KR20120089928A - 금-형광 실리카 나노입자 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

금-형광 실리카 나노입자 복합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 형광 실리카 나노입자, 상기 형광 실리카 나노입자의 표면에 초음파 용착된 금 나노입자; 및 상기 금 나노입자의 표면에 결합된 금 결합 펩티드;를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 광안정성이 우수하기 때문에, 바이오센서, 바이오분리막 등에 사용하기에 매우 적합하며, 그 제조공정이 단순하기 때문에 상업성이 우수하다.

Description

금-형광 실리카 나노입자 복합체 및 이의 제조방법{Gold-doped fluorescent silica nanoparticles composite and Preparing method thereof}
본 발명은 금-형광 실리카 나노입자 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
금, 은, 백금, 팔라듐 등의 금속 나노입자는 여러 가지 촉매, 방부제, 화학 및 바이오센서 등으로 널리 사용되고 있으며, 이러한 금속 나노입자는 금속 이온의 수용액으로부터 금속을 환원시켜 제조한다. 그런데, 생성된 금속 나노입자를 안정화시키지 않으면, 금속 나노입자가 서로 결합하여 금속 덩어리를 형성하여 나노입자의 크기가 균일하지 못하게 되며, 나노입자의 단위 무게당 표면적이 감소하는 단점이 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해서는 제조된 금속 나노입자를 담지하기 위한 안정적인 고분자 물질이 요구된다. 그런데, 환원 반응 후 잔존하는 환원제, 환원제 부산물 및 나노 금속 입자를 담지하기 위한 고분자 물질은 제조된 금속 나노입자를 오염시키는 주된 오염원이 되는 문제가 있다. 나노 금속 입자를 담지하기 위한 고분자 물질의 경우에는 금속 나노입자를 안정한 상태로 유지하는데 필수적이므로 근본적으로 제거할 수 없기 때문에, 나노 금속입자를 담지하기 위한 고분자 물질의 특성에 따라 금속 나노입자의 용도가 결정되기도 한다. 예를 들어, 의료용 금속 나노입자를 제조하는 경우에는 독성이 있는 고분자 물질을 사용할 수 없는 제한이 있다.
또한, 금속 나노입자를 제조하는 것과는 별개로 금속 나노입자를 고분자 물질에 고정하는 것도 중요한 문제가 되고 있는데, 예를 들면, 고정되지 않은 금속 나노입자는 지속적으로 고정된 상태여야 하는 촉매와 같은 경우에는 사용이 적합하지 않다. 종래의 금속 나노입자를 고정하는 방법으로는 티올(thiol)기, 아민(amine)기 등을 함유한 분자로 소정의 물질을 코팅하고 금속 나노입자와 이들 사이의 상호인력에 의하여 활성기를 가진 분자위치에 금속 나노입자를 고정시켰다. 그러나, 이러한 방법은 금속 나노입자를 별도로 제조해야 하기 때문에 제조공정이 복잡할 뿐만 아니라, 특정한 활성기를 가진 분자를 모든 물질에 안정적으로 코팅시키는 것이 어려워서 그 응용이 제한적이다.
최근에 하이브리드 형광 유기 나노입자는 우수한 생체적합성 및 광안정성으로 화학, 생명공학, 의학 분야 등에서 매우 관심 받고 있으며, 양자점(quantum dots), 금, 실리카 및 산화유러피움(europium oxide) 등을 이용하여 개발되었으나, 개발되어 있는 하이브리드 형광 유기 나노입자 역시 나노입자의 독성 문제를 극복하지 못하고 있으며, 광안정성이 낮은 문제점을 갖고 있다.
또한, 단백질을 금속 나노입자 위에 고정하기 위해서는 복잡한 표면 화학공정이 필요하고 높은 단백질 순도가 요구되어 복잡한 정제공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 단점도 있다.
이에 바이오센서 개발에 요구되는 점 중의 하나는 바이오물질을 원하는 나노입자에 선택적이며 안정적으로 고정화할 수 있는 기술의 개발이다. 전통적인 고정화 방법은 크게 4가지 나눌 수 있다. 첫 번째는 센서 칩 표면에 바이오물질을 물리적 또는 화학적으로 흡착시키는 방법이고, 두 번째는 센서 칩 표면에 바이오물질을 공유결합을 생성하게 하는 방법이다. 세 번째는 막, 매트릭스, 고분자 등에 바이오물질이 포착되게 하는 방법이고, 마지막으로 바이오물질간의 교차결합을 유도하여 센서 칩 표면에 고정화하는 방법이 있다.
