JP2024510837A - 治癒進行モニタリングを提供する着色された生物学的創傷処置 - Google Patents

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Abstract

組織再生創傷処置、組織再生創傷処置を生成する方法、および組織再生創傷処置を使用して創傷を処置する方法が提供される。組織再生創傷処置は、皮膚代替物と皮膚代替物に加えられる着色剤とを含む。着色剤は、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である。

Description

本開示は、概して、損傷組織を安定化、保護、および／または治癒するための創傷処置および方法に関し、特に、創傷処置の皮膚代替物への内方成長が起こったかどうかを示す創傷処置および方法に関する。
健康な皮膚は、下層組織を、擦過傷、微生物、水分損失、紫外線による損傷から保護することを含む、いくつかの異なる機能を果たす。健康で正常な皮膚の神経系は、接触、圧力、および振動の触覚、熱さおよび冷たさの熱感覚、および痛みの感覚も提供する。身体の体温調節は、皮膚が発汗し、皮膚への血流を制御して熱損失を増減させる能力に依存している。健康な皮膚には、表皮と呼ばれる細胞の薄い外層、真皮と呼ばれる結合組織の厚い中間層、および内側の皮下層という３つの異なる組織層が含まれている。表皮の薄い外層は、水分損失と微生物の侵入に対する障壁を形成する、平らで角質化した死滅した角化細胞で構成されている。死滅した角化細胞は、真皮の上にある基底層の生きた角化細胞に由来し、皮膚の再上皮形成を担っている。表皮は、神経や血管を含まず、真皮からの拡散を介して水分および栄養素を摂取する。表皮の下にある真皮は、大部分が、線維芽細胞によって産生されたコラーゲン線維と一部の弾性線維とで構成されており、水と大きなプロテオグリカン分子とともに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成している。この皮膚層は、機械的強度および水と栄養素の拡散のための基質を提供する。これは、血管、神経、汗腺、毛包、および免疫機能、成長、および修復に関与する細胞を含有している。皮下層は、脂肪組織の厚い層を形成する脂肪細胞で構成されている。
創傷は、皮膚の構造的および機能的完全性の破壊と考えられ得る。したがって、「創傷」は、たとえば、断裂、擦過傷、切開、穿刺、剥離、火傷、または他の同様の負傷などの、皮膚の切断、裂傷、および／または破壊を引き起こす負傷を含み得る。
創傷事象後に行われることが多い止血の後、創傷は、炎症、増殖、リモデリングという治癒の主要段階を経る。慢性創傷は、通常の治癒プロセスを整然におよび適時に通過できなかった創傷とみなされ得る。慢性創傷は、多くの場合、炎症段階のままである。
多くの場合、広い領域に広がる創傷または深い創傷、大きなもしくは重度の火傷などの重大な創傷の場合、または慢性創傷の場合、創傷の治癒プロセスを助けるために、および上述の健康な皮膚の機能の少なくとも一部をより迅速に修復するために、皮膚代替物がしばしば使用される。皮膚代替物は、創傷の一時的または永久的な閉塞を可能にする要素または材料のグループとして広く考慮され得る。皮膚代替物は、概して、生物学的皮膚代替物、合成皮膚代替物、または生物学的皮膚代替物と合成皮膚代替物を含むハイブリッド皮膚代替物に分類することができる。
生物学的皮膚代替物は、多くの場合、よりインタクトな細胞外マトリックス構造を有するのに対し、合成皮膚代替物は、オンデマンドで合成することができ、具体的な目的に合わせて調整することができる。生物学的皮膚代替物および合成皮膚代替物には各々、利点および欠点がある。生物学的皮膚代替物は、より自然な新しい真皮の構築を可能にし、基底膜の存在により優れた再上皮化特性を可能にし得る。合成皮膚代替物は、化学的に合成されてもよく、足場組成に対する制御の増大という利点をもたらす。合成皮膚代替物には、たとえば、合成されたコラーゲンまたはタンパク質ベースのマトリックス、またはシリコーン成分と組み合わせたコラーゲンまたはタンパク質ベースの成分を含む合成生体層が含まれる。ハイブリッド皮膚代替物は、生細胞によって部分的に合成または産生され、部分的に化学合成され得る。
生物学的皮膚代替物、合成皮膚代替物、またはハイブリッド皮膚代替物が使用されるかどうかに関係なく、皮膚代替物を使用する目的は、創傷事象前の皮膚の機能を可能な限り回復させながら効果的で、タイムリーな瘢痕のない創傷治癒を提供することである。
市販の合成皮膚代替物の例としては、Ｂｉｏｂｒａｎｅ（登録商標）、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）、Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）、Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）、ＭａｔｒｉＤｅｒｍ（登録商標）、ＯｒＣｅｌ（登録商標）、Ｈｙａｌｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）、およびＲｅｎｏｓｋｉｎ（登録商標）が挙げられる。
米国特許出願公開第２００３／００５９４６０号明細書は、生体組織の再生に使用することができる合成ポリマーおよび天然ポリマーを含むハイブリッドポリマー皮膚代替物材料を開示している。当該ハイブリッドは、架橋された天然に生じるポリマーおよび生分解吸収性合成ポリマーを含む。しかし、ハイブリッド材料を産生するには、一連の複雑なプロセスの工程を実行する必要がある。加えて、結果として得られるハイブリッド材料には、合成材料の他に天然に生じる材料が含まれている。
最新の創傷処置製品は、創傷上で適切な水分レベルを維持することによって創傷治癒の改善を促進する、いわゆるウェットツードライの創傷ドレッシングである。製品は典型的に、創傷滲出液を蓄積し、定期的に交換される。
生物学的皮膚代替物は、限定されないが、自家皮膚移植片、同系皮膚移植片、同種皮膚移植片、ブタ皮膚移植片などの異種皮膚移植片、死体同種皮膚移植片、および羊膜移植組織を含む皮膚移植片を含み得る。
さらに、近年、増殖する細胞にシェルターを提供することによって創傷の微環境を改善することを意図した新しい種類の生物学的皮膚移植片製品が台頭している。典型的に、新しい製品は、インタクトなコラーゲンまたは再構築されたコラーゲンを含む生物学的材料から作られる。その例としては、Ｏａｓｉｓ，Ｍａｔｒｉｓｔｅｍ，Ｉｎｔｅｇｒａ、およびＰｕｒａｃｏｌなどのブランドが挙げられる。これらの製品は、しばしば、臨床医によってマトリックス製品と呼ばれる。マトリックス製品は、創傷に挿入され、そこで細胞の内方成長を誘引する。その後、二次的なウェットツードライの創傷ドレッシングが、創傷ドレッシングの上に適用される。インタクトな脱細胞化魚皮に由来するマトリックス製品の一例は、２０１３年１２月２４日に特許査定を受けた米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載されている。米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載される脱細胞化魚皮製品は、内皮細胞および／または上皮細胞の内方成長を支持するためのインタクトな足場を提供する足場材料として機能する。脱細胞化魚皮足場材料は、生体適合性があるため、宿主によって組み込むことができる。Ｏｍｅｇａ３ Ｗｏｕｎｄは、アイスランド原産の野生で捕獲されたタイセイヨウタラの皮膚を最小限に加工して作られた市販の皮膚代替物である。魚皮は、構造的に、表皮、真皮、および皮下組織を含む３つの基本層を有する人間の皮膚と似ており、人間の皮膚と相同であるタンパク質、脂質、脂肪酸、その他の生理活性化合物を含有している。
他の生物学的皮膚代替物の例としては、米国特許第６，５４１，０２３号明細書に記載されているものが挙げられ、これは、組織工学足場としての使用のための魚皮由来の多孔質コラーゲンゲルの使用を記載している。コラーゲンゲルの調製には魚皮の粉砕が伴う。加えて、中国特許第１０６８７０３号明細書には、魚皮を魚の体から分離し、２．５～３のｐＨ値を確立するのに十分な量のヨードチンキ、エタノール、ボルネオール、スルファジアジン亜鉛、および塩酸の保存液に皮膚を入れることを含む、火傷を包帯するための魚皮を調製するためのプロセスが記載されている。しかし、これらの製品は、米国特許第６，５４１，０２３号明細書の製品がゲル状であり、中国特許第１０６８７０３号明細書の製品が溶液中で保存されるため、取り扱うのが難しい場合がある。
加えて、医療用途の多数の細胞外マトリックス製品が、人間の皮膚（ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＬｉｆｅＣｅｌｌ））、ウシ胎児真皮（ＰＲＩＭＡＴＲＩＸ（商標）Ｄｅｒｍａｌ Ｒｅｐａｉｒ Ｓｃａｆｆｏｌｄ（ＴＥＩ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ブタ膀胱（ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ（商標）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｗｏｕｎｄ Ｓｈｅｅｔ（Ｍｅｄｌｉｎｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．））、およびブタ小腸粘膜下層（ＯＡＳＩＳ（登録商標）Ｗｏｕｎｄ Ｍａｔｒｉｘ（Ｈｅａｌｔｈｐｏｉｎｔ Ｌｔｄ．））に由来している。
上述したように、治癒時に、創傷は、炎症、増殖、およびリモデリングという３つの主要な段階を経る。炎症段階では、身体は、プロテアーゼを創傷に分泌して、損傷した組織および細片を創傷から除去する。場合によっては、細胞外マトリックスなどの皮膚代替物が創傷に挿入されると、プロテアーゼが、皮膚代替物を攻撃し、あたかも皮膚代替物が損傷した組織または細片であるかのように分解する。他の場合では、細胞外マトリックスなどの皮膚代替物は、細胞の内方成長を伴って意図した通りに機能し、増殖する新しい細胞にシェルターを提供する。
マトリックス製品を使用する臨床医は、典型的に、創傷床にマトリックス製品を最初に適用してから１～３日後に創傷を検査する。本発明者らによって特定された重大な課題は、臨床医および医療従事者が、脱落組織となった劣化した皮膚代替物と湿潤して細胞の内方成長によって浸透されているマトリックスなどの代用膿または皮膚代替物とを容易におよび／または正確に区別することができないことである。本発明者らは、皮膚代替物と、適切に治癒している、すなわち、たとえばマトリックス皮膚代替物の場合に、細胞の内方成長によって浸透されている劣化した創傷内の皮膚代替物とを区別することが、創傷の効率的な治癒に重要であることを発見した。追加された皮膚代替物材料が劣化したか、またはその一部が劣化した場合、劣化した皮膚代替物材料を除去し、創傷を洗浄して、劣化した皮膚代替物材料に含まれることが多い脱落組織および膿を除去する必要がある。脱落組織および膿を洗浄して除去した後、マトリックス材料の新しい処置を創傷に適用することができる。しかし、意図した通りに、加えたマトリックス材料が細胞の内方成長によって浸透されていると判定された場合、マトリックスは所定の位置に残され、創傷が適切に治癒するまでマトリックス材料のモニタリングが継続される。
たとえば、（たとえば、２０１３年１２月２４日に特許査定を受けた米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載されるように）魚皮由来の細胞足場製品を使用して創傷を治癒する場合、本発明者らは、臨床医および介護提供者が、無意識に創傷治癒足場と感染とを区別するのに誤るか、またはそうでなければ苦労していることを発見した。これは、少なくとも部分的に、創傷治癒足場が分解して、周囲の組織に組み込まれ始めるときの創傷治癒足場に関連する色および／または臭気に起因し得る。これは、時に感染組織（たとえば、化膿性感染）に類似した色を有し得、穏やかに芳香性であり得るため、感染組織に類似した臭気であると解釈する人もいる。
したがって、本発明者らは、皮膚代替物が細胞の内方成長によって浸透されているかどうかを判定する効率的かつ効果的な手段がなければ、創傷の適切な治癒を妨げる、作られた皮膚代替物の創傷、創傷の露出、および不必要な再適用を検査するために、包帯の不必要な除去または交換が必要とされることをさらに特定した。
加えて、感染は創傷の治癒および管理における大きな課題である。たとえば、戦闘による創傷の場合、戦場で負傷した軍人の罹患率および死亡率は感染によって決まる。感染は、死傷者全体の３分の１を占め、処置が長期化し、切断のリスクが増加する。負傷の独特のメカニズムおよび厳しい環境のため、戦闘による創傷は汚染されやすく、処置がより困難になる。感染の初期の兆候は、創傷内の細菌の不均衡である。初期段階の創傷で見られる一般的な病原体は、グラム陽性（Ｇ＋）株とグラム陰性（Ｇ－）株の両方を含む。感染が発生すると、グラム陰性菌および多剤耐性（ＭＤＲ）菌の出現が観察される。感染のリスクを低減して兵士に恩恵を与え、戦闘地域で力を増強させるものとして作用するための効果的かつ即時の介入が強く求められている。
したがって、本発明者らは、皮膚代替物が細胞の内方成長によって浸透されているかどうかを判定する手段を提供することに加えて、皮膚代替物自体が感染を軽減するか、または感染を起こしにくくするという課題をさらに特定した。
上記の課題に対処するために、本発明者らは、本明細書において、皮膚代替物と皮膚代替物に加えられる着色剤とを含む、内方成長表示（ingrowth-indicatory）創傷処置を開示する。着色剤は、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である。
さらに、創傷処置方法が提供され、当該方法は、組織再生創傷処置組成物を提供することと、組織再生創傷処置組成物を創傷床に適用することと、着色剤の色の変化を判定することによって、皮膚代替物が創傷内でプロテアーゼ攻撃によって分解されているかどうかを判定することと、を含む。組織再生創傷処置は、皮膚代替物と皮膚代替物に加えられる着色剤とを含む。着色剤は、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である。
組織再生創傷処置を生産する方法が提供され、当該方法は、皮膚代替物を提供する工程と皮膚代替物に着色剤を加える工程とを含む。着色剤は、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である。
本明細書に記載される実施形態によれば、皮膚代替物は、生物学的皮膚代替物、合成皮膚代替物、または生物学的皮膚代替物と合成皮膚代替物のハイブリッドである。
１つまたは複数の実施形態によれば、皮膚代替物は、自家皮膚移植片、同系皮膚移植片、同種皮膚移植片、異種皮膚移植片、または合成皮膚移植片である。
１つまたは複数の実施形態によれば、皮膚代替物としては足場材料を含む。
１つまたは複数の実施形態によれば、皮膚代替物としては、細胞外マトリックス製品を含める足場材料を含む。
１つまたは複数の実施形態によれば、細胞外マトリックス製品は、粒子、シート、またはメッシュの形態である。
１つまたは複数の実施形態によれば、皮膚代替物はインタクトな脱細胞化魚皮を含む足場材料であり、インタクトな脱細胞化魚皮は細胞外マトリックス材料を含む。
１つまたは複数の実施形態によれば、着色剤としては、チアジン染料、トリアリールメタン染料、またはチアジン染料とトリアリールメタン染料の組み合わせを含む。
１つまたは複数の実施形態によれば、着色剤としては、メチレンブルー（ＭＢ）、またはゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、またはメチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）の組み合わせを含む。
１つまたは複数の実施形態によれば、皮膚代替物は凍結乾燥され、ここで、着色剤は、皮膚代替物の凍結乾燥または再凍結乾燥の前に皮膚代替物に加えられる。
１つまたは複数の実施形態によれば、着色剤は、脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水中に０．０１重量％～０．０００１重量％の着色剤を含有する色素溶液で皮膚代替物を染色することによって、皮膚代替物に加えられる。
１つまたは複数の実施形態によれば、着色剤は、抗生物質、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、または抗酸化剤の特性のうちの１つまたは複数を有することを特徴とする。
１つまたは複数の実施形態によれば、組織再生創傷処置は、抗生物質、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、抗酸化剤、薬物、タンパク質、ペプチド、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数を含むさらなる活性薬剤をさらに含む。
１つまたは複数の実施形態によれば、着色剤は、治癒時に創傷の永久的な着色を引き起こさない。
本明細書に記載されるように、本明細書に開示される組織再生処置および組織再生処置方法は、創傷の治癒進行モニタリングを提供し、創傷に適用された劣化した適用された皮膚代替物と細胞の内方成長による浸透に成功している皮膚代替物とを区別するための正確な効率的かつ効果的な手段を提供する。これによって、臨床医または医療従事者は、（１）創傷を洗浄し、脱落組織および膿を伴って適用に失敗した皮膚代替物を除去する必要があるのか、または（２）適用された皮膚代替物を適所に残すかを容易に区別することが可能となり、着色剤が皮膚代替物に加えられ、該着色剤は処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃によって分解する性質を有する。すなわち、着色剤は、たとえば製造段階で皮膚代替物に加えられ、着色剤の色は、処置された創傷内の１つまたは複数のプロテアーゼによって変更、除去、または分解されることを特徴とする。
この概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される概念の選択を簡略化した形式で導入するために提供されている。この概要は、請求される主題の主要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、請求される主題の範囲を示すものとして使用されることを意図したものでもない。
本開示の追加の特徴および利点は、続く説明で明記され、一部はその説明から明らかになるか、または本開示の実施によって知られ得る。本開示の特徴および利点は、添付の請求項で特に指摘された指示および組み合わせによって実現および取得され得る。本開示のこれらおよび他の特徴は、以下の説明および添付の請求項からより十分に明らかになるか、または以下に明記されるような開示の実施によって知られ得る。
本開示のこれらおよび他の本発明の特徴、態様、および利点は、以下の説明、添付の請求項、および添付の図面を参照してよく理解される。
本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 脱細胞化魚皮の形態での本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 脱細胞化魚皮の形態での本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 脱細胞化魚皮の形態での本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 脱細胞化魚皮の形態での本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 脱細胞化魚皮の形態での本開示による皮膚基材の実施形態を例示する。 本開示の実施形態による着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるさまざまな着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるさまざまな着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるさまざまな着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態による着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるさまざまな媒染して着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるさまざまな媒染して着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるさまざまな媒染して着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるさまざまな媒染して着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態によるｐＨグレーディング下で染色されたさまざまな着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の実施形態による着色した皮膚代替物を例示する。 コラゲナーゼへの曝露前後の本開示の実施形態による着色した皮膚代替物を例示する。 コラゲナーゼへの曝露前後の本開示の実施形態による着色した皮膚代替物を例示する。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置前後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置前後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置前後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置前後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の方法および実施形態による患者の創傷の処置の前、間、および後を示す。 本開示の実施形態による組織再生創傷処置を使用した創傷の処置の例示的な方法を示す。 本開示の実施形態による細菌阻害／減少アッセイの結果を例示する。 本開示の実施形態による細菌阻害／減少アッセイの結果を例示する。 本開示の実施形態による細菌阻害／減少アッセイの結果を例示する。 本開示の実施形態による皮膚移植片の比較を例示する。 本開示の実施形態による皮膚移植片の比較を例示する。 本開示の実施形態による皮膚移植片の比較を例示する。 架橋され、染色された足場材料の実施形態を示す。 架橋され、染色された足場材料の別の実施形態を示す。 架橋され、染色された足場材料の別の実施形態を示す。 架橋され、染色された足場材料の実施形態の染色堅牢度の比較を示す。 架橋され、染色された足場材料の実施形態の染色堅牢度の比較を示す。 架橋され、染色された足場材料の他の実施形態の染色堅牢度の比較を示す。 架橋され、染色された足場材料の他の実施形態の染色堅牢度の比較を示す。 架橋され、染色された足場材料の他の実施形態の染色堅牢度の比較を示す。 架橋され、染色された足場材料の他の実施形態の染色堅牢度の比較を示す。
図面は必ずしも縮尺通りに描かれているわけではない。代わりに、これらは、構成要素のよりよい理解を提供するために描かれており、範囲を限定することを意図したものではなく、例示的な説明を提供することを意図している。図面は、本開示による創傷処置およびその特徴およびサブ構成要素の例示的な構成を説明する。
本開示のさまざまな実施形態のよりよい理解は、同様の参照符号が同様の要素を指す添付図面とともに以下の説明から得られ得る。
本開示は、さまざまな修正および代替構造が可能であるが、特定の例示的な実施形態が以下に説明される図面に示されている。しかし、本開示を開示される具体的な実施形態に限定する意図はなく、逆に、本発明の意図は、本発明の精神および範囲内にあるすべての修正、代替構造、組み合わせ、および等価物を網羅するものであることが理解されるべきである。
使用される参考文献は、便宜上提供されているだけであり、したがって保護範囲や実施形態を定義するものではない。
用語が、記載された意味を持つように本出願において明示的に定義されていない限り、その単純なまたは通常の意味を超えて、明示的または間接的に、そのような用語の意味を制限する意図はないことが理解される。
具体的な機能を実施する「ための手段」または具体的な機能を実施する「ための工程」を明示的に述べていない請求項内の要素は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§ １１２で指定される「手段」または「工程」の節として解釈されるべきではない。
（１つまたは複数の）皮膚代替物
上記したように、創傷の治癒プロセスを助け、健康な皮膚の機能の少なくとも一部をより迅速に修復するために、多くのさまざまなタイプの皮膚代替物が使用され得る。皮膚代替物は、創傷の一時的または永久的な閉塞を可能にする要素または材料のグループとして広く考慮され得る。皮膚代替物は、概して、生物学的皮膚代替物、合成皮膚代替物、または生物学的皮膚代替物と合成皮膚代替物を含むハイブリッド皮膚代替物に分類することができる。
