KR20130055569A - 친화성 크로마토그래피용 충전제 - Google Patents

친화성 크로마토그래피용 충전제 Download PDF

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유스께 오까노
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히로시 가와이
사또시 휴가지
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Abstract

본 발명은 단백질의 동적 결합 용량이 높고 압력 특성이 우수한 다공질 입자를 포함하는, 단백질 정제에 유용한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 제공한다. 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제는 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체, 또는 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체를 포함하는 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자, 상기 다공질 입자에 결합한 리간드 및 개환 에폭시기를 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

친화성 크로마토그래피용 충전제 {FILLER FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 친화성 크로마토그래피용 충전제에 관한 것이다. 특히, 단백질의 동적 결합 용량이 높고, 나아가 압력 특성이 우수한 다공질 입자를 포함하는, 단백질 정제에 유용한 친화성 크로마토그래피용 충전제에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는 모노클로날 항체를 포함시킨 단백질의 연구, 개발 및 제조에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. 친화성 크로마토그래피용 충전제는 일반적으로 표적 분자와 선택적으로 결합하는 리간드를 갖는 고상 담체를 포함한다. 친화성 크로마토그래피는 고상 담체 상의 리간드가 표적 분자에 대하여 높은 선택성을 갖기 때문에, 이온 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 액체 크로마토그래피 등의 다른 크로마토그래피에 비하여 우수한 수율 및 고속이며 경제적인 정제가 가능해진다.
친화성 크로마토그래피용 충전제의 고상 담체는 주로 아가로오스 입자가 사용되고 있다(특허문헌 1, 2). 아가로오스 입자는 그 높은 친수성으로 인해 리간드의 활성이 높고, 표적 분자에 대한 동적 결합 용량이 높다.
다른 친화성 크로마토그래피용 충전제의 고상 담체로서는 스티렌-디비닐벤젠의 중합체를 포함하는 다공질 입자가 사용되는 경우가 있다(특허문헌 3, 4). 스티렌-디비닐벤젠과 같은 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자는 일반적으로 탄성률이 높고, 압력 특성이 우수하다.
또한, 친화성 크로마토그래피용 충전제에서의 높은 동적 결합 용량과 압력 특성의 양립을 위하여, 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자의 세공에 아가로오스와 같은 당쇄를 결합한 입자도 제안되어 있다(특허문헌 5).
한편, 수산기 함유 가교성 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자를 크로마토그래피에 이용하는 예는 있었지만, 이것들은 모두 분석을 목적으로 한 겔 여과 크로마토그래피, 역상 액체 크로마토그래피에만 적합한 것이다(특허문헌 6 내지 8).
일본 특허 공표 제2008-523140호 공보 일본 특허 공표 제2009-522580호 공보 일본 특허 공개 (평)8-278299호 공보 일본 특허 공표 (평)10-501173호 공보 일본 특허 공개 제2008-232764호 공보 일본 특허 공개 제2002-239380호 공보 일본 특허 공개 제2003-176363호 공보 일본 특허 공개 제2000-187028호 공보
그러나, 아가로오스 입자는 일반적으로 탄성률이 낮기 때문에, 고속으로 매체를 흘렸을 때 칼럼의 압력이 높아진다고 하는 결점을 갖고 있어 압력 특성이 떨어진다. 또한, 아가로오스 입자는 일반적으로 천연의 해초로부터 길고 복잡한 공정을 거쳐 제조되기 때문에, 일정한 품질의 것을 얻는 것이 곤란하다고 하는 결점이 있다. 한편, 스티렌-디비닐벤젠과 같은 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자는 친수성이 낮기 때문에 리간드의 활성이 낮고, 표적 분자에 대한 동적 결합 용량이 낮다고 하는 결점을 갖는다. 또한, 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자의 세공에 아가로오스와 같은 당쇄를 결합한 입자는, 아가로오스 입자와 마찬가지로 길고 복잡한 공정을 거쳐 제조되기 때문에, 친화성 크로마토그래피로서 사용할 수 있는 품질의 것은 고가이었거나, 일정한 품질의 것이 얻어지기 어렵다고 하는 결점을 갖는다. 또한, 종래와 같은 겔 여과 크로마토그래피나 역상 액체 크로마토그래피에 이용되고 있었던 수산기 함유 가교성 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자는, 친화성 크로마토그래피용 충전제로서의 높은 동적 결합 용량과 압력 특성의 양립을 달성할 수 있는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 단백질의 동적 결합 용량이 높고 압력 특성도 우수한, 단백질 정제에 유용한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제는,
수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체, 또는 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체를 포함하는 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자,
상기 다공질 입자에 결합한 리간드 및
개환 에폭시기를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 상기 리간드가 단백질 A, 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인, 또는 그의 변이체를 적어도 1개 포함하는 단백질일 수 있다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 상기 비닐 단량체가
(X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 20 내지 90질량부,
(X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 0 내지 40질량부,
(M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체 1 내지 40질량부, 및
(M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체 0 내지 70질량부로 구성(단, (X-1), (X-2), (M-1) 및 (M-2)의 합계는 100질량부임)될 수 있다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 상기 개환 에폭시기는 상기 중합체에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻을 수 있다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 상기 다공질 입자가
상기 비닐 단량체 100질량부와,
(P-1) 탄소수 7 내지 14인 직쇄상, 분지쇄상 및 환상의 알코올, 에테르, 알데히드, 케톤, 에스테르, 탄소수 8 내지 10의 알킬벤젠으로부터 선택되는 적어도 1개의 포로겐(단, 포로겐의 합계량은 100 내지 400질량부이고, (P-1)은 포로겐의 합계량 100질량％ 중에 10질량％ 이상임)을 필수 성분으로 하는 수계 혼합물
을 현탁 중합하여 얻을 수 있다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 수은 세공 측정기로 공경 10 내지 5000nm의 범위에 상당하는 세공을 측정하였을 때 상기 다공질 입자의 세공 용적이 1.00 내지 1.90ml/g일 수도 있다.
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 상기 다공질 입자의 입경이 35 내지 100㎛일 수도 있다.
본 발명의 별도의 일 양태에 관한 면역 글로불린을 단리하는 방법은,
상기 친화성 크로마토그래피용 충전제를 이용하여 상기 충전제에 면역 글로불린을 흡착시키는 공정, 및
상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정을 포함한다.
본 발명의 별도의 일 양태에 관한 칼럼은, 상기 친화성 크로마토그래피용 충전제가 충전된 친화성 크로마토그래피용 충전 칼럼이다.
본 발명에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제에 따르면, 단백질의 동적 결합 용량이 높고, 나아가 압력 특성이 우수한, 단백질 정제에 유용한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이 가능해진다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 면역 글로불린 결합 단백질(SP4Z)의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 발현 벡터(pETM-11)에 삽입된, 본 발명의 실시예 1에 관한 면역 글로불린 결합 단백질을 코드하는 DNA 프래그먼트의 구성을 설명하는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 제조된 면역 글로불린 결합 단백질(SPATK)의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 4는 발현 벡터(pETM-11)에 삽입된, 본 발명의 실시예 2에 관한 면역 글로불린 결합 단백질을 코드하는 DNA 프래그먼트의 구성을 설명하는 도면이다.
이하, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제에 대하여 구체적으로 설명한다.
1. 친화성 크로마토그래피용 충전제
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제는 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체, 또는 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체를 포함하는 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자,
상기 다공질 입자에 결합한 리간드 및
개환 에폭시기를 갖는다.
1.1. 다공질 입자의 구성
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 다공질 입자는, 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체를 필수 성분으로 하는 비닐 단량체의 공중합체, 또는 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체만을 필수 성분으로 하는 비닐 단량체의 단독중합체를 포함하는 담체 입자이다. 상기 중합체에는 에폭시기가 포함되기 때문에, 상기 중합체를 포함하는 리간드 결합 전에 있어서의 다공질 입자는 에폭시기를 포함한다. 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량은 0.05 내지 4.0mmol/g이다.
1.1.1. 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체
수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체는, 1분자 중에 2개 이상의 중합성 비닐기(에틸렌성 불포화 결합을 갖는 기)와 1개 이상의 수산기를 가지며, 에폭시기를 갖지 않는 가교성의 단량체이다. 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체를 이용하여 다공질 입자를 친수화하고, 적절한 탄성률로 제어함으로써 단백질의 동적 결합 용량이 높고, 나아가 압력 특성이 우수한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 얻을 수 있다.
수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체로서는, 바람직하게는 지방족 폴리비닐 단량체이고, 더욱 바람직하게는 다가 알코올의 (메트)아크릴레이트이다. 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체로서는, 구체적으로는 글리세린디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올에탄디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판디(메트)아크릴레이트, 부탄트리올디(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨디(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨트리(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨디(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨트리(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨테트라(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨펜타(메트)아크릴레이트, 이노시톨디(메트)아크릴레이트, 이노시톨트리(메트)아크릴레이트, 이노시톨테트라(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다. 그 밖에 각종 당류의 2치환 이상의 (메트)아크릴레이트, 예를 들면 글루코오스디(메트)아크릴레이트, 글루코오스트리(메트)아크릴레이트, 글루코오스테트라(메트)아크릴레이트, 만니톨디(메트)아크릴레이트, 만니톨트리(메트)아크릴레이트, 만니톨테트라(메트)아크릴레이트, 만니톨펜타(메트)아크릴레이트 등도 들 수 있다. 또한, 디아미노프로판올, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 글루코사민 등의 다가 아미노알코올과 (메트)아크릴산과의 탈수 축합 반응물과 마찬가지의 구조를 갖는 수산기 함유 가교성 비닐 단량체 등도 들 수 있다. 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체로서, 특히 바람직하게는 글리세린디(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨트리(메트)아크릴레이트, 이노시톨트리(메트)아크릴레이트이고, 가장 바람직하게는 글리세린디(메트)아크릴레이트이다. 내알칼리성을 고려하면, 메타크릴레이트류, 아크릴아미드류, 메타크릴아미드류가 바람직하다. 내알칼리성을 고려한 경우, 특히 바람직한 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체는 글리세린디메타크릴레이트, 펜타에리트리톨트리메타크릴레이트, 이노시톨트리메타크릴레이트이고, 가장 바람직하게는 글리세린디메타크릴레이트이다.
1.1.2. 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체
에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체는 1분자 중에 1개의 중합성 비닐기와 1개 이상의 에폭시기를 갖는 비가교성의 단량체이다. 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체가 갖는 에폭시기의 수는 1분자 중에 1 내지 3개가 바람직하고, 1개가 보다 바람직하다. 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체는 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체를 포함하는 비닐 단량체의 공중합체로부터 얻어지는 다공질 입자의 리간드 결합 전에 적절한 양의 에폭시기를 도입하기 위한 필수 성분이다.
에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체로서는 1분자 중에 1개의 중합성 비닐기와 1개의 에폭시기를 갖는 비가교성의 단량체를 공업적으로 용이하게 입수할 수 있다. 이러한 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체로서는, 예를 들면 글리시딜(메트)아크릴레이트, 4-히드록시부틸(메트)아크릴레이트글리시딜에테르, 3,4-에폭시시클로헥실메틸(메트)아크릴레이트, α-(메트)아크릴-ω-글리시딜폴리에틸렌글리콜 등의 (메트)아크릴산 에스테르류; 비닐벤질글리시딜에테르 등의 방향족 비닐 화합물; 알릴글리시딜에테르, 3,4-에폭시-1-부텐, 3,4-에폭시-3-메틸-1-부텐 등을 들 수 있으며, 글리시딜(메트)아크릴레이트, 4-히드록시부틸(메트)아크릴레이트글리시딜에테르가 특히 바람직하다.
