CN103451251A - 利用粗毛韧革菌菌体作为催化剂制备银杏内酯b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用粗毛韧革菌(Stereum hirsutum)菌体作为催化剂转化银杏内酯混合物合成银杏内酯B的方法，属于生物技术领域。本发明通过对粗毛韧革菌菌种进行扩大培养，从试管斜面、液体摇瓶、种子培养和菌体分离，利用菌体作为催化剂，转化银杏内酯合成银杏内酯B，转化液经过离心、乙酸乙酯萃取、无水酒精结晶把银杏内酯B从发酵液分离出来。利用该方法所得到的银杏内酯B的纯度≥99％，银杏内酯转化率＞90％。

Description

利用粗毛韧革菌菌体作为催化剂制备银杏内酯B的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，通过粗毛韧革菌菌种液体培养，同时转化银杏叶提取物制备银杏内酯B的一种新工艺。

背景技术

研究证明银杏内酯是银杏叶中主要的活性成分之一，是一类特异有效的血小板活化因子(Platelet activating factor PAF)受体拮抗剂。血小板活化因子是由血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷酯，是目前发现的最有效的血小板聚集诱导剂，与许多疾病的产生、发展密切相关。银杏内酯作为PAF受体特异性拮抗剂，具有广泛的药理作用。研究发现银杏内酯B对中枢神经系统与缺血损伤有保护作用，抗休克、抗过敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反应。同时还发现银杏内酯B可降低肝门静脉压提高全身血管耐受性，说明它对肝硬化有一定的疗效。银杏内酯对于肾损伤有治疗作用。这些作用都与银杏内酯B作为PAF受体拮抗剂有关，并且它目前被认为是作用最强的、最有临床应用前景的天然血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂。

目前国内外生产银杏内酯B的方法主要是从银杏叶提取物，已见报导的银杏内酯B的专利共有51篇，其中一部分是关于银杏内酯B的制剂的制备(如：一种银杏内酯B固体分散体及其制备方法，申请号：CN200910204198.4)，三篇关于银杏内酯B及其衍生物的生理学功能(银杏内酯B的一种新用途；申请号：CN200910092750.5；银杏内酯B衍生物在制药中的新用途，申请号：CN200910234319.X；银杏内酯B水解衍生物及其用途，申请号：CN201010122039.2)。而关于银杏内酯B的制备只有九篇(一种从银杏叶或银杏叶提取物中提取银杏内酯B的新方法，申请号200510063407.X；一种从银杏内酯混合物中分离银杏内酯B的方法，申请号：CN201010608847.X，等等)，银杏内酯中含有银杏内酯A、B、C、M等同系物，这些专利是采用分离技术从银杏内酯混合物中分离银杏内酯B，难以在工业上大批量生产银杏内酯B。

发明内容

本发明提供的是一种银杏内酯B的生产技术，该技术不是单纯的利用分离提纯方法获得大量的银杏内酯B，而是在培养基中添加银杏内酯，以粗毛韧革菌(Stereum hirsutum)为菌种通过液体培养技术得到菌体，菌体作为催化剂，转化银杏内酯A、C和M生成银杏内酯B，以及通过提取步骤获得银杏内酯B制品。

本发明一方面涉及一种银杏内酯B的生产技术，其特征在于包括如下步骤：

在银杏内酯(包括银杏内酯A、B、C和M)加入蒸馏水和酸，调节pH6.0-7.0，配成20-30克银杏内酯／升的反应液，将粗毛韧革菌和反应液按照重量／体积1：20-30混合，在温度20-30℃，搅拌速率100-150转／分钟，反应10小时以上；

