CN117547652B - 一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法。所述方法包括：(1)将新鲜的动物膜组织进行初步处理，然后依次浸泡于NaCl溶液和纯水中；(2)使用脱细胞复合液对步骤(1)得到的组织至少处理两次；(3)依次使用第一病毒灭活复合液和第二病毒灭活复合液对步骤(2)得到的组织进行处理；(4)对步骤(3)得到的组织进行定型和灭菌处理。本发明提供的方法能够有效去除免疫原成分，包括异种细胞、细胞碎片、残留DNA、杂蛋白、脂肪等，产品生物安全性更高；生产过程更简单可靠，生产成本更低；材料物理性能及抗降解性能更好。
Description
技术领域
本发明实施例涉及组织工程技术领域，具体涉及一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法。
背景技术
胶原蛋白为细胞外基质(ECM)中的主要组成成分，是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占蛋白质总量的25％-30％，约体重的6％，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位。正常成年人体内约有3kg胶原蛋白，约90％的胶原蛋白存在于皮肤和骨头中。不同类型胶原蛋白的功能和存在部位有所区别。目前人类研究发现的胶原蛋白共28种，其中以I至V型较为常见。I型胶原蛋白是最普遍存在的胶原蛋白，占人体胶原蛋白总量的90％，占总蛋白质质量的近20％，主要存在于皮肤、骨和肌腱；Ⅱ型胶原蛋白是软骨和玻璃体中的主要成分；III型胶原蛋白在新生儿皮肤中含量较高，能够为细胞提供充足的营养，维持皮肤的饱满润滑；Ⅳ型胶原蛋白是构成基底膜的重要成分；V型胶原蛋白存在于主要由Ⅰ型胶原蛋白组成的纤维中，为Ⅰ型胶原蛋白纤维形成支架，可能在基膜和结缔组织之间起着“桥梁”作用。
ECM是用来制备维持胶原天然三维结构并具有理想孔结构的支架材料，在组织再生领域应用广泛。通过良好的加工处理，异种ECM具有抗原性小、生物相容性好、可生物降解等特点。其中又包括自体来源、异体来源和异种来源。
自体组织在内的自体材料，无需脱细胞处理，再生及生物相容性较好，但取材会造成二次损伤，只有在少数临床中使用，并且使用越来越少；异体ECM取自尸体，来源有限，价格昂贵，并且具有传染病的危险且受到伦理学的制约，限制了其应用；异体ECM脱细胞工艺及病毒灭活工艺，给材料的加工带来挑战：工艺处理的效果越充分，材料越安全，引导组织再生效果会越不显著。
动物源性材料及含有动物来源的材料(动物组织及其衍生物)，全部或部分采用动物组织制成的，采用动物组织衍生物或由动物体自然获取的物质经特定工艺处理而制成的材料，应用场景包括心脏瓣膜、人工脑膜、疝气补片、种植膜等，可用于缺损组织的填充、修复、屏障、防粘连等。异种ECM包括动物皮、心包、小肠下层粘膜、血管、骨、肌腱、肾脏、肌肉组织、角膜等，异种材料来源广泛、价格较低。异种脱细胞基质材料有广泛的应用，包括人工心脏瓣膜、口腔修复膜、人工脑膜、可降解疝气补片等；天然来源的ECM材料具有较低的免疫原性，与人体类似的空间结构及引导再生功能，在组织修复再生领域发挥重要作用。经过脱细胞工艺处理后，去除能够引起免疫排斥反应的抗原成分，同时完整地保留细胞外基质的三维空间结构。经过充分处理的细胞外基质材料具有良好的机械力学性能，组织相容性好，植入体内免疫排斥反应非常低，在体内起着支持、连接细胞的作用，同时其三维的空间结构及细胞因子有利于细胞的黏附和生长，具有良好的应用前景。
通常的组织脱细胞方法包括机械处理、溶剂处理、冻干、灭菌等一系列工艺，经去脂肪、去宿主细胞、去宿主DNA残留、半成品消毒、病毒灭活、灭菌等工艺处理，产品可用于人体使用。脱细胞处理方法包括机械法、化学法和酶法；机械法通常不单独应用，而是作为配合其它工艺的一部分，但在某些工艺中，又非常重要，以猪皮、牛皮为例，通过机械法控制脂肪含量和厚度，是非常重要的处理步骤；化学法包括去污剂、溶胀剂、表面活性剂、脱脂剂、酸、碱、氧化漂白剂等，按大类可分为酸法及碱法；胶原蛋白耐酸能力较差，酸法对胶原材料有较强的破坏作用，容易导致材料永久变性或降解，应谨慎应用；除垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)溶液容易造成胶原蛋白变性，SDS具有细胞毒性，影响细胞生长，去除细胞后必须彻底清除以免对患者的健康造成危害；酶法也是一种重要的方法，也是当前应用比较广泛的方法，但工艺条件要求较高，有研究表明，酶法制备胶原蛋白易造成多个肽键位点断裂。相对而言天然胶原蛋白基质对碱的耐受能力很好，碱处理控制好处理浓度、PH、温度等条件，对材料整体结构影响是可控的。强氧化剂也是一种重要的处理方法，天然胶原胶原蛋白结构非常稳定，活性氧类强氧化剂对杂蛋白及DNA有很好的破坏效果，但对天然胶原胶原蛋白结构影响较小。
