KR20120134096A

KR20120134096A - 상처 치료 및/또는 다른 조직의 치유 적용을 위한 스캐폴드 재료

Info

Publication number: KR20120134096A
Application number: KR1020127011682A
Authority: KR
Inventors: 구드문두르 페르트람 시구르존슨; 도라 흘린 기스라도티르; 구드문두르 피에이치디 구드문드슨
Original assignee: 케레시스 이에이치에프
Priority date: 2009-10-07
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2012-12-11
Also published as: PE20121798A1; CA2778090C; IL218945A; CA2778090A1; WO2011042794A3; NZ599399A; EP2485779B1; RU2012118397A; JP2013507164A; HUE038789T2; US8613957B2; CN102781485A; MX2012004037A; NO2485779T3; EP2485779B8; KR101755740B1; AU2010304827A1; CL2012000891A1; JP5893563B2; DK2485779T3

Abstract

본 발명은 상처 치료 및/또는 다른 조직의 치유 적용을 위한 스캐폴드 재료 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 스캐폴드 재료는 어피로부터 탈세포화된 세포외 매트릭스로 이루어진다. 스캐폴드 재료는 또한 어피의 지질 층으로부터의 지질을 포함한다. 본 발명은 또한 스캐폴드 재료의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

상처 치료 및/또는 다른 조직의 치유 적용을 위한 스캐폴드 재료{A SCAFFOLD MATERIAL FOR WOUND CARE AND/OR OTHER TISSUE HEALING APPLICATIONS}

본 발명은 상처 치료 및/또는 다른 조직의 치유 적용을 위한 스캐폴드 재료 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 스캐폴드 재료는 어피로부터 탈세포화된 세포외 매트릭스를 포함한다.

다양한 인간, 동물 및 합성 재료가 현재 조직 결함을 증가, 회복 또는 정정하기 위한 의료 과정에서 기재되고 사용된다.

예를 들어, 미국특허 제2003/0059460호는 살아있는 체조직을 재생하는데 사용될 수 있는 합성 중합체 및 천연 중합체를 포함하는 하이브리드 중합체 재료에 관해 기재하고 있다. 하이브리드는 자연적으로 발생하는 가교 결합된 중합체 및 생물 분해-흡수성 합성 중합체를 포함한다. 그러나, 일련의 복잡한 단계가 하이브리드 재료를 생성하기 위해 수행되어야만 한다. 게다가, 생성된 하이브리드 재료는 합성 재료뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 재료도 포함한다.

미국특허 제6,541,023호는 조직공학 스캐폴드로 사용하기 위해 어피로부터 유도된 다공성 콜라겐 겔의 사용을 기재하고 있다. 콜라겐 겔의 제조는 어피 분쇄를 포함한다. 추가적으로, 중국특허 제1068703호는 화상의 드레싱을 위해 어피를 제조하는 과정을 기재하고 있고, 이는 어류의 몸통으로부터 어피를 분리하고, 요오드팅크, 에탄올, 보르네올, 술파다이아진 아연, 및 2.5 내지 3의 pH 값을 수립하기 위해 충분한 양의 염산의 보존액에 피부를 방치하는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 생성물은, 미국특허 제6,541,023호의 생성물이 젤 형태이고 중국특허 제1068703호의 생성물이 용액에 저장되어 있기 때문에, 취급하기가 어려울 수 있다.

게다가, 의학 용도를 위한 많은 세포외 매트릭스 생성물은 인간 피부(알로뎀(등록상표) 리제너레이티브 티슈 매트릭스(ALLODERM(등록상표) Regenerative Tissue Matrix)(라이프 셀(LifeCell)); 소태아진피(프리매트릭스(상표) 데르말 리페어 스캐폴드(PRIMATRIX(상표) Dermar Repair Scaffold)(티이아이 바이오사이언스(TEI Biosciences)); 돼지의 방광(마트리스템(상표) 엑스트라셀룰라 매트릭스 운드 시트(MATRISTEM(상표) Extracellular Matrix Wound Sheet)(메드라인 인터스트리스 인코포레이티드(Medline Industries, Inc.)); 및 돼지의 소장 점막하 조직(오아시스(등록상표) 운드 매트릭스(OASIS(등록상표) Wound Matrix)(헬스포인트 리미티드(Healthpoint Ltd.))으로부터 파생되었다. 그러나, 상처 치유 및 조직 회복을 강화하기 위해 향상된 생성물과 제조 방법이 필요하다. 본 발명은 상기 필요성을 충족한다.

척추동물의 세포외 매트릭스(ECM)는 세포를 둘러싸고 지지하는 복잡한 구조의 독립체이다. ECM은 콜라겐이 매우 풍부한 구조적인 단백질의 복잡한 혼합물, 및 다른 특정 단백질 및 프로테오클리칸으로 이루어져 있다. 상기의 스캐폴드 재료는 어피로부터의 자연적인 생물학적 ECM 성분의 주로 온전한 무세포 스캐폴드이다. 스캐폴드는 또한 어피로부터의 자연적으로 발생하는 지질을 포함한다. 진피 ECM의 천연의 3차 입체구조, 조성 및 기능은 본질적으로 변하지 않고, 조직의 회복 및/또는 대체를 촉진하는 세포 이주, 부착, 증식 및 분화를 지원하기 위한 스캐폴드를 제공한다. 본 발명은 또한 스캐폴드 재료의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

도 1은 상기 기재된 과정에 따라 어피로부터 제조한 탈세포화된 ECM 생성물(스캐폴드 재료)의 예시적인 견본을 나타낸다.
도 2는 100x(2A) 및 400x(2B) 배율에서 스캐폴드 재료 단면의 광학 이미지를 나타낸다.
도 3은 300x(3A) 및 600x(3B) 배율에서 스캐폴드 재료 단면의 주사 전자 현미경(SEM)을 나타낸다.

본 발명에 따른 스캐폴드 재료는 온전한 어피로부터 수득된다. 스캐폴드 재료의 견본의 외관을 보여주는 예시적인 예가 도 1에 제시된다. 경골어 또는 연골어를 포함하는 임의의 어종이 어피의 원료로 사용될 수 있다. 예를 들어, 원료는 대구, 해덕 및 메기와 같은 원형어(round fish); 넙치, 가자미 및 허가자미와 같은 편평어(flatfish); 연어 및 송어와 같은 연어과어; 참치와 같은 고등어과어; 또는 청어, 멸치류, 고등어 및 정어리와 같은 소어일 수 있다. 특정 실시양태에서, 어피는 냉수성 기름진 어류 및/또는 다량의 오메가-3 오일을 함유하고 있다고 공지된 어류로부터 수득된다. 오메가-3 오일을 다량 함유한 어류의 예는 연어, 정어리, 참치, 청어, 대구, 정어리류, 고등어, 은대구, 화이트피쉬, 호키 피쉬 및 송어의 일부 품종이다.

