래 존재하는 아데노신데아미나제(ADA)에 의하여 신속하게 이노신, 히포크산틴으로 분해되는 것이 확인되고 있다. 여기서, 아데노신의 배당체인 글루코실아데노신에 대하여 그 효과를 지속적으로 발휘할 가능성에 대하여 알아보기 위해, 아데노신 대사에 관여하는 효소의 공급원으로서 인간태아 정상섬유아세포의 셀라이세이트(cell lysate)을 사용하여 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신이 생체 내에서 분해되는지 여부를 확인하는 시험을 실시하였다. 10용적% 소태아 혈청(이하,"FCS"으로 약기한다)함유 둘베코의 최소필수 배지(닛스이제약 주식회사 판매, 상품명 『둘베코 변법 이글배지"닛스이"』, 이하 DMEM으로 약기한다)로 희석한 인간태아 정상섬유아세포(쿠라보사 판매, 이하"NHDF세포"라 한다)를, 150cm² 배양 플라스크(코닝사제)에 1.5×10⁶세포/20ml/플라스크에서 파종하여, 4일 동안 배양하였다. 배양상청을 제거 후, 0.05질량% 트립신/EDTA용액(기브코사 판매, 상품명 『Trypsin-EDTA』)으로 처리하고, 세포 현탁액을 플라스크에서 회수하였다. 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거 후, 세포의 펠렛(cell pellet)에, 분해효소 저해제 혼합물(Protease Inhibitor Cocktail)(Complete, EDTA-free, tablets, 로슈사제)을 용해한 10mM Tris-HCl(pH7.5) 완충액(Lysis완충 용액)을 추가하고, NHDF세포를 4.0×10⁶c/ml가 되도록 현탁하였다. 현탁액을 초음파 처리(BRANSON SINIFIER CELL DISROPTOR 185) 하고, 세포를 파쇄(3회, 각 30초×2회) 한 후, 15,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상청을 회수하고 셀라이세이트를 조제하였다. 실험 1-2에서 조제한 5'-글루코실아데노신 또는 실험 2에서 조제한 3'-글루코실아데노신을 농도 5mM가 되도록 용해된 인산 완충 생리식염수(PBS) 0.1ml와 상기 셀라이세이트 0.9ml을 혼합, 교반하고 37℃에서 반응시켰다. 반응개시시(0시간), 반응개시 1,7 및 24시간의 반응액을 회수하고, 실험 3와 같은방식으로 반응액을 처리하여, HPLC법에 의한 아데노신 또는 글루코실아데노신량을 정량하였다. 각각의 화합물의 반응개시시의 농도를 100%로 하고, 각 반응시간에서의 화합물의 반응액 중의 농도의 상대 값을 계산하여, 아데노신 혹은 글루코실아데노신의 잔존율로서 표 3에 나타낸다.

표 3에서 명확한 것처럼, 아데노신은 셀라이세이트에 포함된 효소에 의하여 신속하게 분해되고, 반응 7시간 후 완전히 소실하였다. 5'-글루코실아데노신은 반응 24시간이라도 90%이상이 잔존하고 있었다. 3'-글루코실아데노신은 반응 7시간 후 80%이상이 잔존하고, 24시간 후에는 17%가 잔존하였다. 이 결과는 아데노신은 생체 내에서는 단시간에 분해되고 그 기능을 소실하기 쉬운 것에 비해, 3'-글루코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신은 아데노신데아미나제(ADA)나 α-글루코시다아제 등의 생체 내에 원래 존재하는 효소의 작용을 받기 어렵고, 아데노신보다도 장시간 잔존하여 그 기능을 발휘할 수 있음을 나타내고 있다. 그리고, 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신을 NHDF세포의 셀라이세이트(cell lysate)와 반응시킨 경우, 모두 이노신이나 히포크산틴이 생성된 점, 및 이 반응이 α-글루코시다아제 저해제로 저해되는 점에서(데이터에는 나타나 있지 않다), 아데노신 배당체는 세포 내의 α-글루코시다아제에 의하여 아데노신과 글루코오스로 분해된 후, 아데노신과 마찬가지 ADA에 의하여 분해되고 이노신, 히포크산틴으로 분해된다고 판단하였다.

<실험 4-2:3차원 피부모델 중에서 잔존성>

본 발명의 글루코실아데노신의 효과의 지속성을 판단하기 위하여, 3차원 피부 환경에서의 잔존성에 대해서도 알아보았다. 12웰 플레이트(벡튼 디킨스사 판매, 상품명 『12웰 멀티 웰 플레이트』)에 EPI100 어쎄이 배지(쿠라보사 판매 상품명 『EPI 어쎄이 배지』)를 0.33ml/well 첨가하여 3차원 피부모델 EPI200(쿠라보사 판매 상품명 『EPI-200키트』)의 피부모델 컵을 웰에 옮겼다. 5% CO₂, 37℃에서 3시간 배양한 후, DMEM 배지(닛스이제약 주식회사 판매, 상품명 『둘베코 변법 이글배지"닛스이"』)를 0.9ml/well 첨가한 6웰 플레이트(벡튼 디킨스사 판매, 상품명 『6웰 멀티 웰 플레이트』)에 피부모델 컵을 옮겼다. 실험 1-2의 방법으로 조제한 5'-글루코실아데노신, 실험 2의 방법으로 조제한 3'-글루코실아데노신 또는 아데노신을 종농도가 0.1%가 되도록 30% 에탄올로 용해하고, 얻어진 용액의 0.1ml을 피부모델컵 내에 첨가하였다. 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양 후, 샘플 투과액(웰 중의 배지)을 회수하고, 한외여과(일본미리포아사 판매, 상품명 『울트라프리 0.5 Biomax-5 Membrane』) 한 후, 이동상에서 희석하였다. 이를 하기 조건의 HPLC에 제공하고, 별도로 작성한 검량선에 따라 5'-글루코실아데노신, 3'-글루코실아데노신 및 아데노신의 양을 구하였다. 3차원 피부 중 투과 후의 각 화합물의 잔존량과 이노신 및 히포크산틴의 생성량을 표 4에 나타냈다.

<HPLC분석 조건>

장치:HPLC 펌프 Model 510, 펌프 컨트롤러 Model 680, 오토인젝터 Model 712검출기 Model 2487, 데이터 처리(정량계산) Empower 2 software(미리포아사제)

칼럼:ODS칼럼(YMC사 판매, 상품명 『YMC-Pack ODS AQ-303』, φ4.6mm×250mm)

이동상:20mM초산-초산암모늄 버퍼(pH3.5)/메탄올=92/8(용적/용적)

검출 파장:260nm

속도:0.5ml/min

주입량:10μl

칼럼온도:40℃

표 4에서 명확한 것처럼, 아데노신은 3차원 피부투과의 과정에서 모두 이노신 및 히포크산틴으로 대사되고 소실하고 있었다. 그에 반해, 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신은 일부가 이노신이나 히포크산틴에 대사되었지만, 투여 24시간 후에 3차원 피부투과 후에도 잔존하고 있었다. 이것은 아데노신은 피부 내에 침투 후, 신속하게 분해되어 효과를 잃기 쉬운 것에 비해, 글루코실아데노신은 피부에 침투 후에도 안정적으로 존재하고, 진피까지 이르러 그 효과를 발휘함을 나타내고 있다. 3차원 피부에 있어서의 안정성은 5'-글루코실아데노신 쪽이 3'-글루코실아데노신보다 뛰어났다.

실험 4의 결과로부터, 아데노신은 피부에 투여 후 비교적 신속하게 분해되어 소실되지만, 글루코실아데노신은 아데노신보다도 피부에서 분해되기 어렵다는 것을 알게되었다. 특히, 아데노신은 신속하게 이노신이나 히포크산틴에 대사되는 것에 비해, 글루코실아데노신에서 아데노신이 검출되지 않고, 아데노신의 대사산물인 이노신이나 히포크산틴의 생성도 적은 것은 α-글루코시다아제에 의한 글루코실아데노신의 분해가 서서히 진행함을 나타내고 있고, 글루코실아데노신은 피부에서 장시간 잔존하여, 그 기능을 지속적으로 발휘할 수 있는 것을 말하고 있다.