在普遍的ECM研究中，过多强调材料的组织再生能力，比如说引导细胞长入，与自体组织的混合再生，这种说法对降解较快的材料来说是有一定问题的；异种材料在组织引导再生的过程中，发挥的主要作用并不是完全取代自体组织，而是临时性取代，引导自体组织再生是指材料附近的自体组织再生，而不是长入植入材料中再生，如果植入材料在较快时间内会降解，并不能与自体组织同步生成“混合型”组织；一种情况是，植入材料是非降解的，一定时间后与组织接触的部分会与组织融合；另外一种情况是长期植入产品，如骨修复材料降解周期超过6个月，材料会阶段性的与自体组织融合生长。通常非交联的ECM材料在体内维持功能及形态的时间小于2个月，因此，材料本身设计性能的维持能力及生物相容性非常重要，超过材料引导组织长入等功能。
现有脱细胞ECM产品能在一定程度上满足需要，但同时也存在如下问题：产品热变性温度较低，在病人发热情况下，材料容易变性崩解，导致治疗失败或效果下降，甚至引发感染；以胶原蛋白人工脑膜为例，材料过早降解，会导致脑脊液渗漏，引起颅内压变化及颅内感染，材料短时间释放的胶原蛋白导致高烧不退，必须进行二次手术，甚至导致病人死亡；化学交联产品相对比较稳定，但存在降解时间过长问题，长期异物存在、交联剂残留影响，也有免疫排斥风险；材料的抗污染能力较低，材料的抗污染能力的影响因素较多，如材料厚度、材料的显微表征等，材料较厚、材料氨基酸末端暴露较多，都会增加污染菌定植繁殖的概率。
工艺处理显著影响材料性能的均匀性，包括形变、缝合撕裂、降解速度等。通过我们前期观察研究，在病人不发热的情况下，同一材料在不同个体内使用降解时间差异较大。特别是在人工脑膜的应用中，产品降解速度的控制非常重要，短时间大量胶原蛋白的释放，会导致积液甚至无菌性炎性的发生，导致手术失败，同时脑脊液的渗漏液带来不可接受的风险。
材料种属差异会影响材料的降解性能。以牛为例，有研究表明，牦牛心包降解相关性能较黄牛更好，牛心包较猪心包更好；动物年龄对材料的影响非常大，小牛真皮胶原支架成熟度更低，热变性及体内降解稳定性更差；猪真皮中脂肪含量更高，给脱脂工艺带来更大难度，并且猪真皮的部位显著影响材料的力学性能，背部的致密度及强度更大，而腹部的材料形变非常大，对制备材料的均匀性及临床应用带来挑战。
冻干是目前主流的产品成型方式，冻干的好处是能在一定程度上保留天然的形态结构及均匀的外观，代价是能源的消耗及成本的上升。在当前碳排放日益严峻的国际环境中，通过技术降低能耗，是一种大的趋势，高能耗的生产方式，会被创新技术逐步淘汰。另外一个值得关注的问题是，过多暴露的氨基酸残基和疏松的空隙，在手术初期，为细菌定植提供了理想的条件，容易造成创面污染和感染；对于开放性手术来说，如何控制感染非常重要，通过一定的设计，平衡材料在抗污染及引导再生之间的关系，是值得研究的课题；通过干燥成型，减少材料表面过度暴露，可以使材料在植入初期更加稳定。
辐照灭菌是当前普遍的灭菌方式；胶原蛋白产品进行辐照灭菌，极大的影响到产品的力学性能及降解性能，天然胶原蛋白的热变性温度在未经辐照前通常大于43℃，经过辐照后会下降，给临床使用上带来较大风险，一旦病人发热，材料可能在几个小时内就会崩解；同样，产品撕裂力也会从辐照前的12-15N下降到5-9N，勉强能达到临床缝合撕裂力的要求，也会影响到临床应用。辐照灭菌的另外一个问题是剂量控制的范围，通常25KGY的灭菌剂量，验证要做到40KGY，也就是说，误差范围较大，给产品间带来加工上不均匀的风险，可能是导致材料降解差别较大的一个重要原因。
综合以上信息，可以认为，天然脱细胞基质材料的处理工艺选择非常重要，影响到材料的各种植入性能，特别是降解性能，包括降解的时间一致性，这是非交联ECM材料的重要性能指标，也是非交联材料普遍存在的问题；交联材料通过交联，材料性质均匀度大幅提高，减少了这种差异。但化学交联存在交联相关问题，如过度交联、交联剂残留等，需要对工艺进行精细设计。
鉴于此，特提出本发明申请。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将新鲜的动物膜组织进行初步处理，然后依次浸泡于NaCl溶液和纯水中；
(2)使用脱细胞复合液对步骤(1)得到的组织至少处理两次；
(3)依次使用第一病毒灭活复合液和第二病毒灭活复合液对步骤(2)得到的组织进行处理；
(4)对步骤(3)得到的组织进行定型和灭菌处理。
进一步地，所述初步处理的步骤包括：用设备或器械去除筋膜、肌肉及毛发。
进一步地，所述NaCl溶液的浓度为2-5％。
进一步地，所述脱细胞复合液按重量百分含量计包括如下组分：1-5％过碳酸钠、0.5-2％磷酸盐、0.5-2％Triton-X100，余量为纯化水。
进一步地，所述第一病毒灭活复合液按重量百分含量计包括如下组分：1-5％过碳酸钠、5-20％过碳酰胺、1-5％过氧化氢，余量为纯化水。
进一步地，所述第二病毒灭活复合液按重量百分含量计包括如下组分：3-10％氢氧化钠，1-5％磷酸盐，余量为纯化水。
进一步地，所述磷酸盐选自磷酸钠、焦磷酸钠、三聚磷酸钠中的一种或多种。
进一步地，采用鼓风干燥进行定型，所述鼓风干燥的温度为28-50℃。
进一步地，采用环氧乙烷灭菌。
根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种天然胶原蛋白脱细胞基质材料，其由如上任一项所述的方法制成。
本发明实施例具有如下优点：
