KR20120127443A - 스테비오시드로부터의 스테비올의 효소적 제조 방법 - Google Patents

스테비오시드로부터의 스테비올의 효소적 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펙티나제 또는 사이톨라제 PCL5(등록상표)를 함유하는 시판중인 효소 혼합물을 사용하여 스테비오시드로부터의 글리코시드 잔사를 분열하여 스테비올을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 방법에서, 반응을 효모 배양물의 존재하에 수행한다. 또한 헬릭스 포마티아 효소 및 사이톨라제 PCL5(등록상표)의 조합이 기술된다.

Description

스테비오시드로부터의 스테비올의 효소적 제조 방법{PROCESS FOR THE ENZYMATIC PREPARATION OF STEVIOL FROM STEVIOSIDE}
본 발명은 펙티나제, 사이톨라제(CYTOLASE) PCL5(등록상표)를 함유하는 시판중인 효소 혼합물을 사용하여 스테비오시드로부터의 글리코시드 잔사를 분열하여 스테비올을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 바람직한 방법에서, 반응을 효모의 존재하에 수행한다.
스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)는 단맛이 나는 화합물, 즉 주로 무칼로리 감미료로서 사용되는 스테비오시드 및 레바우디오시드 A를 함유한다. 스테비올은 이러한 화합물의 아글리콘 유도체이다. 스테비올은 인지적 작용을 향상시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 국제특허출원공개 제2009/071277호 참조(디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.(DSM IP ASSETS B.V.)).
스테비오시드로부터의 스테비올의 제조는 어렵다. 스테비오시드의 산 가수분해는 산 조건하에 제조된 스테비올이 이소스테비올로 재배열되는 고질적인 문제가 존재한다. 일부 문헌은 스테비올을 이 방법을 통해 수득할 수 없음을 보고하였다(문헌[Kohda et al 1976 Phytochemistry 15: 981-983]).
나트륨 페리오데이트를 사용하여 스테비오시드를 분열하여 스테비올을 제조하는 다른 방법은 문헌[Ogawa et al 1980; Tetrahedron 36: 2641-2648]에 의해 기술되었다. 그러나, 이 방법은 유용한 수율을 달성하기 위해 과량의 값비싼 나트륨 페리오데이트(약 10 mol 당량 초과) 및 고도로 희석된 시스템을 필요로 한다. 따라서, 이 방법은 많은 양의 스테비올을 생성하는데 있어서 경제적이지 않다.
약간의 효소-기반된 방법이 기술되었다.
문헌[Bridel et al 1931 Bull. Soc. Chimie Biol. 13: 781-96]은 스테비오시드가 다양한 "발효 생성물" 예를 들어 에멀신, 람노디아스타제(rhamnodiastase), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 또는 침연(macerating)되고 공기 건조된 바닥 발효 효소에 의해 가수분해되지 않음에 주목한다. 저자들은 달팽이(헬릭스 포마티아(Helix pomatia))로부터의 디아스타제를 사용하여 성공하였다. 그러나, 그들은 동물 1 마리당 "겨우 0.5 ㎤의 순수 소화액"을 수득하였고, 따라서, 대량 생산에 적합하지 않다. 문헌[Mosettig et al, 1955 J. Org. Chem. 20: 884-899]은 또한 소량의 스테비올(0.5 g 미만)을 제조하기 위해 "효소액" 및 "무수 제제"로서 지칭되는 달팽이 효소제를 사용하는 글루코시드의 효소적 가수분해를 사용하였다. 어떠한 효소의 추가의 특징도 주어지지 않았다.
코다(Khoda) 등의 상기 문헌은 다른 저자들이 스테비오시드로부터 스테비올을 생성하기 위해 조질 헤스페리디나제를 사용했지만, 이것이 반복되었을 때, 레바우디오시드 B 및 글루코스가 목적한 스테비올보다 오히려 더 수득되었음을 보고하였다.
문헌[Ruddat et al 1965 Arch. Biochem. Biophys. 110: 496-499]; 문헌[Gianfagna et al. 1983 Phytochemistry 22(2): 427-430] 및 문헌[Pezzuto et al. 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2475-2482]은 각각 다양한 상업적인 펙티나제(각각, 롬 앤드 하스(Rohm & Haas)로부터의 "펙티놀(Pectinol) 59L"; 코닝 바이오시스템스(Corning Biosystems)로부터의 "펙티놀 50L"; 롬 앤드 하스로부터의 "펙티놀 AC")를 사용하는 절차를 기술하였다. 문헌[Davis et al, 1992 Phytopathology 82: 1244-50]은 "펙티놀 59L"이 더 이상 시판중이지 않고, 다른 펙티놀이 여전히 시판되는지 여부는 명백하지 않다고 보고하였다.
