ES2827253T3 - Preparación cutánea externa antienvejecimiento - Google Patents

Abstract

Uso de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y/o sus sales, en combinación con uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste en ácido ascórbico 2-glucósido, etilendiaminotetraacetato (EDTA) y galato de epigalocatequina, como ingredientes eficaces para antienvejecimiento en un agente dérmico externo.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación cutánea externa antienvejecimiento

Campo técnico

La presente invención se refiere a un agente dérmico externo antienvejecimiento (puede abreviarse como "agente dérmico externo antienvejecimiento", en lo sucesivo).

Técnica antecedente

Mantener la juventud hasta el final de la vida es un deseo común a toda la humanidad, sin embargo, durante mucho tiempo, los seres humanos no podrían haberse librado de los cambios en su piel con el envejecimiento, tales como arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas; se ha considerado que la piel humana o la piel también se vuelve senescente a medida que envejecemos y comienza a mostrar cambios evidentes, tales como arrugas, arrugas de expresión, flacidez, y manchas, que son, por así decirlo, "providencia natural" e inevitablemente inevitables.

Recientemente, se ha ido revelando gradualmente la causa y la función de los evidentes cambios en la piel con el envejecimiento, tales como arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas, a medida que avanzan las investigaciones sobre la estructura y el mecanismo metabólico de la piel. Como es bien conocido, la piel está formada por la capa delgada externa dela epidermis (epitelio) y la capa gruesa más profunda de la dermis (tejido conjuntivo), donde la epidermis como capa más externa protege a los cuerpos vivos del mundo externo y previene la exudación de la humedad interna y los nutrientes al exterior de los cuerpos humanos; mientras que, la dermis, como tejido conjuntivo que tiene una estructura de fibroblastos multifuncionales/expandidos tridimensionalmente, colágenos, elastinas, proteoglicanos, etc., y desempeña un papel a la hora de impartir resistencia, flexibilidad o elasticidad a la piel. También se dice que, como la reducción de los niveles de sebo y humedad en la piel con el envejecimiento, la capa queratinosa en la superficie de la piel se vuelve susceptible a perder su capacidad de retención de humedad e induce fácilmente arrugas de expresión y piel áspera debido a la sequedad, etc.

La epidermis está constituida por una "capa queratinosa" (capa córnea), "capa granulosa", "estrato espinoso" y "estrato germinativo", que se encuentran en este orden desde el lado externo de la piel, donde los queratinocitos generados en el estrato germinativo se mueven secuencialmente hacia el lado exterior de la piel y maduran en la capa queratinosa, y, finalmente, se desprenden. En particular, los queratinocitos proliferan en el estrato germinativo existente en la parte más interna de la piel y se diferencian en ella, y, a continuación, se mueven hacia la capa superior de la piel y, finalmente, se transforman en una capa queratinosa existente en la parte más externa de la piel y, después, se desprenden. Estos procesos en serie de proliferación, movimiento, diferenciación y desprendimiento de los queratinocitos se denominan renovación, donde los queratinocitos se regeneran nuevamente en un ciclo constante para mantener la homeostasis de la piel, sin embargo, se dice que el retraso de la renovación de la piel con el envejecimiento da como resultado la inducción de arrugas, flacidez y piel áspera. La tasa de renovación de la piel varía según la parte del cuerpo humano, sin embargo, se dice que la renovación de la piel es de aproximadamente 20 días en adolescentes sanos, aproximadamente 28 días para la década de 20 años, aproximadamente 40 días para la década de 30 años, aproximadamente 55 días para la década de 40 años, como aproximadamente dos veces más que para las personas en la década de 20 años, y aproximadamente 75 días para las que están en la década de 50 años (consúltese la bibliografía de no patentes 1).

Como se ha descrito anteriormente, dado que se dice que el retraso de la tasa de renovación de la piel con el envejecimiento induce arrugas, flacidez y piel áspera, incluso si ese retraso en la renovación con el envejecimiento pudiera recuperarse por cualquier medio hasta cierto punto, las arrugas, la flacidez y la piel áspera se pueden mejorar eficazmente, aunque la tasa de renovación en la que se denominan generaciones preenvejecimiento, incluidas aquellas con edades en torno a los 30 y hasta los 50 años, que comienzan a estar ansiosos por los deterioros cutáneos mencionados anteriormente, difícilmente se reduciría a la tasa de renovación de la piel normal de las generaciones en la década de 20 años (consúltese la literatura de patentes 1). Desde este punto de vista, la tasa de renovación puede aumentarse acelerando al menos cualquiera de las etapas en serie de proliferación, movimiento, diferenciación y descamación; sin embargo, aún no se ha proporcionado ningún medio real para resolverlo.

Una capa queratinosa está compuesta por numerosas capas concéntricas de corneocitos, donde hay una membrana sólida compuesta por varias proteínas, tal como involucrina, llamada envoltura cornificada, para proteger el sitio subcelular de los corneocitos,presente en la capa más externa de corneocitos. Tal envoltura cornificada desempeña un papel importante en la función de barrera de la piel. Es bien sabido que, tras una reducción de la función barrera, los rayos ultravioleta (UV), en particular, los rayos UV-A (onda larga) que llegan a la dermis dañarán el colágeno, la elastina, el ácido hialurónico, etc. ; y que, cuando la función de barrera de la piel disminuye, la piel se seca y disminuye su capacidad de retención de humedad, se induce secreción excesiva de sebo o se induce un trastorno de la renovación. La función de barrera de la piel disminuye con la edad, dando como resultado la inducción de arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas en la piel (consúltense la bibliografía de patentes 2 y 3).

La función de barrera de la piel significa la función de la capa queratinosa llamada segunda barrera, denominada función de la membrana sebácea llamada primera barrera, es decir, la función de prevenir tanto la invasión de sustancias externas desde el exterior al interior de los cuerpos vivos como la liberación de una cantidad excesiva de humedad desde el interior hacia el exterior de los cuerpos vivos; y significa la función de separar la región interna y externa de los cuerpos vivos con la estructura de adhesión célula-célula denominada unión estrecha que existe en la capa granular de la epidermis adyacente a la capa queratinosa.

La reducción de fibroblastos y ácido hialurónico en la dermis inducida por el envejecimiento, así como la escisión del colágeno y la desnaturalización de la elastina, supuestamente forman arrugas y disminuyen la elasticidad de la piel para inducir flacidez y piel áspera. Desde la elastina, como fibra con la función de soporte de la fibra de colágeno, tiene una función de proporcionar resiliencia y elasticidad a la piel (consúltese la bibliografía no de patentes 2). Asimismo, se sabe que la matriz metaloproteinasa-1 para descomponer el colágeno induce arrugas (consúltese la bibliografía no de patentes 3).

La endotelina-1, una sustancia para acelerar la activación y proliferación de los melanocitos, se conoce como una causa de manchas. Además, se ha observado que se puede inducir pigmentación en la piel (manchas) y opacidad de la piel como resultado de una liberación irregular de melanina, liberada por los melanocitos a las células epidérmicas, desde las células epidérmicas (bibliografía de no patentes 4).

Según estos resultados y hallazgos de la investigación, se ha propuesto una pluralidad de agentes dérmicos externos para prevenir y/o mejorar razonablemente las manchas evidentes en la piel con la edad, tales como arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas, es decir, agentes dérmicos externos para antienvejecimiento (véase, por ejemplo, la bibliografía de patentes 4 a 10); la humanidad se está acercando a cumplir su deseo de mantener la juventud paso a paso hasta el final del capítulo. Los agentes dérmicos externos para antienvejecimiento propuestos hasta ahora se han realizado como resultado de perseguir solo unas pocas posibilidades entre muchas posibilidades y ahora todavía se desea proporcionar un nuevo agente dérmico externo para antienvejecimiento desde muchos más ángulos diferentes, incluyendo otro mecanismo diferente para ejercer un efecto antienvejecimiento, mejor manejabilidad y viabilidad de producción.

Bibliografía de la técnica anterior

Bibliografía de patentes

Bibliografía de patentes 1: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2012-056857

Bibliografía de patentes 2: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2004-091376

Bibliografía de patentes 3: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2008-007411

Bibliografía de patentes 4: Reedición nacional de la publicación internacional PCT N.° WO2007/011066 Bibliografía de patentes 5: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2007-291102

Bibliografía de patentes 6: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2008-169196

Bibliografía de patentes 7: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2008-255020

Bibliografía de patentes 8: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2008-260721

Bibliografía de patentes 9: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2009-040690

Bibliografía de patentes 10: Patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2009-249306

Bibliografía de patentes 11: EP2583972, que desvela un agente terapéutico para enfermedades inflamatorias que contiene N1-óxido de adenosina o un derivado del mismo como ingrediente eficaz.

Bibliografía de patentes 12: EP2204154, que desvela una composición que comprende una combinación de al menos un monosacárido que comprende manosa y/o ramnosa, y al menos un compuesto adicional que comprende adenosina y/o uno de sus análogos en un medio.

Bibliografía de patentes 13: JP2011032187, que desvela un ingrediente activo farmacológico que comprende al menos un compuesto seleccionado de entre adenosina, N1-óxido de adenosina, adenosina-5'-monofosfato, N1-óxido de adenosina-5'-monofosfato, dinucleótido nicotinamida adenina y dinucleótido-N1-óxido de nicotinamida adenina contenidos en un extracto acuoso de la jalea real fraccionada a un peso molecular <2.000 que se utiliza como principio activo para un inhibidor de la proliferación de osteoblastos humanos.

Bibliografía de patentes 14: JP2004067576, que desvela un agente antienvejecimiento que comprende (A) al menos un compuesto seleccionado de entre ácido ascórbico, su derivado y su sal; y (B) una sustancia relacionada con un ácido nucleico a base de purinas.

Bibliografía de patentes 15: EP1547577, que desvela una composición antienvejecimiento capaz de retardar eficazmente el envejecimiento de la piel, en particular, aliviar la pigmentación de la piel.

Bibliografía de patentes 16: EP2671565, que desvela un agente dérmico externo con una acción antiarrugas sostenible, que posee tanto la acción de potenciar la proliferación y diferenciación de los queratinocitos en la piel como la acción de potenciar la producción de colágeno en la piel, y que ayuda al mantenimiento y mejora de las estructuras tisulares y las funciones fisiológicas de la epidermis y la dermis, proporcionando así un efecto de mejora de la piel.