1、通过复配各种溶剂，提高了单一步骤各种免疫原成分的去除效果，包括异种细胞、细胞碎片、残留DNA、杂蛋白、脂肪等，产品生物安全性更高。
2、通过复配的多种溶液多次处理，全面系统地强化了材料多步骤各种免疫原成分的去除效果，产品应用更安全。
3、通过复配各种溶剂，强化了交叉病毒灭活效果，同时具备进一步去除免疫原的效果。
4、通过复配各种溶液，生产过程更简单可靠，生产成本更低。
5、通过非冻干的方式产品成型，降低了生产成本，工艺更环保。
6、产品环氧乙烷方式灭菌，避免了辐照灭菌工艺对材料的破坏，材料物理性能及抗降解性能更好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明提供提供的通过脱细胞处理得到的牛心包材料；
图2为本发明提供的通过脱细胞处理得到的牛皮材料(冷冻状态)；
图3为本发明提供的通过干燥成型方法得到的牛皮脱细胞胶原蛋白基质。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明是基于发明人的如下研究所作出的：
在蛋白质溶液中若加大量中性盐，蛋白质胶粒的水化层即被破坏，其所带电荷也被中和，蛋白质胶粒因失去这两种稳定因素而沉淀。此种沉淀过程称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。1-5％NaCl水溶液常用于蛋白质盐析沉淀。同时高渗透压的盐溶液会引起细胞皱缩，有利于细胞与基质的分离脱除。以细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液(如低浓度的稀盐溶液)中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，从而引起细胞膜发生胀破。高盐溶液处理后，再用纯化水浸泡，使细胞溶胀破裂。
过碳酸钠俗称固体双氧水。过氧化氢(H2O2)俗名双氧水，常温下是一种无色的液体，它难电离，易分解。为了储存、运输、使用的方便，工业上采用醇析出将其转化成固态的过碳酸钠晶体(化学式为：2Na2CO3·3H2O2)，该物质具有Na2CO3和H2O2的双重性。过氧碳酸钠中理论活性氧含量为15.3％，相当于32.5％的过氧化氢，但一般市售的产品其活性含量要少两个百分点左右。过氧碳酸钠在水中分解，产生H2O2和Na2CO3，故其水溶液的性质与相应组成的双氧水和碳酸钠的水溶液的性质相同。在碱性溶液中过氧化氢发生以下的化学反应，其反应式如下：H2O2→H++HOO-；2HOO-→O2↑+2OH-，由以上两式可知，生成的过羟基离子HOO-具有氧化作用。在碱性介质中有利于过羟基离子的形成，且pH值对氧化作用影响很大。碳酸钠在水中呈碱性，故过氧碳酸钠溶液在1％～3％浓度时其pH值在10.5～11，这有利于氧化反应的发生。碳酸钠是碱性的，能和油脂中的一些成分反应生成了有去污能力的表面活性剂。当油脂中含有羧酸(比如动物油脂往往会含有硬脂酸(C17H35COOH)时，羧酸可以和碳酸钠发生反应：生成的羧酸的阴离子(R-COO-)，一头是非极性的链烃基R，一头是带电荷的-COO-，使得这样的分子一头是亲水的，一头是亲脂的。在水中，这些“双亲”分子遇到油脂时，亲脂一端会靠近油脂，而亲水的一端会伸到水溶液里，这样形成一个球形，把油脂包裹起来，起到了表面活性剂的作用，使得油脂可以以小液滴的形式存在于水相中(否则油和水是互不相溶的)。在高浓度的过氧化氢(1％以上)作用下，会导致细胞膜的脂质过氧化反应，使膜结构发生改变，膜通透性增加，从而导致细胞膜的破坏。过氧化氢会破坏普通蛋白质分子结构，使DNA分子裂解，但不会对胶原蛋白破坏，反而会增加胶原蛋白羧基/氨基比值，并且在一定程度上促进分子间发生了交联，提高了材料的热收缩温度。
磷酸三钠，是一种无机化合物，化学式为Na3PO4，是无色透明结晶体或白色粉末，易溶于水，具有良好的除油功能。磷酸三钠有一定的螯合能力，能够与油脂中的某些离子结合，起到分散作用。其次，磷酸三钠的碱性带负电，能够与油脂分子表面的阳离子结合，使油分子的表面活化，产生亲水性，从而分散在水中并悬浮起来。此外，磷酸三钠还能与水中的钙镁离子发生反应，防止其产生浑浊和结垢的作用。在食品加工中，磷酸三钠常用于乳制品去除浮油和悬浮物。
三聚磷酸钠，化学式为Na5P3O10，是一种高分子化合物。在三聚磷酸钠的分子中，多个磷酸根离子通过氧原子相互连接形成了一条链。三聚磷酸钠在洗涤剂行业中有着广泛应用，其主要作用是软化水质，润滑纤维，增强洗涤剂的清洁能力。同时，三聚磷酸钠还可以作为食品添加剂，在肉制品和饮料中应用。
焦磷酸钠，无水焦磷酸钠为无色透明晶体或白色粉末。相对密度1.824，熔点880℃。溶于水，不溶于醇，其水溶液呈碱性，易风化，有吸潮性。具有较强的pH缓冲性，对金属离子有一定的螯合作用。无水焦磷酸钠主要用作软水剂，印染漂白助剂，羊毛脱脂剂，锅炉除垢剂，金属离子螯合剂，分散剂，印染和草制品精漂时的助剂。
1％磷酸三钠溶液pH值为11.5～12.1，1％焦磷酸钠溶液pH值为10.0～10.2，而1％三聚磷酸钠溶液pH值为9.5～9.8。