어피는 가공 전 어류로부터 제거된다. 어피가 비늘을 가진 어종으로부터 유래하는 경우에, 어피는 비늘-제거(descaling)되어 상당 부분의 비늘이 제거되거나, 또는 적어도 비늘의 수산화인회석이 제거되어야만 한다. 어구 "상당 부분의 비늘이 제거된" 또는 "비늘이 실질적으로 존재하지 않는"은 어피의 비늘이 95% 이상, 바람직하게는 99% 이상, 더욱 바람직하게 100% 제거되었음을 의미한다. "비늘이 실질적으로 존재하지 않는" 어피는 또한 비늘이 없는 어종의 어피를 나타낸다. 비늘은 순수한 기계적인 압력(예컨대, 칼, 연마재에 의한 털기, 수압, 또는 세라믹 또는 플라스틱을 사용한 연마와 같은 칼 또는 다른 압력 장치와 동일한 기계적인 힘을 사용하는 특수한 비늘 제거 장치를 통함), 또는 일부 화학적 처리(예를 들어, 탈세포화) 및 이어서 비늘을 세척 제거하기 위한 기계적인 압력을 사용하여 모든 가공 전에 제거된다. 어피를 처음에 화학적 및/또는 효소적으로 처리(예를 들어, 트리톤(TRITON: 등록상표) X-100으로 처리)한 경우, 기계적인 압력은, 피부가 탈세포화된 후에 찢어지기가 더욱 쉽기 때문에, 통상적으로 가볍게 필요하다. 비늘은 하나 초과의 단계, 예를 들어 탈세포화 전의 부분적인 제거, 및 이어서 탈세포화 동안 및/또는 후의 추가적인 제거에 의해 제거될 수 있다. 다르게는, 비늘은 화학적 처리만으로 제거될 수 있다.

비늘이 제거된 후, 어피는 선택적으로 탈세포화 전에 냉동된다. 스캐폴드의 콜라겐 구조를 보존하기 위해, 어피를 액체 질소에서 항온 처리하거나 또는 -70℃ 이하에서 어피를 냉동할 수 있는 다른 특수한 냉동 장비를 사용하여, 어피를 빨리 냉동시킬 수 있다. 다르게는, 어피를 어류 공장에서 통상적으로 발견할 수 있는 종래 유형의 냉동기에서 냉동할 수 있다. 냉동 가공은 온전한 어피를 포함하는 세포를 용해 또는 부분적으로 용해하고, 어피의 탈세포화를 촉진하도록 도울 수 있다. 어피가 냉동된 경우, 추가의 가공을 위해 이후에 해동할 수 있다.

어피의 냉동 여부에 불문하고, 추가의 가공 전에 완충액으로 세척할 수 있다. 예를 들어, 어피의 소독 및 안정을 촉진하기 위해, 하나 이상의 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산(예를 들어 50 mM 아스코르브산), 비타민 A, C, E 및 베타 카로틴), 항생제(예를 들어, 스트렙토마이신 및 페니실린), 프로테아제(예를 들어, 디스파아제 II) 및 프로테아제 억제제(예를 들어, 안티페인, 아프로티닌, 벤자미딘, 베스타틴, DFP, EDTA, EGTA, 류펩틴, 펩스타틴, 포스포라미돈 및 PMSF)를 선택적으로 포함하는 완충액으로 어피를 1 내지 3회 세척할 수 있다. 완충액은 5.5 이상, 예를 들어, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상의 pH일 수 있다. 특정 실시양태에서 pH는 7.0 내지 9.0, 예를 들어, 7.5 내지 8.5이다. 완충액은 또한 어피를 며칠 내지 몇 주 이상 보관할 수 있는 배지로써 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서 어피는 약 4℃의 온도 하에 완충액에서 보관된다.

완충액에서 냉동 및/또는 세척 및/또는 저장 후, 어피는 기계적 및 구조성 온전성 및 세포외 매트릭스에서 자연적으로 발생하는 생물학적 활성에 대한 손상이 최소화되거나 전혀 없는 어피로부터, 항원 재료를 포함하는 세포 재료를 제거하기 위해 하나 이상의 탈세포화 용액으로 어피를 처리된다.

상기 사용된 용어 "세포외 매트릭스" 또는 "ECM"은 다양한 다른 중요 기능을 수립하는 외에, 피부 세포에 구조적인 지지를 제공하는, 어피 안에 있는 비세포 조직 재료를 의미한다. 상기 기재된 ECM은 추출, 정제 또는 분리된 ECM 성분(예를 들어, 콜라겐)으로부터 구성되거나 또는 완전히 재-형성된 매트릭스 재료를 포함하지 않는다.

상기 사용된 용어 "무세포의", "탈세포화된", "탈세포화된 어피" 등은, 상당한 양의 세포 및 핵산 함량이 제거되고, ECM의 복잡한 3차원 사이 구조가 남아있는 어피를 의미한다. "탈세포화제"는 ECM의 상당량의 세포 및 핵산 함량을 제거하기에 효과적인 약품이다. 독자 생존 가능한 핵산, 독자 생존 불가능한 핵산 및 다른 세포 재료가 ECM으로부터 50% 이상 제거되었을 때, ECM은 세포 및 핵산 내용물이 "탈세포화되거나" 또는 "실질적으로 존재하지 않는다"(즉, "상당한 양"이 제거되었음). 특정 실시양태에서, 독자 생존 가능한 핵산, 독자 생존 불가능한 핵산 및 세포 재료의 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%가 제거된다. 예를 들어, 탈세포화는, DNA 내용물에 대해 처리된 어피를 시험함으로써, 입증될 수 있다. ECM으로부터의 핵산의 제거는, 예를 들어, ECM의 조직학적 시험, 및/또는 피코그린(PICOGREEN: 등록상표) 어세이, 다이페닐라민 어세이와 같은 생화학적 어세이, 또는 PCR에 의해 측정될 수 있다.

탈세포화는 세포막을 파괴하고 세포 내용물을 방출한다. 탈세포화는 하나 이상의 물리적 처리, 하나 이상의 화학적 처리, 하나 이상의 효소적 처리, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 물리적 처리의 예는 초음파 처리, 기계적 교반, 기계적 마사지, 기계적 압력 및 냉동/해동이다. 화학적 탈세포제의 예는 이온 염(예를 들어, 나트륨 아자이드), 염기, 산, 세제(예를 들어, 비-이온 및 이온 세제), 산화제(예를 들어, 과산화수소 및 퍼옥시산), 저장액, 고장액, 킬레이트제(예를 들어, EDTA 및 EGTA), 유기 용매(예를 들어, 트라이(n-부틸)-포스페이트), 아스코르브산, 메티오닌, 시스테인, 말레산, 및 DNA에 결합하는 중합체(예를 들어, 폴리-L-라이신, 폴리에틸이민(PEI) 및 폴리아미도아민(PAMAM))이다. 비-이온 세제는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, t-옥틸펜옥시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 3차-옥틸페닐 에터(트리톤(등록상표) X-100)(다우 케미칼 컴퍼니(Dow Chemical CO.))를 포함한다. 이온 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 데옥시콜레이트, 트리톤(등록상표) X-200 및 양쪽성이온 세제(예를 들어, CHAPS)를 포함한다. 다른 적합한 탈세포화 세제는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노-올레이트 및 폴리옥시에틸렌(80) 소르비탄 모노-올레이트(트윈(Tween) 20 내지 80), 3-[(3-클로르아미도프로필)-다이메틸아미노]-1-프로판-설포네이트, 옥틸-글루코사이드 및 나트륨 도데실 설페이트를 포함한다. 효소적인 탈세포화제의 예는 프로테아제, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제이다. 프로테아제는 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신), 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제(예를 들어, 터몰리신) 및 글루타민산 프로테아제를 포함한다. 탈세포화는 통상적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 실시양태에서 pH는 7.0 내지 9.0, 예를 들어, 7.5 내지 8.5이다.

