KR20100102273A

KR20100102273A - 형광-표면증강라만산란 도트를 이용한 다중 마커의 정량 분석법

Info

Publication number: KR20100102273A
Application number: KR1020090020563A
Authority: KR
Inventors: 조명행; 이윤식; 정대홍; 우민아; 김성용; 이상명
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2010-09-24

Abstract

본 발명은 다중 마커의 정량 분석 방법에 관한 것으로, 시료내 다중 마커에 특이적인 형광-표면증강라만산란 도트 혼합물을 시료에 처리하는 단계 및 다중 마커에 해당하는 라만 신호를 측정하여 다중 마커의 상대적인 양을 산출하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 시료내 다중 마커를 고감도, 고선택성으로 정량 분석이 가능하다.

형광-표면증강라만산란입자, 면역 측정법, 폐 줄기세포, 라만 분광학

Description

형광-표면증강라만산란 도트를 이용한 다중 마커의 정량 분석법{Method for Quantification of Multiple Markers Using F-SERS dots}

본 발명은 시료내 다중 마커에 대한 정량 분석 방법에 관한 것이다.

현재까지 면역형광(immunofluorescence (IF)) 측정법은 생물 조직에서 발현된 단백질의 분포와 편재화를 규명하기 위해 널리 사용되어 왔다. 형광계 물질은 생물 분야에서 널리 이용되어 왔고(M. C. Pirrung et al. J. Am. Chem. Soc., 122, 1873 (2000); S. D. Duhachek et al. Anal. Cem., 72, 3709 (2000); B. He et al. Anal. Chem., 73, 1942 (2001); A. H. Peruski et al. J. Immunol. Methods., 263, 35 (2002)), 다양한 형광 염료가 다중 조직 분석(multiplex tissue analysis)에 이용되어 왔다. 그러나, 형광 분자 스팩트럼은 거대한 방사 피크 너비(>50nm)로 인하여 오버래핑(overlapping)되고 광-표백(photo-bleaching) 문제점을 가지고 있다(S. Keren et al. PNAS, 105, 5844-5849 (2008)). 종래의 형광 라벨과 유사하게, SERS(surface enhanced Raman scattering)는 날카롭고 구별되는 진동 밴드를 통하여 분자 정보를 분석할 뿐만 아니라 생물 분석물을 검출하는데 이용될 수 있다(J. Kneipp et al. Chem. Soc. Rev., 37, 1052-1060 (2008); C. C. Lin et al. Biosensors and Bioelectronics, (2008) [Epub ahead of print]; K. Nithipatikom et al. Analytical Biochemistry, 322, 198-207 (2003); R. J. Swain et al. Biochemical Society Transactions, 35, 3 (2007); S. Y. Lee et al. Anal. Chem., 79, 916-922 (2007); B. Lutz et al. J Histochem Cytochem., 56, 371-9 (2008); L. Sun et al. Nano Lett., 7, 351-356 (2007)). 금속 나노입자를 이용한 SERS는, 낮은 강도로 인하여 면역측정에서 판독 방법이 요구되는 충분한 감수성을 가지고 있지 않은, 보통의 라만 산란의 한계를 극복할 수 있는 것으로 여겨졌다. SERS 기술은 라만 신호 강도를 10⁶-10¹⁴ 배 향상시켜, 피코(pico) 내지 펨토(femto) 몰 양의 생물분자를 검출하는데 충분하다(C. C. Lin et al. Biosensors and Bioelectronics, (2008) [Epub ahead of print]; S. Y. Lee et al. Anal. Chem., 79, 916-922 (2007); L. Sun et al. Nano Lett., 7, 351-356 (2007)). 라만 활성 분자의 존재하에서 기능화되는 SERS 나노입자는 생물 시료(DNA, 단백질, 세포 또는 조직)의 검출, 센싱 또는 이미지에 이용되어 왔다. 상기 입자는 신속하고, 민감하고, 다중 진단으로서 우수한 잠재력을 가지고 있다.