최근에 파지 디스플레이 또는 세균 디스플레이 기술을 이용하여 금, 산화철, 산화아연, 백금, 실버, 이산화규소, 제올라이트 등의 무기금속에 선택적으로 결합을 하는 펩티드인 MBP(metal binding protein)의 염기서열이 확인되었다(Sarikaya,M. et al., Nature Materials, 2:577, 2003). 금속 결합 단백질 중에서 14개의 아미노산으로 이루어진 금 결합 단백질(gold binding protein, GBP)이 금 표면에 선택적으로 결합한다고 밝혀진 이후 (Brown, S., Nature Biotechnol.,15:269, 1997) GBP에 대한 연구가 진행되고 있으나, GBP가 어떻게 금 표면을 인식하고 결합하는지에 대한 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지 않고 있다.
본 발명자들은 기존 금속-유기 나노 복합체 또는 금속-고분자 나노 복합체의 문제점을 해결하고자 노력한 결과, 실리카 표면에 금 나노입자를 고정시키기 위하여, 초음파를 사용하면 독성이 있는 아민화합물 또는 티올화합물을 사용하지 않고서도 효과적으로 용착(deposit)시킬 수 있음을 알게 되었으며, 또한, 이를 바이오센서, 바이오분리막 등에 적용시키기 위하여 실리카 표면에 용착된 금 나노입자 위에 금 결합 폴리펩티드를 도입함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 형광 실리카 나노입자; 상기 형광 실리카 나노입자의 표면에 초음파 용착된 금 나노입자; 및 상기 금 나노입자의 표면에 결합된 금 결합 펩티드;를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 또 다른 특징에 다른 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조 방법은 루피, FITC, DAPI, TRTIC, 로호다민, 텍사스 레드, 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, 또는 cy7을 함유한 형광염료액을 제조하는 1 단계; 상기 형광염료액에 실리카 전구체 및 NH4OH를 첨가 및 반응시켜서 형광 실리카 나노입자(SiNPs) 용액을 제조하는 2 단계; 및 상기 형광 실리카 나노입자(SiNPs) 용액에 금 전구체 용액 및 NH4OH를 첨가한 다음, 초음파를 조사하여 금 나노입자가 상기 형광 SiNPs의 외주면에 용착된 금-실리카 나노입자(금-형광 실리카 나노입자)를 제조하는 3 단계; 를 포함한다.
본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 아민화합물 또는 티올화합물을 사용하지 않고, 생체내 독성이 없는 형광 실리카 나노입자, 금 나노 입자, 및 금 결합 폴리펩티드로 이루어지므로, 생체 독성이 없다.
또한, 본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 광안정성이 우수하기 때문에, 바이오센서, 바이오분리막 등에 사용하기에 매우 적합하며, 그 제조공정이 단순하기 때문에 상업성이 우수하다.
도 1a 내지 1c는 각각 실시예 1-(1) ~ 1-(3)에서 제조한 형광 실리카 나노입자의 FE-SEM 사진이다.
도 2a 내지 2c는 각각 실시예 1-(1) ~ 1-(3)에서 제조한 형광 실리카 나노입자의 PL(photoluminescence spectra) 측정결과이다.
도 3은 실시예 1-(1) ~ 1-(3)에서 제조한 형광 실리카 나노입자 파우더의 형광 이미지 사진이다.
도 4a 내지 4c는 각각 실시예 2에서 제조한 금-형광 실리카 나노입자의 FE-SEM 사진이다.
도 5은 실시예 3에서 사용되는 재조합 플라스미드 pET-6HisGBP의 구성을 개략적으로 보여준다.
도 6은 실시예 4에 따른 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 공초점 현미경 사진이다.
도 7은 실시예 4에 따른 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 TEM 사진이다.
도 8은 비교예 1에 따른 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 TEM 사진이다.
도 9는 비교예 2에 따른 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 TEM 사진이다.
본 발명자는, 형광 실리카 나노입자에 금 나노입자를 초음파를 통해 용착시킴으로써, 아민화합물 또는 티올화합물과 같은 생체 독성 물질을 사용하지 않으면서도, 금-형광 나노입자 복합체(또는 금-형광 실리카 나노입자(Au-Si Nanoparticles))를 수득할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르렀다.