Bibliografía no de patentes

Bibliografía no de patentes 1: "Textbook of Aging Skin", Farage et al., como editores, publicado por Springer, 2010

Bibliografía no de patentes 2: "Journal of Society of Cosmetic Chemists of Japan", Vol. 44, n.° 4, pág. 278 a 284, 2010

Bibliografía no de patentes 3: "American Journal of Pathology", Fisher et al., Vol. 174, n.° 1, págs. 101-114, 2009 Bibliografía no de patentes 4: "Photochemistry and Photobiology", Gilchrest et al., Vol. 63, n.° 1, pág. 1 a 10, 1996

Sumario

Los presentes inventores enérgicamente, han realizado de forma enérgica y continua investigaciones y esfuerzos para resolver el objeto anterior. Como resultado, descubrieron lo siguiente y lograron la presente invención: Los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus sales ejercen un ventajoso efecto antienvejecimiento, es decir, poseen acciones de mejora de la renovación, mantenimiento o potenciación de la función de barrera, potenciación de la expresión de la proteína filagrina, aceleración de la producción de elastina, inhibición de la producción de la matriz metaloproteinasa-1 o inhibición de la producción de endotelina-1 en la piel; y prevención y mejora de la formación de arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas en la piel con la edad.

La presente divulgación proporciona un agente dérmico externo para antienvejecimiento, que contiene como ingrediente o ingredientes eficaces uno o más de los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos, análogos de los mismos y sus sales.

Los presentes inventores también han descubierto que los efectos antienvejecimiento de los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus sales mejoran significativamente, cuando se usan en combinación con ácido ascórbico 2-glucósido, galato de epigalocatequina y/o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

La presente invención proporciona un uso de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y/o sus sales, en combinación con uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste en ácido ascórbico 2-glucósido, etilendiaminotetraacetato (EDTA) y galato de epigalocatequina, como ingredientes eficaces para antienvejecimiento en un agente dérmico externo.

Efecto

El agente dérmico externo antienvejecimiento de la presente divulgación mejora la renovación, mantiene o potencia la función de barrera, potenciala expresión de la proteína filagrina, mantiene o acelera la producción de elastina, inhibe la producción de la matriz metaloproteinasa-1 o inhibe la producción de endotelina-1 en la piel; y, por lo tanto, el agente dérmico externo antienvejecimiento previene o mejora eficazmente la formación de arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas en la piel con la edad.

Descripción detallada

El agente dérmico externo antienvejecimiento de la presente divulgación contiene como ingrediente o ingredientes eficaces uno cualquiera o más de los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus sales. Independientemente de los orígenes, los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos anteriores y sus sales pueden ser los que se purifican a partir de sustancias naturales o los que se obtienen mediante síntesis química. El término análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato como se hace referencia en el presente documento incluye, por ejemplo, N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y N1-óxido de adenosina 5'-trifosfato. El término "sales de N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos" como se hace referencia en el presente documento incluyen, por ejemplo, N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y N1-óxido de adenosina 5'-fosfato potásico.

Asimismo, los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos son superiores al N1-óxido de adenosina en fotoestabilidad y solubilidad. Dado que las sales de los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos actúan como N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos, los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus sales ejercen sustancialmente los mismos efectos, sin embargo, este último es superior al primero en solubilidad. Cualquiera de estos compuestos puede contener componentes derivados de materiales de producción y subproductos formados en los procesos de producción y por lo general tienen una pureza de al menos el 95 % en masa, deseablemente al menos el 98 % en masa y, más deseablemente, al menos el 99 % en masa ("% en masa" se abrevia como "%" a lo largo de toda la memoria descriptiva, a menos que se especifique lo contrario).

El agente dérmico externo de la presente divulgación se explica con detalle a continuación:

En el agente dérmico externo, uno o más de los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus sales se incorporan habitualmente a la masa total del agente en un porcentaje preferible del 0,001 al 10,0 % y, más preferentemente, del 0,01 al 1,0%; donde, cuando el porcentaje es inferior al 0,001 %, los ingredientes identificados anteriormente no podrían ejercer suficientemente los efectos deseados; mientras que, cuando es superior al 10,0%, tales efectos deseados pueden no lograrse de una manera dependiente de la dosis y tales sobredosis pueden no ser recomendables.

Los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus sales usados en la presente divulgación pueden usarse ventajosamente por separado porque ejercen en sí mismos una acción de mejora de la renovación, acción de acción de mantenimiento/aceleración de la función de barrera, acción de mantenimiento/aceleración de la producción de elastina, acción de inhibición de la producción de matriz metaloproteinasa-1 y acción de inhibición de la producción de endotelina 1 en la piel; y se pueden usar arbitrariamente en combinación con otros ingredientes.

Dado que el efecto antienvejecimiento de los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus sales puede mejorarse significativamente cuando se usan en combinación con ácido ascórbico 2-glucósido, galato de epigalocatequina y/o EDTA, estos ácido ascórbico 2-glucósido, galato de epigalocatequina y EDTA se utilizan como ingredientes para el agente dérmico externo antienvejecimiento de la presente divulgación.

El término "mejora de la renovación" significa mantener en estado saludable los procesos en serie (o renovación) de proliferación, movimiento, diferenciación y descamación de las células epidérmicas (o queratinocitos), como el que forma la epidermis humana, que está formada por una "capa queratinosa" (capa córnea), "capa granulosa", "estrato espinoso" y "estrato germinativo". Expresándolo de manera concreta, el término anterior significa acortar el ciclo de renovación de la piel a medida que se alarga con el envejecimiento.

El agente dérmico externo antienvejecimiento acelera secuencialmente la diferenciación de los queratinocitos, potenciala actividad de la transglutaminasa, promueve la producción de la envoltura cornificada y mejora la renovación de la piel, seguido de prevenir eficazmente la formación y mejorar el estado de las arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas en la piel con la edad. Asimismo, dado que el agente dérmico externo antienvejecimiento refuerza la función de unión estrecha en la piel y mantiene o potenciala función de barrera en la piel para suprimir la liberación de humedad desde la piel, previene eficazmente la formación o mejora el estado de las arrugas de expresión o flacidez en la piel con el envejecimiento. Además, el agente dérmico externo antienvejecimiento potenciala producción de elastina que imparte resiliencia o elasticidad a la piel y suprime la producción de matriz metaloproteinasa-1 responsable de inducir arrugas, dando como resultado una prevención o mejora eficaz de las arrugas y la flacidez. Además, el agente previene o mejora eficazmente las manchas como resultado de suprimir la producción de endotelina-1.

El agente dérmico externo antienvejecimiento se puede incorporar con cualquier ingrediente convencional, dependiendo de la forma real del agente. Normalmente, dicho agente dérmico externo puede usarse con uno o más ingredientes usados en agentes dérmicos externos convencionales siempre que no deterioren las funciones y efectos prescritos de la presente invención. Los ejemplos de estos incluyen ingredientes oleosos, tensioactivos, antisépticos (o antimicrobianos), aromas, blanqueantes de la piel, hidratantes, espesantes, antioxidantes, quelantes, agentes absorbentes/dispersantes de rayos UV, vitaminas, aminoácidos, antiinflamatorios, agentes promotores de la circulación sanguínea, extractos de algas marinas, astringentes, agentes antiarrugas, activadores celulares, inhibidores antiretrogradación, agentes restauradores/de crecimiento del cabello, aceleradores de la absorción percutánea, agua, alcoholes, polímeros solubles en agua, agentes controladores de pH, agentes espumantes, polvos, aditivos para agentes farmacéuticos, cuasifármacos y productos alimenticios, e ingredientes efectivos para agentes farmacéuticos y cuasifármacos. Usando los ingredientes anteriores, el agente dérmico externo antienvejecimiento se puede producir de la manera habitual.

Los ejemplos concretos de los ingredientes oleosos identificados anteriormente incluyen aceites y grasas vegetales, tales como aceites de nueces de Macadamia integrifolia, aceites de ricino, aceites de oliva, aceites de vainas de cacao, aceites de camelia, aceites de palma, ceras de Japón, aceites de jojoba, aceite de semilla de uva y aceite de aguacate; aceites animales, tales como aceite de visón y aceite de yema de huevo; ceras, tales como cera de abejas, cetáceo, lanolina, cera de carnaúba y cera de candelilla; hidrocarburos, tales como vaselina, escualano, cera microcristalina, cera de ceresina, cera de parafina y petróleo; ácidos grasos naturales y sintéticos, tales como ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido behénico, ácido graso de lanolina, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido oleico y ácido isoesteárico; alcoholes superiores naturales y sintéticos, tales como cetanol, alcohol estearílico, hexildecanol, octildodecanol, alcohol laurílico, alcohol caprílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico, colesterol y fitosterol; y ésteres, tales como miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, miristato de octildodecilo, oleato de octildodecilo y oleato de colesterilo.

Los ejemplos de los tensioactivos identificados anteriormente incluyen tensioactivos no iónicos tales como monolaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, sesquiolato de sorbitán, trioleato de sorbitano, monolaurato de polioxietilensorbitano (20), monoestearato de polioxietilen sorbitano, monooleato de polietilenglicol, alquilato de polietilenglicol, éter alquílico de polioxietileno, diéter poliglicólico, lauroildietanolamida, amida de isopropanol de ácido graso, éter de ácido graso de hidroximaltitol, polisacáridos alquilados, alquilglucósidos y ésteres de azúcares; tensioactivos no iónicos, tales como monoestearato de glicerilo hidrófilo, monoestearato de glicerol (autoemulsionante), monoestearato de poliglicerilo, monooleato de sorbitán, monoestearato de polioxietilenglicol, monoestearato de polioxietilen sorbitano, éter cetílico de polioxietileno, cera de abejas polioxietilada y aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno; tensioactivos aniónicos, tales como estearato de sodio, palmitato de potasio, cetilsulfato de sodio, laurilsulfato sódico, palmitato de trietanolamina, laurilfosfato de polioxietileno sódico, N-acil-L-glutamato de sodio, palmitato de sodio, laurato de sodio, laurilato de sodio, laurilsulfato de potasio, éter de trietanolamina de alquilsulfato, aceite de pavo rojo, sulfato de dodecilbenceno lineal, maleato de aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno y metiltaurato de acilo; tensioactivos catiónicos, tales como cloruro de estearil dimetil bencil amonio, cloruro de estearil trimetil bencil amonio, cloruro de benzalconio y óxido de laurilamina; y tensioactivos anfolíticos, tales como solución de cloruro de alquilaminoetilglicina y lecitina.