このような皮膚代替物の例が、図１Ａから１Ｆに示される。
図１Ａは、第１の細断された脱細胞化魚皮粒子１０２を含む、一実施形態による創傷処置の皮膚代替物１００の例を示す。図１Ｂは、第２の細断された脱細胞化魚皮粒子１１２を含む、一実施形態による創傷処置の皮膚代替物１１０の例を示す。図１Ｃは、第３の細断された脱細胞化魚皮粒子１２２を含む、一実施形態による創傷処置の皮膚代替物１２０の例を示す。図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃの実施形態では、脱細胞化魚皮足場材料は、生体適合性があるため、宿主によって組み込むことができる。このような市販の脱細胞化魚皮足場材料の例は、米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載されるように、野生で捕獲したタイセイヨウタラの最小限に加工された皮膚から作られる、ケレシス（Kerecis）社によるＯｍｅｇａ３（商標）Ｗｏｕｎｄである。
適用可能な皮膚代替物の他の例が、図１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆに示される。図１Ｄは、加工されたティラピアの魚皮から生成された皮膚代替物１３０の例を示す。ティラピアベースの皮膚移植片が、大型の皮膚移植片１３２、中型の皮膚移植片１３４、および小型の皮膚移植片１３６を含むさまざまなサイズで提供され得る。図１Ｅは、非メッシュ状のブタ皮膚移植片１４２およびメッシュ状のブタ皮膚移植片１４４を含むブタ皮膚移植片１４０の例を示す。皮膚代替物のさらなる例が図１Ｆに示されており、この場合、二重層組織１５２から形成された生体工学によって作られた皮膚代替物である合成皮膚代替物１５０が示されている。この非限定的な例では、合成皮膚代替物１５０の真皮層の二重層組織１５２は、生きたヒト新生児線維芽細胞で播種されたＩ型ウシコラーゲンゲルである。表皮は新生児の角化細胞である。細胞は、増殖因子、サイトカイン、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を活発に分泌する。このような合成皮膚代替物の非限定的な例としては、糖尿病性足潰瘍および静脈性下腿潰瘍を処置するために使用され得るＡｐｌｉｇｒａｆ（商標）が挙げられる。
ここで図２Ａおよび２Ｂを参照すると、脱細胞化魚皮片２００、２１０の例示的な実施形態が説明されている。米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載されるように作られた脱細胞化され魚皮２００の例示的な断面が、ユーザの手袋をはめた手２０２の大きさによって与えられたサイズで図２Ａに例示されている。脱細胞化魚皮２００のサイズは、当然限定されず、処置される創傷のサイズおよび形状に適合するように生成もしくは提供されるか、またはトリミングされ得る。さらに、示された脱細胞化され魚皮は非メッシュの魚皮であるが、メッシュの脱細胞化魚皮が使用されてもよい。
脱細胞化魚皮は、粒子化されるか、粉砕されるか、またはそうでなければさまざまなサイズおよび形状に加工され得ることが理解されるべきである。図２Ｂに示されるように、複数の脱細胞化魚皮シート２１０は、図２Ａの脱細胞化魚皮２００と同様のサイズおよび形状（たとえば長方形）にすることができるか、または図２Ｂに例示される脱細胞化魚皮シート２２０などの、より均一な寸法（たとえば、正方形）形状を有することができる。
図２Ａおよび２Ｂに示される脱細胞化魚皮足場２１０、２２０は、凍結乾燥された形態では実質的に硬質であり、非弾性である。脱細胞化魚皮足場は、その延性および／または弾性を増大させるように作用する１つまたは複数の酵素で処理することができる。いくつかの実施形態では、酵素は、創傷の保存および／または安定化にとって重要な健康的な特性に実質的に影響を与えることなく、相互接続された細胞外マトリックス成分を切断することによって作用する。いくつかの実施形態では、酵素は、エラスチン、プロテオグリカン、コラーゲン、または他の細胞外マトリックス材料内および／またはそれらの間の共有結合を切断するが、修飾された脱細胞化魚皮は、たとえその天然の三次元構造から部分的に除去されたとしても、細胞外マトリックスの内容物のかなりの部分を保持する。
いくつかの実施形態では、酵素処理は、足場材料としての修飾された脱細胞化魚皮の使用に悪影響を与える。しかし、驚くべきことに、足場材料としての機能の喪失が、創傷の保存および安定化の材料としての脱細胞化魚皮の使用にそれほど影響を及ぼさないことが理解されるべきである。したがって、材料の延性および／または弾性は、細胞外成分の組成を維持しながら高められ得、これが創傷治癒のための足場としての材料の使用に悪影響を与え得るにもかかわらず、修飾された脱細胞化魚皮は、それでもなお創傷の保存／安定化の材料として機能することができる。
脱細胞化魚皮足場は、粉砕されて、粒子の形態で提供され得る。個々の粉砕した粒子のサイズが、粉砕の種類および／または方法に応じて変化し得ることが理解されるべきである。たとえば、脱細胞化魚皮粒子は、指定されたサイズ未満の粒子を出力するように設計されたジェットミリングプロセスを介して作成することができる。いくつかの実施形態では、脱細胞化魚皮は、切断、細断、または粉砕されて粒子にされ、これは均一な粒子を作成するために測定される方法で行われ得るか、または大まかに行われてもよく、それによってさまざまな異なるサイズの粒子が生成される。
図２Ｃは、脱細胞化魚皮足場材料のシートをグラインダー、たとえば大麻グラインダーで砕くことによって結果として得られる、粒子化または粉砕された脱細胞化魚皮２３０の大きな粒子２３２の例示的な描写を例示する。図２Ｄは、本開示の実施形態による、脱細胞化魚皮足場材料のシートをグラインダーで砕くことによって得られる粒子化または粉砕された脱細胞化魚皮２４０の糸状の綿状繊維２４２の例示的な描写を例示する。図２Ｅは、脱細胞化魚皮足場材料のシートをグラインダー、たとえば大麻グラインダーで砕くことによって結果として得られる、粉砕された脱細胞化魚皮２５０の小さな、粉末状の粒子２５２の例示的な描写である。
実施形態では、創傷処置は、少なくとも１つの所定のサイズの粒子化された、特に細断された脱細胞化魚皮粒子であるか、またはそれを含む。粒子化された、すなわち細断された脱細胞化魚皮粒子は、２０１０年１０月６日に出願され、２０１３年１２月２４日に特許査定を受けた、米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載されるように、組織の修復および／または置換を促進するために、細胞の遊走、付着、増殖、および分化を支持するための足場材料を提供するように構成されている。
脊椎動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、細胞を取り囲み支持する複雑な構造実体である。ＥＣＭは、構造タンパク質の複雑な混合物で構成されており、その中で最も豊富に含まれるのはコラーゲンと、他の特殊なタンパク質およびプロテオグリカンである。本明細書に記載される足場材料は、魚皮からの天然の生物学的ＥＣＭ成分のほとんどインタクトな無細胞足場である。足場は、魚皮から天然に生じる脂質を含むこともできる。真皮ＥＣＭのネイティブな三次元構造、組成、および機能は、本質的に変化しておらず、細胞の遊走、付着、増殖、および分化を支持する足場を提供し、したがって組織の修復および／または置換を促進する。
本発明による足場材料は、インタクトな魚皮から得られる。硬骨魚や軟骨魚を含む、任意の種類の魚は、魚皮の供給源として使用することができる。たとえば、供給源は、タラ、ハドック、およびナマズのような丸い魚、オヒョウ、カレイ、およびヒラメのようなカレイ科、サケおよびマスなどのサケ科、マグロのようなサバ科、またはニシン、アンチョビ、サバ、およびイワシなどの小魚であり得る。特定の実施形態では、魚皮は、脂っこい冷水魚および／または大量のオメガ３油を含有することが知られている魚から得られる。オメガ３油を多く含む魚の例としては、サケ、マイワシ、マグロ、ニシン、タラ、イワシ、サバ、クロテン、ワカサギ、白身魚、ホキ、およびいくつかの種類のマスが挙げられる。
魚皮は加工前に魚から除去される。魚皮が鱗を有する種類の魚からのものである場合、鱗の大部分が除去されるか、または少なくともヒドロキシアパタイトが鱗から除去されるように、魚皮の鱗は除去されなければならない。「鱗の大部分が除去される」または「鱗を実質的に含まない」という表現は、魚皮上の鱗の少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％が除去されることを意味している。「実質的に鱗を含まない」魚皮はまた、鱗のない魚種からの魚皮を指し得る。鱗は、すべての処理の前に、純粋に機械的圧力（たとえば、ナイフ、研磨剤を用いた振盪、水圧、ナイフと同じ機械力を使用する特別な鱗除去装置、またはセラミックもしくはプラスチックで研磨するような他の圧力装置を介する）を用いて、または何らかの化学処理（たとえば脱細胞化）後に、鱗を洗い流すために機械的圧力を用いて除去される。魚皮が、最初に化学的および／または酵素的に処理される場合（たとえばＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００による処理）、脱細胞化後に裂傷を受けやすいため、機械的圧力は概して穏やかである必要がある。鱗は、１つを超える工程で除去することができ、たとえば、脱細胞化の前に部分的に除去し、続いて脱細胞化の間および／または後にさらに除去することができる。代替的に、化学処理単独で鱗を除去することもできる。
鱗が除去された後、魚皮は、随意に脱細胞化の前に冷凍される。魚皮は、足場のコラーゲン構造を保存するために、液体窒素中で皮膚をインキュベートするか、または皮膚を－７０℃以下に凍結することができる他の特殊な冷凍装置を使用することによって急速に冷凍することができる。代替的に、魚皮は、水産工場で典型的に見られる従来型の冷凍庫で冷凍することもできる。冷凍プロセスは、インタクトな魚皮を含む細胞を溶解または部分的に溶解し、魚皮の脱細胞化を促進するのに役立ち得る。魚皮は、冷凍されている場合、後にさらに加工するために解凍することができる。
魚皮は、冷凍されているかどうかに関係なく、さらなる処理の前に緩衝液で洗浄することができる。たとえば、魚皮は、１つまたは複数の抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸（５０ｍＭのアスコルビン酸など）、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、およびベータカロテン）、抗生物質（たとえば、ストレプトマイシンおよびペニシリン）、プロテアーゼ（たとえばディスパーゼＩＩ）、およびプロテアーゼ阻害剤（たとえば、アンチパイン、アプロチニン、ベンズアミジン、ベスタチン、ＤＦＰ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ロイペプチン、ペプスタチン、ホスホラミドン、およびＰＭＳＦ）を随意に含有する緩衝液で１～３回洗浄して、魚皮の消毒および安定化を促進することができる。緩衝液は、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０以上などの、少なくとも５．５のｐＨであり得る。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０～９．０、たとえば７．５～８．５の間である。緩衝液は、魚皮を数日間から数週間以上保存することができる培地として使用することもできる。特定の実施形態では、魚皮は緩衝液中に約４℃の温度で保存される。
凍結および／または洗浄および／または緩衝液中での保存後、魚皮は、１つまたは複数の脱細胞化溶液を用いて、天然に生じる細胞外マトリックスの機械的および構造的完全性および生物学的活性に対する損傷を最小限に抑えて、またはまったく与えずに、抗原性物質を含む細胞材料を魚皮から除去するように処理される。
本明細書で使用されるような「細胞外マトリックス」または「ＥＣＭ」という用語は、さまざまな他の重要な機能を実施することに加えて、皮膚細胞に対する構造的支持を提供する、魚皮内に存在する非細胞組織材料を指す。本明細書に記載されるＥＣＭは、抽出、精製、または分離されたＥＣＭ成分（たとえばコラーゲン）から完全に構成または再形成されたマトリックス材料を必ずしも含むわけではない。しかし、いくつかの実施形態では、皮膚代替物として使用されるＥＣＭは、抽出、精製、または分離されたＥＣＭ成分（たとえばコラーゲン）から完全に構成または再形成されたマトリックス材料を含み得る。
本明細書で使用されるような「無細胞」、「脱細胞化」、「脱細胞化魚皮」などの用語は、相当量の細胞内容物および核酸内容物が除去されて、ＥＣＭの複雑な三次元間質構造を残す、魚皮を指す。実施形態では、「脱細胞化魚皮」は、相当量の細胞内容物および核酸内容物を含まないＥＣＭの複雑な三次元間質構造に加えて、オメガ３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む、魚皮をさらに含み得る。
「脱細胞化剤」は、ＥＣＭから相当量の細胞内容物および核酸内容物を除去するのに有効な薬剤である。ＥＣＭは、生存可能な核酸および生存不可能な核酸および他の細胞材料の少なくとも５０％がＥＣＭから除去された場合に、細胞内容物および核酸内容物が「脱細胞化されている」か、またはそれらを「実質的に含まない」（すなわち、「相当量」が除去されている）。特定の実施形態では、生存可能な核酸および生存不可能な核酸および細胞材料の約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％が除去される。脱細胞化は、たとえば、処理された魚皮のＤＮＡ含有量を検査することによって確証することができる。ＥＣＭからの核酸の除去は、たとえば、ＥＣＭの組織学的検査、および／またはＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（登録商標）アッセイ、ジフェニルアミンアッセイなどの生化学的アッセイ、またはＰＣＲによって判定することができる。
脱細胞化は、細胞膜を破壊し、細胞内容物を放出する。脱細胞化には、１つまたは複数の物理的処理、１つまたは複数の化学的処理、１つまたは複数の酵素的処理、またはそれらの任意の組み合わせが伴い得る。物理的処理の例としては、超音波処理、機械的撹拌、機械的マッサージ、機械的圧力、および凍結／解凍などが挙げられる。化学的脱細胞化剤の例としては、イオン性塩（たとえばアジ化ナトリウム）、塩基、酸、洗剤（たとえば、非イオン性およびイオン性洗剤）、酸化剤（たとえば、過酸化水素および過酸）、低張溶液、高張溶液、キレート剤（たとえば、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ）、有機溶媒（たとえばリン酸トリ（ｎ－ブチル））、アスコルビン酸、メチオニン、システイン、マレイン酸、およびＤＮＡに結合するポリマー（たとえば、ポリ－Ｌ－リジン、ポリエチルイミン（ＰＥＩ）、およびポリアミンドアミン（ＰＡＭＡＭ））が挙げられる。非イオン性洗剤は、４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含む。イオン性洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－２００、および両性イオン性洗剤（たとえばＣＨＡＰＳ）を含む。他の適切な脱細胞化洗剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートおよびポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ２０および８０）、３－［（３－クロラミドプロピル）－ジメチルアミノ］－１－プロパン－スルホネート、オクチル－グルコシド、およびドデシル硫酸ナトリウムを含む。酵素的脱細胞化剤の例としては、プロテアーゼ、エンドヌクレアーゼ、およびエキソヌクレアーゼが挙げられる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ（たとえばトリプシン）、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ（たとえばサーモリシン）、およびグルタミン酸プロテアーゼを含む。脱細胞化は、概して、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０以上などの、少なくとも５．５のｐＨで実行される。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０～９．０、たとえば７．５～８．５の間である。
脱細胞化工程の例は、１ＭのＮａＣｌ、２％のデオキシコール酸、０．０２％のアジ化ナトリウム、および５００ｐｐｍストレプトマイシンを含む溶液中で魚皮をインキュベートする工程である。別の例では、魚皮は、プロテアーゼ（たとえば、２．５Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩ）および他の成分（たとえば、０．０２％アジ化ナトリウム）を含む第１の脱細胞化溶液でインキュベートされる。第１の脱細胞化溶液は注ぎ出され、魚皮は、その後、洗剤（たとえば、０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）および他の成分（たとえば、０．０２％のアジ化ナトリウム）を含む溶液などの第２の脱細胞化溶液で処理される。別の例では、魚皮は、最初に、他の成分（たとえば、０．０２％のＥＤＴＡ、アジ化ナトリウム、および／またはデオキシホル酸）とともに洗剤（たとえば、０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）を含む脱細胞化溶液で処理され、その後、ＳＤＳなどの洗剤を含む第２の脱細胞化溶液中でインキュベートされる。
魚皮は、振盪しながら培養されても、されなくてもよい。（１つまたは複数の）脱細胞化工程は、必要に応じて、残りの脱細胞化溶液を注ぎ出し、随意に緩衝液（たとえばハンクス平衡塩類溶液）で魚皮を洗浄し、その後、別の脱細胞化工程で魚皮を再度処理することによって繰り返すことができる。十分な量の細胞材料が除去されると、（たとえば、吸引によって、または溶液を穏やかに注ぎ出すことによって）脱細胞化溶液を除去することができる。
脱細胞化後、魚皮は、随意に、水、緩衝液、および／または塩溶液で洗浄することができる。適切な洗浄液の例としては、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９（Ｍ１９９、ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、および／またはＬ－グルタミンが挙げられる。（１つまたは複数の）洗浄工程は、概して、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０以上などの、少なくとも５．５のｐＨで実行される。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０～９．０、たとえば７．５～８．５の間である。
最終生成物の外観を改善するために、随意に魚皮を漂白することができる。漂白は、脱細胞化の前、後、および／または脱細胞化と同時に実行することができる。たとえば、１つまたは複数の漂白剤は、脱細胞化溶液の１つまたは複数および／または１つまたは複数の緩衝液に組み込むことができる。漂白剤の例としては、亜硫酸ナトリウム、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、および過硫酸ナトリウムが挙げられる。特定の実施形態では、（１つまたは複数の）過硫酸塩のような強力な漂白剤が使用される場合、漂白および脱細胞化は、１つまたは複数の漂白剤、増粘剤、および過酸化物源の混合物中で魚皮をインキュベートすることを含む単一工程で組み合わせることができる。たとえば、乾燥漂白混合物を調製して（たとえば、実施例５に記載される「漂白混合物」を参照）、続いて、水、過酸化水素、またはそれらの組み合わせを乾燥混合物に加えて、脱細胞化にも十分であり得る漂白溶液を形成することができる。漂白剤（たとえば、亜硫酸ナトリウム、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、および過硫酸ナトリウム）は、約４０～６０％ｗ／ｗの乾燥混合物であるべきである。ＥＤＴＡと過硫酸塩との組み合わせは混合物に加えられて、漂白の他に脱細胞化も加速させ得る。
特定の実施形態では、乾燥混合物中のＥＤＴＡの濃度は、約０．２５～５％ｗ／ｗである。過酸化水素は混合物の約１５～２５％になり得、過酸化物源は過炭酸ナトリウムおよび過炭酸カリウムであり得る。リン酸ナトリウム過水和物および炭酸ナトリウムまたはメタケイ酸マグネシウムおよびケイ酸ケイ酸も過酸化物源として使用することができる。乾燥混合物はまた、たとえば、１～１０％ｗ／ｗのシリカおよび水和シリカ、および随意に１つまたは複数のステアリン酸塩（たとえばステアリン酸アンモニウム、ステアリン酸ナトリウム、および／またはステアリン酸マグネシウム）を含むことができる。加えて、乾燥混合物は、随意に、漂白／脱細胞化溶液の粘度を高め、タンパク質繊維を損傷から保護するために、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン（すなわちアルギン酸塩）、有機ガム（たとえば、セルロース、キサンタンガム）、メタケイ酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせなどの、増粘剤を含むことができる。漂白、および／または漂白＋脱細胞化は、概して、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０以上などの、少なくとも５．５のｐＨで実行される。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０～９．０、たとえば７．５～８．５の間である。漂白および／または漂白＋脱細胞化の後、魚皮は、随意に、上記したｐＨ条件下でＬ－グルタミンを含む溶液で洗浄される。
特定の実施形態では、魚皮は消化酵素で処理される。漂白と同様に、消化は、脱細胞化の前、後、および／または脱細胞化と同時に実行することができる。適切な酵素は、プロテアーゼ、たとえば、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼを含む。特定の実施形態では、消化酵素はトリプシンなどのセリンプロテアーゼである。消化酵素は、アルカリ環境で機能し、ＥＣＭ内の架橋を制限し、魚皮を軟化する酵素であり得る。消化は、概して、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０以上などの、少なくとも５．５のｐＨで実行される。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０～９．０、たとえば７．５～８．５の間である。
脱細胞化魚皮は、随意に、凍結保存することができる。凍結保存には、凍結前に魚皮を凍結保護剤溶液に浸漬することが伴い得る。凍結保護剤溶液は、概して、適切な緩衝剤、１つまたは複数の凍結保護剤、および随意に溶媒、たとえば水と組み合わせて膨張および収縮を最小限に抑える有機溶媒を含む。凍結保護剤の例としては、スクロース、ラフィノース、デキストラン、トレハロース、ジメチルアセトアミド、メチルスルホキシド、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、２－メチル－２，４－パンタンジアール（pantandial）、特定の不凍タンパク質およびペプチド、およびそれらの組み合わせが挙げられる。代替的に、凍結工程中に形成される氷の結晶を最小限に抑えるために昇華前に脱細胞化魚皮が急速冷凍（瞬間冷凍）される場合、魚皮は、随意に、凍結保護剤を含まない緩衝液中で冷凍することができる。冷凍保存は、概して、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０以上などの、少なくとも５．５のｐＨで実行される。特定の実施形態では、ｐＨは、７．０～９．０、たとえば７．５～８．５の間である。
脱細胞化魚皮は、ガラスバイアルやパウチなどの滅菌容器内に包装することができる。一実施形態では、ＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチが使用される。たとえば、魚皮は、凍結保護剤溶液中でインキュベートされ、ＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチに包装され、その後、凍結乾燥機に入れて、凍結保護剤と適合する速度で冷凍させることができる。
脱細胞化魚皮は、氷が再結晶化することなく各氷結晶相から水が順次除去されるように、低温および真空条件下で凍結乾燥、すなわち、凍らせることができる。凍結乾燥中、水は、概して、最初に昇華によって除去され、その後、必要に応じて脱着によって除去される。処理後および滅菌前に余分な水を除去する別の方法は、真空プレス成形である。
