KR20230160364A - 치유 진행 모니터링을 제공하는 착색된 생물학적 상처 치료제 - Google Patents

치유 진행 모니터링을 제공하는 착색된 생물학적 상처 치료제 Download PDF

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구드문드르 페르트람 시구르욘손
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Abstract

조직-재생 상처 치료제, 조직-재생 상처 치료제의 제조 방법, 및 조직-재생 상처 치료제를 사용하여 상처를 치료하는 방법이 제공된다. 조직-재생 상처 치료제는 피부 대체물 및 피부 대체물에 첨가되는 착색제를 포함한다. 착색제는 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제이다.

Description

치유 진행 모니터링을 제공하는 착색된 생물학적 상처 치료제
본 발명은, 일반적으로, 손상된 조직을 안정화, 보호, 및/또는 치유하기 위한 상처 치료제(wound treatment) 및 방법, 특히, 상처 치료의 피부 대체물(skin substitute)로의 내성장(ingrowth)이 발생했는지 여부를 나타내는 상처 치료 및 방법에 관한 것이다.
건강한 피부는 마모, 미생물, 수분 손실, 자외선 손상으로부터 기저 조직을 보호하는 등 여러 가지 뚜렷한 기능을 수행한다. 건강하고 정상적인 피부의 신경계는 또한 촉각, 압력, 진동의 촉감 감각, 열감과 냉감, 및 통증 감각을 제공한다. 신체의 체온조절은 땀을 흘리고 피부로의 혈류를 조절하여 열 손실을 늘리거나 줄이는 피부의 능력에 달려 있다. 건강한 피부는, 표피라고 하는 얇은 외부 세포층, 진피라고 하는 결합 조직의 두꺼운 중간층, 및 내부 피하층으로 이루어진, 3가지 뚜렷한 조직층을 포함한다. 표피의 얇은 외층은 편평하고 각질화된 죽은 각질세포로 구성되어, 수분 손실과 미생물 유입을 막는 장벽을 형성한다. 죽은 각질세포는 진피 위에 있는 기저층의 살아있는 각질세포로부터 유래하며, 피부 재상피화를 담당한다. 표피는 신경이나 혈관을 함유하지 않으며 진피로부터의 확산을 통해 수분과 영양분을 얻는다. 표피 아래에 있는 진피는 섬유아세포에 의해 생성된 콜라겐 섬유와 일부 탄력 섬유로 대부분 구성되며, 물 및 큰 프로테오글리칸 분자와 함께 세포외 기질(ECM)을 구성한다. 이러한 피부층은 기계적 강도 및 물과 영양분 확산을 위한 기질을 제공한다. 이는 혈관, 신경, 땀샘, 모낭, 및 면역 기능, 성장 및 복구에 관여하는 세포를 포함한다. 피하층은 두꺼운 지방 조직층을 형성하는 지방세포로 구성된다.
상처는 피부의 구조적 및 기능적 완전성이 붕괴된 것으로 간주될 수 있다. 따라서, "상처"는, 예를 들어 열상, 찰과상, 절개, 자창, 벗겨짐, 화상, 또는 기타 부상과 같은 피부의 절단, 찢김 및/또는 파손(break)을 유발하는 부상을 포함할 수 있다.
상처 사건 이후 흔히 발생하는 지혈 후, 상처는 치유 시 주요 단계인 염증, 증식 및 재형성을 거친다. 만성 상처는 질서있고 시기 적절한 방식으로 정상적인 치유 과정을 거치지 못한 상처로 간주될 수 있다. 만성 상처는 종종 염증 단계에 남아 있다.
종종, 넓은 부위에 걸쳐 확장된 상처 또는 깊은 상처, 크고 심한 화상 상처와 같은 심각한 상처의 경우, 만성 상처의 경우에는, 상처의 치유 과정을 돕기 위해 그리고 전술된 건강한 피부의 기능 중 적어도 일부를 더 빨리 회복시키기 위해 피부 대체물이 종종 사용된다. 피부 대체물은 상처를 일시적 또는 영구적으로 폐쇄할 수 있는 요소 또는 재료의 군으로 광범위하게 간주될 수 있다. 피부 대체물은 일반적으로 생물학적 피부 대체물, 합성 피부 대체물, 또는 생물학적 및 합성 피부 대체물을 포함하는 하이브리드 피부 대체물로 나뉠 수 있다.
생물학적 피부 대체물은 종종 더 온전한 세포외 기질 구조를 가지며, 합성 피부 대체물은 필요에 따라 합성될 수 있고 특정 목적에 맞게 변조될 수 있다. 생물학적 피부 대체물 및 합성 피부 대체물은 각각 장단점이 있다. 생물학적 피부 대체물은 보다 자연스러운 새로운 진피의 형성을 가능하게 하며 기저막의 존재로 인해 뛰어난 재상피화 특성을 가능하게 한다. 합성 피부 대체물은 화학적으로 합성될 수 있으며 스캐폴드(scaffold) 구성에 대한 제어를 증가시키는 이점을 제공한다. 합성 피부 대체물은, 예를 들면, 합성된 콜라겐 또는 단백질계 기질 또는 실리콘 구성요소와 조합된 콜라겐 또는 단백질계 구성요소를 포함하는 합성 생물층을 포함한다. 하이브리드 피부 대체물은 부분적으로 합성되거나 살아있는 세포에 의해 생성될 수 있으며 부분적으로는 화학적으로 합성될 수 있다.
생물학적, 합성 또는 하이브리드 피부 대체물이 사용되는 것과는 무관하게, 피부 대체물을 사용하는 목적은 상처 발생 전의 피부 기능을 최대한 복구하면서 효과적이고 시의 적절하며 흉터 없는 상처 치유를 제공하는 것이다.
시판중인 합성 피부 대체물의 예는 Biobrane®, Dermagraft®, Integra®, Apligraf®, MatriDerm®, OrCel®, Hyalomatrix®, 및 Renoskin®를 포함한다.
미국 공개 특허 출원 2003/0059460에는 생체 조직 재생에 사용될 수 있는 합성 및 천연 중합체를 포함하는 하이브리드 중합체 피부 대체물이 개시되어 있다. 하이브리드는 가교결합된 천연 중합체 및 생분해-흡수성 합성 중합체를 포함한다. 그러나, 하이브리드 재료를 제조하려면 일련의 복잡한 공정 단계를 거쳐야 한다. 또한, 생성된 하이브리드 재료는 합성 재료 및 천연 재료를 함유한다.
대부분의 현대 상처 치료 제품은 상처에 적절한 수분 수준을 유지시켜 향상된 상처 치유를 촉진하는 소위 습식-대-건식(wet-to-dry) 상처 드레싱이라고 한다. 상기 제품은 통상적으로 상처 삼출물을 축적하며 일정 간격으로 교환된다.
생물학적 피부 대체물은 자가 피부 이식편, 동계(syngeneic) 피부 이식편, 동종(allogeneic) 피부 이식편, 이종(xenogeneic) 피부 이식편, 예를 들어 돼지 피부 이식편, 사체 피부 동종이식편, 및 양막 조직 이식편을 포함하는 피부 이식편을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
또한, 최근에는, 증식하는 세포에 보호막을 제공하여 상처의 미세한 환경을 개선하려는 의도를 갖는 새로운 종류의 생물학적 피부 이식편이 등장하였다. 통상적으로, 신제품은 손상되지 않은 콜라겐 또는 재구성된 콜라겐을 함유한 생물학적 재료로부터 제조된다. 예를 들면 Oasis, Matristem, Integra 및 Puracol과 같은 브랜드를 포함한다. 임상의는 이러한 제품을 종종 기질 산물(matrix product)로 지칭한다. 기질 산물은 세포 내성장을 유도하기 위해 상처에 삽입된다. 이어서 2차 습식-대-건식 상처 드레싱을 상처 드레싱 위에 적용한다. 2013년 12월 24일자로 허여된 미국 특허 8,613,957 B2에는 탈세포화(decellularization)된 온전한 어류 피부로부터 유래된 기질 산물의 일례가 개시되어 있다. US 8,613,957에 개시된 탈세포화된 어류 피부 생성물은 내피 및/또는 상피 세포의 내성장을 지원하기 위한 온전한 스캐폴드를 제공하는 스캐폴드 물질의 역할을 한다. 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질은 생체적합성이므로 숙주(host)에 의해 통합될 수 있다. Omega3 Wound는 아이슬란드산 자연산 대서양 대구(Atlantic cod)의 피부를 최소한으로 가공하여 만든 시판중인 피부 대체물이다. 어류 피부는 표피, 진피, 및 하피를 포함하는 3가지 기본 층으로 구성되어 사람 피부와 구조적으로 유사하며, 사람 피부와 유사한 단백질, 지질, 지방산, 및 기타 생리활성 화합물을 함유한다.
다른 생물학적 피부 대체물의 예는, 조직 공학 스캐폴드로 사용하기 위한 어류 피부로부터 유래된 다공성 콜라겐 겔의 용도를 기술하는 미국 특허 6,541,023에 개시된 것을 포함한다. 콜라겐 겔을 제조하려면 어류 피부를 갈아야 한다. 또한, 중국 특허 1068703에는 화상 상처 치료용 어류 피부를 제조하는 방법이 개시되어 있으며, 이는, 어류 몸체로부터 어류 피부를 분리하고, 요오드 팅크, 에탄올, 보르네올, 설파디아진 아연 및 염산으로 구성된 보존 용액에 상기 피부를 pH 값을 2.5 내지 3으로 설정하기에 충분한 양으로 담는 것을 포함한다. 그러나, 미국 특허 6,541,023의 제품이 겔 형태이고 중국 특허 1068703의 제품이 용액 중에 저장되어 있으므로, 이들 제품은 취급이 어렵다.
또한, 의료용으로 사용되는 다수의 세포외 기질 산물이 사람 피부 (ALLODERM® 재생 조직 기질(LifeCell)); 소 태아 진피(PRIMATRIX™ 진피 복구 스캐폴드(TEI Biosciences)); 돼지 방광(MATRISTEM™ 세포외 기질 상처 시트(Medline Industries, Inc.)); 및 돼지 소장 점막하층(OASIS® 상처 기질(Healthpoint Ltd.))으로부터 유래되고 있다.
전술된 바와 같이, 상처가 치유될 때 상처는 염증, 증식 및 재형성의 세 가지 주요 단계를 거친다. 염증 단계에서 신체는 손상된 조직 및 잔해를 상처로부터 제거하기 위해 상처에 프로테아제를 분비한다. 세포외 기질과 같은 피부 대체물이 상처에 삽입되는 경우, 프로테아제는 피부 대체물을 공격하여, 피부 대체물이 손상된 조직이나 잔해인 것처럼 피부 대체물을 분해한다. 다른 경우에는, 세포외 기질과 같은 피부 대체물은 의도된 대로 세포 내성장을 통해 기능하며, 증식하는 신규 세포에 보호소(shelter)를 제공한다.
통상, 기질 산물을 사용하는 임상의는 기질 산물을 상처 기저부(wound bed)에 최초 적용한지 1 내지 3일이 지난 후에 상처를 검사한다. 본 발명자들에 의해 확인된 중요한 문제는, 임상의 및 의료 종사자는 허물(slough)로 변한 분해(degradation)된 피부 대체물과, 습윤되어 있으며 세포 내성장에 의해 침투되어 있는 기질과 같은 피부 대체물이나 고름(pus)을, 용이하게/하거나 명확하게 구별할 수 없다는 점이다. 본 발명자는, 적절하게 치유되는 상처 내의, 즉 예를 들어 세포 내성장에 의해 침투되는 기질 피부 대체물의 경우인 피부 대체물과, 분해된 피부 대체물을 구별할 수 있는 것이 상처를 효과적으로 치유하는데 핵심이라는 것을 발견하였다. 첨가된 피부 대체물 재료가 분해되거나 또는 이의 일부가 분해된 경우, 분해된 피부 대체물을 제거해야 하며, 분해된 피부 대체물에 종종 포함되는 허물과 고름을 제거하기 위해 상처를 세척해야 한다. 허물과 고름을 세척 제거한 후, 기질 재료의 신규한 치료제를 상처에 적용할 수 있다. 그러나, 의도한 대로, 첨가된 기질 재료가 세포 내성장에 의해 침투되는 것으로 판정되면, 상기 기질은 제자리에 남아 있고 상처가 적절하게 치유될 때 상기 기질 재료에 대한 모니터링을 지속한다.
예를 들어, 어류-피부-유래 세포 스캐폴드 제품을 사용하여 상처를 치유할 때 (예를 들어, 2013년 12월 24일자로 허여된 미국 특허 8,613,957에 개시된 바와 같음), 본 발명자는 임상의 및 치유 제공자가 부지불식간에 실수하거나 상처 치유 스캐폴드와 감염을 구별하는 데 어려움을 겪는다는 것을 발견하였다. 이는 상처 치유 스캐폴드가 파괴(breakdown)되기 시작하고 주변 조직에 통합되면 상처 치유 스캐폴드와 관련된 색 및/또는 냄새에 적어도 부분적으로 기인할 수 있다. 때로는 이는 감염된 조직과 유사한 색을 가질 수 있고(예를 들어, 화농성 감염) 약간의 냄새가 날 수도 있는데, 일부에서는 감염된 조직과 유사한 냄새인 것으로 해석할 수도 있다.
따라서, 본 발명자는, 피부 대체물이 세포 내성장에 의해 침투되는지 여부를 결정하는 효율적이고 효과적인 수단이 없으면, 상처 검사, 상처 노출, 및 상처의 적절한 치유를 방해하는 피부 대체물의 불필요한 재적용을 검사하기 위해서는 불필요한 드레싱 제거 또는 변경이 요구됨을 추가로 확인하였다.
또한, 감염은 상처 치유 및 관리에 있어 주요한 과제이다. 예를 들어, 전투 부상의 경우, 감염은 전장에서 부상당한 군인의 이환율 및 사망률을 결정한다. 감염은 전체 사상자의 3분의 1을 차지하며, 치료 기간이 길어지고, 절단 위험이 증가한다. 부상의 분명한 메커니즘 및 열악한 환경으로 인해, 전투 상처는 오염되기 쉽고 치료가 더욱 어렵게 된다. 감염의 초기 징후는 상처내 세균 불균형이다. 초기 단계의 상처에서 발견되는 일반적인 병원체는 그램-양성균(G+)과 그램-음성균(G-)을 모두 포함한다. 감염이 발생하면, 그램-음성균과 다제내성(multi-drug resistant)(MDR) 유기체의 출현이 관찰된다. 감염 위험을 낮추어 군인들에게 이익을 주고 전투 지역에서 전력 승수 역할을 하기 위해서는 효과적이고 즉각적인 개입이 절실히 필요하다.
따라서, 본 발명자는, 피부 대체물이 세포 내성장에 의해 침투하는지 여부를 판정하는 수단을 제공하는 것에 더하여, 피부 대체물 자체가 감염을 감소시키거나 감염 발생 가능성을 낮추게 한다는 문제를 추가로 확인하였다.
상기 언급된 문제를 해결하기 위해, 본 발명자는 피부 대체물 및 피부 대체물에 첨가되는 착색제를 포함하는 내부성장-표시형 상처 치료제를 개시한다. 착색제는 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제이다.
또한, 조직-재생 상처 치료 조성물을 제공하는 단계, 조직-재생 상처 치료 조성물을 상처 기저부에 적용하는 단계, 및 착색제의 색 변화를 측정함으로써 피부 대체물이 상처 내에서 프로테아제 공격에 의해 분해되었는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하는 상처 치료 방법이 제공된다. 조직-재생 상처 치료제는 피부 대체물 및 피부 대체물에 첨가되는 착색제를 포함한다. 착색제는 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제이다.
피부 대체물을 제공하는 단계 및 착색제를 피부 대체물에 첨가하는 단계를 포함하는, 조직-재생 상처 치료제의 제조 방법이 제공된다. 착색제는 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제이다.
본원에 기재된 양태에 따라, 피부 대체물은 생물학적 피부 대체물, 또는 합성 대체물, 또는 생물학적 피부 대체물과 합성 피부 대체물의 하이브리드이다.
하나 이상의 양태에 따라, 피부 대체물은 자가 피부 이식편, 동계 피부 이식편, 동종 피부 이식편, 이종 피부 이식편, 또는 합성 피부 이식편이다.
하나 이상의 양태에 따라, 피부 대체물은 스캐폴드 물질을 포함한다.
하나 이상의 양태에 따라, 피부 대체물은 세포외 기질 산물을 포함하는 스캐폴드 물질을 포함한다.
하나 이상의 양태에 따라, 세포외 기질 산물은 입자 또는 시트 또는 메쉬 형태이다.
하나 이상의 양태에 따라, 피부 대체물은 탈세포화된 온전한 어류 피부(fish skin)를 포함하는 스캐폴드 물질이며, 탈세포화된 온전한 어류 피부는 세포외 기질 재료를 포함한다.
하나 이상의 양태에 따라, 착색제는 티아진 염료, 또는 트리아릴메탄 염료, 또는 티아진 염료와 트리아릴메탄 염료의 조합을 포함한다.
하나 이상의 양태에 따라, 착색제는 메틸렌 블루(MB), 또는 젠티안 바이올렛(GV), 또는 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)의 조합을 포함한다.
하나 이상의 양태에 따라, 피부 대체물은 동결건조되며, 피부 대체물의 동결건조 또는 재동결건조(re-lyophilization) 전에 착색제는 피부 대체물에 첨가된다.
하나 이상의 양태에 따라, 탈이온수 중에 또는 인산염-완충 염류 용액 중에 착색제 0.01wt% 내지 0.0001wt%를 함유하는 염료 용액으로 피부 대체물을 염색함으로써, 착색제는 피부 대체물에 첨가된다.
하나 이상의 양태에 따라, 착색제는 항생, 방부, 항균, 항바이러스, 항진균, 항기생충, 항염증, 또는 항산화 특성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 한다.
하나 이상의 양태에 따라, 조직-재생 상처 치료제는, 항생제, 방부제, 항균제, 항바이러스제, 항진균제, 항기생충제, 항염증제, 항산화제, 약물, 단백질, 펩타이드, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 첨가된 활성제(active agent)를 추가로 포함한다.
하나 이상의 양태에 따라, 착색제는 치유 시 상처에 영구적인 착색을 유발하지 않는다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 조직-재생 치료 및 방법은 상처의 치유 진행 모니터링을 제공하며, 상처에 적용된 분해된 적용된 피부 대체물과 세포 내성장에 의해 성공적으로 침투되는 피부 대체물을 구별하기 위한 정확하고 효율적이고 효과적인 수단을 제공한다. 이를 통해 임상의 또는 의료 종사자는 (1) 상처를 세척하여, 허물 및 고름이 동반된 성공적으로 적용되지 못한 피부 대체물을 제거해야 하는지, 아니면 (2) 적용된 피부 대체물을 그대로 두고, 치료된 상처 내에서 프로테아제 공격에 의해 분해되는 성질을 갖는 착색제를 피부 대체물에 첨가해야 하는지를 용이하게 구별할 수 있다. 즉, 예를 들어, 제조 단계에서 착색제가 피부 대체물에 첨가되며, 착색제의 색은 치료된 상처에서 하나 이상의 프로테아제에 의해 변화, 제거 또는 파괴됨을 특징으로 한다.
상기 발명의 요약은, 이하의 상세한 설명에서 추가로 기재되는 단순화된 형태로 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 상기 발명의 요약은 청구된 주제의 주요 특징이나 필수적인 특징을 식별하려는 의도는 없으며 청구된 주제의 범위를 표시하는 데 사용하려는 의도도 없다.
본 개시의 추가적인 특징 및 이점은 이하의 설명에서 기재될 것이며, 본 설명으로부터 부분적으로는 명백해지거나 본 개시의 실시에 의해 학습될 수 있을 것이다. 본 개시내용의 특징 및 이점은 청구범위에서 특히 지적된 장비 및 조합에 의해 실현되고 획득될 수 있다. 본 개시의 이러한 특징 및 다른 특징은 이하 설명 및 청구범위로부터 더욱 완전하게 명백해질 것이며, 이하 설명되는 본 개시의 실시에 의해 학습될 수 있다.
본 개시의 이들 및 기타 현재의 특징, 양태 및 이점은 이하 설명, 청구범위 및 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e 및 1f는 본 개시내용에 따른 피부 하위상태(skin substate)의 양태를 예시한다.
도 2a, 2b, 2c, 2d, 및 2e는 탈세포화된 어류 피부 형태인 본 개시내용에 따른 피부 하위상태의 양태를 예시한다.
도 3은 본 개시내용의 양태에 따른 착색된 피부 대체물을 예시한다.
도 4a, 4b, 및 4c는 본 개시내용의 양태에 따른 다양한 착색된 피부 대체물을 예시한다.
도 5는 본 개시내용의 양태에 따른 착색된 피부 대체물을 예시한다.
도 6a, 6b, 6c, 및 6d는 본 개시내용의 양태에 따른 다양한 매염(mordanted) 및 착색된 피부 대체물을 예시한다.
도 7은 본 개시내용의 양태에 따른 pH 등급하에 염색된 다양한 착색된 피부 대체물을 예시한다.
도 8은 본 개시내용의 양태에 따른 착색된 피부 대체물을 예시한다.
도 9a 및 9b는 콜라게나제에 노출되기 전과 후의 본 개시내용의 양태에 따른 착색된 피부 대체물을 예시한다.
도 10A 및 10b는 본 개시내용의 방법 및 양태에 따라 환자의 상처를 치료하기 전과 치료한 후를 도시한다.
도 11a 및 11b는 본 개시내용의 방법 및 양태에 따라 환자의 상처를 치료하기 전과 치료한 후를 도시한다.
도 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 12f, 12g, 12h, 12i, 12j, 12k, 12l, 및 12m은 본 개시내용의 방법 및 양태에 따라 환자의 상처를 치료하기 전, 치료하는 동안 및 치료한 후를 나타낸다.
도 13은 본 개시내용의 양태에 따른 조직-재생 상처 치료제를 사용하여 상처를 치료하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 14a, 14b, 및 14c는 본 개시내용의 양태에 따른 박테리아 저해/감소 검정의 결과를 예시한다.
도 15a, 15b, 및 15c는 본 개시내용의 양태에 따른 피부 이식편의 비교를 예시한다.
도 16은 가교결합되고 착색된 스캐폴드 물질의 일양태를 도시한다.
도 17은 가교결합되고 착색된 스캐폴드 물질의 다른 양태를 도시한다.
도 18은 가교결합되고 착색된 스캐폴드 물질의 다른 양태를 도시한다.
도 19a 및 19b는 가교결합되고 착색된 스캐폴드 물질의 양태의 색 견뢰도(color fastness)의 비교를 보여준다.
도 20a, 20b, 20c, 및 20d는 가교결합되고 염색된 스캐폴드 물질의 다른 양태의 색 견뢰도의 비교를 보여준다.
도면은 반드시 일정한 비율로 그려지는 것은 아니다. 대신, 이는 구성요소에 대한 더 나은 이해를 제공하기 위해 작성되었으며 범주를 제한하려는 것이 아니라 예시적인 설명을 제공하기 위한 것이다. 도면은 본 개시내용에 따른 상처 치료의 예시적인 구성, 특징 및 이의 하위 구성요소를 예시한다.
본 개시내용의 다양한 양태의 보다 양호한 이해는 유사한 참조 문자가 유사한 요소를 지칭하는 첨부 도면과 함께 해석되는 이하 설명으로부터 얻을 수 있다.
본 개시내용은 다양한 수정 및 대안적인 구성이 가능하지만 특정한 예시적인 양태가 아래에 설명된 도면에 있다. 그러나, 본 개시내용을 개시된 특정 양태로 제한하려는 의도는 없으며, 반면, 이의 의도는 본 개시내용의 요지와 범주 내에 있는 모든 수정, 대안적인 구성, 조합 및 등가물을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
사용된 참고문헌은 단지 편의를 위해 제공되는 것이므로 보호 범주 또는 양태를 정의하지 않는다.
용어가 설명된 의미를 갖기 위해 본 출원에서 명시적으로 정의되지 않는 한, 이러한 용어의 의미를 이의 단순하거나 일반적인 의미를 넘어 명시적으로 또는 간접적으로 제한하려는 의도가 없다는 것이 이해될 것이다.
특정 기능을 수행하는 "수단" 또는 특정 기능을 수행하는 "단계"를 명시적으로 언급하지 않은 청구항의 모든 요소는 35 U.S.C. §112에 지정된 대로 "수단" 또는 "단계" 구문으로 해석되지 않아야 한다.
피부 대체물(들)
전술된 바와 같이, 상처 치유 과정을 돕고 건강한 피부의 기능 중 적어도 일부를 보다 신속하게 회복시키기 위해 다양한 유형의 피부 대체물이 사용될 수 있다. 피부 대체물은 상처를 일시적 또는 영구적으로 폐쇄할 수 있는 요소 또는 재료의 군으로 광범위하게 간주될 수 있다. 피부 대체물은 일반적으로 생물학적 피부 대체물, 합성 피부 대체물, 또는 생물학적 및 합성 피부 대체물을 포함하는 하이브리드 피부 대체물로 나눌 수 있다.
이러한 피부 대체물의 예가 도 1a 내지 1f에 도시되어 있다.
도 1a는 제1 크기의 파쇄된(shredded) 탈세포화된 어류 피부 입자(102)를 포함하는 일양태에 따른 상처 치료제의 피부 대체물(100)의 예를 도시한다. 도 1b는 제2 크기의 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자(112)를 포함하는 일양태에 따른 상처 치료제의 피부 대체물(110)의 예를 도시한다. 도 1c는 제3 크기의 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자(122)를 포함하는 일양태에 따른 상처 치료제의 피부 대체물(120)의 예를 도시한다. 도 1a, 1b, 및 1c의 양태에서, 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질은 생체적합성이며 따라서 숙주에 의해 통합될 수 있다. 이러한 시판중인 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질의 일례로는, 미국 특허 8,613,957에 개시된 바와 같이 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로 만든, Kerecis의 Omega3™ Wound가 있다.
적용 가능한 피부 대체물의 다른 예가 도 1d, 1e, 및 1f에 도시되어 있다. 도 1d는 가공된 틸라피아 어류 피부로부터 생산된 피부 대체물(130)의 예를 보여준다. 틸라피아-기반 피부 이식편은 대형 피부 이식편(132), 중형 피부 이식편(134), 및 소형 피부 이식편(136)을 포함하여 다양한 크기로 제공될 수 있다. 도 1e는 메쉬화되지 않은(non-meshed) 돼지 피부 이식편(142) 및 메쉬화된(meshed) 돼지 피부 이식편(144)을 포함하는 돼지 피부 이식편(140)의 예를 도시한다. 피부 대체물의 추가의 일례가 도 1f에 도시되어 있으며, 이는 합성 피부 대체물(150)을 나타내며, 이 경우 이는 이중층 조직(152)으로 형성된 생체공학적 피부 대체물이다. 이러한 비제한적 예에서, 합성 피부 대체물(150) 진피층의 이중층 조직(152)은 살아있는 사람 신생아 섬유아세포가 주입된 I형 소 콜라겐 겔이다. 표피는 신생아 각질세포이다. 세포는 성장 인자, 사이토카인, 및 세포외 기질(ECM) 단백질을 적극적으로 분비한다. 이러한 합성 피부 대체물의 비제한적 일례로는 당뇨병성 족부궤양 및 정맥성 하지 궤양 치료에 사용될 수 있는 Apligraf™이 포함될 수 있다.