Los ejemplos de los antisépticos (antimicrobianos) identificados anteriormente incluyen ácido benzoico y sales del mismo, ácido salicílico y sales del mismo, ácido sórbico y sales del mismo, ácido deshidroacético y sales del mismo, p-hidroxibenzonato, incluyendo éster de alquilo de ácido benzoico, éter de 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifenilo, 3,4,4'-triclorocarbanilida, hexaclorofeno, cloruro de benzalconio, fenoxietanol, hinokitiol, resorcina, etanol, 1,3-butilenglicol y Kankohso 201 (o "PIONIN").

Los ejemplos del aroma identificado anteriormente incluyen benzaldehído, benzoato de bencilo, acetato de fenilo, santalol, eugenol, lilial, lyral, linalool, 2-metil-3-(4-metilfenil)-propanal, almizcle cetona, cinamaldehído, vertofix, metilionona, formato de geranilo, "ISO E SUPER (número CAS 54464-57-2), Y-undecalactona, salicilato de hexilo, salicilato de cis-3-hexenilo, dihidrojasmonato de metilo, 2-mercaptopropionato de tetrahidrofurfurilo, "KOVANOL" (hidroximetilpentilciclohexenocarboxaldehído), vanillina, etilvanillina, aceite de geranio, aceite de poleo, aceite de abedul y aceite de ajenjo.

Los ejemplos de blanqueadores de la piel identificados anteriormente incluyen ácido ascórbico, derivados del mismo y sus sales; ácidos alcoxisalicílicos y sales de los mismos; hidroquinona y derivados de la misma, tales como glucósidos de hidroquinona; ácido tranexámico, derivados del mismo y sus sales; derivados de resorcina; ácido kójico, derivados del mismo y sus sales; ácido elágico, ácido linoleico y sus sales; extracto de Matricaria recutita; tetrahidro curcuminoides; extractos de índigo; y otros.

Los ejemplos de humectantes identificados anteriormente incluyen polialcoholes, tales como eritritol, xilitol, sorbitol, maltitol, glicerina, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, poliglicerina, polietilenglicol, dipropilenglicol, 1,2-pentanodiol e isoprenoglicol; sacáridos, tales como glucosa, maltosa, trehalosa, derivados de trehalosa, dextrinas, ciclodextrinas, tetrasacárido cíclico que tiene una estructura de ciclo {^6)-a-D-glucopiranosil-(1^ 3)-a-D-glucopiranosil-(1^ 6)-a-D-glucopiranosil-(1,3)-a-D-glucopiranosil(1^) desvelado en la publicación de patente internacional N.° WO 02/10361, tetrasacárido cíclico que tiene una estructura de ciclo{^6)-a-D-glucopiranosil-(1^ 4)-a-D-glucopiranosil-(1^- 6)-a-D-glucopiranosil-(1^4)-a-D-glucopiranosil(1^) desvelada en la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2005-95148; ingredientes hidratantes naturales, tales como aminoácidos, lactato de sodio, pirrolidona carbonato de sodio; mucopolisacáridos, tales como glucógeno, goma garrofín, xiloglucano, Semilla de membrillo, carragenano, pectina, manano, curdlano, succinoglucano, galactano, dermatánsulfato, queratánsulfato, condroitina, sulfato de condroitina, sulfato de mucoitina, queratosulfato, quitina, heparánsulfato, ácido hialurónico e hidrolizados de los mismos; proteínas y péptidos, tales como seda y colágeno, y sustancias de alto peso molecular solubles en agua, tales como sus hidrolizados, así como sus sales; siliconas, tales como dimetilpolisiloxano y metilfenilsiloxano; y sobrenadantes de cultivo, tales como los de lactobacilos, bifidobacterias, etc.

Los ejemplos de los espesantes identificados anteriormente incluyen sustancias naturales de alto peso molecular, tales como alginato de sodio, goma de xantano, silicato de aluminio, extracto de semilla de Cydonia oblonga, goma arábiga, goma guar de hidroxietilo, goma guar carboximetilo, goma guar, dextrano, goma tragacanto, almidón, pululano, quitina, quitosano, agar y celulosa; sustancias semisintéticas de alto peso molecular, tales como hidroxipropilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, almidón soluble, celulosa cationizada y carboximetilquitina; y sustancias sintéticas de alto peso molecular, tales como polímero de carboxivinilo, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y copolímero de alcohol vinílico/acetato de vinilo. Los ejemplos de antioxidantes identificados anteriormente incluyen dibutilhidroxitolueno, hidroxianisol butilado, galato de propilo, ácido L-ascórbico, vitamina E, catequinas y flavonoides.

Los ejemplos de los quelatos identificados anteriormente incluyen edetato de disodio, ácido etilendiaminotetraacético, pirofosfatos, hexametafosfatos, ácido cítrico y ácido glucónico.

Los ejemplos de los agentes de control del pH identificados anteriormente incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, trietanolamina, nitrilotrietanol, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido bórico, bórax e hidrogenofosfato de potasio.

Los ejemplos de los agentes absorbentes de UV identificados anteriormente incluyen agentes absorbentes de UV de ácido p-aminobenzoico, agentes absorbentes de UV de ácido antranílico, agentes absorbentes de UV de ácido salicílico, agentes absorbentes de UV de ácido cinámico, agentes absorbentes de UV de benzofenona, agentes absorbentes de UV de tipo sacárido, 3-(4'-metilbenciliden)-d-alcanfor, 3-bencilideno-d, 1-alcanfor, ácido urocánico, éster etílico del ácido urocánico, 2-fenil-5-metilbenzoxazol, 2,2'-hidroxi-5-metilfenilbenzotriazol, 2-(2'-hidroxi-5'-toctilfenil)benzotriazol, 2-(2'-hidroxi-5'-metilfenil)benzotriazol, dibenzalazina, dianisoilmetano, 4-metoxi-4'-f-butildibenzoilmetano, 5-(3,3-dimetil-2-norbonilideno)-3-pentano-2-ona, 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, paraaminobenzoato de octildimetilo, etilhexil-p-metoxicinamato, óxido de titanio, caolín y talco.

Los ejemplos de las vitaminas identificadas anteriormente incluyen vitamina A y derivados de la misma; vitamina B, tales como vitamina B1 y sus derivados, vitamina B2 y sus derivados, clorhidrato de vitamina Be, tripalmitato de vitamina Be, dioctanoato de vitamina Be, vitamina B12, vitamina B15 y sus derivados; ácido ascórbico y sus derivados; vitaminas E, tal como a-tocoferol, p-tocoferol, Y-tocoferol y acetato de vitamina E; vitaminas D; vitamina H; ácido pantoténico; pantetina; vitamina F; vitamina K; vitamina P y sus derivados; y vitamina U, ácido ferúlico, Y-orizanol, ácido a-lipoico, ácido orótico, coenzima Q10 (CoQio) y sus derivados. Además, se pueden usar sales de los compuestos ilustrados anteriormente.

Los ejemplos de los aminoácidos identificados anteriormente incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina, asparagina, glutamina, taurina, triptófano, cistina, cisteína, metionina, prolina, hidroxiprolina, ácido asparagínico, ácido glutámico, arginina, histidina, lisina, carnitina, citrulina y derivados de los mismos, así como sus sales.

El agente dérmico externo antienvejecimiento de la presente divulgación no debe restringirse específicamente a formas específicas, y puede usarse en cualquier forma de, por ejemplo, sistemas de solución acuosa, sistemas solubilizados, sistemas de emulsión, sistemas de dispersión de polvo, sistemas de barra sólida, sistemas de aguaaceite de dos capas, sistemas de agua-aceite-polvo de tres capas. El agente dérmico externo antienvejecimiento no debe restringirse específicamente a ninguna forma real de formulaciones y no debe estar sujeto a la distinción de la Ley de Asuntos Farmacéuticos sobre productos farmacéuticos, cuasifármacos y cosméticos. El agente dérmico externo para antienvejecimiento significa una composición que se aplica dérmicamente a la piel, los labios o el cuero cabelludo como agente farmacéutico, cuasifármaco o cosmético; pomadas, cremas, lociones lechosas, lociones, esencias, gelatinas, geles, paquetes, champús, enjuagues, tratamientos para el cabello, mascarillas, máscaras, delineadores de ojos, restauradores de cabello, barras de labios, brillos de labios, bases, carmín, sombras de ojo, polvos, manicuras, jabones, jabones corporales, sales de baño, dentífricos en polvo, dentífricos humedecidos, pastas de dientes, dentífricos líquidos, dentífricos médicos, caramelos para la garganta, películas para caramelos para la garganta, colutorios y enjuagues para gárgaras.

Los siguientes ejemplos explican la presente invención con más detalle.

<Experimento 1 (proporcionado como referencia): Efecto de Nl-óxido de adenosina 5'-fosfato y sus análogos sobre la renovación de los queratinocitos epidérmicos humanos normales>

Un proceso en serie de proliferación, movimiento, diferenciación y descamación de los queratinocitos se llama renovación, donde los queratinocitos se renuevan a una velocidad de ciclo prescrita para mantener la homeostasis de la piel; sin embargo, la renovación se retrasa con el envejecimiento, lo que supuestamente provoca la inducción de arrugas, flacidez y piel áspera. En consecuencia, se considera que la tasa de renovación aumentará cuando se induzca la diferenciación de queratinocitos, seguido de la mejora de las arrugas, la flacidez y la piel áspera. Por lo tanto, se evaluaron las acciones de aceleración de la renovación de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y sus análogos con índices de la acción inductora de diferenciación, acción aceleradora de la producción de envoltura cornificada y acción potenciadora de la actividad de transglutaminasa por parte de los queratinocitos. Este experimento se realizó de acuerdo con Hasegawa et al., "Lipids", Vol. 46, n.° 6, pág. 529-535, 2011; y Sturniol et al., "The Journal of Biological Chemistry", Vol. 278, n.° 48, pág. 48, 066 a 48,073, 2003.

<Experimento 1-1 (proporcionado como referencia): Efecto sobre la diferenciación de los queratinocitos>

A placas de 12 pocillos, un mililitro de una suspensión celular con una densidad celular de 2,5 x 104 células/ml se preparó suspendiendo queratinocitos epidérmicos humanos normales en EpiLife, el nombre de producto de un medio para queratinocitos que contiene un factor de crecimiento, comercializado por Life Technologies, Inc., 9800 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850 EE.UU.; seguido de cultivo de las células hasta que suba hasta aproximadamente la mitad de la superficie inferior de cada pocillo. A continuación, el medio de cultivo en cada pocillo se reemplazó con un medio para queratinocitos libre de factor de crecimiento y se cultivó durante dos días y, a continuación, se reemplazó con un medio nuevo para queratinocitos, que contenía cualquiera de las sustancias de ensayo de la Tabla 1 a las concentraciones respectivas, como se indica en la tabla, y luego se cultivó durante tres días. Como control, se proporcionó un sistema de cultivo similar al anterior, excepto que no se añadió ninguna de las sustancias de ensayo. En condiciones microscópicas, se observó y evaluó la morfología celular para determinar la capacidad inductora de la diferenciación de queratinocitos según los siguientes criterios:

Puntuación 0: Sin modificar

Puntuación 1: El número de células en forma aplanada frente al total de células es del 50 % o menos.