Sha 등은 Oxonica Inc.에 의해 고안된 Nanoplex^TM 바이오태그(biotag)가 생물학적 측정에서 검출 라벨로서 유용함을 소개하였다. 자기 입자와 SERS 바이오태그를 이용하여 매우 저농도의 HIV 올리고뉴클레오타이드 타겟을 검출하기 위해 노력 하였다. 상기 두 입자 기반 측정은 특이성과 감수성이라는 장점을 입증하였다(M. Y. Sha et al. Nanomedicine, 2, 725-734 (2007)). 또한, Nithipatikom 등은 온전한 단일 세포에서 세포 단백질을 검출하는데 공초점 라만 미세분광법(microspectroscopy)과의 콘주게이션에 대한 두 가지 방식을 개시하였다. 첫째, 라만 라벨을 마커로서의 생물분자에 부착하였다. 둘째, 은 콜로이드를 라만 산란 신호의 향상을 위해 이용하였다. 그리하여, 단일 세포에서 12-LO 및 COX-1의 편재화에 대한 정보를 얻었다(K. Nithipatikom et al. Analytical Biochemistry, 322, 198-207 (2003)). Lee 등은 생존 세포를 표지하기 위한 항체와 콘주게이션된 Ag/Au 코어(core)-셸(shell) 나노입자를 PLCγ1 암 마커를 발현하는 HEK293 세포를 이미지화하는 이용하였다. SERS 이미지는 암과 정상 세포가 명확하게 구별될 수 있음을 보여주었다(S. Y. Lee et al. Anal. Chem., 79, 916-922 (2007)). 본 발명자들은 유기 라만 라벨 화합물이 혼입된 실리카 구체에 은 나노입자가 포매된 새로운 Surface Enhanced Raman Spectroscopic Dots (SERS Dots^TM)를 소개하였다. CD10 및 HER-2 항체가 콘주게이션된 SERS 도트는 암에서 세포 라벨링의 특이적 타겟팅에 성공적으로 적용되었다(J. H. Kim et al. Anal. Chem., 78, 6967-6973 (2006)).

최근, SERS 활성 나노입자를 이용한 다중 조직 분석법은 더욱 발달하였다. Su 등은 COINs(composite organic-inorganic nanoparticles) 라고 불리우는 나노입자에 대한 새로운 합성법을 개발하였고, 화학적으로 SERS 유사 기호(signature)를 코딩하였다. 그 후에 두 개의 상이한 COINs는 전립선 조직 절편의 직접적 결합 측 정법에도 적용되었다(L. Sun et al. Nano Lett.x, 7, 351-356 (2007); X. Su et al. Nano Lett., 5, 49-54 (2005)). 또한, 본 발명자들은 F-SERS Dots^TM(Fluorescent Surface Enhanced Raman Spectroscopic Dots)이라고 명명된 새로운 타입의 SERS 도트를 개발하였다. 생체적합성이고 다기능성인 F-SERS 도트는 형광 유기 염료 및 특이적 라만 라벨링을 가지고, 은 나노입자가 포매된 실리카 구체로 구성되어 있다. 2개의 상이한 코딩 화합물을 갖도록 제조된 F-SERS 도트를 이용한 면역측정법은 조직 절편에서 BAX/BAD 단백질 발현의 다중 타겟팅, 트래킹(tracking) 및 이미지를 수행할 수 있다(K. N. Yu et al. Bioconjugate Chem.,18, 1155-1162 (2007)). 둘 이상의 분석물이 동시에 검출되는 다중 조직 분석법은 단백질 발현의 공 발현 및 공간적 분포를 연구하기 위한 강력한 전략이고, 조직 시료를 거의 소비하지 않는 장점이 있다(C. C. Lin et al. Biosensors and Bioelectronics, (2008) [Epub ahead of print]; L. Sun et al. Knudsen, Nano Lett., 7, 351-356 (2007)). 그러나, 다중 마커의 정량이 가능한 시스템이 완전히 구현되지 않았다.

