CN102796789B

CN102796789B - 甜菊醇转化为甜菊单苷的方法

Info

Publication number: CN102796789B
Application number: CN 201210288492
Authority: CN
Inventors: 李沁桐; 欧阳劲
Original assignee: CHENGDU NANNUOGE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHENGDU NANNUOGE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2032-08-14
Also published as: CN102796789A

Abstract

本发明公开了一种甜菊醇转化为甜菊单苷的方法，属于食品化工领域，其采用黑曲酶I在以蔗糖为糖源的条件下将甜菊醇转化为甜菊单苷。本发明以甜菊醇为原料得到甜菊单苷的转化率≥70%，固形物中甜菊单苷含量至少可达60%，进一步分离纯化后可达80%，甚至可＞90%，甜菊单糖苷的口感无异味，可单独作为甜味剂使用，以此方法生产甜菊单苷成本低，易放大，适用于工业生产。

Description

甜菊醇转化为甜菊单苷的方法

技术领域

本发明属于食品化工领域，具体涉及甜菊醇转化为甜菊单苷的方法。

背景技术

甜菊糖苷(Steviol glycosides)是对甜叶菊提取物的一个总称，其甜味成分包括甜菊苷（Stevioside），莱鲍迪苷A、B、C、D、E（Rebaudioside A/B/C/D/E），甜菊单苷（Steviolmonoside），甜菊双苷（Steviolbioside），杜克苷A（Dulcoside A）等，甜菊糖苷成分的结构式见下。

甜菊单苷（Steviolmonoside，以下简称SM）是甜菊糖苷中甜味成分之一，研究发现其有较强的降血糖生理功效，是新一代的功能性甜味剂。但是SM在甜菊糖苷中的含量远远小于1%，如果通过纯化甜菊糖苷来生产SM，其成本很高，难以大量生产和推广使用。

目前对于甜菊糖苷生物转化的研究多集中在已有分子上加入长糖链。

专利申请CN201110379733.7公开了一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)提高甜菊糖苷味质的方法，其特征在于：用水配制成含2～5％重量的甜菊糖苷和2～5％重量的淀粉的反应液，将酶活为60～70U/ml的β-环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均匀，转移酶的加入量为300～500U/甜菊糖苷重量g，在温度为37～50℃进行转化反应48～72小时。

专利申请201010131126.4公开了种用微波辅助环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方法。该方法以甜菊糖水溶液和淀粉水解液为原料，在微波反应装置中经由微波辐射与CGTase催化的共同作用合成葡萄糖基取代的甜菊糖苷。在本发明提供的工艺条件内，不仅可以显著加快酶催化反应的进行，而且不会产生通常条件下水体系中微波使酶失活的现象。

以上这些方法都是用环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷，但CGTase不能将单一的一个葡萄糖残基加到甜菊糖苷分子上，并且其催化糖链转移到甜菊糖苷上的位置不专一。因此，CGTase的催化产物是复杂的混合物，难以符合美国FDA和欧盟JECFA的标准。

迄今为止，还没有以甜菊醇为原料，通过微生物发酵，以蔗糖为糖基供体进行生物转化生产甜菊单苷的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以甜菊醇为原料，以蔗糖为糖源，通过酶法转化生产甜菊单苷，从而改善其口感的方法。

本发明的技术方案为：甜菊醇转化为甜菊单苷的方法，其采用黑曲酶I在以蔗糖为糖源的条件下将甜菊醇转化为甜菊单苷。

进一步地，甜菊醇转化为甜菊单苷的方法的步骤为：

（1）以重量计，取甜菊醇1份、蔗糖1～6份配制成水溶液。

（2）向步骤（1）得到的水溶液中加入黑曲酶I，在一定条件下反应。

（3）反应完成后，过滤反应液，干燥即得含有甜菊单糖苷的固形物。

进一步地，按重量计，步骤（1）中配制水溶液时加水量为30～50份。

进一步地，步骤（2）中黑曲酶I的添加量按重量计为：甜菊醇︰黑曲酶I＝1600～2000︰1，优选为1800︰1。

进一步地，步骤（2）中的反应条件为：温度30～50度、pH6～8、时间3～7小时。

作为本发明转化方法中的关键因子黑曲酶I，它是从黑曲霉菌CICC 40415（中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏编号：40415）发酵诱导得到的一种特异性糖基转移酶具体的，它是利用下述方法得到的：