特定の実施形態では、脱細胞化魚皮は、冷凍の前および／または後に滅菌される。滅菌方法は当該技術分野で周知である。たとえば、脱細胞化魚皮を、エチレンオキシドチャンバに入れ、エチレンオキシドの適切なサイクルで処理することができる。他の滅菌方法には、オゾン、二酸化炭素、ガス状ホルムアルデヒド、または放射線（たとえば、ガンマ線、Ｘ線、電子線処理、および亜原子粒子）による滅菌を含む。
水の冷凍、冷凍乾燥、および／または真空プレス成形の代替として、またはそれに加えて、脱細胞化魚皮を、アルコールなどの非水溶液中で保存することができる。
結果として得られた生成物（足場材料）は、組織の再生、修復、および／または置換（たとえば、内因性組織の修復、再生、および／または増殖）を促進し得る特性を持つ、無菌の、コラーゲンベースのマトリックスである。魚皮に関連する「足場材料」という用語は、上で論じたように、脱細胞化され、随意に漂白、消化、凍結乾燥などをされた魚皮を含む材料を指す。足場材料は、内皮細胞および／または上皮細胞を支持するためのインタクトな足場を提供することができ、宿主によって組み込まれ得、生体適合性があり、著しく石灰化することはなく、周囲温度で保存および輸送することができる。「宿主によって組み込まれる」という表現は、本明細書では、足場材料で処置されている患者の細胞および組織が足場材料内で増殖することができ、足場材料が実際に患者の体内に組み込まれる／吸収されることを意味している。「生体適合性」という用語は、その使用目的のインビボ環境において実質的に無毒であり、患者の生理系によって実質的に拒絶されない（すなわち、非抗原性である）材料に言及する。
これは、「Use of International Standard ISO-10993,Biological Evaluation of Medical Devices Part 1:Evaluation and Testing」と題された、国際標準化機構（ＩＳＯ）規格番号１０９９３および／または米国薬局方（ＵＳＰ）２３および／または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）青本備忘録番号Ｇ９５－１に明示された生体適合性試験に合格する材料の能力によって測定することができる。典型的に、これらの試験では、材料の毒性、感染性、発熱性、刺激性、反応性、溶血活性、発癌性、および／または免疫原性が測定される。生体適合性の構造または材料は、大多数の患者に導入された場合でも、深刻に有害で、長期にわたる、または増大する生物学的反応または応答を引き起こすことはなく、典型的に異物の手術または生存生物への移植に伴う、軽度で一時的な炎症とは区別される。
足場材料は、魚皮の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からのタンパク質を含有している。足場材料内のＥＣＭ成分は、たとえば、構造タンパク質、接着性糖タンパク質、プロテオグリカン、非プロテオグリカン多糖類、およびマトリックス細胞タンパク質を含むことができる。構造タンパク質の例としては、線維状コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＸＩ型）、ファシットコラーゲン（ＩＸ、ＸＩＩ、およびＸＩＶ型）、短鎖コラーゲン（ＶＩＩＩおよびＸ型）、基底膜コラーゲン（ＩＶ型）、および他のコラーゲン（ＶＩ、ＶＩＩ、およびＸＩＩＩ型）などのコラーゲン（ＥＣＭ中で最も豊富なタンパク質）、エラスチン、およびラミニンが挙げられる。接着性糖タンパク質の例としては、フィブロネクチン、テネイシン、およびトロンボスポンジンが挙げられる。プロテオグリカンの例としては、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラタン硫酸が挙げられる。非プロテオグリカン多糖類の例としては、ヒアルロン酸が挙げられる。マトリックス細胞タンパク質は、細胞表面受容体、サイトカイン、増殖因子、プロテアーゼ、およびＥＣＭとの相互作用を介して細胞機能を調節する、構造上多様な群の細胞外タンパク質である。その例としては、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）１および２、テネイシン、およびＳＰＡＲＣ（酸性でシステインが豊富な分泌タンパク質）が挙げられる。
特定の実施形態では、脱細胞化（および他の随意の処理工程）において、魚皮の脂質層から天然に生じる脂質のすべてが除去されるわけではない。したがって、足場材料は、魚皮、特に魚皮の脂質層から１つまたは複数の脂質を含むことができる。たとえば、足場材料は、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、または２４％ｗ／ｗの脂質などの、（凍結乾燥後の足場材料全体の乾燥重量の）最大で約２５％ｗ／ｗの脂質を含み得る。足場材料中の脂質の存在は、たとえば、有機溶媒抽出およびそれに続くクロマトグラフィーによって確認することができる。適切な有機溶媒の例としては、アセトンおよびクロロホルムが挙げられる。
足場材料中の脂質は、たとえば、脂肪酸アシル（すなわち、脂肪酸、それらの複合体、および誘導体）、グリセロ脂質、グリセロリン脂質（すなわちリン脂質）、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド、ステロール脂質（すなわちステロール）、特定の脂溶性ビタミン、プレノール脂質、および／またはポリケチドを含むことができる。脂肪酸アシルの例としては、多価不飽和脂肪酸などの飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アミド、およびエイコサノイドが挙げられる。特定の実施形態では、脂肪酸は、（魚油中に高濃度で見られる）エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのオメガ３脂肪酸を含む。魚油に見られる他の脂肪酸は、アラキジン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、ベヘン酸、エルカ酸、およびリグノセリン酸を含む。グリセロ脂質の例としては、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロール（すなわち、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド）などのモノ、ジ、およびトリ置換グリセロールが挙げられる。グリセロリン脂質の例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルセリンが挙げられる。スフィンゴ脂質の例としては、リンスフィンゴ脂質およびスフィンゴ糖脂質が挙げられる。ステロール脂質の例としては、コレステロール、ステロイド、およびセコステロイド（さまざまな形態のビタミンＤ）が挙げられる。プレノール脂質の例としては、イソプレノイド、カロテノイド、およびビタミンＥやＫなどのキノン類ならびにハイドロキノン類が挙げられる。
足場材料は、抗生物質、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、および抗炎症剤などの、１つまたは複数の追加の活性剤（すなわち、足場材料の加工の間または後に加えられる薬剤）を含有することができる。活性成分は、抗酸化剤または薬剤などの、創傷ケアおよび／または組織治癒を促進する化合物または組成物であり得る。これはまた、タンパク質またはタンパク質類および／または他の生物学的物質であり得る。抗生物質、防腐剤、および抗菌剤は、足場材料に効果的な抗菌特性を提供するのに十分な量で加えることができる。特定の実施形態では、抗菌剤は、銀、金、白金、銅、亜鉛、またはそれらの組み合わせなどの、１つまたは複数の抗菌金属である。たとえば、銀は、イオン、金属、元素、および／またはコロイドの形態で加工中に足場材料に加えられ得る。銀は他の抗菌剤と組み合わせてもよい。抗炎症剤は、足場材料が適用される創傷または組織の領域で炎症を軽減および／または抑制するのに十分な量で加えることができる。
足場材料は乾燥した形態で使用することができる。代替的に、足場材料は使用前に再水和することもできる。特定の実施形態では、１つまたは複数の足場材料は一緒に積層されて、より厚い足場材料が形成される。
概して、足場材料は、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、または３．５ｍｍの厚さなどの、約０．１～４．０ｍｍの厚さ（すなわち、断面での厚さ）である。厚さは、出発材料として使用される魚の種類、加工、凍結乾燥、および／または再水和など、多数の要因に依存し得る。もちろん、製品が足場材料の１つを超える層を含む場合、厚さは比例して大きくなる。
創傷処置および方法の実施形態の細断された脱細胞化魚皮粒子は、利点として、創傷の形状によく適応するように創傷に対して形成または加えられるように構成されながら、内因性組織などの組織の再生、修復、および／または増殖を促進し得る特性を持つ、無菌の、コラーゲンベースのマトリックスを提供する。実施形態では、細断された脱細胞化魚皮粒子は、シートベースの材料を使用した場合には利用することができない方法で、侵食されたまたはトンネル状の創傷などの創傷に詰め込まれるように構成されている。すなわち、細断された脱細胞化魚皮粒子は、組み込みを促進するように構成され得る、すなわち、足場材料で処置されている患者の細胞および組織が足場材料内に増殖することができ、足場材料が実際に患者の身体内に組み込まれる／吸収されるように構成され得る。
実施形態による細断された脱細胞化魚皮粒子は、実施形態において、細胞の内方成長および血管新生など、創傷治癒／修復に関与する細胞に浸潤するための物理的足場として、創傷治癒を積極的に促進するように構成され得る。創傷処置の実施形態の細断された脱細胞化魚皮粒子は、利点として、たとえば組織学的分析に関して認識可能な細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）を有する脱細胞化魚皮の三次元（「３Ｄ」）構造を保持するように構成されている。細断された脱細胞化魚皮粒子の寸法は、創傷治療に対する既存のアプローチよりも高い精度で、細断された脱細胞化魚皮粒子を創傷腔内に成形、包装、またはそうでなければ適用することを促進するようにさらに構成され得る。
実施形態では、細断された脱細胞化魚皮粒子は、所定のサイズ閾値の最大値、および脱細胞化魚皮のマトリックス構造を保存し、かつ創傷内への細胞の再生性内方成長を促進するのに有効であるサイズ閾値の最小値の範囲内の最大寸法を有する。すなわち、細断された脱細胞化魚皮粒子の長さ、幅、および／または厚さのうちの最大の寸法などの、最大寸法は、１ｍｍなどの最大サイズより小さくなり得、ＥＣＭが破壊されるサイズなどの最小サイズより大きくなり得る。実施形態では、細断された脱細胞化魚皮粒子は、上記したような脱細胞化魚皮シートを提供し、その後、脱細胞化魚皮シートを細断し、随意に、細断された脱細胞化魚皮粒子が所定の最小および最大サイズ閾値内になるまで、細断された粒子を篩い分けることによって得られる。
細断された脱細胞化魚皮粒子は、それらの寸法を考慮してせん断力に抵抗するようにさらに構成することができ、したがって、細断された脱細胞化魚皮粒子により、場所や環境間を移動する、または移動させられる患者に対する、または回復中の歩行などの患者の通常の活動中に、改善された創傷処置を提供することが可能になる。
実施形態の細断された脱細胞化魚皮粒子は、利点として、創傷に局所適用および／または移植されて、細胞の内方成長および血管新生のための足場を提供することができ、癒着バリア、軟組織修復、裂開防止などの、組織足場形成の恩恵を含む追加の恩恵をさらに提供することができる。
（１つまたは複数の）着色剤
着色剤のさまざまな例が考えられる。本明細書で企図される着色剤は、その最も広い意味で、治癒プロセス中の創傷内の状態の変化または皮膚代替物への変化に基づいて、色が変化または消失する皮膚代替物に色を提供する、着色剤、または色剤または着色剤の組み合わせである。好ましい実施形態では、着色剤は、創傷内で１つまたは複数のプロテアーゼによる攻撃により分解する。このような着色剤を用いると、色剤は、１つまたは複数のプロテアーゼによって分解すると、その色を消失する。たとえば、着色剤は、皮膚代替物に青または紫の色を提供し得る。しかし、皮膚代替物および着色剤を含む創傷処置の適用後に創傷内の１つまたは複数のプロテアーゼによる攻撃を受けると、創傷処置の皮膚代替物の色も分解または消失され、それによって、適用された創傷処置の色は、皮膚代替物の元の色または別の色に変化する。しかし、着色剤の色の変化は、これに限定されず、創傷内の状態の変化に伴う色ずれも含み得る。たとえば、着色剤によって提供された色は、着色剤の適用または添加によって皮膚代替物の元の色が変化しないように誘発され得る。しかし、着色剤の色の変化は、創傷内の状態の変化によって誘発されるか、または引き起こされ得、それによって、創傷処置の皮膚代替物を、新しい色、または皮膚代替物の元の色とは異なる色に変える。
着色剤として染料が使用されてもよい。着色剤の好ましい例は、メチレンブルー（ＭＢ）などのチアジン染料である。メチレンブルー（ＭＢ）の構造は以下に提供される：
Figure 2024510837000002
メチレンブルー（ＭＢ）は、塩化メチルチオニニウムまたはベーシックブルー９とも呼ばれる。ＭＢは、布地の染色、医療、研究などのさまざまな用途に使用されるカチオン性チアジン染料である。これは、数時間かけて最大２ｍｇ／ｋｇの用量でメトヘモグロビン血症の処置に使用される。
着色剤の別の実施形態は、トリアリールメタン染料である。好ましいトリアリールメタン染料の例は、以下の構造を有するゲンチアナバイオレット（ＧＶ）である：
Figure 2024510837000003
ゲンチアナバイオレット（ＧＶ）は、クリスタルバイオレット、メチルバイオレット１０Ｂ、またはヘキサメチルパラロスアニリンクロリドとしても知られており、グラム染色法における組織学的染色に一般的に使用されるトリアリールメタン色素である。局所用ゲンチアナバイオレット（Ｖ）は、特定のタイプの口腔内の真菌感染症（鵞口瘡）および皮膚の真菌感染症を処置するために使用される。
着色剤の別の実施形態は、以下の構造を有するブリリアントブルーＦＣＦ（ＢＢ－ＦＣＦ）である：
Figure 2024510837000004
Ｂｌｕｅ Ｎｏ．１とも呼ばれる、ブリリアントブルーＦＣＦ（ＢＢ－ＦＣＦ）は、主に、加工食品、医薬品、栄養補助食品、および化粧品のための青色着色剤として使用されるトリアリールメタン染料である。これは、ＦＤＡが承認した最も古い着色添加剤の１つであり、概して、無毒で安全であると考えられている。
着色剤の別の実施形態は、以下の構造を有するインジゴカルミン（ＩＣ）である：
Figure 2024510837000005
フードブルー１とも呼ばれる、インジゴカルミン（ＩＣ）は、化合物を水溶性にする、芳香族スルホン化によってインジゴから導出された有機塩である。これは、１１．４未満のｐＨでは青色であり、１３．０を超えるｐＨではと黄色であり、還元されると黄色に変わる酸化還元指示薬としてさらに使用することもできる。
以下を含む他の染料化学物質または染料混合物が使用されてもよく、本発明者らによって検討されている：
大青の抽出液のＩＮＣＩ（化粧品原料国際命名法）を有する、Ｔｈｅ Ｗｏｏｌｅｒｙが提案する羊毛染料である、Ｗｏａｄ Ｐｏｗｄｅｒ（ＨＵＥ－３０２３）。これは、糸および衣類に一般的に使用される染料化学物質であり、通常はアルカリ環境での染色に使用される。Ｗｏａｄ Ｐｏｗｄｅｒは、ケラチンタンパク質に結合する能力を持つ粉末の性質により有用な着色剤と考えられ得る。
着色添加剤、Ｄ＆Ｃ Ｇｒｅｅｎ ＃５ Ｐｏｗｄｅｒ ＡＮ０７２５は、天然源から作られ、概して化粧品に使用される。この着色添加剤のＩＮＣＩ名は、Ｇｒｅｅｎ Ｎｏ．５である。粉末は乾燥粉末状の水系染料である。これは、粉末状のその典型的な水系化粧品の色により着色剤として選択され得る。
着色添加剤、Ｕｌｔｒａ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｌｕｅ Ｈ９－０３Ｒ１は、（リップ製品用でない）アイメイクアップ、石鹸、ローションを含む化粧品に使用される。この着色添加剤は、天然資源に基づいており、Ｕｌｔｒａｍａｒｉｎｅ Ｎａ６Ａｌ６Ｓｉ６Ｏ２４Ｓ４のＩＮＣＩ名を有する。この着色添加剤は、油分散性顔料であり得、水や油に溶解せず、ＣＡＳ番号：５７４５５－３７－５を有する。これは、染色力が強く、化粧品で非常に効果的であると評価され、化粧品に入れると水や油に溶解しないため、色剤として選択され得る。しかし、この着色添加剤は、望ましくない物質の残留物を含み得るため、考慮する必要がある。
着色添加剤液体、ＦＤ＆Ｃブルー＃１は、化粧品、石鹸、バスソルト、およびバスボムに使用される。これは、天然資源から作られており、Ｂｌｕｅ Ｎｏ．１のＩＮＣＩ名を有する。この着色添加剤は、予め混合された水系染料として提供され得る。これは、典型的な化粧品用の水溶性液体染料である。
着色添加剤液体、Ｄ＆Ｃグリーン＃５も、化粧品、石鹸、バスソルト、バスボムに使用される。これは、天然資源から作られており、Ｇｒｅｅｎ Ｎｏ．５のＩＮＣＩ名を有する。この着色添加剤は、予め混合された水系染料として提供され得る。これは、典型的な化粧品用の水溶性液体染料である。
着色添加剤液体、Ｄ＆Ｃグリーン＃６オイルＡＭ４２９９も、化粧品、石鹸、バスソルト、バスボムに使用される。これは、天然資源から作られており、Ｇｒｅｅｎ Ｎｏ．６およびカプリル酸／カプリン酸トリグリセリドのＩＮＣＩ名を有する。この着色添加剤は、保存寿命を長くするために、たとえば分画されたココナッツオイルにおいてブレンドされた、予め混合された油性液体染料に提供される。この染料は、油性染料とよりよく反応する製品として考えられ得、後に、洗浄工程によく耐え、水和に溶解しない。しかし、この染料を使用する場合は、患者に刺青効果をもたらす可能性のある創傷の永久的な着色を軽減するまたはそれに対処する手段を考慮する必要があることが留意されるべきである。
グリーン濃縮食品用着色料（Green Concentrated Food Coloring）は、Ｒａｙｎｅｒによって製造された食品用着色料である。これは、Ｗａｔｅｒ、タートラジン（Ｅ１０２）（１．８７％）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ ＦＣＦ（Ｅ１３３）（０．１３％）、酢酸のＩＮＣＩ名を有する。これは、予め混合された水性の液体食用色素混合物として提供されるため、着色剤であると考えられ得る。染料混合物は無害な染料混合物であると考えられる。
ガルニエ ナチュラル カラー（Garnie natural Color）、マホガニーブラウンは、アクア、デセス－３、アルレス－１２、コカミドミパ、オレス－３０、水酸化アンモニウム、デセス－５、グリセリン、オレイン酸、オレイルアルコール、ヘキサジメトリンクロリド２、４－ジアミノフェノキシエタノールＨＣｌ（４－ｄｉａｍｉｎｏｐｈｏｎｅｘｙｅｔｈａｎｏｌ ＨＣｌ）、ｐ－アミノフェノール、ｍ－アミノフェノール、アスコルビン酸、ヒドロキシエチルセルロース、メタ重亜硫酸ナトリウム、エタノールアミン、コムギ胚芽油、小麦胚芽油、チオグリセリン、ポリクオタニウム－６、トルエン－２、５－ジアミン、ポリクオタニウム－６７、２－メチル－５－ヒドロキシエチルアミノフェノール、チオ乳酸アンモニウム、シモンシア・キネンシス油（simmondsia chinensis oil）、ホホバ種子油、イソプロパノールアミン、レゾルシノール、ＥＤＴＡ、パルファムの成分を有する、Ｇａｒｎｉｅｒによって製造された毛髪着色料である。この染料は、予め混合されたヘアカラーキットとして市販されている。この染料は、タンパク質と結合するように製剤されており、足場または皮膚代替物のコラーゲンと反応するため、着色剤の別の実施形態である。
ＥＬＥＡによって製造された毛髪着色料である、ＥＬＥＡ、カラー＆ケア、ブラック。これは、アクア、セテライルアルコール、アンモニアセテレト－２０、塩化セトリモニウム、コカムドプロピルベタタン、オレイン酸、プロピレングリコール、ＰＥＧ－４０、硬化ヒストロール油、ｐ－フェニレンジアミン、２，４－ジアミノフェノキシエタノール、ＨＣｌ、ヴィティス・ヴィニフェラ（vitis vinferia）種子油、メタ重亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸、パルファム、クマリン、リモネン、リナロール、レゾルシノール、テトラナトリウムＥＤＴＡの成分を有している。この染料は、タンパク質と結合するように製剤されており、足場または皮膚代替物のコラーゲンと反応するため、着色剤の別の実施形態である。
着色剤のさまざまな例および実施形態が本明細書で提供されるが、考えられる着色剤のこの説明は、染料または着色添加剤のいずれかとして、すべての考えられる着色剤を網羅するものではなく、そのようにみなされるべきではない。
皮膚代替物への着色剤の添加
好ましい実施形態として、皮膚代替物に加えられる着色剤として、メチレンブルー（ＭＢ）、ゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、またはメチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）の組み合わせが使用される。
メチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）を組み合わせて使用する実施形態では、メチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）は等しい重量比で一緒に使用されている。しかし、他の実施形態では、メチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）は異なる重量比で一緒に使用されている。他の実施形態では、これらの染料、メチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、および他の染料のうちの２つまたはそれ以上の任意の組み合わせが含まれる。例示的な方法および実施形態が以下に説明される。
第１の実施形態では、アイスランド原産の野生で捕獲されたタイセイヨウタラの最小限に加工された皮膚から作られた脱細胞化魚皮足場材料が、皮膚代替物として提供される。簡潔にするために、以下のサブセクションでは、別段の明記がない限り、アイスランド原産の野生で捕獲されたタイセイヨウタラの最小限に加工された皮膚から作られたこの足場材料は、皮膚代替物の実施形態として提供される「足場」または「足場材料」と呼ばれる。
以下は、１つまたは複数の着色剤を足場に加えて、（１つまたは複数の）着色剤の堅牢度を高めるための方法の説明である。
好ましい実施形態として、メチレンブルー（ＭＢ）および／またはゲンチアナバイオレット（ＧＶ）の着色剤を足場に加えるための一般的なプロセスが使用される。
例示的な手順では、０．００１重量％の各着色剤（ＭＢおよびＧＶ）（合計で０．００２重量％または２つの染料（ＭＢおよびＧＶ）を使用した場合は２０ｍｇ／Ｌ）を含有する脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する）のいずれかに基づいた、１００ｍＬの染料溶液を使用した。約４×４ｃｍの寸法および０．２５～０．３０ｇの重量の冷凍乾燥した足場片を溶液に加え、３時間放置する。その後、Ｋｒｏｍａ足場を溶液から取り出し、水道水で洗浄した後、脱イオン水ですすぎ、冷凍する。結果として得た染色足場３００を図３に示す。
上記したようにＭＢおよびＧＶを使用した場合、足場中の両方の色素の合計量は約１ｍｇ／ｇである。まったく同じ方法を、水またはＰＢＳ溶液中の同じ総濃度（０．００２重量％）または染料濃度（０．００１重量％）当たりで、上述の４つの染料（メチレンブルー（ＭＢ）、ゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、ブリリアントブルーＦＣＦ（ＢＢ－ＦＣＦ）、およびインジゴカーミン（ＩＣ））の任意の組み合わせ、またはこれらの４つの染料のいずれかを用いて使用することができる。染料溶液の総濃度または体積がわずかに変化しても、任意の単一の染料または上記に列挙した染料の他の組み合わせに対して足場内で同じ総濃度が得られる。ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計は、足場への吸着に対する親和性を判定するために、任意の単一の染料または染料の任意の組み合わせによる染色プロセスの前後の着色溶液の吸光度、およびある程度の濃度を測定することができる（また発明者らによって使用された）。
図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、２４時間放置した、図４Ａの足場材料４１０中に０．００１重量％のＭＢを含有している、２４時間放置した、図４Ｂの足場材料４２０中に０．００１重量％のＧＶを含有している、および２４時間放置した、図４Ｃの足場材料４３０中に合計量で０．００１重量％の２５／７５の配合比のＭＢ／ＧＶを含有している、脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記する）のいずれかに基づいた、１００ｍＬの染料溶液で染色して、結果として得た足場材料を示す。