Triton X-100中文名为曲拉通X-100或聚乙二醇叔辛基苯基醚，是一种常用的非离子型的表面活性剂(nonionic surfactant)或去垢剂(detergent)。Triton X-100是一种不变性的相对温和的去垢剂，可溶解脂质，以增加细胞膜通透性，所以常用于脱脂及细胞裂解液中。
以上多种成分的处理液组合，在处理过程中，除了原配方成分外，还会在使用中生成碳酸钠、过氧化氢、活性氧，在处理过程中，磷酸盐及不断生成的碳酸钠，溶液PH不断升高，介于10-11区间，这种动态PH变化，又促进了过碳酸钠分解，不断产生活性氧，活性氧的产生及较高的PH，在达到处理效果的同时，溶液不会滋生微生物，不会增加新的污染风险。
磷酸盐(磷酸三钠、三聚磷酸钠或焦磷酸钠)、碳酸钠、TritonX-100共同发挥脱脂作用；
过氧化氢、TritonX-100共同发挥破细胞的作用；
过氧化氢在脱细胞、DNA分子裂解、杂蛋白破坏清除方面发挥作用。
重复以上处理过程或延长处理时间，有利于强化溶液处理效果。
过氧化氢(H2O2)是一种强氧化剂，可以氧化细菌和病毒的蛋白质和核酸，使其失去生物活性，从而达到消毒的效果。具体来说，双氧水进入细胞后会与细胞内的酶和蛋白质反应，产生自由基(OH-)和单质氧(O)。这些自由基和单质氧会破坏细胞内的有机物质，包括细胞膜、蛋白质、核酸等，从而导致细胞死亡。过氧化氢可使细菌细胞的分子或原子发生电离，引起细胞壁上的脂链断裂，从而破坏细胞壁，造成细胞膜的渗透压和通透性改变，内容物漏出，引起细胞死亡。过氧化氢进入菌体后可与核酸中金属离子或大分子上转换型金属离子反应，产生毒性OH基，作用于DNA的磷酸二酯键而使其断裂，并对DNA的四种碱基成分有破坏作用。过氧化氢具有杀菌作用快、杀菌能力强、杀菌谱广、刺激性小、腐蚀性低、容易气化不留有毒性等优点。
过氧化脲(过碳酰胺)，英文名称：Ureaperoxide，CAS号：124-43-6，分子式：CH6N2O3，相对分子质量：94.07，热分解温度：45℃，熔点：75～85℃，堆积密度：0.5～0.8g/cm3，外观为白色结晶粉末，无毒无气味，理论活性氧含量16.0％，H2O2含量35.0％，易溶解于水，水溶液兼有尿素和双氧水的性质。过碳酰胺是尿素和过氧化氢所形成的加和物，外观为白色结晶粉末，无毒无气味，理论活性氧含量16.0％，H2O2含量35.0％，易溶解于水溶液，兼有尿素和双氧水的性质。尿素的氨基既能中和过氧化氢的酸性，又克服了过氧化氢作为一种液体储运困难的缺点。过碳酰胺在水溶液中分解生成过氧化氢、脲、二氧化碳和氨等，其漂白活性成分是过氧化氢。据报道10％～15％过碳酰胺分解成7％～10％的尿素和3％～5％的过氧化氢。不同品牌的产品过氧化物含量略有差异。其它几种无机过氧化物相比，过碳酰胺具有活性氧值高，水溶液pH值低，稳定性好，溶解度大，释氧速度慢，作用时间长，用后无残余毒性。
氢氧化钠已被证明可有效灭活脂质包膜病毒，如人类免疫缺陷病毒和伪狂犬病病毒。已经有两种利用其有效性的技术被确定为可能适用于猪粪中非洲猪瘟病毒ASFV的灭活：一种是热处理，另一种是用碱性化学品，特别是氢氧化钠或氢氧化钙。这些方法相对容易，而且便宜，并且处理过的浆料(特别是在热处理后)可以用通常的方式处理。发现ASFV可被Ca(OH)2在1％和30％(w/v)下在4℃和22℃下30分钟内灭活；NaOH在22℃下1％，0.5％和0.2％(w/v)有效，在4℃下1％和0.5％(w/v)有效，0.2％在该温度下无效。
病毒灭活：根据我国现行法规，动物源性医疗器械总降低系数宜达到6logs以上(即病毒数量下降到进行灭活前数量的百万分之一以下)。若采用多步不同灭活原理的病毒灭活工艺，应分别进行病毒灭活效果验证，并保证对于每一类指示病毒，原则上需至少有一步病毒灭活工艺的降低系数应达到4logs以上(如因检测方法的灵敏度造成检测出的病毒降低系数接近但小于4logs时，应盲传三代，如无病毒检出，亦可认为是有效地灭活病毒步骤)；根据产品的特性及所采用的病毒灭活工艺，至少应选择四类指示病毒，包括有包膜RNA病毒、有包膜DNA病毒、无包膜RNA病毒、无包膜DNA病毒，并且其中至少应包含一种对物理和/或化学处理有明显抗性的病毒。非包膜病毒——由蛋白质衣壳和核酸内芯组成核衣壳。对于非包膜病毒来说，这个蛋白质衣壳就是病毒用于连接宿主细胞的工具。
非包膜病毒——由蛋白质衣壳和核酸内芯组成核衣壳。对于非包膜病毒来说，这个蛋白质衣壳就是病毒用于连接宿主细胞的工具。以流感病毒、冠状病毒等为代表的包膜病毒——不仅具有核衣壳，而且核衣壳外还包裹有一层脂质膜，这些脂质可以帮助病毒牢固地粘附在其靶宿主细胞上。
牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)属于一种牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheavirus,BVDV)所造成的急性、热性传染病。有研究通过对过氧化氢完全灭活BVDV NADL病毒液的浓度、时间及温度的最优条件的摸索，及细胞水平、分子水平上的验证的结果显示：牛病毒性腹泻病毒在27℃、2h的条件下被3％的过氧化氢完全灭活。过氧化氢可以将DNA和RNA分解为单独的碱基，从而杀死病毒。