（1）挑取黑曲霉菌CICC 40415单克隆，接种至含25ml BMGY培养液的250ml摇瓶中，26～30度，200～300rpm培养至OD600＝2～6(约16～18小时)。将25ml培养基接种至含1LBMGY培养液的2～4L摇瓶中，26～30度剧烈振荡(200～300rpm)，至对数生长期(OD600＝2～6)。

（2）用灭菌离心管，室温2000～3000g离心5min收集细胞，去除上清，用BMMY溶液重悬细胞至OD600＝1.0(2～6L)，分装培养基至几个3～4L隔板摇瓶，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床26～30度继续培养。

（3）每24小时，加甲醇至0.4～0.6%浓度，直至到达最佳诱导时间。室温条件下，2000～3000g离心5min收集细胞。保留上清酶液，置于4度预冷浓缩。使用葡聚糖凝胶按分子量对粗酶分段，其中分子量在65～70kD的酶即为黑曲酶I，存于-80度备用。

优选的，黑曲酶I的制备方法如下：

（1）挑取黑曲霉菌CICC 40415单克隆，接种至含25ml BMGY培养液的250ml摇瓶中，28度，250rpm培养至OD600＝4(约16～18小时)；将25ml培养基接种至含1LBMGY培养液的3L摇瓶中，28度剧烈振荡(250rpm)，至对数生长期(OD600＝4)；

（2）用灭菌离心管，室温2500g离心5min收集细胞，去除上清，用BMMY溶液重悬细胞至OD600＝1.0(2～6L)，分装培养基至几个3～4L隔板摇瓶，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床28度继续培养。

（3）每24小时，加甲醇至0.5%浓度，直至到达最佳诱导时间；室温条件下，2500g离心5min收集细胞。保留上清酶液，置于4℃浓缩。使用葡聚糖凝胶按分子量对粗酶分段，其中分子量在65～70kD的酶即为黑曲酶I，存于-80℃备用。

本方法制得的固形物中甜菊单糖苷含量为60%～70%，采用蔗糖作为原料之一，由于其物理化学性质与甜菊单糖苷差异较大，故反应后还可以采用柱层析和结晶等方式去除未反应的蔗糖以及反应后的果糖。当固形物中去除了蔗糖、果糖、黑曲酶I后，固形物中甜菊单糖苷含量可大于80%，甚至可大于90%。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明以甜菊醇为原料得到甜菊单苷的转化率≥70%，固形物中甜菊单苷含量至少可达60%，进一步分离纯化后可达80%，甚至可＞90%，甜菊单苷的口感无异味，与蔗糖相似，可单独作为甜味剂使用，以此方法生产甜菊单苷成本低，易放大，适用于工业生产。

具体实施方式

在具体实施方式中，甜菊醇(Steviol)简称为SL，甜菊单苷 (Steviolmonoside)简称为SM，蔗糖(Sucrose)简称为SU。

以下是针对本发明转化方法中关键参数进行的筛选试验。

试验1反应底物条件对SM转化的影响

实施例1～9为考察反应底物条件对SM生物转化的影响，以正交试验方法进行实验，分别将9份20g SL（95%）按表1条件（1:30～1:50m/v、10～40℃、搅拌时间30～60min）进行反应底物准备。准备后，再按照SL干粉与SU的比例1:4，1600:1～2000:1(m/m,SL干粉：黑曲酶I）的重量比量加入黑曲酶I，在pH值7、40℃条件下保温5h的进行酶催化的生物转化。