상업적인 대규모 생산을 위해 적합한 스테비오시드로부터 스테비오를 제조하는 효율적인 방법에 대한 요구가 있다.
본 발명에 따라서, 시판중인 효소제인 사이톨라제 PCL5(등록상표)가 스테비오시드를 분열하여 스테비올을 제조할 수 있고, 효율적이고 상업적으로 실현가능한 방법에 사용될 수 있음이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 일 양상은 (a) 스테비오시드를 사이톨라제 PCL5(등록상표) 효소제와 접촉하는 단계, 및 (b) 스테비올을 회수하는 단계를 포함하는 스테비올의 제조 방법이다.
또한, 분열하는 동안 배출된 당(글루코스)이 상기 효소적 반응을 억제할 수 있음이 발견되었다. 따라서, 상기 반응이 효모의 존재하에 발생하는 것이 바람직하다. 효모는 생성된 글루코스를 제거할 수 있고, 따라서 효소적 반응은 아무런 방해를 받지 않고 진행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 (a) 스테비오시드를 생 효모 배양의 존재하에 사이톨라제 PCL5(등록상표) 효소제와 접촉하는 단계, 및 (b) 스테비올을 회수하는 단계를 포함하는 스테비올의 제조 방법이다.
본 명세서에 걸쳐, 화합물명 뒤에 나타나는 숫자는 하기 도면에 예시된 바와 같은 화합물을 나타낸다.
도 1은 레바우디오시드 A 및 스테비오시드의 가수분해를 나타낸다.
도 2는 헬릭스 포마티아 효소 및 펙티나제에 의한 스테비오시드의 가수분해를 나타낸다.
"사이톨라제 PCL5"는 디에스엠 푸드 스페셜티스(DSM Food Specialties, 네덜란드 델프트 소재)에서 시판중인 효소제이다. 이는 아스페르길루스 니거의 선택된 GRAS 균주로부터 수득된 효소의 혼합물이고, 펙티나제 및 헤미셀룰라제를 포함한다. 이는 일반적으로 갈락투론산의 낮은 함량을 갖는 즙을 생산하고, 과일즙 제제를 투명하게 하기 위해 사용되었지만, 다른 용도가 또한 보고된다:
· 이것의 β-D-글루코시다제 활성은 와인 및 샴페인의 제조에서 사용될 수 있다(국제특허출원공개 제1998/38316호 참조);
· 이것의 β-글루코시피라노시다제 및 α-람노시다제 활성은 스테로이드 글리코시드를 가수분해하여 데스글루코데스람노루스신을 제조하기 위해 사용될 수 있다(미국특허 제6,911,325호 참조).
"효모"는 사카로미세스 세레비스시애(Saccharomyces cerevisceae), 사카로미세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 또는 효모가 이산화탄소 및 에탄올로 글루코스를 전환할 수 있는 조건을 갖는 공지된 기술을 사용하는 대규모의 발효에서 사용될 수 있는 다른 효모 종을 나타낸다.
이 반응을 위한 스테비오시드 출발 물질은 정제되거나 단리된 형태로 존재할 필요는 없다. 바람직한 양태에서, 그들은 스테비오시드, 예를 들어 스테비아 종(Stevia sp .) 추출물, 더욱 바람직하게는 스테비아 레바우디아나 추출물을 함유하는 식물 추출물에 존재한다. 분열할 수 없는 스테비오시드 성분이 또한 추출물에 존재할 수 있다. 바람직한 스테비아 추출물은 고농도의 스테비오시드 및 저농도의 분열할 수 없는 스테비오시드, 예컨대 반응 시간의 과정에 걸쳐 축적되고 방법을 덜 효율적으로 만드는 레바우디오시드 A를 함유한다. 추출물 중 스테비오시드를 위한 바람직한 농도는 전체 스테비오시드의 50% 이상, 바람직하게는 90중량% 초과이다(고함량의 스테비오시드는 쉽게 구입할 수 있음).