그 밖에 비닐 단량체로서 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체 대신에, 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체를 단독으로 사용할 수 있다. 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체로서는, 예를 들면 펜타에리트리톨디(메트)아크릴레이트글리시딜에테르, 이노시톨디(메트)아크릴레이트글리시딜에테르, 이노시톨트리(메트)아크릴레이트글리시딜에테르 등을 예시할 수 있다. 또한, 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체를, 상기 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체와 함께 이용할 수도 있다.
1.1.3. 바람직한 비닐 단량체
비닐 단량체는
(X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 20 내지 90질량부,
(X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 0 내지 40질량부,
(M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체 1 내지 40질량부, 및
(M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체 0 내지 70질량부로 구성되는 것(단, (X-1), (X-2), (M-1) 및 (M-2)의 합계는 100질량부)인 것이 바람직하다.
(X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체의 구체예, 바람직한 예는, 상기 1.1.1. 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체에서 설명한 바와 같다. (X-1)은 바람직하게는 20 내지 90질량부, 보다 바람직하게는 25 내지 85질량부, 가장 바람직하게는 30 내지 80질량부이다. (X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체가 20질량부 이상 90질량부 이하이면 단백질의 동적 결합 용량이 우수하다.
(X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체는 1분자 중에 2개 이상의 중합성 비닐기를 갖고, 수산기도 에폭시기도 갖지 않는 가교성의 단량체이다. (X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체는, (X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체를 보충하여 사용하며, 적절한 탄성률로 제어함으로써 압력 특성을 향상시킬 수 있는 경우가 있다. (X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체로서는 방향족 폴리비닐 단량체, 지방족 폴리비닐 단량체가 바람직하며, 방향족 폴리비닐 단량체로서는 디비닐벤젠이 바람직하고, 지방족 폴리비닐 단량체로서는 다가 (메트)아크릴레이트 화합물이 바람직하다. 다가 (메트)아크릴레이트 화합물로서는, 예를 들면 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 디에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 트리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 테트라에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 디프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 트리프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 테트라프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 1,4-부탄디올디(메트)아크릴레이트, 1,6-헥산디올디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판트리(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨테트라(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있으며, 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트, 펜타에리트리톨테트라아크릴레이트가 특히 바람직하다. (X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체는 바람직하게는 0 내지 40질량부이고, 보다 바람직하게는 0 내지 20질량부이다. (X-2)가 40질량부를 초과하면 단백질의 동적 결합량이 낮아지는 경우가 있다.
(X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체와 (X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체는 혼합물로서 공업적으로 공급되는 경우가 있으며, 본 발명의 범위 내에서 이것들을 그대로 사용할 수도 있다.
(M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체의 구체예, 바람직한 예는, 상기 1.1.2. 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체에서 설명한 바와 같다. (M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체는 바람직하게는 1 내지 40질량부, 보다 바람직하게는 2 내지 30질량부, 가장 바람직하게는 3 내지 15질량부이다. (M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체가 1질량부 이상 40질량부 이하이면, 얻어지는 중합체를 포함하는 다공질 입자에 포함되는 에폭시기 함유량이 적절한 양이 된다.
(M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체로서는 친수성 비닐 단량체가 바람직하고, 수산기 함유 비가교성 비닐 단량체가 더욱 바람직하다. (M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체로서 친수성 단량체를 이용한 경우에는, 친화성 크로마토그래피용 충전제의 친수성을 보충하여 높은 표적 분자의 동적 결합 용량을 발현할 수 있는 경우가 있다. 친수성 비닐 단량체 중 수산기 비함유 비가교성의 친수성 비닐 단량체로서는, 예를 들면 디메틸아크릴아미드, 아크릴로일모르폴린, 메톡시에틸(메트)아크릴레이트, 디아세톤(메트)아크릴아미드, N-비닐-2-피롤리돈 등을 들 수 있다. 수산기 함유 비가교성 비닐 단량체로서는, 예를 들면 글리세롤모노(메트)아크릴레이트, 트리메틸올에탄모노(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판모노(메트)아크릴레이트, 부탄트리올모노(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨모노(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨모노(메트)아크릴레이트, 이노시톨모노(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴아미드 등을 들 수 있으며, 글리세롤모노메타크릴레이트, 히드록시에틸메타크릴레이트, 히드록시에틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴에스테르가 바람직하고, 글리세롤모노메타크릴레이트가 가장 바람직하다. (M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체는 바람직하게는 0 내지 70질량부이고, 보다 바람직하게는 0질량부 초과 40질량부 이하이다. (M-2)가 70질량부를 초과하면 압력 특성이 떨어지는 경우가 있다.
바람직한 비닐 단량체에서의 바람직한 양비의 구체예로서는,
(X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 25 내지 85질량부,
(X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 0 내지 20질량부,
(M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체 2 내지 30질량부, 및
(M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체 0 내지 70질량부
로 구성되는 비닐 단량체,
또는
(X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 30 내지 80질량부,
(X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 0 내지 20질량부,
(M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체 3 내지 15질량부, 및
(M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체 0질량부 초과 40질량부 이하
로 구성되는 비닐 단량체를 들 수 있다. 단, 어느 비닐 단량체의 구체예에 있어서도 (X-1), (X-2), (M-1) 및 (M-2)의 합계는 100질량부이다.
1.1.4. 다공질 입자의 제조
다공질 입자는 공지된 시드 중합, 현탁 중합 등에 의해 제조할 수 있다. 시드 중합법으로서 일본 특허 공고 (소)57-24369호 공보에 기재된 2단 팽윤 중합법도 바람직하게 이용된다. 중합시에는 상기 단량체 외에 물, 포로겐을 필수 성분으로 하고, 중합 개시제, 고분자 분산제, 계면활성제, 염, 시드 입자, 수용성 중합 금지제 등을 필요에 따라 사용한다.
다공질 입자의 제조에서의 바람직한 중합법은,
상술한 비닐 단량체 100질량부와,
(P-1) 탄소수 7 내지 14인 직쇄상, 분지쇄상 및 환상의 알코올, 에테르, 알데히드, 케톤, 에스테르, 탄소수 8 내지 10의 알킬벤젠으로부터 선택되는 적어도 1개의 포로겐을 필수 성분으로 하는 수계 혼합물의 현탁 중합법이다.
이 때, 또한 (P-2)로서 (P-1) 이외의 포로겐을 병용할 수도 있다. 포로겐의 사용량은 바람직하게는 단량체 100질량부에 대하여 합계로 100 내지 400질량부이다. (P-1)의 사용량은 포로겐의 합계량 100질량％ 중에 10질량％ 이상인 것이 바람직하다.
(P-1)의 포로겐을 구체적으로 예시하면,
알코올로서 1-헵탄올, 2-헵탄올, 3-헵탄올, 4-헵탄올, 2,4-디메틸-3-펜탄올, 5-메틸-2-헥산올, 2-에틸-1-헥산올, 2-옥탄올, 3-옥탄올, 5-메틸-3-헵탄올, 1-노난올, 3,5,5-트리메틸헥산올;
에테르로서 헥실메틸에테르, 디부틸에테르, 시네올;
알데히드로서 헵타날, 옥타날, 2-에틸-1-헥사날, 노나날, 3,5,5-트리메틸헥사날, 1-데카날, 도데카날;
케톤으로서 2-헵타논, 3-헵타논, 4-헵타논, 2,4-디메틸-3-펜타논, 4,4-디메틸-2-펜타논, 5-메틸-2-헥사논, 2-옥타논, 3-옥타논, 5-메틸-3-헵타논, 2,6-디메틸-4-헵타논, 2-노나논, 3-노나논, 4-노나논, 3,3,5-트리메틸시클로헥사논, 2-데카논, 3-데카논, 2-운데카논, 4-t-펜틸시클로헥사논, 2-헥실시클로펜타논, 2-헵틸시클로펜타논, 디시클로헥실케톤;
에스테르로서 포름산 헥실, 아세트산 펜틸, 아세트산 이소펜틸, 프로피온산 부틸, 프로피온산 이소부틸, 부티르산 프로필, 부티르산 이소프로필, 이소부티르산 프로필, 이소부티르산 이소프로필, 발레르산 에틸, 이소발레르산 에틸, 피발산 에틸, 헥산산 메틸, 아세트산 헥실, 아세트산 시클로헥실, 아세트산-2-에틸부틸, 프로피온산 이소펜틸, 부티르산 부틸, 이소부티르산 부틸, 부티르산 이소부틸, 이소부티르산 이소부틸, 발레르산 프로필, 이소발레르산 프로필, 헥산산 에틸, 헵탄산 메틸, 아세트산 헵틸, 프로피온산 헥실, 부티르산 펜틸, 부티르산 이소펜틸, 이소부티르산 펜틸, 이소부티르산 이소펜틸, 발레르산 이소부틸, 헥산산 프로필, 헥산산 이소프로필, 헵탄산 에틸, 옥탄산 메틸, 아세트산 옥틸, 아세트산 이소옥틸, 아세트산-2-에틸헥실, 부티르산 헥실, 부티르산 시클로헥실, 발레르산 펜틸, 이소발레르산 이소펜틸, 헥산산 부틸, 헥산산 이소부틸, 옥탄산 에틸, 노난산 메틸, 아세트산 노닐, 헥산산 펜틸, 노난산 에틸, 2-에틸헥산산 프로필, 3,5,5-트리메틸헥산산 에틸, 데칸산 메틸, δ-도데카노락톤, 아세트산 데실, 데칸산 에틸, 아세트산 시트로넬릴, 도데칸산 메틸, 아세트산 도데실, 도데칸산 에틸;
알킬벤젠으로서 크실렌, 에틸벤젠, 쿠멘, n-프로필벤젠, n-부틸벤젠, t-부틸벤젠, sec-부틸벤젠, iso-부틸벤젠, 에틸톨루엔, 시멘, 메시틸렌 등을 들 수 있다.
(P-1)의 포로겐으로서는 친수성을 저해하지 않고, 리간드의 활성을 높게 유지할 수 있기 때문에 알코올, 에테르, 알데히드, 케톤, 에스테르가 바람직하고, 케톤, 에스테르가 더욱 바람직하고, 탄소수 7 내지 10의 케톤, 에스테르가 가장 바람직하다.
(P-2)는 (P-1) 이외의 포로겐이며, 다공질 입자의 세공 용적을 조정하기 위하여 첨가할 수도 있는 성분이다. 20℃에서의 (P-2)의 물에의 용해도는 20％ 이하인 것이 바람직하다.
포로겐의 구성으로서 (P-2)의 포로겐, 즉 탄소수 7 미만의 직쇄 및 분지의 알코올, 에테르, 알데히드, 케톤, 에스테르, 탄소수 8 미만의 알킬벤젠을 주성분으로 하면, 단백질 분리 등에 적합한 큰 세공 직경이 되지 않으며, 또한 세공 용적이 작아지는 경우가 있다. 또한, 탄소수 14를 초과하는 알코올, 에테르, 알데히드, 케톤, 에스테르, 또는 탄소수 10을 초과하는 알킬벤젠을 주성분으로 하면, 세공 용적이 작아지거나 또는 다공질이 아닌 미소한 입자가 형성되는 경우가 있다.
(P-1)을 포함하는 포로겐의 합계량은, 상기 단량체 전량 100질량부에 대하여 통상 100 내지 400질량부이고, 바람직하게는 150 내지 300질량부이다. 포로겐의 합계량이 100질량부 미만이면, 단백질 분리 등에 적합한 큰 세공 직경이 되지 않으며, 또한 세공 용적이 작아진다. 포로겐의 합계량이 400질량부를 초과하면, 세공 용적이 과대해지거나 또는 다공질이 아닌 미소한 입자가 형성된다.
(P-1)은 포로겐의 합계량에 대하여 10질량％ 이상인 것이 바람직하고, 20질량％ 이상인 것이 바람직하다. (P-1)이 포로겐의 합계량 중에 10질량％ 이하이면 세공 용적이 작아지는 경우가 있다.