이제 도 2a 및 2b를 참조하면, 탈세포화된 어류 피부(200, 210)의 예시적 양태가 도시되어 있다. 미국 특허 8,613,957에 개시된 바와 같이 제조된 탈세포화된 어류 피부(200)의 예시적 섹션이 도 2a에 예시되어 있으며, 이의 크기는 사용자의 장갑 낀 손(202)에 의해 문맥에 따라 주어진다. 탈세포화된 어류 피부(200)의 크기는 물론 비제한적이며, 생산 또는 제공될 수 있거나, 치료할 상처의 크기 및 형상에 맞게 다듬어질 수 있다. 또한, 도시된 탈세포화된 어류 피부는 메쉬화되지 않은 어류 피부이지만, 메쉬화된 탈세포화된 어류 피부도 사용될 수 있다.
탈세포화된 어류 피부는 입자화되거나, 분쇄(comminution)되거나, 다양한 크기와 형상으로 가공될 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 복수의 탈세포화된 어류 피부 시트(210)는 도 2a의 탈세포화된 어류 피부(200)와 유사한 크기 및 형상(예를 들어, 직사각형)을 가질 수 있거나, 도 1b에 예시된 탈세포화된 어류 피부 시트(220)와 같은 보다 균일한 치수(예를 들어, 정사각형)를 가질 수 있다.
도 2a 및 2b에 도시된 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드(210, 220)는 동결건조된 형태에서 실질적으로 경질이고 비탄성이다. 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드는 이의 연성(ductility) 및/또는 탄성(elasticity)을 증가시키는 역할을 하는 하나 이상의 효소로 처리될 수 있다. 일부 양태에서, 효소는, 상처 보존 및/또는 안정화에 중요한 건강 특성에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 상호연결된 세포외 기질 성분을 절단함으로써 작용한다. 일부 양태에서, 효소는 엘라스틴, 프로테오글리칸, 콜라겐 또는 다른 세포외 기질 재료 내에서 및/또는 사이에서 공유 결합을 절단하지만, 변형된 탈세포화된 어류 피부는 이의 천연 3차원 구조물로부터 부분적으로 제거되더라도 세포외 기질 내용물의 상당 부분을 유지한다.
일부 양태에서, 효소 처리는 변형된 탈세포화된 어류 피부를 스캐폴드 물질로서 사용하는 데 부정적인 영향을 끼친다. 그러나, 스캐폴드 물질로서의 기능 상실은 놀랍게도 탈세포화된 어류 피부를 상처 보존 및 안정화 재료로서 사용하는 데에는 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 재료의 연성 및/또는 탄성은 세포외 성분의 조성을 유지하면서 증가될 수 있으며, 이것이 상처 치유를 위한 스캐폴드로서 재료를 사용하는 데에 부정적인 영향을 끼칠 수 있음에도, 변형된 탈세포화된 어류 피부는 상처 보존/안정화 재료로서의 역할을 할 수 있다.
탈세포화된 어류 피부 스캐폴드는 분쇄되어 입자 형태로 제공될 수 있다. 분쇄된 개별 입자의 크기는 분쇄 유형 및/또는 방식에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 탈세포화된 어류 피부 입자는 지정된 크기 미만의 입자를 출력하도록 설계된 제트 밀링 공정을 통해 생성될 수 있다. 일부 양태에서, 탈세포화된 어류 피부는 절단(cut), 잘게 썰기(chopped) 또는 입자로 마쇄(grinding)되며, 이는 균일한 입자를 생성하기 위해 측정된 방식으로 수행되거나 대략적으로 수행되어, 다양한 크기의 입자를 생성할 수 있다.
도 2c는 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질의 시트를 그라인더, 예를 들어 헴프 그라인더(hemp grinder)로 마쇄하여 생성된 입자화되거나 분쇄된 탈세포화된 어류 피부(230)의 대형 입자(232)의 예시적인 묘사를 예시한다. 도 2d는 본 개시내용의 양태에 따라 그라인더를 사용하여 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질의 시트를 마쇄하여 생성된 입자화되거나 분쇄된 탈세포화된 어류 피부(240)의 실 모양의 면형 섬유(threaded, cotton-like fibers)(242)의 예시적인 묘사를 예시한다. 도 2e는 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질의 시트를 그라인더, 예를 들어 헴프 그라인더로 분쇄하여 생성된 분쇄된 탈세포화된 어류 피부(250)의 소형 분말형 입자(252)의 예시적인 묘사이다.
양태에서, 상처 치료제는 적어도 하나의 소정의 크기의 입자화된, 특히 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자이거나 이를 포함한다. 상기 입자화된, 즉, 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는, 2010년 10월 6일자로 출원되고 2013년 12월 24일자로 등록된 미국 특허 8,613,957에 개시된 바와 같이, 조직의 복구 및 대체를 촉진하기 위한 세포 이동, 부착, 증식 및 분화를 지원하는 스캐폴드 물질을 제공하도록 구성된다.
척추동물의 세포외 기질(ECM)은 세포를 둘러싸고 지지하는 복합 구조체이다. ECM은 구조 단백질의 복합 혼합물로 구성되며, 그 중 가장 풍부한 것은 콜라겐, 및 기타 특수 단백질 및 프로테오글리칸이다. 본원에 기술된 스캐폴드 물질은 어류 피부로부터의 천연 생물학적 ECM 성분의 대부분 손상되지 않은 무세포 스캐폴드다. 스캐폴드는 또한 어류 피부로부터 자연적으로 발생하는 지질을 포함할 수 있다. 피부 ECM의 기본 3차원 구조, 조성 및 기능은 본질적으로 변경되지 않으며, 세포 이동, 부착, 증식 및 분화를 지원하는 스캐폴드를 제공하여 조직의 복구 및/또는 대체를 촉진한다.
본 발명에 따른 스캐폴드 물질은 온전한 어류 피부로부터 얻어진다. 뼈가 있는 어류 또는 연골성 어류를 포함한 모든 종류의 어류를 어류 피부의 원료로 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 공급원은 대구, 해덕 및 메기와 같은 둥근 어류; 할리벗(halibut), 플라이스(plaice) 및 솔(sole)과 같은 가자미류; 연어 및 송어와 같은 연어류; 참치와 같은 고등어과; 또는 청어, 멸치, 고등어 및 정어리와 같은 소형 어류일 수 있다. 특정 양태에서 어류 피부는 냉수성의 기름진 어류 및/또는 다량의 오메가-3 오일을 함유하는 것으로 알려진 어류로부터 얻는다. 오메가-3 오일이 다량 함유된 어류의 예로는 연어, 정어리(pilchard), 참치, 청어, 대구, 정어리(sardine), 고등어, 은대구, 빙어, 흰살 생선, 호키 생선, 및 일부 품종의 송어가 있다.
어류 피부는 가공 전에 어류로부터 제거된다. 어류 피부가 비늘이 있는 어류로부터 나온 것인 경우, 어류 피부의 비늘을 제거하여 비늘의 상당 부분을 제거하거나 최소한 수산화인회석(hydroxyapatite)을 비늘로부터 제거해야 한다. "비늘이 상당 부분 제거된다" 또는 "비늘이 거의 없다"는 것은 어류 피부의 비늘이 95% 이상, 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 100% 제거됨을 의미한다. "비늘이 거의 없는" 어류 피부는 또한 비늘이 없는 어종의 어류 피부를 지칭할 수 있다. 비늘은 모든 가공 전에 순수한 기계적 압력(예를 들어, 나이프, 연마재를 사용한 진탕, 수압, 나이프와 동일한 기계적 힘을 사용하는 특수 비늘 제거 디바이스(device), 또는 세라믹이나 플라스틱을 사용한 연마와 같은 기타 압력 디바이스) 또는 화학적 처리(예를 들어, 탈세포화) 후 기계적 압력을 가하여 비늘을 세척하여 제거한다. 어류 피부를 먼저 화학적 및/또는 효소적으로 처리하는 경우(예를 들어, TRITON® X-100 처리) 탈세포화 후 피부가 찢어짐에 보다 취약해지기 때문에 기계적 압력은 일반적으로 약할 필요가 있다. 비늘은 하나 이상의 단계로 제거될 수 있으며, 예를 들어 탈세포화 전 부분 제거 및 이어서 탈세포화 과정에서 및/또는 이후에 추가로 제거될 수 있다. 또는, 비늘은 화학적 처리만으로 제거할 수도 있다.
비늘을 제거한 후, 어류 피부는 탈세포화 전에 임의로 냉동된다. 어류 피부는, 스캐폴드의 콜라겐 구조를 보존하기 위해 상기 피부를 액체 질소에서 배양하거나 상기 피부를 -70℃ 이하로 동결시킬 수 있는 기타 특수 냉동 장비를 사용하여, 신속하게 냉동될 수 있다. 또는, 어류 공장에서 통상 사용되는 종래의유형의 냉동고에서 어류 피부가 냉동될 수 있다. 냉동 과정은 온전한 어류 피부를 구성하는 세포를 용해하거나 부분적으로 용해시킬 수 있으며 어류 피부의 탈세포화를 촉진하는 데 도움이 될 수 있다. 어류 피부가 냉동된 경우 이는 나중에 추가 가공을 위해 해동할 수 있다.
어류 피부의 냉동 여부와 관계없이, 이는 완충액으로 세척된 후 추가 가공할 수 있다. 예를 들어, 어류 피부의 소독 및 안정화를 촉진하기 위해, 어류 피부는 하나 이상의 항산화제(예를 들어, 아스코르브산(예를 들어, 50mM 아스코르브산), 비타민 A, C, E, 및 베타 카로틴), 항생제(예를 들어, 스트렙토마이신 및 페니실린), 프로테아제(예를 들어, 디스파제 II) 및 프로테아제 저해제(예를 들어, 안티페인, 아프로티닌, 벤즈아미딘, 베스타틴, DFP, EDTA, EGTA, 류펩틴, 펩스타틴, 포스포라미돈, 및 PMSF)를 임의로 함유하는 완충액으로 1 내지 3회 세척될 수 있다. 완충액은 pH가 적어도 5.5, 예를 들어 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상일 수 있다. 특정 양태에서 pH는 7.0과 9.0 사이, 예를 들어 7.5와 8.5 사이이다. 완충액은 어류 피부를 수 일 내지 최대 몇 주 이상 저장할 수 있는 배지로도 사용할 수 있다. 특정 양태에서 어류 피부는 약 4℃의 온도에서 완충액에 저장된다.
냉동 및/또는 세척 및/또는 완충액에 저장한 후, 어류 피부는 하나 이상의 탈세포화 용액으로 처리되어, 자연적으로 발생하는 세포외 기질의 기계적 및 구조적 무결성 및 생물학적 활성의 손상을 최소화하거나 전혀 손상시키지 않고 어류 피부로부터 항원 물질을 포함한 세포 물질을 제거한다.
본원에 사용된 용어 "세포외 기질" 또는 "ECM"은 다양한 다른 중요한 기능을 수행하는 것 이외에도 피부 세포에 구조적 지지를 제공하는 어류 피부 내에 존재하는 비세포 조직 물질을 지칭한다. 본원에 기술된 ECM은 추출, 정제 또는 분리된 ECM 성분(예를 들어, 콜라겐)으로 구성되거나 이들로부터 완전히 재형성된 기질 재료를 반드시 포함하지는 않는다. 그러나, 일부 양태에서, 피부 대체물로서 사용되는 ECM은 추출, 정제 또는 분리된 ECM 성분(예를 들어, 콜라겐)으로 구성되거나 이들로부터 완전히 재형성된 기질 재료를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "무세포(acellular)", "탈세포화된(decellularized)", "탈세포화된 어류 피부" 등은 상당량의 세포 및 핵산 내용물이 제거되어 ECM의 복합 3차원 사이질 구조(interstitial structure)를 남긴 어류 피부를 지칭한다. 양태에서, "탈세포화된 어류 피부"는 상당량의 세포 및 핵산 내용물이 없는 ECM의 복합 3차원 사이질 구조에 더하여 오메가 3 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 어류 피부를 추가로 수반할 수 있다.
"탈세포화 제제(decellularizing agent)"는 ECM으로부터 상당량의 세포 및 핵산 내용물을 제거하는 데 효과적인 제제이다. ECM은, 생존 가능한 및 생존 불가한 핵산 및 기타 세포 물질의 50% 이상이 ECM으로부터 제거되는 경우, 세포 및 핵산 내용물이 "탈세포화"되거나 "실질적으로 없는" 것이다(즉, "상당량"이 제거된다). 특정 양태에서, 생존 가능한 및 생존 불가한 핵산 및 기타 세포 물질의 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%가 제거된다. 탈세포화는, 예를 들어, 처리된 어류 피부의 DNA 함량을 테스트하여 확인할 수 있다. ECM으로부터의 핵산의 제거는, 예를 들어, ECM의 조직학적 검사에 의해 및/또는 PICOGREEN® 검정, 디페닐아민 검정과 같은 생화학적 검정에 의해 또는 PCR에 의해 판정될 수 있다.
탈세포화는 세포막을 파괴하여 세포 내용물을 방출한다. 탈세포화로는 하나 이상의 물리적 처리, 하나 이상의 화학적 처리, 하나 이상의 효소적 처리, 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다. 물리적 치료의 예로는 초음파 처리, 기계적 교반, 기계적 마사지, 기계적 압력, 및 동결/해동이 있다. 화학적 탈세포화 제제의 예로는 이온성 염(예를 들어, 나트륨 아지드), 염기, 산, 세제(예를 들어, 비이온성 및 이온성 세제), 산화제(예를 들어, 과산화수소 및 퍼옥시 산), 저장성 용액, 고장성 용액, 킬레이트제(예를 들어, EDTA 및 EGTA), 유기 용매(예를 들어, 트리(n-부틸)-포스페이트), 아스코르브산, 메티오닌, 시스테인, 말레산, 및 DNA에 결합하는 중합체 (예를 들어, 폴리-L-리신, 폴리에틸이민 (PEI), 및 폴리아민도아민 (PAMAM))이 있다. 비이온성 세제는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르 (TRITON® X-100)(Dow Chemical Co.)를 포함한다. 이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 나트륨 데옥시콜레이트, TRITON® X-200, 및 쯔비터이온성 세제 (예를 들어, CHAPS)를 포함한다. 다른 적합한 탈세포화(decullularizing) 세제는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노-올레에이트 및 폴리옥시에틸렌 (80) 소르비탄 모노-올레에이트(Tween 20 및 80), 3-[(3-클로르아미도프로필)-디메틸암미노]-1-프로판-설포네이트, 옥틸-글루코시드 및 나트륨 도데실 설페이트를 포함한다. 효소적 탈세포화 제제의 예로는 프로테아제, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제가 있다. 프로테아제는 세린 프로테아제 (예를 들어, 트립신), 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제 (예를 들어, 써모리신), 및 글루탐산 프로테아제를 포함한다. 탈세포화는 일반적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 양태에서 pH는 7.0과 9.0 사이, 예를 들어 7.5와 8.5 사이이다.
탈세포화 단계의 일례는 1M NaCl, 2% 데옥시콜산, 0.02% 나트륨 아지드 및 500ppm 스트렙토마이신을 포함하는 용액에서 어류 피부를 배양하는 것이다. 다른 예에서, 어류 피부는 프로테아제(예를 들어, 2.5 U/mL 디스파제 II) 및 기타 성분(예를 들어, 0.02% 나트륨 아지드)을 포함하는 제1 탈세포화 용액으로 배양된다. 제1 탈세포화 용액을 따라낸 다음 어류 피부를 세제(예를 들어, 0.5% TRITON® X-100) 및 기타 성분(예를 들어, 0.02% 나트륨 아지드)을 포함하는 용액과 같은 제2 탈세포화 용액으로 처리한다. 다른 예에서, 어류 피부는 먼저 세제(예를 들어, 0.5% TRITON® X-100)를 기타 성분(예를 들어, 0.02% EDTA, 나트륨 아지드, 및/또는 데옥시홀산)과 함께 포함하는 탈세포화 용액으로 처리한 다음, SDS와 같은 세제를 포함하는 제2 탈세포화 용액으로 배양한다.
어류 피부는 진탕하에 배양할 수도 있고 배양하지 않을 수도 있다. 탈세포화 단계(들)는 필요에 따라 잔여 탈세포화 용액을 붓고 임의로 완충액(예를 들어, 행크 균형 염 용액)으로 어류 피부를 세척한 다음 어류 피부를 다시 탈세포화 단계로 처리하여 반복할 수 있다. 충분한 양의 세포 물질이 제거되면 (예를 들어, 흡인에 의해 또는 상기 용액을 부드럽게 부어서) 탈세포화 용액을 제거할 수 있다.
탈세포화 후, 어류 피부는 임의로 물, 완충액 및/또는 염 용액으로 세척될 수 있다. 적합한 세척액의 예는 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline)(DPBS), 행크 균형 염 용액(Hank's balanced salt solution)(HBSS), Medium 199 (M199, SAFC Biosciences, Inc.) 및/또는 L-글루타민을 포함한다. 세척 단계(들)는 일반적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 양태에서 pH는 7.0과 9.0 사이, 예를 들어 7.5와 8.5 사이이다.
어류 피부는 최종 제품의 외관을 개선하기 위해 임의로 표백될 수 있다. 탈세포화 전, 탈세포화 후 및/또는 탈세포화와 동시에 표백을 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표백제가 하나 이상의 탈세포화 용액(들) 및/또는 하나 이상의 완충액(들)에 혼입될 수 있다 표백제의 예는 아황산나트륨, 과산화수소, 과황산암모늄, 과황산칼륨, 및 과황산나트륨을 포함한다. 특정 양태에서, 과황산염(들)과 같은 강력한 표백제가 사용되는 경우, 하나 이상의 표백제, 증점제 및 과산화물 공급원의 혼합물에서 어류 피부를 배양하는 것을 포함하는 단일 단계로 표백 및 탈세포화를 조합할 수 있다. 예를 들어, 건식 표백 혼합물을 제조한 후(예를 들어, 실시예 5에 기술된 "표백 혼합물" 참조), 이어서 물, 과산화수소 또는 이들의 조합을 건조 혼합물에 첨가하여, 탈세포화에도 충분할 수 있는 표백 용액을 형성할 수 있다. 표백제 (예를 들어, 아황산나트륨, 과산화수소, 과황산암모늄, 과황산칼륨, 및 과황산나트륨)는 건조 혼합물의 약 40 내지 60%(w/w)이여야 한다. 탈세포화뿐만 아니라 표백을 가속화하기 위해 EDTA와 과황산염의 조합을 혼합물에 첨가할 수 있다.
특정 양태에서 건조 혼합물 중 EDTA의 농도는 약 0.25 내지 5% w/w이다. 과산화수소는 혼합물의 약 15 내지 25%를 차지할 수 있으며, 과산화물 공급원은 과탄산나트륨과 과탄산칼륨일 수 있다. 인산나트륨 과수화물 및 탄산나트륨 또는 메타규산마그네슘 및 규산규산염도 과산화물 공급원으로 사용될 수 있다. 건조 혼합물은 또한 예를 들어 1 내지 10% w/w의 실리카 및 수화된 실리카, 및 임의로 하나 이상의 스테아레이트 (예를 들어, 암모늄 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 및/또는 마그네슘 스테아레이트)를 포함할 수 있다. 또한, 표백/탈세포화 용액의 점도를 증가시키고 단백질 섬유가 손상되지 않도록 보호하기 위해, 건조 혼합물은 증점제, 예를 들어 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 알긴 (즉, 알기네이트), 유기 검 (예를 들어, 셀룰로스, 크산탄 검) 나트륨 메타실리케이트, 및 이들의 조합을 임의로 포함할 수 있다. 표백 및/또는 표백+탈세포화는 일반적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 양태에서 pH는 7.0과 9.0 사이, 예를 들어 7.5와 8.5 사이이다. 표백 및/또는 표백+탈세포화 후에, 어류 피부는 전술된 pH 조건하에서 L-글루타민을 포함하는 용액으로 임의로 세척된다.
특정 양태에서, 어류 피부는 소화 효소로 처리된다. 표백과 유사하게, 소화는 탈세포화 전에, 탈세포화 후에 및/또는 탈세포화와 동시에 수행될 수 있다. 적합한 효소는 프로테아제, 예를 들어 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 및 글루탐산 프로테아제를 포함한다. 특정 양태에서 소화 효소는 트립신과 같은 세린 프로테아제이다. 소화 효소는 알칼리성 환경에서 기능하고, ECM 내 가교결합을 제한하며, 어류 피부를 부드럽게 만드는 효소일 수 있다. 소화는 일반적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 양태에서 pH는 7.0과 9.0 사이, 예를 들어 7.5와 8.5 사이이다.
탈세포화된 어류 피부는 임의로 냉동보존될 수 있다. 냉동보존은 냉동 전에 어류 피부를 동결보호제 용액에 침지시키는 것을 포함할 수 있다. 동결보호제 용액은 일반적으로 적절한 완충제, 하나 이상의 동결보호제, 및 임의로 용매, 예를 들어 물과 조합하여 최소한으로 팽창 및 수축되는 유기 용매를 포함한다. 동결보호제의 예는 수크로스, 라피노스, 덱스트란, 트레할로스, 디메틸아세트아미드, 에이메틸설폭사이드, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 2-메틸-2.4-판탄디알, 특정 부동액 단백질 및 펩타이드, 및 이들의 조합을 포함한다. 또는, 냉동 단계 동안 형성된 얼음 결정을 최소화하기 위해 승화 전에 급속-냉동(fast-froze)(플래쉬-냉동(flash-frozen))되는 경우, 피부는 임의로 동결 보호제를 포함하지 않는 완충액에서 냉동될 수 있다 냉동보존은 일반적으로 pH 5.5 이상, 예를 들어 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 그 이상에서 수행된다. 특정 양태에서 pH는 7.0과 9.0 사이, 예를 들어 7.5와 8.5 사이이다.
탈세포화된 어류 피부는 유리 바이알이나 파우치와 같은 멸균 용기 내부에 포장될 수 있다. 일양태에서, TYVEK® 파우치가 사용된다. 예를 들어, 어류 피부르는 동결 보호제 용액에서 배양되고 TYVEK® 파우치에 포장된 다음 동결 건조기에 넣고 동결 보호제와 호환성인 속도로 동결될 수 있다.
탈세포화된 어류 피부는 동결건조될 수 있으며, 즉, 저온에서 진공 조건하에 동결되어 얼음 재결정화 없이 각각의 얼음 결정 단계로부터 물이 순차적으로 제거될 수 있다. 동결건조 과정에서, 물은 일반적으로 먼저 승화를 통해 제거되고 이어서 필요한 경우 탈착을 통해 제거된다. 가공한 후 멸균하기 전에 과량의 물을 제거하는 또 다른 방법으로는 진공 압착(vacuum pressing)이 있다.
특정 양태에서, 탈세포화된 어류 피부는 냉동 전 및/또는 냉동 후에 멸균된다. 멸균 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 탈세포화된 어류 피부는 에틸렌 옥사이드 챔버에 넣고 적절한 주기의 에틸렌 옥사이드로 처리될 수 있다. 다른 멸균 방법은 오존, 이산화탄소, 기체 포름알데히드 또는 방사선(예를 들어, 감마 방사선, X-선, 전자빔 처리 및 아원자 입자)을 사용한 멸균을 포함한다.
물의 동결, 동결-건조 및/또는 진공 압착에 대한 대안으로서 또는 이에 추가하여, 탈세포화된 어류 피부는 알코올과 같은 비수성 용액 중에 보존될 수 있다.
생성물 (스캐폴드 물질)은조직의 재생, 복구 및/또는 대체 (예를 들어, 내인성 조직의 복구, 재생 및/또는 성장)를 촉진할 수 있는 특성을 보유하는 멸균 콜라겐-기반의 멸균 기질이다. 어류 피부와 관련하여 용어 "스캐폴드 물질"은 전술된 바와 같이 탈세포화되고 임의로 표백, 소화, 동결건조 등이 된 어류 피부를 포함하는 물질을 지칭한다. 스캐폴드 물질은 내피 및/또는 상피 세포의 지지를 위한 온전한 스캐폴드를 제공할 수 있으며, 숙주에 의해 통합될 수 있고, 생체적합성이며, 현저하게 석회화되지 않으며, 주변 온도에서 저장 및 운송될 수 있다. 본원에서 "숙주에 의해 통합됨"이라는 표현은 스캐폴드 물질로 처리되는 환자의 세포 및 조직이 스캐폴드 물질로 성장할 수 있고 스캐폴드 물질이 실제로 환자의 신체에 통합/흡수됨을 의미한다. 용어 "생체적합성(biocompatible)"은 의도된 사용의 생체내 환경에서 실질적으로 무독성이고 환자의 생리 시스템에 의해 실질적으로 거부되지 않는(즉, 비항원성인) 물질을 지칭한다.
이는 국제 표준 기구(ISO) 표준 번호 10993 및/또는 미국 약전(USP) 23 및/또는 미국 식품의약국(FDA) 블루북 각서 No. G95-1(제목: "국제 표준 ISO-10993의 사용, 의료 기기의 생물학적 평가 1부: 평가 및 테스트(Use of International Standard ISO-10993, Biological Evaluation of Medical Devices Part 1: Evaluation and Testing)")에 규정된 생체적합성 테스트를 통과하는 물질의 능력에 의해 측정될 수 있다. 통상적으로, 이러한 테스트에서는 물질의 독성, 감염성, 발열성, 자극 가능성, 반응성, 용혈 활성, 발암성 및/또는 면역원성을 측정한다. 생체적합성 구조 또는 물질을 대다수의 환자에게 도입하는 경우, 이는 유의미하게 불리하고 오래 지속되거나 확대되는 생물학적 반응이나 반응을 일으키지 않으며, 통상적으로 수술 또는 살아있는 유기체로의 이물질 이식에 수반되는 경미하고 임시 염증과는 구별된다.
스캐폴드 물질은 어류 피부의 세포외 기질(ECM)로부터의 단백질을 함유한다. 스캐폴드 물질의 ECM 성분은 구조 단백질; 접착성 당단백질; 프로테오글리칸; 비(non)-프로테오글리칸 다당류; 및 모세포 단백질을 함유할 수 있다. 구조 단백질의 예는 콜라겐(ECM에서 가장 풍부한 단백질), 예를 들어 원섬유성(fibrillar) 콜라겐 (I형, II형, III형, V형, 및 XI형); facit 콜라겐 (IX형, XII형, 및 XIV형), 단쇄 콜라겐 (VIII형 및 X형), 기저막 콜라겐 (IV형), 및 기타 콜라겐 (VI형, VII형, 및 XIII형); 엘라스틴; 및 라미닌을 포함한다. 접착성 당단백질의 예는 피브로넥틴; 테나신; 및 트롬보스폰딘을 포함한다. 프로테오글리칸의 예는 헤파린 설페이트; 콘드로이틴 설페이트; 및 케라탄 설페이트를 포함한다. 비-프로테오글리칸 다당류의 예는 히알루론산이다. 모세포 단백질은 세포-표면 수용체, 사이토카인, 성장 인자, 프로테아제, 및 ECM과의 상호작용을 통해 세포 기능을 조절하는 구조적으로 다양한 세포외 단백질 군이다. 이의 예는 트롬보스폰딘(TSP) 1 및 2; 테나신; 및 SPARC(분비된 단백질, 산성이며 시스테인이 풍부함)를 포함한다.