탈세포화 단계의 예는 1 M NaCl, 2% 데옥시콜산, 0.02% 나트륨 아자이드 및 500 ppm 스트렙토마이신을 포함하는 용액에서 어피를 항온 처리하는 것이다. 다른 예에서, 어피는 프로테아제(예를 들어, 2.5 U/mL 디스파즈 II) 및 다른 성분(예를 들어, 0.02% 나트륨 아자이드)을 포함하는 제 1 탈세포화 용액에 의해 항온 처리된다. 제 1 탈세포화 용액을 부어버리고 이어서 어피를 제 2 탈세포화 용액, 예를 들어, 세제(예컨대, 0.5% 트리톤(등록상표) X-100) 및 다른 성분(예컨대, 0.02% 나트륨 아자이드)을 포함하는 용액으로 처리한다. 다른 예에서, 어피를 먼저 다른 성분(예를 들어, 0.02% EDTA, 나트륨 아자이드 및/또는 데옥시콜산) 및 세제(예를 들어, 0.5% 트리톤(등록상표) X-100)를 포함하는 탈세포화 용액으로 처리하고, 이어서 나트륨 도데실 설페이트와 같은 세제를 포함하는 제 2 탈세포화 용액에서 항온 처리한다.

어피는 진탕 하에 항온 처리되거나 항온 처리되지 않는다. 탈세포화 단계는 임의의 잔여 탈세포화 용액을 부어버리고, 선택적으로 어피를 완충액(예를 들어, 한크(Hank) 평형 염 용액으로 세척하고, 이어서 어피를 탈세포화의 다른 단계에서 다시 처리하는 것에 의해 필요에 따라 반복될 수 있다. 일단 세포 재료의 충분한 양이 제거되면, 탈세포화 용액은 제거(예를 들어, 흡입 또는 용액을 서서히 쏟아 버림)될 수 있다.

탈세포화 후, 어피를 선택적으로 물, 완충액 및/또는 염 용액으로 세척할 수 있다. 적합한 세척액의 예는 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 염수(DPBS), 한크 평형 염 용액(HBSS), 미디엄 199(M199, SAFC 바이오사이언시스 인코포레이트(SAFC Biosciences, INC.)) 및/또는 L-글루타민을 포함한다. 세척 단계는 통상적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 실시양태에서 pH는 7.0 내지 9.0, 예를 들어, 7.5 내지 8.5이다.

어피를 최종 생성물의 외관을 개선하기 위해 선택적으로 표백할 수 있다. 표백을 탈세포화 전, 후 및/또는 진행중에 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표백제가 하나 이상의 탈세포화 용액 및/또는 하나 이상의 완충액에 혼입될 수 있다. 표백제의 예는 나트륨 설파이트, 과산화수소, 암모늄 퍼설페이트, 칼륨 퍼설페이트 및 나트륨 퍼설페이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 퍼설페이트와 같은 강한 표백제가 사용된 경우, 표백 및 탈세포화는 하나 이상의 표백제, 증점제 및 과산화물 원료의 혼합물에서 어피를 항온 처리하는 것을 포함하는 단일 단계에서 조합될 수 있다. 예를 들어, 무수 표백 혼합물을 제조(예를 들어, 실시예 5에 기재된 "표백 혼합물" 참고)하고, 이어서 물, 과산화수소, 또는 탈세포화에 또한 충분한 표백 용액을 형성하기 위한 무수 혼합물의 조합을 첨가할 수 있다. 표백제(예를 들어, 나트륨 설파이트, 과산화수소, 암모늄 퍼설페이트, 칼륨 퍼설페이트 및 나트륨 퍼설페이트)는 약 40 내지 60%(중량/중량)의 무수 혼합물이어야 한다. EDTA 및 퍼설페이트의 조합은 표백뿐만 아니라 탈세포화를 가속화하기 위해 혼합물을 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서 무수 혼합물중 EDTA 농도는 약 0.25 내지 5%(중량/중량)이다. 과산화수소는 혼합물의 약 15 내지 25%일 수 있고; 과산화물 원료는 나트륨 퍼카보네이트 및 칼륨 퍼카보네이트일 수 있다. 나트륨 포스페이트 과수화물 및 나트륨 카포네이트 또는 마그네슘 메타실리케이트 및 실리큠 실리케이트를 또한 과산화물 원료로 사용할 수 있다. 무수 혼합물은 또한 실리카 및 수화된 실리카를 포함하고, 예를 들어 1 내지 10%(중량/중량)이고, 선택적으로 하나 이상의 스테아레이트(예를 들어, 암모늄 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트 및/또는 마그네슘 스테아레이트)일 수 있다. 추가로 무수 혼합물은 표백/탈세포화 용액의 점도를 증가시키고 손상으로부터 단백질 섬유를 보호하기 위하여 선택적으로 증점제, 예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 알긴(즉, 알기네이트), 유기 검(예를 들어, 셀룰로스, 잔탄 검) 나트륨 메타실리케이트 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표백 및/또는 표백에 탈세포화를 더한 것은, 통상적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 실시양태에서 pH는 7.0 내지 9.0, 예를 들어 7.5 내지 8.5이다. 표백 및/또는 표백에 탈세포화를 더한 후, 어피를 선택적으로 상기 기재된 pH 조건 하에 L-글루타민을 포함하는 용액으로 세척한다.

특정 실시양태에서, 어피를 다이제스션(digestion) 효소로 처리한다. 표백과 유사하게, 다이제스션을 탈세포화 전, 후 및/또는 진행중에 수행할 수 있다. 적합한 효소는 프로테아제, 예를 들어 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 글루탐산 프로테아제를 포함한다. 특정 실시양태에서 다이제스션 효소는 트립신과 같은 세린 프로테아제이다. 다이제스션 효소는 알칼리 환경에서 기능하고, ECM안에서 가교 결합을 제한하고, 어피를 연화시키는 효소이다. 다이제스션을 통상적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서 pH는 7.0 내지 9.0, 예를 들어 7.5 내지 8.5이다.