본 발명의 금-형광 나노입자 복합체는 생체 물질과의 결합성을 개선하기 위해, 금 결합 폴리펩티드(gold binding polypeptide; GBP)를 더 부가할 수 있다. 이와 같은 금 결합 폴리펩티드를 통해, 항원과 같은 생체 물질이 추가 결합될 수 있다.
특히 본 명세서에, 항원이 결합된 형태를 'GBP-a(gold binding polypeptide-antigen) 복합체'로 정의한다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명을 하도록 하겠다.
본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 형광 실리카 나노입자, 및 형광 실리카 나노 입자의 표면에 용착된 금 나노입자를 포함하여 이루어진다. 그리고, 본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 금 나노입자 표면에 금 결합 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 여기서, 금 결합 폴리펩티드는 생체 물질이 금-형광 실리카 나노입자 복합체에 결합되도록 한다. 이러한 생체 물질로는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 항 바이러스성 항체 또는 항원이 사용될 수 있다. 그리고 이러한 생체 물질의 표지를 위해, 생체 물질에 표지로서 자성 나노입자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 형광 실리카(silica) 나노입자는 실리카 전구체와 형광염료를 반응시켜서 제조한 것으로서, 상기 형광염료는 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluorescein isothiocyanate), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), TRTIC (Tetramethylrhodamine-5-(and 6)-isothiocyanate) , 로호다민(Rohodamine), 텍사스 레드(Texas red), 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, 또는 cy7 중에서 선택된 1종을 용도에 따라 선택하여 사용할 수 있다.
상기 형광 실리카 나노입자는 특별히 한정하지는 않으나, 평균직경 20 ~ 900 nm 크기의 구형인 것이, 바람직하게는 40 ~ 100 nm의, 더욱 바람직하게는 40 ~ 80 nm의 평균직경을 갖는 구형인 것이 좋다.
이때, 평균직경이 20 nm 미만이면 입자 크기가 너무 작아져서 세포 내로 투과될 가능성이 높아지고, 금 나노입자를 융착시키기 어려울 수 있으며, 900 nm를 초과하면 형광 실리카 나노입자의 분산성이 떨어지고 입자체의 표면적이 작아질 수 있으므로 상기 범위 내의 직경을 갖는 것을 사용하는 것이 좋다.
또한, 상기 실리카 전구체는 당업계에서 일반적으로 사용하는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 테트라에틸오르소실리케이트, 트리메톡시페닐실레인, (3-아미노프로필)트리메톡시실레인 또는 트리메톡시실레인 중에서 선택된 것을 사용하는 것이 좋다.
상기 금 나노입자는 여러 금속 입자 중 생체적합성, 생체접합성, 생체활성 등의 요소를 고려하여 도입한 것으로서, 평균직경 1 ~ 10 nm를 갖는 것이, 바람직하게는 1 ~ 5 nm인 것이, 더욱 바람직하게는 1 ~ 3 nm를 갖는 것이 좋다. 이때, 평균직경이 1 nm 미만일 경우 실리카 나노입자 사이에 묻히게 되어 반응성이 낮을 수 있으며, 10 nm를 초과할 경우 금 나노입자의 반응성은 높아지나, 형광 실리카 나노입자의 외주면에 상기 금 나노입자의 융착 수가 상대적으로 적어지게 되므로 상기 범위 내의 평균직경을 갖는 것이 좋다.
상기 금 결합 폴리펩티드는 형광 실리카 나노입자의 외주면에 융착된 금 나노입자의 표면 상단에 선택적으로 고정된다. 이를 위해, 정제된 폴리펩티드를 1 mg 금-형광 실리카 나노입자 복합체와 상온에서 1시간 동안 혼성화 반응시켜 고정 결착시킨다. 이러한 금 결합 폴리펩티드는 금-형광 실리카 나노입자 복합체와 항원과 같은 생체 물질을 연결하는 역할을 수행하게 된다. 상기 생체 물질은 형광 실리카 나노입자의 외주면에 융착된 금 나노입자의 상단에 결착된 폴리펩티드의 한쪽 끝 부분과 결합하게 된다.
상기 항원은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으나, 예를 들면, 바이러스성 표면항원(viral surface antigen)을 사용할 수 있으며, 항원의 종류는 항체의 종류에 따라 선택적으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 항원의 표지를 위해 자성 나노입자를 더 포함할 수 있는데, 상기 자성 나노입자로는 특별한 제한이 없으며, 생체 독성이 적은 산화철이 바람직하게 사용된다.