Puntuación 2: El número de células en forma aplanada frente al total de células es del 50 % o más.

Puntuación 3: Casi todas las células tienen una forma irregular y parece haber algunas células con brillo.

Significa que cuanto mayor es la puntuación, más se acelera la diferenciación celular. Cada sistema de experimento se realizó por triplicado, seguido del cálculo de un valor medio para cada sistema. La Tabla 1 muestra la acción de los análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la inducción de diferenciación de queratinocitos.

T l 11

Como queda claro en la Tabla 1, no se observó ningún cambio morfológico en los queratinocitos epidérmicos humanos normales en el control sin adición de ninguna sustancia de ensayo, mientras que el sistema experimental con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico o N1-óxido de adenosina dio un cambio celular morfológico a una concentración de 10 pM y convirtió células con una forma aplanada en células de menor tamaño después de la desnucleación a una concentración de 20 a 40 pM, por lo que las células habían cambiado y mostraban formas morfológicas irregulares y algunas de ellas llegaron a tener brillo, lo que significa que la diferenciación de las células se había acelerado. Los sistemas con 3'-a-glucosiladenosina o 5'-a-glucosiladenosina dieron un cambio morfológico a concentraciones respectivas de 40 a 80 y de 200 a 400 pM, y convirtieron las células con una forma aplanada en células de menor tamaño después de la desnucleación a concentraciones de 160 y 800 pM, por lo que las células habían cambiado y mostraban formas morfológicas irregulares y algunas de ellas llegaron a tener brillo, lo que significa que la diferenciación de las células se había acelerado. Sin embargo, la adenosina a una concentración de 400 pM y 3'-a-glucosiladenosina o 5'-a-glucosiladenosina, incluso a una concentración de 800 pM, no dio ningún cambio celular morfológico.

Dentro del intervalo de concentraciones probadas, la diferenciación de los queratinocitos se aceleró por uno cualquiera de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, N1-óxido de adenosina, N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina y N1-óxido e 5'-a-glucosiladenosina, entre los que se reveló que N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y N1-óxido de adenosina tenían un efecto más fuerte. Estos resultados muestran que los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos, análogos de los mismos, y sus sales son eficaces como agentes que mejoran la renovación debido a su aceleración de la diferenciación de los queratinocitos.

<Experimento 1-2 (proporcionado como referencia): Efecto sobre el nivel de producción de la envoltura cornificada> La envoltura cornificada desempeña un papel importante en la función de barrera en la piel. Las arrugas, arrugas de expresión, flacidez y manchas en la piel son inducidas por la reducción de la función de barrera de la piel. En consecuencia, en este experimento se examinó el efecto de los N1-óxido de adenosina 5'-fosfatos y sus análogos sobre la formación de la envoltura cornificada, que se realizó de acuerdo con Hasegawa et al., "Lipids", Vol. 46, n.° 6, pág. 529 a 535, 2011.

Se cultivaron queratinocitos epidérmicos humanos normales de manera similar al Experimento 1-1, excepto porque se añadieron a las células las sustancias de ensayo enumeradas en la Tabla 2 a las concentraciones prescritas. Las células cultivadas resultantes se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de raspado de las células adheridas a cada placa de cultivo añadiendo 0,5 ml de PBS a cada pocillo de las placas. A las suspensiones celulares así obtenidas se les añadió una solución de lauril sulfato de sodio al 10 % en un volumen de 1/4 de cada uno de los volúmenes de suspensión, seguido de agitación y congelación de las mezclas resultantes a 80 °C. Después de descongelar, las mezclas resultantes se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 minutos, seguido de la recogida de los precipitados celulares que luego se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato que contenía lauril sulfato de sodio al 2%. Las mezclas resultantes se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 minutos, seguido de la recogida de células y la suspensión de las células recogidas con solución salina tamponada con fosfato que contiene lauril sulfato de sodio al 2 % y ditiotreitol 20 mM. Las suspensiones de células resultantes se llevaron a ebullición en un baño de agua en ebullición durante una hora y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 310 nm para determinar el nivel de producción de envoltura cornificada para cada sistema de ensayo al que se ha añadido cualquiera de las sustancias de ensayo. Se proporcionó un sistema de control similar al anterior excepto que no se añadió ninguna de las sustancias de ensayo al sistema y se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 310 nm de manera similar a lo anterior para que se considere como 100%. El nivel de producción de la envoltura cornificada para cada sustancia de ensayo se evaluó relativamente conforme a la siguiente ecuación.

Ecuación: Nivel de producción de la envoltura cornificada (valor relativo (%)) = [(absorbancia de una muestra con cualquiera de las sustancias de ensayo) /

(Absorbancia del control)] x 100

El experimento se repitió tres veces y los datos se sometieron a múltiples comparaciones de Dunnett con control. El símbolo significa un nivel de significación de p <0,01. La Tabla 2 muestra la acción de análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la producción de envoltura cornificada asociada con la diferenciación de los queratinocitos.

T l 21

Como queda claro en la Tabla 2, en comparación con el control sin adición de ninguna sustancia de ensayo, el sistema con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato o N-1 óxido de adenosina mejoró hasta dar un nivel de producción de envoltura cornificada de aproximadamente 180% a una concentración de 25 ^{j M ,} revelando que mostraron una acción significativa de potenciar la producción de envoltura cornificada. Mientras que el sistema con N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina dio una acción significativa de potenciar la producción de envoltura cornificada a una concentración de 200 ^{j M .} El sistema con N1-óxido de 5'-a-glucosiladenosina dio una acción significativa de potenciar la producción de envoltura cornificada a una concentración de 600 ^{j M .} Sin embargo, el sistema con 5'-fosfato de adenosina tendió a potenciar la producción de envoltura cornificada a una concentración de 400 ^{j M .} Sin embargo, el sistema con 3'-a-glucosiladenosina no mostró ninguna acción para potenciar la producción de envoltura cornificada incluso a concentraciones de 400 ^{j M} y 800 ^{j M ,} respectivamente.

Dentro del intervalo de concentraciones probadas, se observaron mejoras en la producción de envoltura cornificada con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, N1-óxido de adenosina, N1-óxido de 3'-a-glucosilo y N1-óxido de 5'-aglucosiladenosina, donde se reveló que los efectos del N1-óxido de adenosina, N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina eran más fuertes, entre los cuales se reveló que el N1-óxido de adenosina y el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico eran los ingredientes más fuertes. Estos resultados indican que el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, sus análogos y sus sales son útiles como agentes que mejoran la renovación dependiendo de sus mejoras en la producción de envoltura cornificada.

<Experimento 1-3 (proporcionado como referencia): Efecto sobre la actividad transglutaminasa>

La transglutaminasa es una enzima que cataliza el entrecruzamiento de proteínas y se relaciona con la formación de envoltura cornificada; la potenciación de la actividad transglutaminasa promueve la formación de envoltura cornificada y previene o mejora, por ejemplo, las arrugas, las arrugas de expresión, la flacidez y las manchas en la piel. Por lo tanto, en este experimento se examinó el efecto de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y sus análogos sobre la actividad de la transglutaminasa de acuerdo con Sturniolo et al., "The Journal of Biological Chemistry", Vol.

278, n.° 48, pág. 48.066 a 48.073, 2003.

Se cultivaron queratinocitos epidérmicos humanos normales de manera similar al Experimento 1-1, excepto por que se añadieron las sustancias de ensayo que se enumeran en la Tabla 3 a los sistemas de cultivo respectivos. A los queratinocitos epidérmicos humanos normales cultivados se les añadió 100 pM de fluoresceína cadaverina y se dejaron reposar durante cuatro horas. A continuación, las células resultantes se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato y se trataron adicionalmente con metanol frío durante 10 minutos para la fijación celular. Las células fijadas se lavaron tres veces con metanol frío, seguido de la adición de solución salina tamponada con fosfato. La fluoresceína cadaverina tomada por las células a través de transglutaminasa se analizó con Cell Imaging Station, comercializado por Molecular Probes Life Technology, Francia, y las intensidades fluorescentes analizadas se consideraron actividades de transglutaminasa. Se proporcionó un sistema de control similar al anterior, excepto por que no se añadió ninguna de las sustancias de ensayo. La actividad transglutaminasa de cada sustancia de ensayo se evaluó como un valor relativo determinado con la siguiente ecuación usando la intensidad de fluorescencia del sistema de control considerándose como 100 %.

Ecuación: Actividad e transglutaminasa (valor relativo (%)) = [(Intensidad fluorescente de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(Intensidad fluorescente del control)] x 100

El experimento se repitió tres veces y los datos se sometieron a múltiples comparaciones de Dunnett con control. El símbolo significa un nivel de significación de p <0,01. La Tabla 3 muestra la acción de los análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la actividad de transglutaminasa relacionada con la producción de envoltura cornificada.

T l 1

Como queda claro en la Tabla 3, en comparación con un sistema de control sin la adición de sustancia de ensayo alguna, los sistemas de ensayo con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y con N1-óxido de adenosina a las concentraciones respectivas de 20 pM mejoraron de forma marcada las actividades de transglutaminasa hasta aproximadamente un 570 % y aproximadamente un 630 %, respectivamente, y dieron acciones de potenciación significativas de las actividades de transglutaminasa. El N1-óxido de 5'-a-glucosiladenosina mostró una acción de potenciación significativa sobre la actividad transglutaminasa a una concentración de 400 pM. Sin embargo, El N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina no mostró una acción potenciadora significativa sobre la actividad transglutaminasa a una concentración de 100 pM; sin embargo, puede ser eficaz cuando se usa A una concentración más alta, conforme a la eficacia del N1-óxido de 5'-a-glucosiladenosina a una concentración de 400 pM. Sin embargo, adenosina, 5'-fosfato de adenosina, 3'-a-glucosiladenosina y 5'-a-glucosiladenosina no mostraron una acción de potenciación significativa sobre la actividad transglutaminasa a una concentración de 400 pM.