정확히 어떠한 효소가 스테비오시드로부터의 당을 분열하여 스테비올을 제조하는 반응을 매개하기에 적합한지는 불분명하다. 예를 들어, 일부 펙티나제는 적합할 수 있지만, 다른 것은 아닐 수 있고; 유사하게, 일부 β-글루쿠로니다제는 적합할 수 있지만, 다른 것은 아닐 수 있다. 따라서, 다수의 효소 및 효소 혼합물을 적합성을 결정하기 위해 조사하였다. 수많은 시험된 것들 중, 다수의 생성된 것들은 심지어 4일 항온 처리 후에도 반응을 야기하지 않았다. 적어도 부분적인 성공을 하기 효소로 수득하였다:
헬릭스 포마티아(Helix pomatia)로부터의 β-글루카나제(플루카(FLUKA) 49103);
헬릭스 포마티아로부터의 β-글루쿠로니다제 유형 H-3(시그마(SIGMA) G8885);
헬릭스 포마티아로부터의 β-글루쿠로니다제 유형 H-2(시그마 G0876);
헬릭스 포마티아로부터의 β-글루쿠로니다제 유형 HP-2(시그마 7017);
아스페르길루스 니거로부터의 펙티나제(시그마 PS4716);
아스페르길루스 아쿨레아투스로부터의 펙티나제(시그마 P2611);
헬릭스 포마티아 유형 H-1로부터의 설파타제(시그마 S9626);
사이톨라제 PCL5(등록상표)(디에스엠).
많은 효소 중, 사이톨라제 PCL5(등록상표)가 좋은 활성을 갖고, 시판중이고, 따라서 본 발명의 바람직한 효소인 것으로 밝혀졌다.
또한, 효소가 스테비올(수용성이 아님)이 아닌 분열된 글루코스의 생성에 의해 피드백 억제의 적용을 받음에 유의한다. 따라서, 작은 규모의 스테비올 생산이 다른 반응물의 부재하에, 스테비오시드와 함께 사이톨라제 PCL5(등록상표)를 항온처리함으로써 가능할 수 있지만, 이는 글루코스 축적 때문에 대규모 생산을 위한 가장 바람직한 방법이 아닐 수 있다.
그러나, 본 발명에 따라서, 그것은 글루코스가 이산화탄소 및 에탄올로 전환될 때까지 최대 40℃에서 효모를 사용하는 발효에 의해 효소적 활성이 거의 처음 활성까지 회복되었음이 발견되었다. 이 공정은 지금까지 불가능했던, 스테비올의 대규모 생산을 위해 적합한 산업적인 수준까지 확대될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 효모 발효 조건하에, 스테비오시드 또는 레바우디오시드를 효모 배양물의 존재하에 사이톨라제 PCL5(등록상표)와 접촉하는 단계, 및 생성된 스테비올을 회수하는 단계를 포함하는 스테비올의 상업적인 규모의 제조를 위한 방법이다.
필요에 따라, 발효 단계 후, 남아있는 스테비오시드, 예를 들어 스테비아 추출물에 존재하는 것의 선택적인 추가 효소적 가수분해가 스테비올의 양을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 효소제가 효모 배양물보다 더 높은 온도에서 안정하므로, 이 효소적 가수분해 단계는 효모를 배양하기 위해 사용된 것보다 더 높은 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 온도는 40℃ 초과, 바람직하게는 약 40 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 약 55℃일 수 있다. 기질에 의한 효소의 잠재적인 억제는 스테비아 추출물의 순차적인 첨가에 의해 피할 수 있고, 따라서, 낮은 수준으로 스테비오시드의 농도를 유지한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 (a) 효모 배양물을 스테비오시드 및 사이톨라제 PCL5(등록상표)와 함께 발효 조건하에서 제공하여 스테비올을 포함하는 배양 배지를 제조하는 단계; 및 (b) 배양 배지에 남아있는 스테비오시드의 적어도 일부분을 고온 조건하에 가수분해하여 스테비올이 강화된 배양 배지를 제조하는 단계를 포함하는, 스테비올의 상업적인 규모의 제조를 위한 방법이다.
스테비올이 강화된 배양 배지가 그 자체로 사용될 수 있거나, 선택적으로, 스테비올이 분리되고, 필요에 따라 정제될 수 있다.
스테비아 추출물의 가수분해 및 글루코스 발효가 동시에 가능하지만, 효모의 t최대가 40℃이기 때문에, 40℃에서의 전체 가수분해율은 순차적인 가수분해 및 발효 보다 더 낮다.