病毒灭活复合液1：过碳酸钠、过碳酰胺、过氧化氢组合。
作用：病毒灭活、脱脂、去杂蛋白、去除残留DNA。
为了强化过氧化氢病毒灭活效果，我们对病毒灭活复合液1配方进行了设计；过碳酸钠、过碳酰胺、过氧化氢组合，通过在溶液中不同稳定性的三种成分组合。其中过碳酸钠分解生成碳酸钠和过氧化氢，碳酸钠使溶液PH处于9-11区间，促进过氧化氢分解，同时又有脱脂、协助包膜病毒溶解破坏的作用；过碳酰胺在水溶液中分解生成过氧化氢和尿素。尿素可以破坏杂蛋白质二级结构，可以结合更多的水。无尿素情况下疏水基团包裹在蛋白质三级结构内部，尿素和蛋白争夺氢键破坏水化层，蛋白变性展开，增大了接触面积，当然尿素浓度继续上升的话，会导致蛋白沉淀出来的。一旦蛋白质逐渐展开，水和尿素就可以更容易地进入蛋白质的疏水内核，从而加快变性过程。尿素还可以通过影响蛋白质所浸入的溶剂的属性来间接使蛋白质变性。通过改变溶剂本身的结构和流体动力学，类似于将非极性溶质放入混合物中，尿素会促进内部键的不稳定。通过改变溶剂本身的结构和流体动力学，类似于将非极性溶质放入混合物中，尿素会促进内部键的不稳定。已有研究表明，一定浓度尿素的加入会降低胶原蛋白的变性温度，尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性，变性后，蛋白质的肽链就伸展开来，当加入3mol/L的尿素溶液时，胶原蛋白的变性温度从67℃降低至53℃。高浓度(8-10mol/l)的尿素会使蛋白质变性溶解；而在室温下4～6mol/l尿素可使球状蛋白质变性，通常增加变性剂浓度可提高变性程度，通常8mol/l尿素可以使蛋白质完全转变为变性状态。
因此，适当控制尿素的用量，可以在不破坏胶原蛋白基本结构的前提下，使胶原蛋白中的杂蛋白更好的溶出分离。因为胶原蛋白以膜的形态存在，而杂蛋白通常在膜的空隙中，或者通过氢键作用结合在胶原蛋白上，这种结合作用力较弱，通过对过碳酰胺添加量，控制溶液中尿素的浓度，既可以使杂蛋白变性或解除与胶原蛋白的结合，容易去除，同时对胶原蛋白较小的影响。
以上病毒灭活组合成分在水中有不同稳定性，过碳酸钠在水中溶解，快速释放出碳酸钠和过氧化氢，碳酸钠使溶液PH快速上升到9-11区间，加速了过氧化氢解离出活性氧，维持活性氧在溶液中的浓度；同时过碳酰胺也在高PH环境中加速分解，进一步提高了过氧化氢的浓度，根据计算20％过碳酰胺分解成13.3％的尿素和6.7％的过氧化氢；在全部分解的前提下13.3％的尿素折合2.2mol/L，5％过碳酰胺分解尿素折合0.55mol/L；这种浓度范围内，对比较稳定的胶原蛋白结构不会造成明显破坏，但对杂蛋白会有较好的溶解破坏效果；按3％过碳酸钠，20％过碳酰胺，3％的过氧化氢计算，理论上三种组合溶液中过氧化氢含量可以达到10.7％，但实际上可能不会超过10％；按1％过碳酸钠，5％过碳酰胺，3％的过氧化氢计算，理论上三种组合溶液中过氧化氢含量可以达到5％。
病毒灭活复合液2：氢氧化钠/磷酸钠盐(磷酸三钠/焦磷酸钠/三聚磷酸钠，其中一种、两种或三种组合)组合。
作用：病毒灭活、脱脂、脱杂蛋白、去除残留DNA、去重金属。
氢氧化钠溶液具有病毒杀灭作用，杀灭效果与浓度在一定范围内呈正相关性，磷酸三钠、焦磷酸钠或三聚磷酸钠，可以协助破坏病毒脂质包膜，可以起到辅助脱脂效果。一项研究对携带病毒的动物骨修复材料经过2M NaOH溶液浸泡，分别于0min、5min、10min、15min、30min取样，进行产品滴度检测和敏感细胞培养检测，确定各时间点病毒灭活效果。携带病毒的生物膜材料则经过2M NaOH溶液浸泡，于30min取样，进行产品滴度检测。结果PRV、VSV、PPV和EMCV四种指示病毒滴度下降均达到4个Log评价指标。有效的杀灭朊毒体方法包括焚化、高压消毒132℃持续1h、5％次氯酸钙或1mol/L氢氧化钠60min浸泡等，WHO(世界卫生组织)推荐1mol/L氢氧化钠处理动物组织废料，可杀灭绝大部分病原体。磷酸钠盐与铁、铜、镍重金属离子、碱金属离子形成稳定的水溶性络合物，可以去除可能存在的重金属残留。
膜材料冻干，是一个高能耗过程，采用接近常温的干燥成型方式，不仅可以节约能源，所制备出的材料具有更好的物理及降解性能。
辐照灭菌是当前普遍的灭菌方式，但辐照灭菌对胶原蛋白产品物理及降解性能影响太大；环氧乙烷灭菌方式不会对胶原蛋白产品造成前述不良影响，对于多孔材料，环氧乙烷是一种适合的灭菌方式。
对黄牛心包按照以上设计中优选的处理方案，对材料进行处理，并对各步处理后材料进行缓冲，缓冲后干燥至恒重，0.2g/ml纯化水浸提24小时，检测浸提液蛋白总量及羟脯氨酸含量，并按13.4％(羟脯氨酸算是胶原蛋白的特征氨基酸，一般羟脯氨酸的含量为13.4％)的比例换算成胶原蛋白，结果如下表1。
表1
通过以上结果可见，经过脱细胞复合溶液处理，产品中杂蛋白含量快速下降，各个步骤的处理，对胶原蛋白的破坏较小，浸提液中胶原蛋白比例占蛋白总量的比例较低；蛋白总量检测方法灵敏度相对羟脯氨酸较低，因此出现了病毒灭活复合液后二者检测结果不匹配的情况。
对牦牛心包材料进行清洗，按照以上设计中优选的处理方案，对材料进行处理，并对各步处理后材料进行干燥脱水，进行如下检测观察，结果如下表2。