<실험 5:글루코실아데노신의 케라티노사이트의 분화에 미치는 효과>

글루코실아데노신의 항주름작용에 관하여, 피부의 케라티노사이트에 미치는 효과를 알아보기 위하여 사람 피부의 케라티노사이트에 대한 분화 촉진제의 평가에 범용되고 있는 정상 인간피부 각질세포를 사용하여 이하와 같이 실시하였다. 즉, 정상 인간피부 각질세포(쿠라보사 판매, 신생아 유래, 이하"NHEK세포"라 한다)를 사용하여 케라티노사이트가 기저층 세포로부터 과립층 세포로 분화하는 경우, 과립층 세포로 분화했을 때에, 과립층 세포에 특이적으로 발현되고, 그 분화마커로 되어 있는 프로필라그린(profilaggrin:과립층 세포의 마커)을 지표로, 이 마커 단백질에 대한 특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅법에 의하여 그 발현량을 비교하고, 케라티노사이트의 분화에 대한 글루코실아데노신의 효과를 평가하였다. 본 실험에서 프로필라그린의 증가는 기저층의 케라티노사이트의 분화가 촉진되고, 과립층의 세포가 증가한 것을 의미한다.

<케라티노사이트의 분화평가 방법>

세포증식 첨가제(EDGS:EpiLife Defined Growth Supplement) 함유 EpiLife 배지(Caskade Biologics사 판매)(이하, EDGS함유 EpiLife 배지를 "EpiLife 배지"로 약기한다.)에 현탁한 NHEK세포를 5×10⁵세포/1.5ml/웰이 되도록 콜라겐(신덴젤라틴사 판매, 상품명 『Cellmatorix Type IV』)을 코트한 6 웰플레이트(벡튼 디킨슨사 판매, 상품명 『FALCON MULTI-WELLTM 6WELL』)에 파종하여, 인큐베이터에서 5용적% CO₂존재하, 37℃의 조건에서 2일간 배양하였다. 각 웰의 배양상청을 흡인제거하고 실험 1-2에서 조제한 5'-글루코실아데노신 또는 실험 2에서 조제한 3'-글루코실아데노신을 종농도가 0.1μM, 1μM 또는 10μM이 되도록 각각 EpiLife 배지에서 희석하여 1.5ml/웰 첨가하였다. 대조 1로서 아데노신을 종농도가 0.1μM, 1μM 또는 10μM이 되도록 EpiLife 배지에서 희석하여 1.5ml/웰 첨가하였다. 또한, 대조 2로서 EpiLife 배지만 1.5ml/웰 첨가하였다. 이후, 하루 걸러서 처음에 첨가한 것과 같은 성분을 포함하는 배지에서 배지교환하면서 배양을 8일간 실시하였다. 각 웰의 배양액을 흡인제거하고 PBS를 첨가하여 세정한 후, 추출 완충액(extraction buffer)을 100μl/웰 추가하고, 셀스크레이퍼를 사용하여 세포를 웰에서 박리하고, 1.5ml마이크로 튜브(엣펜도르프사 판매, 상품명 『엣펜도르프 튜브』)로 회수하였다. 회수한 세포를 볼텍스 믹서에 의하여 혼합, 현탁한 후 빙상에 30분 방치하고, 원심(15,000×g, 10분, 4℃)하고, 상청을 회수하여 분석용 샘플을 조제하였다. 또한, 추출 완충액으로서 2질량% 소디움도데실술페이트(SDS), 1mM 에디트산(EDTA), 20μM phenylmethylsulfonyle fluoride(PMSF), 20μM 류펩틴(leupeptin), 0.1μM 아프로티닌(aprotinin)을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 사용하였다.

<웨스턴블로팅 분석>

5용적%의 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는 2.5w/v% SDS수용액 8μl에 상기 분석용 샘플 12μl를 추가하여 혼합하고, 단백질량이 20μg/렌이 되도록 차지(charge)하여 통상법에 따라 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동하였다. 영동 종료 후, 겔에 포함되는 단백질을 상법에 따라, 니트로셀룰로오스막으로 옮기고 비특이적인 반응을 억제하기 위한 블로킹 용액(대일본스미토모 제약회사 판매, 상품명"블록 에이스")에 침지하였다. 이 블로킹 처리를 한 니트로셀룰로오스막을 항 프로필라그리 항체(Santa Cruz사 판매, 상품명 『Filaggrin(AKH1)Antibody』)를 10용적%블록 에이스 포함 50mM TBS(200mM NaCl 함유 50mM Tris-HCl(pH7.4))완충액(이하,"TBS완충액"이라 한다)으로 100배 희석한 용액에 실온에서 1시간 침지한 후, 0.05용적% 트윈 20을 포함하는 50mM TBS완충액으로 세정하여 과잉항체를 제거하였다. 니트로셀룰로오스막을 HRP표지한 항마우스 IgG 토끼 폴리클로날 항체(DAKO사 판매)용액에 실온에서 2시간 침지하였다. 이 막을 0.05용적% 트윈 20을 포함 50mM TBS완충액으로 30분간 세정 후, 발색반응은 시판의 웨스턴블로팅 검출키트(디이헬스 케어 바이오사이언스사 판매, 상품명 "ECL western blotting detection reagent and Hyperfilm ECL")를 사용하여 실시하였다. 대조로서, 항프로필라그리 항체 대신 항β-액틴 항체를 사용한 것 이외에는 똑같이 처리를 하였다. 발색 후의 니트로셀룰로오스막을 덴시토미터(아마샴·팔마시아·바이오텍사 판매, 상품명 『Image Master 1D』)에 의하여 각 밴드의 농도(강도)를 측정하고, β-actin을 내부표준으로 하여, 프로필라그리의 밴드강도를 β-actin의 밴드강도의 값으로 나누어 프로 필라그린의 발현량으로 하였다. EpiLife 배지에서만 배양한 대조 2의 프로필라그린의 발현량을 1로 하고, 5'-글루코실아데노신, 3'-글루코실아데노신 또는 아데노신을 첨가하여 배양했을 때의 프로필라그린의 발현량의 상대값을 구하여 표 5에 나타낸다.

표 5에서 명확한 것처럼, 배지에 아데노신을 첨가하여 배양한 경우에는 NHEK세포에서의 프로필라그린 단백질 발현량의 유의적인 증강은 인정되지 않았다. 이에 반해 배지에 5'-글루코실아데노신 또는 3'-글루코실아데노신을 첨가하여 NHEK세포를 배양했을 경우, 표피의 과립층 세포의 마커인 프로필라그린 단백질의 발현량의 유의적인 증가가 인정되었다. 이 결과는 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신은 모두 표피 기저층의 케라티노사이트를 과립층 세포로 분화시키는 케라티노사이트 분화촉진 작용을 가지며, 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 성분으로서 적합하다는 것을 나타내고 있다. 또한, 5'-글루코실아데노신과 3'-글루코실아데노신을 비교하면 5'-글루코실아데노신을 첨가한 경우가 강한 프로필라그린 단백질의 발현증강 효과를 나타냈다.