이하에서는 본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체를 제조하는 방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluorescein isothiocyanate), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), TRTIC (Tetramethylrhodamine-5-(and 6)-isothiocyanate) , 로호다민(Rohodamine), 텍사스 레드(Texas red), 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, 또는 cy7 중에서 선택된 1종을 함유한 형광염료액을 제조하는 1 단계; 상기 형광염료액에 실리카 전구체 및 NH4OH를 첨가 및 반응시켜서 형광 실리카 나노입자(SiNPs) 용액을 제조하는 2 단계; 및 상기 형광 실리카 나노입자(SiNPs) 용액에 금 전구체 용액 및 NH4OH를 첨가한 다음, 초음파를 조사하여 금 나노입자가 상기 형광 SiNPs의 외주면에 결착된 금-실리카 나노입자(금-형광 실리카 나노입자)를 제조하는 3 단계; 를 거쳐서 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 금-형광 실리카 나노입자의 금 나노입자 표면에 금 결합 폴리펩티드를 결합시키는 4 단계;를 더 포함할 수 있다. 그리고, 본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조방법은 금 결합 폴리펩티드를 이용하여 항원과 같은 생체물질을 결합시키는 5 단계;를 더 포함할 수 있다.
1 단계의 상기 형광염료액은 루피, FITC, DAPI, TRTIC, 로호다민, 텍사스 레드, 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, 또는 cy7 중에서 선택된 형광염료, 사이클로헥산, 트리톤 X-100(triton X-100), n-헥산올 및 탈이온수(DI water)를 포함할 수 있다.
2 단계의 형광 SiNPs는 1 단계의 상기 형광염료액에 실리카 전구체와 NH4OH를 첨가하여 반응시킨 다음 24 시간 후에 생성된 나노입자를 분리한 후, 이를 여러 번 세척하고, 65 ~ 85℃에서 건조시켜서 얻을 수 있다. 여기서, 상기 실리카 전구체는 당업계에서 일반적으로 사용하는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 테트라에틸오르소실리케이트, 트리메톡시페닐실레인, (3-아미노프로필)트리메톡시실레인 또는 트리메톡시실레인 중에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 2 단계에서 제조된 형광 SiNPs는 구형으로서, 평균직경 20 ~ 900 nm 크기를 갖게 되며, 바람직하게는 40 ~ 100 nm의 크기를, 더욱 바람직하게는 40 ~ 80 nm의 평균직경을 갖게 된다.
그리고, 형광 SiNPs는 탈이온수에 혼합하여 혼합 용액을 수득하는데, 이때 그 함량은 특별히 한정하지는 않으나, 형광 SiNPs : 탈이온수 = 1 : 1 ~ 1000 중량비로 사용하는 것이 나노입자 복합체 제조 측면에서 바람직하다.
3 단계의 상기 금 전구체 용액은 금 전구체를 탈이온수에 용해시킨 용액으로서, 상기 금 전구체의 종류를 본 발명에서 특별히 한정하지는 않으나, HAuCl4를 사용하는 것이 좋다.
그리고, 상기 초음파는 50 ~ 200 W/㎝2의 세기로 10 ~ 30분간 조사하는 것이 좋으며, 바람직하게는 50 ~ 150 W/㎝2의 세기로, 더욱 바람직하게는 60 ~ 100 W/㎝2의 세기로 조사하는 것이 좋다.
이때, 초음파의 세기가 50 W/㎝2 미만이면 금 나노입자가 형광 실리카 외주면에 충분하게 융착되지 않을 수 있으며, 200 W/㎝2를 초과하는 세기로 조사하면 금 나노 입자가 따로 생성되는 문제가 발생할 수 있으므로 상기 범위 내의 세기로 초음파를 조사하는 것이 바람직하다.
3 단계에서 제조된 금-형광 실리카 나노입자의 금 나노입자는 평균직경 1 ~ 10 nm를 갖으며, 바람직하게는 1 ~ 5 nm를, 더욱 바람직하게는 1 ~ 3 nm의 평균직경을 갖게 된다.