反应之后的反应液按照4000-6000转／分钟离心10-20分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pH2.0-3.0，连续用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃以下结晶70小时以上，过滤，滤渣水洗，干燥得到银杏内酯B。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的粗毛韧革菌通过如下方式获得：以粗毛韧革菌为出发菌株，进行试管菌种传代、液体摇瓶菌种、种子罐菌种、催化转化等步骤制得含有银杏内酯B的转化液，含有银杏内酯B的转化液经过离心、乙酸乙酯萃取、浓缩、酒精复溶，-20℃结晶、过滤、烘干等提取工艺得到银杏内酯B晶体。其中所述的试管菌种的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)；其中所述的试管斜面菌种培养工艺为斜面菌种切成4×4mm小块菌种，挑取一小块转接含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中，20～32℃培养5～20天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；其中所述的液体摇瓶培养基组成为(单位为克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；其中所述的摇瓶培养的培养条件是：250mL三角瓶装液量为60～150mL，接种3～4块4×4mm小块菌种，置于温度22～30℃，转速120～160转／分钟，培养时间24～48小时；其中所述的种子罐培养的培养基组成为(单位为克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，消泡剂0.1～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；其中所述种子罐的培养条件是：接种量5～10％(种子液体积／接种后体积)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转／分钟，通风量1：0.3～1v／v／m，培养时间80～90小时；其中所述转化反应液为(单位为克／升)：银杏内酯10～50，起始pH值为5.0～8.0；其中所述的转化工艺条件是：种子液4000～6000转／分钟，离心5～20分钟，收集菌体，菌体与反应液按1：5～50(重量：体积)混匀，在温度22～30℃，搅拌速率90～150转／分钟，通风量1：0.3～1v／v／m，反应6～18小时；其中所述的银杏内酯B提取工艺为，转化液4000～6000转／分钟离心10～20分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pH1.0～4.0，连续用0.3～3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃结晶24～120小时，过滤，滤渣水洗，80℃干燥得到银杏内酯B纯品。

本发明所使用的粗毛韧革菌菌种为金耳的伴生菌，可选任意一种金耳子实体，例如云南、西藏或山西的金耳子实体，通过组织分离即可得到野粗毛韧革菌菌种。该菌不形成或很难形成子实体，菌丝体遇氢氧化钾溶液变暗或变黑。生殖菌丝疏松地交织在一起，分枝，有锁状联合，近无色。

本发明所述的工艺银杏内酯B白色，纯度≥99％，银杏内酯转化率＞90％。

根据此工艺采用的银杏内酯测定方法为：精密称取银杏内酯B对照品10mg，溶于1mL色谱级甲醇中，配制成10mg／mL的标准液。0.2μm微孔滤膜过滤，控制进样量为1，2，3，4，5，6，7和8μl，利用高效液相色谱仪(HIMADZU(岛津)LC-20AT)测定银杏内酯B含量。色谱柱为硅胶柱(4.6mm×250mm，5μm)。测定条件为流动相：甲醇：0.1％磷酸溶液=10：90；柱温：30℃，流速：0.8mL／min，检测波长：270nm。以进样量为横坐标(X)，以相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，求得银杏内酯浓度与峰面积的线性回归方程。吸取样品液(发酵过程中和发酵后)的上清液少量，用0.45μm微孔滤膜过滤，按上述色谱条件分别测定峰面积，采用外标峰面积根据上述求得的银杏内酯B浓度与峰面积的回归方程计算银杏内酯B含量。

银杏内酯B转化率按下列公式(1)计算：

$R_t=\frac{C_t{V}_t}{C_0{V}_0}\×100\%---\left(1\right)$

式中，R_t为t时间银杏内酯B的转化率；C₀(mg/L)，V₀(mL)为0小时加入的银杏内酯浓度和反应液体积；C_t(mg/L)和Vt(mL)为反应t小时银杏内酯B的浓度和反应液体积。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

试管菌种的制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备：称取马铃薯200g，切成片状、加入1000mL水，煮沸30分钟，过滤，滤液定容至1000mL，加入琼脂20g，加热待琼脂完全融化后，分装18×200mm的试管，每管15mL培养基，120℃灭菌30分钟，冷却到50℃，摆成斜面，斜面长度为试管长度的一半；将保藏的从金耳子实体中分离的粗毛韧革菌菌种切成4×4mm小块菌种，挑取一小块转接含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的试管中，20℃培养20天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；