<실험 6:글루코실아데노신의 콜라겐 생성에 미치는 효과>

글루코실아데노신의 항주름작용에 대하여, 진피에서의 콜라겐 생성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 사람피부의 콜라겐 생성 증강제 평가에 범용되는 인간태아 정상섬유아세포(NHDF)를 사용하여 이하와 같이 실시하였다. 즉, 인간태아 정상섬유아세포(쿠라보사 판매, 이하 "NHDF세포"라 한다)를, 10용적% 소태아 혈청(이하,"FCS"으로 표기한다)함유 둘베코의 최소필수배지(이하, DMEM으로 약기한다)(닛스이 제약회사 판매)에 현탁하고 24웰 플레이트(벡튼 디킨슨사 판매, 상품명 『FALCON MULTI-WELL^TM 24WELL』)에 1.5×10⁵세포/0.5ml/웰에 파종하여, 인큐베이터에서 5용적%₂ 존재하, 37℃의 조건에서 하루 동안 배양하였다. 실험 1-2에서 조제한 5'-글루코실아데노신, 실험 2에서 조제한 3'-글루코실아데노신 또는 아데노신의 어느 하나를 종농도가 표 6에 나타내는 농도가 되도록 10용적% FCS함유 DMEM으로 희석하고 0.5ml/웰에 첨가하여 인큐베이터에서 5용적% CO₂존재하, 37℃의 조건에서 3일 간 배양 후, 배양상청을 흡인제거하고 인산 완충 생리식염수(PBS)으로 세정 후 1M초산으로 1mg/ml에 희석한 펩신(SIGMA사 판매)용액을 250μl/웰 첨가하였다. 실온에서 4시간 진탕한 후 셀 스크레이퍼로 웰에 부착된 세포를 웰에서 박리하고, 피펫팅하여 펩신소화 후의 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로 튜브(에펜도르프사 판매, 상품명 『에펜도르프 튜브』)로 회수하였다. 이 튜브에 콜라겐 정량용 발색시약(Biocolor사 판매, 상품명 『Sicrol Collagen Assay kit』)을 500μl/튜브 첨가하고 볼텍스 믹서에서 혼합 후, 실온에서 로테타(TAITEC사 판매, 상품명 『RT-50』)를 사용하여 정확하게 30분간 전도혼화한 후, 4℃에서 10분간 원심(15,000rpm)하고, 상청을 제거한 침전에 1N의 NaOH를 100μl/튜브 첨가한 후, 침전을 피펫팅으로 녹여 그 전량 96 마이크로 웰플레이트(벡튼 디틴슨사 판매, 상품명 『FALCON MICROTEST^TM96』)로 옮겨, 흡광도계(Molecular Devices사 판매, 상품명 『Vmax microplate reader』)에 의하여 흡광도(A560-A650)를 측정하였다. 같은 방법으로 타입 I 콜라겐(KOKEN사 판매)을 사용하여 작성한 콜라겐 정량용 발색시약에 의한 발색의 검량선에 기초하여 각 웰의 콜라겐량을 구하여 표 6에 같이 나타낸다.

표 6에서 명확한 것처럼, 배지에 아데노신을 첨가한 경우 5μM의 첨가로는 무첨가의 경우와 차이가 인정되지 않기는 하지만, 10μM의 첨가로는 콜라겐 산생 의 항진이 인정되었다. 이에 반해, 5'-글루코실아데노신 또는 3'-글루코실아데노신을 첨가하여 NHDF세포를 배양한 경우, 모두 그 농도에 의존하여, 유의적인 콜라겐산생의 항진이 인정되고 이 콜라겐 산생증강 작용의 세기는 아데노신보다 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신이 강했다. 이것은 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신은 아데노신보다도 섬유아세포에서의 콜라겐 생성을 증강시키는 기능이 뛰어나며, 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 성분으로서 적합하다는 것을 나타내고 있다. 콜라겐 생성 증강작용의 세기는 5'-글루코실아데노신과 3'-글루코실아데노신이 거의 동등했다.

실험 5와 실험 6의 결과는 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신은 모두 표피의 케라티노사이트 분화촉진 작용과 진피의 섬유아세포에 의한 콜라겐 산생증강 작용을 겸비하고, 항주름작용을 가진 피부 외용제의 유효성분으로서 이용할 수 있음을 말한다. 또한, 이러한 효과는 글루코실아데노신이 아데노신보다 더 강하다고 판단되었다.

<실험 7:글루코실아데노신의 케라티노사이트의 분화에 미치는 효과 2>

실험 5에서 글루코실아데노신이 피부개선에 유효한 표피 케라티노사이트의 분화촉진 작용을 갖는 것이 확인되었으므로, 이 작용에 대하여 더욱 상세하게 해석하기 위하여 실시간 PCR분석을 사용하여 케라티노사이트의 분화 마커 유전자를 지표로서 그 발현량의 변화를 알아보는 시험을 이하와 같이 실시하였다. 또한, 사람의 피부보습이나 방어기능에 중요한 역할을 가지며 피부개선에 유효한 세라마이드 합성에 미치는 글루코실아데노신의 영향을 알아볼 목적으로 세라마이드의 합성에 관여하는 유전자 발현량에 대해서도 아울러 검토하였다. 즉, 해석대상 유전자로서, 케라티노사이트의 분화마커로서 프로필라그린(PFG:후기 마커)이나 인볼크린(INV:초기 분화마커)을 세라마이드의 합성에 관여하는 효소인 β 글루코세레브로시다아제(GCase), 스핑코미엘리나아제(SMase)를 선택하고, PCR반응시 내부표준으로서 사이클로필린 B(CypB)의 유전자를 사용하였다(표 7 참조). 콜라겐을 코트한 6 웰플레이트에 NHEK세포를 8×10⁴세포/1.5ml/웰로 파종하고, EpiLife 배지를 사용하여 인큐베이터에서 5용적% CO₂존재하, 37℃의 조건으로 2일 배양하고 배지를 제거 후, 5'-글루코실아데노신, 3'-글루코실아데노신 또는 아데노신을 함유하는 새로운 EpiLife 배지를 1.5ml/웰 첨가하고(글루코실아데노신 또는 아데노신의 종농도는 1μM), 하루 걸러서 글루코실아데노신 또는 아데노신을 함유하는 같은 배지를 사용하여 배지 교환(1.5ml/웰에)하면서 7일간 배양하였다. 배양종료 후, 각 웰을 PBS(K-)에서 2회 세정 후 0.025질량% 트립신/EDTA용액을 0.2ml/웰 첨가하고 실온에서 5분 방치함으로써 세포를 플레이트에서 박리하였다. 또한, 중화액(키렉스 처리한 0.5용적% FCS함유 PBS)을 1ml/웰 첨가하고, 피펫팅하면서 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로 튜브(에펜도르프사 판매, 상품명 『에펜도르프 튜브』)로 회수하였다. 이 튜브를 5,000rpm, 5분간 원심하고 상청을 제거함으로써 얻은 세포펫릿을 전RNA추출에 제공하였다. 대조로서, EpiLife 배지만을 첨가하여 배양한 세포를 같은방법으로 처리하였다. 시험은 대조, 글루코실아데노신 또는 아데노신에 대하여 각 3웰을 사용하였다.

이들 세포펠릿으로부터의 전RNA추출은 시판의 RNA추출 키트(모두 기아겐(GIAGEN)사 판매, 세포의 파쇄:상품명 『QIA shledder』, RNA의 회수:상품명 『RNeasy Mini kit』)를 사용하고, 조작은 그 설명서에 따랐다. 도중에 DNase(기아겐사 판매)처리를 추가하였다. 다음으로 시판의 역전사효소(기브코사 판매, 상품명 『M-MLVRT』)를 사용하여 첨부의 설명서에 준하여 이하와 같이 cDNA템플릿을 합성하였다. 전RNA에 올리고dT 랜덤프라이머(기브코사 판매) 및 dNTPs(GE헬스케어사 판매, 상품명 『DNA polymerization Mix』)를 혼합하여 70℃에서 5분간 처리 후 빙상에서 1분 이상 방치하였다. 이에 역전사효소 및 디티오 트레이톨을 첨가하고 25℃에서 10분간, 42℃에서 50분간, 계속해서 70℃에서 15분간 인큐베이트하였다.

내부표준 및 해석대상 유전자의 PCR분석에 필요한 프라이머의 염기서열(Forward 및 Reverse 프라이머)은 GENBANK의 mRNA배열에서 "primer 3 소프트웨어"(프리웨어)를 사용하여 설계하거나 혹은 이미 알려진 염기서열을 사용하고, 프라이머는 합성의 수탁회사(시그마-올드리치 주식회사)에 의뢰하여 조제하였다. 본 실험대상으로 한 분석대상 유전자 및 내부표준으로서 사용한 유전자 및 이들의 유전자의 PCR반응의 프라이머로서 사용한 염기서열을 표 7에 같이 나타낸다. 이 프라이머를 사용하여 시판의 PCR 정량해석 시스템(로슈·다이아그노스틱스사 판매, 상품명 『Light Cycler480』)에 의하여 각 해석대상 유전자의 발현량을 정량하였다. 각 cDNA템플릿의 PCR 반응은 시판의 PCR 키트(로슈·다이아그노스틱스사 판매, 상품명 『SYBR Green I Master kit』)를 사용하고, 그 첨부 설명서를 바탕으로 처음에 반응액을 95℃에서 5분간 열변성한 후, PCR반응(95℃에서 10초, 60℃에서 10초 72℃에서 15초를 1사이클로 하고, 이를 45사이클 되풀이하였다)을 하였다. 내부표준으로서 시클로필린 B를 코드하는 DNA를 사용하여 각 해석대상 유전자의 상대적인 발현량을 산출하였다. 대조에서의 각 해석대상 유전자의 발현량의 3웰의 평균값을 1.00로 하고, 각각의 해석대상 유전자 발현량의 상대값의 3웰의 평균값을 구하여 표 8에 나타낸다.