他の実施形態では、以下を含む染料の他の追加の組み合わせを使用した：（１）（ＭＢとＧＶが適用される場合）上記と同じ実験設定を使用して、一緒に適用したＢＢ－ＦＣＦおよびＩＣ、（２）インビボ条件で寿命を延ばすためにＭＢおよび／またはＧＶの前後に適用したＢＢ－ＦＣＦおよび／またはＩＣ、および（３）ＭＢおよび／またはＧＶと組み合わせたＢＢ－ＦＣＦおよび／またはＩＣ。上記の組み合わせでは、溶媒は水またはＰＢＳのいずれかとすることができた。他の実施形態では、本明細書において後のセクションで論じる他の溶媒混合物が含まれる。図５は、３時間放置した、０．００２重量％の総濃度を有する、０．００１重量％の各着色剤ＢＢ－ＦＣＦおよびでＩＣでの、上記のような着色剤ＭＢおよびＧＶを有する上述の実施例と同様の重量で適用したＢＢ－ＦＣＦおよびＩＣで染色して結果として得た足場５１０を示す。
媒染剤を使用する代替方法
他の実施形態では、足場材料に加えられた着色剤または着色剤の組み合わせの堅牢度を高めるために、さまざまな方法またはカラーファスナーが使用される。
媒染剤、または染料ファスナーもしくは固定剤は、主に２価の金属（塩）で構成されている、生物学的染色および繊維産業で使用される化合物のグループである。タンニン酸や酒石クリーム（酒石酸のカリウム塩）などの化合物も、多くの場合同じ目的でよく使用されるが、これらは概して真の媒染剤とは考えられていない。
媒染剤の選択は、多くの場合、使用する染料に依存し、たとえば、一部の亜鉛塩は、ＭＢとともに使用され、ＧＶにはヨウ素（ＫＩ＋１２）が使用され得る。ヨウ素は、グラム染色でも媒染剤として使用されるが、実際の媒染剤ではなく捕捉剤であると考えられている。
媒染剤の１つの定義は、特定の染料と配位錯体を形成する多価金属イオンであるが、この定義は、本開示において「媒染剤」という用語に必ずしも限定されるものではなく、上に反映されているように、一部の組成物（たとえば、タンニン酸、酒石クリーム、ヨウ素）は、概して、この定義に当てはまらないにもかかわらず、当業者によって媒染剤であると考えられている。
媒染剤は、概して次の３つの方法で着色プロセスに適用することができる：（１）基材を媒染剤で処理し、その後染料で処理する、前媒染（オンクロム）、（２）媒染剤が最初から着色溶液中に存在する、メタ媒染（メタクローム）（このプロセスは、前媒染／後媒染よりも簡単であるが、少数の染料でのみ適用可能である）、および（３）基材を最初に染料で処理し、その後媒染剤で処理する、後媒染（アフタークローム）。
図６Ａおよび６Ｂは、媒染された足場材料を示し、図６Ａは、ミョウバンを使用して０．００２重量％の濃度でＭＢ／ＧＶの組み合わせで染色されたＫｒｏｍａ足場材料６１０の媒染後のサンプルを示し、図６Ｂは、ミョウバンを使用して０．００２重量％の濃度でＭＢ／ＧＶの組み合わせで染色された足場材料６２０の前媒染サンプルを示す。硫酸アルミニウムとしても知られるミョウバンは、さまざまな染料に良好な堅牢度を提供する他に、色の明るさと彩度を高めるため、繊維製品に最も使用される媒染剤の１つである。しかし、これは、足場とともに使用することができる唯一の媒染剤では決してない。他の実施形態では、可能な媒染剤／塩としては、限定されないが、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＣＯ３、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＺｎＣｌ２、いくつかの他のＺｎ塩が含まれるか、またはＫＩ／Ｉ２も使用される。
他の実施形態では、図６Ｃおよび６Ｄにメタ媒染のバリエーションが示されるように、足場材料６３０が、図６Ｃにおいて０．００２重量％の総濃度でＭＢ／ＧＶの組み合わせを用いて染色されており、ここでは、０．５グラムのＣａＣｌ２が加えられた。また図６Ｄにおいて、足場材料６４０が、０．００２重量％の総濃度でＭＢ／ＧＶの組み合わせを用いて染色されており、ここでは、０．５グラムのＮａＣｌが加えられた。
実施形態では、これらの金属塩／媒染剤のいずれか、または２つまたはそれ以上の組み合わせが、上記の任意の染料または染料の任意の組み合わせ、または任意の他の染料の組み合わせおよび着色技術を用いて使用される。
異なる実施形態では、３つの媒染方法すべてがおよそ９０℃でおよそ２時間適用される。それが不可能である場合には、足場基材を、室温で４８時間を超えて溶液中に保持することができる。我々のケースにおいて、発明者らの実験結果は、足場を塩化ナトリウム溶液中でおよそ８０℃で２時間加熱すると、コラーゲンがよりゲル状の形態に実質的に分解され得、これがおそらく部分的なコラーゲンのゼラチンへの分解によるものであることを示している。したがって、「冷却方法」、またはたとえば、およそ３７℃での１２時間のハイブリッド方法が好ましい。
メタ媒染は、概して、最も制限的な方法であると考えられる。これは、（染料レーキとして知られる）プロセス中に形成される染料媒染複合体の溶解度を含む、さまざまな要因による。複合体の溶解度は、多くの場合、媒染剤および染料よりも低く、別々に沈殿させてしまうため、適用することができる媒染剤と染料の組み合わせが制限される。さらに、メタ媒染を使用する場合、溶液中の時間は媒染時間に依存し、室温でおよそ２日間である。したがって、染色プロセスを、より長くしたり、より高い温度で行う必要があり得る。吸着された色の量は、溶液中の時間に直接関係していることが示されており、おそらく温度にも相関している。
好ましい実施形態には、前媒染または後媒染が含まれ、ここで、媒染プロセス中に足場がそれほど色を失わないことを考慮すると、後媒染の方が我々の用途にとって潜在的により好適であり、これは、後媒染が、現在の着色方法および定量化方法を変更することなく使用することができるためである。染料レーキが吸着中に足場の表面に直接形成されるため、前媒染プロセスによって染料の吸着速度が変化し得る。さらに、媒染剤は染料溶液に「漏れ出し」得るため、染料分子の沈殿または吸光度の強度の変化を引き起こす可能性がある。いずれの場合でも、これは、足場に吸着された色素の量を測定するときに問題を引き起こし得る。
前述したように、ミョウバンは好ましい媒染剤であるが、他の実施形態では、限定されないが、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、および鉄の塩などの金属塩を含む他の媒染剤が使用されてもよい。
ｐＨ勾配染色または「通し染色」
他の実施形態では、「通し染色」のプロセスを足場の染色処理に使用した。このプロセスでは、わずかに塩基性のｐＨ９～１０からわずかに酸性のｐＨ３～４までの染色プロセス中の染料溶液のｐＨの段階的な変化が伴う。これは、さまざまな弱酸／弱塩基（たとえば酸性酸／重炭酸ナトリウム）、強酸／強塩基の希釈溶液（たとえばＨＣｌ／ＮａＯＨ）を使用して、または極少量の濃強酸／濃強塩基、あるいはそれらの方法の組み合わせを使用して達成することができる。このプロセスは、本明細書に記載される染色方法の代わりに、または染色方法のいずれかとともに使用することができる。通し染色の効果は、ｐＨスケールの範囲にわたるタンパク質（この場合はコラーゲン）の三次構造の安定性が制限されていることに起因すると考えられる。タンパク質が取り扱いすることができるようには発達していないｐＨにさらされると、タンパク質構造が開くことによって変形し、色素の結合部位が露出される。
図７には、染色プロセスにｐＨグレーディングが伴う、結果として得たさまざまな足場材料が示されている。最初に、ｐＨ勾配を適用した場合の、０．００２重量％の総濃度でＭＢ／ＧＶの組み合わせを用いて染色した後の足場材料７１０が示される。ｐＨ勾配を適用した場合の、０．００２重量％の総濃度でＭＢを用いて染色した後の足場材料７２０が示される。ｐＨ勾配を適用した場合の、０．００２重量％の総濃度でＭＢ／ＢＢ－ＦＣＦの組み合わせを用いて染色した後の足場材料７３０が示される。また、ｐＨ勾配を適用した場合の、０．００２重量％の総濃度でＢＢ－ＦＣＦを用いて染色した後の足場材料７４０が示される。
従来のものとは異なる染色または固定方法
他の実施形態では、従来のものとは異なる染色または色固定方法が使用される。以下は、他の実施形態で使用されているいくつかの従来のものとは異なる染色方法の説明である。これらの実施形態では、色の吸収または固定度の有効性を、主に目視検査によって判定した。
いくつかの実施形態では、染色プロセスに代替溶媒を使用した。上述の染色方法を、染料に水系／水性溶媒を使用して実施した。しかし、上述の４つの色素（ＭＢ、ＧＶ、ＢＢ－ＦＣＦ、ＩＣ）は、水中に溶解するだけでなく、エタノールなどのさまざまな溶媒中に溶解し、わずかに親油性である。
いくつかの実施形態では、ＭＢおよび／またはＧＶをエタノール中に溶解し、冷凍乾燥した足場をエタノール溶液中で染色する。この結果として、同様の水性方法と比較した場合に、より濃縮した染料溶液およびより長い染色時間を適用したときでも、はるかに明るい着色が得られた。これらの実施形態では全体的により明るい色が視覚的に見られたが、これらの実施形態は、染色堅牢度が改善され、創傷の永久的な刺青が生じる可能性が低くなる傾向があり得、それでも効果的に着色された皮膚代替物を提供するため、依然として効果的であって好ましくもあると考えられ得る。
他の実施形態では、染料をオレイン酸中に溶解するが、これらの実施形態では、それらの溶解度はより低かった。しかし、７０／３０のオレイン酸／エタノール混合物を使用すると、より高い溶解度が得られた。結果として得た足場の色が、同じ時間および同じ染料濃度でエタノールおよびオレイン酸の場合よりも全体的に暗かったことが判明した。
他の実施形態では、植物油も使用した。また、魚油／タラ肝油も使用することができる。油／有機溶媒ベースの染料溶液の使用は、染料の任意の組み合わせで行うことができ、さまざまな油、脂肪酸、それらの塩、および溶媒を用いて前媒染した足場上で行うこともできる。
他の実施形態では、染色後にコーティング処理を実施した。これらの実施形態では、最も関心のあるものは、油および糖ベースのコートである。
一実施形態では、トリグリセリド、モノグリセリド、および魚油由来の遊離脂肪酸の混合物を、染色後に足場上に薄膜をスプレーすることによるコーティングに使用した。当該サンプルは、コーティングなしの同様のサンプルと比較して、インビトロの脱色および分解実験に対するある程度の耐性を獲得した。さらに、これは適切な脂肪酸アルキルエステルを使用して行うこともできた。
他の実施形態では、糖ベースのコートは、リボース、フルクトース、またはデキストロースのような単糖類（モノサッカライド）、またはスクロースもしくはマルトースのような複糖類（ジサッカライド）のいずれかの、さまざまな糖を用いて作られる。選択した糖を水溶液中に溶解し、足場を浸した後に再度冷凍乾燥する。非還元糖が着色溶液中に溶解されてもよい。糖は、追加の架橋を導入することによって、コラーゲン自体の安定性を高め得る。さらに、糖は、大量の－ＯＨ基を含有し、これらは、水素結合または双極子力による色素分子へのさらなる結合を促進し得る。さらに、Ｎ－アセチルグルコサミンのような窒素含有糖は、コラーゲンおよび特定の色素の遊離アミノ／酸末端と共有結合を形成し得る。
本明細書で上記したほぼすべての可能な方法および実施形態が一緒に使用され得るが、各カテゴリーの複数の成分、たとえば２つまたはそれ以上の媒染剤を使用して、色の鮮やかさ、堅牢度などを高めることは、染色足場の製造にかかる複雑さ、起こり得る副作用、および全体的なコストも増加させ得る。
したがって、適切なプロトタイプを生成する好ましい方法および実施形態は、「基本的な」染色プロセスに類似している。特定された最も注目すべき問題は、インビボ条件（たとえばマウス）での色素の寿命である。考えられ得る改善策としては、媒染工程、ｐＨ勾配、またはそれら２つの組み合わせを使用して、足場のコラーゲンマトリックス内の色素分子の結合を増加させることが考えられる。図８に示すように、染色した足場の２つの好ましい実施形態を比較して示している。足場８１０を、０．００２重量％の総濃度でＭＢ／ＧＶの組み合わせを使用して染色し、足場８２０を、０．００２重量％の総濃度でＭＢ／ＧＶと前媒染染料の組み合わせを使用して染色する。
コラゲナーゼ触媒による足場の分解
足場を生物学的包帯として使用する場合、体は大きな足場を微細な断片の「プール」に分解し、これが患部の再構築および成長を助ける。検証実験では、この足場の分解プロセスおよび足場サンプル中の（１つまたは複数の）色素に対するその影響を模倣するために、コラゲナーゼのＰＢＳ溶液を選択した。自然界および人間において、コラゲナーゼの主な機能は、コラーゲンをペプチドレベルに分解することであり、これは、たとえば皮膚内の損傷した組織で起こり、体が新しい健康な組織を生成するのを助ける。
このために、ＰＢＳ中の０．５０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼのストック溶液を調製した。最初の実験では、ストック溶液を、１０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬまで希釈した。溶液の大部分としてＰＢＳまたは「ヒト血漿様溶液」のいずれかを使用して、合計９つの溶液を作製し（１０ｍｌ）、その後、足場片を、溶液に入れて、室温で長期間維持した。
染色されていない足場がコラゲナーゼＰＢＳ溶液中で分解し始めることを本発明者らは発見した。血漿様培地の場合、コラゲナーゼの濃度が血漿溶液中で１０倍高い場合でも、およそ３日後の足場の分解の比較レベルによって見られるように、溶液はコラゲナーゼを阻害するように見えた。この間、０．００２％の濃度でＭＢとＧＶの組み合わせを用いて染色した足場にはそれほど変化は見られなかった。
ＭＢ／ＧＶ染色を分解するために、かなり高濃度のコラゲナーゼを適用した。このために、元の０．５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を使用した。染色されていない足場片を時間と分解レベルの比較のために試験した後、一連の変動を試験した。微細な粒子への完全な分解におよそ２４時間しかかからなかったことがわかった。染色されたサンプルに目を向けると、図９Ａに示すように、ＭＢ／ＧＶの０．００１重量％の溶液中で染色された第１の足場サンプル９１０を試験した。０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液では、そのサンプルの完全な分解にはおよそ２日間かかった。図９Ｂに見られるように、色の一部が溶液中に滲んでいるが、染料の大部分は依然として小さなコラーゲン粒子９２０に結合している。
前のセクションで説明した「プロトタイプ」の次の５つを同じ方法で試験した。試験したプロトタイプは、１）水中の０．００２重量％のＭＢ／ＧＶ、２）ＰＢＳ中の０．００２重量％のＭＢ／ＧＶ、３）ＰＢＳ中の０．００２重量％のＭＢ／ＢＢ ＦＣＦ、４）水中の０．００１重量％のＩＣ、ならびに５）トリグリセリド、モノグリセリド、および魚油由来の遊離脂肪酸の混合物でコーティングした水中の０．００２重量％のＭＢ／ＧＶで染色された足場材料であった。次の４日間にわたってサンプルをチェックし、１つのケース（サンプル４：水中に０．００１重量％のＩＣ）を除くすべてのケースにおいて、全分解には４日間かかった。
これらの実験では、染色された足場（上記の１～５）が微細な断片に分解され、すべてのケースで、染料のかなりの部分がそれらの断片上に残ったことが示された。これは、色素が表面だけでなく足場のコラーゲン／ペプチドにしっかりと結合していることを示唆している。上述したように、１つのケース（すなわちサンプル４：水中に０．００１重量％のＩＣ）を除くすべてのケースで、分解におよそ４日間かかり、ＭＢ／ＧＶで染色したサンプル間で大きな差は観察されなかった。サンプル３および４はわずかに異なり、ＩＣで染色したサンプル４は２４時間弱でほぼ完全に分解され、少数の細片のみが残った。サンプル３は、サンプル４と比較してより安定していたが、他の３つのサンプルよりも早く分解し、より小さな細片になった。
上記の実施形態では、足場の着色には、概して、メチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）を等しい重量比で組み合わせることが伴った。しかし、これは必ずしもそうとは限らない。着色剤の量を、この種の製品に対してＦＤＡによって発行されたＭＢの最大許容量を下回る、およびいくつかの実施形態ではかなり下回るようにすることを目的として、染色量は、特定の量の着色剤を含む足場を生成するように調整され得る。足場内の組み合わされた両方の色素ＭＢ／ＧＶの量は、およそ１ｍｇ／ｇであるが、最大許容量は、いくつかの実施形態において２ｍｇ／ｇ、３ｍｇ／ｇ、４、５ｍｇ／ｇ、６ｍｇ／ｇ、７ｍｇ／ｇ、８ｍｇ／ｇ、９ｍｇ／ｇ、またはさらには１０ｍｇ／ｇであり得る。
いくつかの実施形態において、着色剤を加える工程では、０．００１重量％の各着色剤（合計で０．００２重量％または２０ｍｇ／Ｌ）を含有する（脱イオン水またはＰＢＳ）に基づいた１００ｍＬの染料溶液を使用する。しかし、染料溶液内の着色剤のこの量は、着色剤が適用される皮膚代替物の必要性に合わせて増減され得る。たとえば、染料溶液は、着色剤、着色剤または色剤が加えられる皮膚代替物に応じて、（脱イオン水、ＰＢＳ、またはいくつかの他の染料溶媒に基づいた）１．０～１０．０重量％の着色剤または色剤、（脱イオン水、ＰＢＳ、またはいくつかの他の染料溶媒に基づいた）１．０～２０．０重量％の着色剤または色剤、（脱イオン水、ＰＢＳ、またはいくつかの他の染料溶媒に基づいた）１．０～０．０１重量％の着色剤または色剤、（脱イオン水、ＰＢＳ、またはいくつかの他の染料溶媒に基づいた）０．０１～０．００１重量％の着色剤または色剤、（脱イオン水、ＰＢＳ、またはいくつかの他の染料溶媒に基づいた）０．０５～０．００２重量％の着色剤、（脱イオン水、ＰＢＳ、またはいくつかの他の染料溶媒に基づいた）０．０１～０．０００２重量％の着色剤、または（脱イオン水、ＰＢＳ、またはいくつかの他の染料溶媒に基づいた）０．０１～０．０００２重量％の着色剤または色剤の量を有し得る。
約４×４ｃｍの寸法および０．２５～０．３０ｇの重量の足場片が溶液に加えられ、３時間放置され得る。しかし、上記のように、足場材料のサイズおよび足場材料が染色溶液中に放置される時間は変更され得る。さらに、足場材料のサイズは当然変更することができ、色素溶液の体積および濃度に必要な調整が行われてもよい。その後、足場を溶液から取り出し、水道水で洗浄した後、脱イオン水ですすぎ、冷凍し、冷凍乾燥または凍結乾燥する。
いくつかの実施形態では、溶液のベースとして脱イオン水の代わりにＰＢＳを使用する場合に、足場によって吸着されたＭＢおよびＧＶの相対量が変化し、水溶液に対するおよそ６０重量％のＧＶおよび４０重量％のＭＢからＰＢＳに対するおよそ４０重量％のＧＶおよび６０％のＭＢに変化することが判明した。しかし、吸着された着色剤の総量はほぼ同じである。さらに、ＭＢとＧＶを組み合わせて使用する場合に、９５／５、９０／１０、８５／１５、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６５／３５、６０／４０、５５／４５、５０／５０、４５／５５、４０／６０、３５／６５、３０／７０、２５／７５、２０／８０、１５／８５、１０／９０、および５／９５のＭＢ比率を含む、さまざまなＭＢ／ＧＶ比率が使用されてもよい。ＭＢ／ＧＶの比率は、１０～５０％のＭＢ、１０～６０％のＭＢ、１０～７０％のＭＢ、１０～８０％のＭＢ、および１０～９０％のＭＢの範囲であり得、残りの対応するパーセンテージ（９０～５０％、９０～４０％、９０～３０％、９０～２０％、および９０～１０％）が伴う。好ましい実施形態では、ＭＢ／ＧＶ比率は５０／５０である。別の好ましい実施形態では、ＭＢ／ＧＶ比率は７５／２５である。また、別の好ましい実施形態では、ＭＢ／ＧＶ比率は２５／７５である。
皮膚代替物用の着色剤としてのＭＢおよびＧＶの使用に加えて、他の実施形態では、食用色素、またはより正確には食用色素中の活性化合物（染料／顔料）が、ＭＢおよびＧＶと組み合わせて、またはＭＢおよびＧＶと交換して使用される。
一実施形態では、脂溶性および１つの水溶性の食用色素が使用される。脂溶性食用色素中の染料は、Ｅ１３３、すなわちブリリアントブルーＦＣＦ（ＢＢ－ＦＣＦ）であったが、これは、ＧＶに非常に類似した分子構造を有する水溶性分子である。染料は食用色素のおよそ４０重量％であったが、添加物の残りは「脂溶性」用であった。水溶性色素中の染料は、Ｅ１３２、すなわちインジゴカルミン（ＩＣ）であったが、これは、食用色素のおよそ８５重量％であった。
コラゲナーゼを使用した酵素分解およびそれをおよそ１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液中に放置することの両方によって、食用色素のみが足場材料から除去され得ることが本発明者らによって発見された。
足場材料のコラーゲン／ペプチドに結合されることが判明した、上述の着色剤の結合機構により、同様のまたは適切な着色剤を用いる同様の結合機構を介して、表面だけでなく、他のコラーゲンまたはペプチドベースの皮膚代替物に対して結合を実施することができる。
本発明による足場材料は、魚皮の供給源として使用することができる、骨魚または軟骨魚を含む、インタクトな魚皮または任意の種の魚から得られ得る。たとえば、供給源は、タラ、ハドック、およびナマズのような丸い魚、オヒョウ、カレイ、およびヒラメのようなカレイ科、サケおよびマスなどのサケ科、マグロのようなサバ科、またはニシン、アンチョビ、サバ、およびイワシなどの小魚であり得る。さらに、他のコラーゲン、ペプチド、または他のタンパク質含有皮膚代替物が、生物学的皮膚代替物、合成皮膚代替物、またはハイブリッド皮膚代替物のいずれであっても、染料、顔料、および／または他の着色剤の適切な組み合わせによって同様に着色され得る。
マウスおよび患者に対する試験とその結果
マウス
アイスランド原産の野生で捕獲されたタイセイヨウタラの最小限に加工された皮膚から作られた脱細胞化魚皮足場材料の実施形態を、皮膚代替物として提供した。再び、以下のサブセクションでは、別段の明記がない限り、アイスランド原産の野生で捕獲されたタイセイヨウタラの最小限に加工された皮膚から作られた、足場材料として使用される「魚皮」は、皮膚代替物の実施形態として提供される「足場」または「足場材料」としての「魚皮」と呼ばれる。
皮膚代替物として着色された足場材料の実施形態を使用して、合計５２匹のマウスを試験した。
第１のパイロット、パイロット１では、４匹のマウスを処置した。
パイロット１には以下が含まれた：
１）０．００５重量％のＭＢ＋０．００５重量％のＧＶの着色剤、凍結乾燥前に３時間水中で染色した新鮮な脱細胞化魚皮；および
２）０．０１０重量％のＭＢ＋０．０１０重量％のＧＶの着色剤、凍結乾燥前に３時間水中で染色した新鮮な脱細胞化魚皮。
第２のパイロット、パイロット２では、１６匹のマウスを処置した。
パイロット２には以下が含まれた：
１）０．００１重量％のＭＢ＋０．００１重量％のＧＶの着色剤、寒糖溶液に浸漬して凍結乾燥する前に２４時間水中で染色した新鮮な脱細胞化魚皮；
２）０．００１重量％のＭＢ＋０．００１重量％のＧＶの着色剤、寒糖溶液に浸漬して凍結乾燥する前に３時間水中で染色した凍結乾燥された魚皮；
３）０．００１重量％のＭＢ＋０．００１重量％のＧＶの着色剤、鉱油に浸漬して凍結乾燥する前に３時間水中で染色した凍結乾燥された魚皮；および
４）０．００１重量％のＭＢ＋０．００１重量％のＧＶの着色剤、凍結乾燥前に３時間水中で染色した凍結乾燥された魚皮。
第２のパイロット、パイロット３では、３２匹のマウスを処置した。
パイロット３には以下が含まれた：
０．００１重量％のＭＢ＋０．００１重量％のＧＶの着色剤、凍結乾燥前に３時間ＰＢＳ中で染色した凍結乾燥した魚皮。
パイロット１、パイロット２、およびパイロット３の各々のマウス研究の結果は、以下の結果をもたらした。着色した魚皮を足場材料として使用した後に、予期せぬ炎症や他の有害事象は検出されなかった。処置用製品（足場材料）は通常の時間で分解し、創傷は正常に治癒された。重要なことに、創傷床の永久的または半永久的な刺青は検出されなかった。
人間の患者
３人の患者（患者１、患者２、および患者３）を、このサブセクションで「魚皮」、「足場」、または「足場材料」と呼ばれる、アイスランド原産の野生で捕獲されたタイセイヨウタラの最小限に加工された皮膚で処置した。
３人の患者（患者１、患者２、および患者３）の各々において、０．００１重量％のＭＢ＋０．００１重量％のＧＶの着色剤、凍結乾燥前にＰＢＳ溶液中で３時間染色した凍結乾燥した魚皮を用いて、上記のパイロット３と同様に足場材料を生成した。
患者１を、２０２１年１０月１２日に、図１０Ａに示されるように第１の写真を用いて着色した魚皮で処置し、患者１の同じ創傷を、２０２１年１０月１９日に、図１０Ｂに示されるように再び７日後に撮影した。
患者２を、２０２１年１０月２５日に、図１１Ａに示されるように第１の写真を用いて着色した魚皮で処置し、患者２の同じ創傷を、２０２１年１１月２日に、図１１Ｂに示されるように再び７日後に撮影した。