기존의 면역 측정법이 갖는 문제점들을 해결하여 시료내 생체 분자를 다중 정량 분석하기 위한 시스템이 요구된다. 본 발명자는, 형광-표면증강라만산란 입 자를 이용하여 시료에 존재하는 복수개의 마커를 동시에 정량 분석하기 위한 시스템을 구현하였다.

본 발명은 시료내 다중 마커에 특이적인 형광-표면증강라만산란 도트 혼합물을 시료에 처리하는 단계; 및 라만 신호를 측정하여 다중 마커의 상대적인 양을 산출하는 단계를 포함하는 다중 마커의 정량 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 시료내에 존재하는 복수개의 마커를 동시에 검출 및 정량 분석할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "마커"는 시료내의 검출 및/또는 확인하려는 흥미있는 어떠한 원자, 화학물질, 분자, 화합물을 의미한다. 본 발명의 방법으로 분석가능한 마커로 생체 물질, 구체적으로, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 당단백질, 지단백질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고당, 다당류, 지방산, 지질, 호르몬, 대사물질, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경 전달 물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사물질, 보조인자, 저해제, 약물 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

이를 위하여, 분석하고자 하는 마커를 특이적으로 인지하는 형광-표면증강라만산란 도트를 각각 제작하고, 제작된 형광-표면증강라만산란 도트의 혼합물을 시료에 동시에 처리한다. 형광-표면증강라만산란 도트 혼합물은 시료의 종류에 따라 적합한 방법과 시간으로 처리한다.

본 발명에서 다중 마커의 정량 분석에 사용되는 "형광-표면증강라만산란 도트(F-SERS dots)"는 형광 신호와 라만 신호를 모두 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 시료내 마커에 특이적으로 결합 가능한 반응분자를 가지는 것을 특징으로 하며, 구체적으로, 실리카 나노입자 표면에 금속이 포매된 금속나노입자 층; 상기 금속나노입자층에 형성된 라만 프로브 및 형광 프로브 층; 상기 층에 형성된 기능기 층; 및 상기 기능기층에 부착된 반응분자를 포함하는 형태이다.

본 발명에서 형광-표면증강라만산란 도트(F-SERS dots)의 라만 신호 증강에 사용되는 금속으로, 금, 은, 팔라듐, 백금, 알루미늄, 이리듐, 오스뮴, 로듐 및 루테늄과 같은 금속 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 형광-표면증강라만산란 도트는 라만 신호 및 형광 신호를 모두 가지는 것을 특징으로 하며 이를 위하여 금속나노입자 층에 라만 프로브 및 형광 프로브 층을 모두 가진다.

형광-표면증강라만산란 도트의 라만 프로브로, 4-머켑토톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토- 1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

형광-표면증강라만산란 도트의 형광 프로브로, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate), 로다민 6G (rhodamines 6G), 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD), 액티노마이신 D(Actinomycin D), 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine), 디에이피아이(DAPI), 디하이드로에티듐(Dihydroethidium), 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide), 에티듐 호모다이머-1(EthD-1), 에티듐 호모다이머-2(EthD-2), 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide), 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide), 비스벤지마이드(bisbenzimide), 호에크스트 33342 (Hoechst 33342), 호에크스트 34580(Hoechst 34580), 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine), 엘디에스 751(LDS 751), 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI), Cy3, Cy5, 알렉사플루오로 405, 알렉사플루오로 430, 알렉사플루오로 488, 알렉사플루오로 532, 알렉사플루오로 546, 알렉사플루오로 555, 알렉사플루오로 568, 알렉사플루오로 594, 알렉사플루오로 633, 알렉사플루오로 647, 알렉사플루오로 660, 알렉사플루오로 680 및 알렉사 플루오로 700 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