효소의 조합
또한 본 발명에 따라서, 사이톨라제 PCL5(등록상표)(또는 아스페르길루스 니거로부터의 펙티나제(시그마 PS4716) 또는 아스페르길루스 아쿨레아투스로부터의 펙티나제(시그마 P2611)) 및 하기 효소제로 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 효소제의 조합이 단일 효소제의 사용보다 더욱 효율적으로 스테비오시드를 가수분해할 수 있음이 밝혀졌다:
헬릭스 포마티아로부터의 β-글루쿠로니다제 유형 H-3(시그마 G8885);
헬릭스 포마티아로부터의 β-글루쿠로니다제 유형 H-2(시그마 G0876);
헬릭스 포마티아로부터의 β-글루쿠로니다제 유형 HP-2(시그마 7017);
헬릭스 포마티아 유형 H-1로부터의 설파타제(시그마 S9626).
도 2에서 보여진 바와 같이, 헬릭스 포마티아(빈야드 달팽이)로부터의 효소는 스테비오시드(1)를 빠르게 루부소시드(5)로 분열시키고, 천천히 추가로 스테비올모노시드(6) 및 스테비오글루코시드 에스터(7)의 혼합물로 분열시키고, 이어서 천천히 스테비올(3)로 최종 분열시킨다. 이 경향은 효소가 주로 설파타제 또는 글루쿠로니다제 활성을 함유하는지 여부에 상관없이 관찰되었다.
활성 펙티나제 및 사이톨라제는 스테비오시드(1)를 천천히 루부소시드(5)로 분열시키고 이어서 더욱 빠르게 6/7로 가수분해시키고, 최종적으로 스테비올(3)로 가수분해시킨다. 사이톨라제 PCL5(등록상표) 및 활성 펙티나제는 스테비올시드(1)를 유사한 활성을 갖는 스테비올로 분열시킨다. 이 효소가 식품 생산을 위해 허용되었고, 디에스엠으로부터 쉽게 이용가능하므로, 사이톨라제 PCL5(등록상표)가 추가 개발을 위해 사용되었다.
헬릭스 포마티아 유래 효소 및 펙티나제 또는 사이톨라제 PCL5(등록상표)의 혼합물이 단독으로 보다 더 적은 효소를 사용하여 더 빠르게 스테비오시드를 분열하는 것을 발견하였다. 헬릭스 포마티아 효소는 첫번째 가수분해 단계에서 더 빠르게 분열하였다. 펙티나제 및 사이톨라제 PCL5(등록상표)는 다음 가수분해 단계에서 더욱 빠르게 작용하였다.
특히 바람직한 효소 조합은 사이톨라제 PCL5(등록상표) 및 헬릭스 포마티아로부터의 글루쿠로니다제 HP2(시그마 G7017); 및 사이톨라제 PCL5(등록상표) 및 헬릭스 포마티아로부터의 글루쿠로니다제 유형 H2(시그마 G0876)이다.
하기 실시예는 본 발명의 더 나은 설명을 위해 제공된다.
실시예
실시예 1
다양한 효소 및 효소제(총괄하여 이하 "효소"로 지칭함)가 스테비오시드 및 레바우디오시드 A를 분열시켜 스테비올을 생성하는 그들의 능력에 대해 평가되었다. 50 mg의 스테비아 추출물 RV140-54(19%의 레바우디오시드 A, 19%의 스테비오시드[중량%])를 pH 4.1의 5 ㎖의 완충액(0.1 mol/ℓ H3PO4 + NaOH), 50 ㎕의 효소 용액 또는 10 mg의 냉동 건조된 분말(40℃)(렘 1)에 용해되었다. 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
효소의 평가
효소/공급원 스테비올의 형성
셀룰라제 ( Cellulase ) 오노주카(Onozuka) R-10 머크(Merck) 102321 4일 무반응
셀룰라제 아스페르길루스 니거 플루카 22178 4일 무반응
헬릭스 포마티아로부터의 β- 글루카나제 플루카 49103 7일 약간 형성
아몬드로부터의 β- 글루코시다제 플루카 49290 4일 무반응
아스페르길루스 니거로부터의 β- 글루코시다제 플루카 49291 4일 무반응
쌀로부터의 α- 글루코시다제 유형 V 시그마 G9259 4일 무반응
β- 글루쿠로니다제 유형 H-3 헬릭스 포마티아 시그마 G8885 4일 완전 형성
β- 글루쿠로니다제 유형 H-2 헬릭스 포마티아 시그마 G0876 4일 완전 형성
