CN113484383A - 一种纳米粒子膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳米粒子膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纳米粒子膜及其制备方法和应用；所述纳米粒子膜的制备方法包括以下步骤：a)将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X‑100、氨水和正硅酸乙酯混合，进行反应，得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液；b)在步骤a)得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面，再加入甲醇，进行液‑液界面自组装，得到纳米粒子膜。与现有技术相比，本发明利用液‑液界面自组装成膜法将成本较低吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子制备成有序排列的单层纳米粒子薄膜，使其同时作为发光增强介质和发光体，进一步简化免疫检测的步骤并大幅提高了检测性和稳定性。

Description

一种纳米粒子膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及电化学发光电极技术领域，更具体地说，是涉及一种纳米粒子膜及其制备方法。
背景技术
电化学发光是通过电极表面的发光体物质与其共反应剂发生电化学反应而释放光子的过程。它结合了化学发光高灵敏度、可观察性强及电化学反应可调控性好、反应物稳定的优点，因而被广泛地应用在免疫检测、核酸分析等生物分析领域。其中，电化学发光无标记免疫传感技术因其简单快捷等优点被广泛地研究发展，这一技术是将一抗(Ab1)修饰到电极表面后，直接检测溶液中特异性抗原的浓度，不同浓度的特异性抗原与电极表面修饰的抗体结合后，会导致电极表面发生不同的变化而导致发光强度的变化。然而这种技术的检测性和稳定性不能满足实际应用的需要，近年来，各种纳米材料被应用于无标记免疫传感的设计制备上，例如石墨烯、碳量子点、MOF等纳米材料修饰到电极表面通过增强电化学反应活性都表现出了一定的电化学发光增强现象；但是由于其复杂的制备过程、高昂的成本以及检测性和稳定性仍达不到实用要求等原因，很难进一步开发并大规模应用。此外二氧化硅纳米粒子膜通过光散射作用也表现出了电化学发光增强现象，这种膜制备方法简单，价格低廉并具有高稳定性，若将发光分子富集在多孔二氧化硅纳米中将进一步增强材料的检测性。
综上，基于发光体标记检测技术的免疫传感器需要的修饰步骤繁琐复杂，其稳定性和检测性仍然不能满足实际要求；此外一些纳米材料增强发光性能的具有高稳定性检测性的免疫传感器存在制备材料过程复杂，成本高昂的问题；现有的一些基于无标记检测技术的免疫传感器在检测性和稳定性方面仍然与发光体标记检测技术存在差距。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米粒子膜及其制备方法和应用，利用液-液界面自组装成膜法将成本较低吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子制备成有序排列的单层纳米粒子薄膜，使其同时作为发光增强介质和发光体，进一步简化免疫检测的步骤并大幅提高了检测性和稳定性。
本发明提供了一种纳米粒子膜的制备方法，包括以下步骤：
a)将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯混合，进行反应，得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液；
b)在步骤a)得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面，再加入甲醇，进行液-液界面自组装，得到纳米粒子膜。
优选的，步骤a)中所述三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为30mM～50mM；
所述三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯的体积比为(0.3～0.4)：(7～8)：(0.1～0.3)：(1.5～2)：(0.04～0.08)：0.1。
优选的，步骤a)中所述混合的过程具体为：
将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷和正己醇混合搅拌，然后加入曲拉通X-100，搅拌20min～40min后加入氨水和正硅酸乙酯，得到混合物。
优选的，步骤a)中所述反应的温度为20℃～30℃，时间为20h～30h。
优选的，所述步骤a)还包括：
将得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液通过8000rpm～10000rpm离心除掉未反应的物质。
优选的，步骤b)中所述吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液、正己烷和甲醇的体积比为(2～4)：0.5：(2～4)。
优选的，步骤b)中所述液-液界面自组装的过程具体为：
在吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面后，迅速加入甲醇，使纳米粒子迅速在水-正己烷界面形成有序排列的单层纳米粒子薄膜，得到纳米粒子膜。
本发明还提供了一种纳米粒子膜，采用上述技术方案所述的制备方法制备而成。
本发明还提供了一种无标记免疫传感器，采用超灵敏电化学发光电极为基底，所述超灵敏电化学发光电极由上述技术方案所述的纳米粒子膜转移到ITO玻璃表面形成。
优选的，所述无标记免疫传感器进行抗原检测的过程具体为：