Se reveló que la potenciación de la actividad transglutaminasa se observaba para N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, N1-óxido de adenosina y N1-óxido de 5'-a-glucosiladenosina, entre los cuales el N1-óxido de adenosina y el N1-óxido adenosina 5'-fosfato sódico son mejores que los demás. Estos resultados indican que el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, sus análogos y sus sales poseen una acción de potenciación sobre la actividad transglutaminasa y actúan de forma eficaz como agente de potenciación de la renovación.

<Experimento 2 (proporcionado como referencia): Efecto de la acción de potenciación del N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y análogos del mismo sobre la función de unión estrecha de las células que derivan de las células cancerosas de tipo epidérmico>

La unión estrecha tiene la función de prevenir la invasión de sustancias extrañas desde el exterior de los cuerpos vivos hacia el interior y una cantidad excesiva de liberación de humedad desde el interior del cuerpo hacia el exterior. Por lo tanto, el fortalecimiento de la unión estrecha daría como resultado la miniaturización de la piel y la estimulación de la función de barrera de la piel. A partir de esto, este experimento es para examinar el efecto del N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y sus análogos sobre la unión estrecha, y se demuestra de acuerdo con Suzuki y Hara, "Journal of Nutrition", Vol. 139, n.° 5, pág. 965 a 974, 2009.

Se suspendió una línea celular de carcinoma epidermoide humano A-431 en un medio, complementado con cualquiera de las sustancias de ensayo desveladas en la Tabla 4 y con las concentraciones respectivas indicadas en la tabla, para dar una concentración celular de 1 x 105 células/ml, y cada suspensión celular se introdujo en una copa de inserción para una placa de cultivo de 12 pocillos en dos mililitros por pocillo, seguido de cultivo de las células hasta alcanzar un estado de confluencia a través de la superficie inferior de cada pocillo. Los volúmenes interior y exterior de la copa se ajustaron para dar dos mililitros mientras se verificaba que los niveles de líquido de las copas fueran constantes y se añadió amarillo lucifer como modelo para la sustancia permeante, comercializado por Life Technologies Corporation, CA, EE. UU., a cada copa interior para dar una concentración final de 100 pM. A continuación, se midieron las intensidades fluorescentes de amarillo lucifer en los medios de cultivo tanto en la copa interior como en la exterior, seguido del cálculo del porcentaje de la intensidad fluorescente de la copa exterior frente a la suma de las copas exterior e interior para usar como una transmitancia de amarillo lucifer con la siguiente ecuación.

Ecuación: Transmitancia de amarillo lucifer (%) = {(Absorbancia de un líquido fuera de una copa de inserción)/[(Absorbancia de un líquido dentro de la copa de inserción) (Absorbancia del líquido fuera de la copa de inserción)]} x 100

Se proporcionó un sistema de control preparado de manera similar al anterior, excepto por que no se añadieron sustancias de ensayo y la transmitancia del amarillo lucifer se consideró como del 100 % para evaluar la reducción de la transmitancia debido al refuerzo de la función de la unión estrecha, conforme a la siguiente ecuación.

Ecuación: Transmitancia relativa (porcentaje relativo (%)) de amarillo lucifer = [(transmitancia de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(transmitancia del control)] x 100

El experimento se repitió tres veces y los datos se sometieron a las comparaciones múltiples de Dunnett con el control. El símbolo significa un nivel de significación de p <0,01. La Tabla 4 muestra la acción de análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la unión estrecha de células de carcinoma epidermoide humano.

T l 41

Como queda claro en la Tabla 4, en comparación con un sistema de control sin la adición de sustancia de ensayo alguna, el sistema de ensayo con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico marcó una reducción de aproximadamente un 60 % de la transmitancia del amarillo lucifer a una concentración de 20 pM, de modo que revela que tiene una acción significativa de potenciación de la función de la unión estrecha. Se reveló que el N1-óxido de adenosina tenía una acción significativa de potenciación de la función de la unión estrecha a una concentración de 10 a 20 pM. Además, se reveló que la adenosina tenía una acción significativa de potenciación de la función de la unión estrecha a una concentración de 200 a 400 pM. Sin embargo, no se observó una acción de potenciación sobre la función de la unión estrecha en N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina, N1-óxido de 5-a-glucosil adenosina, 5'-fosfato de adenosina, 3'-a-glucosil adenosina y 5'-a-glucosil adenosina a una concentración de 200 a 400 pM.

En el intervalo de las concentraciones analizadas, N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, N1-óxido de adenosina y adenosina son deseables en términos de eficacia, entre los que N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y N1-óxido de adenosina eran más deseables. Estos resultados indican que N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y N1-óxido de adenosina son útiles como humectantes y un agente para potenciar la función de barrera de la piel, dependiendo de sus acciones de potenciación sobre la función de la unión estrecha.

Experimento 3 (proporcionado como referencia): Acción de potenciación de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la expresión de la proteína filagrina en queratinocitos epidérmicos humanos normales>

La filagrina se conoce como una proteína que desempeña un papel importante en la formación de la función de barrera y la retención de la humedad en la piel; se genera en la epidermis como profilagrina que se descompone en filagrina que desempeña un papel en la función de barrera. La filagrina se descompone sucesivamente para actuar como un factor humectante natural. La relación entre la reducción de la expresión de filagrina y la dermatitis atópica se ha señalado recientemente en Osawa et al., Allergology International, Vol. 60, n.° 1, pág. 1 a 9, 2011. En este experimento, se examinó el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico para determinar su acción de potenciación sobre la expresión de la proteína filagrina en queratinocitos epidérmicos humanos normales, de acuerdo con el método de Otsuka et al., "The Journal of Allergy and Clinical Immunology", Vol. 133, n.° 1, pág. 139 a 146, 2014.

Usando placas de cultivo de 6 pocillos, queratinocitos epidérmicos humanos normales, que se habían suspendido e inoculado a "EpiLife", un nombre de producto de un medio que contiene un factor de crecimiento para queratinocitos, comercializado por Kurabo Industries Inc., Osaka, Japón, a una concentración de 5 x 104 células/pocillo, se cultivaron a 37 °C durante cuatro días, en el que las células alcanzaron un 80 % de estado de confluencia. A continuación, la expresión de filagrina se indujo de tal manera que se siguieron cultivando las células durante otros cuatro días, mientras se reemplaza el medio de cultivo con un medio EpiLife suplementado con 2 |^j M, 5 |^j M, o 10 |^j M de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico cada tres días. Se proporcionó un control positivo de forma similar al anterior excepto por el uso de un medio EpiLife complementado con cloruro de calcio para dar una concentración de 0,5 mM en lugar de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico. Después de cuatro días de cultivo, a las células resultantes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, se añadieron 0,1 ml de un tampón de muestra de SDS (pH 6,8) que contiene Tris-HCl 62,5 mM, 2 % de SDS, 10 % de glicerol y DTT 50 mM junto con un inhibidor de proteasa, y se recogen con un raspador de células. Las células recogidas se llevaron a ebullición durante 10 minutos, se rompieron con ultrasonidos y se cuantificaron con "Pierce BCA Protein Assay Kit", comercializado por ThermoFisher Scientific K. K., Yokohama, Japón. Se tomó una muestra de una cantidad prescrita de las células rotas resultantes y se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en una cantidad de 100 jg/carril y el gel resultante se transfirió a una membrana de PVDF.

La membrana de PVDF transferida resultante se bloqueó con "Block Ace", comercializado por DS Pharma Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japón, reaccionó con una dilución de 200 veces de "AKH1", un anticuerpo anti-filagrina de ratón, comercializado por, Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, EE.UU., o una dilución de 20.000 veces de "MAB1501", un anticuerpo frente a actina de ratón, comercializado por Chemicon International Inc., MA, EE. UU., como primer anticuerpo y, a continuación, reaccionó con una dilución de 2.000 veces de "P0447", una inmunoglobulina anti-ratón marcada con HRP, comercializada por Dako Japan, Tokio, Japón, como anticuerpo secundario. Tras la reacción, mediante el uso del sistema de detección de transferencia Western ECL Plus, comercializado por GE Healthcare Japan, Tokio, Japón, se detectaron bandas en "Hyperfilm ECL", una película quimioluminiscente comercializada por GE Healthcare Japan, Tokio, Japón. Las bandas detectadas se analizaron y cuantificaron con "I mage J", un software de análisis de imágenes.

Se proporcionó un sistema de control sin adición de ninguna de las sustancias de ensayo y se consideró que la proporción de intensidad creciente de una banda de filagrina/actina era del 100%, con lo que se evaluaron comparativamente los datos de los porcentajes aumentados de las relaciones de intensidad de las bandas de filagrina/actina de las sustancias de ensayo. La Tabla 5 muestra el efecto de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico sobre la expresión de la proteína filagrina en queratinocitos epidérmicos humanos normales.

T l

Como queda claro en la Tabla 5, en comparación con el sistema de control sin adición de ninguna sustancia de ensayo, los sistemas de ensayo con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico aumentaron el nivel de expresión de la proteína filagrina de una manera dependiente de la dosis, que dio como resultado la observación de un incremento del 308 % a 10 ^jiM igual al del control positivo con cloruro de calcio 0,5 mM. Estos resultados indican que la acción de potenciar la función de unión estrecha por N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico se produce en parte a través de la acción de potenciación de la expresión de la proteína filagrina, lo que significa que la sustancia es útil como humectante y como agente de potenciación de la función de barrera en la piel.

Recientemente, se observa que la reducción de la función de barrera de la piel provoca la invasión de sustancias externas a través de la piel y da como resultado que se establezca fácilmente la sensibilización a alérgenos externos, que se relaciona con la aparición de dermatitis atópica. El resultado del experimento indica que el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico puede conducir a la prevención de la aparición de dermatitis atópica a través de la acción de potenciación de la proteína filagrina.

<Experimento 4 (proporcionado como referencia): Efecto de la acción de potenciación de los análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la producción de elastina de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF)>

La elastina, una fibra que tiene un papel en el soporte de las fibras de colágeno, tiene un papel en la impartición de tensión y elasticidad a la piel; la desnaturalización de la elastina reduce la elasticidad de la piel y conduce a la formación de arrugas y flacidez. Por lo tanto, la potenciación de la producción de elastina previene o mejora las arrugas y la flacidez. En este experimento, se examinó el efecto del N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y análogos del mismo sobre la producción de elastina. El experimento se realizó de acuerdo con Syedain y Tranquillo, "Journal of Biomechanics", Vol. 44, n.° 5, pág. 848 a 855, 2011.