특정 양태에서, 탈세포화 (및 기타 임의의 가공 단계)는 어류 피부의 지질층으로부터 자연 발생 지질을 모두 제거하지는 않는다. 따라서, 스캐폴드 물질은 어류 피부로부터, 특히 어류 피부의 지질 층으로부터의 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 물질은 (동결건조 후 전체 스캐폴드 물질의 건조 중량의) 약 25% w/w 이하의 지질, 예를 들어 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 또는 24% w/w의 지질을 포함할 수 있다. 스캐폴드 물질내의 지질의 존재는, 예를 들어, 유기 용매 추출 후 크로마토그래피를 통해 확인할 수 있다. 적합한 유기 용매의 예는 아세톤 및 클로로포름을 포함한다.
스캐폴드 물질의 지질은, 예를 들어, 지방 아실(즉, 지방산, 이의 접합체 및 유도체); 글리세로지질; 글리세로인지질(즉, 인지질); 스핑고지질; 사카로지질; 폴리케타이드; 스테롤 지질(즉, 스테롤); 특정 지용성 비타민; 프레놀 지질; 및/또는 폴리케타이드를 포함할 수 있다. 지방 아실의 예는 포화 지방산, 예를 들어 다중불포화 지방산; 지방 에스테르; 지방 아미드; 및 에이코사노이드를 포함한다. 특정 양태에서 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)(어유에서 고농도로 발견됨)과 같은 오메가-3 지방산을 포함한다. 어유에서 발견되는 다른 지방산은 아라키드산, 가돌레산, 아라키돈산, 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 박센산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산, 베헨산, 에루크산, 리그노세르산을 포함한다. 글리세로지질의 예는 모노아실글리세롤, 디아실글리세롤 및 트리아실글리세롤과 같은 일치환, 이치환 및 삼치환 글리세롤(즉, 모노글리세라이드, 디글리세라이드 및 트리글리세라이드)을 포함한다. 글리세로인지질의 예는 포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민; 및 포스파티딜세린을 포함한다. 스핑고지질의 예는 포스포스핑고지질 및 글리코스핑고지질을 포함한다. 스테롤 지질의 예는 콜레스테롤; 스테로이드; 및 세코스테로이드(다양한 형태의 비타민 D)를 포함한다. 프레놀 지질의 예는 이소프레노이드; 카로티노이드; 및 비타민 E와 K와 같은 퀴논 및 하이드로퀴논을 포함한다.
스캐폴드 물질은 하나 이상의 첨가된 활성제(즉, 스캐폴드 물질의 가공 과정에서 또는 가공 후에 첨가되는 제제), 예를 들어 항생제, 방부제, 항균제, 항바이러스제, 항진균제, 항기생충제 및 항염증제를 함유할 수 있다. 활성 성분은 항산화제 또는 약물과 같이 상처 관리 및/또는 조직 치유를 촉진하는 화합물 또는 조성물일 수 있다. 또한 이는 단백질 또는 단백질들 및/또는 기타 생물학적 제제일 수 있다. 항생제, 방부제, 및 항균제는 스캐폴드 물질에 효과적인 항균 특성을 제공하기에 충분한 양으로 첨가될 수 있다. 특정 양태에서, 항균제는 은, 금, 백금, 구리, 아연 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 항균 금속이다. 예를 들어, 이온, 금속, 원소 및/또는 콜로이드 형태로 가공하는 동안 은이 스캐폴드 물질에 첨가될 수 있다. 은은 다른 항균제와 함께 사용될 수도 있다. 항염증제는 스캐폴드 물질이 적용되는 상처 또는 조직 영역에서 염증을 감소 및/또는 저해하기에 충분한 양으로 첨가될 수 있다.
스캐폴드 물질은 건조된 형태로 사용될 수 있다. 또는, 스캐폴드 물질은 사용 전에 재수화될 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 스캐폴드 물질은 함께 적층되어 더 두꺼운 스캐폴드 물질을 형성한다.
일반적으로, 스캐폴드 물질은 두께가 (즉, 단면에서) 약 0.1 내지 4.0mm, 예를 들어 두께가 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 또는 3.5mm이다. 두께는 출발 물질로서 사용된 어종, 가공, 동결건조 및/또는 재수화를 포함한 여러 인자들에 따라 달라질 수 있다. 물론, 제품이 2개 이상의 스캐폴드 물질 층을 포함하는 경우 두께는 그에 비례하여 더 커진다.
상처 치료 및 방법 양태의 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는 유리하게는 내인성 조직과 같은 조직의 재생, 복구 및/또는 성장을 촉진할 수 있는 특성을 보유하는 콜라겐-기반 멸균 기질을 제공하며, 상처의 기하학적 형태를 더 잘 수용할 수 있도록 상처에 형성되거나 추가되도록 구성된다. 양태에서, 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는, 시트-기반 물질을 사용하여 이용할 수 없는 방식으로, 약화되거나 터널링된 상처와 같은 상처에 채워지도록 구성된다. 즉, 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는 통합을 촉진하도록 구성될 수 있으며, 즉, 스캐폴드 물질로 치료받는 환자의 세포 및 조직이 스캐폴드 물질로 성장할 수 있고 스캐폴드 물질이 실제로 환자의 신체내로 통합/흡수되도록 구성될 수 있다.
양태에서, 양태 따른 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는 세포 내성장 및 혈관신생과 같은 상처 치유/복구에 관여하는 세포 침투를 위한 물리적 스캐폴드로서 상처 치유를 적극적으로 촉진하도록 구성될 수 있다. 상처 치료 양태의 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는 예를 들어 조직학 분석에서 인식 가능한 세포외 기질("ECM")에 의해 탈세포화된 어류 피부의 3차원("3D") 구조를 유리하게 유지하도록 구성된다. 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자의 치수는 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자를 상처 치료에 대한 종래의접근 방식보다 더욱 정밀하게 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자를 성형 또는 포장하거나 또는 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자를 상처 구멍에 적용하는 것을 용이하게 하도록 추가로 구성될 수 있다.
양태에서, 파쇄된 세포가 제거된 어류 피부 입자는, 탈세포화된 어류 피부의 기질 구조를 보존하고 상처로의 세포 재생 내부성장을 촉진하는 데 효과적인 소정의 최대 크기 역치 및 최소 크기 역치 내에서 가장 큰 크기를 갖는다. 즉, 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자의 길이, 너비 및/또는 두께 중 가장 큰 치수와 같은 최대 치수는, 최대 크기, 예를 들어 1mm보다 작을 수 있고 ECM이 파괴되는 크기와 같은 최소 크기보다 클 수 있다. 양태에서, 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는, 전술된 바와 같이 탈세포화된 어류 피부의 시트를 제공하고 이어서 탈세포화된 어류 피부의 시트를 파쇄하고 임의로 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자가 소정의 최소 및 최대 크기 임계치 내에 있을 때까지 상기 파쇄된 입자를 씨빙(sieving)하여 얻는다.
파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는 이의 크기로 인해 전단력에 저항하도록 추가로 구성될 수 있으며, 이에 따라, 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는 위치 또는 환경 사이를 이동하거나 이동되는 환자에게 또는 회복 과정에서의 걷기와 같은 환자의 정상적인 활동 과정 중에 개선된 상처 치료를 제공할 수 있다.
양태의 파쇄된 탈세포화된 어류 피부 입자는, 유리하게는, 상처에 국소 적용 및/또는 이식되어, 세포 내성장 및 혈관신생을 위한 스캐폴드를 제공할 수 있으며, 유착 장벽, 연조직 복구, 열개(dehiscence) 예방 등과 같은 조직 스캐폴딩 이점을 포함하는 추가 이점이 있다.
착색제(들)
착색제의 다양한 예가 고려될 수 있다. 가장 넓은 의미에서, 본원에서 고려되는 착색제는, 치유 과정 동안 상처 내의 병태의 변화 또는 피부 대체물로의 변화에 근거하여 색이 변하거나 상실되는 피부 대체물에 색을 제공하는 착색제, 또는 색 또는 착색제의 조합이다. 바람직한 양태에서, 착색제는 상처 내에서 하나 이상의 프로테아제에 의한 공격시에 분해된다. 이러한 착색제의 경우, 색 제제(color agent)는 하나 이상의 프로테아제에 의한 분해시 이의 색을 잃는다. 예를 들어, 착색제는 피부 대체물에 청색(blue) 또는 자색(violet)을 제공할 수 있다. 그러나, 피부 대체물과 착색제를 포함하는 상처 치료제를 적용한 후 상처내의 하나 이상의 프로테아제에 의해 공격을 받으면, 상처 치료제의 피부 대체물의 색 또한 저하되거나 상실되어, 적용된 상처 치료제의 색이 피부 대체물의 본래 색으로 또는 다른 색으로 변하게 된다. 그러나, 착색제의 색 변화는 이에 한정되지 않으며, 이는 상처 내부의 병태 변화에 따른 색 이동을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 착색제에 의해 제공되는 색은, 착색제의 적용이나 첨가시 피부 대체물의 본래 색이 변하지 않도록, 촉발될 수 있다. 그러나, 착색제의 색 변화는, 상처 내부 병태의 변화에 의해 촉발되거나 유발될 수 있으며, 이에 따라, 상처 치료용 피부 대체물이 피부 대체물의 본래 색과는 상이하거나 새로운 색으로 변할 수 있다.
착색제로는 염료가 사용될 수 있다. 색 제제의 바람직한 예는 메틸렌 블루(MB)와 같은 티아진 염료이다. 메틸렌블루(MB)의 구조는 다음과 같다:
메틸렌 블루(MB)는 메틸티오니늄 클로라이드 또는 베이직 블루 9라고도 한다. MB는 직물 염색, 의학 및 연구와 같은 다양한 분야에 사용되는 양이온성 티아진 염료이다. 이는 수 시간에 걸쳐 최대 2mg/kg의 용량으로 메트헤모글로빈혈증 치료에 사용된다.
착색제의 다른 양태로는 트리아릴메탄 염료가 있다. 바람직한 트리아릴메탄 염료의 예는 하기 구조를 갖는 젠티안 바이올렛(GV)이다:
젠티안 바이올렛(GV)은 크리스탈 바이올렛, 메틸 바이올렛 10B 또는 헥사메틸 파라로사닐린 클로라이드로도 알려져 있다. 이는 그램법(Gram's method)에서 조직학적 염색에 종종 사용되는 트리아릴메탄 염료이다. 국소용 젠티안 바이올렛(GV)은 입(아구창)과 피부 내부의 특정 유형의 곰팡이 감염을 치료하는 데 사용된다.
착색제의 다른 양태로는 하기 구조를 갖는 브릴리언트 블루 FCF(BB-FCF)가 있다:
블루 넘버 1이라고도 하는 브릴리언트 블루 FCF(BB-FCF)는 주로 가공식품, 의약품, 건강보조식품, 및 화장품을 위한 청색 착색제로 사용되는 트리아릴메탄 염료이다. 이는 FDA-승인된 가장 오래된 색 첨가제 중 하나이며 일반적으로 무독성이고 안전한 것으로 간주된다.
착색제의 다른 양태로는 하기 구조를 갖는 인디고 카르민(IC)이 있다:
푸드 블루 1(food blue 1)이라고도 하는 인디고 카르민(IC)은 방향족 설폰화에 의해 인디고로부터 추출된 유기 염이며, 이는 화합물이 물에 가용성이 되게 한다. 이는 pH 11.4 미만에서는 청색이고 13.0 이상에서는 황색이며, 환원되면 황색으로 변하는 산화환원 지시약으로도 사용될 수 있다.
다음을 포함하는 다른 염료 화학물질 또는 염료 혼합물이 사용될 수 있으며 이는 본 발명자에 의해 고려되어 왔다.
우드 파우더(Woad Powder)(HUE-3023)는 목재 추출물의 INCI(국제 화장품 원료 명명법(International Nomenclature Cosmetic Ingredient))를 보유하고 있는 The Woolery에 의해 제안한 양모 염료이다. 이는 원사(yarn) 및 의류 등에 흔히 사용되는 염료 화학물질이며 알칼리성 환경에서의 착색에 주로 사용된다. 우드 파우더는 케라틴 단백질에 대한 결합능을 갖는 분말의 특성으로 인해 유용한 색 제제로 간주될 수 있다.
색 첨가제 D&C 그린 #5 Powder AN0725는 천연 원료로 만들어지며 일반적으로 화장품에 사용된다. 이는 INCI 명칭이 그린 5호인 색 첨가제이다. 분말은 건조 분말 형태의 수계 염료이다. 이는, 이의 분말 형태의 통상적인 수계 화장품 색으로 인해 색 제제로서 선택될 수 있다.
색 첨가제 울트라 마린 블루 H9-03R1은 눈 메이크업, 비누, 로션을 포함하는 화장품(입술 제품 제외)에 사용된다. 상기 색 첨가제는 천연 자원을 기반으로 하며 INCI 명칭은 울트라마린 Na6Al6Si6O24S4이다. 상기 색 첨가제는 오일 분산성 안료일 수 있으며 물이나 오일에 용해되지 않고 CAS 번호는 57455-37-5이다. 이는 강한 염색제이며, 이는 화장품에 매우 효과적이라고 평가되고, 화장품에 바르면 물이나 오일에 용해되지 않기 때문에 색 제제로서 선택될 수 있다. 그러나, 상기 색 첨가제는 바람직하지 않은 물질이 남아 있을 수 있으며 이러한 점이 고려되어야 한다.
색 첨가제 리퀴드 FD&C blue #1은 화장품, 비누, 배스 솔트, 및 배스 밤에 사용된다. 이는 천연 원료로 만들어졌으며 INCI 명칭은 블루 넘버 1이다. 상기 색 첨가제는 사전 혼합된 수계 염료로 제공될 수 있다. 이는 통상의 화장품 수용성 액체 염료이다.
색 첨가제 리퀴드 D&C 그린 #5 또한 화장품, 비누, 배스 솔트, 및 배스 밤에 사용된다. 이는 천연 원료로 만들어졌으며 INCI 명칭은 그린 넘버 5이다. 상기 색 첨가제는 사전 혼합된 수계 염료로 제공될 수 있다. 이는 통상의 화장품 수용성 액체 염료이다.
색 첨가제 리퀴드 D&C 그린 #6 오일 AM4299 또한 화장품, 비누, 배스 솔트, 및 배스 밤에 사용된다. 이는 천연 원료로 만들어졌으며 INCI 명칭은 그린 넘버 6 및 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드이다. 상기 색 첨가제는, 예를 들어 긴 유통 기한을 위해 분류된 코코넛 오일 중에 블렌드된, 사전 혼합된 유계 액체 염료로 제공된다. 상기 염료는 유계 염료와 더 잘 반응하는 제품으로 간주될 수 있으며, 이는 세척 단계에 더 잘 저항하고 수화에 용해되지 않는다. 그러나, 상기 염료의 사용은 환자에게 문신 효과를 줄 수 있는 상처의 영구적인 착색 가능성을 완화하거나 해결하기 위한 수단을 고려해야 함을 유의해야 한다.
녹색 농축 식용 색료는 Rayner에 의해 제조된 식용 색소이다. 이는 INCI 명칭이 워터(Water), 타르트라진(E102)(1.87%), 브릴리언트 블루 FCF(E133)(0.13%), 아세트산이다. 이는 사전 혼합된 수계 액체 식품 염료 혼합물로 제공되므로 착색제로 간주될 수 있다. 염료 혼합물은 무해한 염료 혼합물인 것으로 간주된다.
가르니어 내추럴 컬러(Garnier natural Color), 마호가니 브라운은 Garnier에 의해 생산되는 헤어 컬러링으로, 아쿠아, 데세스-3, 알루레스-12, 코카마이드 미파, 올레스-30, 수산화암모늄, 데세스-5, 글리세린, 올레산, 올레일 알코올, 헥사디메트린 클로라이드 2, 4-디아미노포넥시에탄올 HCl, p-아미노페놀, m-아미노페놀, 아스코르브산, 하이드록시에틸셀룰로오스, 메타중아황산나트륨, 에탄올아민, 트리티쿰 불가레 배아유, 밀배아유, 티오글리세린, 폴리쿼터늄-6, 톨루엔-2,5-디아민, 폴리쿼터늄-67, 2-메틸-5-하이드록시에틸아미노페놀, 암모늄 티오락테이트, 심몬시아 키넨시스 오일, 호호바씨 오일, 이소프로판올아민, 레조르시놀, EDTA, 향수로 이루어진 성분을 갖는다. 상기 염료는 사전 혼합된 헤어 컬러 키트로 상업적으로 제공된다. 상기 염료는, 단백질과 결합하도록 제형화되고 스캐폴드의 콜라겐 또는 피부 대체물의 콜라겐과 반응할 수 있으므로, 착색제의 또 다른 양태이다.
ELEA, 컬러 앤 케어, 블랙은 ELEA에 의해 생산되는 헤어 컬러링 제품이다. 아쿠아(Aqua), 세테라일 알코올, 암모니아 세테레스-20, 세트리모늄 클로라이드, 코캄도프로필 베타인, 올레산, 프로필렌 글리콜, PEG-40, 수소화 카스트롤 오일, p-페닐렌디아민, 2,4-디아미노페녹시에탄올, HCl, 비티스 빈페리아 씨드 오일 메타중아황산나트륨, 에리소르빈산, 향수, 쿠마린, 리모넨, 리나룰, 레조르시놀, 테트라나트륨 EDTA의 성분을 갖는다. 상기 염료는, 단백질과 결합하도록 제형화되고 스캐폴드의 콜라겐 또는 피부 대체물의 콜라겐과 반응할 수 있으므로, 착색제의 또 다른 양태이다.
착색제의 다양한 예 및 양태가 본원에 제공되지만, 가능한 착색제에 대한 이러한 설명은 염료 또는 색 첨가제로서의 모든 가능한 착색제를 망라하는 것은 아니며 그와 같이 고려되지 않아야 한다.
피부 대체물로의 착색제의 첨가
바람직한 양태로서, 메틸렌 블루(MB), 젠티안 바이올렛(GV), 또는 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)의 조합이 피부 대체물에 첨가되는 착색제로서 사용된다.
메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)을 병용하는 양태에서, 메틸렌 블루(MB) 및 젠티안 바이올렛(GV)이 동일한 중량비로 함께 사용된다. 그러나, 다른 양태에서, 메틸렌 블루(MB) 및 젠티안 바이올렛(GV)이 동일하지 않은 중량비로 함께 사용된다. 다른 양태는 이들 염료, 메틸렌 블루(MB) 및 젠티안 바이올렛(GV), 및 기타 염료 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 방법 및 양태가 아래에 설명된다.
제1 양태에서, 아이슬란드산 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로 만든 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질이 피부 대체물로서 제공된다. 단순하게 하기 위해, 달리 명시하지 않는 한, 아이슬란드산 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로 만든 상기 스캐폴드 물질은 "스캐폴드" 또는 "스캐폴드 물질"로 지칭되며, 이는 피부 대체물의 양태로서 제공된다.
다음은 하나 이상의 색 제제를 스캐폴드에 첨가하고 색 제제(들)의 견뢰도를 증가시키는 방법에 대한 설명이다.
바람직한 양태로서, 메틸렌 블루(MB) 및/또는 젠티안 바이올렛(GV)의 색 제제를 스캐폴드에 첨가하는 데 사용되는 일반적인 공정이 있다.
예시적인 절차에서, 0.001중량%의 각각의 착색제(MB 및 GV)(2개 염료(MB 및 GV)가 사용된 경우 총 0.002중량% 또는 20mg/L)를 함유하는 염료 용액(탈이온수 또는 인산염-완충 식염수(이하 "PBS"로 약칭함)를 기준으로) 100mL가 사용된다. 크기가 대략 4×4cm이고 중량이 0.25 내지 0.30g인 동결-건조 스캐폴드 조각을 용액에 첨가하고 3분간 방치한다. 이어서 Kroma 스캐폴드를 용액으로부터 제거하여 수돗물로 세척한 후 탈이온수로 헹구고 냉동시킨다. 염색된 스캐폴드(300) 생성물을 도 3에 나타낸다.
MB 및 GV와 함께 전술된 바와 같이 사용하는 경우, 스캐폴드에서 두 염료의 조합 양은 대략 1mg/g이다. 전술된 4개 염료(메틸렌 블루(MB), 젠티안 바이올렛(GV), 브릴리언트 블루 FCF(BB-FCF), 및 인디고 카르민(IC))를 조합하거나 이들 4개 염료 중 하나를 사용하여, 물 또는 PBS 용액에서 동일한 총 농도(0.002wt%) 또는 염료당 농도(0.001wt%)에서, 정확히 동일한 방법을 사용할 수 있다. 염료 용액의 총 농도 또는 체적에 약간의 변화가 있으면 임의의 단일 염료 또는 위에 나열된 염료의 다른 조합에 대한 스캐폴드에서의 동일한 총 농도가 생성된다. UV-VIS 분광광도계는 임의의 단일 염료, 또는 임의의 염료 조합에 의한 염색 공정 전과 후의 착색 용액의 흡광도 및 농도 정도를 측정하여, 스캐폴드로의 흡착에 대한 친화도를 판정할 수 있다 (이는 본 발명자에 의해 사용됨).
도 4a, 4b 및 4c는, 염료 용액(탈이온수 또는 인산염-완충 식염수(이하 "PBS"로 약칭함)를 기준으로) 100mL로 염색되어 생성된 스캐폴드 물질을 나타내며, 도 4a의 스캐폴드 물질(410)에 0.001wt%의 MB를 함유하는 상기 염료 용액을 24시간 동안 방치하고; 도 4b의 스캐폴드 물질(420)에 0.001wt%의 GV를 함유하는 상기 염료 용액을 24시간 동안 방치하고; 도 4c의 스캐폴드 물질(430)을 0.001wt%의 25/75 조합 비의 MB/GV를 함유하는 상기 염료 용액을 24시간 동안 방치한다.
다른 양태에서, (1) 상기와 동일한 실험 설정을 사용하여 함께 적용되는 BB-FCF 및 IC(MB 및 GV가 적용되는 경우); (2) 생체내 조건에서 수명 연장을 위해 MB 및/또는 GV 전후에 적용되는 BB-FCF 및/또는 IC; 및 (3) MB 및/또는 GV와 조합된 BB-FCF 및/또는 IC를 포함하는, 다른 추가의 조합의 염료가 사용되었다. 전술된 조합에서, 용매는 물 또는 PBS일 수 있다. 다른 양태는, 이후 섹션에서 논의되는 다른 용매 혼합물을 포함한다. 도 5는, 총 농도 0.002중량%로 상기와 같은 착색제 MB 및 GV(각 착색제 BB-FCF 및 IC의 0.001중량%)를 사용하여 전술된 실시예와 유사한 중량으로 적용된 BB-FCF 및 IC로 염색되고 3시간 방치되어 생성된 스캐폴드(510)를 보여준다.
매염제를 사용한 대체 방법
다른 양태에서, 스캐폴드 물질에 첨가된 색 제제 또는 색 제제 조합의 견뢰도를 증가시키기 위해 여러 방법 또는 색 고정제(color fastener)가 사용된다.
매염제, 또는 염료 고정제(fastener) 또는 정착제(fixative)는 생물학적 염색 및 섬유 산업에 사용되는 화합물 군으로, 주로 2가(염)를 갖는 금속으로 구성된다. 탄닌산이나 타르타르 크림(타르타르산의 칼륨 염)과 같은 화합물은 일반적으로 진정한 매염제로 간주되지는 않지만 종종 동일한 목적으로 사용된다.
매염제의 선택은 사용되는 염료에 따라 종종 달라지며, 예를 들어, 일부 아연 염은 GV용 MB 및 요오드(KI + I2)와 함께 사용될 수 있다. 요오드는 그램 stain에서 매염제로서 사용되기도 하지만 실제로는 매염제라기보다는 포획제(trapping agent)로 간주된다.
매염제의 한 가지 정의는, 비록 상기 정의는 본 기재사항에서 반드시 "매염제(mordant)"라는 용어로 제한되는 것은 아니지만, 특정 염료와 배위 착물을 형성하는 다가 금속 이온이며, 위에 반영된 바와 같이, 일부 조성물은 이러한 정의에 속하지 않음에도 당업자에 의해 일반적으로 매염제(예를 들어, 탄닌산, 타르타르 크림, 요오드)인 것으로 간주된다.
매염제는 일반적으로 3가지 방식으로 착색 공정에 적용될 수 있다: (1) 사전-매염(온크롬(onchrome)), 여기서 기판은 매염제로 처리된 다음 염료로 처리된다; (2) 매염제가 처음부터 착색 용액에 존재하는 메타-매염(메타크롬(metachrome)) (이 공정은 사전/사후-매염보다 간단하지만 소수의 염료에만 적용 가능함); 및 (3) 사후-매염(애프터크롬(afterchrome)), 여기서 기판은 먼저 염료로 처리된 다음 매염제로 처리된다.
도 6a 및 6b는 매염된 스캐폴드 물질을 나타내며, 도 6a는 명반을 사용하여 0.002중량% 농도의 MB/GV 조합으로 염색된 Kroma 스캐폴드 물질(610)의 매염 후 샘플을 나타내고, 도 6b는 명반을 사용하여 농도 0.002중량%의 MB/GV 조합으로 염색된 스캐폴드 물질(620)의 매염 전 샘플을 도시한다. 황산알루미늄으로도 알려진 명반(alum) 다양한 염료에 대한 우수한 견뢰도를 제공하고 색의 명도와 채도를 증가시키기 때문에 직물에 가장 많이 사용되는 매염제 중 하나이다. 그러나, 스캐폴드와 함께 사용할 수 있는 유일한 매염제를 의미하는 것은 아니다. 다른 양태에서, 가능한 매염제/염은 NaCl, MgCl2, MgSO4, CaCO3, CaCl2, KCl, ZnCl2, 일부 다른 Zn 염 또는 심지어 KI/I2의 사용을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 양태에서, 도 6c 및 6d에 도시된 바와 같이, 메타-매염의 변형으로서, 도 6c에서는 총 농도 0.002wt%의 MB/GV 조합으로 염색된 스캐폴드 물질(630)은 CaCl2 0.5g이 첨가된다. 또한, 도 6d에서는 총 농도 0.002wt%의 MB/GV의 조합으로 염색된 스캐폴드 물질(640)은 NaCl 0.5g이 첨가된다.
양태에서, 이러한 금속 염/매염제 중 임의의 것 또는 2개 이상의 조합이 전술된 임의의 염료 또는 염료의 임의의 조합, 또는 임의의 다른 염료 조합 및 착색 기술과 함께 사용된다.
다른 양태에서, 3가지 매염 방법 모두가 대략 90℃에서 대략 2시간 동안 적용된다. 가능하지 않은 경우, 스캐폴드 기판은 실온에서 최대 48시간에 걸쳐 용액에 저장될 수 있다. 본원의 경우, 본 발명자의 실험 결과는, 스캐폴드를 염화나트륨 용액에서 약 80℃에서 2시간 동안 가열하면, 콜라겐의 젤라틴으로의 부분 분해로 인한 것일 가능성이 가장 높은, 콜라겐이 보다 젤형인 형태로 실질적으로 파괴될 수 있음을 보여준다. 따라서 "콜드 방법(cold method)" 또는 하이브리드 방법(예를 들어, 12시간 동안 대략 37℃)이 바람직하다.