首先利用0.3M～0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05M～0.15M的N-羟基琥珀酰亚胺活化超灵敏电化学发光电极中纳米粒子膜表面的羧基基团；再将0.05mg/mL～0.15mg/mL的PSA抗体滴到电极表面，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗出去未反应的抗体；然后用质量分数为2％～4％的牛血清白蛋白覆盖纳米粒子表面的其它非特异性位点，将修饰完抗体的电极浸没于BSA溶液中，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗；最后将含有待测PSA抗原的溶液滴到电极表面，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗后，进行抗原检测试验。
本发明提供了一种纳米粒子膜及其制备方法和应用；所述纳米粒子膜的制备方法包括以下步骤：a)将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯混合，进行反应，得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液；b)在步骤a)得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面，再加入甲醇，进行液-液界面自组装，得到纳米粒子膜。与现有技术相比，本发明利用液-液界面自组装成膜法将成本较低吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子制备成有序排列的单层纳米粒子薄膜，使其同时作为发光增强介质和发光体，进一步简化免疫检测的步骤并大幅提高了检测性和稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子的透射电镜图；
图2为本发明实施例提供的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子膜的扫描电镜图；
图3为本发明实施例提供的整体技术方案的制备过程示意图；
图4为本发明实施例提供的纳米粒子膜电极修饰不同浓度的抗原后的电化学阻抗谱；
图5为本发明实施例提供的纳米粒子膜电极(a)修饰不同PSA抗原浓度与电化学发光强度的关系，(b)及其对应的线性曲线；
图6为本发明实施例提供的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子膜与无掺杂的二氧化硅纳米粒子膜及单纯ITO玻璃电极电化学发光强度的对比图；
图7为无序状态的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子膜电化学发光图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种纳米粒子膜的制备方法，包括以下步骤：
a)将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯混合，进行反应，得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液；
b)在步骤a)得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面，再加入甲醇，进行液-液界面自组装，得到纳米粒子膜。
本发明首先将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯混合，进行反应，得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液。本发明对所述三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述三联吡啶氯化钌六水合物的浓度优选为30mM～50mM，更优选为40mM；所述三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯的体积比优选为(0.3～0.4)：(7～8)：(0.1～0.3)：(1.5～2)：(0.04～0.08)：0.1，更优选为(0.33～0.35)：7.5：0.2：(1.7～1.8)：0.06：0.1。
在本发明中，所述混合的过程优选具体为：
将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷和正己醇混合搅拌，然后加入曲拉通X-100，搅拌20min～40min后加入氨水和正硅酸乙酯，得到混合物；
更优选为：
将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷和正己醇混合搅拌，然后加入曲拉通X-100，搅拌30min后加入氨水和正硅酸乙酯，得到混合物。
得到所述混合物后，本发明采用微乳液法合成吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子；所述反应的温度优选为20℃～30℃，时间优选为20h～30h，更优选为24h。
在本发明中，所述步骤a)优选还包括：
将得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液通过8000rpm～10000rpm离心除掉未反应的物质；
更优选为：
将得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液通过9000rpm离心除掉未反应的物质。
得到所述吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液后，本发明在得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面，再加入甲醇，进行液-液界面自组装，得到纳米粒子膜。本发明对所述正己烷和甲醇的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液、正己烷和甲醇的体积比优选为(2～4)：0.5：(2～4)，更优选为3：0.5：3。
本发明对所述在得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面的容器没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的培养皿即可。
本发明通过液-液界面自组装成膜法制备二维纳米粒子膜；所述液-液界面自组装的过程优选具体为：
在吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面后，迅速加入甲醇，使纳米粒子迅速在水-正己烷界面形成有序排列的单层纳米粒子薄膜，得到纳米粒子膜。
本发明利用液-液界面自组装成膜法将成本较低吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子制备成有序排列的单层纳米粒子薄膜，使其同时作为发光增强介质和发光体，进一步简化免疫检测的步骤并大幅提高了检测性和稳定性。
本发明还提供了一种纳米粒子膜，采用上述技术方案所述的制备方法制备而成。
本发明还提供了一种无标记免疫传感器，采用超灵敏电化学发光电极为基底，所述超灵敏电化学发光电极由上述技术方案所述的纳米粒子膜转移到ITO玻璃表面形成。
本发明主要想解决超灵敏电化学发光电极的制备及超灵敏免标记电化学发光传感器构建的技术问题。对此，本发明将电化学发光试剂富集在多孔二氧化硅纳米粒子中，并将这种富集了发光试剂的二氧化硅纳米粒子紧密堆积在电极表面，大大提高了发光分子的利用效率并提高了电化学发光强度，成功制备了超灵敏电化学发光电极；并且这种电极材料非常适合制备免标记电化学发光传感器。
本发明在得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子膜后，将其转移到ITO玻璃表面使其作为电化学发光电极基底进一步进行抗体的修饰和抗原检测试验。在本发明优选的实施例中，以前列腺特异抗原(PSA)为例，检测限为0.169fg/mL。
在本发明中，所述无标记免疫传感器进行抗原检测的过程优选具体为：
首先利用0.3M～0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05M～0.15M的N-羟基琥珀酰亚胺活化超灵敏电化学发光电极中纳米粒子膜表面的羧基基团；再将0.05mg/mL～0.15mg/mL的PSA抗体滴到电极表面，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗出去未反应的抗体；然后用质量分数为2％～4％的牛血清白蛋白覆盖纳米粒子表面的其它非特异性位点，将修饰完抗体的电极浸没于BSA溶液中，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗；最后将含有待测PSA抗原的溶液滴到电极表面，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗后，进行抗原检测试验；
更优选为：
首先利用0.35M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化超灵敏电化学发光电极中纳米粒子膜表面的羧基基团；再将0.1mg/mL的PSA抗体滴到电极表面，25℃反应2h，用pH为7.4的PBS清洗出去未反应的抗体；然后用质量分数为3％的牛血清白蛋白(BSA)覆盖纳米粒子表面的其它非特异性位点，将修饰完抗体的电极浸没于BSA溶液中，25℃反应2h，用pH为7.4的PBS清洗；最后将含有待测PSA抗原的溶液滴到电极表面，25℃反应2h，用pH为7.4的PBS清洗后，进行抗原检测试验。
目前，电化学发光在免疫传感中的应用主要采用夹心型免疫传感器，即将一抗(Ab1)、抗原蛋白层层修饰到电极表面，二抗(Ab2)与发光体结合，通过所表现出的发光强度来表征检测物中免疫抗原的浓度；这种检测方法需要的修饰步骤繁琐、耗时较长，并且具有更高的检测成本。而无标记检测法省略了与二抗结合的步骤，直接通过电极界面的变化所引起的电化学发光强度变化来检测溶液中抗原的浓度，相比于发光体标记法，这种方法更加简便快捷。本发明利用液-液界面自组装成膜技术制备了吡啶钌掺杂二氧化硅纳米粒子纳米薄膜，以此为基底制备的无标记免疫传感器具有更好的检测性和灵敏度，实现吡啶钌掺杂二氧化硅纳米粒子膜在电化学发光免疫传感中的应用。
本发明提供了一种纳米粒子膜及其制备方法和应用；所述纳米粒子膜的制备方法包括以下步骤：a)将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯混合，进行反应，得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液；b)在步骤a)得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面，再加入甲醇，进行液-液界面自组装，得到纳米粒子膜。与现有技术相比，本发明利用液-液界面自组装成膜法将成本较低吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子制备成有序排列的单层纳米粒子薄膜，使其同时作为发光增强介质和发光体，进一步简化免疫检测的步骤并大幅提高了检测性和稳定性。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例
(1)通过微乳液法合成吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子：
将340μL浓度为40mM的三联吡啶氯化钌六水合物、7.5mL的环己烷与0.2mL正己醇混合搅拌，然后加入1.8mL曲拉通X-100，搅拌30min后加入60μL氨水与0.1mL正硅酸乙酯；室温搅拌24h后得到均匀的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液，最后通过9000rpm离心除掉未反应的物质；所制备的纳米粒子的透射电镜图如图1所示。
(2)通过液-液界面自组装成膜法制备二维纳米粒子膜：
取3mL步骤(1)制备得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液于10mL小培养皿中，加入0.5mL正己烷形成两相界面，然后迅速加入3mL甲醇，使纳米粒子迅速在水-正己烷界面形成有序排列的单层纳米粒子薄膜，最后转移到ITO玻璃表面使其作为电化学发光电极基底进一步进行抗体的修饰和抗原检测试验；所制备得到的纳米粒子膜的扫描电镜图如图2所示。
(3)抗体的修饰和抗原检测试验：