현탁 중합에서의 중합 용매는 물이다. 물에는 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서 알코올 등의 유기 용매 등이 포함되어 있을 수도 있다. 물의 양은 단량체 전량 100질량부에 대하여 바람직하게는 200 내지 10000질량부, 보다 바람직하게는 500 내지 5000질량부이다. 물의 양이 상기의 범위 내이면 중합 중의 입자끼리의 합일이 억제되어 입경의 제어가 용이하고, 생산성이 우수하다.
중합 개시제로서는 과황산칼륨, 과황산나트륨, 과황산암모늄 등의 과황산염, 과산화수소, t-부틸히드로퍼옥시드, t-부틸퍼옥시말레산, 숙신산 퍼옥시드, 2,2'-아조비스[2-N-벤질아미디노]프로판 염산염 등의 수용성 개시제; 벤조일퍼옥시드, 라우로일퍼옥시드, 쿠멘히드로퍼옥시드, 디이소프로필퍼옥시디카보네이트, 쿠밀퍼옥시네오데카노에이트, 쿠밀퍼옥시옥타노에이트, t-부틸퍼옥시-2-에틸헥사노에이트, 3,5,5-트리메틸헥사노일퍼옥시드, 아조비스이소부티로니트릴, 아조비스이소발레로니트릴 등의 유용성 개시제; 유기 퍼옥시드와 아황산나트륨, 론갈리트, 아스코르브산나트륨 등의 환원제를 병용한 산화 환원계 개시제 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유용성 개시제 또는 유용성의 산화 환원 개시제이고, 생산성의 점에서 보다 바람직하게는 유용성 개시제이다. 개시제의 양은 단량체 전량 100질량부에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 10질량부, 보다 바람직하게는 0.05 내지 5질량부이다. 이들 중합 개시제는 물, 단량체 혼합물 또는 포로겐에 용해하여 중합계에 제공할 수도 있고, 실온 및 가열 중의 중합계에 단독으로 첨가할 수도 있다. 과황산염 등 중합 중에 산성 또는 염기성을 나타내는 개시제를 사용하며, 에폭시기의 가수분해를 방지할 필요가 있는 경우에는, pH를 중성 부근으로 유지하는 완충 용액 중에서 현탁 중합하는 것이 바람직하다. 자외선, 전자선 등을 조사함으로써 개시제를 사용하지 않고 현탁 중합하는 것도 가능하며, 공지된 광 라디칼 개시제를 사용하는 것도 가능하다.
고분자 분산제로서는 비누화도 80 내지 95％의 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 수용성 중합체를 사용할 수 있다.
계면활성제로서는 도데실황산나트륨, 도데실벤젠술폰산나트륨, 폴리옥시에틸렌도데실에테르황산에스테르염 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 등의 비이온성 계면활성제 등을 사용할 수 있다.
염으로서는 염화나트륨, 황산나트륨, 탄산나트륨 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
시드 입자로서는 중량 평균 분자량 1,000 내지 100,000 정도의 폴리스티렌 입자, 폴리알킬(메트)아크릴레이트 입자 등을 사용할 수 있다.
수용성 중합 금지제로서는 요오드화칼륨 등의 요오드화물염, 아질산나트륨 등의 아질산염, 티오황산나트륨 등의 티오황산염, 술폰화 나프토히드로퀴논암모늄염 등의 수용성 퀴논 화합물 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
시드 중합에서는 시드 입자의 크기와 양, 단량체의 양, 포로겐의 양을 조정함으로써, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제로서 필요한 입경을 갖는 다공질 입자를 얻을 수 있다. 현탁 중합에서는 고분자 분산제 및 계면활성제의 종류와 양, 교반 속도, 교반 날개 및 중합 용기의 형상과 크기를 조정함으로써, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제로서 필요한 입경을 갖는 다공질 입자를 얻을 수 있다.
다공질 입자의 세공 용적은 단량체와 포로겐의 비를 바꿈으로써 조절하는 것이 공지이다. 그 밖에 중합시에 사용하는 염이나 중합 금지제의 종류와 양, 중합 온도 등에 따라서도 다공질 입자의 세공 용적을 조절할 수 있다. 친화성 크로마토그래피용 충전제로서의 다공질 입자의 세공 용적은, 리간드 결합 전의 다공질 입자의 세공 용적과, 결합하는 리간드의 양에 의해 조절할 수 있다.
중합의 온도 및 시간은 산화 환원계 개시제 이외의 개시제를 사용하는 경우, 바람직하게는 40 내지 100℃에서 30분 내지 24시간, 보다 바람직하게는 60 내지 90℃에서 1 내지 10시간이다.
중합 완결 후, 시드 입자 및/또는 포로겐의 양용매를 이용하여 세정하는 것이 후술하는 리간드의 결합이 용이해지는 점에서 바람직하다. 세정 용매로서는 아세톤, 에탄올, 이소프로필알코올 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 세정 전후에 초음파 분산기 등을 이용하여 다공질 입자를 분산시킬 수도 있다. 또한, 기울여 따르기, 여과 등의 방법에 의해 소 입자나 조대 입자를 제거하는 것이 압력 특성의 향상이나 단백질 등의 동적 결합 용량의 향상의 점에서 바람직하다.
1.1.5. 에폭시기 함유량
리간드 결합 전의 다공질 입자에 포함되는 에폭시기는 리간드를 결합하기 위한 관능기이며, 또한 개환 후에 친화성 크로마토그래피용 충전제로서의 친수성 향상의 기초가 되는 관능기이다. 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량은 0.05 내지 4.0mmol/g이고, 바람직하게는 0.08 내지 2.5mmol/g이고, 가장 바람직하게는 0.10 내지 1.5mmol/g이다. 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량이 0.05mmol/g 이상이면 리간드의 결합량이 적절하고, 단백질의 동적 결합 용량의 저하가 억제된다. 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량이 4.0mmol/g 이하이면, 보존 중에 있어서의 리간드의 활성의 저하가 억제되고, 단백질의 동적 결합 용량의 저하도 억제된다. 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량은, 다공질 입자에 염산을 과잉으로 첨가하여 염산을 부가 반응시킴으로써 에폭시기를 개환하고, 잔여의 염산을 과잉량의 수산화나트륨 수용액으로 중화한 후, 잔여의 수산화나트륨을 염산으로 역적정함으로써 정량할 수 있다. 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량은 에폭시기 비닐 함유 단량체의 양, 중합 온도, 중합 시간, 중합액의 pH, 나아가 중합 후의 개환 처리 등에 의해 조정할 수 있다.
1.2. 친화성 크로마토그래피용 충전제의 구성
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제는, 상기 다공질 입자, 상기 다공질 입자에 결합한 리간드 및 개환 에폭시기를 포함한다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제의 일 실시 형태로서는, 상기 특정한 중합체를 포함하는 다공질 입자에 리간드를 결합하고, 상기 중합체에 포함되는 에폭시기를 개환시켜 얻어지는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함한다.
상기 리간드 결합 다공질 입자의 부피 평균 입경은 35 내지 100㎛인 것이 바람직하며, 수은 세공 측정기로 공경 10 내지 5000nm의 범위에 상당하는 세공을 측정하였을 때 세공 용적이 1.00 내지 1.90ml/g인 것이 바람직하다.
1.2.1. 리간드
리간드는 표적물에 대하여 적절한 친화성을 갖는 것이면 그 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 단백질 A, 단백질 G, 아비딘 등의 단백질; 인슐린 등의 펩티드; 모노클로날 항체 등의 항체; 효소; 호르몬; DNA; RNA; 헤파린, 루이스 X, 강글리오시드 등의 당질; 이미노디아세트산, 합성 색소, 2-아미노페닐붕소산, 4-아미노벤즈아미딘, 글루타티온, 비오틴이나 그의 유도체와 같은 저분자 화합물을 이용할 수 있다. 상기에 예시한 리간드는 그 전체를 이용할 수도 있지만, 리콤비넌트, 효소 처리 등에 의해 얻어지는 그의 프래그먼트를 이용할 수도 있다. 또한, 인공적으로 합성된 펩티드나 펩티드 유도체일 수도 있다.
면역 글로불린의 분리 또는 정제에 바람직한 리간드로서는, 예를 들면 단백질 A 및 단백질 G이고, 더욱 바람직하게는 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인이고, 가장 바람직하게는 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인의 말단에 4개 이상의 연속된 히스티딘 단위를 포함하는 펩티드를 부가한 단백질이며, 이러한 단백질로서는 예를 들면 후술하는 화학식 (1) 또는 화학식 (2)로 표시되는 면역 글로불린 결합 단백질을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 「단백질」이란 펩티드 구조 단위를 갖는 모든 분자를 말하며, 예를 들면 천연형 단백질의 부분적 단편이나 천연형 단백질의 아미노산 서열을 인위적으로 개변한 변이체를 포함하는 개념이다. 또한,「면역 글로불린 결합 도메인」이란 단독으로 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능 단위를 나타내고, 「면역 글로불린 결합 단백질」이란 면역 글로불린에 특이적인 친화성을 가지며, 「면역 글로불린 결합 도메인」을 포함하는 단백질을 나타낸다. 「면역 글로불린 결합」이란 면역 글로불린 분자의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역, 특히 Fc 프래그먼트에 결합하는 것을 나타낸다. 본 발명에 있어서, 친화성 크로마토그래피에 관련하여 사용되는 용어 「리간드」란, 친화성 크로마토그래피의 표적 물질과 결합하는 부분을 나타낸다.
1.2.2. 면역 글로불린 결합 도메인
단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인은 천연형의 면역 글로불린 결합 도메인일 수도 있고, 또는 재조합형의 면역 글로불린 결합 도메인일 수도 있다. 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인은 A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인, E 도메인 및 Z 도메인으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다. A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인 및 E 도메인의 아미노산 서열은, 예를 들면 문헌 [Moks T, Abrahms L, et al., Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643의 도 1]에 기재되어 있다. 상기 문헌은 이 참조에 의해 개시에 포함된다. 또한, 상기 문헌에 기재된 각 도메인의 아미노산 서열과 70％ 이상(바람직하게는 90％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질도, 본 발명에서의 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인으로서 사용할 수 있다.
재조합형의 면역 글로불린 결합 도메인은 면역 글로불린 결합 활성에 있어서 개변 전의 면역 글로불린 결합 도메인과 동등한 것으로서 취급할 수 있으며, 예를 들면 천연형의 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열과 70％ 이상(바람직하게는 90％ 이상)의 상동성을 유지하는 것이 바람직하다. 구체예로서는 문헌 [닐슨 비(Nilsson B.) 외, 단백질 엔지니어링(Protein engineering), 1987년, 제1권, 2호, 107-113쪽]에 기재되어 있는 Z 도메인(서열번호 1), 호버(Hober S) 등에 의한 미국 특허 출원 2006/0194955A1에 기재되어 있는 알칼리 내성을 갖는 Z 도메인의 변이체(mutant)를 들 수 있다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제에 이용되는 리간드는, 복수의 동일하거나 또는 상이한 종류의 면역 글로불린 결합 도메인을 가질 수도 있다.
예를 들면, 상기 리간드는 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인으로서 (D 도메인-A 도메인)n(여기서, n은 1 이상의 정수(바람직하게는 1 내지 6)를 나타내고, D 도메인과 A 도메인의 사이에는 임의의 아미노산 서열이 존재할 수도 있음), 즉 A 도메인 및 D 도메인을 포함하는 반복 단위를 포함하는 것일 수도 있다. 또한, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제는 사용시에 알칼리 수용액에 접촉할 기회를 갖기 때문에, 상기 리간드는 단백질 A의 Z 도메인을 포함하는 반복 단위를 포함하는 것일 수도 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 리간드는 상기 각 도메인, 또는 그의 프래그먼트 또는 변이체를 단독으로 또는 조합하여 2개 이상 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 면역 글로불린 결합 도메인의 프래그먼트란, 해당 도메인의 아미노산 서열의 일부를 갖는 것이며, 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 것을 말한다. 바람직하게는 면역 글로불린 결합 도메인의 프래그먼트란, 해당 도메인의 아미노산 서열과 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상의 서열 동일성을 가지며, 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 것을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서, 면역 글로불린 결합 도메인의 변이체란, 바람직하게는 해당 도메인의 아미노산 서열과 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상의 서열 동일성을 가지며, 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 것을 말한다.