最後に、患者３のさまざまな創傷を、２０２２年１月２０日から２０２２年２月１０日まで、着色した魚皮で処置し、図１２Ａ～１２Ｎは、創傷ドレッシングが変更されるたびに処置した創傷を示している。図１２Ａは、着色した魚皮が０日目に適用されていることを示し、図１２Ｂは、４日目の同じ創傷を示している。図１２Ｃにおいて６日目に示されるように新たに染色した魚皮を適用し、図１２Ｄは、２日後の８日目の処置した創傷を示している。同じ患者３では、図１２Ｅにおいて異なる創傷に新たに染色した魚皮を適用し、図１２Ｆは２日後の同じ創傷を示し、図１２Ｇは５日後の同じ創傷を示している。図１２Ｈは新たに着色した魚皮の適用を示し、図１２Ｉは２日後の結果を示し、図１２Ｊは４日後の結果を示している。最後に、図１２Ｋは新たに着色した魚皮の適用を示し、図１２Ｌは２日後の治癒を示し、図１２Ｍは４日後の治癒結果を示している。
上記の患者１～３の各々において、着色した魚皮の使用後に装置関連の炎症や他の有害事象は報告されなかった。適用した処置は、これらの慢性創傷の治癒を促進することがわかる。さらに、適用した着色した魚皮は、通常創傷中で分解した。また、創傷床の永久的または半永久的な刺青は、５日目以降に検出されなかった。
さらなる例
（たとえば、米国特許第８，６１３，９５７号明細書に開示されるようにＫｅｒｅｃｉｓ（商標）の魚皮由来の細胞足場製品を使用して創傷を治癒する場合）、上述したように、本発明者らは、臨床医が、無意識に創傷治癒足場と感染とを区別するのに誤るか、またはそうでなければ苦労しているという重大な課題を発見した。これは、少なくとも部分的に、創傷治癒足場が分解し、周囲の組織に統合し始めると、それに関連する色および／または臭気に起因し得、これは、時に感染組織（たとえば、化膿性感染）に類似した色を有し得、穏やかに芳香性であり得るため、感染組織に類似した臭気であると解釈する人もいる。したがって、本発明者らは、改良された製品または既知の製品の改良から大きな恩恵を得ることができる課題が当該技術分野に存在することを発見した。
１つの解決策は、魚皮由来の細胞足場がクリニックでより簡単に識別され得るようにおよび／または創傷床に設置されたときに周囲の組織と区別され得るように、魚皮由来の細胞足場を疑似色にすることである。そのために、以下の開示は、経時的に安定を保つことができる、および加工／製造工程中に魚皮足場に組み込まれ得る着色剤を特定することに焦点を当てた一連の試験からの例示的なデータを提供する。
米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載されるように、野生で捕獲されたタイセイヨウタラの皮膚を最小限に加工して作られる、Ｋｅｒｅｃｉｓ（商標）の魚皮由来の細胞足場製品の加工／製造に使用される脱細胞化溶液（本明細書では「Ｄｅｃｅｌｌ溶液」と呼ばれる）内のさまざまな着色剤の安定性を判定するために、第１のセットの実験を行った。Ｄｅｃｅｌｌ溶液を、ＥＢＬ Ｍ２２２に従って調製し、以下の表にリストされている６つのさまざまな着色剤の安定性を試験した。
Figure 2024510837000006
Ｄｅｃｅｌｌ溶液を、ＥＢＬ Ｍ２２２に従って調製した。各着色剤を、（たとえば、表１にリストされるように）１％ｗ／ｖの溶液強度に調製した。５０ｍＬのＤｅｃｅｌｌ溶液を、それぞれの蓋で固定可能な７つの別々のプラスチックチューブの各々に等分した。第１のチューブは、Ｄｅｃｅｌｌ溶液のみを含み、対照として機能した。６つの調製した色溶液の各々の０．５ｍＬのアリコートを、５０ｍＬのＤｅｃｅｌｌ溶液を含有する対応するチューブに別々に加えた。混合物のあらゆる反応または目に見える変化を経時的にモニターした。
インキュベーションの３０分後および２４時間後に、それぞれの着色剤を含むそれぞれのチューブ内の溶液をモニターし、実験の開始時に写真によって文書化した。
着色剤の多くが、開始時にＤｅｃｅｌｌ溶液内でかなり明るいことが判明した。最初の２０分で、ほとんどの着色剤が退色し始めたが、その顕著な例外はメチレンブルーであった。この傾向は継続し、２４時間後、メチレンブルーを加えたＤｅｃｅｌｌ溶液を除いて、着色したＤｅｃｅｌｌ溶液はすべて白色またはほぼ白色に変わった。したがって、メチレンブルー色は、米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載されるように、野生で捕獲されたタイセイヨウタラの最小限に加工された皮膚から作られる、Ｋｅｒｅｃｉｓ（商標）の魚皮由来の細胞足場製品の製造の脱細胞化段階中に加える着色剤の好ましい実施形態であると考えられる。
別の実施形態では、図１３に示されるように、組織再生創傷処置を使用した創傷の処置の方法１３００が提供される。工程１３１０では、皮膚代替物および着色剤を含む組織再生創傷処置を提供し、着色剤は、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である。工程１３２０では、組織再生創傷処置を創傷床に適用する。また、工程１３３０において、着色剤の色の変化を判定することによって、皮膚代替物が創傷内でプロテアーゼ攻撃によって分解されているかどうかを判定する。
さらなる例示的な方法では、皮膚代替物を含む組織再生創傷処置は、青色で着色された（たとえば、ＭＧ／ＧＶ）細胞外マトリックスの形態であり、創傷床に挿入され、その上に二次創傷ドレッシングが適用される。さらに別の例示的な方法では、創傷検査時に創傷床の色を記録する。色が青色の場合、組織再生創傷処置は、（正しく）インタクトであると考えられ、細胞の内方成長は、（正しくはまたはおそらく）生じていると結論付けられる。創傷処置は、青ではなくなった場合、脱落してしまい、洗い流して新しい材料を創傷床に適用する必要がある。
使用される着色材料は、生体適合性があって、プロテアーゼがマトリックス自体を攻撃すると分解する必要がある。これは、永久的でなくてもよく、治癒が行われた後に創傷に永久的な色または「刺青効果」が残る場合もある。
追加の試験
第１の色試験を脱皮化した魚皮に対して実施した。魚皮ベースの創傷製品に対して試験を実施して、その材料がさまざまな染料化学物質にどのように対応するかを確認した。その目的は、繊維状コラーゲン材料がさまざまな染色剤とどのように反応するか、および湿った状態と乾燥した状態で反応が異なるかどうかを確認することであった。
試験スキーム
ガラスボウル、ピンセット、密閉プラスチック容器を実験に使用した。これらの試験は、コラーゲン材料がさまざまな種類の染料とどのように反応するか、油ベースと水ベースのどちらがタンパク質とよく反応するか、洗浄しても保持されるか、および脱皮化した魚皮の足場の染色が製造のどの時点で最適であるかの質問に答えるためのものであった。試験したさまざまな染料／着色剤／顔料／色添加剤には、Ｗｏａｄ Ｐｏｗｄｅｒ（ＨＵＥ－３０２３）；Ｃｏｌｏｒ ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｄ＆Ｃ Ｇｒｅｅｎ ＃５ Ｐｏｗｄｅｒ ＡＮ０７２５；Ｃｏｌｏｒ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｕｌｔｒａ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｌｕｅ Ｈ９－０３Ｒ１；Ｃｏｌｏｒ ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｌｉｑｕｉｄ ＦＤ＆Ｃ ｂｌｕｅ ＃１；Ｃｏｌｏｒ ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄ＆Ｃ ｇｒｅｅｎ ＃５；Ｃｏｌｏｒ ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄ＆Ｃ ｇｒｅｅｎ ＃６ ｏｉｌ ＡＭ４２９９；グリーン濃縮食品用着色料；およびガルニエ ナチュラル カラー、マホガニーブラウンが含まれた。
凍結乾燥前の着色
第１の工程では、脱細胞化魚皮を凍結乾燥する前に着色する。これは、湿った状態のときに材料が色とどのように反応するか、および着色剤が洗浄および凍結乾燥においてどのように反応するかを確認するために行われる。試験を、脱細胞化魚皮の創傷製品の製造における脱細胞化工程の後に実行した。
脱細胞化魚皮の足場を、染料化学物質中に６０分間保持し、その後、連続流水中で２時間洗浄した。
凍結乾燥後の着色
この試験の第２の工程では、凍結乾燥後に材料を着色する。これは、凍結乾燥後に足場と色との反応に違いがあるかどうか、および構造が染料化学物質に対してより開放的であるかどうかを確認するためのものであった。その後、シートを再度凍結乾燥する。
試験手順
脱細胞化魚皮から１枚の皮膚を取り出し、小片に切断した。小片を、それぞれ、一部が無希釈の液剤、一部がカラーリングパウダーと水／油の混合物、または着色剤とヘアカラー顕色剤の混合物である、着色剤に入れた。小片を、２時間放置し、その後、徹底的に洗浄し、検査して、写真を撮影した。有望な小片と見られるものを、密閉容器内の水に浸し、翌朝までかき混ぜた。これは、色が最終的に水中に溶解しなくなるかどうかを確認するためのものであった。すべての小片を、再度検査し、再度洗浄した。純水に浸し、すべての溶液を５分後に着色した。有望な小片を、凍結乾燥（－８０℃で冷凍）に送り、冷凍乾燥機で凍結乾燥した。
本開示のさまざまな実施形態のよりよい理解は、同様の参照符号が同様の要素を指す添付図面とともに以下の説明から得られ得る。
本開示は、さまざまな修正および代替構造が可能であるが、特定の例示的な実施形態が以下に説明される図面に示されている。しかし、本開示を開示される具体的な実施形態に限定する意図はなく、逆に、本発明の意図は、本発明の精神および範囲内にあるすべての修正、代替構造、組み合わせ、および等価物を網羅するものであることが理解されるべきである。
使用される参考文献は、便宜上提供されているだけであり、したがって保護範囲や実施形態を定義するものではない。
用語が、記載された意味を持つように本出願において明示的に定義されていない限り、その単純なまたは通常の意味を超えて、明示的または間接的に、そのような用語の意味を制限する意図はないことが理解される。
本明細書で使用されるように、「処置」という用語は、その共通の辞書の定義によって理解されるように意図されている。すなわち、「処置」という用語には、広い意味で、病気または負傷のために患者に与えられる医療および／または医薬が含まれる。当業者に理解されるように、「処置」には、何かに特定の特性を保存または付与するための化学的、物理的、または生物学的な薬剤の使用が含まれる。したがって、「処置」は、提供される医療（すなわち、方法または一連の規定された行為の形態）であり得るか、または何かに特定の特性を保存または付与するために使用される医薬を指し得る。
非限定的な例として、本明細書に開示される脱細胞化魚皮の粒子形態は、「処置」、すなわち、創傷を保存および／または安定化するために使用される、または他の開示された有益な効果のいずれかを創傷部位にもたらすことができる医薬と呼ぶことができる。同様に、いくつかの例では、処置には、創傷を安定化および／または保護するための方法内における粒子形態での開示された脱細胞化魚皮の使用が含まれる。
本明細書で使用されるような「脱細胞化」、「脱細胞化魚皮」、「無細胞魚皮」などの用語は、任意の方法によって作られた魚皮を指し、「Scaffold Material for Wound Care and/or Other Tissue Healing Applications」と題される米国特許第８，６１３，９５７号明細書に開示される任意の実施形態を含む。したがって、本明細書で使用されるような「脱細胞化」、「脱細胞化魚皮」、「無細胞魚皮」などの用語は、相当量の細胞内容物および核酸内容物が除去されて、細胞外マトリックス材料（ＥＣＭ）の複雑な三次元間質構造を残す、魚皮を含む。概して、上記した脱細胞化は、多くの場合、過酷な化学処理および／または化学物質（たとえば、抗生物質）中での保管を利用する、他の方法で哺乳類の組織に対して必要とされるおよび／または定期的に実施される処理よりも穏やかな形式の処理である。
米国特許第８，６１３，９５７号明細書に記載される脱細胞化方法は、天然の細胞外マトリックス成分の三次元構造を維持する足場材料の生成を結果としてもたらし、これにより、いくつかの例では、物理媒体によって、幹細胞、および創傷治癒プロセスに寄与する他の細胞は、創傷治癒を促進するために横断して移動し、および／または支持され得る。コラーゲンなどの細胞外成分の天然構造は、オメガ３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）などの他の天然成分に加えて、脱細胞化魚皮の足場材料内に維持される。
胎盤ベースの創傷処置などの、哺乳類の皮膚／膜に由来する他の足場材料が、皮膚代替物として使用されてもよい。
タイセイヨウタラ（Gadus morhua）および多くの他の魚種から人間への疾病伝播のリスクが存在しないか、または少なくともその可能性がはるかに低いため、脱細胞化魚皮に基づいた皮膚代替物が好ましい。さらに、脱細胞化魚皮は、アレルギーの原因となる成分を含まない傾向があり、アレルギーや他の免疫反応のリスクが大幅に低下する。疾病伝播およびアレルギー反応のリスクが低下するため、脱細胞化魚皮には、細胞外マトリックスの生物学的構造および生物活性化合物を保持する穏やかな処理が施される。したがって、脱細胞化魚皮は、加工中に皮膚細胞が剥がされるが、細胞外成分の天然の三次元構造を維持するため、天然の足場を提供して、創傷治癒を促進する。対照的に、哺乳類の足場材料は、三次元構造を欠いており、他の天然の細胞外成分を失っており、脱細胞化魚皮と同じ方法または同じ程度に創傷治癒を促進することができない。
他の形態のコラーゲンベースの材料は、生物学的皮膚代替物または合成皮膚代替物として使用され得るが、再構成されたコラーゲン材料は、特に他の天然の細胞外成分の天然に関連する中で、それらの天然の三次元構造を維持できない過酷な物理的および化学的処置を介して採取されないことが好ましい。上記で論じた哺乳類由来の足場材料と同様に、再構成されたコラーゲン材料によって提供された天然構造および／または三次元細胞外マトリックス環境の欠如によって、皮膚代替物の創傷治癒を促進する効果は低下し得る。もちろん、皮膚代替物の選択には、皮膚代替物の製造コストおよび一貫性、ならびに他の要因を考慮する必要があり、いくつかのケースまたは用途ではそのような再構成されたコラーゲン材料の使用は、実際に好ましくなり得る。
感染の発症に関する追加の考慮事項
創傷処置は、多くの場合、医療訓練を受けていない人材によって、厳しい環境で、たとえば戦闘状況での負傷箇所またはその近くに必然的に施される。本発明者らは、創傷処置、たとえば魚皮移植片の組織再生能力、細菌バリア、および鎮痛特性を備えた広い抗菌スペクトルの抗菌活性の重大な必要性を発見した。本発明者らは、保管および持ち運びが容易であり、最終的または一時的な処置のいずれかとして機能することができる創傷処置製品が、たとえば、戦闘または緊急事態における負傷者の避難の必要性を減らすことによって特に役立つことを発見した。
上述したように、感染は、緊急時および戦闘時の創傷の管理における大きな課題である。これは、負傷者または戦場での軍人の罹患率および死亡率を左右するものである。たとえば、感染は、死傷者全体の３分の１を占め、処置が長期化し、切断のリスクが増加する。負傷の独特のメカニズムおよび厳しい環境のため、戦闘による創傷は汚染されやすく、処置がより困難になる。感染の初期の兆候は、創傷内の細菌の不均衡である。初期段階の創傷で見られる一般的な病原体は、グラム陽性（Ｇ＋）株とグラム陰性（Ｇ－）株の両方を含む。感染が発生すると、グラム陰性菌および多剤耐性（ＭＤＲ）菌の出現が観察される。したがって、本発明者らは、感染のリスクを低減して兵士および救急隊員に恩恵を与えるための効果的かつ即時の介入が強く求められていることを特定した。
いくつかの実施形態では青色の抗菌性魚皮膚移植片であり得る、本開示の組織再生創傷処置は、創傷治癒の新規な視覚的刺激を提供する。本開示の創傷処置は、創傷治癒を促進し、火傷、急性および慢性の創傷に生物学的被覆を提供する移植片などの、初期の創傷処置の性能上の恩恵を保持している。しかし加えて、本開示の創傷処置には、メチレンブルー（ＭＢ）およびゲンチアナバイオレット（ＧＶ）などの抗菌着色剤の形態で、またはさらなる追加の活性剤として、抗菌剤が含浸される。本開示の創傷処置は、経時的に創傷床に統合し、抗菌剤を放出して感染の発症を防ぐ。皮膚移植片の青色は不必要な再適用を減らすのを助け、したがって、創傷の露出が最小限に抑えられ、創傷周囲組織が永久に変色することなく創傷治癒が促進される。
戦闘環境または緊急環境で利用可能な従来の野戦包帯は、速効性の被覆を提供し、厳しい環境でも現場で配備可能であり、患者自身または相棒によって使用可能であり得、多くの場合、すすぎ脱水するために生理食塩水とともに使用することができる。しかし、従来の野戦包帯は、抗菌範囲が広くなく、毎日交換する必要があり、創傷床に統合せず、創傷治癒を増強せず、他人のケアのセルフケアのための統合の視覚的補助をもたらすものではない。
戦闘環境または緊急環境でも使用され得る抗菌銀包帯は、速効性の被覆を提供し、厳しい環境でも現場で配備可能であり、患者自身または相棒によって使用可能であり得、広い抗菌範囲をもたらし得る。しかし、抗菌銀包帯は、すすぎや再水和のために生理食塩水とともに使用することはできず、１～３日ごとに交換する必要があり、創傷床に統合せず、創傷治癒を増強せず、セルフケアまたは他人のケアのための統合の視覚的補助をもたらすものではない。
比較すると、本開示の創傷処置は、速効性の被覆を提供し、厳しい環境でも現場で配備可能であり、患者自身または相棒によって使用可能であり、広い抗菌範囲をもたらす。さらに、本開示の創傷処置は、すすぎや再水和のために生理食塩水とともに使用することができ、（色視覚補助に基づいて）交換が必要になるのは５～１０日後であり、有意なことに、本開示の創傷処置は、創傷床に統合し、創傷治癒を増強し、他人のケアのセルフケアのための統合の好適かつ効果的な視覚的補助をもたらす。
本開示の創傷処置は、以下の理由により、兵士および医療従事者のニーズを考慮してそれに対処するため、戦闘環境または緊急環境によく適している：
抗菌活性：メチレンブルーＭＢは、Ｇ－細菌に対する強力な抗菌色素である。これは、創傷における細菌負担を軽減し、過肉芽形成を減少させる。ＧＶは、Ｇ＋細菌に対する抗菌色素であり、炎症誘発性メディエータに影響を与えることができる；
保存期間：創傷処置は、室温で３年以上安定しており、衝撃に対してロバストである。長期間の高温多湿下での安定性が検査される；
包装：好ましい実施形態における創傷処置は、乾燥した滅菌された魚皮のシートを含む真空密封された軍用グレードのホイルパウチに個別に包装される。パウチは、小さくて、軽量で、ポケットまたは医療バッグ（１００ｃｍ２の魚皮、２ｇ）に簡単に収まる。包装は湿気や厳しい環境に耐性がある。当該製品は、搬送や保管が簡単であり、複数のサイズが入手可能である；
使いやすさ：創傷処置には、基本的な医療用品および使用のための限られた医療知識が必要とされる。着色剤は、ユーザが創傷の膿／脱皮と創傷床に統合された魚皮を区別するのを補助し、分かりやすいフォローアップ処置を可能にする；
非染色：創傷処置では、既知の着色および分解のプロファイルを備えた医療グレードの着色化合物を使用する。通常の局所使用では染色は見られなかった。何らかの顔料が吸収された場合、分解プロファイルは６～１２日間であることが本発明者らによって判明した；
除去可能：創傷処置を創傷から除去必要はない。魚皮などの皮膚代替物は、天然のヒト細胞をその構造に動員し、そこで、細胞は、最終的に魚皮などの皮膚代替物を新しい組織に変換する。しかし、必要に応じて、魚皮が統合し始めたら、当該製品を、ピンセットで持ち上げたり、湿ったガーゼで拭き取ったりすることによって、簡単に除去することができる；
厳しい環境での使用：創傷処置は、最終的な創傷治療または一時的な抗菌カバーとして損傷箇所またはその近くで使用することができる。魚皮などの皮膚代替物はゆっくりと統合するため、包帯の交換頻度が結果として少なくなる；
痛みの軽減：創傷処置は、独自に創傷を皮膚で覆い、体内環境を作り出す。魚皮の場合、移植片は、オメガ３を含む脂肪酸が豊富に含まれており、露出された神経末端の遮蔽を助け、炎症を軽減し、脂質メディエータを介して痛みにプラスの影響を与える。
本開示の有意な目的は、ＦＤＡ認可の抗菌性皮膚代替物として損傷箇所またはその近くで創傷管理のための革新的な解決策を国防総省および救急隊員に提供することである。本開示の創傷処置は、強力な抗菌活性と一緒に優れた治癒特性を提供する。創傷処置は、より小さくて深刻度の低い創傷に対する最終的なケアおよびより高次なケアへの移行を必要とする重度の損傷に対する一時的な抗菌カバーとして適用され得る。さらに、着色剤は、医療提供者が統合する皮膚代替物と膿または創傷の脱落組織とを区別するのを助ける。
本開示の創傷処置は、以下のアプローチの組み合わせを介して創傷治癒を促進する：１．創傷に統合する細胞外マトリックスとして作用し、宿主細胞が組織を治癒および再生するための構造的支持を提供する。２．ＭＢおよびＧＶは真菌とともにＧ＋およびＧ－細菌を阻害し、したがって、バイオフィルムの形成を防ぎ、感染のリスクを低下させる。３．包帯の交換が少ないと、汚染への創傷の露出および繰り返しの包帯除去による機械的外傷が少なくなる。４．色は、最適な包帯および抗菌の管理の際に医療訓練を受けていないユーザに対するガイドになる。５．皮膚代替物、たとえば魚皮（オメガ３およびコラーゲン）に自然に存在する生体分子、または追加の活性剤が、痛み、炎症、および出血を軽減する。
本開示の創傷処置は、感染を予防し、被覆を提供し、治癒を促進することによって、軽度および重度の創傷／火傷に対する最終的かつ一時的な処置を提供する。
脱細胞化、冷凍乾燥した魚皮移植片などの、皮膚代替物の好ましい実施形態は、自然治癒プロセスの開始および促進において極めて効果的である。皮膚代替物、および特に物理的足場、ならびにさらにより好ましくは魚皮の物理的足場は、細胞の浸潤を可能にし、炎症および痛みを軽減する生体分子を提供する。これらの特性は、インビトロ、インビボ、および臨床研究で何度も実証されている。加えて、さらに好ましい実施形態では、魚皮は天然のオメガ３が豊富であり、これは、細菌侵入に対するバリア、抗ウイルスの潜在的な、静菌性および抗菌の効果として作用することが示されている。
魚皮の好ましい実施形態は、細菌バリア特性を提供する。もしかすると、創傷感染を軽減する未染色の魚皮の能力に対する最も有力な証拠は、パリのキュリー研究所（Curie Institute）で実施された、独立した２１人の患者を対象とした研究であり、そこで、分層ドナー部位に対する感染率は、魚皮で処置した創傷に対して６０％から０％に低下した。無着色の魚皮移植片であっても、最適な細菌増殖条件で４８～７２時間までスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に対する細菌バリアとして作用することができる。感染したマウスモデルに対するインビボ研究では、魚皮が、戦闘外傷関連の感染症で最も頻繁に特定されるＭＤＲ株の１つである、プロテウス・ミラビリス（P.mirabilis）に対する細菌バリアとして作用することができることが実証された。
メチレンブルーおよびゲンチアナバイオレットは、追加の抗菌特性さえ提供する。創傷処置の進歩によって、結果として、銀、ヨウ素、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）などの抗菌剤と従来の創傷包帯との組み合わせがもたらされた。銀およびヨウ素は抗菌活性においてロバストな効果を示すが、これらの薬剤を長期間使用すると、宿主細胞に対して高レベルの細胞毒性がもたらされる。ＭＢおよびＧＶは、ＦＤＡに認可されており、局所的に使用され得、局所感染を伴う慢性創傷の管理に対する優れた効果を実証している。
インビトロでのデータは、本開示の好ましい実施形態のプロトタイプに対する有望な結果を示している。試験は、ＡＳＴＭ Ｅ２１４９およびＫｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ Ｚｏｎｅ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎのアッセイに基づいた。両方のアッセイは、ＭＢおよびＧＶを含浸させた魚皮移植片が、溶液中および寒天プレート上で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはスタフィロコッカス・アウレウスの両方を効率的に阻害することを示した。
図１４Ａおよび１４Ｂは、（Ａ）大腸菌に対するＡＳＴＭ Ｅ２１４９の結果を示し、図１４Ｃは、（Ｂ）スタフィロコッカス・アウレウスに対するＫｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ Ｚｏｎｅ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎのアッセイの結果を示している。図１４Ａおよび１４Ｂは、抗菌性魚皮を、大腸菌の懸濁液に入れ、最長２４時間振盪した結果を示しており、抗菌性魚皮（ディスク１）（図１４Ａ）と元の魚皮（ディスク２）（図１４Ｂ）との間で細菌の減少が明確に観察された。図１４Ｃでは、（Ｂ）０．１％ｗ／ｖ（セクション１４１０）、０．５％ｗ／ｖ（セクション１４２０）、および１％ｗ／ｖ（セクション１４３０）の範囲の異なる濃度のメチレンブルーおよびゲンチアナバイオレットで処置した魚皮が、スタフィロコッカス・アウレウスを接種した寒天プレート上で明らかな阻害領域を示し、元の魚皮には阻害領域は見られなかった。