以前列腺特异抗原(PSA)为例，检测限为0.169fg/mL；首先，利用0.35M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化纳米粒子膜电极表面的羧基基团；然后将0.1mg/mL的PSA抗体滴到电极表面，25℃反应2h，用pH为7.4的PBS清洗出去未反应的抗体；下一步用质量分数为3％的牛血清白蛋白(BSA)覆盖纳米粒子表面的其它非特异性位点，将修饰完抗体的电极浸没于BSA溶液中，25℃反应2h，用pH为7.4的PBS清洗；最后将含有待测PSA抗原的溶液滴到电极表面，25℃反应2h，用pH为7.4的PBS清洗；整体技术方案的制备过程参见图3所示。
PSA与抗体的结合会增大电极电阻并降低纳米粒子表面吡啶钌分子的释放速度从而影响电化学发光强度，如图4所示。本发明利用MPI A型多功能电化学发光分析仪检测其电化学发光强度的变化，然后根据电化学发光强度推测其浓度，其电化学发光强度与PSA抗原浓度的关系及对应的线性曲线如图5所示。
本发明利用吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子膜作为电化学发光基底，大幅增强了电化学发光强度和检测灵敏度，如图6所示，与单纯ITO玻璃电极相比具有600倍的增强，与无掺杂的二氧化硅纳米粒子膜相比具有21倍的增强；如图7所示，与无序吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子修饰电极相比，有约15.7倍增强。
本发明利用吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子膜进行了无标记免疫传感器的构建和测试，与其它类型的电化学发光免疫传感器相比，无标记检测法省略了与二抗结合的步骤，直接通过电极界面的变化所引起的电化学发光信号的变化来检测溶液中免疫抗原的浓度，更加简便快捷；此外吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子膜使其具有了优于其它类型无标记免疫传感器的高检测性和稳定性。
综上，本发明首次利用吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子通过液-液界面自组装成膜法制备了有序排列的单层纳米粒子膜，这种有序纳米粒子膜具有不同于无序纳米粒子的特殊性质，可以大幅提高电化学发光强度；并且将这种纳米粒子膜应用于免疫传感也表现出了较高的灵敏度和稳定性。
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种纳米粒子膜的制备方法，包括以下步骤：
a)将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯混合，进行反应，得到吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液；
b)在步骤a)得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面，再加入甲醇，进行液-液界面自组装，得到纳米粒子膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述三联吡啶氯化钌六水合物的浓度为30mM～50mM；
所述三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷、正己醇、曲拉通X-100、氨水和正硅酸乙酯的体积比为(0.3～0.4)：(7～8)：(0.1～0.3)：(1.5～2)：(0.04～0.08)：0.1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述混合的过程具体为：
将三联吡啶氯化钌六水合物、环己烷和正己醇混合搅拌，然后加入曲拉通X-100，搅拌20min～40min后加入氨水和正硅酸乙酯，得到混合物。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述反应的温度为20℃～30℃，时间为20h～30h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)还包括：
将得到的吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液通过8000rpm～10000rpm离心除掉未反应的物质。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液、正己烷和甲醇的体积比为(2～4)：0.5：(2～4)。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述液-液界面自组装的过程具体为：
在吡啶钌掺杂的二氧化硅纳米粒子溶液中加入正己烷形成两相界面后，迅速加入甲醇，使纳米粒子迅速在水-正己烷界面形成有序排列的单层纳米粒子薄膜，得到纳米粒子膜。
8.一种纳米粒子膜，采用权利要求1～7任一项所述的制备方法制备而成。
9.一种无标记免疫传感器，采用超灵敏电化学发光电极为基底，其特征在于，所述超灵敏电化学发光电极由权利要求8所述的纳米粒子膜转移到ITO玻璃表面形成。
10.根据权利要求9所述的无标记免疫传感器，其特征在于，所述无标记免疫传感器进行抗原检测的过程具体为：
首先利用0.3M～0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05M～0.15M的N-羟基琥珀酰亚胺活化超灵敏电化学发光电极中纳米粒子膜表面的羧基基团；再将0.05mg/mL～0.15mg/mL的PSA抗体滴到电极表面，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗出去未反应的抗体；然后用质量分数为2％～4％的牛血清白蛋白覆盖纳米粒子表面的其它非特异性位点，将修饰完抗体的电极浸没于BSA溶液中，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗；最后将含有待测PSA抗原的溶液滴到电极表面，20℃～30℃反应1h～3h，用pH为7.3～7.5的PBS清洗后进行抗原检测试验。
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