일반적으로 메타-매염은 가장 제한적인 방법으로 간주될 수 있다. 이는 공정 과정에서 형성되는 염료-매염제 복합체(다이-레이크(dye-lake)로 알려짐)의 용해도를 포함한 다양한 인자에 기인한다. 복합체의 용해도는 종종 매염제와 염료의 용해도보다 낮아서 침전을 일으키며, 이는 적용될 수 있는 매염제-염료 조합을 제한한다. 또한, 메타-매염을 사용할 때 용액 중에서의 시간은 매염 시간에 따라 달라지는데, 이는 실온에서 대략 2일이다. 따라서, 염색 공정은 더 길어지거나 더 높은 온도에서 수행되어야 할 수 있다. 흡착된 색의 양은 용액에서의 시간과 직접적으로 연관되어 있는 것으로 나타났으며 이는 온도와도 연관될 가능성이 높다.
바람직한 양태는 사전-매염 또는 사후-매염이 포함되며, 매염 공정 과정에서 스캐폴드가 다수의 색을 상실하지 않는다는 점을 고려하면 현재의 착색 및 정량화 방법을 변경하지 않고도 사용할 수 있으므로 후, 사후-매염이 잠재적으로 본원의 적용에 더 유리할 수 있다. 사전-매염 공정은, 흡착 중에 다이-레이크가 스캐폴드 표면에 직접 형성되기 때문에, 염료의 흡착 속도를 변경할 수 있다. 또한, 매염제는 염료 용액으로 "누출"되어 잠재적으로 침전을 일으키거나 염료 분자의 흡광도 강도를 변화시킬 수 있다. 두 경우 모두 스캐폴드에 의해 흡수된 염료의 양을 측정할 때 문제가 발생할 수 있다.
전술된 바와 같이, 명반은 바람직한 매염제이지만, 다른 양태에서, 나트륨, 마그네슘, 칼륨 및 철의 염과 같은 금속 염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 매염제가 사용될 수 있다.
pH 구배 염색 또는 "염색을 통함"
다른 양태에서, 스캐폴드의 염색 가공에 "염색을 통한(through dyeing)" 공정이 사용되었다. 상기 공정은 염색 공정 과정에서 염료-용액의 pH가 약염기성(pH 9 내지 10)으로부터 약산성(pH 3 내지 4)까지 점진적으로 변한다. 이는 다양한 약산/약염기(예를 들어, 산성 산/중탄산나트륨), 강산/강염기(예를 들어, HCl/NaOH)의 희석 용액, 또는 극소량의 농축된 강산/염기 또는 이들 방법의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 공정은 본원에 기재된 임의의 염색 방법 대신에 또는 상기 방법과 함께 사용될 수 있다. 염색을 통한(though dyeing) 공정의 효과는 pH 척도의 범위에 걸쳐 단백질(이 경우 콜라겐)의 3차 구조의 제한된 안정성에 기인할 수 있다. 단백질이 처리할 수 있는 수준으로 진화하지 않은 pH에 노출되면, 이는, 단백질 구조가 개방되어 염료에 대한 가능한 결합 부위가 노출됨으로써 변형된다.
도 7에는 염색 공정에 pH 등급이 수반되는 다양한 생성된 스캐폴드 물질이 나타나 있다. 먼저, pH 구배 적용시 총 농도 0.002중량%에서 MB/GV의 조합으로 염색한 후의 스캐폴드 물질(710)이 도시되어 있다. pH 구배 적용시 총 농도 0.002중량%에서 MB로 염색한 후의 스캐폴드 물질(720)이 도시되어 있다. pH 구배 적용 시 총 농도 0.002중량%에서 MB/BB-FCF 조합으로 염색한 후의 스캐폴드 물질(730)이 도시되어 있다. 또한, 스캐폴드 물질(740)은 pH 구배 적용시 총 농도 0.002wt%에서 BB-FCF로 염색한 후를 도시한 것이다.
비전통적인 염색 또는 고정 방법
다른 양태에서, 비전통적인 염색 또는 색-고정(color-fastening) 방법이 사용된다. 다음은 다른 양태에서 사용된 몇 가지 비전통적인 염색 방법에 대한 설명이다. 이들 양태에서, 색 흡수의 유효성 또는 고정 정도는 주로 육안 검사에 의해 판정되었다.
일부 양태에서, 염색 공정에서 대체 용매가 사용되었다. 전술된 염색 방법은 염료에 대한 수계/수성 용매를 사용하여 수행하였다. 그러나, 전술된 4가지 염료(MB, GV, BB-FCF 및 IC)는 에탄올과 같은 다양한 용매에 용해되며, 물에 용해될 뿐만 아니라 약간 친유성이다.
일부 양태에서, MB 및/또는 GV는 에탄올에 용해되고, 동결-건조된 스캐폴드는 에탄올 용액에서 염색된다. 이로 인해 유사한 수성 방법에 비해 훨씬 밝은 색상이 나타났으며, 보다 농축된 염료 용액 및 더 긴 염색 시간을 적용한 경우에도 마찬가지였다. 이러한 양태에서 더 밝은 전체 색상이 육안으로 보였지만, 효과적으로 착색된 피부 대체물을 여전히 제공하면서도 색 견뢰도가 개선될 수 있고 상처의 영구 문신 가능성이 덜 발생할 수 있기 때문에, 이러한 양태는 여전히 효과적이고 심지어 바람직한 것으로 간주될 수 있다.
다른 양태에서, 염료는 올레산에 용해되지만 이들 양태에서는 용해도가 더 낮았다. 그러나, 70/30 올레산/에탄올 혼합물을 사용하면 더 높은 용해도를 얻을 수 있다. 스캐폴드의 생성된 색은 동일한 시간 및 염료 농도에 대해 에탄올 및 올레산에 비해 전반적으로 더 어두운 것으로 밝혀졌다.
다른 양태에서, 식물성 오일도 사용되었다. 어류 오일/대구 간유도 사용할 수 있다. 오일/유기 용매 기반 염료 용액을 사용하는 것은 염료의 모든 조합으로 수행될 수 있으며, 이는 다양한 오일, 지방산, 이의 염 및 용매를 사용하여 사전-매염된 스캐폴드에서도 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 염색 후에 코팅 처리를 수행하였다. 이러한 양태에서, 가장 관심을 끄는 것은 오일 및 당-기반 코팅이다.
일양태에서, 어유로부터 유래된 트리글리세라이드, 모노글리세라이드 및 유리 지방산의 혼합물은, 염색 후 스캐폴드에 박막을 분사하여 코팅하는 데 사용되었다. 샘플은 코팅이 없는 유사한 샘플과 비교하여 시험관내 탈색 및 파괴 실험에 대해 어느 정도의 저항성(resistance)을 얻었다. 또한, 이는 적합한 지방산 알킬 에스테르를 사용하여 수행될 수도 있다.
다른 양태에서, 당-기반 코트는, 리보스, 프룩토스 또는 덱스트로스와 같은 단순 당(단당류) 또는 수크로스 또는 말토스와 같은 이중 당(이당류)과 같은 다양한 당으로 제조된다. 선택한 당을 수용액에 용해시키고, 스캐폴드를 침지한 후 다시 동결-건조한다. 비-환원 당은 착색 용액에 용해될 수 있다. 당은 추가의 가교결합을 도입하여 콜라겐 자체의 안정성을 증가시킬 수 있다. 또한, 당은 수소 결합이나 쌍극자 힘에 의해 염료 분자에 대한 추가의 연결을 촉진할 수 있는 다량의 -OH 기를 함유한다. 또한, N-아세틸글루코사민과 같은 질소 함유 당은 콜라겐 및 특정 염료의 유리 아미노산/산 말단과 공유 결합을 형성할 수 있다.
전술한 거의 모든 가능한 방법과 양태가 함께 사용될 수 있지만, 색의 생동감(vibrancy), 견뢰도 등을 증가시키기 위해 각 카테고리의 여러 구성요소, 예를 들어 2개 이상의 매염제를 사용하면, 염색된 스캐폴드의 제조에 드는 복잡성, 가능한 부작용 및 전체 비용이 또한 증가할 수 있다.
따라서, 적합한 프로토타입을 생성하는 바람직한 방법 및 양태는 "기본(basic)" 염색 공정과 유사하다. 확인된 가장 주목할만한 문제는 생체내 조건에서의 (예를 들어, 마우스에서의) 염료의 수명이다. 잠재적인 개선은 매염 단계, pH 구배, 또는 2가지의 조합을 사용하여 스캐폴드의 콜라겐 기질 내에서의 염료 분자의 결합을 증가시킬 수 있다는 점이다. 도 8에 도시된 바와 같이, 염색된 스캐폴드의 2가지 바람직한 양태가 비교되어 도시된다. 스캐폴드(810)는 총 농도 0.002중량%의 MB/GV 조합을 사용하여 염색되고, 스캐폴드(820)는 총 농도 0.002중량%의 MB/GV 조합 및 사전-매염된 염료를 사용하여 염색된다.
콜라게나제는 스캐폴드의 분해를 촉매함.
스캐폴드가 생물학적 드레싱으로 사용될 때 신체는 큰 스캐폴드를 미세한 조각의 "풀(pool)"로 파괴되어, 환부를 재건하고 성장시키는 데 도움을 준다. 검증 실험에서, 스캐폴드의 이러한 분해 과정과 스캐폴드 샘플의 염료(들)에 대한 이의 영향을 모방하기 위해 PBS에 있는 콜라게나제 용액을 선택하였다. 자연과 사람에서, 콜라게나제의 주요 기능은 콜라겐을 펩타이드 수준으로 파괴하는 것으로, 이는 예를 들어 피부 내 손상된 조직에서 발생하며 신체가 새로운 건강한 조직을 생성하도록 돕는다.
이를 위해, PBS 중의 0.50mg/mL 콜라게나제의 원액(stock solution)을 제조하였다. 이어서, 제1 실험에서, 원액을 10 또는 100㎍/mL로 희석하였다. PBS 또는 "사람 혈장 유사 용액"을 상기 용액의 대부분으로 사용하여 총 9개의 용액을 제조한 다음, 10ml의 스캐폴드 조각을 용액에 넣고 장기간 실온에서 유지하였다.
염색되지 않은 스캐폴드는 콜라게나제 PBS 용액에서 파괴되기 시작하는 것으로 본 발명자에 의해 발견되었다. 혈장 유사 배지의 경우, 혈장 용액에서 콜라게나제의 농도가 10배 더 높은 경우에도 상기 용액은 대략 3일 후 스캐폴드의 유사한 파괴 수준에서 볼 수 있듯이 콜라게나제를 저해하는 것으로 보였다. 이러한 기간 동안 MB와 GV를 0.002% 농도로 조합하여 염색한 스캐폴드에서는 큰 변화가 나타나지 않았다.
MB/GV 염색물을 파괴하기 위해, 현저하게 더 높은 농도의 콜라게나아제를 적용하였다. 이를 위해 원래의 0.5mg/mL PBS 용액이 사용되었다. 시간과 파괴 수준을 비교하기 위해 염색되지 않은 스캐폴드의 조각을 시험한 후 일련의 변형을 시험하였다. 미세한 입자로의 전체 파괴에는 약 24시간밖에 걸리지 않는 것으로 밝혀졌다. 염색된 샘플로 전환하면, 도 9a에 도시된 바와 같이, 0.001중량% MB/GV 용액에 염색된 제1 스캐폴드 샘플(910)을 시험하였다. 0.5mg/mL 콜라게나제 용액에서, 해당 샘플의 전체 파괴에 대략 2일이 걸렸다. 도 9b에서 볼 수 있는 바와 같이, 색의 일부가 용액으로 흘러나왔지만, 대부분의 염료는 여전히 작은 콜라겐 입자(920)에 결합되어 있다.
이전 섹션에서 기재된 하기의 5개의 "프로토타입"이 동일한 방식으로 시험하였다. 시험된 프로토타입은 1) 물 중의 0.002wt% MB/GV, 2) PBS 중의 0.002wt% MB/GV, 3) PBS 중의 0.002wt% MB/BB FCF, 4) 물 중의 0.001wt% IC, 및 5) 트리글리세라이드, 모노글리세라이드, 및 어유로부터 추출된 유리 지방산의 혼합물로 코팅된 물 중의 0.002wt% MB/GV에서 염색된 스캐폴드 물질이었다. 이어서 4일 동안 샘플을 검사하였는데, 하나의 경우(샘플 4: 물 중의 0.001wt% IC)를 제외한 모든 경우에서 전체 분해에 4일이 걸렸다.
이러한 실험에서, 염색된 스캐폴드(상기 1 내지 5)가 미세한 조각으로 파괴되었으며 모든 경우에 염료의 양호한 부분이 해당 조각에 남아 있는 것으로 나타났다. 이는 염료가 표면에 뿐만 아니라 스캐폴드의 콜라겐/펩타이드에 단단히 결합됨을 제안한다. 전술된 바와 같이, 하나의 경우(즉, 샘플 4: 물 중의 0.001wt% IC)를 제외한 모든 경우 분해에 약 4일이 소요되었으며, MB/GV로 염색된 샘플들간에는 큰 차이가 관찰되지 않았다. 샘플 3 및 4는 약간 상이하였고, IC로 염색된 샘플 4는 24시간도 안되어 거의 완전히 파괴되어 몇 개의 작은 조각만 남았다. 샘플 3은 샘플 4에 비해 더 안정적이었지만 다른 3개 샘플보다 더 빨리 분해되고 더 작은 조각으로 분해되었다.
상기 양태에서, 스캐폴드의 착색은 일반적으로 동일한 중량 비의 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)의 조합을 수반하였다. 그러나, 반드시 그런 것은 아니다. 염색량은 특정량의 착색제를 갖는 스캐폴드를 생성하도록 조정될 수 있으며, 이는 착색제의 양이 이러한 유형의 제품에 대해 FDA에 의해 발행된 MB의 최대 허용량보다 낮고 일부 양태에서는 상당히 낮도록 하는 것을 목표로 한다. 스캐폴드 내 2가지 염료 MB/GV의 조합량은 대략 1mg/g이지만, 최대 허용량은 일부 양태에서 2mg/g, 3mg/g, 4, 5mg/g, 6mg/g, 7mg/g, 8mg/g, mg/g, 9mg/g, 또는 심지어 10mg/g일 수 있다.
일부 양태에서, 착색제를 첨가하는 단계는 (총 0.002wt% 또는 총 20mg/L 중에) 0.001wt%의 각각의 착색제를 함유하는 염료 용액(탈이온수 또는 PBS를 기준으로) 100mL를 사용한다. 그러나, 염료 용액 내의 착색제의 양은 착색제가 적용되는 피부 대체물의 요구를 충족시키기 위해 증가되거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 염료 용액은, 색소, 및 착색제 또는 색 제제가 첨가되어야 하는 피부 대체물에 따라, 1.0 내지 10.0wt%의 양의 착색제 또는 색 제제 (탈이온수, PBS, 또는 몇몇 기타 염료 용매), 1.0 내지 20.0wt% 착색제 또는 색 제제 (탈이온수, PBS, 또는 몇몇 기타 염료 용매), 1.0 내지 0.01wt% 착색제 또는 색 제제 (탈이온수, PBS, 또는 몇몇 기타 염료 용매), 0.01 내지 0.001wt% 착색제 또는 색 제제 (탈이온수, PBS, 또는 몇몇 기타 염료 용매를 기준으로), 0.05 내지 0.002wt% 착색제 (탈이온수, PBS, 또는 몇몇 기타 염료 용매를 기준으로), 0.01 내지 0.0002wt% 착색제 (탈이온수, PBS, 또는 몇몇 기타 염료 용매를 기준으로), 또는 0.01 내지 0.0002wt% 착색제 또는 색 제제 (탈이온수, PBS, 또는 몇몇 기타 염료 용매를 기준으로)를 가질 수 있다.
크기가 약 4×4cm이고 무게가 0.25 내지 0.30g인 스캐폴드 조각을 용액에 첨가하고 3시간 동안 방치할 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, 스캐폴드 물질의 크기와 스캐폴드 물질이 염색 용액에 남아 있는 시간은 다양할 수 있다. 또한, 스캐폴드 물질의 크기는 물론 다양할 수 있으며, 염료 용액의 체적 및 농도에 대해 필요한 조정이 이루어질 수 있다. 이어서, 스캐폴드를 용액으로부터 제거하여 수돗물로 세척한 후 탈이온수로 헹구고 냉동, 냉동-건조 또는 동결건조한다.
일부 양태에서, 용액의 베이스(base)로서 탈이온수 대신 PBS를 사용하는 경우 스캐폴드에 의해 흡착된 MB 및 GV의 상대적인 양은, 수용액에 대해 대략 60중량% GV 및 40중량% MB로부터 PBS에 대해 대략 40중량% GV 및 60중량% MB로 변하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 흡착된 착색제의 총량은 거의 동일하다. 또한, 95/5, 90/10, 85/15, 80/20, 75/25, 70/30, 65/35, 60/40, 55/45, 50/50, 45/55, 40/60, 35/65, 30/70, 25/75, 20/80, 15/85, 10/90, 및 5/95의 MB 비를 포함하여, MB와 GV가 병용될 때 다양한 MB/GV 비가 사용될 수 있다. MB/GV의 비는 10 내지 50% MB, 10 내지 60% MB, 10 내지 70% MB, 10 내지 80% MB, 및 10 내지 90% MB 범위일 수 있으며, 나머지 해당 퍼센티지(90 내지 50%, 90 내지 40%, 90 내지 30%, 90 내지 20%, 및 90 내지 10%)가 존재한다. 바람직한 양태에서 MB/GV 비는 50/50이다. 바람직한 양태에서 MBGV 비는 75/25이다. 또한, 바람직한 양태에서 MB/GV 비는 25/75이다.
피부 대체물용 착색제로서의 MB 및 GV의 사용에 더하여, 다른 양태에서, 식용 색소의 사용, 또는 보다 정확하게는 식용 색소 내의 활성 화합물(염료/안료)이 MB 및 GV조합하여 사용되거나 MB 및 GV로 대체된다.
일양태에서, 지용성 식용 색소 및 하나의 수용성 식용 색소가 사용된다. 지용성 식용 색소의 염료는 E133, 또는 브릴리언트 블루 FCF(BB-FCF)이었으며 이는 GV와 매우 유사한 분자 구조를 갖는 수용성 분자이다. 염료는 식용 색소의 대략 40중량%이었고 나머지 첨가물은 '지용성'을 위한 것이었다. 수용성 색소의 염료는 E132 또는 인디고 카르민(IC)이었으며 이는 식용 색소의 대략 85wt%를 차지하였다.
본 발명자는 콜라게나제를 사용한 효소 파괴에 의해 그리고 대략 1M 중탄산나트륨 용액에 방치함으로써 식용 색소만 스캐폴드 물질로부터 제거될 수 있음을 발견하였다.
전술된 착색제들의 결합 메커니즘으로 인해 스캐폴드 물질의 콜라겐/펩타이드에도 결합하는 것으로 확인되었으며 다른 콜라겐이나 펩타이드계 피부 대체물 상에서 유사하거나 적절한 착색제와의 유사한 결합 메커니즘을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 스캐폴드 물질은 온전한 어류 피부로부터 얻어질 수 있거나 뼈가 있는 어류 또는 연골성 어류를 포함한 모든 종류의 어류를 어류 피부의 원료로 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 공급원은 대구, 해덕 및 메기와 같은 둥근 어류; 할리벗, 플라이스 및 솔과 같은 가자미류; 연어 및 송어와 같은 연어류; 참치와 같은 고등어과; 또는 청어, 멸치, 고등어 및 정어리와 같은 소형 어류일 수 있다. 또한, 다른 콜라겐, 펩타이드, 또는 기타 단백질-함유 피부 대체물이, 생물학적 피부 대체물, 합성 피부 대체물, 또는 하이브리드 피부 대체물인지의 여부와 무관하게, 염료, 안료, 및/또는 다른 착색제의 적절한 조합으로 유사하게 착색될 수 있다.
마우스 및 환자에 대한 테스트, 및 결과
마우스
아이슬란드산 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로부터 만들어진 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질의 양태는 피부 대체물로서 제공되었다. 다시, 다음의 하위섹션에서, 달리 명시하지 않는 한, 아이슬란드산 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로부터 만들어진, 스캐폴드 물질로서 사용되는 "어류 피부(fish skin)"는 "스캐폴드" 또는 "스캐폴드 물질"로서의 "어류 피부"로 지칭되며, 이는 피부 대체물의 양태로서 제공된다.
착색된 스캐폴드 물질의 양태를 피부 대체물로서 사용하여 마우스 총 52마리를 테스트하였다.
제1 파일럿인 파일럿 1에서는 4마리의 마우스를 치료하였다.
파일럿 1에는 다음이 포함되었다:
1) 착색제 0.005wt% MB + 0.005wt% GV, 3시간 동안 물에서 염색되고 이어서 동결건조된, 신규로 탈세포화된 어류 피부; 및
2) 착색제 0.010wt% MB+ 0.010wt% GV, 3시간 동안 물에서 염색되고 이어서 동결건조된, 신규로 탈세포화된 어류 피부.
제2 파일럿인 파일럿 2에서는 16마리의 마우스를 치료하였다.
파일럿 2에는 다음이 포함되었다:
1) 착색제 0.001wt% MB +0.001wt% GV, 24시간 동안 물에서 염색되고 이어서 극저온 당 용액에 침지되고 동결건조된, 신규로 탈세포화된 어류 피부;
2) 착색제 0.001wt% MB +0.001% GV, 3시간 동안 물에서 염색되고 이어서 극저온 당 용액에 침지되고 동결건조된, 동결건조된 어류 피부;
3) 착색제 0.001wt% MB +0.001wt% GV, 3시간 동안 물에서 염색되고 이어서 미네랄 오일에 침지되고 동결건조된, 동결건조된 어류 피부; 및
4) 착색제 0.001wt% MB +0.001wt% GV, 3시간 동안 물에서 염색되고 이어서 동결건조된, 동결건조된 어류 피부.
제2 파일럿인 파일럿 3에서는 32마리의 마우스를 치료하였다.
파일럿 3에는 다음이 포함되었다:
착색제 0.001wt% MB + 0.001% GV, 3시간 동안 PBS에서 염색되고 동결건조된, 동결건조된 어류 피부.
파일럿 1, 파일럿 2, 및 파일럿 3 각각에 대한 마우스 연구 결과는 다음과 같다. 유색 어류 피부를 스캐폴드 물질로 사용한 후에는 예상치 못한 염증이나 기타 부작용이 검출되지 않았다. 치료 제품(스캐폴드 물질)은 시간이 지나면 분해되고 상처는 정상적으로 치유된다. 특히, 상처 기저부의 영구적 또는 반영구적 문신이 검출되지 않았다.
사람 환자
3명의 환자(환자 1, 환자 2 및 환자 3)는 당해 하위섹션에서 "어류 피부" 또는 "스캐폴드" 또는 "스캐폴드 물질"로 불리는 아이슬란드산 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로 치료되었다.
3명의 환자(환자 1, 환자 2 및 환자 3) 각각에서, 상기 파일럿 3과 같이, 착색제 0.001wt% MB + 0.001% GV, 3시간 동안 PBS에서 염색되고 동결건조된, 동결건조된 어류 피부로, 스캐폴드 물질을 제조하였다.
환자 1은 유색 어류 피부로 2021년 10월 12일에 치료되었으며, 제1 사진은 도 10a에 도시되어 있고, 환자 1의 동일한 상처는 7일 후인 2021년 10월 19일에 재촬영되었으며 이는 도 10b에 도시되어 있다.
환자 2는 유색 어류 피부로 2021년 10월 25일에 치료되었으며, 제1 사진은 도 11a에 도시되어 있고, 환자 2의 동일한 상처는 7일 후인 2021년 11월 2일에 재촬영되었으며 이는 도 11b에 도시되어 있다.
마지막으로, 환자 3의 다양한 상처를 2022년 1월 20일부터 2022년 2월 10일까지 유색 어류 피부로 치료하였으며, 도 12a 내지 12n은 상처 드레싱을 교체할 때마다 치료된 상처를 보여준다. 도 12a는 적용된 유색 어류 피부를 0일째에 보여주고, 도 12b는 동일한 상처를 4일째에 보여준다. 도 12c의 6일째로 표시된 대로 새로운 유색 어류 피부를 적용하고, 도 12d는 2일 후인 8일째에 처리된 상처를 보여준다. 동일한 환자 3의 경우, 도 12e에서 새로운 유색 어류 피부를 다른 상처에 적용하고, 도 12f는 2일 후 상기 동일한 상처를 보여주고, 도 12g는 5일 후 상기 동일한 상처를 보여준다. 도 12h는 새로운 유색 어류 피부를 적용한 것을 나타내고, 도 12i는 2일 후의 결과를 나타내고, 도 12j는 4일 후의 결과를 나타낸다. 마지막으로, 도 12k는 새로운 유색 어류 피부를 적용한 것을 나타내고, 도 12l은 2일 후의 치유 결과를 나타내고, 도 12m은 4일 후의 치유 결과를 나타낸다.
상기 환자 1 내지 3에서, 유색 어류 피부 사용 후 디바이스-관련 염증이나 기타 부작용은 보고되지 않았다. 적용된 치료는 이러한 만성 상처의 치유를 촉진하는 것으로 볼 수 있다. 또한, 적용된 유색 어류 피부는 상처에서 정상적으로 분해되었다. 더욱이, 상처 기저부의 영구 또는 반영구 문신은 5일 이후에는 검출되지 않았다.
추가 예
전술된 바와 같이 Kerecis™ 어류-피부-유래 세포 스캐폴드 제품(예를 들어, 미국 특허 번호 8,613,957에 개시된 바와 같음)을 사용하여 상처를 치유할 때, 본 발명자는 임상의가 부지불식간에 실수하거나 상처 치유 스캐폴드와 감염을 구별하는 데 어려움을 겪는다는 것을 발견하였다. 이는 상처 치유 스캐폴드가 파괴되기 시작하고 주변 조직에 통합되면 상처 치유 스캐폴드와 관련된 색 및/또는 냄새에 적어도 부분적으로 기인할 수 있으며; 때로는 이는 감염된 조직과 유사한 색을 가질 수 있고 (예를 들어, 화농성 감염) 약간의 냄새가 날 수도 있는데, 일부에서는 감염된 조직과 유사한 냄새인 것으로 해석할 수도 있다. 따라서, 본 발명자는 개선된 제품 또는 공지된 제품에 대한 개선으로부터 상당한 이점을 얻을 수 있는 기술 분야의 문제가 있음을 발견하였다.
한 가지 해결책은 어류-피부-유래 세포 스캐폴드를 가색(false-color)하여 병원에서 더 용이하게 식별할 수 있도록 하고/하거나 상처 기저부에 놓일 때 주변 조직으로부터 구별할 수 있도록 하는 것이다. 이를 위해, 하기 기재사항은, 시간이 지나도 안정하게 유지될 수 있는 착색제와 가공/제조 단계 동안 어류 피부 스캐폴드에 혼입될 수 있는 착색제를 확인하는 데 초점을 맞춘 일련의 테스트로부터 얻은 예시적인 데이터를 제공한다.
미국 특허 8,613,957에 개시된 바와 같이 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로 만든 Kerecis™ 어류-피부-유래 세포 스캐폴드 제품의 가공/제조에 사용되는 탈세포화 용액(본원에서는 "데셀(Decell) 용액"으로 칭함)내 다양한 착색제의 안정성을 결정하기 위해 제1 세트의 실험을 수행하였다. EBL M222에 맞춰 데셀 용액을 제조하고, 다음 표에 나열된 6가지 착색제의 안정성을 테스트하였다.