형광-표면증강라만산란 도트의 기능기는 반응분자를 부착시킬 수 있는 물질로, 마커에 결합되는 반응분자와 형광-표면증강라만산란입자를 연결해주는 역할을 한다. 기능기로, 티올기(-SH), 아민기(-NH₂) 및 카르복실기 (-COOH) 기 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 기능기층은 에틸렌클리콜과 같은 스페이서를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 용어, "반응분자"는 특정 마커와 결합 및/또는 반응이 가능한 물질로, 반응분자와 시료내 마커와의 결합은 라만산란 및 형광을 이용하여 확인할 수 있다. 구체적으로, 반응분자는 효소기질, 리간드, 항체, 항체 단편, 단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 수용체 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 정량분석은 다중 마커에 해당하는 라만 신호, 즉 라만 스텍트럼으로부터 다중 마커의 상대적인 양을 산출하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, "라만 신호"란, 라만 스펙트럼 또는 라만 스펙트럼의 일부를 의미하고, "라만 스펙트럼"이란 조사 진동수의 함수로 산란, 전자기 조사, 강도간의 관계를 의미한다.

라만 스펙트럼의 분석을 위하여, 우선, 라만 프로브가 가지는 고유 피크 위치를 선정한다. 예를 들어, MT는 1593 cm^-1, BT는 997 cm^-1, NT는 1378 cm^-1에서 피 크를 나타낸다.

본 발명에서는, 불규칙한 피크를 평균화시키기 위하여 "피크 높이"를 측정하는 분석 방법을 확립하였다. 본 발명에서, "피크 높이"란, 피크탑 강도가 피크를 기준으로 설정된 좌측 및 우측 기준 영역에서의 평균 강도를 이용하여 보정된 수치를 의미하고, 구체적으로 측정된 피크탑 강도에서 평균 강도를 감하여 계산된다. 좌측 및 우측 기준 영역은 5-15 cm^-1 구간에서 설정될 수 있다.

본 발명에서, 라만 신호를 측정하는 단계는, 처리되는 라만 프로브 각각에 대하여, 시료내에서의 형광-표면증강라만산란 도트에 대하여 라만 신호의 합계를 산출하는 단계; 및 상기 얻은 합계를 프로브의 광-표면증강라만산란 도트 대조 평균값으로 나누어서 평준화시키는 단계를 포함한다.

즉, 시료내 형광-표면증강라만산란 도트 혼합물에 대한 라만 신호로부터 다중 마커의 정확한 정량을 위하여, 획득된 데이터 수치는 그대로 사용되는 것이 아니라, 본 발명의 방법으로 처리 및 보정을 거치게 된다.

구체적으로, 각 라만 프로브에 대하여, 라만 신호 실험치 합계를 대조 평균값으로 나누어서 평준화된 수치를 얻게 되고, 라만 프로브 간에 상기 평준화된 수치를 비교함으로써, 다중마커에 대한 상대적 양을 분석할 수 있다. 이 수치는 백분율로도 나타낼 수 있다.

예를 들어, 세포에서 타겟 단백질 A와 타겟 단백질 B의 상대적인 양을 본 발명의 방법으로 측정하고자 할 때, 단백질 A에 대하여 특이적으로 결합하는 라만 프 로브 A와 단백질 B에 대하여 특이적으로 결합하는 라만 프로브 B를 각각 제작하여 세포에 처리한다. 세포에서 라만 프로브 A에 대한 라만 신호를 모두 합계하며 라만 프로브 B에 대한 라만 신호를 모두 합계하여 각각에 대한 합계치를 얻는다. 상기 실험으로 얻은 합계를 보정하기 위한 목적으로, 동일 농도의 라만 프로브 A와 라만 프로브 B에 대하여 라만 신호의 대조 평균값을 각각 측정한다. 라만 프로브 A에 대하여 세포에서 측정된 라만 신호 합계를 라만 프로브 A의 평균값으로 나누고, 라만 프로브 B에 대한 라만 신호 합계를 라만 프로브 B의 평균값으로 나눌 경우, 세포내에서 타겟 A와 B의 상대적 양에 대한 평준화된 수치를 얻을 수 있다. 이를 백분율로도 나타낼 수 있다.