탈세포화된 어피를 선택적으로 동결 보존할 수 있다. 동결 보존은 냉동하기 전에 동결 방지액에 어피를 합침시키는 것을 포함한다. 동결 방지액은 통상적으로 적절한 완충액, 하나 이상의 동결 방지제 및 선택적으로 용매, 예를 들어, 최소한의 팽창 및 수축 하에 물과 조합하는 유기 용매를 포함한다. 동결 방지제의 예는 수크로스, 라피노스, 덱스트란, 트레할로스, 다이메틸아세트아미드, 다이에틸설폭사이드, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 2-메틸-2,4-판탄다이알, 특정 부동 단백질 및 펩타이드 및 이들의 조합을 포함한다. 다르게는, 탈세포화된 어피가 냉동 단계 동안 형성된 빙정을 최소화하기 위해 승화 전에 급속-냉동(플래시-냉동)된 경우, 피부를 동결 방지제를 포함하지 않는 완충액에서 선택적으로 냉동할 수 있다. 동결 보존은 통상적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 실시양태에서 pH는 7.0 내지 9.0, 예를 들어 7.5 내지 8.5이다.

탈세포화된 어피를 유리 바이알 또는 파우치와 같은 무균 용기 안에서 포장할 수 있다. 한 실시양태에서, 티베크(TIVEK: 등록상표)파우치를 사용한다. 예를 들어, 어피를 동결 방지액에서 항온 처리할 수 있고, 티베크(등록상표) 파우치로 포장하고, 이어서 냉동 건조기에 위치시키고, 동결 방지제와 상용되는 비율로 냉동할 수 있다.

탈세포화된 어피는 동결 건조(즉, 저온 및 진공 상태에서 냉동하여 물이 얼음 재-결정화 없이 각각의 빙정 상으로부터 연속적으로 제거됨)될 수 있다. 동결 건조 동안, 물은 통상적으로 승화를 통해 먼저 제거되고 이어서 필요한 경우, 탈착을 통해서 제거된다. 멸균 전 및 후에 과량의 물을 제거하는 다른 방법은 진공 프레싱(vacuum pressing)이다.

특정 실시양태에서, 탈세포화된 어피는 냉동 전 및/또는 후에 멸균된다. 멸균 방법은 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 탈세포화된 어피를 에틸렌 옥사이드 챔버에 위치시키고, 적합한 주기의 에틸렌 옥사이드로 처리할 수 있다. 다른 멸균 방법은 오존, 이산화탄소, 포름알데히드 기체 또는 방사선(예를 들어, 감마선, X-레이, 전자 빔 프로세싱 및 이원자 입자)를 포함한다.

대안으로, 또는 물의 냉동, 냉동-건조 및/또는 진공 프레싱 이외에, 탈세포화된 어피를 알코올과 같은 비수성 용액에서 보존할 수 있다.

생성물(스캐폴드 재료)는 조직의 재생, 회복 및/또는 대체(예를 들어, 내인성 조직의 회복, 재생 및/또는 성장)을 용이하게 할 수 있는 특성을 소유하는 멸균한 콜라겐계 매트릭스다. 용어 "스캐폴드 재료"는 상기 기재된 것처럼, 탈세포화 및 선택적인 표백화, 다이제스션, 동결 건조화 등을 거친, 어피를 포함하는 재료를 나타낸다. 스캐폴드 재료는, 내피 및/또는 상피 세포를 지지하기 위한 온전한 스캐폴드를 제공할 수 있고, 숙주에 의해 통합될 수 있고, 생체에 적합하고, 상당히 석회화되지 않고, 상온에서 저장되고 운반될 수 있다. 어구 "숙주에 의해 통합된"은 스캐폴드 재료로 처리된 환자의 세포와 조직이 스캐폴드 재료 안으로 성장하고, 스캐폴드 재료가 실제로 환자의 몸안으로 통합되고/되거나 흡수되는 것을 의미한다. 용어 "생체에 적합한"은 이의 의도된 용도의 생체내 환경에서 주로 무독성이고, 환자의 생리학적 시스템에 의해 실질적으로 거절되지 않은(즉, 비-항원인) 재료를 의미한다. 이는 국제 표준 기구(ISO) 표준 10993 및/또는 미국 약전(USP) 23 및/또는 미국 식품의약국(FDA) 블루북 각서 G95-1 문헌["Use of International Standard ISO-10993, Biological Evaluation of Medical Deviced Part 1: Evaluation and Testing."]에 제시된 생체적합성 시험을 통과하는 재료의 능력에 의해 측정될 수 있다. 전형적으로, 이러한 시험은 재료의 독성, 전염성, 발열성, 자극 가능성, 반응성, 용혈 활성, 발암성 및/또는 면역원성을 측정한다. 대다수의 환자에게서 도입되는 경우, 생체에 적합한 구조 또는 재료는 상당한 부작용, 오래 유지되거나 증가하는 생물학적 반응 또는 응답을 야기하지 않고, 생물 안으로 외부 물체의 수술 또는 이식을 전형적으로 수반하는, 가볍고 일시적인 염증과는 상이하다.

지속적으로 고수준의 기질스틸단백질 분해효소(MMP)는 만성 상처에 기여한다. 상기 기재된 스캐폴드 재료는 기질스틸단백질 분해효소(MMP)를 흡수하여, 상처 치료 및 만성에서 급성 상처로의 전환을 촉진한다.

스캐폴드 재료는 어피의 세포외 매트릭스(ECM)의 단백질을 포함한다. 스캐폴드 재료의 ECM 성분은, 예를 들어, 구조적 단백질; 접착 당단백; 프로테오글리칸; 비-프로테오글리칸 폴리사카라이드; 및 기질세포 단백질을 포함할 수 있다. 구조적 단백질의 예는 콜라겐(ECM에서 가장 풍부한 단백질)을 포함하고, 예를 들어, 미소섬유 콜라겐(유형 I, II, III, V 및 XI); 파시트 콜라겐(유형 IX, XII 및 XIV), 단쇄 콜라겐(유형 VIII 및 X), 기저막 콜라겐(유형 IV) 및 다른 콜라겐(유형 VI, VII 및 XIII); 엘라스틴; 및 라미닌을 포함한다. 접착 당단백의 예는 피브로넥틴; 테나신; 및 트롬보스폰딘을 포함한다. 프로테오글리칸의 예는 헤파린 설페이트; 콘드로이틴 설페이트; 및 케라탄 설페이트를 포함한다. 비-프로테오글리칸 폴리사카라이드의 예는 히알루론산이다. 기저막 단백질은 세포 표면 수용체, 사이토카인, 성장 인자, 프로테아제 및 ECM과 상호 작용을 통해 세포 기능을 조절하는 세포외 단백질의 구조적으로 다양한 군이다. 예는 트롬보스폰딘(TSP) 1 및 2; 테나신 및 SPARC(산성이고 시스테인이 풍부한 분비 단백질)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 탈세포화(및 다른 추가적인 가공 단계)가 어피의 지질 층로부터 자연적으로 발생하는 지질을 모두 제거하지는 않는다. 그러므로, 스캐폴드 재료는 어피, 특히 어피의 지질 층으로부터의 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 재료는 약 25%(중량/중량) 이하의 지질(동결 건조 후 총 스캐폴드 재료의 건조 중량), 예를 들어, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23% 또는 24%(중량/중량)의 지질을 포함할 수 있다. 스캐폴드 재료의 지질의 존재는, 예를 들어, 유기 용매 추출 및 이어서 크로마토그래피에 의해 입증될 수 있다. 적합한 유기 용매의 예는 아세톤 및 클로로포름을 포함한다.