表2
对黄牛皮材料进行化学法/机械法初步脱毛/脱脂/去筋膜处理，按照以上设计中优选的处理方案，对材料进行处理，并对各步处理后材料进行干燥脱水，进行如下检测观察，结果如下表3。
表3
通过以上两种不同来源的胶原蛋白原料进行处理，检测结果可见，脱细胞复合溶液脱脂效果非常理想，首次处理后快速下降，二次处理后已经下降到极低水平；脱细胞效果明显，在经过脱细胞复合溶液二次处理后，已经达到可以接受的水平；通过这两种材料处理可见，该脱细胞方法对于不同材料具有接近的处理效果，表明该处理方法是一种普遍通用的脱细胞、脱脂处理方法。
对黄牛皮材料进行化学法/机械法，初步脱毛/脱脂/去筋膜处理，按照以上设计中优选的处理方案，对材料进行干燥成型，进行如下检测观察，结果如下表4。
表4
通过不同方法成型的产品，干燥成型的产品力学性能远大于冻干方法；环氧乙烷灭菌对材料的破坏明显低于辐照灭菌；干燥成型+EO灭菌对材料的力学性能保持更为显著。
实施例1
本实施例提供一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法：
(1)破细胞除杂蛋白
取冷冻的新鲜牛心包，解冻，人工去掉筋膜；称重，膜与液体重量体积比1：15；3％NaCl浸泡去除杂蛋白，常温1小时；捞出产品，去除水分，置于纯化水中浸泡2小时。
(2)脱脂/脱细胞/除杂蛋白/除DNA
3％过碳酸钠，2％三聚磷酸钠，2％Triton-X100，余量纯化水，测PH；搅拌或震荡，25℃以下18小时；刮板排除水分，换液，4小时。用刮板排除水分，泡沫用纯化水冲洗干净；0.4mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时；
3％过碳酸钠，0.5％磷酸钠，0.5％Triton-X100，余量纯化水，测PH，搅拌或震荡，25℃以下18小时。
(3)病毒灭活
捞出产品，泡沫用纯化水冲洗干净。排除水分，置于0.4mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时，转入洁净区；
5％过碳酸钠，10％过碳酰胺，3％过氧化氢，余量纯化水，浸泡3小时；结束后用纯化水冲洗，0.4mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡，PH接近7；
8％氢氧化钠，1％焦磷酸钠，余量纯化水，浸泡2小时；纯化水清洗，0.5mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡2小时，换缓冲液过夜；
注射用水清洗，产品排水后放入0.4mol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾中，静置2小时。
(4)产品定型
35℃鼓风干燥4.5小时，得到厚度均匀的膜片。
(5)分切包装
用合适的工具或设备，把产品切割成1cm*2cm-10cm*10cm大小。
(6)产品灭菌
按确定的灭菌工艺对产品进行环氧乙烷灭菌。
实施例2
本实施例提供一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法：
(1)破细胞除杂蛋白
取冷冻的新鲜牛皮，解冻，用剖层设备去除筋膜、肌肉及毛发；用碳酸钠溶液发泡，用精密剖层设备切割剖层，厚度控制在0.6-1.2区间；0.5mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中调节PH至中性；
称重，膜与液体重量体积比1：10；5％NaCl浸泡去除杂蛋白，常温3小时；捞出产品，去除水分，置于纯化水中浸泡2小时。
(2)脱脂/脱细胞/除杂蛋白/除DNA
3％过碳酸钠，0.5％磷酸钠，1％Triton-X100，余量纯化水，测PH；搅拌或震荡，25℃以下18小时；刮板排除水分，换液，4小时。用刮板排除水分，泡沫用纯化水冲洗干净；0.2mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡2小时；
3％过碳酸钠，0.5％焦磷酸钠，1.2％Triton-X100，余量纯化水，测PH，搅拌或震荡，25℃以下18小时。
(3)病毒灭活
捞出产品，泡沫用纯化水冲洗干净。排除水分，放0.4mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时，转入洁净区；
2％过碳酸钠，15％过碳酰胺，2％过氧化氢，余量纯化水，浸泡3小时；结束后用纯化水冲洗，PH6.0磷酸盐缓冲液(钠)中浸泡，PH接近7；
6％氢氧化钠，4％磷酸钠，余量纯化水，浸泡2小时；纯化水清洗，0.3mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡2小时，换缓冲液过夜；
注射用水清洗，产品排水后放入0.4mol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾中，静置2小时。
(4)产品定型
40℃鼓风干燥3小时，得到厚度均匀的膜片。
(5)分切包装