Los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF), que se habían suspendido en un medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero de bovino fetal al 10 % para dar una concentración celular de 3 x 105 células/ml, se introdujeron en placas de 24 pocillos por 0,5 ml/pocillo y se cultivaron durante un día. Las células cultivadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco y se cultivaron durante otros dos días en un medio Eagle modificado de Dulbecco, complementado con una cualquiera de las sustancias de ensayo de la Tabla 5 en las concentraciones respectivas que se muestran en la tabla, para inducir la síntesis de elastina. A continuación, se recogió el sobrenadante de cada cultivo y las células restantes se lavaron con un mililitro de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, se añadió 0,1 ml de tripsina al 0,25 % y tetraacetato de etilendiamina, seguido de incubación a 37 °C durante dos minutos para separar las células de las placas. Se añadió medio mililitro de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco a cada placa y las suspensiones celulares resultantes se recogieron en un tubo de 1,5 ml que luego se sometió a centrifugación (3.000 x g durante cinco minutos) para recoger las células. La elastina se cuantificó con un kit de determinación colorimétrica comercializado por Biocolor Ltd., Tokio, Japón. El sobrenadante recogido previamente se usó para suspender las células recogidas, al que luego se le añadió 0,16 ml de ácido oxálico 1 M, un reactivo adherido al kit y se incubó a 100 °C durante una hora para solubilizar la elastina. A la elastina solubilizada colocada en un recipiente se le añadieron 0,66 ml de un precipitante de elastina como reactivo fijado al kit, se mezcló durante 15 minutos al tiempo que se invertía repetidamente el recipiente y se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos para precipitar las proteínas. Al precipitado resultante se añadió medio milímetro de un colorante, como reactivo fijado al kit, seguido de inversión repetida del recipiente durante 90 minutos y centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos para recoger los sedimentos unidos con el colorante. A continuación, a los sedimentos recogidos se añadieron 0,25 ml de un separador de colorante como reactivo fijado al kit y se mezclaron durante una hora mientras se invertía repetidamente un recipiente con la mezcla resultante, seguido de la determinación de la absorbancia de la mezcla resultante a una longitud de onda de 490 nm y el cálculo de la cantidad de elastina por pocillo. Se generó una curva de calibración con un accesorio para el kit. Se proporcionó un sistema de control tratando de manera similar los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) sin añadir ninguna sustancia de ensayo y se determinó su absorbancia a una longitud de onda de 490 nm. Considerando la absorbancia como del 100 %, el nivel de producción de elastina de cada sustancia de ensayo se evaluó comparativamente conforme a la siguiente ecuación.

Ecuación: Nivel de producción de elastina (valor relativo (%)) = [(Absorbancia de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(Absorbancia del control)] x 100

Para confirmar la proliferación celular en las condiciones anteriores analizadas, los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF), que se habían suspendido en un medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero de bovino fetal al 10 % para dar una concentración celular de 2,5 x 105 células/ml, se introdujeron en microplacas de 96 pocillos a razón de 0,1 ml/pocillo y se cultivaron durante un día. Las células resultantes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco y se cultivaron durante otros dos días en un medio Eagle modificado de Dulbecco complementado con una cualquiera de las sustancias de ensayo de la Tabla 5. Los sobrenadantes del cultivo se retiraron de las microplacas, a los que luego se añadieron 0,2 ml/pocillo de una dilución de "Alamar Blue" diluida con el mismo medio de cultivo utilizado en lo anterior por 10 veces para reaccionar con las células a 37 °C durante dos horas, seguido de la medición de la intensidad fluorescente de las células a una longitud de onda de excitación de 544 nm y una longitud de onda fluorescente de 590 nm y obtención de a variación del número de células con la adición de una cualquiera de las sustancias de ensayo en función de la intensidad fluorescente de un sistema de control, que se habían tratado de manera similar a lo anterior, excepto por que no se añadieron sustancias de ensayo alguna, considerándose como del 100 %.

El experimento se repitió tres veces y los datos se compararon con los del control con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. El símbolo "*" significa un nivel de significación de p <0,01. La tabla 6 muestra la acción de los análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la producción de elastina de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF).

[Tabla 6]

continuación

Como queda claro en la Tabla 6, en comparación con el control sin adición de sustancia de ensayo alguna, los grupos de ensayo con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico o N1-óxido de adenosina aumentaron en el nivel de producción de elastina hasta aproximadamente un 120 % a una concentración de 10 ^{j M ,} mostrando una acción de potenciación significativa en la producción de elastina. Sin embargo, el 5'-fosfato de adenosina tendió a potenciar la producción de elastina a una concentración de 10 a 40 ^{j M} y mostró una acción de potenciación significativa en la producción de elastina a una concentración de 100 ^{j M .} En el experimento no se observó influencia de las sustancias de ensayo sobre la proliferación celular.

En vista de la eficacia, se puede decir que, en el intervalo de concentraciones analizadas, N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, N1-óxido de adenosina y 5'-fosfato de adenosina son deseables en lo que respecta a la acción de potenciación de la producción de elastina; y N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y N1-óxido de adenosina son más deseables. Estos resultados indican que el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y su análogo, es decir, N1-óxido de adenosina son útiles como agente anti-arrugas, dependiendo de sus acciones de potenciación de la producción de elastina.

<Experimento 5 (proporcionado como referencia): Efecto de la acción inhibidora de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y análogos del mismo sobre la producción de matriz metaloproteinasa-1 de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF)>

Se dice que la hidrólisis del colágeno por la matriz metaloproteinasa-1 induce la formación de arrugas y la reducción de la elasticidad en la piel para provocar flacidez; la inhibición de la producción de la matriz metaloproteinasa-1 evitaría o mejoraría tales arrugas y flacidez. Se demostró que el experimento examinaba el efecto del N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y sus análogos sobre la producción de matriz metaloproteasa-1, de acuerdo con el procedimiento desvelado en Fuller et al., "Journal of Cosmetic Dermatology", Vol. 5, n.° 1, pág. 30 a 38, 2006" Los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF), que se habían suspendido en un medio Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10% para dar una concentración de 2,5 x 105 células/ml, se introdujeron en microplacas de 96 pocillos a razón de 0,1 ml/pocillo y se cultivaron hasta alcanzar un estado de confluencia sobre el fondo de cada pocillo. A continuación, el medio de cada pocillo se reemplazó con un medio de cultivo fresco sin suero y se cultivó durante otras 24 horas, se añadió una cualquiera de las sustancias de ensayo en la Tabla 6 a cada concentración mostrada en la tabla y se cultivó durante 24 horas adicionales. A continuación, a los cultivos celulares resultantes se añadieron IL-1 p humana para dar una concentración final de 1 ng/ml, seguido de cultivo de las células durante otras 24 horas. Después de la finalización del cultivo, la matriz metaloproteasa-1 en el sobrenadante de cada pocillo se detectó con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), comercializado por R & D Systems, Inc., MN, EE. UU., desarrolló coloración con tetrametilbencidina y se midió la absorción a una longitud de onda de 450 nm. Se proporcionó un sistema de control similar al anterior, excepto que no se añadió ninguna sustancia de ensayo y se determinó la actividad de la matriz metaloproteasa-1 de manera similar a la anterior para ser considerada como del 100 %. El nivel de producción de matriz metaloproteasa-1 para cada sustancia de ensayo se evaluó comparativamente conforme a la siguiente ecuación.

Ecuación: Nivel de producción de matriz metaloproteasa-1 (valor relativo (%)) = [(Absorbancia de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(Absorbancia del control)] x 100

El número de células se contó con un kit de citometría (o un método de tinción) y la variación del número de células cuando se añadió con una cualquiera de las sustancias de ensayo, conforme al valor de control considerado como del 100 %.

El experimento se repitió tres veces y los datos se compararon con los del control con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. El símbolo "*" significa un nivel de significación de p <0,01. La Tabla 7 muestra la acción de los análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la producción de matriz metaloproteasa-1.

continuación

Como queda claro en la Tabla 7, en comparación con un sistema de control sin la adición de sustancia de ensayo alguna, un sistema de ensayo con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico redujo su nivel de producción de matriz metaloproteasa-1 a un nivel de aproximadamente 80 a aproximadamente 30 % a una concentración de 10 to 20 pM y mostró una acción inhibidora de la producción dependiente de la dosis y significativa. En un sistema de ensayo con N1-óxido de adenosina, se observó una acción similar inhibidora de la producción a una concentración de 5 a 20 pM. En los sistemas con N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina y N1-óxido de 5'-a-glucosiladenosina mostraron una acción similar inhibidora de la producción dependiente de la dosis y significativa a una concentración de 200 a 800 pM, donde la acción inhibidora por N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina fue más fuerte que la de N1-óxido de 5'-aglucosiladenosina. No se observó ninguna acción inhibidora de la producción de matriz metaloproteasa-1 por parte de adenosina, adenosina, 5'-fosfato de adenosina, N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina y 5'-a-glucosiladenosina. Dentro del intervalo de concentraciones probadas, N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, N1-óxido de adenosina, N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina y N1-óxido de 5'-a-glucosiladenosina son preferibles en términos de eficacia sobre la acción inhibidora de la de matriz metaloproteasa-1, y entre las cuales son más preferibles N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, y N1-óxido de adenosina. Estos resultados indican que el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, sus análogos y sus sales son útiles como agentes antiarrugas, dependiendo de sus acciones inhibidoras de matriz metaloproteasa-1.

<Experimento 6 (proporcionado como referencia): Efecto de la acción inhibidora de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y sus análogos sobre la producción de endotelina-1 de los queratinocitos epidérmicos humanos normales>

Se sabe que la endotelina-1 es una sustancia que potenciala activación y proliferación de los melanocitos y provoca manchas. También se observa que la pigmentación/manchas de la piel o la opacidad de la piel pueden inducirse cuando la melanina, secretada por los melanocitos a las células epidérmicas, no se elimina fácilmente de las células epidérmicas. En consecuencia, la inhibición de endotelina-1 evitaría o mejoraría la pigmentación/manchas de la piel y la opacidad de la piel. Por lo tanto, en este experimento, se examinó el efecto del N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y análogos del mismo sobre la producción de endotelina-1. Este experimento se realizó de acuerdo con Ishida y Sakaguchi, "Biological & Pharmaceutical Bulletin", Vol. 30, n.° 5, pág. 928 a 934, 2007.