스캐폴드 재료의 지질은, 예를 들어, 지방 아실(즉, 지방산, 이의 공액체 및 유도체); 글리세롤리피드; 글리세로포스포리피드(즉, 포스포리피드); 스핑고리피드; 사카로리피드; 폴리케티드; 스테롤 리피드(즉, 스테롤); 특정 지용성 비타민; 프레놀리피드; 및/또는 폴리케티드를 포함하다. 지방 아실의 예는 포화된 지방산, 예를 들어, 다불포화된 지방산; 지방 에스터; 지방 아미드; 및 에이코사노이드를 포함한다. 특성 실시양태에서, 지방산은 오메가-3 지방산, 예를 들어, 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)(고 농도 어류 오일에서 발견됨)을 포함한다. 어류 오일에서 발견하는 다른 지방산은 아라키드산, 가돌레산, 아라키돈산, 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 바크센산, 리놀레산, 알파-리놀레산, 감마-리놀레산, 베헨산, 에루크산 및 리그노세르산을 포함한다. 글리세롤리피드의 예는 모노-, 다이- 및 트라이-치환된 글리세롤, 예를 들어, 모노아실글리세롤, 다이아실글리세롤 및 트라이아실글리세롤(즉, 모노글리세리드, 다이글리세리드 및 트라이글리세리드)을 포함한다. 글리세로포스포리피드의 예는 포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민; 및 포스파티딜세린을 포함한다. 스핑고리피드의 예는 포스포스핑고리피드 및 글리코스핑고리피드를 포함한다. 스테롤 리피드의 예는 콜레스테롤; 스테로이드; 및 세코스테로이드(비타민 D의 다양한 형태)를 포함한다. 프레놀리피드의 예는 이소프레노이드; 카로테노이드; 및 퀴논 및 하이드로퀴논, 예를 들어 비타민 E 및 K를 포함한다.

스캐폴드 재료는 하나 이상의 첨가된 활성제(즉, 스캐폴드 재료의 가공 중 또는 후 첨가된 약품), 예를 들어 항생제, 방부제, 항균제, 항바이러스제, 항진균제, 항기생충제 및 소염제를 포함할 수 있다. 유효 성분은 산화방지제와 같이 상처 치료 및/또는 조직 치유를 촉진하는 화합물 또는 조성물, 또는 약물일 수 있다. 이는 또한 단백질 또는 단백질 및/또는 다른 생물제일 수 있다. 항생제, 방부제 및 항미생물제는 스캐폴드 재료에 항미생물 특성의 효과를 제공하기에 충분한 양으로 첨가될 수 있다. 특성 실시양태에서, 항미생물제는 하나 이상의 항미생물성 금속, 예를 들어 은, 금, 백금, 구리, 아연 또는 이들의 조합물이다. 예를 들어, 은은 이온, 금속, 원소 및/또는 콜로이드 형태에서 가공하는 동안 스캐폴드 재료에 첨가될 수 있다. 은은 또한 다른 항미생물제와 조합될 수 있다. 소염제는 스캐폴드 재료가 적용된 상처 또는 조직 지역에서 염증을 감소시키고/시키거나 억제하기에 충분한 양으로 첨가될 수 있다.

스캐폴드 재료는 건조 형태로 사용될 수 있다. 다르게는, 스캐폴드 재료는 사용 전에 다시 수화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 스캐폴드 재료는 두꺼운 스캐폴드 재료를 형성하기 위해 서로 적층된다.

통상적으로는, 스캐폴드 재료는 약 0.1 내지 4.0 mm 두께(즉, 단면에서), 예를 들어 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 또는 3.5 mm 두께이다. 두께는 출발 물질로서 사용된 어종, 가공, 동결 건조 및/또는 재수화를 포함하는 요인의 수에 따라 다를 수 있다(실시예 14 참조). 물론, 두께는 생성물이 하나 초과의 층의 스캐폴드 재료를 포함할 때, 비례해서 더 크다.

상기 기재된 스캐폴드 재료는 다양한 의학적 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 재료는 상처 드레싱 및/또는 봉합 재료로서 사용될 수 있고, 이때 스캐폴드 재료는 상처 또는 조직 구역의 일부에 적용된다. 용어 "상처"는 조직 손상, 조직 침투, 열상 또는 병변을 초래하는 임의의 손상을 의미한다. 스캐폴드 재료에 의해 치료할 수 있는 상처는 내부, 계면, 외부, 세포 사이, 체외 및/또는 체내를 포함하는 임의의 부위에 위치할 수 있는 손상을 포함한다. 스캐폴드 재료로 덮기에 적합한 상처의 예는 자상, 깊은 상처, 개방창, 조직 파열, 욕창, 피부염, 병변, 만성 상처, 전상, 괴저상, 급성, 만성, 트라우마, 열상, 찰과상, 타박상, 괴사성 근막염, 독성 표피 괴사융해증, 압력 상처, 정맥부전 궤양, 동맥 궤양, 당뇨병 또는 신경성 궤양, 압박 궤양, 혼합 궤양, 화상, 모균증, 혈관염 상처, 괴저성 농피증 및 이의 등가물, 및/또는 이들의 조합물을 포함하고, 이는 당업자에게 공지되어 있다. 인간 및 동물 대상의 상처 치료가 고려된다.

특정 실시양태에서, 스캐폴드 재료는 예를 들어, 탈장 회복처럼 복벽 재건을 위해 사용된다. 예를 들어, 탈장 회복을 위해, 의사는 탈장 위치 근처를 절개한다. 서혜부 탈장인 경우, 절개는 복부와 대퇴부가 만나는 주름 바로 위에서 수행된다. 배꼽 탈장을 회복을 위해 배꼽 근처를 절개한다. 탈장이 이전 수술의 부위에서 발생한 경우, 이전 수술의 절개 부위가 다시 열린다. 절개가 된 위치에 관계 없이, 수술은 매우 동일한 방법으로 진행된다. 탈장 낭은 조심스럽게 개방되고, 장 또는 다른 조직은 다시 복부 내에 위치된다. 쇠약한 지역은 복부 근육 조직을 서로 뒤편으로 끌어당기는 합성 메쉬 또는 봉합선으로 치료 및 강화된다.

상기 기재된 스캐폴드 재료는 메쉬 재료 또는 봉합선으로서, 또는 메쉬 재료 또는 봉합선을 강화하기 사용될 수 있다. 스캐폴드 재료는 예를 들어, 상처 드레싱, 메쉬 재료, 붕대, 또는 봉합선과 같은, 상처 치료 또는 조직 치유 제품을 강화 또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 재료는 상처 드레싱, 메쉬 재료 또는 봉합선에 이어서, 또는 이와 뒤얽혀 사용될 수 있다. 메쉬 재료 또는 봉합선으로서, 또는 메쉬 재료 또는 봉합선을 강화하기 위해 사용된 경우, 스캐폴드 재료는 예를 들어, 글루터알데하이드 또는 크로뮴과 같은 화학적 가교 결합을 사용하여 ECM 재료 성분의 가교 결합을 증가시키기 위해 처리될 수 있다. 스캐폴드 재료는 또한 치주 질환으로 인한 잇몸 손상을 대체하거나, 방광 슬링을 형성하거나, 골반 저 복원을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용된 단수 형태는 별도로 문맥상에서 분명하게 지적하지 않는 한, 복수의 의미를 포함한다.