Figure pct00005
데셀 용액은 EBL M222에 따라 제조하였다. 각각의 착색제는 1% w/v의 용액 강도로 제조되었다(예를 들어, 표 1에 나열된 바와 같음). 50mL의 데셀 용액을 각각의 뚜껑으로 고정할 수 있는 7개의 개별 플라스틱 튜브 각각에 분취하였다. 제1 튜브에는 데셀 용액만 포함되어 대조군 역할을 하였다. 제조된 6가지 색상 용액 각각의 0.5mL 분취량을 데셀 용액 50mL가 들어 함유된 해당 튜브에 별도로 첨가하였다. 시간이 지남에 따라 혼합물의 모든 반응 또는 눈에 보이는 가시적 변화를 모니터링하였다.
각각의 착색제가 들어 있는 각 튜브의 용액을 실험 시작 시, 항온배양 30분 후, 및 항온배양 24시간 후 사진으로 모니터링하고 기록하였다.
초기에는 데셀 용액 내에서 다량의 착색제가 상당히 밝은 것으로 밝혀졌다. 최초 20분 내에, 메틸렌 블루를 제외하고 대부분의 착색제가 색이 바래기 시작하였다. 이러한 경향은 계속되었고, 24시간 후에, 착색된 데셀 용액은 메틸렌 블루가 첨가된 데셀 용액을 제외하고는 모두 백색 또는 거의 백색으로 변하였다. 따라서, 메틸렌 블루 색은, 미국 특허 8,613,957에 개시된 바와 같이 자연산 대서양 대구의 최소 가공된 피부로 만든 Kerecis™ 어류-피부-유래 세포 스캐폴드 제품을 제조하는 탈세포화 단계 동안 첨가할 착색제의 바람직한 양태로 간주된다.
다른 양태에서, 도 13에 도시된 바와 같이, 조직-재생 상처 치료제를 사용하여 상처를 치료하는 방법(1300)이 제공된다. 단계 1310에서, 피부 대체물 및 착색제를 포함하는 조직-재생 상처 치료제가 제공되며, 착색제는 치료된 상처 내에서 프로테아제 공격시에 분해되는 생체적합성 착색제이다. 단계 1320에서, 조직-재생 상처 치료제가 상처 기저부에 적용된다. 또한, 단계 1330에서, 착색제의 색 변화를 판정하여 피부 대체물이 상처 내에서 프로테아제 공격에 의해 분해되었는지를 판정한다.
추가의 예시적인 방법에서, 피부 대체물을 포함하는 조직-재생 상처 치료제는 청색으로 착색된 세포외 기질의 형태이며(예를 들어 mg/gV), 이는 상처 기저부에 삽입되고 그 상단부 위에 2차 상처 드레싱이 적용된다. 또한, 추가의 예시적인 방법에서, 상처 검사 시 상처 기저부의 색을 기록한다. 색이 청색이면, 조직-재생 상처 치료가 손상되지 않은 것으로 (올바르게) 간주되며 세포 내성장이 (올바르게 또는 가능성 있게) 발생하는 것으로 결론지어진다. 상처 치료제가 더 이상 청색이 아니면, 허물이 벗겨진 것이므로 세척해내고 상처 기저부에 새로운 재료를 적용해야 한다.
사용되는 착색 재료는 생체적합성이어야 하며 프로테아제 공격시에 기질 자체가 분해되어야 한다. 또한 이는 영구적이지 않을 수도 있으며 치유된 후 상처에 영구적인 색이나 "문신 효과"를 남기지 않을 수 있다.
추가 테스트
탈세포화된 어류 피부에 대해 제1 색 테스트를 수행하였다. 상기 재료가 다양한 염료 화학물질과 어떻게 상응하는지 확인하기 위해 어류 피부 기반 상처 제품에 대해 테스트를 수행하였다. 이러한 목표는 섬유질 콜라겐 재료가 다양한 염색제와 어떻게 반응하는지, 그리고 이것이 습식 또는 건식에서 상이하게 반응하는지를 확인하는 것이었다.
테스트 방식
실험에는 유리 그릇, 핀셋, 및 밀폐형 플라스틱 용기를 사용하였다. 이러한 테스트는, 콜라겐 재료가 다양한 염료 유형과 어떻게 반응하는지, 유계 또는 수계 염료가 단백질과 더 잘 반응하는지, 이것이 세척을 통해 유지되는지, 및 제조시 탈세포화된 염료를 염색하는 것이 가장 좋은 시점에 대한 질문에 답하기 위한 것이었다. 테스트된 상이한 염료/착색제/안료/색 첨가제는 우드 파우더(HUE-3023); 색 첨가제 D&C 그린 #5 파우더 AN0725; 색 첨가제 울트라 마린 블루 H9-03R1; 색 첨가제 리퀴드 FD&C 블루 #1; 색 첨가제 리퀴드 D&C 그린 #5; 색 첨가제 리퀴드 D&C 그린 #6 오일 AM4299; 그린 컨센트레이티드 푸드 컬러링(Green Concentrated Food Coloring); 및 가르니어 내추럴 컬러, 마호가니 브라운을 포함하였다.
동결건조 전 착색
제1 단계는 탈세포화된 어류 피부를 동결건조하기 전에 염색하는 것이다. 이는, 습윤시 재료가 색과 어떻게 반응하는지, 색 제제가 세척 및 동결건조에서 어떻게 반응하는지 확인하기 위해 수행된다. 탈세포화된 어류 피부 상처 제품 제조시 탈세포 단계 후에 테스트를 실행하였다.
탈세포화된 어류 피부 스캐폴드를 염료 화학물질에 60분 동간 저장한 후 흐르는 물에 2시간 동안 세척하였다.
동결건조 후 착색
상기 테스트의 제2 단계는 동결건조 후 재료를 착색하는 것이다. 이는 동결건조 후 색과 스캐폴드의 반응에 차이가 있는지, 및 구조가 염료 화학물질에 더 개방적인지의 여부를 확인하기 위한 것이었다. 이어서 시트를 다시 동결건조한다.
테스트 절차
탈세포화된 어류 피부로부터 1개의 껍질을 취하여 작은 조각으로 자른다. 이들 조각을 각각 착색제에 넣고, 일부는 희석하지 않은 액상 제제에 넣고, 일부는 착색 분말과 물/오일의 혼합물 또는 착색제와 헤어 컬러 현상액의 혼합물에 넣었다. 조각을 2시간 동안 방치한 후, 조각을 철저히 세척하고 검사한 후 사진 촬영하였다. 유망해 보이는 조각은 밀폐된 용기 내의 물에 침지하여 다음날 아침까지 진탕하였다. 이는 색이 결국 물에 용해되는 것을 멈추는지 확인하기 위한 것이었다. 모든 조각을 다시 검사하고 다시 세척하였다. 순수한 물에 침지하고, 5분 후에 모든 용액이 착색되었다. 유망한 조각을 동결건조(-80℃에서 냉동)로 보내고 동결-건조기에서 동결건조하였다.
본 개시내용의 다양한 양태의 보다 양호한 이해는 유사한 참조 문자가 유사한 요소를 지칭하는 첨부 도면과 함께 해석되는 이하 설명으로부터 얻을 수 있다.
본 개시내용은 다양한 수정 및 대안적인 구성이 가능하지만, 특정한 예시적인 양태가 아래에 설명된 도면에 있다. 그러나, 본 개시내용을 개시된 특정 양태로 제한하려는 의도는 없으며, 반면, 이의 의도는 본 개시내용의 요지와 범주 내에 있는 모든 수정, 대안적인 구성, 조합 및 등가물을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
사용된 참고문헌은 단지 편의를 위해 제공되는 것이므로 보호 범주 또는 양태를 정의하지 않는다.
용어가 설명된 의미를 갖기 위해 본 출원에서 명시적으로 정의되지 않는 한, 이러한 용어의 의미를 이의 단순하거나 일반적인 의미를 넘어 명시적으로 또는 간접적으로 제한하려는 의도가 없다는 것이 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "치료(treatment)"는 일반적인 사전 정의에 의해 이해되도록 의도된다. 즉, "치료"라는 용어는 질병이나 부상으로 인해 환자에게 제공되는 의료 행위 및/또는 약물을 광범위하게 포함한다. 당업자가 이해해야 하는 바와 같이, "치료"는 무언가에 특정한 특성을 보존하거나 부여하기 위한 화학적, 물리적 또는 생물학적 제제의 사용을 포함한다. 따라서, "치료"는 제공된 의료 행위(즉, 방법이나 일련의 규정된 행위의 형태)일 수도 있고, 이는 특정한 특성을 보존하거나 부여하기 위해 사용되는 약품을 지칭할 수도 있다.
비제한적 일례로서, 본원에 기재된 탈세포화된 어류 피부의 입자 형태는 "치료제", 즉 상처를 보존 및/또는 안정화하기 위해 사용되거나 상처 부위에 대한 유익한 효과가 개시된 다른 치료를 제공할 수 있는 약제로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 경우에, 치료는, 상처를 안정화 및/또는 보호하기 위한 방법 내에서 개시된 탈세포화된 어류 피부를 입자 형태로 사용하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "탈세포화된", "탈세포화된 어류 피부", "무세포 어류 피부" 등은 임의의 방법에 따라 제조된 어류 피부를 지칭하며, 발명의 명칭이 "상처 관리 및/또는 기타 조직 치유 분야를 위한 스캐폴드 물질"인 미국 특허 제8,613,957호에 개시된 임의의 양태를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "탈세포화된", "탈세포화된 어류 피부", "무세포 어류 피부" 등은 상당량의 세포 및 핵산 내용물이 제거되어 천연 세포외 기질 재료(ECM)의 복합 3차원 사이질 구조를 남긴 탈스케일 어류 피부를 포함한다. 일반적으로, 전술된 탈세포화는 포유류 조직에서 필요하고/하거나 일상적으로 수행되는 것보다 더 온화한 형태의 가공이며, 이는 종종 가혹한 화학적 처리 및/또는 화학물질(예를 들어 항생제)의 저장을 활용한다.
미국 특허 8,613,957에 기재된 탈세포화 방법은 천연 세포외 기질 성분의 3차원 구조를 유지하는 스캐폴드 물질을 생성하며, 이는, 일부 경우에, 상처 치유 공정에 기여하는 줄기 세포 및 다른 세포가 이동하고/하거나 지지되어 상처 치유를 촉진할 수 있게 하는 물리적 매개체를 허용한다. 콜라겐과 같은 세포외 성분의 기본 구조는 Omega3 다중불포화 지방산(PUFA)과 같은 기타 기본 성분 이외에도 탈세포화된 어류 피부 스캐폴드 물질 내에서 유지된다.
태반-기반 상처 치료제와 같이 포유동물의 피부/막으로부터 유래된 기타 스캐폴드 물질도 피부 대체물로 사용될 수 있다.
대서양 대구(가뒤스 모르후아(Gadus morhua)) 및 기타 여러 어종으로부터 사람으로의 질병 전파 위험은 존재하지 않거나 적어도 가능성이 훨씬 낮기 때문에 세포 제거된 탈세포화된 어류 피부를 기반으로 하는 피부 대체물이 바람직할 수 있다. 또한, 탈세포화된 어류 피부에는 알레르기 성분이 함유되어 있지 않아 알레르기 또는 기타 면역 반응의 위험이 크게 감소한다. 질병 전염 및 알레르기 반응의 위험이 감소하기 때문에, 탈세포화된 어류 피부는 세포외 기질의 생물학적 구조와 생리활성 화합물을 유지하는 부드러운 가공을 거친다. 따라서, 탈세포화된 어류 피부는 가공 과정에서 피부 세포가 벗겨지지만 세포외 성분의 천연 3차원 구조를 유지하여, 상처 치유를 촉진하는 천연 스캐폴드를 제공한다. 반면, 포유류 스캐폴드 물질은 3차원 구조가 부족하고 다른 천연 세포외 성분을 상실하였으며 탈세포화된 어류 피부와 동일한 방식 또는 동일한 정도로 상처 치유를 촉진하지는 못한다.
다른 형태의 콜라겐-기반 재료가 생물학적 또는 합성 피부 대체물로 사용될 수 있지만, 재구성된 콜라겐 재료는 바람직하게는, 다른 천연 세포외 성분의 맥락내에서, 이의 본래의 3차원 구조를 유지하지 못하는 가혹한 물리적 및 화학적 처리를 통해 수확되지는 않는다. 위에서 논의한 포유동물-유래 스캐폴드 물질과 유사하게, 재구성된 콜라겐 재료에 의해 제공되는 고유 구조 및/또는 3차원 세포외 기질 환경이 부족하여, 피부 대체물이 상처 치유 촉진에 덜 효과적이게 될 수 있다. 물론, 피부 대체물을 선택할 때 피부 대체물의 생산 비용과 일관성 및 기타 요인들을 고려해야 하며, 이러한 재구성된 콜라겐 재료를 사용하는 것이 어떤 경우나 적용에서는 실제로 바람직할 수 있다.
감염 발생에 관한 추가 고려사항
상처 치료는 예를 들어 전투 상황과 같이 부상 지점이나 그 근처에서 의학적으로 훈련받지 않은 인력이 열악한 환경에서 적용하는 것이 종종 필요하다. 본 발명자는 조직 재생 능력, 박테리아 장벽, 및 상처 치료제, 예를 들어 어류 피부 이식편의 진통 특성과 함께 광범위한 항균 스펙트럼 항균 활성에 대한 중요한 필요성을 밝혀내었다. 본 발명자는 저장 및 운반이 용이하고 최종 또는 임시 치료법으로 작용할 수 있는 상처 치료 제품이, 예를 들어, 전투 또는 긴급 상황에서 부상당한 인원의 대피 필요성을 줄임으로써 특히 도움이 될 것임을 밝혀내었다.
전술된 바와 같이, 감염은 응급 및 전투 상처 관리에 있어서 주요 과제이다. 감염은 전장에서 부상당한 민간인 또는 군인의 이환율 및 사망률을 결정한다. 예를 들어, 감염은 전체 사상자의 3분의 1을 차지하며, 치료 기간이 길어지고, 절단 위험이 증가한다. 부상의 분명한 메커니즘 및 열악한 환경으로 인해, 전투 상처는 오염되기 쉽고 치료가 더욱 어렵게 된다. 감염의 초기 징후는 상처내 세균 불균형이다. 초기 단계의 상처에서 발견되는 일반적인 병원체는 그램-양성균(G+)과 그램-음성균(G-)을 모두 포함한다. 감염이 발생하면, 그램-음성균과 다제내성(multi-drug resistant)(MDR) 유기체의 출현이 관찰된다. 따라서 본 발명자는 군인과 응급요원에게 이득을 주기 위해 감염 위험을 저하시키기 위한 효과적이고 즉각적인 개입이 크게 필요함을 확인하였다.
몇몇 양태에서 청색 항균 어류 피부 이식편일 수 있는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제는 상처 치유에 대한 신규한 시각적 신호를 제공한다. 본 개시내용의 상처 치료제는 상처 치유를 촉진하고 화상, 급성 및 만성 상처에 생물학적 피복을 제공하는 이식편과 같은 초기 상처 치료제의 성능 이점을 유지한다. 그러나, 추가로, 본 개시내용의 상처 치료제에는 메틸렌 블루(MB) 및 젠티안 바이올렛(GV)과 같은 항균 착색제 형태 또는 추가로 첨가된 활성제로서 항균제가 함침되어 있다. 본 개시내용의 상처 치료제는 시간이 지남에 따라 상처 기저부로 통합되어 항균제를 방출하여 감염 발병을 예방한다. 피부 이식편의 청색은 불필요한 재적용을 줄여, 상처 노출을 최소화하고 상처 주위 조직의 영구적인 변색 없이 상처 치유를 촉진한다.
전투 또는 비상 환경에서 사용할 수 있는 전통적인 현장 드레싱은 즉각적인 커버를 제공할 수 있고, 열악한 환경에서 현장 배치가 가능하고, 환자 자신이나 동료가 사용할 수 있으며, 종종 식염수와 함께 사용하여 세정 또는 탈수될 수 있다. 그러나, 전통적인 현장 드레싱은 광범위한 항균 적용 범위를 제공하지 않으며, 전통적인 현장 드레싱은 매일 교체해야 하며, 전통적인 현장 드레싱은 상처 기저부에 통합되지 않고, 상처 치유를 강화하지 않으며, 타인에 의한 환자의 자가 관리를 위한 통합에 대한 시각적 도움을 제공하지 않는다.
전투 또는 비상 환경에서도 사용할 수 있는 항균 은 드레싱은 즉각적인 보호를 제공할 수 있고, 열악한 환경에서 현장 배치가 가능하며, 환자 자신이나 동료가 사용할 수 있으며, 광범위한 항균 적용 범위를 제공할 수 있다. 그러나 항균 은 드레싱은 세정 또는 재수화하기 위해 식염수와 함께 사용할 수 없으며, 1 내지 3일마다 교체해야 하고, 상처 부위에 통합되지 않으며, 상처 치유를 강화하지 않으며, 타인에 의한 자가 관리를 위한 통합에 대한 시각적 도움을 제공하지 않는다.
이에 비해, 본 개시내용의 상처 치료제는 즉각적인 커버를 제공하고, 열악한 환경에서 현장 배치가 가능하고, 환자 자신 또는 동료에 의해 사용 가능하고, 광범위한 항균 커버리지를 제공한다. 또한, 본 개시내용의 상처 치료제는 식염수와 함께 사용하여 세정 또는 재수화할 수 있고, 매우 5 내지 10일(색 시각적 도움 기준)로 교체하면 되며, 본 개시내용의 상처 치료제는 유의미하게 상처 기저부, 상처 치유를 강화하고 타인에 의한 자기 관리 통합에 대한 편리하고 효과적인 시각적 도움을 제공한다.
본 개시내용의 상처 치료는 다음과 같은 이유로 군인 및 의료인의 요구를 고려하고 다루기 때문에 전투 환경 또는 응급 환경에 매우 적합하다.
항균 활성: 메틸렌 블루 MB는 G-박테리아에 대한 강력한 항균 염료이다. 이는 상처의 박테리아 부담을 줄이고 과다과립화를 감소시킨다. GV는 G+ 박테리아에 대한 항균 염료이며 전염증 매개체에 영향을 끼칠 수 있다;
유통 기한: 상처 치료제는 실온에서 3년 이상 안정적이며 충격에 강하다. 장기간의 고온 및 습도에서의 안정성을 검사한다;
포장: 바람직한 양태에서 상처 치료제는 어류 피부의 건조하고 멸균된 시트를 함유하는 진공 밀봉된 군용 호일 파우치에 개별적으로 포장된다. 파우치는 작고 경량이며 파우치 또는 의료용 가방(100㎠ 어류 피부 2g)에 용이하게 들어간다. 포장은 습기와 열악한 환경에 저항한다. 상기 제품은 운반 및 저장이 용이하며 이는 다양한 크기로 제공된다;
사용 용이성: 상처 치료에는 기본적인 의료 용품과 제한된 의학 지식이 필요하다. 색 제제는 사용자가 상처 고름/허물과 상처 기저부에 통합된 어류 피부를 구별하는 데 도움을 주어, 간단한 후속 치료를 가능하게 한다;
비-오염성(non-staining): 상처 치료는 착색 및 파괴 프로파일이 알려진 의료용 색 화합물을 사용한다. 정기적인 국소 사용에서는 얼룩(staining)이 보이지 않는다. 임의의 안료가 흡수되면 파괴 프로파일은 6 내지 12일인 것으로 본 발명자에 의해 밝혀졌다;
제거 가능: 상처 치료제를 상처로부터 제거할 필요가 없다. 어류 피부와 같은 피부 대체물은 본래의 사람 세포를 이의 구조로 끌어들이고, 여기서 세포는 결국 어류 피부와 같은 피부 대체물을 신규 조직으로 전환시킨다. 그러나, 필요한 경우, 어류 피부가 통합되기 시작하면 핀셋으로 들어 올리거나 젖은 거즈로 닦아 내어 제품을 용이하게 제거할 수 있다;
열악한 환경에서의 사용: 상처 치료는 최종 상처 치료 또는 임시 항균 커버로 부상 지점이나 그 부근에 사용할 수 있다. 어류 피부와 같은 피부 대체물은 천천히 통합되므로 드레싱 교체 횟수가 감소한다;
통증 감소: 상처 치료는 상처에 대한 피부 커버를 제공하여 신체 내부 환경을 조성한다. 어류 피부의 경우 오메가3를 포함한 지방산이 풍부한 이식편은, 노출된 신경 말단을 보호하고 염증을 감소시키며 지질 매개체를 통해 통증에 긍정적인 영향을 끼친다.
본 개시내용의 중요한 목적은 FDA 승인 항균 피부 대체물로서 부상 지점 또는 그 부근의 상처 관리를 위한 혁신적인 해법을 국방부 긴급구조 요원에게 제공하는 것이다. 본 개시내용의 상처 치료제는 강력한 항균 활성과 함께 우수한 치유 특성을 제공할 것이다. 상처 치료는 더 작고 덜 심각한 상처에 대한 최종 치료로서 적용될 수 있으며, 더 높은 수준의 치료로 이전되어야 하는 심각한 부상에 대한 임시 항균 커버로 적용될 수 있다. 또한, 색 제제는 의료 서비스 제공자가 통합 피부 대체물과 고름 또는 상처 허물을 구별하는 데 도움이 된다.
본 개시내용의 상처 치료제는 하기 접근법의 조합을 통해 상처 치유를 촉진한다: 1. 상처에 통합되는 세포외 기질로서 작용하여, 숙주 세포가 조직을 치유하고 재생하도록 구조적 지지를 제공한다. 2. MB 및 GV는 곰팡이와 함께 G+ 및 G- 박테리아를 억제하여, 생물막 형성을 방지하고 감염 위험을 줄인다. 3. 드레싱 교체 횟수가 줄어들면 반복적인 드레싱 제거로 인한 오염 및 기계적 외상에 대한 상처 노출이 줄어든다. 4. 색은 의료 교육을 받지 않은 사용자에게 최적의 드레싱 및 항균 관리 방법을 안내한다. 5. 피부 대체물, 예를 들어, 어류 피부(오메가3 및 콜라겐)에 자연적으로 존재하는 생체분자, 또는 첨가된 활성제는 통증, 염증 및 출혈을 감소시킨다.
본 개시내용의 상처 치료제는 감염을 예방하고, 적용 범위를 제공하고, 치유를 촉진함으로써 경미한 상처/화상에 대한 최종적이고 임시 치료를 제공한다.
탈세포화된 동결 건조된 어류 피부 이식편과 같은 피부 대체물의 바람직한 양태는 자연 치유 과정을 개시하고 촉진하는 데 매우 효과적이다. 피부 대체물, 특히 물리적 스캐폴드, 보다 바람직하게는 어류 피부의 물리적 스캐폴드는 세포 침투를 허용하고 생체분자를 제공하여 염증 및 통증을 감소시킨다. 이러한 특성은 시험관내, 생체내 및 임상 연구에서 여러 번 입증되었다. 또한, 어류 피부의 추가의 바람직한 양태에서, 천연 오메가3가 풍부하며, 이는 박테리아 침입, 항바이러스 잠재력, 정균 및 항균 효과에 대한 장벽으로 작용하는 것으로 나타났다.
어류 피부의 바람직한 양태는 박테리아 장벽 특성을 제공한다. 아마도 상처 감염을 줄이는 데 얼룩이 없는(unstained) 어류 피부의 능력에 대한 가장 강력한 증거는 파리의 퀴리 연구소(Curie Institute)에서 실시된 독립적인 21명의 환자 연구일 것이며, 여기서, 어류 피부 치료된 상처의 경우 분할 두께 공여 부위에 대한 감염률이 60%로부터 0%로 감소되었다. 무색의 어류 피부 이식편이라도 최적의 박테리아 성장 조건에서 최대 48 내지 72시간 동안 황색 포도상구균에 대한 박테리아 장벽 역할을 할 수 있다. 감염된 마우스 모델에 대한 생체내 연구에서는 어류 피부가 전투-외상 관련 감염에서 가장 자주 확인되는 MDR 계통 중 하나인 P. mirabilis에 대한 박테리아 장벽 역할을 할 수 있음을 보여주었다.
메틸렌 블루 및 젠티안 바이올렛은 추가적인 항균 특성을 제공한다. 상처 치료의 발전으로 인해 은, 요오드, 폴리헥사메틸렌 비구아나이드(PHMB)와 같은 항균제와 전통적인 상처 드레싱이 조합되었다. 은과 요오드는 항균 활성에 있어서 강력한 효과를 나타내지만, 이들 제제의 확장된 사용은 숙주 세포에 대한 높은 수준의 세포 독성을 초래한다. MB 및 GV는 FDA에 의해 승인되었고 국소 사용될 수 있으며 국소 감염이 있는 만성 상처 관리에 탁월한 효과가 입증되었다.
시험관내 데이터는 본 개시내용의 바람직한 양태의 양태의 프로토타입에 대한 고무적인 결과를 보여주었다. 테스트는 ASTM E2149 및 커비-바우어 저해 구역(Kirby-Bauer Zone of Inhibition) 검정을 기반으로 하였다. 두 분석법 모두 MB 및 GV로 함침된 어류 피부 이식편이 용액 중에서 그리고 한천 플레이트 상에서 대장균(E. coli)이나 포도상구균을 모두 효율적으로 저해함을 나타낸다.
도 14a 및 14b는 (A) 대장균에 대한 ASTM E2149의 결과를 나타내고, 도 14c는 (B) 포도상구균에 대한 커비-바우어 저해 구역 검정 결과를 나타낸다. 도 14a 및 14b는 항균 어류 피부를 대장균 현탁액에 넣고 최대 24시간 동안 진탕한 결과를 보여주며, 항균 어류 피부(디스크 1)(도 14a) 및 본래의 원래 어류 피부(디스크 2)(도 14b) 사이에서 박테리아 감소가 명확하게 관찰되었다. 도 14c에서, (B) 0.1% w/v(섹션 1410), 0.5% w/v(섹션 1420) 및 1% w/v(섹션 1430) 범위의 다양한 농도의 메틸렌 블루 및 젠티안 바이올렛으로 처리된 어류 피부는 포도상구균 아우레우스를 접종한 한천 플레이트에서 명확한 저해-영역을 나타내었고, 본래의 어류 피부에서는 저해 영역이 보이지 않았다.
본 출원인은 어류 피부의 치유 특성을 입증하는 풍부한 과학적 데이터를 보유하고 있다. 본원에는 급성 상처에 대한 2건의 무작위 임상 시험이 포함되며, 여기서, 어류 피부는 포유동물 세포 및 조직-기반 제품(CTP), 예를 들어 (Oasis)17 및 완전한 치유 시간에서의 사람 양막/융모막, 및 어류 피부의 사용으로 환자의 치유 시간이 절반으로 단축되는 임상 기증 현장 연구에 비해 더 효과적인 치유를 제공하는 것으로 나타났다. 예시적이고 바람직한 양태로서의 어류 피부에 대해 압도적으로 긍정적인 결과를 가져온 다수의 독립적인 사례 시리즈 간행물이 존재한다.