表1反应底物条件试验方案及结果分析

本发明不限于实施例中SM的特定转化率、纯度及溶解SL干粉的特定条件。

试验2生物转化条件对SM转化的影响

实施例10～18为考察生物转化条件对SM转化率的影响，以生物转化条件因素进行正交实验。首先，别将9份20g SL（90%）按表3条件，将SL干粉与水的比例1:40，搅拌时间45min，溶解温度25℃，搅拌速度90rpm进行反应底物准备。然后按SL：黑曲酶I＝1800:1(m/m)加入黑曲酶I，再按照表2条件（SL：SU＝1:2～1:6m/m、温度30～50℃、酸碱度pH 6～8、反应时间3～7h）进行生物转化的正交试验。生物转化反应后，采用国标GB8270-1999中的HPLC检测方法，检测SM的生成量，并计算SM转化率，结果见表2。

表2生物转化条件对SM转化率的影响

本发明不限于实施例中SM的特定转化率、纯度及酶处理SL的特定条件。

实验3考察过滤、浓缩法对固形物SM含量的影响

按照实施例1～18的转化方法得到反应液后，若采用滤纸过滤，干燥，得到固形物A；若采用结晶可得到固形物B；若将固形物B再结晶后干燥得到固形物C，采用国标GB8270-1999中的HPLC检测方法检测SM，结果见表3。

表3不同提纯方法对固形物SM含量的影响

从表3可见，采用固形物中SM含量至少可达60%，进一步精制后可达80%，甚至可＞90%。

Claims

1.甜菊醇转化为甜菊单苷的方法，其特征在于：其采用黑曲酶I在以蔗糖为糖源的条件下将甜菊醇转化为甜菊单苷；所述黑曲酶I是从黑曲霉菌（Aspergillus niger）CICC 40415（中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏编号：40415）发酵诱导得到的一种特异性糖基转移酶，它是利用下述方法得到的：

（1）挑取黑曲霉菌CICC 40415单克隆，接种至含 25ml BMGY培养液的 250ml 摇瓶中，26～30 ℃，200～300rpm 培养至 OD600＝2～6，将 25ml 培养基接种至含 1L BMGY培养液的 2～4L 摇瓶中，26～30 ℃剧烈振荡，至对数生长期；

（2）用灭菌离心管，室温 2000～3000g 离心 5min 收集细胞，去除上清，用BMMY溶液重悬细胞至 OD600＝1.0，分装培养基至几个 3～4L 隔板摇瓶，用 2 层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床 26～30℃继续培养；

（3）每 24 小时，加甲醇至 0.4～0.6%浓度，直至到达最佳诱导时间，室温条件下，2000～3000g 离心 5min 收集细胞；保留上清酶液，置于 4 ℃预冷浓缩；使用葡聚糖凝胶按分子量对粗酶分段，其中分子量在65～70kD的酶即为黑曲酶I，存于-80 ℃备用。

2.根据权利要求1所述的甜菊醇转化为甜菊单苷的方法，其特征在于：采用黑曲酶I在以蔗糖为糖源的条件下将甜菊醇转化为甜菊单苷的具体步骤为：

（1）以重量计，取甜菊醇1份、蔗糖1～6份配制成水溶液；

（2）向步骤（1）得到的水溶液中加入黑曲酶I，黑曲酶I的添加量按重量计为：甜菊醇︰黑曲酶I＝1600～2000︰1；反应条件为：温度30～50℃、pH6～8、时间3～7小时；

3.根据权利要求2所述的甜菊醇转化为甜菊单苷的方法，其特征在于：按重量计，转化步骤（1）中配制水溶液时加水量为30～50份。

4.根据权利要求2所述的甜菊醇转化为甜菊单苷的方法，其特征在于：转化步骤（2）中黑曲酶I的添加量按重量计为：甜菊醇︰黑曲酶I＝1800︰1。