상기 기재된 문헌은 본원의 출원일 전의 이의 기재 내용만을 제공한다. 어떠한 것도 본 개시 내용이 종래 개시 내용에 기인하여 종래 문헌보다 앞서지 못한다는 입장으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 문헌의 일자는 실제 공개 일자와 상이하고, 이는 별도로 확인될 필요가 있을 수 있다. 본원에 인용된 모든 문헌, 특허, 특허 출원 및 다른 인용 문헌은 그들 전체가 참조로서 본원에 혼입된다.

개시 내용이 특정 실시양태를 참고하여 자세히 기술되어 있지만, 개시 내용의 범위를 벗어남이 없이, 다양한 변화가 만들어질 수 있고, 등가물이 사용될 수 있음이 당해 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다. 추가로, 하기 실시예는 단지 예시적인 것이고, 어떠한 방식으로든지 개시 내용을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1

표피 제거

표피를, 가능한 많은 표피 지방과 함께, 어류 필렛으로부터 제거하였다. 칼을 이용해 어피의 표면을 긁어냄으로써, 도마 위에서 어피의 비늘을 제거하였다.

살균 및 안정화

비늘을 벗긴 피부를 50 mM 아스코르비산, 500 ppm 스트렙토마이신을 각각 포함하는 멸균된 포스페이트-완충된 염수로 4℃ 하에 1시간 동안 2회 세척하였다.

탈세포화

(a) 어피를 1 M NaCl에 8시간 동안 넣고, 이어서 0.02% 나트륨 아자이드 및 500 ppm 스트렙토마이신을 포함하는 2% 데옥시콜산에서 항온 처리하였다.

(b) (a)의 용액을 부어버렸다. 어피를 실온 하에 40 RPM에서 10분 동안 한크 평형 염 용액에 위치시켰다. 단계를 반복하였고, 어피를 층류 후드안의 용기에 위치시켰고, 열고, 용액을 흡입 제거하였다. 이 과정을 2회 반복하였다.

(c) 어피를 0.5% 나트륨 도데실 설페이트를 포함하는 탈세포화 용액으로 처리하였고, 그 용기를 실온에서 1시간 동안 40 RPM의 회전기에 위치시켰다.

(d) 탈세포화 용액을 (b)에 기재된 바와 같이 흡입으로 제거하였다. 어피를 둘베코 포스페이트 완충 용액 50 mL로 세척하였다.

다이제스션

어피를 1 M 트리스-HCl, 트립신 0.5 ㎍/mL(pH 8.5)로 이루어진 다이제스션 용액에 넣고 실온에서 18시간 동안 항온 처리하였다.

동결 방지

어피를 7% 덱스트란, 6% 수크로스, 6% 라피노스 및 한코 평형 완충 용액중 1 M EDTA를 포함하는 전-동결액에 함침시켰다.

세척

어피를 전-동결액으로 세척하였고, 실온에서 120분 동안 40 RPM의 회전기에 위치시켰다.

포장

어피를 파우치 안에 넣고 열로 봉인하였다. 파우치는 듀퐁트(DuPont)의 의료 품질 다공성 티베크(등록상표) 막 파우치이고, 에틸렌 옥사이드(EtOx)로 살균하기 적합하다.

동결 건조

어피를 포함하는 파우치를 동결 건조기에 넣고 동결 건조시켰다.

멸균

어피를 포함하는 파우치를 에틸렌 옥사이드 챔버에 넣고, 에틸렌 옥사이드의 1 내지 5 주기로 처리하여 어피를 멸균시켰다.

실시예 2

표피 제거

살균 및 안정화

탈세포화

(a) 어피를 디스파제 II(또는 프로나제) 2.5 U/mL 및 0.02% 나트륨 아자이드를 포함하는 포스페이트-완충된 염수에 넣고 연속 진탕하면서 4℃ 하에 8시간 동안 항온 처리하였다. 이어서 용액을 부어버리고, 시료를 0.5% 트리톤(등록상표) X-100 및 0.02% 나트륨 아자이드를 포함하는 제 2 용액에 넣고 24시간 동안 가벼운 진탕 하에 항온 처리하였다.

(b) (a)의 2차 용액을 부어버렸다. 어피를 10분 동안 40 RPM 하에 실온에서 한크 평형 염 용액에 위치시켰다. 이 단계를 반복하였고, 어피를 층류 후드안의 용기에 위치시켰고, 열고, 용액을 흡입 제거하였다. 이 과정을 2회 더 반복하였다.

(d) (c)의 탈세포화 용액을 (b)에 기재된 바와 같이 흡입으로 제거하였다. 어피를 둘베코 포스페이트 완충 용액 50 mL로 세척하였다.

다이제스션

어피를 1 M 트리스-HCl, 트립신 0.5 ㎍/mL(pH 8.5)의 다이제스션 용액에 넣고 실온에서 18시간 동안 항온 처리하였다.

동결 방지

어피를 7% 덱스트란, 6% 수크로스, 6% 라피노스 및 한크 평형 염 용액중 1 mM EDTA룰 포함하는 전-동결액에 함침시켰다.

세척

어피를 전-동결액으로 세척하였고, 40 RPM의 회전기에 120분 동안 실온에서 위치시켰다.

포장

어피를 티베크(등록상표) 막 파우치에 넣고 열로 봉인하였다.

동결 건조

멸균

어피를 포함하는 파우치를 에틸렌 옥사이드 챔버에 넣고 에틸렌 옥사이드의 1 내지 5 주기로 처리하여 어피를 멸균시켰다.

실시예 3

표피 제거

표피는 가능한 많은 표피 지방과 함께, 어류 필렛으로부터 제거하였다. 칼을 이용해 어피의 표면을 긁어냄으로써, 도마 위에서 어피의 비늘을 제거하였다.

냉동

어피를 표준 어류-공장 급속-냉동기에 넣고 냉동시켰다. 냉동 과정 동안 세포가 용해된다. 냉동은 미생물의 성장을 억제한다.

해동

어피를 4℃에서 해동하였다.

살균 및 안정화

탈세포화

(a) 어피를 0.5% 나트륨 도데실 설페이트를 포함하는 탈세포화 용액으로 처리하였고, 용기를 40 RPM의 회전기에 1시간 동안 실온에서 위치시켰다.

(b) 탈세포화 용액을 흡입으로 제거하였다. 어피를 둘베코 포스페이트 완충 용액 50 mL로 세척하였다.

다이제스션

어피를 1 M 트리스-HCl, 트립신 0.05 ㎍/mL(pH 8.5)의 다이제스션 용액에 넣고 실온에서 18시간 동안 항온 처리하였다.

동결 방지

어피를 7% 덱스트란, 6% 수크로스, 6% 라피노스 및 한크 평형 염 용액중 1 mM EDTA를 포함하는 전-동결액에 함침시켰다.