조직-재생 상처 치료제의 제조, 특히 어류 피부-기반 조직-재생 상처 치료제의 제조 가능성은 매우 높다. 항균 색을 피부 대체물에 함침시키는 추가 단계는 새로운 장비의 최소한의 첨가를 요구한다. MB 및 GV는 제약 품질 등급으로 용이하게 이용 가능하다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제의 양태는, 당뇨병성 족부궤양, 동맥 궤양, 욕창, 정맥성 하지 궤양 및 외상성 궤양을 포함하는 상처 관리를 위한 임시 항균 스캐폴드로 지칭될 수 있는 것을 사용하는 것이 효과적이다. 이러한 상처 유형이 조합되어 미국에서 하지 절단의 54%가 발생하는 것으로 생각되며, 이는 돌이킬 수 없게 쇠약해지는 상태이다. 혈관 질환으로 인해 절단 수술을 받은 사람 중 거의 절반이 5년 이내에 사망한다. 이는 유방암, 결장암, 및 전립선암의 5년 사망률보다 높다.
만성 궤양 치료를 위한 미국의 표준 치료는 다음과 같다: 확립된 만성 상처에 대한 일반적인 치료 또는 표준 치료는 모든 상처 유형 관리에 적용되는 다음과 같은 공통 원칙을 포함한다; 변연절제술(통상 날카로운 변연절제술)을 통한 괴사 조직 제거; 삼출물을 조절하기 위해 적절한 상처 드레싱을 선택함으로 인한 수분 균형 유지; 상처 감염의 예방이나 치료를 위한 조치; 상처 부위 허혈의 교정; 정맥성 하지 궤양의 경우, 일부 형태의 압박의 적용; 당뇨병성 족부궤양의 경우, 일부 형태의 오프로딩(offloading)의 적용.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제의 양태는, SOC에 비해 임시 스캐폴딩을 제공하고 드레싱 내 박테리아 성장에 저항함으로써 만성 상처 치료에 보다 효과적이 됨으로써, 피부 대체물에 대해 확립된 SOC에 비해 보다 효과적인 만성 상처 치료를 제공한다. 본 출원의 목적을 위해, 표준 진료는 보건 의료 연구 품질원(Agency for Healthcare Research and Quality)(AHRQ) 정의와 동일한 방식으로 정의될 것으로 예상된다. 무작위 임상 시험에서 입증된 디바이스 탈세포화된 어류 피부 상처 제품은 표준 치료 - 콜라겐 드레싱에 비해 훨씬 더 빠른 치유를 보여주었다. 이러한 디바이스는 AHRQ에 의해 정의된 현재의 표준 치료보다 효과적인 치료를 제공한다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제의 양태는, SOC와 비교하여 동일한 개선을 달성하는 한편 박테리아 성장에 대한 저항성을 제공하고 임시 스캐폴드로서 정의된 특성을 갖는다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제의 바람직한 양태는 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하며 물론 다른 피부 대체물은, 어류 피부 제품, 또는 Kerecis™에 의해 제공되는 어류 피부 기반 상처 치료제와는 상이하게 사용될 수 있다.
확대된 비교를 위해, 본원의 디바이스는 새로운 치료법에 비해 더 효과적인 치료법을 제공한다. 이러한 적용에 있어서, 헬스케어 공통진료 코딩 시스템(Healthcare Common Procedure Coding System)(HCPCS)에 따라 피부 대체물로서 Q 코드가 부여된 새로운 치료법이 포함된다.
전술된 바와 같이, 본 개시내용에 따른 피부 대체물의 예로서 사용될 수 있는 피부 대체물 군은 크고 다양하다. 2020년 2월 2일에 공개되고 명칭이 "만성 상처 치료를 위한 피부 대체물"인 AHRQ 기술 평가 프로그램(프로젝트 ID WNDT0818)은 표 2의 9 내지 13쪽에 76개의 상용 제품을 식별하였으며 내부적으로 비교한 연구는 거의 없다. 이들 나열된 피부 대체물 각각은 본 개시내용에 따른 피부 대체물의 양태일 수 있다.
보다 효과적인 치료법을 제시한다는 주장에서는, 치료 결과, 항균 특성 및 임시 스캐폴딩 특성, 및 활용에 끼치는 이의 영향의 비교에 중점을 두고 있다.
생분해성(biodegradable) 스캐폴드에 대한 항균 색의 조합은, 최소한, 각각의 기본 기능을 방해하지 않아야 하며 잠재적으로 상승적인 추가 효과를 가질 수 있어야 한다.
임시 스캐폴딩은, 세포 내성장, 혈관신생 및 세포외 기질의 재생을 지원함으로써 조직 재생을 돕는 조직 스캐폴드로 이해될 수 있다. 현재의 임시 스캐폴드는 박테리아 성장을 예방하지 못한다. 실제로, 어떤 경우에는, 콜라겐이 박테리아에 대한 영양분으로서 역할을 할 수 있다. 현재의 임시 스캐폴드 제품은 상처 치료에 사용하도록 지정되지 않았다.
항균 제품은 디바이스의 박테리아 군집화를 방지하지만 반드시 스캐폴드에 도움이 되는 것은 아니다 (은-기반 제품의 경우 이는 세포독성 효과로 인해 실제로 해로울 수 있다).
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는 "디바이스 식별(device identification)"로 지칭될 수 있는 것을 제공한다. 흡수성 드레싱을 상처에 적용하면, 활성이지만 부분적으로 흡수된 디바이스인 것 또는 제거해야 하는 상처 허물인 것을 식별하기가 어려워질 수 있다.
조합된 스캐폴드 및 항균성 색은 상승적인 추가 이점을 제공한다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는, 임시 스캐폴딩, 및 흡수성 상처 드레싱의 디바이스 식별을 제공하는 본 발명자에게 알려진 최초의 상처 관리 제품이다. 항균 보호와 조합된 것은, 박테리아가 염증을 일으키거나 제품내에서 성장하여 파괴가 가속화될 위험을 제한한다. 또한, 디바이스의 용이한 식별은 보다 정확한 드레싱 교체를 가능하게 한다.
임시 스캐폴딩은 다른 피부 대체물과 비교될 수 있다. 임시 스캐폴딩은 세포 내성장, 혈관신생, 및 세포외 기질의 재생을 지원한다. 조직 공학 분야가 계속 발전함에 따라, 이상적인 피부 이식편에 대한 기준은 세포 통합과 조직 성장을 지원하는 재료 방향으로 이동하였다. 이러한 기준은 스캐폴드가 다음 중 하나 이상, 바람직하게는 이들 모두를 충족해야 함을 포함한다: 세포 내성장의 허용과 촉진; 세포의 균일한 공간 분포의 허용; 세포외 기질의 재생의 지원; 혈관신생의 지원; 이물형 반응을 유발하지 않음; 상처에 대한 신속한 통합; 기계적으로 강하고 안정적임.
본 발명자는 본 개시내용에 기재된 바와 같은 어류 피부 이식 기술이 임시 스캐폴딩 기능을 제공할 수 있음을 보여주었다. 또한, 상기 증거는, 세포 내성장, 혈관신생, 및 세포외 기질의 재생에 대한 스캐폴딩 결과가 흡수성 콜라겐 디바이스, 예를 들어 PriMatrix와 같은 다른 알려진 디바이스보다 효과적임을 보여준다.
이들 결과에 근거하여, 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는, 임시 스캐폴드 역할을 함으로써 표준 치료보다 더 효과적인 치료를 제공한는 증거가 있다.
본래의 어류 피부 상에 항균제를 첨가하면 상기 디바이스에 항균 보호가 제공된다. 또한, 본 발명자에 의해, 적절한 색 제제의 첨가가 어류 피부의 근본적인 스캐폴딩 효과를 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다. MB 및 GV는 사람에 대한 독성을 최소화하면서 임상 환경에서 미생물을 줄이는 데 사용될 수 있는 유기 염료이다. MB 및 GV는 상처의 국소적인 박테리아 부담을 신속하게 관리하기 위해 국소 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서 MB 및 GV의 농도는 0.00025g/g(0.01%) 이하로 제어되고, 하이드로페라 블루 레디(Hydrofera Blue Ready)에서의 농도(각각의 색의 0.0035g/g 이하)보다 낮으며 상용화된 국소 제제 1% MB 및 GV의 농도하에서는 훨씬 낮다. 물론, 하이드로페라 블루 레디는 착색제의 다른 양태로 사용될 수도 있다. GV 및 MB는 동반 제품의 작용을 저해하지 않고 효소성 괴사 제거제, 성장 인자 및 하이드로겔과 함께 사용할 수 있다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히 어류 피부를 포함하는 조직-재생 상처 치료제에서 사용되는 MB 및 GV는 어류 피부의 스캐폴딩 효과를 손상시키지 않는 것으로 본 발명자에 의해 밝혀졌다. 어류 피부에 MB 및 GV를 첨가하는 것은 멸균 전에 제조 공정의 최종 단계에서 수행될 수 있다. 상기 단계는 본래 어류 피부의 디자인, 재료, 기능, 포장 및 살균을 변경하지 않는다.
전임상 돼지 모델의 깊은 부분 두께(deep partial thickness)(DPT) 화상 상처를 치료할 때 어류 피부 이식편을 소 태아 진피(Primatrix)와 비교하기 위한 최근 연구(Stone II, International Journal of Molecular Sciences, 2021)가 수행되었다. 이러한 연구의 목표는 어류 피부 이식이 DPT 화상 상처에 얼마나 잘 작용하는지, 이것이 어떻게 통합되는지, 및 이것이 장기적인 치유를 향상시키는지를 판정하는 것이었다. 연구 조건에 따르면, 어류 피부 이식편은 소 태아 진피보다 상처 기저부에 더 빨리 통합되는 것으로 밝혀졌다. 어류 피부 이식은 10일차부터 시작하여 28일차까지 더 신속한 재상피화(re-epithelialization)를 초래하였고, 특히 14일차에는, 어류 피부 이식편과 소 태아 진피간의 차이가 상당하였다. 어류 피부 이식으로 인해 혈류가 증가하고 신규 형성된 혈관이 증가하였다. 어류 피부 이식은 21일 후 표피의 완전한 형성을 촉진한다. 또한, 어류 피부 이식은 염증 반응을 덜 촉발하였다 (이물질 감소, 염증 세포 감소).
본 연구의 발견은 어류 피부 이식편이 바람직한 양태라는 증거를 제공하지만, 소 태아 진피(Primatrix) 제품은 물론 본 발명에 따른 효과적인 피부 대체물로 여전히 사용될 수 있으며, 일부 조건 또는 고려사항하에서, 이는 본 발명에서 예상되는 피부 대체물의 바람직한 양태일 수 있다.
또한, 이러한 연구는 항균제인 MB 및 GV가 포함되지 않은 무색 어류 피부 제품에 대해 진행되었음에도, 생성된 상처의 정도는 표피층과 진피층 모두를 손상시키는 깊은 부분층 화상 상처로 분류되었으며 이는 종종 치료가 복잡하고 시간이 오래 걸린다. 본 연구에서 어류 피부의 역할은 임시 커버 역할 뿐만 아니라 장기적인 치유를 위한 임시 스캐폴드 역할도 하는 것이다. 본 연구는 본래의 어류 피부의 스캐폴딩 효과에 대한 다수의 중요한 통찰을 제공한다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는, 현재 알려진 다른 피부 대체물과 비교하여 본원의 디바이스의 박테리아 군집화의 방지를 제공한다.
"박테리아 장벽(bacterial barrier)"이라는 문구는 광범위한 스펙트럼의 항균제가, 감염을 줄이고 임시 스캐폴드가 의도한 대로 기능하도록 보장하는 데 도움이 될 수 있기 때문에, 드레싱의 박테리아 침투에 대한 장벽을 제공함을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
넓은 의미에서 피부 대체물은 신체 자체 세포에 의해 침투되거 이후에 통합, 흡수 또는 파괴되는 생분해성 조직으로 간주될 수 있다. 대부분의 피부 대체물은 박테리아 침입을 방어하는 선천적 능력이 낮고 상처에 박테리아가 존재하는 경우 군집화될 수 있다. 피부 대체물의 박테리아 군집화로 인해 피부 대체물이 보다 빠르게 파괴되고 숙주 세포의 내부성장 가능성이 낮아질 수 있다.
76개의 피부 대체물 중 일부 항균 효과를 제공하는 2개의 다른 피부 대체물, 즉, PriMatrix AG 및 PuraplyAM이 열거되어 있다. 그러나, 이들 중 어느 것도, 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제에 사용되는 항균제와 동일한 항균 스펙트럼 및 항진균 활성을 갖는 것으로 밝혀지지 않았다. 물론, 전술된 바와 같이, PriMatrix AG 및 PuraplyAM은 여전히 본 발명에서 피부 대체물의 양태로 간주될 수 있으며, 실제로 특정 상황 및 조건하에 바람직한 양태일 수 있다.
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물론, 전술된 바와 같이, PriMatrix AG 및 PuraplyAM은 여전히 본 개시내용에서 피부 대체물의 양태로 간주될 수 있으며, 실제로, 특정 상황 및 조건하에 바람직한 양태일 수 있다. 본원의 디바이스의 항균 적용은 MB 및 GV 농도가 동등한 드레싱인 하이드로페라 블루(Hydrofera Blue)와 유사하다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는 최적의 활용 주기를 촉진하는 "디바이스 식별"로 지칭되는 것이 있을 수 있다. "디바이스 식별"은 상처 기저부에 통합될 때 제품 식별을 용이하게 하는 착색제로 이해될 수 있다.
피부 대체물은 적용 전 가장 투명하거나 오프화이트색이며, 상처 기저부에 통합되면 투명해지거나 백색이 되거나 캐러멜화된다. 이러한 외관은, 어떤 경우에는, 특히 경험이 부족한 사용자의 경우, 상처 허물, 삼출물 또는 생물막로부터의 구별이 어려울 수 있다. 이로 인해 피부 대체물이 완전히 통합되어 교체가 필요한지, 아니면 여전히 부분적으로 활성화되어 상처에 더 오래 유지될 수 있는지 판단하기가 어렵다. 상처에 여전히 활성 피부 대체물이 있는지 판정할 수 없으면 다음 3가지 결과가 발생할 수 있다: (1) 상처의 허물이 콜라겐 드레싱으로 오인되어, 공급자가 상처로부터 허물을 제거하지 않아 상처 치유가 느려지고 감염 위험 증가가 발생한다; (2) 상처에서 활성 제품이 허물로 오인되어, 공급자가 디바이스를 조기에 제거한다; (3) 신선한 숙주 세포 내성장이 있는 활성 임시 스캐폴드 조직을 제거한다.
상처에서 허물로 오인된 활성 제품에 의해, 불필요한 개입 및 환자 관련 비용을 사용하여 디바이스를 조기에 재적용하게 된다.
본원에 개시된 신규 디바이스는, 허물 또는 기타 조직으로부터 안전하고 용이하게 구별되도록 하는 생체적합성 착색제를 사용하여 착색된다. 이는 색을 이식편에 결합시키는 개시된 색 제제를 사용하여 수행된다.
이러한 디바이스는 치유되지 않은 만성 상처의 치료 및 절단 가능성의 예방에 있어서 임상적 개선을 가져올 가능성이 있는 획기적인 기술 및 신규 적용을 나타낸다. 본 디바이스는 3D 구조를 제공하여, 사람 세포의 침투 및 증식, 혈관신생을 지원하는 동시에 스캐폴드 상에서 박테리아 군집화를 저해한다.
본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는, 적어도, 하기 특성들 중 하나 이상, 바람직하게는 이들 모두를 갖는다: 세포 내성장 및 혈관신생을 촉진하는 안정하고 흡수 가능한 스캐폴드의 제공; 상처에 종종 존재하는 미생물을 처리하기 위힌 광범위한 스펙트럼 범위의 제공; 은-함유 드레싱에 비해 숙주 세포에 독성을 유발하지 않거나 세포 내성장을 저해하지 않음; 항균 드레싱에 비해 박테리아 돌연변이를 일으키지 않아 항균제 내성이 발생하지 않음.
또한, 드레싱 변화를 안내하는 중요한 시각적 지표를 제공할 수 있는 착색제의 고갈로 인해 드레싱에서 색 변화가 발생할 수 있다.
본 출원인은 사전 승인된 디바이스 Omega3 Wound에 대한 여러 개의 시험관내 및 생체내 임시 스캐폴딩 데이터를 갖고 있다. 본 발명자의 증거는 스캐폴드에 착색제(항균제)를 첨가하는 것이 기본 기능을 방해하지 않고 상승적인 부가 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
세포 내성장에 대한 시험관내 연구(Magnusson, Military Medicine, 2017)에서, 섬유아세포의 침투가 적은 hHACM 재료에 비해, 12일 후에, 섬유아세포가 어류 피부 이식편에 침투하여 리모델링하는 것으로 밝혀졌다. 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는, 스캐폴드로의 세포 침투를 유도하는 본래 어류 피부와 동일한 다공성 구조 및 기공 크기를 유지할 것이다. 세포에 대한 MB 및 GV의 독성을 다루기 위해, 본 발명자는 예비 세포독성 테스트를 수행하여, MB 및 GV가 어떠한 세포독성 문제도 일으키지 않음을 밝혀내었다. 또한, 레퍼런스 디바이스인 하이드로페라 블루 레디는 더 높은 농도의 MB 및 GV를 함유하지만 어떠한 세포독성 문제도 일으키지 않았기 때문에, 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)에 의해 또는 추가로 첨가된 활성제에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제는 세포 내성장에 불리한 효과를 유발하지 않아야 한다.
예비 벤치 연구(bench study)는, 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제, 특히 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들) (MB/GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 조직-재생 상처 치료제의 항균력에 있어서의 효능을 입증하였다. 상기 테스트는 상처 감염에서 가장 흔히 발견되는 3가지 미생물인 대장균(E. coli), 황색 포도상구균(S. aureus) 및 녹농균(P. aeruginosa)을 사용하여 수행되었다. 테스트 방법은 한천 디스크-확산과 같은 간단하고 기본적인 검정으로부터 AATCC100 또는 ASTM E2149와 같은 보다 까다로운 산업 표준화 테스트까지 다양하였다. 한천 디스크-확산의 결과는, Omega3 Wound 및 Primatrix AG와 비교하여, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB /GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제는 황색 포도상구균에 대해 뚜렷한 저해 구역의 형성을 나타내었다. 저해 구역 직경은, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB /GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제에 의해 17.25±0.5mm이었으며, Primatrix AG에 의해 11.67±0.58이었고, 어류 피부에는 아무런 효과가 없었기 때문에 샘플 직경(6mm)과 동일한 직경을 갖는 저해 구역을 나타내었다. AATCC100-평가 결과는, 황색 포도상구균 및 녹농균 둘 다에 의한, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB /GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제의 높은 효능을 입증하였다. 녹농균의 감소율은 대략 98%로 추정되었다. 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB /GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제는 황색 포도상구균 및 녹농균 둘 다에 대해 강력한 항균 효능을 보여주었다. ASTM E2149 테스트 결과는 크로마 안티바이오틱(Kroma Antibiotic)에 의한 대장균 현탁액에서의 성장의 저하를 입증하였다. 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB /GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제를 사용하여 한천 플레이트 상에 형성된 콜로니는 37개였으며, 무색 어류 피부 및 대장균 현탁액 자체에 445개 및 491개의 콜로니가 있다. 성장 감소율은, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB /GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제에 비해 대략 92 내지 93%이었다.
예비 테스트로부터 본 발명자의 고무적인 결과를 고려하여, 어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB /GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 조직-재생 상처 치료제는 다양한 상처 유형에 보다 효과적인 항균 치료를 제공할 것이다.
콜라겐 스캐폴드는 상처 치유 과정을 향상시키기 위해 만성 상처 관리에 널리 사용된다. 생체활성 상처 드레싱은, 생체적합성 및 EMC-템플릿과 같은 것이 세포 내성장 및 조직-재생을 향상시키기 때문에 다른 유형의 드레싱에 비해 이점이 있다.
본 발명자는 스캐폴드 내의 미생물 군집화에 저항하기 위한 효과적인 장벽으로서 상처 관리를 위한 2가지 항균 착색제와 조합된 어류 피부 임시 스캐폴드를 사용하는 바람직한 양태를 포함하는 다양한 양태를 밝혀내어 개시하였다. 임시 스캐폴드는, 드레싱의 미생물 군집화를 저해하면서 혈관신생 및 세포 내성장을 지원한다.
어류 피부를 피부 대체물로서 포함하고 착색제(들)(MB/GV)에 의해 제공되는 항균 특성을 갖는 본 개시내용의 바람직한 양태의 조직-재생 상처 치료제는 무세포 재흡수성 어류 진피 상처 기질이다. 상처 치료제는, 혈관신생 및 세포 성장을 지원하는 한편 스캐폴드 상에서 박테리아의 군집화를 저해하는 임시 스캐폴드 역할을 한다. 상기 디바이스는 스캐폴드 상에서 메틸렌 블루와 젠티안 바이올렛(크리스탈 바이올렛)을 사용하여 광범위한 항균 보호를 제공하는 2가지 항균 제제를 함유한다. 본원의 디바이스는 멸균 상태로 제공되거나 최대 20cm×30cm 크기의 메쉬 시트로 제공된다. 광범위한 스펙트럼의 항균제는 감염을 줄이고 임시 스캐폴드가 의도한 대로 기능하도록 보장하기 때문에 드레싱의 박테리아 침투에 대한 장벽을 제공한다.
사용을 위한 표시
바람직한 양태의 조직-재생 상처 치료제는 당뇨병성 족부궤양, 동맥 궤양, 욕창, 정맥성 하지 궤양, 및 외상성 상처를 포함하는 상처의 관리를 위한 임시 항균성 스캐폴드로서 의도된다.
디바이스의 조성
바람직한 양태의 조직-재생 상처 치료제는 상처 관리용으로 표시된 어류 피부 의료 디바이스이다. 이하 디바이스로도 언급되는 본원의 스캐폴드 물질은 표준화된 제어된 제조 공정을 통해 야생 북대서양 대구(가뒤스 모르후아(Gadus morhua))의 피부로부터 얻어지며 다음 크기의 필-파우치 최종 멸균 포장으로 공급된다. 16mm 디스크; 2×2cm; 2×4cm; 5×5cm; 10×10cm; 20×30cm. 상기 디바이스는 위에서 설명하고 도시한 바와 같이 부분화된 형태(particalized form)로 제공될 수도 있다.
디바이스는 스캐폴드에 광범위한 항균 보호 기능을 제공하는 메틸렌 블루 및 젠티안 바이올렛(크리스탈 바이올렛)과 같은 2가지 항균제를 포함할 수 있다. MB 및 GV의 농도는 0.00025g/g(0.01%) 이하로 제어되지만 최대 0.1% 이하까지 포함될 수 있다.
본원의 디바이스는 바람직하게는 시간이 지남에 따라 주변 조직에 완전히 통합되어 신규 숙주 조직 침착에 상응하는 것이 바람직하다. 본원의 디바이스의 바람직한 물리적 특성은 세포 내성장을 허용한다. 본원의 디바이스는 바람직하게는 생체적합성이고, 비-가교결합되고 생체흡수성이고, 강하고, 유연하다. 이의 인장 강도는 봉합사 또는 스테이플에 의한 고정을 지원한다.
본원의 디바이스의 작용 메커니즘은 3가지 주요 영역으로 분류될 수 있다: 1. 콜라겐 드레싱: 탈세포화된 어류 피부 상처 산물(K132343)과 실질적으로 동일하며, 다음과 같은 차별화된 특성이 있다: 1.1. 이 제품에는 다음과 같은 항균 착색제가 함침되어 있다: 2a: "박테리아 장벽": 광범위한 스펙트럼의 항균제는 감염을 줄이고 임시 스캐폴드가 의도한 대로 기능하도록 보장하기 때문에 드레싱의 박테리아 침투에 대한 장벽을 제공한다. 2b: "디바이스 식별": 착색제는 상처 기저부에 통합될 때 제품 식별을 용이하게 한다. 2. "임시 스캐폴딩": 세포 내성장, 혈관신생, 및 세포외 기질의 재생을 지원하는 임시 스캐폴딩. 2.1 콜라겐 드레싱. 본원의 디바이스는 동일한 기본 작용 메커니즘을 갖는 콜라겐 드레싱으로서 탈세포화된 어류 피부 상처 제품과 실질적으로 동일하게 기능한다.
콜라겐 스캐폴드의 주요 목적은 건강한 조직의 세포외 기질(EMC)을 모방하는 탬플릿 역할을 하는 것이다. 상처 치유 과정을 돕기 위해 다수의 다양한 조직 유형의 재구성을 돕기 위해 세포를 지원하는 것을 모방한다. EMC의 각 성분은 상처 치유의 각각의 단계에 필수적이다. ECM의 성분은 세포 증식과 분화를 돕고, 세포 이동을 안내하고, 세포 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 외인성 EMC는 상처 부위의 건강한 조직이 분해되어 천연 콜라겐으로 대체되면서 자연적으로 리모델링된다. 탈세포화된 어류 피부 상처 제품은 만성 상처에서 기능성 EMC를 다시 확립한다. 콜라겐 드레싱은 또한 (1) 촉촉한 상처 환경, (2) 체액 관리, 및 (3) 체액의 증산 제어를 제공한다.
탈세포화된 어류 피부 상처 제품은 510k 시판전 통지 절차를 통해 제거된 다수의 돼지 콜라겐 기질과 실질적으로 동등한 콜라겐 드레싱으로서 사용될 수 있다. 상처 관리를 위한 콜라겐 드레싱으로서의 상기 디바이스의 효능은 포유류-유래 콜라겐 드레싱인 Oasis 상처 기질과 비교한 비-열등성 연구를 통해 입증되었다. 이러한 연구에서는 어류 콜라겐 드레싱이 돼지 유래 콜라겐 드레싱보다 열등하지 않고, 부작용이 확인되지 않았으며, 28주의 기간 동안 상처 치유 개선이 밝혀졌다는 결론을 내렸다.
탈세포화된 어류 피부 상처 제품과 본원의 디바이스 사이의 유일한 기술적 차이점은 착색제의 첨가이다. 착색제 중 하나가 콜라겐 스캐폴드를 방해하거나 가교결합한다는 증거나 문헌 증거는 없다. 따라서, 본 발명가의 증거에 근거하여, 어류 피부-기반 피부 대체물이든 다른 피부 대체물이든 본원의 디바이스가 세포 내성장 및 혈관신생을 돕기 위해 세포외 기질을 모방하는 스캐폴드 역할을 할 것이라는 점을 시사하는 충분한 증거가 있다.
바람직한 양태의 색소는 상당한 항균 효과를 갖는다. 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV) 혼합물 대략 0.01%로 이루어진 착색제를 사용하여, 2개 항균제는 그램-음성균과 그램-양성균 둘 다에 대해 광범위한 항균 보호를 제공한다. 박테리아와 접촉하는 경우, 본원의 디바이스의 MB 및 GV는 디바이스 내에서 박테리아 성장을 지속 불가능하게 만들어 박테리아를 제거한다.
메틸렌 블루는 페노티아진 계열의 일부이며 항말라리아 약물에 대한 내성이 발생했을 때 최초로 FDA-승인된 말라리아 치료제 중 하나이다. MB는 시험관내에서 대장균(E. coli), 황색 포도상구균(S. aureus), 녹농균(P. aeruginosa) 및 칸디다 알비칸스(C. albicans)를 포함한 광범위한 유기체로 인한 박테리아 불활성화를 보여주었다.