β- 글루쿠로니다제 유형 HP-2 헬릭스 포마티아 시그마 7017 5일 부분적 형성
헤스페리디나제 ( Hesperidinase ) 아스페르길루스 니거 시그마 H8137 4일 무반응
페니실리움 종(Penicillium sp .)으로부터의 헤스페리디나제 시그마 H8510 4일 무반응
펙티나제 리조푸스 종(Rhizopus sp .) 조질 분말 시그마 P2401 4일 무반응
펙티나제 아스페르길루스 니거 플루카 17389 4일 무반응
펙티나제 아스페르길루스 니거 시그마 PS2736 4일 무반응
펙티나제 아스페르길루스 니거 시그마 PS4716 6일 부분적 형성
펙티나제 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus) 시그마 P2611 6일 부분적 형성
설파타제 헬릭스 포마티아 유형 H-1 시그마 S9626 4일 완전 형성
설파타제 파텔라 불가타(Patella vulgata) 유형 IV 시그마 S8504 4일 무반응
*라피다제 ( Rapidase ) 아덱스(ADEX)-P 디에스엠 효소 00075 4일 무반응
*라피다제 AR2000 디에스엠 효소 00071 4일 무반응
*라피다제 프레스(Press) 디에스엠 효소 00072 4일 무반응
*라피다제 TF; 디에스엠 효소 00071 4일 무반응
*글루코 아밀라제( Gluco Amylase ) GA130L 디에스엠 효소 50022 4일 무반응
*사이톨라제 PCL5 디에스엠 효소 00073 7일 부분적 형성
어떠한 효소도 레바우디오시드 A를 분열시킬 수 있고, 따라서 출발 물질로서 사용하기 위한 바람직한 스테비아 추출물은 고수준의 스테비오시드 및 저함량의 레바우디오시드 A를 함유해야 한다.
실시예 2
스테비오시드의 효소적 가수분해에 의한 스테비올
3000 ㎖의 물, 108 ㎖의 사이톨라제 PCL5(등록상표) 및 헬릭스 포마티아로부터의 12 ㎖의 글루쿠로니다제 HP2(시그마 G7017); 16.5 g의 칼륨 다이하이드로겐포스페이트(플루카), 120 g의 스테비오시드 95% "대평(DAE Pyung)"의 용액을 55℃에서 약 1.6 ㎖의 오르토 인산 1 mol/ℓ를 첨가함으로써 pH를 4.2까지 조정하였다.
혼합물을 4일 동안 55℃에서 교반시켰다. HPLC는 스테비올로의 스테비오시드의 가수분해가 거의 완료되었음을 나타냈다.
스테비올의 미세한 슬러리의 온도를 40℃까지 낮췄고, 2.0 g의 무수 효모(건조된 빵 효모)를 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 40℃에서 이산화탄소 방출이 거의 중단될 때까지 교반시켰다. 혼합물을 55℃까지 가열하였고, pH를 약 16 ㎖의 칼륨 하이드록사이드 1 mol/ℓ를 첨가함으로써 4.2까지 조정하였다. 120 g의 스테비오시드 95% "대평"을 혼합물에 첨가하였다. 베이지색 슬러리를 6일 동안 55℃에서 교반시켰다. HPLC는 스테비올(3)로의 스테비오시드(1) 및 중간체(5, 6, 7)의 가수분해가 거의 완료되었음을 나타냈다.
백색 슬러리를 상온까지 냉각시켰고, 흡인여과기에 의해 여과하였다. 젖은 여과 케이크를 3 ℓ 반응 플라스크에서 1시간 동안 상온에서 3000 ㎖의 에틸 아세테이트에 현탁시켰다. 에멀젼을 여과하였고, 200 ㎖의 에틸 아세테이트 "플루카 45760"으로 세척하였다.
유기상을 45분 동안 상온에서 7.5 g의 목탄 노리트(Norit) CA1을 함유한 3 ℓ 반응 플라스크에서 교반시켰다. 흑색 슬러리를 여과하였다. 잔사를 100 ㎖의 에틸 아세테이트로 세척하였다. 투명한 여과액을 진공에서 로터베이퍼에서 진한 슬러리가 수득될 때까지 농축하였다. 현탁액을 여과하였다. 과정을 여과액으로 반복하였다. 여과 케이크를 합하였고, 18시간 동안 진공에서 건조시켰다. 본 발명자는 72.1 g의 스테비올, 백색의 밝은 결정체를 수득하였고, 함량은 98%[a%]이다.