표 8에서 명확한 것처럼, NHEK세포는 아데노신을 첨가하여 배양한 경우에는 프로필라그린(PFG), 인볼크린(INV), β 글루코세레브로시다아제(GCase) 및 스핑고미엘리나아제(SMase) 유전자 발현량이 각각 1.41, 1.15, 1.37, 1.35가 되고, 어느 유전자도 대조의 발현량과 비교하여 유의적인 증강은 인정되지 않았다. 이에 대하여 3'-글루코실아데노신을 첨가하여 배양했을 경우에는 프로필라그린(PFG), 인볼 크린(INV), β 글루코세레브로시다아제(GCase) 및 스핑고미엘리나아제(SMase) 유전자 발현량이 각각 2.03, 1.52, 2.08, 2.03이 되고 어느 유전자도 대조의 발현량과 비교하여 유의적으로 증강되었다. 또, 5'-글루코실아데노신을 첨가하여 배양했을 경우, 배지에서만 배양했을 경우와 비교하여 프로필라그린(PFG), 인볼크린(INV), β 글루코세레브로시다아제(GCase) 및 스핑고미엘리나아제(SMase) 유전자 발현량이 각각 2.54, 1.66, 2.68, 2.57이 되고, 어느 유전자도 대조의 발현량과 비교하여 유의적인 증강이 인정되었다. 이 결과는 3'-글루코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신에 의한 케라티노사이트 분화촉진 작용이 유전자 발현레벨에도, 그리고 그 증강 작용은 유전자 레벨에 있어서도 아데노신보다 글루코실아데노신이 강하다는 것을 나타내고 있다. 또, 글루코실아데노신 첨가 후 24시간 이상 경과하여도 상기 유전자가 발현하고 있다는 점에서, 글루코실아데노신의 효과는 적어도 24시간 지속되고 있음을 나타내고 있다. 3'-글루코실아데노신과 5'-글루코실아데노신을 비교하면 5'-글루코실아데노신이 강한 것을 나타내고 있다. 또한, 이 실험결과는 글루코실아데노신이 β 글루코세레브로시다아제나 스핑고미엘리나아제 등, 피부의 보습이나 방어기능에 중요한 역할을 하고 있는 세라마이드의 합성에도 유전자 레벨에서 작용하는 것을 나타내고 있으며, 글루코실아데노신이 β 글루코세레브로시다아제나 스핑고미엘리나아제의 발현 증강제, 또한 세라마이드의 합성 촉진제로 이용할 수 있는 것을 나타내고 있다.

<실험 8:케라티노사이트 증식인자에 미치는 영향>

실험 5 및 7에서 글루코실아데노신은 케라티노사이트 분화를 촉진하는 작용이 확인되었으므로, 케라티노사이트의 증식에 대한 영향도 알아보았다. 정상 사람 피부 섬유아세포(NHDF)에서, 케라티노사이트 증식인자(KGF) 발현에 대한 5'-글루코실아데노신과 3'-글루코실아데노신의 영향을 비교하였다. NHDF를 10% FBS(JRS사 판매, 상품명 『Fetal Bovine Serum(FBS) Australian Origin』)함유 DMEM 배지(닛스이 제약 주식회사 판매, 상품명 『둘베코 변법 이글배지"닛스이"』)에 현탁하고, 12웰 플레이트(벡튼 디킨슨사 판매, 상품명 "12웰 멀티 웰플레이트")에 3×10⁵cells/ml/well에서 파종하여, 5% CO₂, 37℃에서 하루를 배양하였다. 배양상청을 제거 후, 실험 1-2의 방법으로 얻은 5'-글루코실아데노신 또는 실험 2의 방법으로 얻은 3'-글루코실아데노신을 종농도 0.15, 1.5mM이 되도록, 각각을 1% FCS함유 DMEM 배지로 희석하고 첨가하였다. 글루코실아데노신을 포함하지 않는 1% FCS함유 DMEM 배지를 첨가한 것을 대조로 하였다. 5% CO₂, 37℃에서 4시간 배양 후, 배양상청을 흡인제거하고 PBS(-)에서 2회 세정한 후, 세포를 RNA추출에 제공하였다.

전RNA추출은 시판의 RNA 추출키트(기아겐사 판매, 상품명 『QIA shledder+RNeasy Mini kit』)를 사용하여 실시하였다. 조작은, 키트에 부속된 설명서를 따랐다. RT반응은 Super Script VILO cDNA 합성키트(Invitrogen사 판매, 상품명 『Super Script VILO cDNA합성 키트』)를 사용하고, RNA10.5μl, 5×VILO reaction mix3μl, 10×enzyme mix1.5μl를 혼합한 것(합계 15μl)을 25℃에서 10분간, 42℃에서 60분간, 이어서 85℃에서 5분간 처리하는 조건으로 실시하였다.

실시간 PCR반응은 LightCycler480 SYBR Green I Master(Roche Diagnostics사, 상품명 『LightCycler480 SYBR Green I Master』)를 사용하고, 물 1.8μl, master Mix6.0μl, primer L(10μM)0.6μl, primer R(10μM)0.6μl, template3.0μl을 혼합하여(합계 12.0μl), 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 이어서 72℃에서 15초 유지하는 조건으로 45 사이클을 실시하였다. 각 샘플의 KGF발현량은 표준곡선으로 산출하고, 내부표준(18s rRNA)의 발현양으로 보정하였다. 대조에서의 발현량을 1.0으로 한 경우의 상대값을 구하여, 각 샘플의 발현량을 평가하였다. 사용한 프라이머는 표 9에 나타낸 것을 사용하였다. 결과를 표 10에 나타냈다.

표 10에서 명확한 것처럼, 3'-글루코실아데노신을 사용했을 경우 0.15mM 이상의 농도에서 KGF의 발현량이 2배 이상이 되고, 5'-글루코실아데노신을 사용했을 경우, 1.5mM 이상의 농도에서 KGF의 발현량이 상승하였다. 이것은 3'-글루코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신은 모두 케라티노사이트의 분화 뿐만 아니라, 그 증식도 촉진하는 작용을 갖는 점에서 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로서 적합하다는 것을 나타내고 있다.

실험 5,7 및 실험 8의 결과는, 3'-글루코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신은 모두 케라티노사이트의 분화 및 증식을 촉진하므로 피부의 턴오버를 개선하는 작용을 가지며, 주름발생을 억제하는 작용에서 뛰어나다는 것을 나타내고 있다. 또, 실험 7에 의하여 본 발명의 글루코실아데노신의 효과는 첨가 후 24시간 경과하여도 지속되고 있는 점, 실험 4에 의하여 본 발명의 글루코실아데노신은 피부에서 장시간 잔존하는 것이 나타나고 있는 점에서, 본 발명의 글루코실아데노신의 항주름작용은 지속성을 갖는 것을 나타내고 있다. 또한, 5'-글루코실아데노신은 케라티노사이트 분화에 대하여, 3'-글루코실아데노신은 케라티노사이트 증식에 대한 촉진효과가 강했던 점에서, 피부 외용제에 사용할 경우, 목적에 따라 두 글루코실아데노신을 적의 조합하여 이용하는 것이 적합하다.