MB와 GV의 안료는 상처의 디바이스와 허물을 구별하는 지표로 작용한다. 피부 대체물은 흡수성 드레싱이므로, 드레싱이 완전히 통합되어 제2 적용이 필요할 때, 색을 통해 의사에게 알린다. 또한, 색은, 의사가 상처에 대한 변연절제술을 수행할 때 실수로 드레싱을 제거하는 것을 줄이는 데 도움이 된다. 무색 콜라겐 드레싱은 부분적으로 통합되면 허물과 구별하기 어려울 수 있다.
예를 들어, 도 15a는 박테리아로 가득 찬 상처에서 허물로 변한 상처의 이식편을 보여준다. 이에 비해, 도 15b는 대략 50% 통합되어 상처에 남아 있어야 하는 상처 내 어류 피부 이식편을 보여준다. 그러나, 도 15a의 상처 내부의 허물을 도 15b의 상처 내 이식편과 비교하여 보면 알 수 있듯이, 내성장을 경험한 이식편과 허물이 된 이식편을 정확하고 용이하게 구별하는 것은 어렵다. 이에 비해, 도 15c는 MB/GV의 착색제로 착색된 피부 대체물, 이 경우에는 어류 피부 이식편을 보여준다. 도 15c의 이식편이 통합되고 내생성장이 일어나고 있다는 것과 도 15c의 이식편이 일주일 정도 남아 있고 제거되지 않아야 한다는 것이 분명하다.
어류 피부 상단 위에 마우스 배아 섬유아세포를 첨가한 시험관내 연구는, 피부 스캐폴드가 매우 다공성이고 세포가 스캐폴드로 이동하여 증식할 수 있었음을 보여주었다. 동물 연구에서, 돼지 모델에서 발생한 화상 상처 상에 어류 피부를 적용하였다. 어류 피부 이식편은 상처 치유 속도를 높이고 어류 피부 아래의 혈류가 향상되었으며 신규 형성된 혈관이 증가한 것으로 나타났다. 동일한 돼지 연구에서, 어류 피부 이식편은 21일 후 더 빠른 재상피화 및 적은 염증 반응에 의해 표피의 완전한 형성을 촉진하였다.
환자의 상처에 적용될 때, 본원의 디바이스의 양태는 상처로 급속하게 통합되어, 세포 이동 및 증식을 위한 임시 스캐폴드를 제공하는 한편 MB 및 GV 분자는 기질 상에서 미생물 군집화를 저해하고 제거한다. 풍부한 진피 콜라겐 섬유는 더 빠른 상처 치유에 있어서 중요한 세포 내성장, 혈관신생, 및 세포외 기질의 재생을 지원한다.
착색된 피부 대체물, 예를 들어 어류 피부 이식편은 결국 신체에 의해 파괴된다. 일부 염증 성분을 갖는 1차 섬유아세포의 세포 내성장은, 결국, 어류 피부 이식과 같은 본래의 피부 대체물 및 색이 완전히 리모델링되고 파괴된다.
효소 공정은, 주로, 콜라겐을 더 작고 더 쉬운 공정 입자로 가수분해하고 착색제를 감소시키는 것이다.
착색된 피부 대체물, 예를 들어 어류 피부 이식편은 다음과 같은 특성을 가질 수 있다: 최대 7×20cm, 또는 심지어 20×40cm까지 고체 또는 메쉬형일 수 있으며 시트형이거나 입자화될 수 있다.
상처 치료제의 제조의 추가 예
조직-재생 상처 치료제의 양태를 제조하기 위한 방법 또는 절차의 추가의 예에서는 다음 절차를 따랐다.
도착 전에 10개의 피부가 1개 팩에 평냉 냉동되어 있었다(flat frozen).
MB&GV 0.01% 및 0.005% 희석액을 포함하는 착색 용매를 혼합하여 제조하였다.
깨끗한 물을 공급하기 위해, 세균 갯수를 모니터링한 싱크(sink)를 사용하고 이를 비등시켜 사용하였다.
먼저 1% 원액을 생성하였다.
GV: 650mg 의약품 등급 (USP), SA-1290002, LOT G1K417, SP1098511 (Distica)
MB: 현미경 검사용으로 수화된 메틸렌 블루, ≥97%.0%, Sigma-Aldrich 66720-100g, LOT #BCBZ4929
0.4g MB + 0.4g GV를 끓인 플라스크 내 깨끗한(clean)(아직 따뜻한) 물 40ml에 첨가하였다. GV 250mg이 남았다.
2L 병 2개에 깨끗한/끓인 물 2L(중량 기준)를 채웠다. 병 1개로부터, 깨끗한 피펫으로 물 10ml를 제거하고, 다른 병으로부터는 물 20ml를 제거하였다. 이러한 체적은 원액으로 대체되어. 각각 0.005% 및 0.01% MB&GV 용액을 생성하였다. 최종 용액이 제조되면, 병 안의 물은 만졌을 때 매우 뜨거웠으며 이는 염색 결과에 영향을 끼칠 수 있다.
2개 화합물은 모든 표면을 광범위하게 오염시켰으며, 이는 물과 에탄올을 사용하여 모든 표면을 강력하게 청소해야 함을 의미한다.
이어서 어류 피부를 냉동고로부터 꺼내어 얼음 위에 놓고 착색 용액과 함께 운반하였다. 이들은 모두 동결 건조기 옆 고위험 영역 챔버로 옮겨졌다. 어류 피부는 고위험 챔버 수도꼭지로부터 흐르는 수돗물하에 해동되었다. 부드럽고 유연해지면 상기 피부는 상당히 크고 길기 때문에 2개의 더 짧은 조각으로 절단한다. 염색(staining)을 위해 어류 피부 5개(반쪽 10개)를 2개의 알루미늄 트레이에 넣었다.
약 700ml의 Kroma 용액을 각각 0.01% 및 0.005%로 표기된 각각의 트레이에 넣었다. 이어서, 2개 트레이를 플라스틱 백에 넣고, 유출 위험을 줄이기 위해 접어서, 30rpm으로 설정된 진탕기에 2시간 동안 두었다.
약 20 내지 30분 후, 균일한 염색을 위해 피부를 멸균 펜치(plier)로 이리저리 이동시켰다. 약 20분 후, 어류 피부가 얼룩(stain)을 흡수함에 따라 염색 용액(은 밀도가 감소하고 더 투명해지는 것이 분명하였다. 이를 수정하기 위해 약 300ml의 염색 용액을 각 트레이에 추가하였으며, 이는 최종 염색 체적은 약 1000ml임의 의미한다.
추후 가능한 농도 정량화를 위해, 본래의 착색 용액 및 사용한 염색 용액의 잔류물을 50ml 튜브에 저장한다. 이를, 동결 건조 후 어류 피부 크기와 무게의 측정과 함께 사용하면, 어류 피부에 색이 흡수되는 정도를 대략적으로 정량화할 수 있다.
동결 건조기는 작동 준비에 약 45분이 소요되므로 18:00 직후에 가동되었다.
동결 건조기는 컴퓨터 오류로 인해 시동에 어려움이 있었다. 따라서, 염색에는 약 3시간이 걸렸다 (3시간 후에 진탕기가 기본 진탕 속도로 작동되므로 이 속도가 더 빠르다는 것에 유념한다). 상기 피부를 고위험실에서 흐르는 수돗물로 10 내지 15분 동안 철저히 세척하였다.
남은 착색 용액은 다시 어느 정도 투명해졌으며 2개 배치의 어류 피부에는 약간의 색 차이가 있었다: 0.01%는 진정한 데님 진한 청색(true denim dark blue)이었고 0.005%는 중간 데님 청색(medium denim blue)에 가까웠다. 정량화가 가능한 경우 남은 염색 액체 샘플을 50ml 튜브에 수집하였다. 2개 배치 모두 약 1과 1/2 플레이트를 사용하였기 때문에, 총 3개의 풀 플레이트(full plate)가 있었다. 더 강하게 염색된 피부는 공유 플레이트의 좌측에 있었다.
대략 저녁 8: 30부터 동결 건조를 개시하여 밤새 방치하였다.
어류 피부를 아침에 동결 건조시킨 후, 비-멸균 용도로 포장하였다. (실온) 남은 0.01% 및 0.005% 용액을 사용하여 다음날 또 다른 배치(batch)를 반복하였다.
프로토타입 상처 치료제의 제조의 추가 예
2가지 상이한 농도의 메틸린 블루 및 젠티안 바이올렛을 사용하여 2가지 프로토타입의 착색된 대구(Cod) 피부를 제조한다. 색 용액(color solution)의 농도는 0.01% w/v 수성 용액 w/v; 메틸린 블루(50%) 및 젠티안 바이올렛(50%) 및 0.005% w/v 수성 용액 w/v; 메틸린 블루(50%) 및 젠티안 바이올렛(50%)이다.
재료: 10개의 비늘이 제거되고 탈세포화된(decelled) 대구 껍질 배치(Batch) DC 21039A; 1리터 0.01% w/v 수성 용액 w/v; 메틸린 블루 (50%) 및 젠티안 바이올렛(50%); 1리터 0.005% w/v 수성 용액; 메틸린 블루 (50%) 및 젠티안 바이올렛(50%); 10개 알루미늄 트레이; 가위; 소형 타이벡(Tyvek) 파우치; 대형 타이벡 파우치; 대형 플라스틱 백; 셰이커; 실러(Sealer).
프로토타입 공정: 모든 대구 껍질은 당일 제조 생산되어 신선하였다. -80℃에서 5시간 동안 냉동하였다. 대구 껍질이 지나치게 커서 알루미늄 트레이에 들어가지 않아 2개 조각으로 절단하여 총 20개 조각의 대구 껍질을 제공하였다.
프로토타입 0.01%
MB-GV 0.01%로 표시된 알루미늄 트레이에 0.01% 용액 1리터를 붓고, 상기 용액이 피부를 덮도록 상기 트레이에 대구 조각 10개를 균일하게 놓았다. 색이 쏟아질 위험을 최소화하기 위해 상기 트레이를 플라스틱 백에 넣은 다음, 상기 트레이를 pro:40의 진탕기 위에 3시간 동안 두었다.
프로토타입 0.005%
MB-GV 0.005%로 표시된 알루미늄 트레이에 0.005% 용액 1리터를 붓고, 상기 용액이 피부를 덮도록 상기 트레이에 대구 조각 10개를 균일하게 놓았다. 색이 쏟아질 위험을 최소화하기 위해 상기 트레이를 플라스틱 백에 넣은 다음, 상기 트레이를 pro:40의 진탕기 위에 3시간 30분 동안 두었다.
셰이커 상에서 착색 개시: 15:40±10min.
셰이커 상에서 착색 종결: 19:05±5min.
세정 시작: 19:05±5min.
세정 종결: 19: 20±5min.
동결 건조: 모든 어류 피부를 스틸 플레이트 위에 펴고 그 위에 놓인 다른 플레이트를 끼워 넣었다. 동결 건조기 프로그램: SvavaColor - 총 10시간.
포장: 육안 검사 및 굽힘 테스트는 포장 준비가 되어 있는 깨끗하고 착색된 대구 피부를 지원하였다. 샘플을 타이벡 파우치, 소형 및 대형 샘플 파우치내에 포장하고 표시하고 밀봉하였다.
이러한 프로토타입에서는 피부를 긁어내지(scraping) 않았다.
상처 치료의 색 견뢰도 및 기계적 특성을 개선하기 위한 가교결합
추가의 양태에서, 본 발명자에 의해, 피부 대체물, 예를 들어 스캐폴드 물질의 가교결합이, 피부 대체물을 착색시키는 착색제의 견뢰도의 증가, 피부 대체물의 기계적 물질 특성의 증가, 피부 대체물의 효소적 및 화학적 분해에 대한 내성의 증가, 및 치료된 상처와 같은 생물학적 조건에서 피부 대체물에 첨가된 착색제의 수명의 향상을 포함하는 피부 대체물의 특성이 추가로 향상될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 양태에서, 피부 대체물, 예를 들어 스캐폴드 물질을 가교결합시키는 주된 목적은, 상처에 적용한 후 적어도 1일 동안, 바람직하게는 상처에 적용한 후 3일 동안, 보다 바람직하게는 상처에 적용한 후 최대 8 내지 10일, 보다 더 바람직하게는 최대 14일까지 이의 색을 유지하는 착색된 제품을 얻는 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 피부 대체물 및/또는 첨가된 착색제를 갖는 피부 대체물의 가교결합은 다양한 수단에 의해, 예를 들어 조사(irradiation) 또는 화학적 수단에 의해 수행될 수 있다.
화학적 가교결합 또는 변형제
일양태에서, 피부 대체물은 피부 대체물을 가교결합제로 처리함으로써 가교결합된다. 다른 양태에서, 피부 대체물의 단백질은 단백질 변형제(modifying agent)로 피부 대체물을 처리함으로써 변형된다.
양태에서, 화학적 가교결합제는 1차 아민(-NH2); 카복실(-COOH); 설프하이드릴(-SH), 또는 카보닐(-CHO), 또는 몇몇 기타 기와 같은 기 중 하나 이상을 표적으로 한다. 따라서, 가교결합제는, 예를 들어, 아민-반응성, 카복실-대-아민 반응성, 설프하이드릴-반응성 및/또는 알데히드-반응성일 수 있다.
제1 양태에서, 가교결합제는 단순 당 또는 단당류이다. 글루코스, 프룩토스, 또는 갈락토스를 포함한 대체 당을 사용할 수 있다. 예를 들어, 가교결합제는 리보스(ribose)이거나 리보스를 포함할 수 있다. 글루코스, 프룩토스, 또는 갈락토스를 포함한 대체 당을 사용할 수 있다. 복합당, 이당류도 고려될 수 있다.
다른 양태에서, 가교결합제는 천연 또는 합성 가교결합제이다. 예를 들어, 일양태에서, 가교결합제는 제니핀(genipin)을 포함하거나 또는 제니핀이다.
실시예 1 - 리보스 가교결합
리보스가 가교결합제로서 사용되는 첫 번째 실시예가 본원에 제공된다.
본 실시예에 따라, 표준 리보스(원액) 용액을 제조한다. 이를 위해, 박테리아 성장을 방지하기 위해, 0.05%(w/v) 나트륨 아지드를 함유하는 PBS에서 0.2M(몰) 리보스 용액을 제조하였다. 다른 농도의 리보스가 사용될 수 있으며, 다른 박테리아-성장 방지제가 사용될 수 있다. 당해 예에서, 용액에는 중량 기준으로 리보스 30.03g, 미리 혼합된 PBS 표준품 9.55g, 및 나트륨 아지드 50mg이 포함된다. 1L 체적 플라스크에 첨가된 정밀 저울을 사용하여 건조 성분을 칭량하고 탈이온수로 1.00L까지 희석한다. 성분들이 완전히 용해될 때까지 혼합하고 이어서 용액을 사용할 준비가 된다.
당해 예에서, Kerecis™ 어류- 피부-유래 세포 스캐폴드 제품이 피부 대체물로 사용되었다. 일반적으로, 입자화된 스캐폴드 물질을 포함하여 임의의 크기 및/또는 갯수의 스캐폴드를 처리할 수 있다. 스캐폴드 물질을 용액에 첨가하는 용기는 클 수 있으며, 리보스 용액의 체적이 샘플을 완전히 덮을 수 있다. 당해 예에서, 스캐폴드 물질을 4×8㎠의 조각들로 절단하였다. 5개의 조각 또는 샘플을 더 큰 샘플로 잘라서, 더 긴 면(8cm)이 대구 어류 피부의 길이와 평행하도록 하였다. 이어서 샘플을 대략 250mL의 리보스 용액에 실온에서 3 내지 6일 동안 침지하였다. 제1 샘플은 3일째에 제거하였고, 다음의 2개는 5일째, 마지막 2개는 6일째에 제거하였다. 동일한 크기의 추가 샘플도 약 80ml에 40시간 동안 침지시켜 제조하였다.
각각의 샘플을 리보스 용액으로부터 제거한 후 이를 흐르는 물로 세척한 다음 2일 동안 수조에 넣어, PBS 및 나트륨 아지드와 함께 미반응 리보스를 세척해낸다. 세척 과정을 돕기 위해 물을 주기적으로(1일 1 또는 2회) 추가로 갈아준다. 이어서 추가 가공을 위해 샘플을 부분적으로 건조 및 냉동시킨다.
리보스-가교결합된 스캐폴드의 염색 방법: 가교결합된 스캐폴드를 염색하기 위해 2가지 일반적인 방법을 사용하였다. 제1 방법은 가교결합 용액에 MB와 GV를 첨가하는 메타-염색으로 설명할 수 있다. 상기 방법의 경우, 4×8㎠ 스캐폴드 조각 1개를 표준/스톡 리보스 용액(위에서 설명한 것과 동일) 98mL 및 각각의 염료(MB/GV) 원액 1mL로 이루어진 용액에 24시간 동안 침지하였으며, 상기 원액은 0.1wt%이므로 용액의 MB/GV 농도는 0.002%이다. 조합된 가교결합/염료 공정 후에 샘플을 가교결합에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 방식으로 먼저 수돗물로 세척한 다음 물에 2일 동안 방치하여 도 16에 나타낸 바와 같이 샘플(1610)을 생성하였다. 도 16의 샘플(1610)은 "메타" 용액에 24시간 동안 방치된 메타-염색된 리보스 가교결합되고 염색된 스캐폴드이다.
제2 방법에 따라, 후-염색은 이전에 "표준 염색 공정"에 대해 논의된 바와 동일한 조건을 사용하며, 즉, 스캐폴드가 가교결합 및 세척 공정을 수행한 후 샘플을 PBS 중의 0.002중량% MB/GV 용액에서 3시간 동안 염색하며, 이를 위해 4×4㎠ 스캐폴드 조각이 100mL 용액에 염색되었다. 이는, 가교결합 시간, 예를 들어 24시간, 40시간, 5일, 또는 6일에 관계 없이 사전-가교결합된 스캐폴드를 사용하여 수행될 수 있다. 도 17은 0.002% MB/GV PBS 용액에서 3시간 표준 염색 가공한 후 40시간 동안 방치된, 후-염색된 리보스 가교결합된 스캐폴드(1710)를보여준다.
다른 양태 및 예시적인 방법은 상기 리보스 가교결합 예로부터의 변형을 포함할 수 있다. 메타-염색 가공은 적어도 2가지 방식으로 변경될 수 있다. 제1 변화는 용해 시간을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 제2 변화는 용액 내 염료 또는 리보스의 농도가 변하는 것을 포함할 수 있다. 염료의 흡수는 시간이 지남에 따라 상대적으로 느리게 발생하며 상기 용액의 염료 농도와 직접적으로 연관되므로, 예를 들어, 메타-염색이 예를 들어 48시간인 경우 용액 내 MB 및 GV의 농도를 줄이는 것이 생산적일 수 있으며, 스캐폴드의 농도 및 색이 전술한 24시간 공정과 동일해야 하는 경우, 실제로 시간 및 농도의 (합당한 범위 내에서의) 조합이 가능하며 고유한 결과를 얻을 수 있다.
상기와 같은 후-염색과 관련하여, 스캐폴드의 가교결합 시간은 변경될 수 있다. 스캐폴드의 염료 농도가 변경되면 염료 농도 및/또는 염료-용액내의 시간도 변경될 수 있다.
실시예 2 - 제니핀 가교결합
제2 예에서, 전술된 바와 같이, 제니핀이 가교결합제로서 사용되며, 이에 대한 예시적인 절차가 본원에 설명되어 있다.
제니핀 가교결합 용액을 제조한다. 당해 실시예에 따라, PBS에 용해된 0.3%(w/v) 제니핀 용액을 제조하였으며, 상기 용액 200mL를, 미리 만들어진 PBS 용액(1L당, 미리 만들어진 PBS 분말 9.55g) 200mL에 제니핀 0.60g을 용해하여 제조하였다. 고체 미립자가 남지 않을 때까지 상기 용액을 교반한다.
당해 예에서, Kerecis™ 어류-피부-유래 세포 스캐폴드 제품이 피부 대체물로 다시 사용된다. 일반적으로, 입자화된 스캐폴드 물질을 포함하여 임의의 크기 및/또는 갯수의 스캐폴드로 처리할 수 있다. 이러한 예에서, 15mL 웰이 있는 배양 플레이트를 사용하였다. 스캐폴드/콜라겐의 2×2㎠ 조각을 각 웰에 배치하고 제니핀 용액을 첨가한다. 각각의 웰은 전체 용액 15mL로 완전히 채워졌다. 이어서 상기 플레이트를 뚜껑으로 닫고 밀봉한 후 37℃ 수조에 24시간 동안 침지하였다. 온도가 37℃로 일정하며 용기를 밀봉하거나 용액을 재응축함으로써 증발이 제한되는 경우 임의의 다른 가열원도 작동할 수 있다. 용액에서 24시간이 지나면 스캐폴드를 물로 세척하고 냉동시켰다. 당해 예에서, 제니핀과의 가교결합은 스캐폴드 물질이 권취되게 하는 것 외에도 스캐폴드를 청흑색으로 변하게 하였다. 샘플의 강성에도 뚜렷한 차이가 있었다.
리보스 가교결합 및 염색과 유사하게, 당해 예에서 탐구된 2가지 방법은 가교결합 과정에서 및 가교결합 이후의 염색, 즉 메타 염색 및 후-염색이다. 당해 예에서, 6개의 웰이 사용되었으며, 이 중 4개에는 0.3% 제니핀 용액 15mL만 함유되어 있었고 2개에는 MB 및 GV도 함유되어 있었다 (메타-염색). 메타-염색 용액은 각각의 염료 원액 (0.1wt%) 150㎕를 웰에 첨가한 후, 제니핀 용액 14.7mL를 첨가하여 제조하였다. MB/GV를 첨가한 것을 제외하면, 6개 웰은 모두 동일하였고 가교 공정 과정에서 동일하게 처리되었다.
제니핀 가교결합된 스캐폴드의 후-염색 절차는 리보스 가교결합 스캐폴드의 경우와 동일하다. 상기 샘플을 0.002% MB/GV, PBS 용액에 3시간 동안 침지하고, 염색되는 각각의 2×2㎠에 대해 용액 25mL을 사용한다. 본원에서는, 2×2㎠ 스캐폴드 조각 2개를 염색하여 용액 50mL를 사용하여 도 18의 샘플(1810)을 생성하였다. 도 18은, 0.002wt% MB/GV PBS 용액에서 3시간 동안 염색된, 후-염색된 제니핀 스캐폴드인 샘플(1810)을 보여준다. 염색 후 샘플을 세척하고 부분적으로 건조시킨 후 냉동시켰다.
다른 양태 및 예시적인 방법은 상기 제니핀 가교결합 예로부터의 변형태를 포함할 수 있다. 제니핀 가교결합 스캐폴드 샘플의 염색 공정에 적용될 수 있는 변경 사항은 본질적으로 전술된 리보스 방법과 동일하다. 즉, 공정(메타- 또는 후-)과는 무관하에 염료의 시간과 농도에는 변화가 있을 수 있다.
도 19a 및 19b는 화학적 가교결합으로 인한 색 유지의 개선을 비교한 것이다. 도 19a는 각각 접시(1930, 1920, 및 1910)의 조각 19-C, 19-B, 및 19-A의 비교를 보여준다. 조각 19-C, 19-B 및 19-A를 채취한 각각의 샘플은, 0.002% MB/GV, PBS 용액에 3시간 동안 침지시킨 Kerecis™ 어류-피부-유래 세포 스캐폴드 제품이었다. 조각 19-C가 채취된 샘플을 또한 상기 실시예 2에 따라 0.3% 제니핀 용액으로 가교결합시켰다. 조각 19-B를 채취한 샘플을 또한 상기 실시예 1에 따라 리보스 용액으로 가교결합시켰다. 또한, 조각 19-A를 채취한 샘플은 가교결합시키지 않고 0.002% MB/GV, PBS 용액에서 3시간 동안 착색만 시켰다.
비교를 위해, 도 19a는 각각 염색 후 접시(1930, 1920, 및 1910)에 있는 조각 19-C, 19-B, 및 19-A, 및 가교결합 후 19-C 및 19-B에 대한 샘플을 보여준다. 이어서, pH 8의 중탄산염 용액을 접시(1930, 1920, 및 1910) 각각에 동일한 양 및 동일한 농도로 첨가하였다. 조각 19-C, 19-B, 및 19-A를 각각 접시(1930, 1920, 및 1910)에 48시간 동안 37℃에서 저장하여, 도 19b에 도시된 바와 같이 48시간 후에 동일한 조각 19-C, 19-B 및 19-A를 생성하였다.
볼 수 있는 바와 같이, 각각 제니핀(19-C) 및 리보스(19-B)로 가교결합된 조각 19-C 및 19-B의 색 견뢰도는, 유사하게 착색되었으나 가교결합되지 않은 조각 19-A에 비해 현저하게 개선되었다. 가교결합된 조각 19-C 및 19-B는 착색이 더 빠르고 더 잘 유지된다는 것을 분명하게 보여준다.
또한, 두 경우 모두, 리보스와 제니핀의 경우, 가교결합 공정의 농도 및 시간도 변경될 수 있다는 점에서 주목할 가치가 있다. 이는 메타-염색 시 2개 절차의 최종 색에 영향을 끼치지만, 전술된 방법을 사용할 때 가교결합을 직접 형성하는 색은 매우 어둡고 집중되기 때문에, 제니핀의 경우 훨씬 더 큰 효과를 나타낸다. 여러 연구에서 밝혀진 바와 같이, 용액 상태의 시간, 농도 또는 온도가 낮아지면 가교결합이 줄고 색이 더 밝아진다.
조사에 의한 가교결합
다른 양태에서, 피부 대체물은 피부 대체물 재료에 전자기 방사선을 조사함으로써 가교결합된다. 제1 예에서, 피부 대체물, 예를 들어 스캐폴드 물질에 자외선(UV) 방사선이 조사된다.
UV 가교결합의 예
UV-기반 예에 따라, 200mg의 MB에 200mL의 멸균수를 첨가하고 색이 용해될 때까지 교반함으로써 메틸렌 블루(MB)의 0.1% 원액을 제조하였다. 또한, 1리터의 액체 10× PBS를 8.8리터의 수돗물과 혼합하고 교반하여 PBS 용액을 제조하였다.
Kerecis™ 어류-피부-유래 세포 스캐폴드 제품을 피부 대체물로 다시 사용하였다. 일반적으로, 직경 1mm 정도로 작을 수 있는 입자화된 스캐폴드 물질을 포함하는 임의의 크기 및/또는 개수의 스캐폴드를 처리할 수 있다. 당해 예에서, 4cm×8cm로 절단된 어류 피부 조각 14개 및 절단되지 않은 어류 피부 2개를 사용하였다. 어류 피부는 모두 비늘 제거하여, 살 조직, 비늘, 근막을 제거하였다.
PBS, 및 원액의 일부를 큰 용기에 넣고 균일해질 때까지 교반하였다. 각 용액의 양은 다음과 같다: PBS 스톡, 8.8L; 스톡 컬러, 200mL.
색 용액이 제조된 후, 상기 색 용액에 피부를 첨가하여 교반하고, 피부가 서로 붙지 않는지 확인하였다.
피부를 착색 용액에 3.5시간 동안 담가두고 매시간 교반하였다. UV 캐비닛을 설치하고 피부를 트레이에 배열하였다.