5 단계의 GBP-a 복합체를 제조하는 구체적인 일례를 들면, 3 단계에서 제조한 상기 금-형광 실리카 나노입자, 금 결합 폴리펩티드, 및 항원을 인산완충식염수에 혼합한 후, 상온(15? ~ 35?)에서 1 ~ 2 시간 정도 반응시키면, 금-형광 실리카 나노입자의 금 나노입자 상단에 금 결합 폴리펩티드가, 그리고 금 결합 폴리펩티드에 항원이 각각 결착된 GBP-a(gold binding polypeptide-antigen) 복합체를 얻을 수 있다. 이러한 GBP-a 복합체는 도입된 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 결합하게 되므로, 해당 항체를 검출하는데 이용될 수 있다. 즉, GBP-a 복합체를 이용하여 특정 항체를 검출하기 위한 바이오 센서를 제조할 수 있다.
여기서, 항원는 항 바이러스성 표면항원일 수 있으며, 이에 본 발명이 한정되지 않으나 구체적인 예를 들면, 항 조류 인플루엔자 표면항원일 수 있다. 그리고, 상기 항원은 자성 나노입자를 더 포함할 수 있다. 이러한 자성 나노입자로는 특별한 제한이 없으며, 생체 독성이 낮은 산화철이 바람직하게 사용된다.
지금까지는 본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체에 항원을 결합하여, 항체를 검출함을 개시하고 있으나, 이와 반대로, 금-형광 실리카 나노입자 복합체에 항체를 결합하여 항원을 검출하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 경우, 생체 내에서 항체가 목적하는 항원에 타겟팅되어 결합하는지를 확인할 수 있게 된다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명을 한다. 하기 실시예는 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
형광 실리카 나노입자의 제조
실시예 1-(1) : 레드 ( red ) 형광 실리카 나노입자의 제조
루피(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)) 1.44 ㎎, 사이클로헥산 22.5 ㎖, 트리톤 X-100 5.4 g, 탈이온수 1.68 ㎖ 및 n-헥산올 4.8 ㎖를 혼합한 후, 10 분간 충분히 교반하여 형광염료액을 제조하였다.
다음으로 상기 형광염료액에 테트라에틸오쏘실리케이트(TEOS, tetraethylorthosilicate) 300 ㎕ 및 NH4OH 180 ㎕를 첨가한 다음, 교반하여 반응을 진행시켰다.
24 시간 후에, 원심분리기를 이용하여 반응물로부터 나노입자를 분리한 다음, 에탄올, 아세톤 및 증류수로 분리한 나노입자를 수회 세척한 후, 70℃ 하에서, 10 시간 정도 건조시켜서 레드 형광 실리카 나노입자를 제조하였다.
그리고, 제조한 형광 실리카 나노입자의 FE-SEM(field-emission scanning electron microscopy, Hitachi사의 S4800) 사진을 도 3a에 나타내었으며, 이를 통하여 제조된 레드 형광 실리카 나노입자의 크기가 고른 것을 알 수 있다. 또한, 제조한 형광 실리카 나노입자의 광발광 스펙트라(photoluminescence spectra, PL) 측정 결과를 도 2a에 나타내었으며, 이를 통하여 생성된 나노 입자의 광학 특성을 확인할 수 있었다. 그리고, 도 3에 제조한 그린 형광 실리카 나노입자 파우더의 형광 이미지 사진을 나타내었다.
실시예 1-(2) : 그린( green ) 형광 실리카 나노입자의 제조
FITC(fluorescein isothiocyanate) 수용액(7.5 ㎎ FITC/㎖ DMF) 63 ㎕, APTS(3-aminopropyltriethoxysilane) 15 ㎕, 사이클로헥산 22.5 ㎖, 트리톤 X-100 5.4 g, 탈이온수 1.68 ㎖ 및 n-헥산올 4.8 ㎖를 혼합한 후, 30 분간 충분히 교반하여 형광염료액을 제조하였다.
다음으로 상기 형광염료액에 TEOS 300 ㎕ 및 NH4OH 180 ㎕를 첨가한 다음, 교반하여 반응을 진행시켰다.
24 시간 후에, 원심분리기를 이용하여 반응물로부터 나노입자를 분리한 다음, 에탄올, 아세톤 및 증류수로 분리한 나노입자를 수회 세척한 후, 70℃ 하에서, 10 시간 정도 건조시켜서 그린 형광 실리카 나노입자를 제조하였다.
그리고, 제조한 형광 실리카 나노입자의 FE-SEM 사진을 도 1b에 나타내었으며, 이를 통하여 제조된 그린 형광 실리카 나노입자의 크기가 고른 것을 알 수 있다. 또한, 제조한 형광 실리카 나노입자의 광발광 스펙트라(photoluminescence spectra, PL) 측정 결과를 도 2b에 나타내었으며, 이를 통하여 생성된 나노 입자의 광학 특성을 확인할 수 있다. 그리고, 도 3에 제조한 그린 형광 실리카 나노입자 파우더의 형광 이미지 사진을 나타내었다.