세척

포장

동결 건조

멸균

실시예 4

0.5% 농도의 표백제(나트륨 설파이트)를 또한 세척 단계에서 전-동결액에 첨가하여 표백된 스캐폴드 재료를 수득한 것을 제외하고는 어피를 상기 실시예 1 내지 3에 각각 기술된 바와 같이 가공하였다.

실시예 5

표백/탈세포화 혼합물은 하기와 같이 제조하였다:

참조: 백분율은 총 표백 혼합물(무수)의 중량 단위이다.

실시예 6

표피 제거

표피를 어류 필렛으로부터 제거하였다. 어피를 스틸 와이어 브러쉬 및 칼로 어피의 표면을 긁어냄으로써 도마 위에서 어피의 비늘을 제거하였다.

냉동

어피를 급속 냉동기(즉, -80℃ 냉동기에 직접 넣음)에서 냉동시켰다. 이어서 어피를 냉동기에서 꺼내고, 실온에서 약 2시간 동안 해동하였다.

탈세포화

(a) 조직을 0.5% 트리톤(등록상표) X-100 및 둘베코 포스페이트-완충된 염수중 0.02% 나트륨 아자이드의 용액에서 항온 처리하였고, 40 rpm으로 2시간 동안 실온에서 진탕하였고, 용액을 부어버렸다.

(b) 비늘을 벗기는 과정을 칼을 이용해 계속 진행하였다. 결과물은 비늘이 존재하지 않는 생성물(외관상 비늘이 없음)이다.

(c) 이어서, 조직을 한코 평형 완충 용액중 2 mM L-글루타민에 10분 동안 40 rpm에서 실온에서 넣고, 용액을 부어버렸다.

(d) 조직을 한코 평형 완충 용액중 0.5% 나트륨 도데실 설페이트 용액에 1시간 동안 실온에서 넣고, 40 rpm에서 진탕하고, 용액을 부어버렸다.

다이제스션

조직을 18시간 동안 실온 하에 1 mM EDTA 및 트립신 0.05 ㎍/mL(pH 8.5)의 다이제스션 용액에서 항온 처리하였다.

표백

조직을 표백 혼합물 C 및 2% 과산화수소로 30분 동안 표백하였다.

세척

조직을 6℃에서 48시간 동안 흐르는 물로 세척하였다.

동결 방지

어피를 7% 덱스트란, 6% 수크로스, 6% 라피노스 및 둘베코 포스페이트-완충된 염수중 1 mM EDTA를 포함하는 전-동결액에 함침시켰다.

포장

동결 건조

멸균

어피를 포함하는 파우치를 에틸렌 옥사이드 챔버에 넣고 에틸렌 옥사이드의 1 내지 5 주기로 처리하여 스캐폴드를 멸균시켰다.

실시예 7

생성물을 실시예 6에서 표피 제거 후 냉동 단계를 제외하여 만들었다. 냉동 단계 대신에 조직을 4℃에서 1시간 동안 50 mM 아스코르브산, 500 ppm 스트렙토마이신을 각각 포함하는 멸균된 포스페이트-완충된 염수로 2회 세척하였다.

실시예 8

표피 제거

표피를 어류 필렛으로부터 제거하였다. 스틸 와이어 브러쉬 및 칼을 이용해 어피의 표면을 긁어냄으로써 도마 위에서 어피의 비늘을 제거하였다.

냉동

표피를 -80℃의 급속 냉동기에서 냉동시켰다. 이어서, 표피를 냉동기에서 꺼내고, 실온에서 약 2시간 동안 해동하였다.

탈세포화

(a) 조직을 0.5% 트리톤(등록상표) X-100 및 둘베코 포스페이트-완충된 염수 중 0.02% EDTA의 용액에서 항온 처리하고, 40 rpm으로 24시간 동안 실온에서 진탕하고, 용액을 부어버렸다.

(b) 비늘을 벗기는 과정을 칼을 이용해 계속 진행하였다. 결과물은 비늘이 없는 생성물(외관상 비늘이 없음)이다.

(c) 조직을 한코 평형 완충 용액중 5% 나트륨 도데실 설페이트의 용액에 실온 에서 1시간 동안 넣고, 40 rpm으로 진탕하고, 용액을 부어버렸다.

(d) 이어서, 조직을 한코 평형 완충 용액중 2 mM L-글루타민에 10분 동안 40 rpm으로 실온에서 넣고, 용액을 부어버렸다.

표백

조직을 표백 혼합물 C 및 2% 과산화수소를 사용하여 30분 동안 표백하였다.

세척

조직을 6℃에서 48시간 동안 흐르는 물로 세척하였다.

동결 방지

포장

동결 건조

멸균

어피를 포함하는 파우치를 에틸렌 옥사이드 챔버에 넣고 에틸렌 옥사이드의 1 내지 5 주기로 처리하어 스캐폴드를 멸균시켰다.

실시예 9

생성물은 실시예 8에서 표피 제거 후 냉동 단계를 제외하여 만들었다. 냉동 단계 대신에, 조직을 4℃에서 1시간 동안 50 mM 아스코르브산, 500 ppm 스트렙토마이신을 각각 포함하는 멸균된 포스페이트-완충된 염수로 2회 세척하였다.

실시예 10

표피 제거

표피를 어류 필렛으로부터 제거하였다. 스틸 와이어 브러쉬 및 칼을 이용해 어피의 표면을 긁어냄으로써, 도마 위에서 어피의 비늘을 제거하였다.

냉동

어피를 -80℃의 급속 냉동기에서 냉동시켰다. 이어서, 어피를 냉동기에서 꺼내고, 실온에서 약 2시간 동안 해동하였다.

탈세포화

(a) 조직을 0.5% 트리톤(등록상표) X-100 및 둘베코 포스페이트-완충된 염수 중 0.02% EDTA의 용액에서 항온 처리하고, 40 rpm으로 48시간 동안 실온에서 진탕하고, 용액을 부어버렸다.

(b) 이어서, 조직을 한코 평형 완충 용액중 2 mM L-글루타민에 10분 동안 40 rpm으로 실온에서 넣고, 용액을 부어버렸다.

표백

조직을 케레시스(kerecis) 표백 혼합물 C 및 2% 과산화수소로 30분 동안 표백하였다.

세척

조직을 6℃에서 12시간 동안 흐르는 물로 세척하였다.

동결 방지

포장

동결 건조

멸균

어피를 포함하는 파우치를 에틸렌 옥사이드 챔버에 넣고, 에틸렌 옥사이드의 1 내지 5 주기로 어피를 처리하여 스캐폴드를 멸균시켰다.

실시예 11

생성물은 실시예 10에서 표피 제거 후 냉동 단계를 제외하여 만들었다. 냉동 단계 대신에, 조직을 4℃에서 1시간 동안 50 mM 아스코르브산, 500 ppm 스트렙토마이신을 각각 포함하는 멸균된 포스페이트-완충된 염수로 2회 세척하였다.

실시예 12

표피 제거

표피를 어류 필렛으로부터 제거하였다. 스틸 와이어 브러쉬 및 칼을 이용해 어피의 표면을 긁어냄으로써, 도마 위에서 어피의 비늘을 제거하였다. 결과물은 비늘이 없는 생성물이었다.