면역 글로불린 결합 도메인은, 예를 들면 Z 도메인, 또는 그의 프래그먼트 또는 변이체로부터 선택되는 적어도 1개를 포함할 수 있다. Z 도메인에 대해서는 문헌 [닐슨 비(Nilsson B.) 외, 단백질 엔지니어링(Protein engineering), 1987년, 제1권, 2호, 107-113쪽]에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 리간드는 Z 도메인, 또는 그의 프래그먼트 또는 변이체를 단독으로 또는 조합하여 2개 이상(바람직하게는 4 내지 10개) 포함할 수 있다.
Z 도메인의 변이체로서는, 예를 들면 일본 특허 제4391830호에 기재된 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 예를 들면, 일본 특허 제4391830호의 청구항 1에는 서열번호 1로 규정되는 2 이상의 반복 단위(Z 도메인)를 포함하고, 23위치의 아미노산 잔기가 트레오닌인 단백질이 기재되어 있다.
또한, Z 도메인의 프래그먼트(Z 프래그먼트)란 Z 도메인의 아미노산 서열의 일부를 갖는 것이며, 예를 들면 Z 도메인의 아미노산 서열의 90％ 이상을 갖는 것임이 바람직하고, 95％ 이상을 갖는 것임이 보다 바람직하며, 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 것을 말한다. 또한, Z 도메인의 변이체란, 예를 들면 Z 도메인의 아미노산 서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 것이고, 95％ 이상의 상동성을 갖는 것임이 바람직하며, 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 것을 말한다. Z 도메인의 변이체는 Z 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 개량된 것임이 바람직하다. 이 경우, Z 도메인의 변이체가 Z 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 개량되어 있는지의 여부는, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 확인할 수 있다.
1.2.3. 면역 글로불린 결합 단백질 1
바람직한 리간드의 일례인 면역 글로불린 결합 단백질(이하, 「단백질 1」이라고도 함)은 하기 화학식 (1)로 표시된다.
Figure pct00001
[식 중, R은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 300개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, R2는 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인을 적어도 1개 포함하는 50 내지 500개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 나타냄(여기서, R2가 R에 결합하는 말단은 면역 글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단임)]
상기 화학식 (1)에 있어서, R로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 8 내지 100개인 것이 바람직하고, R에 포함되는 히스티딘이 연속된 부위의 히스티딘의 수는 4 내지 8개인 것이 바람직하다. 또한, 상기 화학식 (1)에 있어서, R2로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 120 내지 480개인 것이 바람직하다.
상기 화학식 (1)에 있어서, R로 표시되는 아미노산 서열 및 R2로 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 한쪽이 리신, 아르기닌 및 시스테인으로부터 선택되는 1종의 아미노산을 포함하는 1 내지 50개의 아미노산을 포함하는 도메인 t를 포함하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 아미노산 서열 중에 동일 또는 상이한 도메인 t가 복수 포함되어 있을 수도 있다.
또한, 상기 화학식 (1)에 있어서, R-는 하기 화학식 (2)로 표시되는 기인 것이 바람직하다.
Figure pct00002
[식 중, R1은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 100개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 나타내고(여기서, R1에서 상기 히스티딘이 연속된 부위의 말단이 r과 결합함), r은 7 내지 200개의 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 나타냄]
상기 화학식 (2)에 있어서, R1로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 4 내지 25개인 것이 바람직하고, R1에 포함되는 히스티딘이 연속된 부위의 히스티딘의 수는 4 내지 8개인 것이 바람직하고, r로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 10 내지 50개인 것이 바람직하다.
또한, 상기 화학식 (2)로 표시되는 r로 표시되는 아미노산 서열 중에는 TEV 도메인이 포함되어 있을 수도 있다. r로 표시되는 아미노산 서열 중에 TEV 도메인이 포함되어 있음으로써, TEV 프로테아제에 의한 절단에 의해 R과 R2의 분리가 가능해지는 데다가, TEV 도메인은 담체에의 고정화량이 많으며, 해당 담체의 면역 글로불린 유지 능력을 높인다고 하는 효과를 실현하기 때문에 바람직한 서열이다. 또한, r로 표시되는 아미노산 서열 중에 TEV 도메인의 변이체(Mutant)(상기 TEV 프로테아제로 절단할 수 있는지의 여부에 상관없이 TEV 도메인의 아미노 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 가짐)가 포함되어 있을 수도 있다.
본 발명에서 이용하는 단백질 1을 구성하는 아미노산의 총 개수는 바람직하게는 54 내지 800이며, 입자에 결합시키는 용도에 사용하는 경우, 80 내지 600인 것이 보다 바람직하다.
1.2.4. 면역 글로불린 결합 단백질 2
리간드는 내알칼리성의 면역 글로불린 결합성 단백질일 수도 있다. 내알칼리성의 면역 글로불린 결합성 단백질로서, 바람직한 리간드의 다른 일례인 면역 글로불린 결합 단백질(이하, 「단백질 2」라고도 함)은 하기 화학식 (3)으로 표시된다.
Figure pct00003
[식 중, R은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 300개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, R2는 Z 도메인, 또는 그의 프래그먼트 또는 변이체를 포함하는 50 내지 500개의 아미노산을 포함하는, 면역 글로불린과 결합 가능한 아미노산 서열을 나타냄(여기서, R2가 R에 결합하는 말단은 면역 글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단임)]
상기 화학식 (3)에 있어서, R로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 8 내지 100개인 것이 바람직하고, R에 포함되는 히스티딘이 연속된 부위의 히스티딘의 수는 4 내지 8개인 것이 바람직하다. 또한, 상기 화학식 (1)에 있어서, R2로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 120 내지 480개인 것이 바람직하다.
또한, 상기 화학식 (3)에 있어서, R-는 하기 화학식 (4)로 표시되는 기인 것이 바람직하다.
Figure pct00004
[식 중, R1은 4 내지 20개의 히스티딘이 연속된 부위를 포함하는 4 내지 100개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 나타내고(여기서, R1에서 상기 히스티딘이 연속된 부위의 말단이 r과 결합함), r은 7 내지 200개의 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 나타냄]
또한, 상기 화학식 (2)와 마찬가지로, 상기 화학식 (4)에서의 r로 표시되는 아미노산 서열 중에는 TEV 도메인이 포함되어 있을 수도 있다. r로 표시되는 아미노산 서열 중에 TEV 도메인이 포함되어 있음으로써, TEV 프로테아제에 의한 절단에 의해 R과 R2의 분리가 가능해지는 데다가, TEV 도메인은 본 발명의 효과(담체에의 고정화량이 많으며, 해당 담체의 면역 글로불린 유지 능력을 높이는 것)를 실현하기 때문에 바람직한 서열이다. 또한, r로 표시되는 아미노산 서열 중에 TEV 도메인의 변이체(Mutant)(상기 TEV 프로테아제로 절단할 수 있는지의 여부에 상관없이 TEV 도메인의 아미노 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 가짐)가 포함되어 있을 수도 있다.
상기 화학식 (4)에 있어서, R1로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 4 내지 25개인 것이 바람직하고, R1에 포함되는 히스티딘이 연속된 부위의 히스티딘의 수는 4 내지 8개인 것이 바람직하고, r로 표시되는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산의 수는 10 내지 50개인 것이 바람직하다.
상기 화학식 (3)에 있어서, R로 표시되는 아미노산 서열 및 R2로 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 한쪽이 리신, 아르기닌 및 시스테인으로부터 선택되는 1종의 아미노산을 포함하는 1 내지 50개의 아미노산을 포함하는 도메인 t를 포함하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 아미노산 서열 중에 동일 또는 상이한 도메인 t가 복수 포함되어 있을 수도 있다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제에 있어서, 리간드로서 단백질 2를 이용한 경우, 알칼리성 조건 하에서의 세정(예를 들면 수산화나트륨 등의 알칼리성액을 이용한 세정)에 대하여 높은 내성을 갖는다. 그 이유로서는 히스티딘이 연속된 부위를 Z 도메인에 부가한 것에 의해, 다공질 입자와 Z 도메인의 결합 위치가 히스티딘 연속 부위가 없는 경우와는 상이한 것, 및 고정화 후의 Z 도메인에 어떠한 구조 변화가 발생하여 알칼리 내성이 높아진 것 등을 생각할 수 있다. 실제의 이유를 실험에 의해 확인하는 것은 되어 있지 않지만, 내알칼리성의 실험 결과는 히스티딘 연속 부위를 부가하는 것에 의한 작용 효과가 있는 것을 나타내고 있다.
또한, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 이용하여 면역 글로불린을 단리하는 경우, 예를 들면 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 이용하여 상기 충전제에 면역 글로불린을 흡착시키는 공정(제1 공정), 및 상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정(제2 공정)에 의해 면역 글로불린을 단리할 수 있고, 또한 상기 충전제를 알칼리성액으로 CIP 세정하는 공정(제3 공정)을 거치는 것이 바람직하다.
제1 공정에서는 상기 친화성 크로마토그래피용 충전제를 충전한 칼럼 등에 면역 글로불린을 함유하는 용액을, 상기 충전제의 리간드에 면역 글로불린이 흡착하는 조건에서 흘린다. 여기서, 상기 면역 글로불린을 함유하는 용액이란, 면역 글로불린을 함유하는 임의의 용액이면 되며, 예를 들면 혈청 등의 생체 유래의 검체, 하이브리도마 배지의 상청 등을 들 수 있다. 상기 면역 글로불린이 흡착하는 조건으로서는, 예를 들면 면역 글로불린 농도 0.1 내지 10g/L, 용액의 pH 5 내지 9, 칼럼 중의 체류 시간 0.5 내지 50분, 온도 0 내지 40℃를 들 수 있다.
이 제1 공정에서는 용액 중의 면역 글로불린 이외의 물질의 대부분은 흡착되지 않고 칼럼을 통과한다. 통상, 일부의 약하게 유지된 물질을 제거하기 위하여 충전제를 NaCl 등의 염을 포함하는 중성의 완충액, 예를 들면 인산이수소나트륨/인산수소이나트륨 용액, 시트르산/인산수소이나트륨 용액, 염산/트리스(히드록시메틸)아미노메탄 용액, HEPES/수산화나트륨 용액 등으로 세정한다. 제2 공정에서는 pH 2 내지 5의 적절한 완충액, 예를 들면 시트르산/시트르산나트륨 용액, 아세트산/아세트산나트륨 용액, 염산/글리신 용액 등을 흘려 면역 글로불린을 용출시킨다. 제3 공정에서는 알칼리성액으로 충전제를 세정(CIP 세정)한다.
여기서 사용되는 알칼리성액으로서는, 예를 들면 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 트리에틸아민, 수산화테트라부틸암모늄 등을 들 수 있다.