出願人は、魚皮の治癒特性を実証する豊富な科学データを有している。これには、哺乳類の細胞および組織ベースの製品（ＣＴＰ）、たとえば、完全な治癒時間での（Ｏａｓｉｓ）１７およびヒトの羊膜／絨毛膜と比較して、魚皮がより効果的な治癒をもたらすことが示された、急性創傷に関する２つの無作為化した臨床試験、および魚皮の使用によって患者の治癒時間が半分になった臨床ドナー部位の研究が含まれた。例示的かつ好ましい実施形態としての魚皮に関して、圧倒的に肯定的な結果をもたらした多くの独立した症例シリーズの公報が存在している。
組織再生創傷処置の生成、および特に魚皮ベースの組織再生創傷処置の生成は、実現の可能性が高い。皮膚代替物に抗菌色を含浸させる追加の工程では、新しい機器の追加の必要性が最小限で済む。ＭＢおよびＧＶは、製剤品質グレードで容易に入手可能である。
本開示の組織再生創傷処置の実施形態、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置の実施形態は、糖尿病性足部潰瘍、動脈性潰瘍、褥瘡、静脈性下腿潰瘍、および外傷性潰瘍を含む創傷の管理のための一過性の抗菌性足場と呼ばれ得るものして効果的に使用され得る。これらの種類の創傷の組み合わせは、米国において下肢切断の５４％の原因であると考えられており、これは不可逆的な衰弱状態である。血管疾患により切断を受けた人のほぼ半数が、５年以内に死亡する。これは、乳癌、結腸癌、および前立腺癌に対する５年死亡率よりも高い。
慢性潰瘍の処置に対する米国における標準ケアは以下の通りである：確立された慢性創傷の通常のケアまたは標準ケアには、以下の通り、すべての種類の創傷の管理に適用される共通の原則が組み込まれている；デブリードマン（典型的には鋭利なデブリードマン）により壊死組織を除去する；滲出液を制御するために適切な創傷ドレッシングを選択することによって水分バランスを維持する；創傷感染を予防または処置するための措置を講じる；創傷領域の虚血を矯正する；静脈性下腿潰瘍については、何らかの形態の圧迫を適用する；糖尿病性足潰瘍については、何らかの形態のオフローディング（offloading）をもたらす。
本開示の組織再生創傷処置の実施形態、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置の実施形態は、ＳＯＣと比較して包帯内に一時的な足場形成をもたらして細菌の増殖に抵抗することによって慢性創傷の処置としてより効果的であるため、皮膚代替物に対して確立されたＳＯＣと比較して、慢性創傷のより効果的な処置を提供し得る。本出願の目的上、標準ケアが、医療研究・品質調査機構（ＡＨＲＱ）の定義と同じ方法で定義されることが期待される。プレディケートデバイス（predicate device）の脱細胞化魚皮の創傷製品は、標準ケアのコラーゲン包帯と比較して、治癒が有意に速いことがランダム化された臨床試験で示されている。当該デバイスは、ＡＨＲＱによって定義されている現在の標準ケアと比較して、より効果的な処置を提供する。
本開示の組織再生創傷処置の実施形態、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置の実施形態は、ＳＯＣと比較して同じ改善を達成すると同時に、さらに、細菌の増殖に対する耐性を提供し、一時的な足場としての明確な特性を有する。
本開示の組織再生創傷処置の好ましい実施形態は、皮膚代替物として魚皮を含むが、魚皮製品、またはＫｅｒｅｃｉｓ（商標）によって提供される魚皮ベースの創傷処置とは異なる他の皮膚代替物が、当然使用されてもよい。
拡張比較として、対象デバイスは、台頭する処置と比較して、より効果的な処置を提供する。本出願には、医療共通治療行為コードシステム（ＨＣＰＣＳ）の下で皮膚代替物としてＱコードが与えられた台頭する処置が含まれている。
上述したように、本開示による皮膚代替物の例として使用することができる皮膚代替物のグループは大きくて多様である。２０２０年２月２日に公開された「Skin Substitutes for Treating Chronic Wounds」Technical Brief Project ID WNDT0818と題されたＡＨＲＱ技術評価プログラムでは、９～１３頁の表２において、７６の市販製品が特定されているが、それらを社内で比較する研究はほとんどない。これらのリストされた皮膚代替物の各々は、本開示による皮膚代替物の実施形態であり得る。
より効果的な処置を示す議論では、処置結果、抗菌特性、一時的な足場特性、および利用へのそれらの影響の比較に焦点が当てられている。
生分解性足場に対する抗菌色の組み合わせは、少なくとも各々の基本機能を妨げるものであってはならず、相乗的な相加効果をもたらす可能性がある。
一時的な足場形成は、細胞の内方成長、血管新生、および細胞外マトリックスの再生を支持することによって組織の再生を助ける組織足場であると理解することができる。現行の一時的な足場では細菌の増殖を防ぐことができない。実際、場合によっては、コラーゲンは細菌のための栄養素として働き得る。現行の一時的な足場製品は創傷ケアにおける使用に適応していない。
抗菌製品は、デバイスの細菌定着を防ぐが、必ずしも足場形成を助けるものではない（銀ベースの製品の場合、細胞毒性効果のため実際には有害であり得る）。
本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置は、「デバイス識別」と呼ばれ得るものを提供する。吸収性包帯が創傷に適用されると、何が活性ではあるが部分的に吸収されたデバイスであるのか、または何が除去すべき創傷の脱落組織であるのかを特定することが困難になり得る。これは、時期尚早の包帯変更につながりかねない。現在、色を識別することができる吸収性創傷製品はない。
足場と抗菌色の組み合わせによって、相乗的な相加効果がもたらされる。
本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置は、一時的な足場形成および吸収性創傷ドレッシングのデバイス識別を提供する、本発明者らに知られている最初の創傷ケア製品である。抗菌保護と組み合わせることによって、細菌が炎症を引き起こしたり、製品内で増殖して、分解を促進したりするリスクが制限される。さらに、簡単なデバイスの識別によって、より正確な包帯交換が可能になる。
一時的な足場形成は他の皮膚代替物と比較され得る。一時的な足場形成は、細胞の内方成長、血管新生、および細胞外マトリックスの再生を支持する。組織工学の分野が進化し続けるにつれて、理想的な皮膚移植の基準は、細胞の統合および組織の増殖を支持する材料へと移行してきた。これらの基準には、足場が以下の１つまたは複数、好ましくはすべてを満たす必要があることが含まれる：細胞の内方成長を可能にして促進する；細胞の均一な空間分布を可能にする；細胞外マトリックスの再生を支持する；血管新生を支持する；異物タイプの反応を引き起こさない；迅速に創傷に統合する；機械的に強くて安定している。
本発明者らは、本開示に記載されるような魚皮移植技術が、一時的な足場機能を提供することができることを示した。さらに、細胞の内方成長、血管新生、および細胞外マトリックスの再生に対する足場形成の結果が、吸収性コラーゲンデバイス、たとえばＰｒｉｍａｔｒｉｘなどの他の既知のデバイスよりも効果的であるという証拠が示されている。
これらの結果に基づいて、本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置が、一時的な足場として機能することによって、標準ケアよりも効果的な処置をもたらすという証拠が存在する。
元の魚皮に抗菌剤を加えることによって、デバイスに抗菌保護が提供される。また、適切な着色剤の添加が魚皮の基本的な足場形成効果を妨げないことが本発明者らによって発見された。ＭＢおよびＧＶは、ヒトへの毒性を最小限に抑えながら臨床現場で微生物を減少させるために使用することができる有機染料である。ＭＢおよびＧＶは、創傷内の局所的な細菌負荷の迅速な管理のために局所的に使用することができる。好ましい実施形態におけるＭＢおよびＧＶの濃度は、（各色の０．００３５ｇ／ｇ以下の）ハイドロフェラ・ブルー・レディ（Hydrofera Blue Ready）の濃度よりも低い、かつ市販の局所剤１％のＭＢおよびＧＶの濃度を著しく下回る、０．０００２５ｇ／ｇ（０．０１％）以下に制御される。もちろん、ハイドロフェラ・ブルー・レディは、着色剤の別の実施形態として使用されてもよい。ＧＶおよびＭＢは、コンパニオン製品の作用を阻害することなく、酵素的デブリードマン用薬剤、増殖因子、およびハイドロゲルと併用することができる。
本開示の組織再生創傷処置、特に魚皮を含む組織再生創傷処置に使用されるＭＢおよびＧＶは、魚皮の足場形成効果を損なわないことが本発明者らによって発見された。魚皮へのＭＢやＧＶの添加は、滅菌前に製造プロセスの最終段階で実施され得る。当該工程では、元の魚皮の設計、材料、機能、包装、および滅菌は変更されない。
最近の研究（Stone II, International Journal of Molecular Sciences, 2021）では、前臨床ブタモデルに対して深達性部分層（ＤＰＴ）熱傷を処置する際の魚皮移植片とウシ胎児真皮（Ｐｒｉｍａｔｒｉｘ）との比較が実施された。この研究の目的は、魚皮移植片がＤＰＴ熱傷にどの程度効果があるのか、どのように統合するのか、および長期的な治癒を改善するかどうかを判定することであった。研究の条件では、魚皮移植片はウシ胎児真皮よりも速く創傷床に統合することが判明した。魚皮移植片によって、結果として、１０日目に開始して２８日目までに、特に１４日目に再上皮化がより速くなり、魚皮移植片とウシ胎児真皮との間の違いが顕著であった。魚皮移植片によって、結果として、血流が増加し、新たに形成された血管が増加した。魚皮移植片は２１日後に表皮の完全な形成を促進した。また、魚皮移植片は炎症反応を引き起こすことがほとんどなかった（異物が少なく、炎症細胞も少ない）。
この研究の結果は、魚皮移植片が好ましい実施形態であるという証拠を提供しているが、ウシ胎児真皮（Ｐｒｉｍａｔｒｉｘ）製品は、当然、本開示に従って依然として効果的な皮膚代替物として使用され得、いくつかの条件または検討下で、本開示で企図されるような皮膚代替物の好ましい実施形態でもあり得る。
さらに、この研究は抗菌剤ＭＢおよびＧＶのない魚皮製品の無着色バージョンで行ったが、作り出された創傷の程度を、表皮と真皮の両方を損傷した、および多くの場合複雑で処置に時間がかかる、深達性部分層熱傷として分類した。この研究における魚皮の役割は、一時的な被覆としてだけでなく、長期的な治癒のための一時的な足場としても作用することである。この研究は、元の魚皮の足場形成効果に関する多くの重要な洞察を提供している。
本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置は、現在知られている他の皮膚代替物と比較した対象デバイスの細菌定着を防ぐ。
「細菌バリア」という語句は、感染を軽減するのを助け、一時的な足場が意図した通りに機能することを確かなものとし得るため、広域スペクトルの抗菌剤が包帯の細菌の侵入に対するバリアを提供することを意味すると理解され得る。
広い意味での皮膚代替物は、身体自身の細胞によって浸潤され、その後、統合、吸収、または分解される生分解性組織であると考えられ得る。ほとんどの皮膚代替物は、細菌の侵入を防御する生来の能力が低く、創傷に細菌が存在する場合に定着され得る。皮膚代替物の細菌定着によって、分解がより迅速になり、宿主の細胞の内方成長が起こりにくくなる。
７６の皮膚代替物のうち、いくつかの抗菌効果をもたらす他の２つの皮膚代替物、すなわちＰｒｉＭａｔｒｉｘ ＡＧおよびＰｕｒａｐｌｙＡＭがリストされている。しかし、これら２つはいずれも、本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置に使用される抗菌剤と同じ抗菌スペクトルおよび抗菌活性を有することが発見されなかった。もちろん、上述したように、ＰｒｉＭａｔｒｉｘ ＡＧおよびＰｕｒａｐｌｙＡＭは、依然として本開示における皮膚代替物の実施形態として考慮され得、実際、特定の状況および条件下では、好ましい実施形態となり得る。
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もちろん、上述したように、ＰｒｉＭａｔｒｉｘ ＡＧおよびＰｕｒａｐｌｙＡＭは、依然として本開示における皮膚代替物の実施形態として考慮され得、実際、特定の状況および条件下では、好ましい実施形態となり得る。対象デバイスの抗菌範囲は、同等のＭＢおよびＧＶ濃度を有する包帯であるハイドロフェラ・ブルーに匹敵する。
本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置は、最適な利用サイクルを促進する、用語「デバイス識別」であり得るものを提供し得る。「デバイス識別」は、創傷床に統合するときに製品の識別を容易にする着色剤として理解され得る。
皮膚代替物は、適用前には最も透明またはオフホワイトであり、創傷床への統合時には透明、白色、またはキャラメル色になる。この外観は、特に経験の浅いユーザにとっては、場合によって、創傷の脱落組織、滲出液、またはバイオフィルムと区別することができない。このため、皮膚代替物が完全に統合して交換が必要であるかどうか、または依然として部分的に活性であり、創傷内により長く保つことができるかどうかを判定することが困難になる。依然として創傷に活性な皮膚代替物が存在するかどうかを判定することができないと、次の３つの結果につながり得る：（１）創傷内の脱落組織をコラーゲン包帯と誤認し、医療提供者が創傷から脱落組織を除去しないことにつながり、そのため、創傷治癒が遅くなり、感染のリスクが高まる；（２）創傷内の活性産物を脱落組織と誤認し、医療提供者がデバイスを時期尚早に取り外してしまうことにつながる；および（３）新鮮な宿主細胞の内方成長を伴う一時的な活性足場組織の除去。
創傷内の活性産物が脱落組織と誤認されると、患者にとって不必要な介入および関連コストが伴ってデバイスの早期再適用につながる。
本明細書に開示されるような新規なデバイスは、脱落組織または他の組織との区別を安全かつ容易にする生体適合性着色剤を使用して着色される。これは、色を移植片に結合する開示された着色剤を用いて行われる。
当該デバイスは、画期的な技術、および慢性的な非治癒性の創傷の処置の臨床上の改善および考えられ得る切断の予防につながる可能性のある革新技術の新規応用を表している。当該デバイスは、足場上の細菌定着を阻害しながら、ヒト細胞の浸潤と増殖、血管新生を支持する３Ｄ構造を提供する。
本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置は、少なくとも以下の特徴の１つまたは複数、好ましくはすべてを有する：細胞の内方成長および血管新生を促進する安定した吸収性足場を提供する；多くの場合創傷内に存在する微生物に対処するために広域スペクトルの適用範囲を提供する；銀含有包帯と比較して、宿主細胞に対する毒性を引き起こさず、細胞の内方成長を阻害しない；抗菌包帯と比較して細菌の抗菌耐性における変化の変異を引き起こさない。
さらに、着色剤の枯渇により包帯の色の変化が生じ得、これは包帯の交換を導くための重要な視覚的指標を提供し得る。
出願人は、以前に明確にされたデバイスのＯｍｅｇａ３ Ｗｏｕｎｄに関する複数のインビトロおよびインビボの一時的な足場データを有している。本発明者らの証拠は、足場への着色剤（抗菌剤）の添加が基本機能に干渉せず、相乗的な相加効果を有することを示している。
細胞の内方成長に関するインビトロ研究（Magnusson, Military Medicine, 2017）では、線維芽細胞の浸潤が少ないｈＨＡＣＭ材料と比較して、１２日後に線維芽細胞が浸潤し、魚皮移植片を再構築することが判明した。本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置は、足場への細胞浸潤を誘引する元の魚皮と同じ多孔質構造および孔径を保持する。細胞に対するＭＢおよびＧＶの毒性に対処するために、本発明者らは、予備的な細胞毒性試験を実施し、ＭＢおよびＧＶが細胞毒性の懸念を引き起こさないことを発見した。さらに、参照デバイスであるハイドロフェラ・ブルー・レディは、より高濃度のＭＢおよびＧＶを含有しているが、細胞毒性の懸念を引き起こさなかったため、本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤またはさらなる追加の活性剤のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置は、細胞の内方成長にいかなる悪影響も引き起こさないはずである。
予備的なベンチ研究は、抗菌能に対する、本開示の組織再生創傷処置、および特に皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、組織再生創傷処置の有効性を実証している。当該試験を、創傷感染症で最も一般的に見られる３つの微生物、大腸菌、黄色ブドウ球菌、および緑膿菌を使用して行った。試験方法は、寒天ディスク拡散などの単純で基本的なアッセイから、ＡＡＴＣＣ１ＯＯやＡＳＴＭ Ｅ２１４９などの、より挑戦的な工業標準試験まで、多岐にわたった。寒天ディスク拡散の結果は、Ｏｍｅｇａ３ ＷｏｕｎｄおよびＰｒｉｍａｔｒｉｘ ＡＧと比較して、皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の組織再生創傷処置が、黄色ブドウ球菌に対して明確な阻害領域の形成を示したことを示した。阻害領域の直径は、皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の組織再生創傷処置によっては１７．２５＋０．５ｍｍであり、Ｐｒｉｍａｔｒｉｘ ＡＧによっては１１．６７＋０．５８ｍｍであったが、魚皮は効果を示さなかったので、サンプルの直径（６ｍｍ）と同じ直径の阻害ゾーンを有していた。ＡＡＴＣＣ１ＯＯ評価の結果は、黄色ブドウ球菌および緑膿菌での、皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の組織再生創傷処置の高い有効性を実証した。緑膿菌に関して、減少率はおよそ９８％と推定された。皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の組織再生創傷処置は、黄色ブドウ球菌と緑膿菌の両方に対して強力な抗菌有効性を示した。ＡＳＴＭ Ｅ２１４９試験の結果は、Ｋｒｏｍａ Ａｎｔｉｖｉｒｕｓによる大腸菌懸濁液中の増殖の低下を実証した。皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の組織再生創傷処置を用いて寒天プレート上に３７個のコロニーが形成された一方で、無着色の魚皮および大腸菌懸濁液自体に４４５個および４９１個のコロニーが存在した。皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の組織再生創傷処置の恩恵で、増殖減少率はおよそ９２～９３％であった。
我々の予備試験からの発明者らの有望な結果を考慮すると、皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の組織再生創傷処置は、さまざまな種類の創傷に対して、より効果的な抗菌処置をもたらす。
コラーゲン足場は、創傷治癒プロセスを増強するように慢性創傷管理に広く使用される。生物活性創傷ドレッシングは、生体適合性があり、ＥＭＣテンプレートのような性質によって細胞の内方成長および組織再生が増強されるため、他の種類のドレッシングよりも利点がある。
本発明者らは、足場内の微生物の定着に抵抗する効果的なバリアとしての創傷の管理のための２つの抗菌着色剤と組み合わせた魚皮の一時的な足場を使用する好ましい実施形態を含む、さまざまな実施形態を発見し、開示した。一時的な足場は、包帯での微生物の定着を阻害しながら血管新生および細胞の内方成長を支持する。
皮膚代替物として魚皮を含み、（１つまたは複数の）着色剤（ＭＢおよびＧＶ）のいずれかによって抗菌特性が提供された、本開示の好ましい実施形態の組織再生創傷処置は、無細胞吸収性の魚皮創傷マトリックスである。創傷処置は、足場上の細菌定着を阻害しながら血管新生および細胞の内方成長を支持する一時的な足場として作用する。当該デバイスは、足場上にメチレンブルーおよびゲンチアナバイオレット（クリスタルバイオレット）による広域スペクトルの抗菌保護を提供する２つの抗菌剤を含む。対象デバイスは、最大２０×３０ｃｍのサイズの無菌でインタクトな、またはメッシュのシートとして供給される。広域スペクトルの抗菌剤は、感染を軽減するのを助け、一時的な足場が意図した通りに機能することを確かなものとし得るため、包帯の細菌の侵入に対するバリアを提供する。
使用上の適応
好ましい実施形態の組織再生創傷処置は、糖尿病性足部潰瘍、動脈性潰瘍、褥瘡、静脈性下腿潰瘍、および外傷性創傷を含む創傷の管理のための抗菌性の一時的な足場として意図されている。
デバイスの構成
好ましい実施形態の組織再生創傷処置は、創傷の管理を目的とした魚皮用医療デバイスである。以下で時にデバイスとも呼ばれる、主題の足場材料は、正規化された管理された製造プロセスによって野生の北大西洋タラ（Gadus morhua）の皮膚から得られ、以下のサイズでの皮パウチの最終滅菌包装で供給される：１６ｍｍのディスク；２×２ｃｍ；２×４ｃｍ；５×５ｃｍ；１０×１０ｃｍ；２０×３０ｃｍ。当該デバイスはまた、上で記載し、示したように、粒子化された形態で提供されてもよい。
当該デバイスは、足場上に広域スペクトルの抗菌保護を提供する、メチレンブルーおよびゲンチアナバイオレット（クリスタルバイオレット）などの２つの抗菌剤を含み得る。ＭＢおよびＧＶの濃度は、０．０００２５ｇ／ｇ（０．０１％）以下に制御されるが、０．１％以下まで含んでもよい。
対象デバイスは、好ましくは、新たな宿主組織の沈着に対応して、経時的に周囲の組織に完全に一体化される。対象デバイスの好ましい物理的特性によって細胞の内方成長が可能になる。対象デバイスは、好ましくは、生体適合性があり、非架橋で生体吸収性があり、強く、柔軟である。その引張強度は、縫合糸またはステープルによる固定を支持する。
対象デバイスの動作メカニズムは、次の３つの主要な領域に分解することができる：１．コラーゲンドレッシング：脱細胞化魚皮の創傷製品（Ｋ１３２３４３）と実質的に同等であり、以下の分化特性を備えている：１．１．抗菌着色剤が含浸されている：２ａ：「細菌バリア」：広域スペクトルの抗菌剤は、感染を軽減するのを助け、一時的な足場が意図した通りに機能することを確かなものとし得るため、ドレッシングの細菌の侵入に対するバリアを提供する。２ｂ：「デバイス識別」：着色剤は、創傷床に統合するときに製品の識別を容易にする。２．「一時的な足場形成」：細胞の内方成長、血管新生、および細胞外マトリックスの再生を支持する、一時的な足場形成２．１．コラーゲンドレッシング。対象デバイスは、同じ基本的な動作メカニズムを有するコラーゲンドレッシングとして、脱細胞化魚皮の創傷製品と実質的に同等に機能する。
コラーゲン足場の主な目的は、健康な組織の細胞外マトリックス（ＥＭＣ）を模倣するテンプレートとして働くことである。細胞を模倣して支持することで、多くのさまざまな種類の組織の再構築を支援して、創傷治癒プロセスを助ける。ＥＭＣの各成分は、創傷治癒の段階の各々に不可欠である。ＥＣＭの成分は、細胞の増殖と分化を助け、細胞遊走を誘導し、細胞応答を調節する上で重要な役割を果たす。外因性ＥＭＣは、創傷部位における健康な組織の自然なリモデリングを受けることで、分解され、天然のコラーゲンに置換される。脱細胞化魚皮の創傷製品は、慢性創傷において機能的なＥＭＣを再確立する。コラーゲン包帯は以下を提供する：（１）湿った創傷環境、（２）流体管理、および（３）流体の蒸散制御。
脱細胞化魚皮の創傷製品は、５１０ｋの市販前の通知プロセスを経て認可されたブタコラーゲンマトリックスの多くと実質的に同等であるため、コラーゲン包帯として使用され得る。創傷の管理用のためのコラーゲン包帯としての当該デバイスの有効性は、哺乳動物由来のコラーゲン包帯であるＯａｓｉｓ Ｗｏｕｎｄ Ｍａｔｒｉｘと比較した非劣性試験によって証明された。当該試験では、魚コラーゲン包帯がブタ由来のコラーゲン包帯に劣らず、副作用が特定されず、２８週間の期間中に創傷治癒の改善が見られたと結論付けられた。
脱細胞化魚皮の創傷製品と対象デバイスとの間の唯一の技術的違いは、着色剤の添加である。いずれの着色剤もコラーゲンの足場を破壊したり架橋したりする証拠や文献証拠はない。したがって、本発明者らの証拠に基づくと、魚皮ベースの皮膚代替物であるか、他の皮膚代替物であるかに関わらず、対象デバイスが、細胞の内方成長および血管新生を支援するために細胞外マトリックスを模倣する足場としても働くことを示唆する十分な証拠が存在する。