냉동

탈세포화 및 표백

(a) 조직을 표백 혼합물 C 및 2% 과산화수소로 30분 동안 항온 처리하였다.

(b) 조직을 한코 평형 완충 용액중 0.5% 나트륨 도데실 설페이트의 용액에 1시간 동안 실온에서 넣고, 40 rpm으로 진탕하고, 용액을 부어버렸다.

(c) 이어서 조직을 한코 평형 완충 용액중 2 mM L-글루타민에 10분 동안 40 rpm으로 실온에서 넣고, 용액을 부어버렸다.

세척

조직을 6℃에서 12시간 동안 흐르는 물로 세척하였다.

동결 방지

포장

동결 건조

멸균

실시예 13

생성물을 실시예 12에서 표피 제거 후 냉동 단계를 제외하여 만들었다. 냉동 단계 대신에, 조직을 4℃에서 1시간 동안 50 mM 아스코르브산, 500 ppm 스트렙토마이신을 각각 포함하는 멸균된 포스페이트-완충된 염수로 2회 세척하였다.

실시예 14

생성물의 두께를 동결 건조 전 및 후에 측정하였다. 두께를 디지털 캘리퍼로 측정하였다. 동결 건조 전 및 후의 평균 두께는 각각 0.29 mm 및 0.46 mm이었다. 생성물을 동결 건조 후 및 상처에 사용하기 전 재수화(예를 들어, 염 수용액에서)될 수 있다. 동결 건조 및 재수화된 생성물을 시험했을 때, 평균 두께는 0.30 mm이다. 물 손실(동결 건조 전 및 후의 중량 차이에 기초함)은 약 80 내지 82%로 계산되었다.

실시예 15

생성물의 투과성을 대기압 및 진공 하(0.2 기압)에서 측정하였다. 대기압 하의 평균 투과성은 24 시간당 시료의 평방 ㎜당 3.73 ㎎의 물이었다. 진공 하의 평균 투과성은 180초당 시료의 평방 ㎜당 4.93 ㎎의 물이었다.

실시예 16

예비 생물분해성 시험을 32℃에서 등장성 염수 및 둘베코 모디파이드 이글 미디엄(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)(깁코(Gibco))에서 생성물의 시료를 항온 처리함으로써 수행하였다. 약 6 내지 10일 후, 시료는 50%(중량) 초과만큼 분해되었다.

실시예 17

예비 세포 독성 시험을 둘베코 모디파이드 이글 미디엄중 인간 표피 섬유아세포(Hs27 세포주, ATCC CRL-1634), 글루코스 및 10% 소태아 혈청으로 생성물의 시료를 항온 처리함으로써 수행하였다. 시료는 임의의 식별할 수 있는 표현형 변화, 축소, 또는 세포 사멸을 야기하지 않았다.

실시예 18

생성물을 수율 강도, 인장 강도 및 신율을 결정하기 위해 시험하였다. 33 mm x 6 mm의 균일한 시료를 재수화하였고, 500 N 로드 세포에서 0.4 bar 압력 하에 잡고 고정시켰다. 시료를 시험이 지속되는 동안 유지하였다. 결과는 하기 표 1에 나타냈다:

시료 번호	시료 두께[mm]	최대 힘 [N]	최대 응력하의 신율[mm]	최대 응력[%]	최대 힘 하의 응력 [Mpa]
1	0.48	18.10	11.68	35.4%	6.5
2	0.63	34.52	10.67	32.3%	9.2
3	0.35	26.66	13.53	41.0%	12.0
4	0.45	8.70	11.32	34.3%	3.1
5	0.56	75.59	20.52	62.2%	22.7
6	0.76	86.00	21.85	66.2%	19.0
7	0.76	64.80	27.32	82.8%	14.3
8	0.77	69.75	18.71	57.0%	15.0
9	0.33	23.67	11.66	35.3%	11.74
10	0.29	6.91	17.02	51.6%	4.51

참조: 1 Mpa(메가 파스칼)은 1 N/㎟임.

상기 기재된 스캐폴드 재료는 더욱 강하고, 랫, 피그 및 인간의 방광으로부터 제조된 무세포성 매트릭스 그래프트(문헌[Dahms et al., Composition and biomechanical properties of the bladder acellular matrix graft : comparative analysis in rat , pig and human . British Journal of Urology. 1998;82(3):411-419] 참고) 및 FDA-승인된 알로데름데름(ALLODERMDERM: 등록상표)(문헌[Bottino et al., Freeze - dried acellular dermal matrix graft : Effects of rehydration on physical , chemical , and mechanical properties. Dental Materials. 2009;25(9):1109-1115] 참고)보다 상당히 더 신축적이다.

오아시스(OASIS: 등록상표)(돼지 소장 점막하 조직) 및 마트리스템(MATRISTEM: 상표)(돼지 방광)의 인장 강도를 측정하기 위한 시도가 수행되었지만, 측정하기 전에 생성물 둘다의 시료가 붕해되었다.

Claims

탈세포화된 어피를 포함하는 스캐폴드 재료.
제 1 항에 있어서,
어피로부터의 세포외 매트릭스 재료를 포함하는 스캐폴드 재료.
제 2 항에 있어서,
어피의 지질 층으로부터의 지질을 추가로 포함하는 스캐폴드 재료.
제 1 항에 있어서,
상처 드레싱, 붕대, 봉합 재료 및/또는 망 재료의 형태인 스캐폴드 재료.
제 1 항에 있어서,
비늘이 실질적으로 존재하지 않는 스캐폴드 재료.
제 1 항에 있어서,
생체에 적합한 스캐폴드 재료.
제 1 항에 있어서,
하나 이상의 부가적인 활성제를 추가로 포함하는 스캐폴드 재료.
제 6 항에 있어서,
부가적인 활성제가 항생제, 방부제, 항미생물제, 항바이러스제, 항진균제, 항기생충제, 소염제, 산화 방지제, 약물, 단백질, 펩타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 스캐폴드 재료.
(a) 어피를 수득하는 단계; 및
(b) 어피를 탈세포시키는 단계
를 포함하는 스캐폴드 재료의 제조 방법.
제 9 항에 있어서,
어피의 비늘-제거, 세척, 냉동, 표백, 다이제스션 및/또는 동결 보존을 추가로 포함하는 제조 방법.
제 9 항에 있어서,
탈세포화가 하나 이상의 물리적 처리, 하나 이상의 화학적 처리, 하나 이상의 효소적 처리 또는 이들의 조합을 포함하는 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
화학적 처리가 이온 염, 염기, 산, 세제, 산화제, 고장액, 킬레이트제, 유기 용매, 메티오닌, 시스테인, 말레산, DNA에 결합하는 중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탈세포화제를 사용하여 어피를 처리함을 포함하는 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
효소적 처리가 프로테아제, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소로 어피를 처리함을 포함하는 제조 방법.
제 9 항에 따른 제조 방법을 사용하여 제조된 스캐폴드 재료.
제 1 항에 따른 스캐폴드 재료를 상처에 적용함을 포함하는, 상처의 치료 방법.