본 발명의 정량 분석은 공지된 라만 분광법에 의해 검출되거나 확인될 수 있다. 라만 분광법에 의한 분석물의 검출을 위한 여러 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

본 발명에 따른 형광-표면증강라만산란 도트를 이용하는 정량 분석 방법으로 시료내 다중 마커의 신속, 민감, 정확한 정성 및 정량 분석이 가능하다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1-1: 티올화된 실리카 나노입자 주형의 제조

약 120nm 크기의 실리카 나노입자를 Stㆆber 방법으로 제조하였다(W. Stober, A. et al. Journal of Colloid and Interface Science, 26, 62-69 (1968)). 1mL의 수산화암모늄(27%)을 78mL의 에탄올(95%) 및 10mL의 H₂O에 첨가한 후, 5mL(22.4 mmol)의 TEOS (tetraethylorthosilicate)를 상기 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 막대자석으로 12시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 이렇게 얻어진 실리카 콜로이드는 원심분리하여, 수차례 에탄올로 세척하였다. 티올화된 실리카 나노입자를 얻기 위하여, 300mg의 실리카 나노입자를 에탄올에 분산한 후, 150㎕의 (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane (MPTS) 및 300㎕의 수산화암모늄을 상기 콜로이드 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 막대자석으로 12시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 이렇게 얻어진 티올화된 실리카 나노입자를 원심분리하여, 에탄올로 수차례 세척하여 과량의 시약들을 제거하였다.

실시예 1-2: 은이 포매된 실리카 나노입자의 제조

은 나노입자는 Sn²⁺환원방법으로 실리카 나노입자의 표면에 포매시켰다(Y. Kobayashi et al. Journal of Colloid and Interface Science, 283, 601-604 (2005)). 먼저, 160mg의 티올화된 실리카 나노입자를 물/에탄올 용액(15mL/15mL)에 분산한 후, 100㎕의 TFA(trifluoroacetic acid)와 100 mg의 SnCl₂를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 이렇게 얻어진 실리카 나노입자를 원심분리하여, 에탄올(20mL)로 3회 세척하였다. Sn²⁺로 코팅된 실리카 나노입자를 250mL의 물에 재분산하고, 50mL의 6 mM AgNO₃를 25℃에서 자석으로 강하게 교반하면서 방울방울 첨가하였다. 분산액을 원심분리하여, H₂O(30mL)로 2회 및 EtOH (30mL)로 2회 세척하여, 과량의 시약을 제거하였다.

실시예 1-3: 은이 포매된 실리카 나노입자로 형광 및 라만 태그 물질의 통합

실리카 나노입자에 라만 산란 및 형광 이중 신호를 도입하기 위하여, 라만 활성 화합물로 MT(mercaptotoluene), BT(benzenethiol) 및 NT(naphthalenethiol)가, 형광 태그 화합물로 FITC(fluorescein isothiocyanate) 및 AF647(Alexafluoro^® 647)이 사용되었다. 먼저, 라만 활성 화합물은 실리카 나노입자의 은 표면 상에 자가 어셈블리 단층을 형성하도록 하는 MPTS와 함께 도입되었다. 라만 활성 화합물 (10mL of 5 mM in ethanol)과 MPTS (10mL of 50 mM in ethanol)를 혼합하여, 50mg의 은이 포매된 실리카 나노입자에 첨가하였다. 분산물을 1시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 콜로이드를 원심분리하여, 에탄올 (20mL)로 3회 및 물 (20mL)로 세척하였다. 이 실리카 나노입자를 20mL의 물에 분산하였고, 30㎕의 수용성 규산나트륨 (27%)을 첨가하고 12시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 이렇게 얻어진 콜로이드를 원심분리하고 물 (20mL)로 3회 및 에탄올 (20 mL)로 세척하여 과량의 시약을 제거하였다.