1.2.5. 단백질 1 및 2의 제조
본 발명에서 이용하는 단백질 1 및 2를 제조하기 위한 표준 기술로서는, 예를 들면 문헌 [Frederick M. Ausbel 등에 의한 Current Protocols In Molecular Biology]이나 문헌 [Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 공지된 유전자 재조합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 이용하는 단백질 1 또는 2는 미국 특허 제5,151,350호 명세서에 기재되어 있는 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 즉, 목적하는 개변 단백질(단백질 1 또는 2)을 코드하는 핵산 서열을 함유시킨 발현 벡터를 대장균 등의 숙주에 형질 전환시키고, 해당 세포를 적절한 액체 배지에서 배양함으로써 배양 후의 세포로부터 본 발명에서 이용하는 단백질 1 또는 2를 대량으로 경제적으로 취득할 수 있다. 바람직한 발현 벡터로서는 세균 내에서 복제 가능한 기지의 벡터 중 어느 것도 이용할 수 있으며, 예를 들면 미국 특허 제5,151,350호 명세서에 기재되어 있는 플라스미드나 문헌 [Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 숙주 중에 핵산을 도입함으로써 숙주를 형질 전환시키기 위해서는, 해당 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법을 이용하여도 되며, 예를 들면 문헌 [Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 형질 전환한 세균을 배양하여 발현된 단백질을 회수하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
구체적으로는, 원하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 수십 염기를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드로 분할하여 합성하고, 그것들을 DNA 리가아제에 의한 라이게이션 반응에 의해 연결하여 플라스미드에 삽입함으로써 목적하는 발현 벡터를 취득할 수 있다. 그 때, 해당 단백질을 대장균으로 효율적으로 발현시킬 목적에서, 대장균의 최적 코돈을 이용한 핵산 서열을 채용하는 것은 당업자에 의해 일반적으로 행해지는 방법이다. 또한, 후술하는 본 발명의 실시예에 나타내어진 바와 같이 황색 포도상구균(Straphylococcus aureus)의 게놈 DNA로부터 PCR(Polymerase Chain Reaction) 기술을 이용하여 원하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 구축하는 것이 가능하다.
예를 들면, 상기 제조 방법에서 이용하는 핵산은 면역 글로불린 결합 단백질(단백질 1 또는 2) 또는 그의 등기능 변이체를 코드할 수 있다. 본 발명에 있어서, 면역 글로불린 결합 단백질의 「등기능 변이체(functional variant)」란, 부분적인 아미노산의 부가, 삭제, 치환, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등에 의해 개변된 면역 글로불린 결합 단백질로서, 개변 전의 면역 글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 유지하며, 면역 글로불린 결합 활성에 있어서 개변 전의 면역 글로불린 결합 단백질과 동등한 것으로서 취급할 수 있는 것을 의미한다. 즉, 상기 핵산으로서는 본 명세서에서의 단백질 1 또는 2를 코드하는 핵산이 포함된다.
또한, 상술한 바와 같이, 본 발명에서 이용하는 단백질 1 및 2는 면역 글로불린 결합 도메인을 1개 이상(바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 4 내지 10개) 포함하는 단백질일 수도 있다. 이와 같은 단백질을 코드하는 cDNA는 1개의 면역 글로불린 결합 도메인을 코드하는 cDNA(상보적 DNA)를 소정의 개수 직렬로 연결함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 이렇게 하여 제조한 cDNA를 적절한 발현 플라스미드에 삽입하여 이용함으로써, 면역 글로불린 결합 도메인을 1개 이상 포함하는 단백질을 용이하게 제조할 수 있다.
예를 들면, 후술하는 실시예에 있어서 나타내어지는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질(SPATK)이나 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질(SP4Z), 서열번호 2 또는 서열번호 4에 있어서 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 단백질은, 본 발명에서 이용하는 면역 글로불린 결합 단백질로서 바람직하다.
1.2.6. 리간드의 결합
상기 담체와 상기 리간드의 결합 방법으로서는, 다공질 입자에 포함되는 에폭시기를 그대로 리간드와의 결합 부위로서 이용하는 것이 공정으로서 간편하여 바람직하다. 그 밖에 다공질 입자에 포함되는 에폭시기를 개환하여 생성하는 알코올성 수산기를 토실기 등으로 활성화하고 나서 리간드를 결합하는 방법이나, 다공질 입자에 포함되는 에폭시기 또는 해당 에폭시기의 개환에 의해 생성되는 기로부터 링커를 더 늘리고 나서, 해당 링커를 통하여 다공질 입자에 리간드를 결합할 수도 있다.
리간드의 결합 조건은 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량, 리간드의 종류에 따라 상이하지만, 당업자에게 있어서의 공지된 방법을 채용할 수 있다. 리간드가 단백질인 경우에는 단백질의 N 말단의 아미노기, 단백질에 포함되는 리신, 시스테인이 에폭시와의 반응점이 될 수 있다. 단백질을 결합하는 경우, 예를 들면 단백질의 등전점에 가까운 버퍼류의 수용액을 이용하고, 필요에 따라 염화나트륨이나 황산나트륨 등의 염을 첨가하고, 단백질과 다공질 입자를 혼합하면서 0 내지 40℃에서 1 내지 24시간 반응시켜 리간드인 단백질을 결합할 수 있다.
리간드의 결합량은 리간드의 종류, 표적 분자의 종류 등에 의해 적절하게 조절되는데, 단백질 A와 같은 항체 결합성 단백질을 리간드로서 결합하는 경우, 다공질 입자 1g당 바람직하게는 10 내지 200mg, 보다 바람직하게는 25 내지 100mg이다. 단백질 A와 같은 항체 결합성 단백질을 리간드로서 결합하는 경우, 다공질 입자 1g 당의 리간드의 결합량이 10mg 이상이면 동적 결합 용량이 우수하고, 200mg 이하이면 결합한 항체의 용출을 위한 용출액의 양이 적량이 된다.
1.2.7. 개환 에폭시기
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 리간드 결합 다공질 입자는 개환 에폭시기를 갖는다. 이 개환 에폭시기는 상기 특정한 중합체를 포함하는 다공질 입자에 리간드를 결합한 후, 상기 중합체에 포함되는 에폭시기, 즉 리간드와 결합한 에폭시기 이외의 잔여의 에폭시기를 개환시켜 얻어진다. 이것은 다공질 입자를 친화성 크로마토그래피용 충전제로서 사용하기 전에, 다공질 입자의 표면의 에폭시기가 실질적으로 전부 개환되어 있는 것을 의미한다.
또한, 다공질 입자의 표면의 에폭시기가 실질적으로 전부 개환되어 있다고 하는 것은, 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자에 잔류하는 에폭시기가 구체적으로는 바람직하게는 0.04mmol/g 미만, 더욱 바람직하게는 0.02mmol/g 미만인 것을 의미하며, 에폭시기가 잔류하지 않는 것이 가장 바람직하다. 개환 에폭시기의 잔류량이 0.04mmol/g 미만이면 보존 안정성이 우수하다.
에폭시기가 개환하여 생성되는 개환 에폭시기인 알코올성 수산기는, 입자 표면을 친수화하여 단백질 등의 비특이 흡착을 방지함과 함께, 수중에서 입자의 인성을 향상시켜 고유속 하의 입자의 파괴를 방지하는 역할을 하다. 다공질 입자 중의 에폭시기의 개환 방법으로서는, 예를 들면 수용매 중에서 산 또는 알칼리에 의해 가열 또는 실온에서 교반하는 방법을 들 수 있다. 또한, 머캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 머캅토기를 갖는 블록킹제나 모노에탄올아민 등의 아미노기를 갖는 블록킹제로 에폭시기를 개환시킬 수도 있다. 가장 바람직한 개환 에폭시기는 다공질 입자에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻어지는 개환 에폭시기이다. 티오글리세롤은 원료로서 머캅토에탄올 등보다도 독성이 낮으며, 티오글리세롤이 부가된 에폭시 개환기는 아미노기를 갖는 블록킹제에 의한 개환기보다도 비특이 흡착이 낮은 데다가 동적 결합량이 높아지는 등의 이점을 갖는다.
1.2.8. 입경, 세공 용적
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자의 입경은 35 내지 100㎛인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 38 내지 75㎛이다. 입경이 35㎛ 이상이면 압력 특성이 우수하다. 100㎛ 이하이면 동적 결합 용량이 높은 충전제가 얻어진다. 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자의 입경은, 상술한 바와 같이 다공질 입자를 중합할 때의 조건에서 조정할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 「입경」이란, 레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치에 의해 얻어지는 부피 평균 입경이다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자는, 수은 세공 측정기로 공경 10 내지 5000nm의 범위에 상당하는 세공을 측정하였을 때, 바람직하게는 1.00 내지 1.90ml/g, 보다 바람직하게는 1.05 내지 1.85ml/g의 세공 용적을 갖는다. 세공 용적이 상기 범위 내이면 단백질의 동적 결합 용량이 높은 충전제가 얻어진다. 또한, 세공 용적이 1.90ml/g 이하이면 압력 특성이 우수하다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자는 바람직하게는 80 내지 150m2/g, 보다 바람직하게는 100 내지 140m2/g의 비표면적을 갖는다. 여기서, 비표면적이 80m2/g 이상이면 동적 결합 용량이 높은 충전제가 얻어진다. 한편, 150m2/g 이하이면 충전제의 강도가 우수하고, 고유속 하에서의 충전제의 파괴가 억제되어 칼럼 압력의 상승이 억제된다. 본 발명에서의 「비표면적」이란, 수은 세공 측정기에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공이 갖는 표면적을 입자의 건조 질량으로 나눈 값이다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자는 바람직하게는 75 내지 300nm, 보다 바람직하게는 80 내지 250nm의 부피 평균 세공 직경을 갖는다. 여기서, 부피 평균 세공 직경이 75nm 이상이면 고유속 하의 동적 결합 용량 저하가 억제된다. 한편, 300nm 이하이면 유속에 상관없이 동적 결합 용량이 우수한 충전제가 얻어진다. 본 발명에서의 「부피 평균 세공 직경」이란, 수은 세공 측정기에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공의 부피 평균 세공 직경이다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자의 습윤 상태의 1개의 입자를 미소 경도계로 측정하였을 때의 탄성률은 바람직하게는 3.0 내지 10.0MPa, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 8.0MPa이다. 3.0MPa 이상이면 압력 특성이 우수하다. 10.0MPa 이하이면 단백질의 동적 결합 용량이 우수한 충전제가 얻어진다. 본 발명에서의 탄성률은 물 슬러리 상태의 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자의 한방울을 미소 경도계의 스테이지에 태워, 습윤 상태의 1개의 입자에 대하여 미소 경도계의 프로브를 입자의 바로 위에서 대어 입자를 직경의 5％ 변형시켰을 때 측정되는 응력(단위 N)을 입경과 동일한 직경의 원의 면적(단위 m2)으로 나눈 값이다.
<실시예>
2. 실시예
이하, 본 실시 형태에 관한 친화성 크로마토그래피용 충전제를 실시예를 들어 더 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 기재는 본 발명의 양태를 개괄적으로 나타내는 것이며, 특별히 이유없이 이러한 기재에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
2.1. 평가 방법
2.1.1. 에폭시기 함유량
리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량은, 중합에서 사용한 에폭시기 함유 단량체량으로부터 계산되는 에폭시기 몰수가 2.00mmol이 되도록, 질량 농도 약 10％로 정확한 질량 농도를 알고 있는 다공질 입자 수분산체를 폴리에틸렌 병에 질량으로 측정하여 취하고, 이것에 농도 38％의 염화칼슘 수용액 25mL 및 2규정의 염산 2.00mL를 첨가하여 75℃에서 2시간 30분간 교반함으로써 에폭시기를 개환하여 냉각한 후, 2규정의 수산화나트륨 수용액 2.50mL로 중화하고, 또한 pH 미터로 pH를 모니터하면서 0.1규정의 염산으로 역적정함으로써 정량하였다.
2.1.2. 입경
레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치(베크만 쿨터사 제조 LS13320)에 의해 입자의 부피 평균 입경을 측정하였다.
2.1.3. 세공 용적, 비표면적, 부피 평균 세공 직경
40℃에서 24시간 진공 건조시켜 건조 입자를 얻고, 수은 세공 측정기(시마즈 세이사꾸쇼사 제조 오토포아 IV9520)로 건조 입자의 세공 용적, 비표면적 및 부피 평균 세공 직경(세공 직경)을 구하였다. 측정 범위는 세공 직경 범위에서 10 내지 5000nm로 하였다.