好ましい実施形態の着色剤は、有意な抗菌効果を有する。メチレンブルー（ＭＢ）およびゲンチアナバイオレット（ＧＶ）のおよそ０．０１％の混合物の着色剤を使用して、２つの抗菌剤は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方に対して広域スペクトルの抗菌保護を提供する。対象デバイス内のＭＢおよびＧＶは、細菌と接触すると、デバイス内の細菌増殖を持続不可能にすることによって細菌を除去する。
メチレンブルーは、フェノチアジンファミリーの一部であり、抗マラリア薬に対する耐性が生じたときにマラリアに対する最初にＦＤＡに承認された治療薬の１つである。ＭＢは、インビトロでの、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、およびカンジダ・アルビカンスを含む幅広い微生物とのその細菌の不活化を示している。
ＭＢおよびＧＶの色素は、創傷内のデバイスと脱落組織を区別するための指標として機能する。皮膚代替物は吸収性包帯であるため、包帯が完全に統合され、第２の適用が必要になるときが、色によって医師に通知される。また、当該色は、医師が創傷上のデブリードマンを実施するときに誤って包帯を除去することを減らす助けになる。無着色のコラーゲン包帯は、部分的に統合されている場合に、時に脱落組織と区別するのが難しい場合がある。
たとえば、図１５Ａは、細菌で満たされた創傷において脱落組織に変わった創傷内の移植片を示す。比較として、図１５Ｂは、およそ５０％統合されており、創傷内に残るはずである、創傷内の魚皮移植片を示す。しかし、図１５Ａの創傷内の脱落組織を図１５Ｂの創傷内の移植片と比較すると見られるように、内方成長を受けた移植片と脱落組織となった移植片とを正確かつ容易に区別することは困難である。比較として、図１５Ｃは、ＭＢ／ＧＶの着色剤で着色された皮膚代替物、この場合は魚皮移植片を示す。これは、図１５Ｃの移植片が統合されており、内方成長が生じていること、および図１５Ｃの移植片が、さらに１週間残留するべきであり、除去されるべきではないことから明らかである。
魚皮の上部にマウス胎児線維芽細胞を加えたインビトロ研究では、皮膚足場が非常に多孔性であり、細胞が足場内に遊走して増殖することができることが示されている。動物試験では、魚皮をブタモデルに生じた火傷に適用した。魚皮移植片は、結果として創傷治癒を早め、魚皮の下の優れた血流に加えて、新たに形成された血管の増加を示した。同じブタ試験では、魚皮移植片は、２１日後に表皮の完全な形成を促進して、再上皮化がより速くなり、炎症反応がより少なくなった。
患者の創傷に適用されると、対象デバイスの実施形態は、創傷に迅速に統合し、細胞の遊走および増殖のための一時的な足場を提供し、一方でＭＢおよびＧＶの分子は、マトリックス上の微生物の定着を阻害および除去する。豊富な真皮コラーゲン線維は、創傷治癒を早めるのに重要である細胞の内方成長、血管新生、および細胞外マトリックスの再生を支持する。
着色された皮膚代替物、たとえば魚皮移植片は、最終的には体内で分解される。最終的に何らかの炎症成分を有する初代線維芽細胞の細胞内方成長は、魚皮移植片などの元の皮膚代替物、および色を完全にリモデリングし、分解する。
酵素プロセスは主に、より小さく容易なプロセス粒子へのコラーゲンの加水分解および着色剤の減少である。
着色された皮膚代替物、たとえば魚皮移植片は、７×２０ｃｍまで、またはさらには２０×４０ｃｍという特徴を有し得、固体またはメッシュであり得、シート状または粒子状であり得る。
創傷処置の生成のさらなる例
組織再生創傷処置の実施形態の生成のための方法または手順のさらなる別の例では、以下の手順に従った。
我々の到着前に１０の皮膚がパックに入れられて平らに冷凍されていた。
０．０１％および０．００５％のＭＢ＆ＧＶの希釈を含む着色溶媒を混合して調製した。
清浄な水を得るために、シンクを使用して、細菌量をモニターし、使用前に煮沸した。
最初に、１％のストック溶液を作成した。
ＧＶ：６５０ｍｇの医薬品グレード（ＵＳＰ）、ＳＡ－１２９０００２、ＬＯＴ Ｇ１Ｋ４１７、ＳＰ１０９８５１１（Ｄｉｓｔｉｃａ）
ＭＢ：顕微鏡用に水和したメチレンブルー、≧９７％．０％、Ｓｉｇｍａ－ＡＩｄｒｉｃｈ ６６７２０－１００ｇ、ＬＯＴ ＃ＢＣＢＺ４９２９
０．４ｇのＭＢ＋０．４ｇのＧＶを、煮沸したフラスコ中の４０ｍｌの清浄な（まだ温かい）水に加えた。２５０ｍｇのＧＶが残っていることに留意されたい。
２本の２Ｌのボトルに、（重量で測定した）２Ｌの清浄な／煮沸した水を充填した。１本のボトルから、１０ｍｌを清浄なピペットで除去し、もう１本のボトルから、２０ｍｌの水を除去した。これらの容量をストック溶液に置き換えて、それぞれ、０．００５％および０．０１％のＭＢおよびＧＶの溶液を作成した。最終溶液を調製した後、ボトル内の水は触れるとかなり熱くなっており、染色の結果に影響を与えかねなかった。
２つの化合物がすべての表面を広範囲に染色し、これが、水とエタノールを用いて、すべての表面の強力な洗浄が必要であったことを意味していることに留意されたい。
その後、魚皮を、冷凍庫から取り出し、氷上に置いて、着色溶液とともに輸送した。すべてを、凍結乾燥機の隣のハイリスクエリアのチャンバに持ち込んだ。魚皮を、ハイリスクのチャンバの蛇口から水道水の流水下で解凍した。魚皮は、かなり大きくて長いため、柔らかく柔軟になると、２つのより短い部分に切断した。５つの魚皮（１０等分）を、染色のために２つのアルミニウムトレイに置いた。
およそ７００ｍｌのＫｒｏｍａ溶液を各トレイに置き、それぞれ、０．０１％および０．００５％に標識化した。その後、２つのトレイをビニール袋に入れ、こぼれるリスクを減らすために折り畳み、２時間３０ｒｐｍでシェーカーセット上に置いた。
およそ２０～３０分後、均一な染色を促すために魚皮を滅菌ワイパーで動かした。およそ２０分後、魚皮が染色を吸収するにつれて、染色溶液が、その密度を減少させ、透明になっていることが明らかになった。これを補正するために、およそ３００ｍｌの染色溶液を各トレイに加え、これは、最終的な染色量がおよそ１０００ｍｌであったことを意味している。
元の着色溶液と使用した染色溶液の残りの両方の一部を、後の濃度の定量化を可能にするために、５０ｍｌのチューブに保存する。これを、凍結乾燥後の魚皮のサイズおよび重量の測定と組み合わせて、魚皮への色の吸収を大まかに定量化することが可能であった。
実行する準備が整うまでに約４５分かかるため、凍結乾燥機を１８：００直後に使用し始めた。
コンピュータエラーが原因で、凍結乾燥機の起動が困難であった。したがって、染色にはおよそ３時間かかった（シェーカーが、３時間後により速いデフォルトの振盪速度に戻ることに留意されたい）。皮膚を、高リスク室において水道水の流水で１０～１５分間徹底的に洗浄した。
残りの着色溶液は明らかに再びいくらか明確に透明になり、魚皮の２つのバッチにわずかな色の違いがあり、０．０１％が真のデニムダークブルーであった一方で、０．００５％はむしろデニムブルーに近かった。定量化が可能な場合には、残りの染色液のサンプルを、５０ｍｌのチューブに収集した。合計で３枚の完全なプレートを有するように、両方のバッチで約１枚半のプレートが必要であった。より強く染色した皮膚は、共有プレートの左手側にあった。
冷凍乾燥を、午後８時半頃に開始し、一晩放置した。
魚皮を、午前中に冷凍乾燥し、非滅菌用途のために包装した。（室温での）残った０．０１および０．００５％の溶液を使用して、翌日別のバッチを繰り返した。
プロトタイプの創傷処置の生成のさらなる例
メチリンブルーとゲンチアナバイオレットの２つの異なる濃度の着色したタラの皮膚の２つのプロトタイプを生成する。色溶液の濃度は、０．０１％ｗ／ｖの水溶液ｗ／ｖ；メチリンブルー（５０％）およびゲンチアナバイオレット（５０％）、および０．００５％ｗ／ｖの水溶液ｗ／ｖ；メチリンブルー（５０％）およびゲンチアナバイオレット（５０％）である。
材料：鱗を落として脱細胞化された１０のタラの皮膚、Ｂａｔｃｈ ＤＣ ２１０３９Ａ；１リットルの０．０１％ｗ／ｖの水溶液ｗ／ｖ；メチリンブルー（５０％）およびゲンチアナバイオレット（５０％）；１リットルの０．００５％ｗ／ｖの水溶液；メチリンブルー（５０％）およびゲンチアナバイオレット（５０％）；１０のアルミニウムトレイ；はさみ；小さなタイベックパウチ；大きなタイベックパウチ；大きなビニール袋；シェーカー；シーラー。
プロトタイププロセス：すべてのタラの皮膚は、同じ日に製造されたものからの新鮮なものであった。－８０℃で５時間冷凍した。タラの皮膚は大きすぎてアルミトレイに収まらなかったため、２つに切断して、合計２０のタラの皮膚にした。
プロトタイプ０．０１％
０．０１％の溶液１リットルを、ＭＢ－ＧＶ ０．０１％とマークしたアルミニウムトレイに注ぎ、１０枚のタラをトレイに均等に置き、溶液が皮膚を確実に覆うことを確かなものとした。トレイをビニール袋に入れて、色がこぼれ落ちるリスクを最小限に抑え、その後、トレイをｐｒｏ：４０でシェーカー上に３時間置いた。
プロトタイプ０．００５％
０．００５％の溶液１リットルを、ＭＢ－ＧＶ ０．００５％とマークしたアルミニウムトレイに注ぎ、１０枚のタラをトレイに均等に置き、溶液が皮膚を確実に覆うことを確かなものとした。トレイをビニール袋に入れて、色がこぼれ落ちるリスクを最小限に抑え、その後、トレイをｐｒｏ：４０でシェーカー上に３時間半置いた。
シェーカー上での着色の開始：１５：４０±１０分
シェーカー上での着色の終了：１９：０５±５分
すすぎ開始時間：１９：０５±５分
すすぎ終了時間：１９．２０±５分
冷凍乾燥：すべての魚皮を、スチールプレート上に広げ、別のプレートをその上に置いて挟んだ。凍結乾燥機プログラム：ＳｖａｖａＣｏｌｏｒ－１０時間の合計時間。
包装：目視検査および曲げ試験によって、清浄で乾燥した着色したタラの皮膚を支持して、包装の準備を整えた。サンプルをタイベックパウチへと包装し、大小のサンプルパウチに包装し、マークを付けて、密封した。
これらのプロトタイプに対して、皮膚の削り取りは行わなかった。
創傷処置の染色堅牢度および機械的特性を改善するための架橋
さらなる実施形態では、皮膚代替物、たとえば足場材料の架橋が、皮膚代替物の特性をさらに増強することができ、これには、皮膚代替物を着色する着色剤の堅牢度を増加させること、皮膚代替物の機械的材料特性を増加させること、皮膚代替物における酵素的および化学的分解に対する耐性を増加させること、および処置した創傷などの生物学的条件下で皮膚代替物に加えられた着色剤の寿命を延長することが含まれることが本発明者らによって発見された。好ましい実施形態では、皮膚代替物、たとえば足場材料を架橋する主な目的は、創傷に適用されてから少なくとも１日間、好ましくは創傷に適用されてから３日間、および創傷に適用してから、より好ましくは８～１０日間まで、さらに好ましくは１４日間まで、その色を維持する着色製品を得ることである。
本明細書に記載されるように、皮膚代替物および／または着色剤が加えられた皮膚代替物の架橋は、さまざまな手段、たとえば、照射または化学的手段によって実施することができる。
化学架橋または修飾因子
一実施形態では、皮膚代替物は、架橋剤による皮膚代替物の処置によって架橋される。別の実施形態では、皮膚代替物のタンパク質は、他にタンパク質修飾剤による皮膚代替物の処置によって修飾される。
実施形態では、化学架橋剤は、以下の基のうちの１つまたは複数を標的とする：一級アミン（－ＮＨ２）；カルボキシル（－ＣＯＯＨ）；スルフヒドリル（－ＳＨ）もしくはカルボニル（－ＣＨＯ）、または他の基。したがって、架橋剤は、たとえば、アミン反応性、カルボキシル対アミン反応性、スルフヒドリル反応性、および／またはアルデヒド反応性であり得る。
第１の実施形態では、架橋剤は単糖またはモノサッカライドである。グルコース、フルクトース、またガラクトースを含む、代替の糖が使用されてもよい。たとえば、架橋剤は、リボースであってもよいし、リボースを含んでもよい。グルコース、フルクトース、またガラクトースを含む、代替の糖が使用されてもよい。寡糖類、二糖類も考慮され得る。
別の実施形態では、架橋剤は、天然または合成の架橋剤である。たとえば、実施形態では、架橋剤は、ゲニピンを含むか、またはゲニピンである。
実施例１－リボースの架橋
リボースが架橋剤として使用される第１の例が本明細書に提供される。
本実施例によれば、標準リボース（ストック）溶液が調製される。このために、リボースの０．２Ｍ（モル）の溶液を、０．０５％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で作成して、細菌増殖を防いだ。他の濃度のリボースが使用されてもよく、他の細菌増殖防止剤が使用されてもよい。本実施例では、溶液には、重量で３０．０３ｇのリボース、９．５５ｇの予め混合したＰＢＳ標準、および５０ｍｇのアジ化ナトリウムが含まれる。乾燥成分を、精密秤を使用して計量し、１Ｌのメスフラスコに加え、脱イオン水で１．００Ｌになるまで希釈する。成分を完全に溶解するまで混合し、その後、溶液の使用の準備を整える。
本実施例では、Ｋｅｒｅｃｉｓ（商標）の魚皮由来の細胞足場製品を皮膚代替物として使用する。概して、粒子化された足場材料さえ含む、任意のサイズおよび／または数の足場を処理することができた。足場材料が溶液に加えられている容器は大きくてもよく、リボース溶液の体積はサンプルを完全に覆う。本実施例では、足場材料を、４×８ｃｍ2の断片に切断した。長い方の辺（８ｃｍ）がタラの魚皮の長さと平行となるように、より大きなサンプルから５つの断片またはサンプルを切り出した。その後、サンプルを、室温で３～６日間約２５０ｍＬのリボース溶液に浸漬した。第１のサンプルを３日目のマークで除去し、次の２つを５日目、最後の２つを６日目で除去した。同じサイズの追加のサンプルも、４０時間約８０ｍｌで浸漬することによって調製した。
各サンプルを、リボース溶液から除去した後、流水で洗浄し、その後、２日間水浴に入れて、未反応のリボースをＰＢＳおよびアジ化ナトリウムとともに洗い流した。水をさらに定期的に（毎日１回または２回）交換して、洗浄プロセスを助ける。その後、サンプルを、部分的に乾燥し、さらなる処理のために冷凍する。
リボース架橋足場のための染色方法：架橋足場を染色するために、２つの一般的な方法が使用されている。１つはメタ染色として記述され得、ここで、ＭＢおよびＧＶを架橋溶液に加える。この方法では、１つの４×８ｃｍ2の足場片を、９８ｍＬの標準／ストックリボース溶液（上記と同じ）および１ｍＬの各色素（ＭＢ／ＧＶ）ストック溶液からなる溶液に２４時間浸漬し、ストック溶液は０．１重量％であるため、溶液中のＭＢ／ＧＶの濃度は０．００２％になる。架橋／染色を組み合わせたプロセスの後、架橋について上記した方法と同じ方法で、サンプルを、最初に水道水で洗浄し、その後、水中に２日間放置して、図１６に示されるようなサンプル１６１０を生成した。図１６のサンプル１６１０は、「メタ」溶液中に２４時間放置された、メタ染色され、リボース架橋され、染色された足場である。
第２の方法によれば、後染色では、「標準染色プロセス」について前に論じた条件と同じ条件を使用し、すなわち、足場が架橋および洗浄プロセスを経た後、サンプルを、ＰＢＳ中のＭＢ／ＧＶの０．００２重量％溶液中に３時間染色し、このために、４×４ｃｍ2の足場片を１００ｍＬの溶液中で染色した。これは、架橋時間に関係なく、たとえば、２４時間、４０時間、５日間、または６日間、予め架橋された足場を用いて行うことができる。図１７は、０．００２％のＭＢ／ＧＶＰＢＳ溶液中での３時間の標準染料処理後に４０時間放置された、後染色された、リボース架橋された足場１７１０を示す。
他の実施形態および例示的な方法は、上記のリボース架橋例からの変形を含み得る。メタ染色のプロセスは、少なくとも２つの方法で変更することができる。第１の変更には、溶液中の時間を増減することが含まれ得る。第２の変更には、溶液中の色素またはリボースのいずれかの濃度を変更することが含まれ得る。染料の吸収は、経時的に比較的ゆっくりと起こり、溶液の染料濃度に直接関係しているため、たとえば、メタ染色が４８時間である場合、足場内の色の濃度が上記した２４時間のプロセスの場合と同じである必要がある場合、溶液中のＭＢおよびＧＶの濃度を下げることが生産的であり得、実際に、（理にかなった範囲内で）時間と濃度の任意の組み合わせが可能であり、特有の結果が得られる。
上述したような後染色に関して、足場の架橋時間は変更することができる。足場内の色素の濃度の変化が有効にされた場合、色素の濃度および／または色素溶液中の時間も変更することができる。
実施例２－ゲニピン架橋
第２の実施例では、上述したように、ゲニピンを架橋剤として使用し、そのための例示的な手順がここで説明される。
ゲニピン架橋溶液を調製する。本実施例によれば、ＰＢＳ中のゲニピンの０．３％（ｗ／ｖ）の溶液を作製し、０．６０ｇのゲニピンを２００ｍＬの既製のＰＢＳ溶液（９．５５ｇの既製のＰＢＳ粉末／１Ｌ）中に溶解することによって、２００ｍＬの溶液を作製した。固体粒子が残らなくなるまで溶液を撹拌する。
本実施例では、Ｋｅｒｅｃｉｓ（商標）の魚皮由来の細胞足場製品を皮膚代替物として再び使用する。概して、粒子化された足場材料さえ含む、任意のサイズおよび／または数の足場を処理することができた。本実施例では、１５ｍＬのウェルを備えた培養プレートを使用した。２×２ｃｍ2の足場／コラーゲン片を各ウェルに置き、ゲニピン溶液を加える。各ウェルを合計１５ｍＬの溶液で完全に充填した。その後、プレートを、蓋で閉めて密封した後、３７℃の水浴に２４時間浸漬した。温度が３７℃で一定である場合、任意の他の加熱源が働き得、容器を密閉するか溶液を再凝縮させることによって蒸発が制限されることに留意されたい。溶液中で２４時間が経過すると、足場を水で洗浄し、冷凍した。本実施例では、ゲニピンによる架橋によって、足場材料が巻き上げられた他に、足場が青みがかった黒色に変化した。サンプルの剛性にも明らかな違いがあった。
リボースの架橋および染色と同様に、本実施例で検討した２つの方法は、架橋中および架橋後の染色、すなわちメタ染色および後染色である。本実施例では、６つのウェルを使用し、そのうちの４つは、０．３％のゲニピン溶液１５ｍＬのみを含有し、２つはＭＢおよびＧＶも同様に含有した（メタ染色）。メタ染色溶液を、１５０μＬの各色素ストック溶液（０．１重量％）をウェルに加え、その後１４．７ｍＬのゲニピン溶液を加えることによって調製した。ＭＢ／ＧＶの添加を除いて、６つのウェルはすべて同じであり、架橋プロセス中に同じ処理を受けた。
ゲニピン架橋足場のための後染色手順は、リボース架橋足場の場合と同じである。サンプルを、０．００２％のＭＢ／ＧＶ、ＰＢＳ溶液中に３時間浸漬し、染色する２×２ｃｍ2ごとに、２５ｍＬの溶液を使用する。ここで、５０ｍＬの溶液を使用して、図１８のサンプル１８１０を生成するように、２つの２×２ｃｍ2の足場片を染色した。図１８は、０．００２重量％のＭＢ／ＧＶのＰＢＳ溶液中で３時間染色された、後染色されたゲニピン足場であるサンプル１８１０を示す。染色後、サンプルを、洗浄し、部分的に乾燥し、冷凍した。
他の実施形態および例示的な方法は、上記のゲニピン架橋例からの変形を含み得る。ゲニピン架橋足場サンプルの染色プロセスに対して行われ得る変更は、本質的には前述のリボース方法の場合と同じである。すなわち、プロセス（メタまたは後染色）に関係なく、染料の時間と濃度を変更することができる。
図１９Ａおよび１９Ｂは、化学架橋による着色の維持の改善の比較を示す。図１９Ａは、皿１９３０、１９２０、および１９１０におけるそれぞれの断片１９－Ｃ、１９－Ｂ、および１９－Ａの比較を示す。断片１９－Ｃ、１９－Ｂ、および１９－Ａが採取されたサンプルの各々は、０．００２％のＭＢ／ＧＶ、ＰＢＳ溶液中で３時間放置されたＫｅｒｅｃｉｓ（商標）の魚皮由来の細胞足場製品であった。断片１９－Ｃが採取されたサンプルも、上記実施例２に従って０．３％のゲニピン溶液で架橋した。断片１９－Ｂが採取されたサンプルも、上記実施例１に従ってリボース溶液で架橋した。また、断片１９－Ａが採取されたサンプルは架橋しなかったが、０．００２％のＭＢ／ＧＶ、ＰＢＳ溶液中で３時間着色しただけであった。
比較のために、図１９Ａは、染色後の皿１９３０、１９２０、および１９１０におけるそれぞれの断片１９－Ｃ、１９－Ｂ、および１９－Ａ、ならびに１９－Ｃおよび１９－Ｂのためのサンプルを示す。続いて、ｐＨ８の重炭酸塩溶液を、等量および等しい濃度で、皿１９３０、１９２０、および１９１０の各々に加えた。断片１９－Ｃ、１９－Ｂ、および１９－Ａを、それぞれ、皿１９３０、１９２０、および１９１０において３７℃の温度で４８時間保管し、結果として図１９Ｂに示されるように４８時間後に同じ断片１９－Ｃ、１９－Ｂ、および１９－Ａが得られた。
見られるように、それぞれゲニピン（１９－Ｃ）およびリボース（１９－Ｂ）でそれぞれ架橋された、断片１９－Ｃおよび１９－Ｂの染色堅牢度は、同様に着色されたが架橋されなかた１９－Ａよりも顕著に改善された。架橋されたピース１９－Ｃおよび１９－Ｂは、それらの着色がより速く、より良好に維持されることを明らかに示している。
さらに、リボースとゲニピンに関する、両方の場合において、架橋プロセスのための濃度および時間も同様に変更することができることは留意するに値する。これは、メタ染色の場合に両方の手順のための最終色に影響するが、上記の方法を使用するときに結果として架橋から直接得られる色が非常に暗くて濃縮されているため、ゲニピンの場合にはより大きな影響がある。溶液中の時間、濃度、または温度が低下される場合、いくつかの研究で示されているように、結果として、架橋が少なくなり、色が明るくなる。
照射による架橋
別の実施形態では、皮膚代替物は、皮膚代替物材料に電磁放射線を照射することによって架橋される。第１の例では、皮膚代替物、たとえば足場材料は、紫外線（ＵＶ）放射線で照射される。
ＵＶ架橋の例
ＵＶベースの例によれば、２００ｍＬの滅菌水を２００ｍｇのＭＢに加えて、色が溶解するまで撹拌することによって、メチレンブルー（ＭＢ）の０．１％のストック溶液を調製した。１リットルの液体１０×ＰＢＳを８．８リットルの水道水と混合して、撹拌することによって、ＰＢＳ溶液も調製した。
Ｋｅｒｅｃｉｓ（商標）の魚皮由来の細胞足場製品を皮膚代替物として再び使用した。概して、粒子化された足場材料さえ含む、任意のサイズおよび／または数の足場を処理することができ、これは、１ｍｍもの小さな直径を有し得る。本実施例では、使用した断片は、４×８ｃｍに切った１４の魚皮片および切られていない２つの魚皮を含んだ。魚皮をすべて予め削り取り、肉組織、鱗、筋膜を除去した。
ＰＢＳおよびストック溶液の一部を、大きな容器に入れ、均一になるまで撹拌した。各溶液の量は、ＰＢＳストックで８．８Ｌ、ストック色で２００ｍＬであった。
色溶液を調製した後、魚皮を、色溶液に加えて撹拌し、魚皮がくっつき合うことがないことを確かなものとした。
魚皮を、色溶液中に３．５時間放置し、１時間ごとに撹拌した。ＵＶキャビネットを設置し、魚皮をトレイに並べた。
ＵＶ放射線源は、１５ＷのＵＶ光（２５４ｎｍ）であり、これを、放射線工程中にトレイを光の下に置くことができるようにキャビネットの内側にネジで留めた。キャビネットの内部をアルミホイルで覆い、壁の光の方向を魚皮に向けようと再び方向付けた。トレイを、光からおよそ１２ｃｍ離れた位置に配置した。本実施例では、ほぼ単色のＵＶ放射であるＵＶ光を選択したが、他の実施形態では、さまざまなワット数および波長の他のＵＶ源が、単色ＵＶ放射または多色ＵＶ放射のいずれかで使用されてもよく、ＵＶ放射は、約１０ｎｍから約４００ｎｍの範囲内の波長を有する。
したがって、以下を含むサンプルを得た：ＭＢベースの着色溶液から除去し、ＰＢＳ溶液（色なし）に入れ、ＵＶ放射線に曝露した、サンプルＡ；ＭＢの色溶液に入れ、ＭＢの色溶液中にある間にＵＶ放射線に曝露した、サンプルＢ；および色溶液に入れたが、ＵＶ放射線には曝露しなかった、サンプルＣ。言い換えれば、サンプルＡの皮膚を、ＭＢベースの色溶液中で染色し、その後、ＰＢＳ溶液中にある間にのみＵＶ放射によって架橋した点で、サンプルＡの皮膚は、後染色の架橋に類似していると考えられ得る。比較すると、サンプルＢの皮膚が、ＵＶ放射によって架橋されている間にＭＢベースの着色溶液中に残っていたという点で、サンプルＢの皮膚は、メタ染色に類似していると考えられ得る。また、サンプルＣの皮膚を、ＭＢベースの色溶液中で染色したが、染色中または染色後にＵＶ放射線に曝露しなかったという点で、サンプルＣの皮膚は対照であると考えられ得る。しかし、対照として、サンプルＣの皮膚を、ＵＶキャビネット内ではあるが、ＵＶ放射線に曝露されなかったキャビネットの暗い部分で維持した。このようにして、サンプルＣの皮膚を、サンプルＡおよびサンプルＢの架橋した皮膚との比較のために同様の温度、フリッピング、および時間条件で処理した。
皮膚を、それらのそれぞれの液体溶液中に６時間放置した。皮膚が上に浮いていたため、上下逆に裏返し、両面が均等にＵＶ光に曝露されることを確かなものとした。これを、（暗所で）ＵＶ光に曝露されていないトレイ内の皮膚に対しても行い、ＵＶ光下の皮膚と同様のプロセスを行った。皮膚をひっくり返すとき、ＵＶ光を、およそ５～１０分間消した。
皮膚をひっくり返したときの液体溶液の温度を測定した。５時間後の最高温度が２５℃未満であったため、冷却システムが必要になる程度までＵＶ光が溶液および皮膚を加熱しなかったと結論付けた。
放射工程の後、皮膚を、トレイから収集し、サンプルＡ、サンプルＢ、およびサンプルＣに１つずつ、３つの別々の袋に移動させた。皮膚を、冷水で数分間すすぎ、鋼板に配置した後、凍結乾燥機に挿入した。皮膚を一晩凍結乾燥機に放置した。