UV 방사선 공급원은 15W UV 광(254nm)이었으며, 이는, 방사 단계 동안 트레이가 광 아래에 놓일 수 있도록 캐비닛 내부에 나사로 고정되었다. 캐비닛 내부는 알루미늄 호일로 덮여 벽의 광이 피부에 닿도록 방향을 바꾸었다. 트레이는 광으로부터 대략 12cm 이격되어 배치되었다. 당해 예에서는 거의 단색 UV 방사선인 UV 광이 선택되었지만, 다양한 전력 및 파장의 다른 UV 공급원이 다른 양태에서 단색 UV 방사선 또는 다색 UV 방사선과 함께 사용될 수 있으며, UV 방사선은 약 10nm 내지 약 400nm 범위 내의 파장을 갖는다.
다음을 포함하는 샘플을 얻었다: MB-기반 착색 용액으로부터 제거하여 PBS 용액(색 없음)에 넣고 UV 방사선에 노출시킨, 샘플 A: MB 색 용액에 넣고 MB 색 용액 중에서 UV 방사선에 노출시킨, 샘플 B; 및 색 용액에 넣었으나 UV 방사선에 노출되지 않은, 샘플 C. 즉, 샘플 A의 피부는, 샘플 A의 피부를 MB-기반 색 용액으로 염색한 후 샘플 A의 피부를 PBS 용액에서만 UV 방사선에 의해 가교결합시킨다는 점에서, 후-염색 가교결합과 유사하다고 볼 수 있다. 이에 비해, 샘플 B의 피부는, 샘플 B의 피부가 UV 방사선에 의해 가교결합된 상태로 MB-기반 착색 용액에 남아 있다는 점에서, 메타-염색과 유사하다고 볼 수 있다. 또한, 샘플 C의 피부는, 샘플 C의 피부를 MB-기반 색 용액에서 염색하였으나 염색 과정에서 또는 염색 후에 UV 방사선에 노출하지 않았다는 점에서, 대조군으로 간주될 수 있다. 그러나, 대조군으로서, 샘플 C의 피부를 UV 캐비닛에 저장하였지만 UV 방사선에 노출되지 않은 캐비닛의 어두운 부분에 저장하였다. 이러한 방식으로, 샘플 C의 피부를, 샘플 A 및 샘플 B의 가교결합된 피부와 비교하기 위해 유사한 온도, 플리핑(flipping), 및 시간 조건에서 처리하였다.
피부를 각각의 액체 용액에 6시간 동안 방치하였다. 피부가 상단에 부유하며, 피부를 거꾸로 뒤집어(flipped upside down) 양면이 UV 광에 균등하게 노출되도록 하였다. 이는 UV 광에 노출되지 않은 (어두운 곳에서) 트레이의 피부에 대해서도 수행되어 UV 광 아래의 피부와 프로세스가 유사하게 되었다. 피부를 뒤집을 때(turning) UV 광은 대략 5 내지 10분 동안 꺼졌다.
피부를 뒤집을 때 용액의 온도를 측정하였다. 5시간 후 최대 온도는 25℃ 미만이므로 UV 광은 냉각 시스템이 필요할 정도로 용액과 피부를 가열하지 않았다는 결론을 내렸다.
조사 단계 후, 피부를 트레이로부터 수집하고 샘플 A, 샘플 B, 및 샘플 C 각각에 대해 1개씩 3개의 별도 백으로 옮겼다. 피부를 찬물로 수 분 동안 헹구고 스틸 플레이트 위에 놓은 다음에 동결 건조기에 넣었다. 피부를 밤새 동결 건조기에 두었다.
피부를 3개의 개별 백에 수집하고 각각의 조각을 타이벡 백에 밀봉하였다.
다양한 샘플의 일부 조각을 에틸렌 옥사이드를 사용하여 멸균하였다.
샘플 A: 샘플 A의 피부를 MB 색 용액으로 착색하고, 이어서 이를 제거하고, 세정하고, UV 광하에 PBS 용액에 넣었다. PBS 용액은 본래는 색이 없었으나, UV 조사 종결 후, 이전 착색으로부터의 피부의 색이 피부로부터 누출되어 PBS 용액을 착색한 것이 분명하였다. 피부의 최종 색은 더 짙은 청색이었던 다른 프로토타입에 비해 더 연한 청색이었으며 피부에 약간의 녹색이 더해졌다.
샘플 B 및 샘플 C: 도 20a에 나타낸 바와 같이, 샘플 B 피부의 가교결합이 완료되면, 샘플 B의 조각 20-B를 샘플 C의 조각 20-C와 비교하였을 때, MB-기반 색 용액 중에서 UV 광 하에 놓인 샘플 B의 착색된 피부(샘플 B) 사이에는 UV 광에 노출되지 않은 샘플 C의 피부와 비교하여 가시적인 차이가 없었다. 비교를 위해, 샘플 A의 조각 20-A가 또한 도 20a에 제공된다. 샘플 B 및 샘플 C의 피부는 색이 매우 유사했으며 어류 피부의 질감에 대한 가시적은 차이 또는 느낌은 없었다.
색상 정량화를 위해 액체 용액의 샘플을 수집하지 않았다. 프로토타입은 UV 방사선 및 이것이 어류 피부에 끼치는 영향을 테스트하기 위해서만 제작되었다.
어류 피부의 일부를 효소로 분해하여 해당 용액의 색량을 측정함으로써 피부의 색량을 측정하기 위해 추후에 다른 방법을 사용할 수도 있다.
가교결합된 샘플의 색 견뢰도를 비교하기 위한 수단으로서, 37℃의 염기 및 산(산/염기) 용액에 샘플을 정치시켜 각 샘플의 조각의 색 누출을 수행하였다. 또한, 샘플을, 상이한 매염제를 사전 제조하고 용액의 pH를 점진적으로 변경하면서 착색된 다른 프로토타입과 비교하였다. 그 결과, UV로 가교결합된 샘플은 다른 다수의 프로토타입보다 색이 더 오래 유지되는 것으로 나타났다.
도 20a 내지 20d는 UV 조사에 의한 가교결합으로 인한 착색의 유지의 개선을 비교한 것이다. 도 20a는, 20-C로 표지되어 있고 접시(2030)에 놓인 샘플 C의 조각; 20-B로 표지되어 있고 접시(2020)에 놓인 샘플 B의 조각; 및 20-A로 표지되어 있고 접시(2010)에 놓인 샘플 A의 조각을 포함하여 샘플 C, B, 및 A로부터 채취한 조각의 비교를 보여준다. 도 20b는, 동일한 농도의 산/염기 용액 중에 24시간 동안 존재한 후에 접시(2030, 2020, 및 2010)에 각각 담긴 조각 20-C, 20-B, 및 20-A를 보여준다. 도 20c는, 동일한 농도의 산/염기 용액 중에 48시간 동안 존재한 후에 접시(2030, 2020, 및 2010)에 각각 담긴 조각 20-C, 20-B, 및 20-A를 보여준다. 또한, 도20d는, 동일한 농도의 산/염기 용액 중에 72시간 동안 존재한 후에 접시(2030, 2020, 및 2010)에 각각 담긴 조각 20-C, 20-B, 및 20-A를 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, UV 방사선에 노출된 조각 20-B 및 20-A의 색 견뢰도는, 유사하게 착색되었지만 UV 방사선에 노출되지 않은 조각 20-C에 비해 현저하게 개선되었다. 이는 특히, 도 20c 및 도 20d에서, 산/염기 용액 중에서 각각 48시간 및 72시간에 볼 수 있는 바와 같은 경우이다. 48시간 및 72시간 후에, 조각 20-B 및 20-C는 여전히 약간의 색을 유지하였으며, 72시간 후에, 가교결합되지 않은 조각 20-C는 거의 백색이 되거나 이의 본래 색으로 돌아왔다. 48시간 및 72시간 모두에서 조각 20-B 및 20-A를 비교하면, 샘플 B의 메타-염색이 나타나며, 여기서, 어류 피부는 MB-기반 색 용액 내에 있으면서 UV 방사선으로 염색되고, 산/염기 용액에 노출되면 어류 피부의 색이 약간 더 변색된다. 즉, 조각 20-B의 색은 산/염기 용액에 존재한 지 48시간 및 72시간 후에 조각 20-A보다 약간 더 어두운 것으로 나타났다.
다른 양태 및 예시적인 방법은, 착색제의 변화, UV 방사선의 강도, UV 방사선의 파장 또는 파장 범위의 변화, 염색 시간의 변화, 염색 농도, 및 UV 방사선에 노출되는 시간의 변화를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
이들 실시예 및 기재된 양태에 근거하여, 피부 대체물을 착색시키는 착색제의 견뢰도의 증가, 피부 대체물의 기계적 물질 특성의 증가, 피부 대체물의 효소적 및 화학적 분해에 대한 저항성의 증가, 및 치료된 상처와 같은 생물학적 조건에서 피부 대체물에 첨가되는 착색제의 수명의 향상을 포함하는, 착색된 피부 대체물, 예를 들어 착색된 스캐폴드 물질의 특성이 본 발명자에 의해 밝혀졌다.
양태 및 특징의 조합가능성
본 기재사항은, 명시적으로 언급되지 않거나 상호 배타적이지 않는 한, 본원에 설명된 다른 예, 양태 또는 특징과 조합 가능한 것으로 이해되어야 하는 다양한 예, 양태 및 특징을 제공한다.
상기에 더하여, 추가 양태 및 예는 다음을 포함한다:
1. 피부 대체물; 및 피부 대체물에 첨가되는 착색제로서, 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제인, 착색제를 포함하는, 조직-재생 상처 치료제.
2. 피부 대체물은 생물학적 피부 대체물, 또는 합성 대체물, 또는 생물학적 피부 대체물과 합성 피부 대체물의 하이브리드인, 상기 1 또는 하기 3 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
3. 피부 대체물은 자가 피부 이식편, 동계 피부 이식편, 동종 피부 이식편, 이종 피부 이식편, 또는 합성 피부 이식편인, 상기 1 내지 2 또는 하기 4 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
4. 피부 대체물은 스캐폴드 물질을 포함하는, 상기 1 내지 3 또는 하기 5 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
5. 피부 대체물은 세포외 기질 산물을 포함하는 스캐폴드 물질을 포함하는, 상기 1 내지 4 또는 하기 6 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
6. 세포외 기질 산물은 입자 또는 시트 또는 메쉬 형태인, 상기 1 내지 5 또는 하기 7 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
7. 피부 대체물은 탈세포화된 온전한 어류 피부를 포함하는 스캐폴드 물질이며, 상기 탈세포화된 온전한 어류 피부는 세포외 기질 재료를 포함하는, 상기 1 내지 6 또는 하기 8 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
8. 착색제가 피부 대체물에 첨가되기 전에, 첨가된 후에, 또는 첨가와 동시에 상기 상처 치료제는 가교결합되는, 상기 1 내지 7 또는 하기 9 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
9. 착색제는 티아진 염료, 또는 트리아릴메탄 염료, 또는 티아진 염료와 트리아릴메탄 염료의 조합을 포함하는, 상기 1 내지 8 또는 하기 10 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
10. 착색제는 메틸렌 블루(MB), 또는 젠티안 바이올렛(GV), 또는 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)의 조합을 포함하는, 상기 1 내지 9 또는 하기 11 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
11. 피부 대체물은 동결건조되며, 피부 대체물의 동결건조 또는 재동결건조 전에 착색제는 피부 대체물에 첨가되는, 상기 1 내지 10 또는 하기 12 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
12. 탈이온수 중에 또는 인산염-완충 염류 용액 중에 착색제 0.01wt% 내지 0.0001wt%를 함유하는 염료 용액으로 피부 대체물을 염색함으로써, 착색제가 피부 대체물에 첨가되는, 상기 1 내지 11 또는 하기 13 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
13. 착색제는 항생, 방부, 항균, 항바이러스, 항진균, 항기생충, 항염증, 또는 항산화 특성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 1 내지 12 또는 하기 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
14. 착색제는 치유 시 상처에 영구적인 착색을 유발하지 않는, 상기 1 내지 13 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제.
15. 상기 1 내지 14 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 조직-재생 상처 치료제를 제공하는 단계; 조직-재생 상처 치료 조성물을 상처 기저부에 적용하는 단계; 및 착색제의 색 변화를 측정함으로써 피부 대체물이 상처 내에서 프로테아제 공격에 의해 분해되었는지의 여부를 판정하는 단계를 포함하는, 상처 치료 방법.
16. 피부 대체물을 제공하는 단계; 및 착색제를 피부 대체물에 첨가하는 단계로서, 착색제는 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제인, 단계를 포함하는, 조직-재생 상처 치료제의 제조 방법.
17. 피부 대체물은 생물학적 피부 대체물, 또는 합성 대체물, 또는 생물학적 피부 대체물과 합성 피부 대체물의 하이브리드이고/이거나, 피부 대체물은 자가 피부 이식편, 동계 피부 이식편, 동종 피부 이식편, 이종 피부 이식편, 또는 합성 피부 이식편이고/이거나, 피부 대체물은 스캐폴드 물질을 포함하고/하거나, 피부 대체물은 세포외 기질 산물을 포함하는 스캐폴드 물질을 포함하는, 상기 16 또는 하기 18 내지 20 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 방법.
18. 피부 대체물은 탈세포화된 온전한 어류 피부를 포함하는 스캐폴드 물질이며, 상기 탈세포화된 온전한 어류 피부는 세포외 기질 재료를 포함하는, 상기 16 내지 17 또는 하기 19 내지 20 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 방법.
19. 착색제는 메틸렌 블루(MB), 또는 젠티안 바이올렛(GV), 또는 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)의 조합을 포함하는, 상기 16 내지 18 또는 하기 20 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 방법.
20. 탈이온수 중에 또는 인산염-완충 염류 용액 중에 착색제 0.01wt% 내지 0.0001wt%를 함유하는 염료 용액으로 피부 대체물을 염색함으로써, 착색제가 피부 대체물에 첨가되는, 상기 16 내지 19 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따른 방법.
정의된 용어의 약식 목록
앞서 기재된 설명과 첨부된 청구범위의 범위와 내용을 이해하는 데 도움을 주기 위해 선택된 몇 가지 용어를 바로 아래에 정의한다.
본원에 사용된 "기저 물질(base material)"이라는 용어는 치료용 비히클로서 작용할 수 있고 추가로 또는 대안적으로 상처의 수분 및/또는 상처 주변부의 수분을 가능하게 및/또는 수동적으로 조절할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 재료를 포함할 수 있다.
"생체적합성 중합체(biocompatible polymer)"라는 용어는 인체에 유해하지 않은 중합체 재료를 지칭한다. 생체적합성 중합체는, 인체에 유해한 물질을 방출하지 않으며 상처 부위에 직접 접촉해도 피부 자극과 같은 부작용이나 인체에 기타 부정적인 영향을 주지 않는 합성 또는 천연 중합체 재료를 포함한다.
본원에 사용된 "에셜론(Echelon)"의 등급은 군인에게 제공되는 의료 조치의 위치 및/또는 유형을 지칭한다. 에셜론 I은, 전장에서 또는 에셜론 II 인원/시설로부터 멀리 떨어진 장소에서 실시되는 자가-지원 및 동료-지원 치료 뿐만 아니라 전투 의무병 치료를 지칭한다. 에셜론 II는 의사, 보조 의사, 또는 기타 자격을 갖춘 의료 인력에 의한 고급 외상 치료를 지칭하며, 에셜론 II 치료는 종종 야전 병원에서 시행된다. 에셜론 III은 군단 수준에서 제공되는 치료를 지칭하며 통상적으로 생명, 사지, 및 시력을 구하기 위한 재건 및 최종 수술을 포함하고; 상기 치료는 필요한 장비를 갖춘 야전 병원에서 제공될 수 있다. 에셜론 IV는 복잡한 수술과 장기간의 요양(예를 들어, 2주 이상)을 지칭하며 일반적으로 지역 영구 병원에서 제공된다. 에셜론 V는 광범위한 재활 및 요양 치료가 필요한 부상 및/또는 절차를 지칭하며; 에셜론 V 치료는 미국 본토 영구 병원에서 시행된다. 전술한 에셜론 시스템은 특히 군인 및 치료 시나리오와 관련되지만, 에셜론 시스템은 적절하게 민간 및/또는 지방 법 집행 시나리오의 치료 위치 및/또는 치료 시나리오 유형에 비유될 수도 있다.
본원에 사용된 "상처"라는 용어는 일반적으로 조직 손상을 포함하도록 의도된다. 따라서, "상처"라는 용어는, 예를 들어, 열상, 찰과상, 절개, 자창, 벗겨짐, 또는 기타 이러한 부상과 같이 피부의 절단, 찢김, 및/또는 파손을 유발하는 부상을 포함한다. 상처는 상처의 크기, 형상, 또는 규모에 의해 설명될 수 있다. 예를 들어, 종이에 베인 상처는 상대적으로 적은 규모의 작고 곧은 절개의 예시이고, 하나 또는 다수의 신체 부위를 덮는 주요 열상을 초래하는 진탕성 폭발(concussive blast)은 상대적으로 더 큰 규모의 더 큰 상처의 예시이다. 그러나, 전술한 예 각각은 본원에서 사용된 "상처"라는 용어의 범위에 속한다.
"상처"라는 용어는 외상성 부상으로 인한 것과 같은 기저 조직에 대한 손상을 추가로 포함한다. 따라서, "상처"라는 용어는 다수의 상이한 상처들의 조합을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 폭약 폭발(explosive blast)로 인한 외상성 절단술은 다양한 열상, 찰과상, 벗겨짐, 및 자창이 복합적으로 발생하더라도 일반적으로 상처라고 지칭할 수 있다. 추가로, 전술된 폭약 폭발로 인한 임의의 기저 조직 손상은 상처에 대한 이러한 언급의 이해 내에 추가로 포함될 수 있다. "상처"라는 용어는 화상(예를 들어, 열 및/또는 화학적 화상)으로 인한 조직 손상도 포함하도록 의도된다. 또한, "상처"라는 용어는 또한 예를 들어 당뇨병성 족부궤양, 정맥성 하지 궤양, 외과 수술, 욕창, 및 기타 원인으로 인한 손상을 또한 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 "외상성 상처"는 피부 및 기저 조직 모두를 손상시키는 신체적 부상으로 인한 모든 상처를 의미한다. 총상은 피부에 구멍을 내고(즉, 파손) 기저 조직을 파열시키거나 손상시키므로 외상성 상처의 비제한적인 일례이다. 다른 비제한적인 예로서, 진탕성 폭발 또는 폭약 폭발은 일반적으로 외상성 상처(들)를 초래한다. 전쟁 중에 입은 상처 중 전부는 아니지만 대부분은 전쟁의 성격 및 전쟁-관련 부상으로 인한 외상성 상처로서 설명될 수 있다. "외상성 상처"는 출혈성 상처, 골 및/또는 힘줄이 노출된 상처, 극심한 화상, 심부 조직 상처(예를 들어, 비대칭 심부-조직 상처) 및/또는 넓은 표면적 상처를 포함할 수 있다.
Omega3 Wound는 만성 상처, 화상 상처를 포함한 상처 관리 및 연조직 복구에 사용하도록 식품의약국(FDA)에 의해 승인되었다. 다른 동물 유래 제품과는 달리, 어류 피부는 사람에게 질병이 전염될 위험이 없으므로 구조 및 생리활성 조성물이 보존되는 부드러운 가공이 필요하다. Omega3 Wound는 더 빠른 상처 봉합과 빠른 치유 시간에 있어서 돼지 소장 유래 스캐폴드에 비해 이점을 입증하였다. 어류 피부 이식편은 다양한 병인의 만성 및 급성 상처에 많이 사용되었으며 강력한 안전성과 효능을 보여주었다. 복잡하고 적대적인 전쟁 환경을 고려할 때, 첨단 상처 치료 기술과 감염 예방 관행을 결합한 총체적인 접근 방식이 취해져야 한다. 새로운 기술이 군인과 의료인의 요구를 고려하고 해결하는 것이 중요하다.
본원에 예시된 독창적인 특징의 다양한 변경 및/또는 수정, 및 본원에 예시된 원리의 추가 적용은 관련 기술 분야의 숙련자 및 본 개시 내용의 소유자에게 발생할 수 있으며, 예시된 실시예에 대해 별도의 조치 없이 이루어질 수 있다. 이는 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 요지와 범주에서 벗어나며 본 개시의 범위 내에서 고려되어야 한다. 따라서, 다양한 측면 및 양태가 본원에 개시되었지만, 다른 측면 및 양태도 고려된다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 등가인 다수의 방법 및 구성 요소가 본 개시내용의 양태를 실행하는 데 사용될 수 있지만, 본원에는 특정 구성 요소 및 방법만 설명되어 있다.
또한, 본 개시내용의 특정 양태에 따른 시스템, 장치, 제품, 키트, 방법 및/또는 프로세스는 특성, 특징(예를 들어, 구성요소, 부재, 요소, 부분, 및/또는 부분)은 본원에 개시 및/또는 설명된 다른 양태에 설명되어 있다. 따라서, 특정 양태의 다양한 특징은 본 개시내용의 다른 양태와 호환, 결합, 포함 및/또는 통합될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 특정 양태에 관한 특정 특징의 개시는 상기 특징의 특정 양태에 대한 적용 또는 포함을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 다른 양태도 본 개시내용의 범위로부터 반드시 벗어나지 않으면서 상기 특징, 부재, 요소, 부품 및/또는 부분을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
더욱이, 특징이 다른 특징과 결합하여 요구되는 것으로 설명되지 않는 한, 본 명세서의 임의의 특징은 본원에 개시된 동일하거나 다른 양태의 임의의 다른 특징과 결합될 수 있다. 또한, 예시적인 시스템, 방법, 장치 등의 잘 알려진 다양한 측면은 예시적 양태의 측면을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 본원에서는 구체적으로 설명하지 않는다. 그러나 이러한 측면도 본원에서 고려된다.
본 개시내용의 양태하에 반드시 모든 목적 또는 이점이 달성될 수 있는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 당업자는 외골격 및 이를 제조하기 위한 방법이 본원에 교시되거나 제안된 다른 목적 또는 이점을 달성하지 않고 본원에 교시된 하나의 이점 또는 이점 군을 달성하거나 최적화하는 방식으로 구현되거나 수행될 수 있음을 인식할 것이다.
숙련가는 개시된 다양한 특징 중 일부의 상호교환성을 인식할 것이다. 본원에 설명된 변형 외에도, 각각의 특징에 대한 다른 알려진 등가물은 외골격을 구성하고 본 개시내용의 원리에 따라 이를 만드는 방법을 활용하기 위해 당업자에 의해 혼합 및 일치될 수 있다.
본 개시내용은 수동적 요추 외골격의 특정한 예시적 양태 및 실시예를 설명하지만, 당업자는 본 개시 내용이 구체적으로 개시된 수동적 요추 외골격 양태를 넘어 다른 대안적인 양태 및/또는 기재내용 및 명백한 변형태 및 등가물의 용도로 확장됨을 이해할 수 있을 것이다. 본 개시내용은 전술된 개시된 양태에 의해 제한되지 않아야 하며, 본원에 설명된 특징을 채용할 수 있는 다른 분야로 확장될 수 있도록 의도되었다.

Claims (20)

  1. 조직-재생 상처 치료제로서,
    피부 대체물; 및
    상기 피부 대체물에 첨가되는 착색제로서, 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제인, 착색제
    를 포함하는, 조직-재생 상처 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피부 대체물은 생물학적 피부 대체물, 또는 합성 대체물, 또는 생물학적 피부 대체물과 합성 피부 대체물의 하이브리드인, 조직-재생 상처 치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피부 대체물은 자가 피부 이식편, 동계 피부 이식편, 동종 피부 이식편, 이종 피부 이식편, 또는 합성 피부 이식편인, 조직-재생 상처 치료제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 대체물은 스캐폴드 물질을 포함하는, 조직-재생 상처 치료제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 대체물은 세포외 기질 산물을 포함하는 스캐폴드 물질을 포함하는, 조직-재생 상처 치료제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질 산물은 입자 또는 시트 또는 메쉬 형태인, 조직-재생 상처 치료제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 대체물은 탈세포화된 온전한 어류 피부를 포함하는 스캐폴드 물질이며, 상기 탈세포화된 온전한 어류 피부는 세포외 기질 재료를 포함하는, 조직-재생 상처 치료제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색제가 상기 피부 대체물에 첨가되기 전에, 첨가된 후에, 또는 첨가와 동시에 상기 상처 치료제는 가교결합되는, 조직-재생 상처 치료제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색제는 티아진 염료, 또는 트리아릴메탄 염료, 또는 티아진 염료와 트리아릴메탄 염료의 조합을 포함하는, 조직-재생 상처 치료제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색제는 메틸렌 블루(MB), 또는 젠티안 바이올렛(GV), 또는 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)의 조합을 포함하는, 조직-재생 상처 치료제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 대체물은 동결건조되며, 상기 착색제는 상기 피부 대체물의 동결건조 또는 재동결건조 전에 상기 피부 대체물에 첨가되는, 조직-재생 상처 치료제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 탈이온수 중에 또는 인산염-완충 염류 용액 중에 상기 착색제 0.01wt% 내지 0.0001wt%를 함유하는 염료 용액으로 상기 피부 대체물을 염색함으로써, 상기 착색제가 상기 피부 대체물에 첨가되는, 조직-재생 상처 치료제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색제는 항생, 방부, 항균, 항바이러스, 항진균, 항기생충, 항염증, 또는 항산화 특성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는, 조직-재생 상처 치료제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색제는 치유 시 상처에 영구적인 착색을 유발하지 않는, 조직-재생 상처 치료제.
  15. 상처 치료 방법으로서,
    제1항 내지 제14항에 따른 조직-재생 상처 치료제를 제공하는 단계;
    상기 조직-재생 상처 치료제를 상처 기저부에 적용하는 단계; 및
    상기 착색제의 색 변화를 측정함으로써 상기 피부 대체물이 상기 상처 내에서 프로테아제 공격에 의해 분해되었는지의 여부를 판정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  16. 조직-재생 상처 치료제의 제조 방법으로서,
    피부 대체물을 제공하는 단계; 및
    착색제를 상기 피부 대체물에 첨가하는 단계로서, 상기 착색제는 치료된 상처내에서 프로테아제 공격시 분해되는 생체적합성 착색제인, 단계
    를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 피부 대체물은 생물학적 피부 대체물, 또는 합성 대체물, 또는 생물학적 피부 대체물과 합성 피부 대체물의 하이브리드이고/이거나,
    상기 피부 대체물은 자가 피부 이식편, 동계 피부 이식편, 동종 피부 이식편, 이종 피부 이식편, 또는 합성 피부 이식편이고/이거나,
    상기 피부 대체물은 스캐폴드 물질을 포함하고/하거나,
    상기 피부 대체물은 세포외 기질 산물을 포함하는 스캐폴드 물질을 포함하는, 방법.
  18. 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 대체물은 탈세포화된 온전한 어류 피부를 포함하는 스캐폴드 물질이고, 상기 탈세포화된 온전한 어류 피부는 세포외 기질 재료를 포함하는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색제는 메틸렌 블루(MB), 또는 젠티안 바이올렛(GV), 또는 메틸렌 블루(MB)와 젠티안 바이올렛(GV)의 조합을 포함하는, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 탈이온수 중에 또는 인산염-완충 염류 용액 중에 상기 착색제 0.01wt% 내지 0.0001wt%를 함유하는 염료 용액으로 상기 피부 대체물을 염색함으로써, 상기 착색제가 상기 피부 대체물에 첨가되는, 방법.
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