2.1.4. 탄성률
물 슬러리 상태의 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자의 한방울을 미소 경도계(피셔 인스트루먼츠사 제조 HM2000)의 스테이지에 태워, 습윤 상태의 1개의 입자에 대하여 미소 경도계의 프로브를 입자의 바로 위에서 대어 입자를 직경의 5％ 변형시켰을 때 측정되는 응력(단위 N)을 기록하였다. 또한, 프로브의 위치와 응력의 그래프로부터 응력=0이 되는 프로브의 위치를 최소 제곱법으로 산출하고, 이것을 대상 입자의 직경으로 하였다. 기록한 응력을 대상 입자의 직경의 원의 면적(단위 m2)으로 나눈 값을 측정한 1입자의 탄성률로 하였다. 측정은 임의로 선택한 5개의 입자에 대하여 실시하고, 개개의 탄성률의 평균치를 구하여 친화성 크로마토그래피용 충전제를 구성하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자의 탄성률로 하였다.
2.1.5. 단백질의 동적 결합 용량
GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 AKTA prime plus를 이용하여 선유속 300cm/hr에서의 단백질(인간 IgG 항체)의 동적 결합 용량을 측정하였다. 칼럼 용량은 4mL(5mmΦ×200mm 길이), 인간 IgG 항체(이퀴테크 바이오(Equitech Bio)사 제조 HGG-1000)는 20mM 인산 버퍼(pH 7.5)로 5mg/mL로 희석한 것을 사용하고, 용출 선단 10％ 브레이크 스루일 때의 인간 IgG 항체 흡착량과 칼럼 충전 부피로부터 동적 결합 용량을 구하였다. 이하, 동적 결합 용량은 DBC로 기재하는 경우가 있다.
2.1.6. 압력 특성
측정하는 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 충전제를 내경 16mm, 충전 높이 100mm가 되도록 칼럼에 충전하고, 이 칼럼을 GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 AKTApilot에 접속하고, 순수를 선유속으로 50cm/hr씩 단계적으로 높이면서 흘렸을 때, 일정 선유속으로 흘리고 있는 1분간에 0.05MPa을 초과하는 경시적인 압력 증가가 보였을 때의 선유속을 압밀 유속으로서 기록하였다. 3000cm/hr에서도 이러한 압력 증가가 보이지 않는 경우, 측정을 중지하고 >3000cm/hr로 기록하였다. 또한, 칼럼의 절대 압력이 1.9MPa에 도달한 경우, 이러한 압력 증가가 보이지 않는 경우라도 측정을 중지하고, 1.9MPa에 도달하였을 때의 선유속을 기록하였다. 압밀 유속은 900cm/hr 이상이 바람직하고, 1200cm/hr 이상이 보다 바람직하고, 1800cm/hr 이상이 더욱 바람직하고, 2700cm/hr 이상이 가장 바람직하다.
2.1.7. 단백질 A 결합량
다공질 입자에 결합한 리간드인 단백질 A(SPA)의 결합량은 비신코닌산(BCA) 시약을 이용한 시약 세트로 정량하였다. 구체적으로는 고형분 환산으로 1mg의 충전제를 테스트 튜브에 채취하고, 이것을 서모 피셔 사이언틱픽(Thermo Fisher Scientific)사(구 PIERCE사)의 BCA Protein Assay Kit로 정량하였다. 반응은 37℃에서 30분간 전도 혼화함으로써 행하였다. 검량선은 다공질 입자에 결합시킨 단백질 A와 동일한 로트의 것을 이용하여 제조하였다.
2.2. 실험예
2.2.1. 실시예 1
(i) 다공질 입자의 현탁 중합
4091g의 순수에 폴리비닐알코올(구라레사 제조 PVA-217) 8.52g, 도데실황산나트륨(카오사 제조 에말 10G) 2.13g 및 탄산나트륨 4.26g을 첨가하여 밤새 교반하여 수용액 (S-1-1)을 제조하였다. 또한, 중합 당일 (S-1-1)의 30g을 별도로 추출하여 나머지 (S-1-1)에 아질산나트륨 2.13g을 용해하여 수용액 (S-2-1)을 제조하였다.
다음에, 글리세린디메타크릴레이트(신나까무라 가가꾸 고교사 제조) 125g, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사 제조) 17.9g, 글리세롤모노메타크릴레이트(닛본 유시사 제조) 35.9g을 2-옥타논(도요 고세이사 제조) 86.4g 및 아세토페논(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 253g에 용해시켜 단량체 용액을 제조하였다. 또한, 단량체의 전체 질량을 100질량부로 하였을 때, 각 단량체의 부수는 글리세린디메타크릴레이트 70질량부, 글리시딜메타크릴레이트 10질량부, 글리세롤모노메타크릴레이트 20질량부이다.
(S-1-1) 30g에 2,2'-아조이소부티로니트릴(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 2.2g을 첨가하여 분산시켜 개시제 분산액으로 하였다.
이어서, 준비한 수용액 (S-2-1) 및 단량체 용액을 배플을 가진 7L 세퍼러블 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여 온수 배스에 세트하고, 질소 분위기 하에 220rpm에서 교반을 개시하였다. 계속해서, 세퍼러블 플라스크를 온수 배스에 의해 가온하고, 내온이 85℃에 도달한 시점에서 개시제 분산액을 첨가하여 85℃로 온도를 유지하면서 5시간 교반을 행하였다.
이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 누체로 여과하고, 순수와 이소프로필알코올로 세정하였다. 세정한 입자를 폴리병에 옮겨 물에 분산시켜 기울여 따르기를 3회 행하여 소 입자를 제거하였다. 이상의 조작에 의해 물에 분산된 12.5질량％의 다공질 입자 1(입자 건조 질량 123g)을 얻었다. 다공질 입자 1의 에폭시기 함유량은 0.47mmol/g이었다.
(ii) 리간드의 제작
2.2.1.1. SP4Z 발현 벡터의 구축
면역 글로불린 결합 단백질(SP4Z) 발현 벡터를 하기의 스텝으로 구축하였다. 도 2는 SP4Z 벡터의 구축 방법을 설명하는 도면이다.
(1) 스텝 1
단량체 Z 도메인을 코드하는 DNA를 출발 물질로 하여 NcoI 절단 부위 및 EcoRI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인 벡터(A-pETM11)(SP1Z)를 구축하였다.
(2) 스텝 2
다음에, A-pETM11 벡터에 또 1개의 Z 도메인을 부가하여 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위를 갖는 2량체 Z 도메인 벡터(AB-pETM11)(SP2Z)를 구축하였다.
(3) 스텝 3
이어서, AB-pETM11 벡터에 또 다른 1개의 Z 도메인을 부가하여 SacI 절단 부위 및 HindIII 절단 부위를 갖는 3량체 Z 도메인 벡터(ABC-pETM11)(SP3Z)를 구축하였다.
(4) 스텝 4
마지막으로 ABC-pETM11 벡터에 4개째의 Z 도메인을 부가하여 HindIII 절단 부위 및 XhoI 절단 부위를 갖는 pETM11-SP4Z의 벡터를 구축하였다.
2.2.1.2. SP1Z-pETM11 벡터(종지 코돈 있는 단량체 Z 도메인 벡터)의 구축
SPZK DNA(서열번호 3)를 템플릿으로 하고, 정방향 프라이머로서 프라이머 153(서열번호 5) 및 역방향 프라이머로서 프라이머 156(서열번호 8)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 프라이머 153 및 프라이머 156에는 각각 NcoI 절단 부위 및 SacI의 제한 효소 절단 부위가 포함된다. PCR의 조건은 이하와 같다.
단계 1: 94℃ 1분간 1사이클, 단계 2: 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 2.5분간(25사이클), 단계 3: 72℃ 10분간 1사이클, 그 후 4℃에서 유지하였다.
PCR 생성물은 GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 생성 키트로 PCR 정제하였다. 다음에, NcoI 제한 효소 및 SacI 제한 효소를 이용하여 절단된 pETM11 벡터와 PCR 생성물의 라이게이션을 행하였다. 제한 효소에 의한 소화 반응은 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 제조의 NcoI 제한 효소 및 SacI 제한 효소를 이용하여 37℃에서 1시간 행하고, GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 생성 키트로 PCR 정제하였다.
라이게이션 반응은 T4 DNA 리가아제(인비트로젠(Invitrogen)사 제조)로 실온에서 밤새 행하였다. 라이게이션으로 얻어진 벡터를 DH5a 활성화 세포(바이오메달 라이프 사이언스(Biomedal Life Science)사 제조)에 형질 전환시키고, 얻어진 형질 전환체를 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 37℃로 밤새 배양하여 양성 콜로니로부터 플라스미드를 추출하고, 삽입된 DNA 프래그먼트의 서열이 올바른 것을 3730 DNA 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사 제조)로 확인하였다.
2.2.1.3. A-pETM11 벡터(종지 코돈 없는 단량체 Z 도메인 벡터)의 구축
프라이머 153, 156 대신에 정방향 프라이머로서 프라이머 153 및 역방향 프라이머로서 프라이머 154(서열번호 6)를 이용하여 실험 2.2.1.2.와 마찬가지로 A-pETM11 벡터를 구축하였다. 또한, DNA 프래그먼트의 삽입은 pETM11의 NcoI 절단 부위 및 EcoRI 절단 부위를 이용하고 있다.
2.2.1.4. SP2Z-pETM11 벡터(종지 코돈 있는 2량체 Z 도메인 벡터)의 구축
정방향 프라이머로서 프라이머 155(서열번호 7) 및 역방향 프라이머로서 프라이머 156을 이용하여 PCR로 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, A-pETM11의 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위에 삽입하여 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 마찬가지의 조건에서 행하였다.
2.2.1.5. AB-pETM11 벡터(종지 코돈 없는 2량체 Z 도메인 벡터)의 구축
정방향 프라이머로서 프라이머 155 및 역방향 프라이머로서 프라이머 157(서열번호 9)을 이용하여 PCR로 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위를 갖는 종지 코돈 없는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, A-pETM11의 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위에 삽입하여 AB-pETM11 벡터를 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 마찬가지의 조건에서 행하였다.
2.2.1.6. SP3Z-pETM11 벡터(종지 코돈 있는 3량체 Z 도메인 벡터)의 구축
정방향 프라이머로서 프라이머 158(서열번호 10) 및 역방향 프라이머로서 프라이머 161(서열번호 13)을 이용하여 PCR로 SacI 절단 부위 및 XhoI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, AB-pETM11의 EcoRI 절단 부위 및 SacI 절단 부위에 삽입하여 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 마찬가지의 조건에서 행하였다.
2.2.1.7. ABC-pETM11 벡터(종지 코돈 없는 3량체 Z 도메인 벡터)의 구축
정방향 프라이머로서 프라이머 158 및 역방향 프라이머로서 프라이머 159(서열번호 11)를 이용하여 PCR로 SacI 절단 부위 및 HindIII 절단 부위를 갖는 종지 코돈 없는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, AB-pETM11의 SacI 절단 부위 및 HindIII 절단 부위에 삽입하여 ABC-pETM11 벡터를 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 마찬가지의 조건에서 행하였다.
2.2.1.8. SP4Z-pETM11 벡터(종지 코돈 있는 4량체 Z 도메인 벡터)의 구축
프라이머 160(서열번호 12) 및 프라이머 161을 이용하여 PCR로 HindIII 절단 부위 및 XhoI 절단 부위를 갖는 단량체 Z 도메인의 DNA를 제조하고, ABC-pETM11의 HindIII 절단 부위 및 XhoI 절단 부위에 삽입하여 SP4Z-pETM11 벡터를 구축하였다. 실험은 실험 2.2.1.2.와 마찬가지의 조건에서 행하였다.