皮膚を３つの別々の袋に収集し、各断片をタイベック袋に密封した。
さまざまなサンプルの一部の断片を、エチレンオキシドを使用して滅菌した。
サンプルＡ：サンプルＡの皮膚をＭＢの色溶液中で着色し、続いてそこから除去し、すすぎ、ＵＶ光下でＰＢＳ溶液中に入れた。ＰＢＳ溶液は元々色を有していなかったが、ＵＶ放射の終わりに、前の着色からの皮膚からの色が皮膚から漏れ出てＰＢＳ溶液を着色したことは明らかであった。皮膚の最終的な色は、より暗い青色であった他のプロトタイプと比べて、皮膚上でより明るい青色で、さらには少し緑色であった。
サンプルＢおよびサンプルＣ：サンプルＢの断片２０－ＢとサンプルＣの断片２０－Ｃとを比較したところ、図２０Ａに見られるように、ＵＶ光に曝露したサンプルＣの皮膚と比較して、サンプルＢの皮膚の架橋が完了すると、ＭＢベースの色溶液中にある間にＵＶ光の下に置いたサンプルＢ（サンプルＢ）の着色した皮膚間に目に見える違いはなかった。比較のために、サンプルＡの断片２０－Ａも図２０Ａに提供される。サンプルＢおよびサンプルＣの皮膚は非常に類似した色を有しており、魚皮の質感には目に見える違いや感触はなかった。
色の定量化のために液体溶液のサンプルは収集しなかった。プロトタイプは、ＵＶ放射とそれが魚皮にどのような影響を与えるかの試験のためにのみ作成した。
魚皮の一部を酵素中で分解し、その溶液の色の量を測定することによって、皮膚における色の量を測定するための他の方法が後に使用され得る。
架橋サンプルの染色堅牢度を比較する手段として、サンプルを塩基および酸（酸／塩基）溶液中に３７℃で放置することによって、各サンプルの断片の色漏れを実施した。さらに、サンプルを、前に異なる媒染剤を作成し、溶液のｐＨを徐々に変化させながら着色した、他のプロトタイプと比較した。その結果は、ＵＶで架橋したサンプルが、多くの他のプロトタイプよりも長く色を維持することを示した。
図２０Ａ～２０Ｄは、ＵＶ照射による化学架橋が要因の着色の維持の改善の比較を示す。図２０Ａは、２０－Ｃと標識され、皿２０３０に置かれた、サンプルＣの断片；２０－Ｂと標識され、皿２０２０に置かれた、サンプルＢの断片；２０－Ａと標識され、皿２０１０に置かれた、サンプルＡの断片を含むサンプルＣ、Ｂ、およびＡから採取された断片の比較を示す。図２０Ｂは、同じ濃度の酸／塩基溶液中に２４時間浸漬した後の、皿２０３０、２０２０、および２０１０における、それぞれ、断片２０－Ｃ、２０－Ｂ、および２０－Ａを示す。図２０Ｃは、同じ濃度の酸／塩基溶液中に４８時間浸漬した後の、皿２０３０、２０２０、および２０１０における、それぞれ、断片２０－Ｃ、２０－Ｂ、および２０－Ａを示す。また、図２０ＣＤ、同じ濃度の酸／塩基溶液中に７２時間浸漬した後の、皿２０３０、２０２０、および２０１０における、それぞれ、断片２０－Ｃ、２０－Ｂ、および２０－Ａを示す。見られるように、ＵＶ放射線に曝露された断片２０－Ｂおよび２０－Ａの染色堅牢度は、同様に着色されたがＵＶ放射線に曝露されなかった断片２０－Ｃよりも顕著に改善された。これは、図２０Ｃおよび２０Ｄで見られるように、酸／塩基溶液中の、それぞれ、４８時間および７２時間で特に当てはまる。４８時間後と７２時間後の両方で、断片２０－Ｂおよび２０－Ｃはある程度の色を依然として維持したが、７２時間後、未架橋の断片２０－Ｃは、ほぼ白色になったか、または元の色に戻った。４８時間と７２時間の両方での断片２０－Ｂと２０－Ａの比較は、魚皮がＭＢベースのカラー溶液中にある間にＵＶ放射線で染色された、サンプルＢのメタ染色が、酸／塩基溶液にさらされると、わずかにより耐色性のある魚皮をもたらすようであることを示している。すなわち、断片２０－Ｂの色は、酸／塩基溶液中に４８時間および７２時間浸漬した後に、断片２０－Ａよりもわずかに暗いように見えた。
他の実施形態および例示的な方法は、限定されないが、着色剤の変化、ＵＶ放射線の強度、ＵＶ放射線の波長または波長範囲の変化、染色時間の変化、染色濃度の変化、およびＵＶ放射線に曝露される時間の変化を含み得る。
これらの実施例および記載された実施形態に基づいて、着色した皮膚代替物、たとえば着色した足場材料の特性を改善することができ、これには、皮膚代替物を着色する着色剤の堅牢度を増加させること、皮膚代替物の機械的材料特性を増加させること、皮膚代替物における酵素的および化学的分解に対する耐性を増加させること、および処置した創傷などの生物学的条件下で皮膚代替物に加えられた着色剤の寿命を延長することが含まれることが本発明者らによって発見され、示されている。
実施形態と特徴の組み合わせ可能性
本開示は、さまざまな実施例、実施形態、および特徴を提供するが、明示的に記載されない限り、または相互に排他的である場合を除き、本明細書に記載される他の実施例、実施形態、または特徴と組み合わせ可能であることが理解されるべきである。
上記に加えて、さらなる実施形態および実施例には以下が含まれる：
１．組織再生創傷処置であって、当該組織再生創傷処置が、皮膚代替物と、皮膚代替物に加えられた着色剤と、を含み、着色剤が、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である、組織再生創傷処置。
２．皮膚代替物が、生物学的皮膚代替物、合成皮膚代替物、または生物学的皮膚代替物と合成皮膚代替物のハイブリッドである、上記１または下記３～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
３．皮膚代替物が、自家皮膚移植片、同系皮膚移植片、同種皮膚移植片、異種皮膚移植片、または合成皮膚移植片である、上記１～２または下記４～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
４．皮膚代替物が足場材料を含む、上記１～３または下記５～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
５．皮膚代替物が、細胞外マトリックス製品を含む足場材料を含む、上記１～４または下記６～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
６．細胞外マトリックス製品が、粒子、シート、またはメッシュの形態である、上記１～５または下記７～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
７．皮膚代替物が、インタクトな脱細胞化魚皮を含む足場材料であり、インタクトな脱細胞化魚皮が細胞外マトリックス材料を含む、上記１～６または下記８～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
８．着色剤が皮膚代替物に加えられる前、後、または間に、創傷処置が架橋される、上記１～７または下記９～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
９．着色剤が、チアジン染料、トリアリールメタン染料、またはチアジン染料とトリアリールメタン染料の組み合わせを含む、上記１～８または下記１０～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
１０．着色剤が、メチレンブルー（ＭＢ）、ゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、またはメチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）の組み合わせを含む、上記１～９または下記１１～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
１１．皮膚代替物が凍結乾燥され、着色剤が、皮膚代替物の凍結乾燥または再凍結乾燥の前に皮膚代替物に加えられる、上記１～１０または下記１２～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
１２．着色剤が、脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水中に０．０１重量％～０．０００１重量％の着色剤を含有する色素溶液で皮膚代替物を染色することによって、皮膚代替物に加えられる、上記１～１１または下記１３～１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
１３．着色剤が、抗生物質、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、または抗酸化剤の特性のうちの１つまたは複数を有することを特徴とする、上記１～１２または下記１４のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
１４．着色剤が、治癒時に創傷の永久的な着色を引き起こさない、上記１～１３のいずれかまたは組み合わせによる組織再生創傷処置。
１５．創傷処置方法であって、当該方法が、上記１～１４のいずれかまたは組み合わせの組織再生創傷処置を提供する工程と、組織再生創傷処置を創傷床に適用する工程と、着色剤の色の変化を判定することによって、皮膚代替物が創傷内でプロテアーゼ攻撃によって分解されているかどうかを判定する工程と、を含む、創傷処置方法。
１６．組織再生創傷処置を生成する方法であって、当該方法が、皮膚代替物を提供する工程と、着色剤を皮膚代替物に加える工程と、を含み、着色剤が、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である、方法。
１７．皮膚代替物が、生物学的皮膚代替物、合成皮膚代替物、または生物学的皮膚代替物と合成皮膚代替物のハイブリッドであり、および／または皮膚代替物が、自家皮膚移植片、同系皮膚移植片、同種皮膚移植片、異種皮膚移植片、または合成皮膚移植片であり、および／または皮膚代替物が足場材料を含み、および／または皮膚代替物が、細胞外マトリックス製品を含む足場材料を含む、１６または下記１８～２０のいずれかまたは組み合わせによる方法。
１８．皮膚代替物が、インタクトな脱細胞化魚皮を含む足場材料であり、インタクトな脱細胞化魚皮が細胞外マトリックス材料を含む、上記１６～１７または下記１９～２０のいずれかまたは組み合わせによる方法。
１９．着色剤が、メチレンブルー（ＭＢ）、ゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、またはメチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）の組み合わせを含む、上記１６～１８または下記２０のいずれかまたは組み合わせによる方法。
２０．着色剤が、脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水中に０．０１重量％～０．０００１重量％の着色剤を含有する色素溶液で皮膚代替物を染色することによって、皮膚代替物に加えられる、上記１６～１９のいずれかまたは組み合わせによる方法。
定義された用語の簡略リスト
前述の書面による説明および添付の請求項の範囲および内容の理解を助けるために、いくつかの選択された用語が以下に直接定義される。
本明細書で使用されるように、「基材（base material）」という用語は、治療薬のためのビヒクルとして作用し得、加えてまたは代替として、創傷でのおよび／またはその周囲の湿気を可能にし、および／または受動的に調節し得る、当該技術分野で既知の任意の材料を含み得る。
「生体適合性ポリマー」という用語は、人体に有害ではないポリマー材料を指す。生体適合性ポリマーには、人体に有害な物質を放出せず、創傷部位に直接接触した場合でも皮膚刺激などの副作用、または人体への任意の他の悪影響を引き起こさない、合成または天然のポリマー材料が含まれる。
本明細書で使用されるような「エシェロン（Echelon）」の程度は、軍人に提供される医療処置の位置および／または種類を指す。エシェロンＩは、戦場またはエシェロンＩＩの人事局／施設から離れた場所で施される自助および仲間援助による処置の他に、戦闘衛生兵による処置を指す。エシェロンＩＩは、医師、医師の助手、または他の資格のある医療従事者による高度な外傷ケアを指し、エシェロンＩＩのケアは、多くの場合、野戦病院で施される。エシェロンＩＩＩは、軍団レベルで提供されるケアを指し、典型的に、生命、四肢、視力を救うための再建手術および根治手術を含み、このケアは、必要な設備を備えた野戦病院で提供され得る。エシェロンＩＶは、複雑な手術および長期にわたる回復期（たとえば２週間を超える）を指し、概して、地域の常設病院で提供される。エシェロンＶは、広範なリハビリテーションおよび回復期のケアを必要とする損傷および／または手順を指し、エシェロンＶの処置は、米国本土の常設病院で施される。前述のエシェロンシステムは、特に軍人および処置シナリオに関連するが、適切なように、民間および／または地方の法執行シナリオにおける処置場所および／または処置シナリオの種類に類推されてもよい。
本明細書で使用されるような「創傷」という用語は、概して組織損傷を包含することを意図されている。したがって、「創傷」という用語には、たとえば、断裂、擦過傷、切開、穿刺、剥離、または他の同様の負傷などの、皮膚の切断、裂傷、および／または破壊を引き起こす負傷を含む。創傷は、創傷のサイズ、形状、規模のいずれかによって記述され得る。たとえば、紙で切った傷は、比較的小さな規模の小さい真っ直ぐな切開の例であり、一方で、１つまたは複数の身体部分を覆う大きな裂傷を結果としてもたらす脳震とうブラスト（concussive blast）は、より大きな規模の比較的大きな創傷の例である。しかし、前述の例は各々、本明細書で使用されるような「創傷」という用語の範囲内に含まれる。
用語「創傷」はさらに、外傷によって引き起こされるものなどの、下層組織への損傷も含まれる。したがって、用語「創傷」は、複数の異なる創傷の組み合わせを含むように意図されている。たとえば、爆発による外傷性切断は、概して、さまざまな裂傷、擦過傷、剥離、および穿刺の集合体であっても、創傷と呼ばれ得る。さらに、前述の爆発による爆発に起因する任意の下層組織の損傷は、創傷に関するこの言及の理解の範囲内にさらに包含され得る。用語「創傷」はまた、火傷傷（たとえば、熱傷および／または化学熱傷）によって引き起こされる組織負傷を包含するように意図されている。さらに、用語「創傷」はまた、たとえば、糖尿病性足潰瘍、静脈性脚潰瘍、外科手術、褥瘡、および他の原因から結果として生じる負傷を包含するように意図されている。
本明細書で使用されるような「外傷性創傷」は、皮膚と下層組織の両方を損傷させる物理的負傷に起因する任意の創傷を指す。銃創は、皮膚に穿刺（すなわち破壊）を引き起こし、下層組織を破裂するまたはそうでなければ損傷させるため、外傷性創傷の１つの非限定的な例である。別の非限定的な例として、脳震盪または爆発は、概して、（１つまたは複数の）外傷性創傷を結果として引き起こす。戦争中に受けた創傷のすべてではないが多くは、戦争および戦争関連の負傷の性質による外傷性創傷と記述され得る。「外傷性創傷」には、出血性創傷、骨および／または腱が露出した創傷、重度の火傷、深部組織創傷（たとえば、非対称深部組織創傷）、および／または大きな表面領域の創傷を含めることができる。
Ｏｍｅｇａ３ Ｗｏｕｎｄは、慢性創傷、火傷創傷を含む創傷管理、および軟組織修復に使用することが食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されている。他の動物由来の製品とは異なり、魚皮は、人間に疾患が伝染するリスクがないため、構造および生理活性成分が保存されている穏やかな処理が必要とされる。Ｏｍｅｇａ３ Ｗｏｕｎｄは、より早い創傷閉鎖および迅速な治癒時間８の点で、ブタ小腸由来の足場よりも利点があることが実証されている。魚皮移植片は、さまざまな病因の多数の慢性および急性の創傷に使用されており、ロバストな安全性および有効性が示されている。戦争という複雑で敵対的な環境を考慮すると、高度な創傷ケア技術と感染予防策を組み合わせた総合的なアプローチが取られるべきである。新しいテクノロジーが兵士および医療従事者のニーズを考慮し、それに対処することが重要である。
関連技術に精通した本開示を所有する当業者であれば想到思いつくであろう、本明細書に例示される本発明の特徴のさまざまな変更および／または修正、および本明細書に例示される原理の追加の応用が、請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、例示された実施形態に対して行われ得、本開示の範囲内にあるとみなされるべきである。したがって、本明細書ではさまざまな態様および実施形態が開示されているが、他の態様および実施形態も企図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の多数の方法および構成要素を本開示の実施形態を実施するために使用することができるが、特定の構成要素および方法のみが本明細書に記載される。
また、本開示の特定の実施形態によるシステム、デバイス、製品、キット、方法、および／またはプロセスが、明細書に開示および／または記載される他の実施形態に記載されている特性、特徴（たとえば、コンポーネント、部材、要素、部品、および／または部分）を含み得るか、組み込み得るか、またはそうでなければ備え得ることが理解される。したがって、特定の実施形態のさまざまな特徴は、本開示の他の実施形態と互換性があり得、組み合わせられ得、それらに含まれ得、および／またはそれらに組み込まれ得る。したがって、本開示の特定の実施形態に関する特定の特徴の開示は、特定の実施形態への上記特徴の適用または包含を限定するものとして解釈されるべきではない。むしろ、他の実施形態が、必ずしも本開示の範囲から逸脱することなく、上記特徴、部材、要素、部品、および／または部分を含むこともできることが理解される。
さらに、特徴が別の特徴と組み合わせて必要とされると記載されていない限り、本明細書の任意の特徴は、本明細書に開示される同じまたは異なる実施形態の任意の他の特徴と組み合わされ得る。さらに、例示的なシステム、方法、装置などのさまざまな周知の態様は、例示的な実施形態の態様を分かりにくくすることを避けるために、本明細書では特に詳細に説明されない。しかし、本明細書ではそのような態様も考慮される。
必ずしもすべての目的または利点が本開示の実施形態の下で達成されるわけではないことが理解されるべきである。当業者は、外骨格および外骨格を作るための方法が、本明細書で教示または示唆されるような他の目的または利点を達成することなく、本明細書で教示されるような１つの利点または利点のグループを達成または最適化する方法で、具体化または実行され得ることを認識する。
当業者は、さまざまな開示された特徴のいくつかの互換性を認識する。当業者であれば、本明細書に記載される変形例に加えて、外骨格を構築し、本開示の原理に基づいて外骨格を作る方法を利用するために、各特徴に対する他の既知の同等物を混合して適合させることができる。
本開示は、受動的な腰部外骨格の特定の例示的な実施形態および実施例を説明しているが、本開示が、具体的に開示された受動的な腰部外骨格の実施形態を超えて、他の代替実施形態および／または本開示の使用およびその明白な修正および同等物に及ぶことが当業者に理解される。本開示が、上で説明した開示された実施形態によって限定されるべきではなく、本明細書で説明した特徴を利用し得る他の用途に拡張され得ることが意図されている。

Claims (20)

  1. 皮膚代替物；および
    前記皮膚代替物に加えられた着色剤であって、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性である着色剤
    を含む組織再生創傷処置。
  2. 前記皮膚代替物が、生物学的皮膚代替物、合成代替物、または生物学的皮膚代替物と合成皮膚代替物のハイブリッドである、請求項１記載の組織再生創傷処置。
  3. 前記皮膚代替物が、自家皮膚移植片、同系皮膚移植片、同種皮膚移植片、異種皮膚移植片、または合成皮膚移植片である、請求項１または２に記載の組織再生創傷処置。
  4. 前記皮膚代替物が足場材料を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  5. 前記皮膚代替物が、細胞外マトリックス製品を含む足場材料を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  6. 前記細胞外マトリックス製品が、粒子、またはシート、またはメッシュの形態である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  7. 前記皮膚代替物が、インタクトな脱細胞化魚皮を含む足場材料であり、
    前記インタクトな脱細胞化魚皮が細胞外マトリックス材料を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  8. 前記着色剤が前記皮膚代替物に加えられる前、後、また加えられると同時に、前記組織再生創傷処置が架橋される、請求項１～７のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  9. 前記着色剤が、チアジン染料、トリアリールメタン染料、またはチアジン染料とトリアリールメタン染料の組み合わせを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  10. 前記着色剤が、メチレンブルー（ＭＢ）、ゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、またはメチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）の組み合わせを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  11. 前記皮膚代替物が凍結乾燥され、前記着色剤が、前記皮膚代替物の凍結乾燥または再凍結乾燥の前に前記皮膚代替物に加えられる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  12. 前記着色剤が、脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水中に０．０１重量％～０．０００１重量％の着色剤を含有する色素溶液で前記皮膚代替物を染色することによって、前記皮膚代替物に加えられる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  13. 前記着色剤が、抗生物質、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、または抗酸化剤の特性のうちの１つまたは複数を有することを特徴とする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  14. 前記着色剤が、治癒時に前記創傷の永久的な着色を引き起こさない、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組織再生創傷処置。
  15. 創傷処置方法であって、
    請求項１～１４に記載の組織再生創傷処置を提供する工程と、
    組織再生創傷処置を創傷床に適用する工程と、
    着色剤の色の変化を判定することによって、皮膚代替物が創傷内でプロテアーゼ攻撃によって分解されているかどうかを判定する工程と
    を含む創傷処置方法。
  16. 組織再生創傷処置を生成する方法であって、前記方法が、
    皮膚代替物を提供する工程と、
    前記皮膚代替物に着色剤を加える工程であって、前記着色剤が、処置された創傷内でプロテアーゼの攻撃を受けると分解する生体適合性の着色剤である、工程と、を含む方法。
  17. 前記皮膚代替物が、生物学的皮膚代替物、合成代替物、または生物学的皮膚代替物と合成皮膚代替物のハイブリッドであり、および／または
    前記皮膚代替物が、自家皮膚移植片、同系皮膚移植片、同種皮膚移植片、異種皮膚移植片、または合成皮膚移植片であり、および／または
    前記皮膚代替物が足場材料を含み、および／または
    前記皮膚代替物が、細胞外マトリックス製品を含む足場材料を含む、請求項１６記載の方法。
  18. 前記皮膚代替物が、インタクトな脱細胞化魚皮を含む足場材料であり、
    前記インタクトな脱細胞化魚皮が細胞外マトリックス材料を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記着色剤が、メチレンブルー（ＭＢ）、ゲンチアナバイオレット（ＧＶ）、またはメチレンブルー（ＭＢ）とゲンチアナバイオレット（ＧＶ）の組み合わせを含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記着色剤が、脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水中に０．０１重量％～０．０００１重量％の着色剤を含有する色素溶液で前記皮膚代替物を染色することによって、前記皮膚代替物に加えられる、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の方法。
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