<실험 9:글루코실아데노신의 세포장해>

글루코실아데노신에 관하여 지속성이 있는 피부 외용제의 성분으로서 피부에 계속적으로 사용할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여, 그 세포장해에 대하여 알아보았다. 글루코실아데노신 및 아데노신의 3차원 피부에 대한 영향으로서 세포가 장해를 받았을 때에 방출되는 락토오스디히드로게나아제(LDH)를 지표로 하고, 세포장해의 세기를 알아보았다. 24웰 플레이트(벡튼 디킨슨사 판매, 상품명 『24웰 멀티 웰 플레이트』)에 EPI100 어쎄이 배지(쿠라보사 판매 상품명 『EPI 어쎄이 배지』)를 0.19ml/well 첨가하고, 3차원 피부모델 EPI200(쿠라보사 판매 상품명 『EPI-200키트』)의 피부모델컵을 상기 웰에 옮겼다. 5% CO₂, 37℃에서 3시간 배양한 후, 새로운 6 웰플레이트(벡튼 디킨슨사 판매, 상품명 『6웰 멀티 웰플레이트』)에 EPI100 어쎄이 배지를 0.9ml/well 첨가하여 피부모델컵을 옮겼다. 실험 1-2의 방법으로 얻은 5'-글루코실아데노신, 실험 2의 방법으로 얻은 3'-글루코실아데노신 또는 아데노신을 종농도 5%가 되도록 30% 에탄올에 용해하고, 얻어진 용액 0.1ml을 피부모델컵 내에 첨가하여 18시간 후, 투과액(웰 내의 배지)을 회수하였다. 글루코실아데노신 및 아데노신을 포함하지 않는 30% 에탄올을 첨가한 것을 대조로 하였다. 회수한 투과액에 대하여 피부모델에서 방출된 락토오스디히드로게나아제(LDH)활성을 세포장해 검출키트(로슈사 판매 상품명 『세포장해 검출키트(LDH)』)를 사용하여 측정하고, 대조의 LDH활성을 1.0으로 하여 상대 LDH활성을 구하여 각 시료의 세포독성을 평가하였다. 결과를 표 11에 나타냈다.

표 11에서 명확한 것처럼, 아데노신을 사용했을 경우, 회수액 중의 LDH활성이 농도의존적으로 상승하여 농도 1%로 명백한 LDH의 방출이 인정되었다. 한편, 5'-글루코실아데노신 및 3'-글루코실아데노신을 사용했을 경우에는, 모두 농도 5%에서도 LDH활성은 상승하지 않고, LDH의 방출은 인정되지 않았다. 이것은 아데노신은 농도의존적으로 세포장해를 일으킬 우려가 있지만, 본 발명의 글루코실아데노신은 아데노신과 비교하여 지극히 피부에 대한 장해를 일으키기 어려운 것을 나타내고 있고, 피부 외용제의 유효성분으로서, 특히 장시간 피부에 적용할 수 있는, 지속성있는 항주름작용을 가진 피부 외용제의 유효성분으로서 유용함을 나타내고 있다. 또한, 상술한 바와 같이 본 발명의 글루코실아데노신은 α-글루코시다아제에 의하여 서서히 분해되고, 생성한 아데노신은 신속히 대사되기 때문에 α-글루코시다아제에 의하여 글루코스와 아데노신으로 분해되어도 세포장해를 일으킬 우려가 있는 아데노신으로서 축적되지 않는다고 생각된다.

<실험 10:글루코실아데노신의 안전성>

글루코실아데노신의 안전성을 10명의 지원자에 대한 패치 테스트에 의하여 평가하였다.

<피험자>

나이가 22 내지 45세의 남녀 총 20명(남성 10명, 여성 10명)을 무작위로 10명씩(각군 남자 5명, 여성 5명)의 2군으로 나눴다.

<피험시료>

실험 2의 방법으로 얻은 3'-글루코실아데노신 또는 실험 1-2의 방법으로 얻은 5'-글루코실아데노신을 하기 농도가 되도록 정제수에 용해하여, 피험시료 1 및 2를 조제하였다. 대조로서 정제수를 사용하였다.

피험시료 1: 3'-글루코실아데노신 2w/v%를 함유하는 수용액

피험시료 2: 5'-글루코실아데노신 2w/v%를 함유하는 수용액

대조: 정제수만

<시험방법>

1군 10명에게는 피험시료 1과 대조를 도포하였다(실험 군 1). 10명의 피험자 중 무작위로 선택한 5명의 피험자에게 좌측상완 내측에 대조를 도포하고, 우측상완 내측에 피험시료 1을 도포하며, 나머지 5명에는 좌측상완 내측에 피험시료 1을 도포하고, 우측상완 내측에 대조를 도포하였다. 피험시료 1 또는 대조의 각각 15μl를 핀챔버(에피테스트(Epitest Ltd.)사제 핀란드)를 사용하여, 상법에 따라 24시간의 폐색도포를 실시하였다. 나머지 1군 10명의 피험자에게는 피험시료 1 대신 피험시료 2를 15μl을 사용한 것 이외에는 피험시료 1과 같은 조건으로 24시간의 폐색 도포 시험을 실시하였다(실험 군 2). 도포 개시 24시간 후에 핀챔버를 제거하고, 제거 후 1시간과 24시간의 도포부위 상태를 육안으로 확인하였다. 시료 도포부위의 피부상태를 하기 판정기준에 의하여 판정하고, 그 피험자 수를 표 12에 나타낸다. 또한, 시험기간 중 핀챔버를 제거할 때까지 입욕, 샤워, 과격한 운동은 금지하고 제거 후 24시간은 과격한 운동을 금지하는 동시에, 수건 등에 따른 마찰 등 시료 도포부위에 대한 자극행위를 금지하였다.

<평가방법>

일본 접촉피부염 학회의 "환경피부과학"이 나타내는 패치 테스트 판정기준 중의 본방 기준(http://www.daiichiclinic.jp/derma/sesyoku/contents_03/patchte st_table_2.html)에 따라 도포부위를 육안으로 판정하였다. 판정은 반응없음(-), 약한 홍반(±), 분명한 홍반(+), 홍반+부종, 구진(++), 홍반+부종·구진+작은수포(+++), 큰수포(++++)의 6단계로 평가하였다.

표 12에서 명확한 것처럼, 피험시료 1(3'-글루코실아데노신) 및 대조를 도포한 실험군 1에서는 핀챔버 제거 후 1시간 및 24시간에서 모두 도포부위에 반응은 인정되지 않았다. 피험시료 2(5'-글루코실아데노신) 및 대조를 도포한 실험군 2군에서는 핀챔버 제거 후 1시간 및 24시간에서 모두 도포부위에 반응은 인정되지 않았다. 이 결과는 글루코실아데노신이 피부에 도포하여도 안전한 물질임을 나타내고 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 어떠한 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