2.2.1.9. SP4Z의 발현 및 정제
얻어진 SP4Z-pETM11 벡터를 E.coli(BL21주) 세포(스트라타젠(STRATAGENE) 제조)에 도입하고, 18℃에서 1mM의 IPTG(시그마 알드리치(Sigma-Aldrich) 제조)를 첨가하여 15시간 인큐베이트하여 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(SP4Z)을 발현시켰다. 유도에 앞서 흡광도(OD600)가 약 0.6에 도달할 때까지 상기 세포를 37℃에서 인큐베이트하였다. 단백질 발현 후, 세포를 회수하고 pH 8.0의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다.
얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(SP4Z)은 Ni 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA(니트릴로트리아세트산) 입자, 키아젠사 제조)에 의해 정제되었다. 정제된 면역 글로불린 결합 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로오스 FF, GE 바이오 사이언스사 제조)에 의해 더 정제되었다. SDS-PAGE에 의해 확인된 면역 글로불린 결합 단백질의 순도는 96％이었다.
또한, 얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(SP4Z)은 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석에 의해 각각 아미노산 서열이 일치한 것에 의해, 도 1에 나타내는 아미노산 서열(서열번호 2)을 갖는 것이 확인되었다.
또한, 도 1에 있어서, R 및 R2는 상기 화학식 (1) 및 (3)에서의 R 및 R2에 대응하고, R1 및 r은 상기 화학식 (2) 및 (4)에서의 R1 및 r에 대응한다. r 중의 하선부는 TEV 도메인(TEV 프로테아제(펩티드 결합 가수분해 합성 효소) 절단 부위)을 나타낸다.
(iii) 다공질 입자와 리간드의 결합
입자 건조 질량 환산으로 1g의 다공질 입자 1, 0.1g의 SP4Z가 25mL의 0.1M 인산 버퍼(pH 6.8)에 분산된 혼합액을 제조하고, 10℃에서 24시간 전도 혼화하여 SP4Z를 다공질 입자 1에 결합시켰다. 생성된 입자를 여과한 후, 1M 티오글리세롤 25mL와 혼합하여 30℃에서 4시간 반응시키고, 잔여의 에폭시기를 개환하여 PBS/0.5％ Tween20으로 세정한 후, PBS로 세정하고, 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 충전제 1(A-1)을 얻었다. Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay kit로 정량 측정을 행하였더니, 상기 입자에 결합한 SP4Z의 양은 41mg/g 입자이었다. 결과를 표 2에 나타낸다.
(iv) 평가
(A-1)의 입경은 54㎛, 세공 용적은 1.26mL/g, 비표면적은 111m2/g, 부피 평균 세공 직경은 101nm이었다. 탄성률은 5.6MPa이었다. 단백질(인간 IgG 항체)의 동적 결합 용량은 40mg/mL, 압력 유속은 2700cm/hr이었다.
2.2.2. 실시예 2
실시예 1의 현탁 중합에서 교반 회전수를 300rpm으로 한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 다공질 입자 2를 얻어 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 충전제 2(A-2)를 제조, 평가하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 다공질 입자 2의 에폭시기 함유량은 0.45mmol/g이었다. (A-2)의 입경은 31㎛, 세공 용적은 1.438mL/g, 비표면적은 132m2/g, 부피 평균 세공 직경은 110nm이었다. 탄성률은 6.4MPa이었다. 단백질(인간 IgG 항체)의 동적 결합 용량은 40mg/mL, 압력 유속은 1100cm/hr이었다.
2.2.3. 실시예 3
(i) 다공질 입자의 현탁 중합
300g의 순수에 폴리비닐알코올(구라레사 제조 PVA-217) 0.600g, 도데실황산나트륨(카오사 제조 에말 10G) 0.030g 및 황산나트륨 1.50g을 첨가하여 밤새 교반하여 수용액 (S-1-2)를 제조하였다. 또한, 중합 당일 (S-1-2)의 5g을 별도로 추출하여 나머지 (S-1-2)에 아질산나트륨 0.150g을 용해하여 수용액 (S-2-2)를 제조하였다.
다음에, 글리세린디메타크릴레이트(신나까무라 가가꾸 고교사 제조) 8.19g, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사 제조) 3.51g을 2-옥타논(도요 고세이사 제조) 6.25g 및 아세토페논(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 18.3g에 용해시켜 단량체 용액을 제조하였다. 또한, 단량체의 전체 질량을 100질량부로 하였을 때, 각 단량체의 부수는 글리세린디메타크릴레이트 70질량부, 글리시딜메타크릴레이트 30질량부이다.
(S-1-2) 5g에 2,2'-아조이소부티로니트릴(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 0.149g을 첨가하여 분산시켜 개시제 분산액으로 하였다.
이어서, 얻어진 수용액 (S-2-2) 및 단량체 용액을 배플을 갖는 0.5L 세퍼러블 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여 온수 배스에 세트하고, 질소 분위기 하에 680rpm에서 교반을 개시하였다. 계속해서, 세퍼러블 플라스크를 온수 배스에 의해 가온하고, 내온이 85℃에 도달한 시점에서 개시제 분산액을 첨가하여 85℃로 온도를 유지하면서 5시간 교반을 행하였다.
이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 누체로 여과하고, 순수와 이소프로필알코올로 세정하였다. 세정한 입자를 폴리병에 옮겨 물에 분산시켜 기울여 따르기를 3회 행하여 소 입자를 제거하였다. 이상의 조작에 의해 물에 분산된 12.5질량％의 다공질 입자 3(입자 건조 질량 8.7g)을 얻었다. 다공질 입자 3의 에폭시기 함유량은 1.7mmol/g이었다.
(ii) 리간드의 제작
후술하는 제조예 (1) 내지 (5)에 의해, 도 3에 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 면역 글로불린 결합 단백질(SPATK(서열번호 4))을 제조하였다.
(1) 스텝 1
황색 포도상구균의 게놈 DNA를 템플릿으로 하여 제한 효소 NcoI 부위를 갖는 프라이머(프라이머 11), 및 제한 효소 BamH1과 HindIII 부위를 갖는 프라이머(프라이머 12)를 이용하여 PCR로 D-A 도메인을 코드하는 DNA를 얻었다. 이 DNA를 제한 효소 NcoI 및 HindIII으로 절단하고, 동일하게 제한 효소 NcoI 및 HindIII으로 절단된 pETM11에 라이게이션하여 SPAK 플라스미드를 구축하였다.
(2) 스텝 2
다음에, 상기에 얻어진 SPAK 플라스미드를 템플릿으로 하여 제한 효소 BamHI 부위를 갖는 프라이머(프라이머 13)와 제한 효소 HindIII 부위를 갖는 프라이머(프라이머 14)를 이용하여 PCR로 새로운 D-A 도메인을 코드하는 DNA를 얻었다. 이 DNA를 제한 효소 BamHI 및 HindIII으로 절단하고, 동일하게 제한 효소 BamHI 및 HindIII으로 절단된 상기에서 얻어진 SPAK 플라스미드에 라이게이션하여 SPATK 플라스미드를 구축하였다.
(3) SPAK 플라스미드의 구축
황색 포도상구균의 게놈 DNA를 템플릿으로 하여 프라이머 11과 프라이머 12를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR의 조건은 이하와 같다.
단계 1: 94℃ 1분간 1사이클, 단계 2: 94℃ 30초간, 53℃ 30초간, 72℃ 2.5분간(25사이클), 단계 3: 72℃ 10분간 1사이클, 그 후 4℃에서 유지하였다.
PCR 생성물은 GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 정제 키트로 정제하였다. 다음에, NcoI 제한 효소 및 HindIII 제한 효소를 이용하여 절단하였다. pETM11 벡터에 대하여 동일하게 NcoI 제한 효소 및 HindIII 제한 효소로 절단하였다. 제한 효소에 의한 소화 반응은 뉴 잉글랜드 바이오랩스 제조의 NcoI 제한 효소 및 HindIII 제한 효소를 이용하여 행하고, GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 정제 키트로 정제하였다. 라이게이션 반응은 T4 DNA 리가아제(인비트로젠사 제조)로 실온에서 밤새 행하였다. 라이게이션으로 얻어진 벡터를 DH5a 활성화 세포(바이오메달 라이프 사이언스사 제조)에 형질 전환시키고, 양성 콜로니의 플라스미드(SPAK 플라스미드)의 서열이 올바른 것을 3730 DNA 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)로 확인하였다.
(4) SPATK 플라스미드의 구축
SPAK 플라스미드를 템플릿으로 하여 프라이머 13과 프라이머 14를 이용하여 PCR로 새로운 D-A 도메인을 코드하는 DNA를 얻었다. PCR의 조건은 단계 1: 94℃ 1분간 1사이클, 단계 2: 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 2.5분간(25사이클), 단계 3: 72℃ 10분간 1사이클, 그 후 4℃에서 유지하였다. PCR 생성물은 GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 정제 키트로 정제하였다. 다음에, BamHI 제한 효소 및 HindIII 제한 효소를 이용하여 이 DNA를 절단하였다. SPAK 플라스미드에 대해서도 동일하게 BamHI 제한 효소 및 HindIII 제한 효소로 절단하였다. 제한 효소에 의한 소화 반응은 뉴 잉글랜드 바이오랩스 제조의 BamHI 제한 효소 및 HindIII 제한 효소를 이용하고, GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조의 정제 키트로 정제하였다. 라이게이션 반응은 T4 DNA 리가아제(인비트로젠사 제조)로 실온에서 밤새 행하였다. 라이게이션으로 얻어진 벡터를 DH5a 활성화 세포(바이오메달 라이프 사이언스사 제조)에 형질 전환시키고, 양성 콜로니의 플라스미드(SPATK 플라스미드)의 서열이 올바른 것을 3730 DNA 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)로 확인하였다.
(5) SPATK의 발현 및 정제
얻어진 SPATK 플라스미드를 E.coli(BL21주) 세포(스트라타젠 제조)에 형질 전환시켰다. 18℃에서 1mM의 IPTG(시그마 알드리치 제조)를 첨가하고, 15시간 인큐베이트하여 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(SPATK)을 발현시켰다. 유도에 앞서 흡광도(OD600)가 약 0.6에 도달할 때까지 상기 세포를 37℃에서 인큐베이트하였다. 단백질 발현 후, 세포를 회수하고 pH 8.0의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다.
얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(SPATK)은 Ni 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA(니트릴로트리아세트산) 입자, 키아젠사 제조)에 의해 정제되었다. 정제된 면역 글로불린 결합 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로오스 FF, GE 바이오 사이언스사 제조)에 의해 더 정제되었다. SDS-PAGE에 의해 확인된 면역 글로불린 결합 단백질의 순도는 96％이었다.
또한, 얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(SPATK)은 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석에 의해 각각 아미노산 서열이 일치한 것에 의해, 도 3에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것이 확인되었다.
Figure pct00005
(iii) 다공질 입자와 리간드의 결합
입자 건조 질량 환산으로 1g의 다공질 입자 3, 0.1g의 SPATK가 25mL의 0.1M 인산 버퍼(pH 6.8)에 분산된 혼합액을 제조하고, 10℃에서 24시간 전도 혼화하여 SPATK를 다공질 입자 3에 결합시켰다. 생성된 입자를 여과한 후, 1M 티오글리세롤 25mL와 혼합하여 30℃에서 4시간 반응시키고, 잔여의 에폭시기를 개환하여 PBS/0.5％ Tween 20으로 세정한 후, PBS로 세정하고, 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 충전제 3(A-3)을 얻었다. Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay kit로 정량 측정을 행하였더니, 상기 입자에 결합한 SPATK의 양은 44mg/g 입자이었다. 결과를 표 2에 나타낸다.