Los queratinocitos epidérmicos humanos normales proliferaron hasta un estado confluente en el que las células se cultivaron en todo el borde inferior de cada pocilio de microplacas de 96 pocilios usando "EpiLife", un nombre de producto de un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento para queratinocitos, comercializado por Life Technologies Corporation, CA, EE.UU., y se cultivó adicionalmente durante otros dos días mientras se reemplazaba el medio con un medio de cultivo nuevo libre de dicho factor de crecimiento. A continuación, a los cultivos resultantes se añadieron N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico para dar una concentración de 10, 20 o 50 ^{j M ,} y se dejaron reposar durante seis horas. Las células cultivadas se lavaron con tampón de Hanks, se irradiaron con radiación ultravioleta B a una intensidad de 40 mJ/cm2 y se cultivaron adicionalmente durante 24 horas después de la adición de un medio de cultivo que contenía el factor de crecimiento. Se detectó endotelina-1 en los sobrenadantes resultantes con un kit ELISA específico de endotelina-1, comercializado por R&D Systems Inc., MN, EE. UU., se coloreó con tetrametilbencidina y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm. Se proporcionó un sistema de control y se trató de manera similar como anteriormente excepto que no se añadió Nl-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y luego se determinó que el nivel de producción de endotelina-1 en el sobrenadante de cultivo resultante se considerara como del 100%. El nivel de producción de endotelina-1 para cada sustancia de ensayo se evaluó comparativamente conforme a la siguiente ecuación.

Ecuación: Nivel de producción de endotelina-1 (valor relativo (%)) = [(Absorbancia de una muestra con una sustancia de ensayo)/(Absorbancia del control)] x 100

El número de células proliferadas se determinó con azul de metileno y se consideró como del 100 % para su uso en el cálculo de la variación de las células con una cualquiera de las sustancias de ensayo.

El experimento se repitió tres veces y los datos se compararon con los del control con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. El símbolo "*" significa un nivel de significación de p <0,01. La Tabla 8 muestra la acción de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico sobre el nivel de producción de endotelina-1 por los queratinocitos epidérmicos humanos normales.

T l

Como queda claro en la Tabla 8, en comparación con el sistema de control sin la adición de sustancia de ensayo alguna, el sistema de ensayo con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico tendía a mostrar una inhibición de la producción de endotelina-1 a una concentración de 20 ^{j M} y dio un nivel de producción de endotelina-1 reducido en aproximadamente un 50 % a una concentración de 50 ^{j M ,} revelando que tiene una acción inhibidora de la producción de endotelina-1 significativa. No se encontró influencias sobre la proliferación celular en el sistema experimental.

El resultado anterior indica que el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato es útil como agente anti-manchas, dependiendo de su acción inhibidora de la producción de endotelina-1.

<Experimento 7: Efecto del uso combinado de galato de epigalocatequina y N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sobre la inducción de queratinocitos en diferenciación>

Excepto por la adición de las sustancias de ensayo enumeradas en las tablas 8 y 9 a las concentraciones respectivas que se muestran en las tablas, los experimentos se realizaron respectivamente de acuerdo con los métodos de los Experimentos 1-2 y 1-3 desvelados en la memoria descriptiva para examinar el efecto del uso combinado de galato de epigalocatequina, que se utiliza como antioxidante para cosméticos, y N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico sobre la acción de acelerar la producción de envoltura cornificada y la acción de potenciar la actividad transglutaminasa de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico. Se proporcionó un sistema de control y se trató de manera similar al anterior, excepto que no se añadió ninguna sustancia de ensayo y se determinó tanto para las tasas de aumento del nivel de producción de envoltura cornificada como para la actividad transglutaminasa, conforme a las siguientes ecuaciones.

Ecuación: Tasa de incremento del nivel de producción de envoltura cornificada (%) )={[(Absorbancia de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(Absorbancia del control)] x 100}- 100

Ecuación: Tasa de incremento de transglutaminasa (%)={[(Absorbancia de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(Absorbancia del control)] x 100}-100

Los resultados respectivos se encuentran en las tablas 9 y 10, donde el símbolo está fijado a una tasa de incremento como combinación eficaz.

T l 1

T l 1

Tal como queda claro en las Tablas 9 y 10, el uso combinado de 15 pM de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y 1,6 a 6,5 pM de galato de epigalocatequina mejoró claramente tanto las tasas de incremento del nivel de producción de envoltura cornificada como la actividad de transglutaminasa en comparación con el caso con un solo uso de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico o galato de epigalocatequina. Basándose en estos resultados, se consideró que el uso combinado de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y galato de epigalocatequina tiene un efecto sinérgico tanto en la acción de acelerar la producción de envoltura cornificada como en la acción de potenciar la actividad transglutaminasa. Una relación molar preferible entre N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y galato de epigalocatequina está en el intervalo de 15 pM:6,5 pM a 15 pM:1,6 pM, es decir, de 2,3:1 a 9,4:1. Dado que estos resultados indican que las composiciones con uno cualquiera de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, análogos del mismo y sus sales incorporadas con galato de epigalocatequina aceleran o mejoran sinérgicamente la producción de envoltura cornificada y la actividad glutaminasa, dichas composiciones son útiles como agente anti-arrugas.

<Experimento 8: Efecto del uso combinado de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y etilendiaminotetraacetato sobre la función de la unión estrecha>

Excepto por la adición de las sustancias de ensayo enumeradas en la tabla 11 a las concentraciones respectivas que se muestran en la tabla, los experimentos se realizaron respectivamente de acuerdo con los métodos del Experimento 2 desvelados en la memoria descriptiva para examinar el efecto del uso combinado con etilendiaminotetraacetato utilizado como conservante para cosméticos sobre la acción de refuerzo de la función de unión estrecha por el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico. Se proporcionó un sistema de control y se trató de forma similar al anterior, excepto que no se añadió ninguna de las sustancias de ensayo. La tasa de reducción de la transmitancia relativa del amarillo lucifer frente a la del control se basa en la siguiente ecuación.

Ecuación: Tasa de reducción de la transmitancia relativa del amarillo lucifer (%) = 100 - [(Transmitancia de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(Transmitancia del rol. de control)] x 100

Los resultados se encuentran en la tabla 11, donde el símbolo está fijado a una tasa de reducción para una combinación eficaz.

T l 111

Como queda claro en la Tabla 11, etilendiaminotetraacetato utilizable como conservante para cosméticos exhibió per se una acción de deprimir la función de unión estrecha, sin embargo, se observó que el grado de tal depresión es moderado por un gran margen cuando se usa en combinación con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico. Los resultados anteriores también indican que, siempre que se utilicen N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y etilendiaminotetraacetato en una proporción molar de al menos 10 pM:3 mM, es decir, al menos 1:300, se puede conseguir un nivel suficiente de potenciación de la unión estrecha usando N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, incluso en presencia de tetraacetato de etilendiamina. Además, los resultados muestran que las composiciones con etilendiaminotetraacetato junto con cualquiera de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, análogos del mismo y sus sales son útiles como agentes para hidratar la piel y potenciar la función de barrera de la piel.

<Experimento 9: Efecto del uso combinado de ácido ascórbico 2-glucósido y N1-óxido de adenosina 5'-fosfato o cualquier análogo de los mismos sobre la producción de matriz metaloproteasa-1

Excepto por la adición de las sustancias de ensayo enumeradas en la tabla 12 a las concentraciones respectivas que se muestran en la tabla, los experimentos se realizaron respectivamente de acuerdo con los métodos del Experimento 5 desvelados en la memoria descriptiva para examinar el efecto del uso combinado con ácido ascórbico 2-glucósido como blanqueante de la piel en cosmética sobre la acción de antiarrugas por análogos de 5'-fosfato de N1-óxido de adenosina. Se proporcionó un sistema de control y se trató de forma similar al anterior, excepto que no se añadió ninguna de las sustancias de ensayo. La tasa de reducción del nivel de producción de matriz metaloproteasa-1 frente a la del control se basa en la siguiente ecuación.

Ecuación: Tasa de reducción del nivel de producción de la matriz metaloproteasa-1 (%)= 100-[(Absorbancia de una muestra con una cualquiera de las sustancias de ensayo)/(Absorbancia del control)] x 100

Los resultados se encuentran en la tabla 12, donde el símbolo está fijado a una tasa de reducción para una combinación eficaz.

T l 12

Como queda claro en la Tabla 12, el uso combinado de 5 a 10 pM de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico o N1-óxido de adenosina como un análogo del mismo y 200 pM de ácido ascórbico 2-glucósido aumentó claramente en la tasa de reducción del nivel de producción de matriz metaloproteasa-1 frente a la mera suma de los de su respectivo uso único. Por esta razón, se consideró que el uso combinado de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico o N1-óxido de adenosina y ácido ascórbico 2-glucósido tenía un efecto sinérgico sobre la acción inhibidora de la producción de matriz metaloproteasa-1. La relación molar preferible entre N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y ácido ascórbico 2-glucósido está en el intervalo de 5 pM:200 pM a10 pM:200 pM, es decir, de 1:40 a 1:20. Los resultados indican que las composiciones que contienen N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, sus análogos y sus sales en combinación con ácido ascórbico 2-glucósido son útiles como agentes antiarrugas porque inhiben sinérgicamente la producción de matriz metaloproteasa-1.

<Experimento 10 (proporcionado como referencia): Efecto de la luz sobre N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y análogos del mismo>

Dado que los agentes dérmicos externos pueden exponerse a la luz al usarse, cualquier ingrediente eficaz contenido en el mismo debería ser deseablemente no fototóxico y fotoestable. El significado de fototóxico es fenómeno donde, cuando se administren sustancias químicas o mezclas de las mismas a sujetos y luego se expongan a la luz, las sustancias administradas reaccionan con la luz para inducir trastornos en las células de la piel. En este experimento, se midió la fotoestabilidad de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y análogos del mismo, tales como N1-óxido de adenosina y N1-óxido de 5'-glucosiladenosina con fines comparativos.

A 25 mg de cada una de las sustancias de ensayo de la Tabla 13 se añadió cada uno de los tampones Mcllvain ajustados a diferentes pH para dar un volumen total de 50 ml y se distribuyeron en botellas de rosca de vidrio transparente (5 ml) con tapones de rosca de plástico igual al número de las sustancias de ensayo en 2,0 ml. Bajo una lámpara fluorescente con aproximadamente 4.000 lux a 28 °C, se dejaron reposar las botellas de vidrio de rosca. El N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y el N1-óxido de 5'-glucosiladenosina se analizaron, respectivamente, en HPLC al inicio de la prueba y ocho semanas después de iniciar el experimento, y al inicio de la prueba y a intervalos de dos semanas. hasta ocho semanas después del inicio, seguido de la extracción de una de las botellas para el análisis de HPLC. El análisis se repitió tres veces y el porcentaje promedio residual de cada sustancia de ensayo se calculó conforme a la relación del área contra el área del pico para cada sustancia de ensayo en cromatograma HPLC al inicio del experimento. La Tabla 13 muestra la tolerancia óptica del N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y sus análogos.