<글루코실아데노신 함유분말>

아데노신(와코순약공업 주식회사 판매, 시약특급)의 농도가 1w/v%, 덱스트린(마츠야화학 주식회사 판매, 상품명 『파인덱스 #1』, 고형물 약 92.3질량%)의 농도가 10w/v%가 되도록, 각각을 2mM의 CaCl₂용액 6,600ml에 첨가하고, 50℃로 가온하여 교반함으로써 완전히 용해하였다. 1N HCl에 의한 pH를 6.0으로 조정한 후, 실험 1-1에서 조제한 바실러스·써큘러스 PP710주(독립행정법인 산업기술종합연구소, 특허생물기탁센터 수탁번호 BP-10771)를 배양함으로써 조제한 α-글루코실 전이효소의 농축 조효소액을 50mM 초산완충액(pH6.0)에서 α-글루코실 전이효소의 활성이 500단위/ml가 되도록 희석한 효소액 30ml(α-글루코실 전이효소를 덱스트린 1g당 20단위 첨가)를 추가하여 교반혼합하고, 50℃에서 24시간 반응을 실시하였다. 반응 종료 후의 반응액에 1N HCl을 추가하여 pH3.5로 조정 후, 글루코아밀라아제(나가세 생화학 공업사 판매, 상품명 『XL-4』, 3,800단위/ml)를, 덱스트린의 고형분 1g당 1,000단위 추가하여 50℃에서 24시간 반응시키고, 100℃에서 10분간 처리하여 효소반응을 정지하였다. 이 효소반응을 정지한 반응액을 활성탄 컬럼(100mmφ 41mm)에 유속 SV=3(5ml/분)으로 통액함으로써 글루코실아데노신을 칼럼에 흡착시킨 후, 탈염수(습윤수지용적이 5배량) 및 20용적% 에탄올 용액(습윤수지용적이 3배량)으로 칼럼을 세정하고, 40용적% 에탄올 용액에서 용출하였다. 용출액을 50ml씩 분획하고 자외흡수(260nm)가 0.15 이상인 획분을 회수하였다. 회수한 획분을 회전증발기에서 농축하여, 강산성 양이온 교환수지(오르가노사 판매, 상품명 『XT-1030E』(Na형), φ4.2cmx100cm, 2개)에 40ml/분의 유속으로 통액하고, 탈이온수를 사용하여 용출하고 회수한 획분을 실험 3과 같은조건의 HPLC에 의한 분석하여 무수물환산으로 글루코실아데노신을 95질량% 이상 함유하는 것으로 계산된 획분을 회수하였다. 또한, 이 회수한 획분을 감압건조함으로써 글루코실아데노신 함유분말 15g을 얻었다. 본품은, 무수물환산으로 5'-글루코실아데노신을 약 85질량%, 3'-글루코실아데노신을 약 10질량%, 니게로실아데노신을 약 0.3질량%, 아데노신을 약 2질량% 함유하고 있었다. 본품은, 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로서, 그자체로 적의한 담체, 부형제, 안정제, 완충제, pH 조정제, 용매 등 임의의 보조제 등을 첨가한 제제로서, 혹은 이들을 배합한 의약품, 의약부외품, 화장품 등의 형태로 사용할 수 있다. 또한, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식 촉진제, 콜라겐 산생 증강제, 세라마이드 합성촉진제 혹은 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

덧붙이면, 상기 니게로실아데노신은 본품을 하기 조건의 HPLC에 제공한 바, 5'-글루코실아데노신, 3'-글루코실아데노신, 아데노신의 용출피크 이외에, 아데노신과 3'-글루코실아데노신의 용출피크 사이에 마이너 피크(리텐션 시간이 약 22 내지 23분)로서 확인되었다. 이러한 피크획분을 회수하고, 상법에 따른 매스 스펙트럼(MS) 분석에 제공한 바, 분자량이 607로 산출되었으므로, 아데노신에 2분자 글루코스가 결합된 화합물이라고 판단하였다. 또한, 회수한 획분을 사용하여 하기 조건의 MNR분석에 의한 탄소 및 프로톤의 화학 시프트값(표 13참조)에서 회수한 획분에 포함되는 물질은 아데노신의 5'번 위치의 수산기에 니게로스 1분자가 결합한 5'-니게로실아데노신(α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신;5'-α-니게로실아데노신)이라고 결정하였다. 5'-니게로실아데노신은 중수에 6w/v% 이상 용해하므로 3'-글루코실아데노신보다 수성용매에 대한 용해성이 높다. 또, 아데노신 및 니게로스의 카본 화학 시프트값은 독립행정법인 산업종합기술연구소 공개의 유기화합물의 스펙트럼 데이터베이스 (SDBS;http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi)로부터 입수하였다.

<HPLC조건>

장치:SHIMADZU UV-VIS DETECTOR SPD-20A(검출기), LC-20AB(펌프), C-R7Aplus(기록계), SIL-20AC(오토 샘플러)

칼럼:ODS컬럼(YMC사 판매, 상품명 『YMC-Pack ODS-AQ303』, φ4.6mm×250mm)

이동상:20mM초산암모늄 완충액(pH3.5)/메탄올=92/8(용적/용적)

검출 파장:260nm

속도:0.5ml/분

주입량:20μl

칼럼온도:40℃

용매:중수(0.6ml)

내부 표준:3-트리메틸실릴-1-프로판술폰산나트륨염(TPS)

적산횟수:1H-NMR 64회, 13C-NMR 12,00회, DEPT 100회, H-H COSY 36회, H-C COSY 72회, HMBC 920회

시료양:36.4mg

실시예 2

실시예 1에서 조제한 글루코실아데노신 함유분말 2.5g에 정제수 100ml을 추가하여 용해하고, 실험 1-2와 같은조건으로 ODS 칼럼을 사용한 분취용 HPLC에 제공하여 5'-글루코실아데노신 함유획분을 회수하고 감압 건조함으로써, 무수물환산으로 5'-글루코실아데노신을 99질량% 이상 함유한 분말표품을 합계 약 1.6g 조제하였다. 본품은, 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로서, 그 자체로 적당한 담체, 부형제, 안정제, 완충제, pH조정제, 용매 등 임의의 보조제 등을 첨가한 제제로서 사용할 수 있다. 또한, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식촉진제, 콜라겐 산생 증강제, 세라마이드 합성촉진제 또는 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

실시예 3

<글루코실아데노신 함유분말>

아데노신(도쿄화성공업 주식회사 판매, 시약특급)의 농도가 1w/v%, 덱스트린(마츠야화학 주식회사 판매, 상품명 『파인덱스 #1』, 고형물 약 92.3질량%)의 농도가 10w/v%가 되도록 각각을 10mM 초산나트륨 용액(pH5.5)에 첨가하고, 50℃로 가온하여 교반하고 완전히 용해시켰다. 디오바실러스·스테아로테르모필루스 Tc-91주(독립행정법인 산업기술종합연구소, 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM BP-11273)유래의 CGTase(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조)를 덱스트린 1g당 1,000단위 첨가하여 50℃에서 24시간 반응 후, 100℃에서 15분간 가열하여 CGTase를 실활시킨 후, 글루코아밀라아제(나가세켐텍스 주식회사 판매, 상품명 『글루코팀#20000』, 20,000단위/g)를 덱스트린 1g당 2,600단위 추가하여 50℃에서 24시간 반응시켰다. 이 반응액을 100℃에서 10분간 가열한 후, 원심(11,500rpm)하여 상청을 800ml 회수하였다. 이 상청을 활성탄 칼럼 150ml(120mmφ 41mm)에 유속 SV=3(5ml/분)으로 통액함으로써, 글루코실아데노신 및 아데노신을 칼럼에 흡착시킨 후 탈이온수(습윤수지용적이 7배량) 및 20용적% 에탄올 용액(습윤수지용적이 6배량)으로 칼럼을 세정하고, 40용적% 에탄올 용액에서 용출하였다(습윤수지용적이 16배량). 용출액을 50ml씩 분획하고, 자외흡수(260nm)가 인정된 획분을 회수하였다. 회수한 획분의 약 반을 막여과(포어사이즈 0.22μm) 후, 감압건조하여, 글루코실아데노신 함유분말 약 4g을 얻었다. 본품은, 무수물환산으로 5'-글루코실아데노신을 약 26질량%, 3'-글루코실아데노신을 약 52질량%, 아데노신을 약 21질량% 함유하고 있었다. 본품은, 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 가진 피부 외용제의 유효성분으로서, 그 자체로 적의의 담체, 부형제, 안정제, 완충제, pH조정제, 용매 등 임의의 보조제 등을 첨가한 제제로서, 혹은 이들을 배합한 의약품, 의약부외품, 화장품 등의 형태로 사용할 수 있다. 또, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식 촉진제, 콜라겐 생성 증강제, 세라마이드 합성 촉진제 또는 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

실시예 4

실시예 3에서 회수한 활성탄 칼럼 용출입자의 나머지 반을 실험 1-2와 같은 조건에서 ODS컬럼을 사용한 분취용 HPLC에 제공하고, 3'-글루코실아데노신 획분 및 5'-글루코실아데노신 획분을 각각 회수하고, 각각 실시예 3과 마찬가지로, 활성탄 칼럼크로마토그래피에 의하여 탈염하여, 40용적% 에탄올에 의하여 용출하고, 글루코실아데노신의 용출획분을 회수하였다. 회수한 획 분을 막여과(포어사이즈 0.22μm)후, 감압건조함으로써, 무수물환산으로 3'-글루코실아데노신 99질량% 이상 함유하는 표품을 약 1.6g과 5'-글루코실아데노신을 99질량% 이상 함유하는 표품을 약 0.6g 조제하였다. 본품은 모두 표피와 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로서, 그자체로 적의한 담체, 부형제, 안정제, 완충제, pH 조정제, 용매 등 임의의 보조제 등을 첨가한 제제로서, 혹은 이들을 배합한 의약품, 의약부외품, 화장품 등의 형태로 사용할 수 있다. 또한, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식 촉진제, 콜라겐 산생 증강제, 세라마이드 합성 촉진제 혹은 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