실시예 1-(3) : 블루 ( blue ) 형광 실리카 나노입자의 제조
DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole) 수용액(20 ㎕ DAPI/㎖ 증류수) 1 ㎖, 사이클로헥산 22.5 ㎖, 트리톤 X-100 5.4 g, 탈이온수 1.68 ㎖ 및 n-헥산올 4.8 ㎖를 혼합한 후, 10 분간 충분히 교반하여 형광염료액을 제조하였다.
다음으로 상기 형광염료액에 TEOS 300 ㎕ 및 NH4OH 180 ㎕를 첨가한 다음, 교반하여 반응을 진행시켰다.
24 시간 후에, 원심분리기를 이용하여 반응물로부터 나노입자를 분리한 다음, 에탄올, 아세톤 및 증류수로 분리한 나노입자를 수회 세척한 후, 70℃ 하에서, 10 시간 정도 건조시켜서 블루 형광 실리카 나노입자를 제조하였다. 그리고, 제조한 형광 실리카 나노입자의 FE-SEM 사진을 도 1c에 나타내었으며, 이를 통하여 제조된 그린 형광 실리카 나노입자의 크기가 고른 것을 알 수 있다. 또한, 제조한 형광 실리카 나노입자의 광발광 스펙트라(photoluminescence spectra, PL) 측정 결과를 도 2c에 나타내었으며, 이를 통하여 생성된 나노 입자의 광학 특성을 확인할 수 있다. 그리고, 도 3에 제조한 그린 형광 실리카 나노입자 파우더의 형광 이미지 사진을 나타내었다.
금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조
실시예 2-(1) ~ 2-(3)
탈이온수 30 ㎖가 담긴 3개의 비이커에 상기 실시예 1-(1) ~ 1-(3)에서 제조한 레드, 그린, 블루 형광 실리카 나노입자를 각각 100 mg씩 첨가하여 혼합용액을 제조하였다.
다음으로 상기 혼합용액에 금 용액(2.5 ㎎ HAuCl4/㎖ 탈이온수) 및 NH4OH 4 ㎖를 첨가한 후, 초음파를 80 W/㎝-2의 세기로 15 분 동안 조사하였다.
다음으로, 생성물을 분리 및 세척한 후, 70℃ 하에서, 10 시간 정도 건조시켜서, 레드, 그린 및 블루 형광을 내는 금-실리카 나노입자 복합체를 각각 제조하여, 실시예 2-(1) ~ 2-(3)을 실시하였으며, 제조된 나노입자의 평균직경은 하기 표 1에 나타내었다.
제조된 각각의 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 FE-SEM 사진을 도 4a 내지 4c에 각각 나타내었으며, 약 45 ~ 65 ㎚ 직경을 갖는 형광 실리카 나노입자의 외주면에 약 1 ~ 2 ㎚ 직경을 갖는 금 나노입자가 융착되어 있는 것을 확인할 수 있다.
구분 실시예 2-(1) 실시예 2-(2) 실시예 2-(3)
실리카 나노입자의평균 직경(nm) 52.54±5.58 60.05±4.06 54.65±3.70
금 나노입자의평균 직경(nm) 1.59±0.32 1.69±0.29 1.27±0.17
비교예 1 ~ 2
상기 실시예 2-(1)과 동일하게 실시하여 비교예 1과 비교예 2를 실시하여 금-형광 실리카 나노입자 복합체를 제조하되, 비교예 1은 초음파의 세기를 30 W/㎝2 의 세기로 30 분간 조사하였으며, 비교예 3은 250 W/㎝2 의 세기로 10 분간 조사하였다.
도 8로부터, 초음파 세기가 지나치게 약한 비교예 1에서는 실리카 표면에 금 나노 입자가 융착되지 못함을 확인할 수 있다.
그리고, 도 9로부터, 초음파 세기가 지나치게 강한 비교예 2에서는 금 나노 입자가 실리카 입자 표면에 융착될 뿐만 아니라 금 나노 입자가 따로 형성됨을 확인할 수 있다.