Ecuación: Porcentaje residual (%) de la sustancia de ensayo = [(área promedio del pico tras un periodo de tiempo prescrito a pH diferentes para cada sustancia de ensayo)/(Área promedio del pico al inicio del experimento a los pH respectivos para cada sustancia de ensayo)] x 100

T l 11

Como queda claro en la Tabla 13, el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico fue claramente estable a la luz porque mostró un porcentaje residual de aproximadamente 89 a 97 % en las condiciones de pH de 4 a 9 a las ocho semanas de iniciado el experimento. Por el contrario, el N1-óxido de adenosina fue inestable a la luz porque mostró porcentajes residuales de aproximadamente 63 ta 66 % y de aproximadamente 25 % en las condiciones de pH respectivas de 6 a 9 y de 4 a 5 a las ocho semanas del inicio del experimento. Además, el N1-óxido de 5'-glucosiladenosina fue claramente inestable la luz porque mostró porcentajes residuales de aproximadamente 24 a 34 % y de aproximadamente 10 % en las condiciones de pH respectivas de 6 a 9 y de 4 a 5 a las ocho semanas de iniciado el experimento.

Los resultados citados anteriormente muestran que el N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico es más estable a la luz en diferentes condiciones de pH en comparación con los análogos del mismo, lo que indica que N1-óxido de adenosina 5'-fosfato se usa de forma más ventajosa como ingrediente eficaz para agentes dérmicos externos a la luz de que dichos análogos de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico son más susceptibles a descomponerse fácilmente tras la exposición a la luz solar en comparación con la luz fluorescente.

En un experimento, realizado conforme con "TG432: Prueba de fototoxicidad in vitro de 3T3 NRU" como guía de prueba de OECD, que es un método experimental acordado internacionalmente para evaluar la seguridad de sustancias químicas y mezclas de las mismas, no se encontró toxicidad óptica de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, N1-óxido de adenosina, N1-óxido de 3'-a-glucosiladenosina y N1-óxido de 5'-a-glucosiladenosina. Conforme a esto, se puede decir que un agente dérmico externo que contiene cualquiera de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato, análogos del mismo y sus sales son seguros.

Ejemplo de referencia 1

<Loción cosmética>

(Composición)

Ingredientes (% en

masa)

(1) Glicerina 4,0

(2) Propilenglicol 3,0

(3) 1,2-pentanodiol 0,1

(4) N1-óxido de adenosina 5'-fosfato 1,0

sódico

(5) Alcohol oleílico de polioxietileno 0,5

(20)

(6) Extracto de geranio de fresa 2,0

(7) Etanol 5,0

(8) Sabor c.s.

(9) Agua refinada Resto

Los ingredientes (1) a (4) anteriores se disolvieron en el ingrediente (9) y la solución resultante se mezcló con una mezcla, que se había preparado mezclando los ingredientes (5) a (8), para preparar una loción cosmética. Dado que el producto contiene N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, es una loción cosmética mejorada capaz de potenciar la renovación de la piel y útil como antienvejecimiento que tiene una acción ventajosa de mantener o potenciar la función de barrera de la piel y la producción de elastina, además de una acción mejorada de antiarrugas, anti­ arrugas de expresión, antiflacidez y antimanchas. Asimismo, es una loción cosmética con un efecto antiséptico mejorado y capacidad de retención de la humedad porque contiene 1,2-pentanodiol.

Ejemplo de referencia 2

<Loción lechosa>

(Composición)

Ingredientes (% en masa) (1) 1,2-Hexanodiol 5,0

(2 ) Octildodecanol 4,0

(3) N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico 0,1

(4) "AA2G", un nombre de producto de ácido ascórbico 2-glucósido comercializado por 2,0 Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japón

(5) Éter de oleil polioxietileno (20) 1,0

(6) Ácido esteárico 0,5

(7) Manteca de karité 2,0

(8) Cera de abeja 4,0

(9) Éster de p-hidroxibenzoato 0,2

(10) Extracto de semilla de membrillo 5,0

(11) Goma xantana 0,1

(12) Ácido fítico 0,02

(13) Vitamina E 0,01

(14) Agua refinada Resto

Los ingredientes anteriores (1), (3), (10), (11) y (14) se mezclaron en una fase acuosa. Sin embargo, los ingredientes anteriores (2), (5) a (9), (12) y (13) se calentaron y se mezclaron en una fase oleosa. La fase acuosa se añadió a la fase oleosa y se mezcló hasta homogeneidad y, a continuación, se enfrió, seguido de la adición del ingrediente (4) restante a la mezcla resultante para obtener una loción lechosa. Dado que el producto en forma de loción lechosa contiene N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y ácido ascórbico 2-glucósido, es una loción lechosa capaz de acelerar la renovación de la piel y se puede utilizar ventajosamente como antienvejecimiento que tiene una acción ventajosa de mantener o potenciar la función de barrera de la piel y la producción de elastina, además de una acción mejorada de antiarrugas, anti-arrugas de expresión, antiflacidez y antimanchas.

Ejemplo de referencia 3

<Loción lechosa cosmética>

(Composición)

Ingredientes (% en masa)

(1) Ácido esteárico 2,5

(2) Cetanol 1,5

(3) Vaselina 5,0

(4) Aceite mineral blanco 10,0

(5) Oleato de polioxietileno 2,0

(6) Acetato de tocoferilo 0,5

(7) Glicirrhizinato dipotásico 0,2

(8) Polietilenglicol 1500 3,0

(9) N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico 0,1

(10) Galato de epigalocatequina 0,5

(11) 1,2-Hexanodiol 0,1

(12) Agua refinada Resto

De acuerdo con la formulación anterior, todos los ingredientes se mezclaron de la manera habitual y se mezclaron adicionalmente con una cantidad adecuada de un aroma para preparar una loción lechosa. Dado que el producto contiene N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico y galato de epigalocatequina, es una loción lechosa capaz de acelerar la renovación de la piel y se puede utilizar ventajosamente para antienvejecimiento que tiene una acción ventajosa de mantener o potenciar la función de barrera de la piel y la producción de elastina, además de una acción mejorada de antiarrugas, anti-arrugas de expresión, antiflacidez y antimanchas.

Ejemplo de referencia 4

<Crema cosmética>

(Composición)

Ingredientes (% en masa)

(1) Ácido esteárico 5,0

(2) Alcohol cetílico 5,0

(3) Escualano 8,0

(4) Vaselina 3,0

(5) tri(2-etilhexanoato) de glicerol 7,0

(6) Dipropilenglicol 6,0

(7) Glicerina 4. 0

(8) N1-óxido de adenosina 5'-fosfato

sódico 0,1

(9) Edetato disódico 0,01

(10) Monoestearato de propilenglicol 3,0

(11) Polioxietileno (20) 3,0

Éter de alcohol cetílico

(12) 1,2-Hexanodiol 0,2

(13) Aroma c.s.

(14) Agua refinada Resto

Se añadieron los ingredientes (6) a (9) al ingrediente (14), seguido de calentamiento de la mezcla a 60 °C para preparar una fase acuosa. Mientras que los ingredientes (1) a (5) y (10) a (13) restantes se mezclaron y calentaron a 70 °C para obtener una fase oleosa, que luego se añadió a la fase acuosa. La mezcla así obtenida se emulsionó de la manera habitual en una crema. Dado que el producto se incorpora con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, es una crema mejorada capaz de acelerar la renovación de la piel y que tiene una estabilidad satisfactoria porque contiene edetato disódico (o sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético). El producto es útil como una crema cosmética antienvejecimiento que no tiene sensación pegajosa pero tiene una disponibilidad satisfactoria y una acción ventajosa de mantener o potenciar la función de barrera de la piel y la producción de elastina, además de una acción mejorada de antiarrugas, anti-arrugas de expresión, antiflacidez y antimanchas.

Ejemplo de referencia 5

<Suero>

(Composición)

Ingredientes (% en masa) (1) Maltitol 7,5 (2) "AA2G", un nombre de producto de ácido ascórbico 2-glucósido, comercializado por 2,0 Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japón

(3) 1,2-Alcanodiol 5,0 (4) Polietilenglicol 1500 1,0 (5) Etanol 5,0 (6) Polímero carboxivinílico 0,4 (7) Poliacrilato de sodio 0,1 (8) éter de oleil polioxietileno (20) 1,5 (9) Aceite de oliva 0,2 (10) N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico 0,1 (11) Hidróxido potásico c.s. (12) Sabor c.s. (13) Agua refinada Resto

De acuerdo con la formulación anterior, todos los ingredientes se mezclaron de la forma habitual para preparar un suero. Dado que el producto se incorpora con N1-óxido de adenosina 5'-fosfato sódico, es un suero capaz de acelerar la renovación de la piel y es útil como suero antienvejecimiento que no tiene sensación pegajosa pero tiene una disponibilidad satisfactoria y una acción ventajosa de mantener o potenciar la función de barrera de la piel y la producción de elastina, además de una acción mejorada de antiarrugas, anti-arrugas de expresión, antiflacidez y antimanchas.

Aplicabilidad industrial

Como se ha descrito anteriormente, el agente dérmico externo antienvejecimiento de la presente divulgación previene o mejora de forma eficaz las arrugas relacionadas con la edad, las arrugas de expresión, la flacidez, las manchas, etc., en la piel porque el agente mejora la renovación de la piel, mantiene o potencia la función de barrera de la piel y la expresión de proteína filagrina en la piel, mantiene o acelera la producción de elastina en la piel, inhibe la matriz metaloproteasa-1 en la piel o inhibe la producción de endotelina-1 en la piel. La presente invención es una invención verdaderamente significativa que contribuye en gran medida a la técnica.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Uso de N1-óxido de adenosina 5'-fosfato y/o sus sales, en combinación con uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste en ácido ascórbico 2-glucósido, etilendiaminotetraacetato (EDTA) y galato de epigalocatequina, como ingredientes eficaces para antienvejecimiento en un agente dérmico externo.

2. El uso de la reivindicación 1, que es para mejorar la renovación de la piel, para potenciar la función de barrera de la piel, para prevenir o reducir las arrugas o para prevenir o reducir las manchas de pigmentación.

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho agente dérmico externo se administra a la piel.