실시예 5

<글루코실아데노신 함유분말>

아데노신(도쿄화성공업 주식회사 판매, 시약특급)의 농도가 1w/v%, 덱스트린(마츠야화학 주식회사 판매, 상품명 『파인덱스 #1』, 고형분 약 92.3질량%)의 농도가 10w/v%가 되도록 각각을 10mM 초산나트륨 용액(pH5.5)에 첨가하여 50℃로 가온하고 교반하여 완전히 용해시켰다. 디오바실러스·스테아로테르모필루스 Tc-91주(독립행정법인 산업기술종합연구소, 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM BP-11273)유래의 CGTase(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조)를 덱스트린 1g당 1,000단위 첨가하여 50℃에서 24시간 반응 후, 100℃에서 15분간 가열하여 CGTase를 실활시킨 후, 원심(11,500rpm)하고 상청을 400ml 회수하였다. 이 상청을 활성탄 칼럼 150ml(120mmφ 41mm)에 유속 SV=3(5ml/분)으로 통액함으로써 글루코실아데노신을 포함하는 글리코실아데노신 및 아데노신을 칼럼에 흡착시킨 후, 탈이온수(습윤수지용적이 7배량) 및 20용적% 에탄올 용액(습윤수지용적이 6배량)에서 칼럼을 세정하고, 40용적% 에탄올 용액에서 용출하였다(습윤수지용적이 16배량). 용출액을 50ml씩 분획하여 자외흡수(260nm)가 인정된 획분을 회수하였다. 회수한 획분을 막여과(포어사이즈 0.22μm) 후, 감압건조하여 글루코실아데노신을 포함하는 글리코실아데노신과 아데노신을 함유하는 분말 약 5g을 얻었다. 본품은 무수물환산으로, 3'-글루코실아데노신, 3'-말토실아데노신이나 3'-말토트리오실아데노신 등의 3'-글리 코실아데노신 및 5'-글루코실아데노신, 5'-말토실아데노신이나 5'-말토트리오실아데노신 등의 5'-글리코실아데노신을 합계로 약 58질량%와 아데노신을 약 37질량% 함유하고 있었다. 또, 본품 중의 글리코실아데노신의 약 30질량%는 그 5'번 위치가 배당화되고 있었다. 본품은 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로서 그자체로 적의의 담체, 부형제, 안정제, 완충제, pH조정제, 용매 등 임의의 보조제 등을 첨가한 제제로서, 혹은 이들을 배합한 의약품, 의약부외품, 화장품 등의 형태로 사용할 수 있다. 또, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식촉진제, 콜라겐 산생 증강제, 세라마이드 합성 촉진제 또는 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

실시예 6

<글루코실아데노신 함유 조성물>

실시예 1 내지 5의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유분말 중 어느 1질량부에 대하여 α, α-트레할로스 2질량부를 첨가하고, 균질하게 혼합하여 글루코실아데노신 함유 조성물을 조제하였다. 본품은 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 또, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식 촉진제, 콜라겐 산생 증강제, 세라마이드 합성 촉진제 또는 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

실시예 7

<글루코실아데노신 함유 조성물>

실시예 1 내지 5의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유분말 중 어느 2질량부에 대하여 α, α-트레할로스의 당질유도체 함유 시럽(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 판매, 상품명 『토르나레』)을 분무건조한 분말(주식회사 하야시바라생물화학 연구소 조제) 3질량부를 첨가하고, 균질하게 혼합하여 글루코실아데노신 함유 조성물을 조제하였다. 본품은 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로 사용할 수 있다. 또, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식 촉진제, 콜라겐 산생 증강제, 세라마이드 합성 촉진제 또는 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

실시예 8

<글루코실아데노신 함유 조성물>

실시예 1 내지 5의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유분말 중 어느 1질량부에 대하여 아스코르빈산 2-글루코시드(주식회사 하야시바라 생물화학연구소 판매, 상품명 『AA2G』) 5질량부, 에디트산2나트륨 0.1질량부를 첨가하고, 균질하게 혼합하여 글루코실아데노신 함유 조성물을 조제하였다. 본품은 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로 사용할 수 있다. 또, 본품은 케라티노사이트 분화 및 생장 촉진제, 콜라겐 생성 증강제, 세라마이드 합성 촉진제 또는 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

실시예 9

<글루코실아데노신 함유 조성물>

정제수 20질량부에 대하여, 실시예 1 내지 5의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유분말 중 어느 1질량부, α-글루코실헤스페리딘 또는 α-글루코실루틴 2질량부, 시클로니게로실니게로스(환상4당:주식회사 하야시바라 생물화학연구소 제조) 1질량부를 첨가하고, 교반용해한 후, 상법에 따라 분무건조함으로써 글루코실아데노신 함유 조성물을 조제하였다. 본품은 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕기 위한 지속성이 있는 항주름작용을 갖는 피부 외용제의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 또, 본품은 케라티노사이트 분화 및 증식 촉진제, 콜라겐 생성 증강제, 세라마이드 합성 촉진제 또는 보습제로서 이용하는 것도 자유롭다.

<배합예 1:크림형태의 피부 외용제>

배합성분 (질량%)

(1)프로필렌글리콜 5

(2)밀랍 5

(3)세틸알코올 4

(4)환원라놀린 5

(5)스쿠알렌 35

(6)스테아린산그리세라이드 2

(7)폴리옥시에틸렌(20몰)

소르비탄모노라우린산에스테르 2

(8)실시예 4에서 조제한 3'-글루코실아데노신 또는

5'-글루코실아데노신 1

(9)방부제 적당량

(10)향료 적당량

정제수를 추가하여 전량을 100질량%로 한다.

<글루코실아데노신을 배합한 피부 외용제의 항주름작용>

본 발명의 글루코실아데노신의 피부 외용제에서의 유효성을 확인하기 위하여 유효성분으로서 3'-글루코실아데노신 또는 5'-글루코실아데노신을 배합한 상기 배합례 1의 크림을 사용, 지원자에 대한 시험을 실시하였다. 즉, 문진에 의하여 만성적인 피부 거칠어짐을 고민하는 30 내지 50대의 여성 40명을 피험자로서 선택하고, 무작위로 10명씩 4군으로 나눴다. 1군 10명에게는 상기 크림(3'-글루코실아데노신 배합:크림 1)을 거칠어진 부분에 하루 3회(아침, 점심, 저녁), 1개월간 매일 도포시켰다. 1군 10명에게는 상기 크림(5'-글루코실아데노신 배합:크림 2)을 거칠어진 부분에 하루 3회(아침, 점심, 저녁), 1개월간 매일 도포시켰다. 1군 10명에게는 상기 크림의 글루코실아데노신 대신 아데노신을 1질량% 배합한 것 이외에는 상기와 같은 처방의 크림(크림 3)을 거칠어진 부분에 하루 3회(아침, 점심, 저녁), 1개월간 매일 도포시켰다. 나머지 1군 10명에게는 글루코실아데노신 또는 아데노신을 포함하지 않는 것 이외에는 상기와 같은 배합의 크림(크림 4)을 거칠어진 부분에 하루 3회(아침, 점심, 저녁), 1개월간 매일 도포시켰다. 하기 방법에 따라 피부의 수분량을 측정함과 동시에, 주름의 상태를 주름점수로 평가하고, 피부가 거칠어진 상태를 판정하였다. 또한, 이 방법에 따르면 피부가 거칠어진 상태는 피험시료를 도포하기 전과 비교하여 도포 후 피부의 수분량이 높아지고, 주름점수가 낮아질수록 개선된 것을 의미한다.

<피부의 수분량의 측정방법>

크림 도포 전날 및 도포 종료 다음날에 크림 도포부위의 피부의 수분함량 및 주름점수를 측정하였다. 피부의 수분함량은 수분함량 측정장치(IBS사 판매, 상품명 『SKICON-200EX』)를 사용하여 측정하고, 각 크림을 도포한 피험자 10명의 수분 량의 평균값을 표 15에 나타낸다.