含有银杏内酯B的发酵液的制备

1、液体摇瓶菌种的制备

液体摇瓶菌种培养基配方为(单位为克／升)葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH₂PO₄1，MgSO₄1，起始pH值为5.0。共配制5500mL，分装250mL三角瓶，每瓶60mL，共84瓶，100℃灭菌60分钟。共配制5500mL，分装250mL三角瓶，每瓶60mL，共84瓶，将保存的从云南金耳子实体中分离的粗毛韧革菌试管斜面菌种切成4×4mm大小的小块，挑取3块转接入装有摇瓶培养基的250mL三角瓶中，置于22℃、90转／分钟摇床培养24小时。

2、种子罐菌种的制备

75L种子罐装有45L种子培养基，其中种子培养基的配方为(单位为克／升)：葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH₂PO₄1，MgSO₄1，消泡剂0.5，起始pH值为5.0，100℃灭菌60分钟，冷却后，将上述培养的菌种5000mL接入种子罐中，即接种量10％(种子液体积／接种后体积)，维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速度90转／分钟，通风量1∶0.3v／v／m，发酵时间90小时。

3、银杏内酯B转化

种子液4000转／分钟离心20分钟收集菌体，得到鲜菌体2kg。准确称取银杏内酯100克，加蒸馏水10L，用盐酸调节pH5.0，配成10克／升的反应液，2kg与10L反应液(1：5，重量／体积)混合，在温度22℃，搅拌速率90转／分钟，通风量1：0.3v／v／m，反应18小时。

4、银杏内酯B的提取

上述反应液4000转／分钟离心20分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pH4.0，连续用3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃结晶24小时，过滤，滤渣水洗，80℃干燥得到银杏内酯B纯品。经分析银杏内酯B含量99.1％，转化率90.8％。

含有银杏内酯B的发酵液的制备

1、摇瓶菌种的制作

摇瓶培养基的配方为(单位为克／升)：葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH₂PO₄3，MgSO₄2，起始pH值为6.5，共配制4500mL，分装250mL三角瓶(共50瓶)，每瓶90mL，120℃灭菌40分钟。冷却后，将保存的从山西金耳子实体中分离的粗毛韧革菌试管斜面菌种切成4×4mm大小的小块，试管斜面菌种切成4×4mm大小的小块，挑取4块转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，置于25℃、120转／分钟摇床上，培养36小时。

2、种子罐菌种的制备

100L种子罐装有50L种子培养基，其中种子罐培养基的配方为(单位为克／升)：葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH₂PO₄3，MgSO₄2，消泡剂0.1，起始pH值为6.5，120℃灭菌40分钟。冷却后，将上述培养的菌种4000mL接入100L种子罐中，即接种量7.4％(种子液体积／接种后体积)，种子罐中发酵液的总体为54L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速度120转每分钟，通风量1：0.5v／v／m，培养时间90小时。

3、银杏内酯B转化

种子液5000转／分钟离心12分钟收集菌体，得到鲜菌体3.5kg。准确称取银杏内酯1250克，加蒸馏水50L，用盐酸调节pH6.5，配成25克／升的反应液，2kg与50L反应液(1：25，重量／体积)混合，在温度25℃，搅拌速率120转／分钟，通风量1：0.8v／v／m，反应12小时。

4、银杏内酯B的提取

上述反应液5000转／分钟离心15分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pH2.5，连续用2倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃结晶72小时，过滤，滤渣水洗，80℃干燥得到银杏内酯B纯品，经分析银杏内酯B含量99.5％，转化率95.8％。

实施例4含有银杏内酯B的发酵液的制备

1、摇瓶菌种的制作

摇瓶培养基的配方为(单位为克／升)：葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH₂PO₄6，MgSO₄4，起始pH值为8.0。共配制2000mL，分装250mL三角瓶(共10瓶)，每瓶150mL，140℃灭菌20分钟。冷却后，将保存的从西藏金耳子实体中分离的粗毛韧革菌试管斜面菌种切成4×4mm大小的小块，挑取4块转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，置于30℃、150转／每分钟摇床上培养46小时。