금 결합 폴리펩티드 융합 단백질의 제조
실시예 3-(1) ( 금 결합 폴리펩티드 융합단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 대장균 준비)
서열 번호 1의 금 결합 폴리펩티드(GBP)와 대상단백질을 융합발현시키기 위한 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 주형 DNA 없이 서열번호 2 및 3의 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행하여 DNA 유전자 산물을 수득하였다.
이렇게 수득된 DNA 유전자를 제한효소 NdeI 및 제한 효소 NcoI을 이용하여, 플라스미드 pET-22b(+)에 도입하여, pET-6HisGBP 카세트를 수득하였다(도 5참조). 이때, 제한효소 NdeI의 절단위치는 서열번호 2의 프라이머에, 그리고 제한효소 NcoI의 절단위치는 서열번호 3의 프라이머에 위치하게 된다.
그리고, 친수성을 개선하기 위해, 조류독감의 표면항원인 뉴라미니데아제(neuraminidase, NA)의 친수성 도메인(이하 'AIa'라 함)을 유전자 수준에서 GBP와 융합시킨, GBP 융합단백질(GBP-A1a)을 위한 DNA 유전자 산물을 수득하였다. 즉, 상기 pET-6HisGBP를 주형으로 하고 서열번호 2 및 4의 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행하여 GBP-H1a의 DNA 유전자 산물을 수득하였다.
서열번호 1: H2N-MHGKTQATSGTIQSMHGKTQATSGTIQSMHGKTQATSGTIQS -COOH (GBP)
서열번호 2:
5'- GATATACATATGGGCCACCATCACCATCACCACGGCAAAACCCAGGCGACCAGCGGCACCATCCAGAGCATGCATGGTAAAACGCAAGCCACG -3' (프라이머 1)
서열번호 3:
5'- ATATCCATGGAGACTGAATGGTACCGCTCGTCGCTTGGGTTTTACCGTGCATAGATTGAATCGTACCAGACGTGGCTTGCGTTTTACCA -3' (프라이머 2)
서열번호 4:
5'- AAACTCGAGGATCGGACGGTTGCTGCCTTTCCAGTTATCACGACACCATGGAGACTGAATGGTACCGCT -3' (프라이머 3)
이러한 PCR 조건으로, 첫 번째 변성(denaturation)은 94?에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94?에서 30초간, 교잡(annealing)은 56?에서 30초간, 연장(extension)은 72?에서 30초간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72?에서 5분간 마지막 연장하였다.
그리고, 상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 약 200 bp (GBP-AIa 융합) 크기의 DNA 절편을 분리하였다.
그리고, DNA 절편을 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단한 다음, NdeI과 XhoI로 절단한 플라스미드 pET-22b(+) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-GBP-AIa를 제작하였다.
상기 제작된 pET-GBP-AIa를 열충격(heat shock)방법을 이용하여 대장균 BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 100 ㎎/L)이 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/L; 트립톤, 10 g/L; NaCl, 10 g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 BL21(DE3)/pET-GBP-AIa를 제조하였다.
본 실시예에서는 AIa의 N-말단에 GBP 단백질을 결합하는 형태를 사용하였으나, 본 발명의 요지상 C-말단에 GBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명한 사항이다.
실시예 3-(2)(GBP 융합단백질 준비)
실시예 3-(1)에서 준비된 pET-GBP-AIa로 형질전환된 대장균 BL1(DE3)을 LB 액체배지 200 mL가 담긴 500 mL 플라스크에 접종하여 37?에서 배양하였다.
분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.4일 때 1 mM의 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여, pET-CBP2-H1a 재조합 플라스미드의 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG는 재조합 플라스미드 pET-GBP-AIa에 구비된 T7 프로모터에 작용하여 발현을 유도하게 된다.
유도발현 후 4시간 후에 전체 배양액을 4?에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4?에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4?에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다.
파쇄한 용액을 4?에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 ㎛ 여과기로 여과하여 GBP-AIa 융합단백질을 함유하는 수용성 단백질분획을 수득하였다. 상기 단백질은 브래드포드 방법(Bradford, M. et al., Anal. Biochem., 72:248, 1976)을 이용하여 정량하였다.