<주름점수의 판정방법>

주름점수의 판정은 각 피험자에 대하여 판정자 5명의 육안에 의하고, 화장품 기능평가 가이드라인(『일본향장품학회지』, 30권, 4호, 316 내지 332쪽(2006년)참조)에 근거하여, 표 14에 나타내는 8단계의 주름점수(0 내지 7등급)로 평가하였다. 각 피험자에 대한 판정자 5명의 평균값을 그 피험자의 주름점수로 하고, 각 크림을 도포한 피험자 10명의 주름점수의 평균값을 표 15에 나타낸다.

표 15에서 명확한 것처럼, 글루코실아데노신을 배합한 크림(크림 1 또는 2)을 도포한 경우에는 도포전과 비교하여, 도포 후 피부의 수분 및 주름점수가 유의적으로 개선되고, 피부가 거칠어지는 것이 개선되었다. 이에 반해, 글루코실아데노신 대신 아데노신을 배합한 크림(크림 3) 및 글루코실아데노신과 아데노신을 배합하지 않은 크림(크림 4)에서는, 피부의 수분량 및 주름점수에서 도포 후에도, 도포전과 비교하여 유의적인 개선은 인정되지 않고, 피부 거칠어짐이 개선되지 않았다. 글루코실아데노신을 배합한 크림 중에서 비교하면, 5'-글루코실아데노신을 배합한 크림(크림 2)을 도포한 경우가 3'-글루코실아데노신을 배합한 크림(크림 1)을 도포한 경우보다도, 피부의 수분량 및 주름점수의 개선효과가 높은 경향을 나타내었으므로, 5'-글루코실아데노신이 3'-글루코실아데노신보다도 피부 거칠어짐 개선효과가 강하다고 판단하였다. 글루코실아데노신을 배합한 크림(크림 1 또는 2)을 도포한 기간 중 및 시험종료 후, 피험자에게서 크림도포로 인한 이상은 전혀 나타나지 않았기 때문에 글루코실아데노신은 안전성에 뛰어나다고 판단하였다.

<배합예 2:용액형태의 조성물>

배합성분 (질량%)

(1)글리세린 3

(2)프로필렌글리콜 4

(3)에탄올 8

(4)폴리옥시에틸렌(20몰)올레핀알코올 0.5

(5)실시예 1 내지 5의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유분말의 중

어느 1종 0.5

또는 실시예 6 내지 8의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유 조성물 중 어느 1종 3

(6)목련 진액 2

(7)구연산 0.01

(8)구연산 나트륨 0.1

(9)1,2-펜탄디올 0.1

(10)향료 0.05

정제수를 추가하여 전량을 100질량%로 한다.

<배합예 3:팩 형태의 피부 외용제>

배합성분 (질량%)

(1)폴리비닐알코올 15

(2)폴리에틸렌글리콜 3

(3)프로필렌글리콜 7

(4)에탄올 10

(5)송이버섯 진액 1

(6)실시예 1 내지 5의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유분말의 중

어느 1종 0.1

(7)1,2-펜탄디올 0.1

(8)향료 적당량

정제수를 추가하여 전량을 100질량%로 한다.

<배합예 4:립크림>

하기의 배합으로, 상법에 따라 립크림을 조제하였다.

배합성분 (질량%)

(1)지방산 덱스트린에스테르 8.0

(2)밀랍 4.0

(3)마이크로크리스탈린 왁스 3.0

(4)카프린산트리글리세리드 15.0

(5)트리이소스테아린산디글리세릴 20.0

(6)사과산디이소스테아릴 32.0

(7)폴리부텐 10.0

(8)초산토코페롤 2.0

(9)실시예 2의 방법으로 조제한 5'-글루코실아데노신

2.0

(10)감초 진액 0.1

(11)1,2-펜탄디올 0.1

(12)향료 적당량

<배합예 5:젤형태의 피부 외용제>

배합성분 (질량%)

(1)트리옥타레인 51.3

(2)α,α-트레할로스의 당질 유도체 함유 시럽

(주식회사 하야시바라상사 판매, 상품명 "할로덱스")

16.4

(3)모노미리스틴산폴리글리세릴-10 5.2

(4)모노스테아린산폴리글리세릴-10 1.75

(5)아스코르빈산 2-글루코시드 1

(6)감초 진액 0.1

(7)히알루론산 0.25

어느 1종 0.2

또는 실시예 6 내지 8의 방법에 따라 조제한 글루코실아데노신 함유 조성물 중 어느 1종 1.0

(9)1,2-펜탄디올 0.1

(10)향료 적당량

정제수를 추가하여 전량을 100질량%로 한다.

<배합예 6:연고형태의 피부 외용제>

배합성분 (질량%)

(1)초산나트륨 1.0

(2)인산수소칼슘 4.0

(3)글리세린 10.0

(4)박하기름 0.5

(5)녹차 진액 0.6

(6)L-아스코르빈산-2-글루코시드 2.0

(7)1,2-헥산디올 0.1

(7)바셀린 49.0

(8)목랍 10.0

(9)라놀리 10.0

(10)참기름 10.5

이들의 배합예의 각종 피부 외용제는 각각의 전형적인 사용상태에서 항주름작용을 지속적으로 발휘할 수 있고, 피부상태를 개선할 수 있다.

이상과 같이 유효성분으로서 α-D-글루코피라노실-(1→3')-아데노신 및/또는 α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신을 함유하는 본 발명의 피부 외용제는 표피 케라티노사이트의 증식과 분화촉진 작용과 진피 섬유아세포의 콜라겐 생성 증강작용을 겸비하고, 피부에서 이들의 작용을 안정적으로 발휘할 수 있으므로, 표피 및 진피의 조직구조나 생리기능의 유지, 개선을 돕는 뛰어나고 지속성이 있는 항주름작용을 가진 피부 외용제로서 화장품, 의약품, 의약부외품, 잡화 등을 제조하는 업계 등에서 이용할 수 있다. 본 발명은 이처럼 현저한 작용효과를 불러일으키는 발명이며, 이 계통에 큰 공헌을 하는, 매우 의의가 있는 발명이다.

(독)산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

FERMBP-10771

20070201

(독)산업기술종합연구소 특허생물기탁센터

FERMBP-11273

19730730

<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> Agent for external application to the skin <130> 1023 <150> JP 2011/020233 <151> 2011-02-01 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 tgaaacagcc aactccactg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 taagctgctg ctctgggttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 ggcaaatcct gaagaatcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 tgctttctgt gcttgtgtcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 gcagccagaa cagaagttcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 atcaggggtg tctgcatagg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 tgaagagctg gagctggaat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 gagctcccgg agtagtttcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 acaggagaga aaggatttgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 ctgtcgtgat gaagaactgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 atgaacaccc ggagcactac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 gggctggaac agttcacatt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 ggacacggac aggattgaca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 acccacggaa tcgagaaaga 20

Claims

α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신 및/또는 α-D-글루코피라노실-(1→ 3')-아데노신을 유효성분으로서 함유하는 지속성의 항주름작용을 갖는 피부 외용제.
제1항에 있어서,
α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신 및/또는 α-D-글루코피라노실-(1→ 3')-아데노신과 함께, 항균제로서 1,3-부틸렌글리콜 또는 1,2-알칸디올로부터 선택되는 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
또한, 미백제, 항산화제, 항염증제 및 보습제로부터 선택되는 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제.
제3항에 있어서,
미백제, 항산화제, 항염증제 및 보습제로부터 선택되는 성분이 식물의 추출물인 피부 외용제.
전분질과 아데노신을 포함하는 용액에 α-글루코실 전이효소 또는 시클로말토덱스트린·글루카노트란스페라아제를 작용시키는 공정과, 생성된 α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신 또는 α-D-글루코피라노실-(1→3')-아데노신을 채취하는 공정을 포함하여 이루어지는, α-D-글루코피라노실-(1→5')-아데노신 및/또는 α-D-글루코피라노실-(1→3')-아데노신의 제조방법.