실시예 3
스테비오시드의 효소적 가수분해에 의한 스테비올
500 ㎖의 물, 36 ㎖의 사이톨라제 PCL5(등록상표) 및 20 g의 스테비오시드 95% "대평"의 용액. 혼합물을 4일 동안 55℃에서 교반시켰다. HPLC는 스테비올로의 스테비오시드의 가수분해가 거의 완료되었음을 나타냈다. 스테비올의 침전물을 여과하였고, 물로 세척하였다. 잔사를 진공에서 건조시켰다. 본 발명자는 91% 함량의 7.29 g의 스테비올을 수득하였다.
실시예 4
" 글루쿠로니다제 H2 + 사이톨라제 PCL5 " 및 스테비오시드의 가수분해(효소 혼합물 1:4)
조건:
100 mg의 스테비오시드, 함량 = 98%;
20 ㎕의 β-글루쿠로니다제 유형 H2 헬릭스 포마티아(시그마 G0876);
80 ㎕의 사이톨라제 PCL5(등록상표);
완충액 0.01 mmol/ℓ 포스페이트, pH = 4.2;
48시간; 45℃.
스테비오시드 1 중간체 5*+6*+7* 스테비올 3
1.0% 스테비오시드 29% 15% 47%
1.0% 스테비오시드 + 1.0% 글루코스 60% 27% 13%
*는 도 2에 기재된 화합물 번호를 나타낸다.
효소는 생성물 글루코스에 의해 억제되었다. 클루코스의 제거 없이 글루코스에 의한 효소의 억제는 반응 시간을 연장하고, 최대 농도를 제한할 수 있다.
실시예 5
효모의 영향, 글루코스의 제거
조건:
100 mg의 스테비오시드, 함량 = 98%;
40 ㎕의 β-글루쿠로니다제 유형 H-2 헬릭스 포마티아(시그마 G0876);
160 ㎕의 사이톨라제 PCL5(등록상표);
완충액 0.01 mmol/ℓ 포스페이트, pH = 4.2;
35℃에서 24시간; 50℃에서 71시간.
스테비오시드의 분열에 의해 형성된 글루코스는 효소에 의한 추가 분열을 억제한다. 건조된 빵 효모는 효소에 의한 가수분해에 영향을 주지 않고 글루코스를 성공적으로 제거하였다. 45℃에서 효모가 수 시간 내에 비활성화되므로, 효모 처리는 40℃ 이하에서 행해졌다. 효소는 이산화탄소 및 에탄올로의 글루코스의 전환 후 완전한 활성을 회복하였다. 비록 전체 반응 속도가 순차적인 방법(55℃에서 6일 가수분해 및 40℃에서 1일 발효)보다 더 낮을지라도, 40℃에서 글루코스의 분열 및 발효가 동시에 가능할 수 있다. 데이타는 하기 표 3에 제공된다.
완충액 중 농도 스테비오시드 1 중간체 5*+6*+7* 스테비올 3
1.0% 스테비오시드 1% 글루코스 34% 19% 44%
1.0% 스테비오시드 1% 글루코스 5 mg 무수 효모 5% 2% 84%
*는 도 2에 기재된 화합물 번호를 나타낸다.

Claims (8)

  1. 스테비오시드를 사이톨라제(CYTOLASE) PCL5(등록상표) 효소제와 접촉하는 단계, 및
    스테비올을 회수하는 단계
    를 포함하는, 스테비올의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    스테비오시드가 식물 추출물에 존재하는 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    식물 추출물이 스테비아 종(Stevia sp .) 추출물인 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    스테비아 종 추출물이 많은 양의 스테비오시드를 함유하는 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스테비오시드를 사이톨라제 PCL5(등록상표) 효소제와 접촉하는 단계가 스테비올이 배양 배지에서 생성되는 조건하에, 배양 배지 중 생 효모 배양물의 존재하에 수행되는 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    배양 배지에 남아있는 스테비오시드의 적어도 일부분을 고온 조건하에 가수분해하여 스테비올이 강화된 배양 배지를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    사이톨라제 PCL5(등록상표) 효소제가 또한 아스페르길루스 종(Aspergillus sp.)으로부터의 펙티나제를 포함하는 제조 방법.
  8. (a) 사이톨라제 PCL5(등록상표) 및 헬릭스 포마티아(Helix pomatia)로부터의 글루쿠로니다제 HP2(시그마(Sigma) G7017);
    (b) 사이톨라제 PCL5(등록상표) 및 글루쿠로니다제 유형 H2 헬릭스 포마티아(시그마 G0876); 및
    (c) 헬릭스 포마티아 유래 효소 및 펙티나제 또는 사이톨라제 PCL5(등록상표)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 효소제.
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