(iv) 평가
(A-3)의 입경은 50㎛, 세공 용적은 1.07mL/g, 비표면적은 104m2/g, 부피 평균 세공 직경은 68nm이었다. 탄성률은 6.6MPa이었다. 단백질(인간 IgG 항체)의 동적 결합 용량은 39mg/mL, 압력 유속은 >3000이었다.
2.2.4. 실시예 4 내지 6
실시예 3에 있어서, 단량체의 전체 질량을 100질량부로 하였을 때 각 단량체의 부수를 표 2와 같이 한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 충전제 4 내지 6(A-4 내지 6)을 얻어 평가하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
2.2.5. 실시예 7
실시예 3에 있어서, 황산나트륨을 사용하지 않고 아질산나트륨 1.50g으로 하고, 단량체의 전체 질량을 100질량부로 하였을 때 각 단량체의 부수를 표 2와 같이 한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 충전제 7(A-7)을 얻어 평가하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
2.2.6. 비교예 1 내지 2
실시예 3에 있어서, 단량체의 전체 질량을 100질량부로 하였을 때 각 단량체의 부수를 표 3과 같이 한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 비교 친화성 크로마토그래피용 충전제 1 내지 2(B-1 내지 2)를 얻어 평가하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
2.2.7. 실시예 8
(i) 다공질 입자의 현탁 중합
4257g의 순수에 폴리비닐알코올(구라레사 제조 PVA-217) 8.51g, 도데실황산나트륨(카오사 제조 에말 10G) 0.425g 및 황산나트륨 21.3g을 첨가하여 밤새 교반하여 수용액 (S-1-6)을 제조하였다. 또한, 중합 당일 (S-1-6)의 20g을 별도로 추출하여 나머지 (S-1-6)에 요오드화칼륨 2.13g을 용해하여 수용액 (S-2-6)을 제조하였다.
다음에, 펜타에리트리톨트리아크릴레이트 60질량％ 및 펜타에리트리톨테트라아크릴레이트 40질량％를 포함하는 단량체(신나까무라 가가꾸 고교사 제조 상품명 「NK 에스테르 A-TMM-3LM-N」) 104g, 4-히드록시부틸아크릴레이트글리시딜에테르(닛본 가세이사 제조) 20.7g, 히드록시에틸아크릴아미드(고우진사 제조) 82.9g을 2-옥타논(도요 고세이사 제조) 134g 및 아세토페논(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 169g에 용해시켜 단량체 용액을 제조하였다. 또한, 단량체의 전체 질량을 100질량부로 하였을 때, 각 단량체의 부수는 펜타에리트리톨트리아크릴레이트 30부, 펜타에리트리톨테트라아크릴레이트 20부, 4-히드록시부틸아크릴레이트글리시딜에테르 10부, 히드록시에틸아크릴아미드 40부이다.
(S-1-6) 20g에 2,2'-아조이소부티로니트릴(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 1.92g을 첨가하여 분산시켜 개시제 분산액으로 하였다.
이어서, 준비한 수용액 (S-2-6) 및 단량체 용액을 배플을 갖는 7L 세퍼러블 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여 온수 배스에 세트하고, 질소 분위기 하에 300rpm에서 교반을 개시하였다. 계속해서, 세퍼러블 플라스크를 온수 배스에 의해 가온하고, 내온이 80℃에 도달한 시점에서 개시제 분산액을 첨가하여 80℃로 온도를 유지하면서 5시간 교반을 행하였다.
이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 누체로 여과하고, 순수와 이소프로필알코올로 세정하였다. 세정한 입자를 폴리병에 옮겨 물에 분산시켜 기울여 따르기를 3회 행하여 소 입자를 제거하였다. 이상의 조작에 의해 물에 분산된 12.5질량％의 다공질 입자 8(입자 건조 질량 107g)을 얻었다. 다공질 입자 8의 에폭시기 함유량은 0.29mmol/g이었다.
(ii) 리간드의 제작, (iii) 다공질 입자와 리간드의 결합, (iv) 평가
실시예 1과 마찬가지로 하여 제작, 평가하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
2.2.8. 실시예 9
실시예 8에 있어서, 펜타에리트리톨트리아크릴레이트 60질량％ 및 펜타에리트리톨테트라아크릴레이트 40질량％를 포함하는 단량체(신나까무라 가가꾸 고교사 제조 상품명 「NK 에스테르 A-TMM-3LM-N」) 96.7g, 4-히드록시부틸아크릴레이트글리시딜에테르(닛본 가세이사 제조) 19.3g, 히드록시에틸아크릴아미드(고우진사 제조) 77.3g을 2-옥타논(도요 고세이사 제조) 139g 및 아세토페논(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조) 175g에 용해시켜 단량체 용액을 제조하고, 2,2'-아조이소부티로니트릴(와꼬 쥰야꾸 고교사 제조)의 질량을 2.69g으로 한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 충전제 9(A-9)를 얻어 평가하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
2.2.9. 실시예 10
실시예 9에 있어서, 내온이 85℃에 도달한 시점에서 개시제 분산액을 첨가하여 85 내지 90℃로 온도를 유지하면서 5시간 교반을 행한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 개환 에폭시기를 갖는 리간드 결합 다공질 입자를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 충전제 10(A-10)을 얻어 평가하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
표 2 내지 4에 따르면, 실시예 1 내지 10의 충전제를 이용한 경우, 비교예 1 내지 2의 충전제를 이용한 경우와 비교하여 리간드의 유지량이 많고, 압력 특성이 우수한 것을 이해할 수 있다.
2.2.10. 비교예 3
실시예 1의 현탁 중합으로 글리세린디메타크릴레이트(신나까무라 가가꾸 고교사 제조) 125g, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사 제조) 17.9g 대신에 글리시딜메타크릴레이트 142.9g을 사용한 것 이외에는, 마찬가지로 하여 단량체 용액을 제조, 중합을 실시하였다. 또한, 단량체의 전체 질량을 100질량부로 하였을 때, 각 단량체의 부수는 글리시딜메타크릴레이트 80질량부, 글리세롤메타크릴레이트 20질량부이다. 이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 누체로 여과하고, 순수와 이소프로필알코올로 세정하고자 하였지만, 여과 도중에 용제를 포함한 백색 괴상물이 되어 막힘이 생겨 다음 공정으로 진행할 수 없었다.
본 실시 형태에 관한 설명은 이상이다. 본 발명은 상술한 실시 형태에 한정되는 것이 아니며, 한층 더 여러가지의 변형이 가능하다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성과 실질적으로 동일한 구성(예를 들면, 기능, 방법 및 결과가 동일한 구성, 또는 목적 및 결과가 동일한 구성)을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성의 본질적이지 않은 부분을 치환한 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성과 동일한 작용 효과를 발휘하는 구성 또는 동일한 목적을 달성할 수 있는 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성에 공지 기술을 부가한 구성을 포함한다.
<산업상 이용가능성>
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 충전제는 종래의 담체와 비교하여 면역 글로불린 결합 단백질의 유지량이 많으며, 해당 단백질의 유지능이 우수하다. 이에 의해 목적 단백질의 포착량을 높일 수 있기 때문에, 목적 단백질(항체)의 결합 용량을 증대시킬 수 있다. 그 결과, 순도가 높은 목적 단백질을 효율적으로 저비용으로 대량 정제할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> JSR CORPORATION <120> FILLER FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY <130> JSR0027 <150> JP2010-081424 <151> 2010-03-31 <160> 15 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Z domain <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 258 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> SP4Z <400> 2 Met Lys His His His His His His Pro Met Ser Asp Tyr Asp Ile Pro 1 5 10 15 Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Val Val Asp Asn Lys 20 25 30 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 35 40 45 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 50 55 60 Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 65 70 75 80 Asp Ala Gln Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln 85 90 95 Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln 100 105 110 Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala 115 120 125 Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Lys Glu Leu 130 135 140 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 145 150 155 160 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 165 170 175 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 180 185 190 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Lys Lys Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn 195 200 205 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 210 215 220 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 225 230 235 240 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 245 250 255 Gln Lys <210> 3 <211> 213 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> SPZK DNA <400> 3 atgcatcatc atcatcatca cgtgaattcg ctcgaggtgg ataacaaatt caacaaagaa 60 caacaaaatg ctttctatga aatcttacat ttacctaact taaacgaaga acaacgcaat 120 gctttcatcc aaagcctaaa agatgaccca agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct 180 aaaaagctaa atgatgcaca aggatctaaa taa 213 <210> 4 <211> 291 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> SPATK <400> 4 Met Lys His His His His His His Pro Met Ser Asp Tyr Asp Ile Pro 1 5 10 15 Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Ala Lys Ala Asp Ala 20 25 30 Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 35 40 45 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 50 55 60 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala 65 70 75 80 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn 85 90 95 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu 100 105 110 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 115 120 125 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser 130 135 140 Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Ser Ser Gly 145 150 155 160 Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala 165 170 175 Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn 180 185 190 Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val 195 200 205 Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp 210 215 220 Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn 225 230 235 240 Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 245 250 255 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys 260 265 270 Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 275 280 285 Gly Ser Lys 290 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing NcoI cutting site <400> 5 ggaggaccat ggttgtggat aacaaattca acaaagaa 38 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing EcoRI cutting site <400> 6 ggtggtgaat tctttttgtg catcatttag ctttttagc 39 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing EcoRI cutting site <400> 7 ggaggagaat 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<400> 14 catgccatgg cgaaagctga tgcgcaacaa aat 33 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer containing HindIII cutting site <400> 15 cggggatcct caggcaaagc tgatgcgcaa caaaat 36

Claims (9)

  1. 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 및 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체, 또는 수산기와 에폭시기를 함유하는 가교성 비닐 단량체를 포함하는 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자,
    상기 다공질 입자에 결합한 리간드 및
    개환 에폭시기를 갖는 것을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 단백질 A, 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인, 또는 그의 변이체를 적어도 1개 포함하는 단백질인 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비닐 단량체가
    (X-1) 수산기를 함유하고 에폭시기를 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 20 내지 90질량부,
    (X-2) 수산기도 에폭시기도 함유하지 않는 가교성 비닐 단량체 0 내지 40질량부,
    (M-1) 에폭시기 함유 비가교성 비닐 단량체 1 내지 40질량부, 및
    (M-2) 에폭시기를 함유하지 않는 비가교성 비닐 단량체 0 내지 70질량부로 구성되는(단, (X-1), (X-2), (M-1) 및 (M-2)의 합계는 100질량부임) 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개환 에폭시기는 상기 중합체에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻어지는 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공질 입자가
    상기 비닐 단량체 100질량부와,
    (P-1) 탄소수 7 내지 14인 직쇄상, 분지쇄상 및 환상의 알코올, 에테르, 알데히드, 케톤, 에스테르, 탄소수 8 내지 10의 알킬벤젠으로부터 선택되는 적어도 1개의 포로겐(porogen)(단, 포로겐의 합계량은 100 내지 400질량부이고, (P-1)은 포로겐의 합계량 100질량％ 중에 10질량％ 이상임)을 필수 성분으로 하는 수계 혼합물
    을 현탁 중합하여 얻어지는 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수은 세공 측정기로 공경 10 내지 5000nm의 범위에 상당하는 세공을 측정하였을 때 상기 다공질 입자의 세공 용적이 1.00 내지 1.90ml/g인 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공질 입자의 입경이 35 내지 100㎛인 친화성 크로마토그래피용 충전제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 크로마토그래피용 충전제를 이용하여 상기 충전제에 면역 글로불린을 흡착시키는 공정, 및
    상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정
    을 포함하는, 면역 글로불린을 단리하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 크로마토그래피용 충전제가 충전된 친화성 크로마토그래피용 충전 칼럼.
KR1020127025503A 2010-03-31 2011-03-29 친화성 크로마토그래피용 충전제 KR20130055569A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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