用合适的工具或设备，把产品切割成2cm*3cm-8cm*10cm大小。
(6)产品灭菌
按确定的灭菌工艺对产品进行环氧乙烷灭菌。
实施例3
本实施例提供一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法：
(1)破细胞除杂蛋白
取新鲜猪小肠，用食盐和碳酸钠进行初步脱油脱脂处理，用工具处理得到厚度均匀的小肠下层粘膜材料；
称重，膜与液体重量体积比1：15；4％NaCl浸泡去除杂蛋白，常温1小时；捞出产品，去除水分，置于纯化水中浸泡2小时。
(2)脱脂/脱细胞/除杂蛋白/除DNA
3％过碳酸钠，0.8％焦磷酸钠，0.8％Triton-X100，余量纯化水，测PH；搅拌或震荡，25℃以下18小时；刮板排除水分，换液，4小时。用刮板排除水分，泡沫用纯化水冲洗干净；0.3mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液浸泡大于1小时；
3％过碳酸钠，0.5％磷酸钠，1％Triton-X100，余量纯化水，测PH，搅拌或震荡，20℃以下18小时。
(3)病毒灭活
捞出产品，泡沫用纯化水冲洗干净；排除水分，置于0.4mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液浸泡1小时；转入洁净区；
5％过碳酸钠，12％过碳酰胺，1％过氧化氢，余量纯化水，浸泡3小时；结束后用纯化水冲洗，置于0.5mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡，PH接近7；
10％氢氧化钠，3％三聚磷酸钠，余量纯化水，浸泡2小时；纯化水清洗；0.3mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时，换缓冲液过夜；
注射用水清洗，产品排水后置于0.3mol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾中，静置2小时。
(4)产品定型
45℃鼓风干燥1小时，得到厚度均匀的膜片。
(5)分切包装
用合适的工具或设备，把产品切割成1cm*2cm-6cm*7cm大小。
(6)产品灭菌
按确定的灭菌工艺对产品进行环氧乙烷灭菌。
实施例4
本实施例提供一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法：
(1)破细胞除杂蛋白
取冷冻的新鲜猪皮，解冻，用剖层设备去除筋膜、肌肉及毛发；用去油脂机切掉油脂，用碳酸钠复合脱脂液发泡，用精密剖层设备切割剖层，厚度控制在0.5-1.2区间；磷酸盐缓冲液调节PH至中性；
称重，膜与液体重量为1：10；4％NaCl浸泡去除杂蛋白，常温3小时；捞出产品，去除水分，置于纯化水中浸泡2小时。
(2)脱脂/脱细胞/除杂蛋白/除DNA
3％过碳酸钠，0.8％磷酸钠，1.5％Triton-X100，余量纯化水，测PH；搅拌或震荡，25℃以下18小时；刮板排除水分，换液，4小时；用刮板排除水分，泡沫用纯化水冲洗干净；0.5mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡大于1小时；
3％过碳酸钠，1％磷酸钠，1.8％Triton-X100，余量纯化水，测PH，搅拌或震荡，25℃以下18小时。
(3)病毒灭活
捞出产品，泡沫用纯化水冲洗干净；排除水分，置于0.2mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时，转入洁净区；
3％过碳酸钠，15％过碳酰胺，3％过氧化氢，余量纯化水，浸泡3小时；结束后用纯化水冲洗，0.3mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡，PH接近7；
8％氢氧化钠，2％磷酸钠，2％焦磷酸钠，余量纯化水，浸泡2小时；纯化水清洗，0.5mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时，换缓冲过夜；
注射用水清洗，产品排水后放入0.2mol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液中中，静置2小时。
(4)产品定型
42℃鼓风干燥3小时，得到厚度均匀的膜片。
(5)分切包装
用合适的工具或设备，把产品切割成1cm*2cm-6cm*10cm大小。
(6)产品灭菌
按确定的灭菌工艺对产品进行环氧乙烷灭菌。
实施例5
本实施例提供一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法：
(1)破细胞除杂蛋白
取冷冻的新鲜猪心包，解冻，用工具去除筋膜组织，修剪成合适的大小；
称重，膜与液体的重量体积比1：20；4％NaCl浸泡去除杂蛋白，常温1小时；捞出产品，去除水分，置于纯化水中浸泡1小时。
(2)脱脂/脱细胞/除杂蛋白/除DNA