GBP -a 복합체의 제조
실시예 4-(1) ~ 4-(3)
상기 실시예 2-(1) ~ 2-(3)에서 제조한 금-형광 실리카 나노입자 각각을 인산완충식염수(PBS)이 담긴 3개의 비이커에 넣은 후, 상기 실시예 3-(1) 및 3-(2)에 의해 제조되고 정제된 조류 인플루엔자(AI) 표면항원 융합단백질(purified AI-fusion protein)을 첨가한 다음, 25?에서 1시간 동안 반응(또는 배양)시켰다. 반응이 완료된 후, 금-형광 실리카 나노입자에 결합되지 않은 융합단백질은 PBS로 세척하여 제거하여 폴리펩티드를 통해 항원과 결합된 레드, 그린, 블루 형광을 나타내는 GBP-a 복합체를 각각 제조하였다.
실험예
항체 검출 실험
산화철(iron oxide) 나노입자(평균직경 10 nm)-표지된 항 조류 인플루엔자(AI) 항체가 담긴 인산완충식염수에, 상기 실시예 4-(1)에서 제조한 레드 형광의 GBP-a 복합체를 담근 후, 25?에서 1시간 동안 반응(또는 배양)시켜서, 상기 GBP-a 복합체의 AI 표면항원과 상기 AI 항체를 결합시켰다. 다음으로, 결합물을 세척한 후, 공초점 현미경(confocal microscopy, Carl Zeiss사 LSM 510 Meta, 독일)과 투과전자현미경(TEM, Transmission electron microscopy, JEOL사 JEM-2100F, 일본)으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다.
이와 같이, 본 발명의 금-형광 실리카 나노입자 복합체는 항체 검출용으로 사용할 수 있으며, 나아가 바이오센서, 바이오분리막 등으로 응용될 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (17)

  1. 형광 실리카 나노입자,
    상기 형광 실리카 나노입자의 표면에 초음파 용착된 금 나노입자; 및
    상기 금 나노입자의 표면에 결합된 금 결합 펩티드;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  2. 제 1 항에 있어서, 상기 형광 실리카 나노입자는 평균직경 20 ~ 900 nm 크기의 구형인 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  3. 제 2 항에 있어서, 상기 금 나노입자는 1 ~ 10 nm 크기의 구형인 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  4. 제 1 항에 있어서, 상기 형광 실리카 나노입자는 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluorescein isothiocyanate), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), TRTIC (Tetramethylrhodamine-5-(and 6)-isothiocyanate) , 로호다민(Rohodamine), 텍사스 레드(Texas red), 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, 또는 cy7 에서 선택된 1종이 실리카 전구체와 반응되어 형성된 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  5. 제 2 항에 있어서, 금 나노입자가 상기 형광 실리카 나노입자의 외주면에 융착되어 있고, 상기 금 결합 폴리펩티드는 상기 금 나노입자와 결착되어 있는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 금 결합 폴리펩티드에 생체 물질이 추가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 생체 물질은 항체 및 자성나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 금 결합 폴리펩티드는 탐침 단백질이 융합되어 있는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 금 결합 폴리펩티드는 친수성 단백질이 더 융합되어 있는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 자성나노입자는 산화철인 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체.

  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중에서 선택된 어느 한 항의 상기 금-형광 실리카 나노입자 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.

  12. 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluorescein isothiocyanate), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), TRTIC (Tetramethylrhodamine-5-(and 6)-isothiocyanate) , 로호다민(Rohodamine), 텍사스 레드(Texas red), 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, 또는 cy7 중에서 선택된 1종을 함유한 형광염료액을 제조하는 1 단계;
    상기 형광염료액에 실리카 전구체 및 NH4OH를 첨가 및 반응시켜서 형광 실리카 나노입자(SiNPs) 용액을 제조하는 2 단계; 및
    상기 형광 실리카 나노입자(SiNPs) 용액에 금 전구체 용액 및 NH4OH를 첨가한 다음, 초음파를 조사하여 금 나노입자가 상기 형광 SiNPs의 외주면에 용착된 금-실리카 나노입자(금-형광 실리카 나노입자)를 제조하는 3 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조방법.

  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 3 단계는 초음파를 50 ~ 1500 W/㎝2의 세기로 10 ~ 30분간 조사하는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조방법.

  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 형광염료액은 사이클로헥산, 트리톤 X-100(triton X-100), n-헥산올 및 탈이온수(DI water)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조방법.

  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 금-형광 실리카 나노입자의 금 나노입자 표면 상단에 금 결합 폴리펩티드를 결착시키는 5 단계;
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조방법.

  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 금 결합 폴리펩티드에 생체 물질을 추가 결합시키는 6 단계;
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조방법.

  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 항체는 자성 나노입자를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 금-형광 실리카 나노입자 복합체의 제조방법.






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