2、种子罐菌种的制备

50L种子罐装有30L种子培养基，其中种子罐培养基的配方为(单位为克／升)：葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH₂PO₄6，MgSO₄4，消泡剂0.8，起始pH值为8.0，140℃灭菌20分钟。冷却后，将上述液体摇瓶培养的菌种1600mL接入50L种子罐中，即接种量5.1％(种子液体积／接种后体积)；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速度150转／分钟，通风量1：1v／v／m，发酵时间90小时。

3、银杏内酯B转化

种子液6000转／分钟离心5分钟收集菌体，得到鲜菌体1.2kg。准确称取银杏内酯3000克，加蒸馏水60L，用氢氧化钠调节pH8.0，配成50克／升的反应液，1.2kg鲜菌体与60L反应液(1：50，重量／体积)混合，在温度30℃，搅拌速率150转／分钟，通风量1：1v／v／m，反应6小时。

4、银杏内酯B的提取

上述反应液6000转／分钟离心10分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pH1.0，连续用0.3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃结晶120小时，过滤，滤渣水洗，80℃干燥得到银杏内酯B纯品。经分析银杏内酯B含量99.9％，转化率98.5.8％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (6)

1.粗毛韧革菌转化银杏内酯生产银杏内酯B的方法，其特征在于以粗毛韧革菌为出发菌株，通过试管斜面菌种、液体摇瓶菌种、种子罐菌种、离心获得菌体，菌体催化银杏内酯合成含有银杏内酯B的反应液，含有银杏内酯B的反应液经过离心、乙酸乙酯萃取、浓缩、酒精复溶，-20℃结晶、过滤、烘干等提取工艺得到银杏内酯B晶体。

2.根据权利要求书1所述的方法，其中所述的粗毛韧革菌菌种为从云南、山西和西藏的任意一种金耳子实体中分离出的金耳伴生菌菌种。

3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于粗毛韧革菌通过液体摇瓶、种子罐和菌体转化银杏内酯，分离提取得到银杏内酯B。其中所述的液体摇瓶种子培养基组成为(单位为克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；其中所述的种子罐培养基组成为(单位为克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，消泡剂0.1～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；其中所述转化银杏内酯反应液组成为(单位为克／升)：银杏内酯10～50，起始pH值为5.0～8.0；其中所述的摇瓶培养的培养条件是：250mL三角瓶装液量为60～150mL，接种3～4块4×4mm小块菌种，置于温度22～30℃，转速120～160转／分钟，培养时间24～48小时；其中所述种子罐的培养条件是：接种量5～10％(种子液体积／接种后体积)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转／分钟，通风量1：0.3～1v／v／m，培养时间80～90小时；其中所述的转化工艺条件是：种子液4000～6000转／分钟，离心5～20分钟，收集菌体，菌体与反应液按1：5～50(重量：体积)混匀，在温度22～30℃，搅拌速率90～150转／分钟，通风量1：0.3～1v／v／m，转化6～18小时；按照该转化工艺，其中在进行摇瓶培养之前，首先将粗毛韧革菌的斜面菌种接入新配制的马铃薯葡萄糖培养基中进行传代培养，培养温度22～30℃，培养时间24～248小时。

4.根据权利要求1所述的银杏内酯B的方法，转化液4000～6000转／分钟离心，滤液用盐酸或硫酸调节pH1.0～4.0，连续用0.3～3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃结晶24～120小时，过滤，滤渣水洗，80℃干燥得到银杏内酯B纯品。

5.根据权利要求1所述的转化提取工艺所制得的银杏内酯B白色，纯度≥99％，银杏内酯转化率＞90％。

6.一种银杏内酯B的生产技术，其特征在于包括如下步骤：

在银杏内酯(包括银杏内酯A、B、C和M)加入蒸馏水和酸，调节pH6.0-7.0，配成20-30克银杏内酯／升的反应液，将粗毛韧革菌和反应液按照重量／体积1：20-30混合，在温度20-30℃，搅拌速率100-150转／分钟，反应10小时以上；

反应之后的反应液按照4000-6000转／分钟离心10-20分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pH2.0-3.0，连续用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃以下结晶70小时以上，过滤，滤渣水洗，干燥得到银杏内酯B。