3％过碳酸钠，0.5％磷酸钠，1％Triton-X100，余量纯化水，测PH；搅拌或震荡。25℃以下18小时；刮板排除水分，换液，浸泡4小时。用刮板排除水分，泡沫用纯化水冲洗干净；0.3mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中大于2小时；
2％过碳酸钠，0.5％三聚磷酸钠，0.8％Triton-X100，余量纯化水，测PH，搅拌或震荡，25℃以下18小时。
(3)病毒灭活
捞出产品，泡沫用纯化水冲洗干净。排除水分，放0.4mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时，转入洁净区；
3％过碳酸钠，12％过碳酰胺，3％过氧化氢，余量纯化水，3小时；结束后用纯化水冲洗，0.4mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡，PH接近7；。
10％氢氧化钠，2％焦磷酸钠，1％三聚磷酸钠，余量纯化水，浸泡2小时，10℃；纯化水清洗，0.5mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中浸泡1小时，换缓冲过夜；
注射用水清洗，产品排水后放入0.1mol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾中，静置2小时。
(4)产品定型
38℃鼓风干燥2.5小时，得到厚度均匀的膜片。
(5)分切包装
用合适的工具或设备，把产品切割成1cm*2cm-6cm*8cm大小。
(6)产品灭菌
按确定的灭菌工艺对产品进行环氧乙烷灭菌。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将新鲜的动物膜组织进行初步处理，然后依次浸泡于NaCl溶液和纯水中；
(2)使用脱细胞复合液对步骤(1)得到的组织至少处理两次；
(3)依次使用第一病毒灭活复合液和第二病毒灭活复合液对步骤(2)得到的组织进行处理；
(4)对步骤(3)得到的组织进行定型和灭菌处理；
所述脱细胞复合液按重量百分含量计包括如下组分：1-5％过碳酸钠、0.5-2％磷酸盐、0.5-2％Triton-X100，余量为纯化水；
所述第一病毒灭活复合液按重量百分含量计包括如下组分：1-5％过碳酸钠、5-20％过碳酰胺、1-5％过氧化氢，余量为纯化水；
所述第二病毒灭活复合液按重量百分含量计包括如下组分：3-10％氢氧化钠，1-5％磷酸盐，余量为纯化水。
2.根据权利要求1所述的天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法，其特征在于，所述初步处理的步骤包括：用设备或器械去除筋膜、肌肉及毛发。
3.根据权利要求1所述的天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法，其特征在于，所述NaCl溶液的浓度为2-5％。
4.根据权利要求1所述的天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法，其特征在于，所述磷酸盐选自磷酸三钠、焦磷酸钠、三聚磷酸钠中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法，其特征在于，采用鼓风干燥进行定型，所述鼓风干燥的温度为28-50℃。
6.根据权利要求1所述的天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法，其特征在于，采用环氧乙烷灭菌。
7.一种天然胶原蛋白脱细胞基质材料，其特征在于，其由权利要求1-6中任一项所述的方法制成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311648485.0A CN117547652B (zh) | 2023-12-04 | 一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311648485.0A CN117547652B (zh) | 2023-12-04 | 一种天然胶原蛋白基质材料脱细胞方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117547652A CN117547652A (zh) | 2024-02-13 |
| CN117547652B true CN117547652B (zh) | 2024-07-16 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102781485A (zh) * | 2009-10-07 | 2012-11-14 | 克雷西斯公司 | 用于创伤护理和/或其它组织愈合应用的支架材料 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102781485A (zh) * | 2009-10-07 | 2012-11-14 | 克雷西斯公司 | 用于创伤护理和/或其它组织愈合应用的支架材料 |
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