다음 단계에서, 형광 층이 라만 신호로 라벨링된 실리카 나노입자 상에 도입되었다. 이를 위해, APS(3-aminopropyltriethoxysilane) 및 형광 염료의 콘주게이트를 합성하였다. FITC의 경우에, FITC (10㎕ of 8 mM in DMSO)를 APS (100㎕ of 19.2 mM in ethanol)에 첨가하고, 얻어진 용액을 6시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 그 다음, FITC-APC 콘주게이트, 20㎕의 TEOS 및 40㎕의 수용성 수산화암모늄 (25%)을 라만 라벨을 가진 20mg의 실리카 나노입자에 첨가하였다. 그 혼합물을 12시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 이렇게 얻어진 나노입자(F-SERS dots)를 원심분리하고 에탄올로 충분히 세척하였다.

실시예 1-4:F-SERS 도트의 표면 기능화

정제된 나노입자는 캔틸레버(cantilever) 표면에 대한 나노입자의 비특이적인 단백질 결합을 감소시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜 스페이서(polyethylene glycol (PEG) spacer)로, 나노입자에 기능성을 도입하기 위해 아미노기로 코팅하였다. 메톡시-PEG 스페이서인 2-[methoxy(polyoxyethylene)propyl]trimethoxysilane (mPEG600-Si, mw:~600) (11 mg, 0.5 mM) 및 APS (0.22 mg, 0.1 mM)를 100㎕의 수산화암모늄 용액과 함께 10mL 에탄올에 용해하였고, 10mg의 기능하지 않는 F-SERS 도 트의 분산액에 첨가하였다. 혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반하였고, mPEG600/-NH₂로 커버된 최종 F-SERS 도트를 에탄올로 세척하였다. 아미노 말단기를 카르복실기로 전환하기 위해, 1mg의 F-SERS 도트를 DMF(N,N-dimethylformamide)에 녹인 50 mM 숙신산 무수물 및 50 mM DIEA(N,N-diisopropyethylamine)로 2시간 동안 실온에서 처리하였다. 이렇게 얻은 나노입자를 DMF, 에탄올 및 탈이온수로 순차적으로 세척하였다.

실시예 1-5: 항체와 콘주게이션된 F-SERS 도트의 제조

F-SERS 도트를 CD34 (Abcam, Cambridge, UK), Sca-1 (R&D systems, MN, USA) 및 SP-C (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 모노클로날 항체와 콘주게이션하였다. 카르복실기와 아민기간의 일반적인 생물학적 콘주게이션 방법은 다음과 같다: 1mg의 카르복실화된 F-SERS 도트를 1mL MES 완충용액(pH 6.0)에 분산하고, MES 완충용액에 녹인 50 mg/mL EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 중 50㎕ 및 MES 완충용액에 녹인 50 mg/mL NHS (N-hydroxysuccinimide) 중 50㎕를 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 활성화된 F-SERS 도트를 MES 용액으로 한 차례 씻어주고, MES 완충용액에 재분산하였다. 40㎍의 모노클로날 항체를 상기 분산액에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 항체가 콘주게이션된 F-SERS 도트는 PBS-T (1% Tween 20을 포함한 PBS), PBS로 순차적으로 씻어주고, 광으로부터 격리시켜 4℃에 서 보관하였다.

실시예 1-6: F-SERS 도트의 평균 SERS 강도의 측정

1.5 ml 튜브에 F-SERS 도트 (20㎍ in 100% ethanol)를 마이크로-원심분리(microcentrifugation)에 의해 스핀 다운(spin-down)시켰다. 에탄올을 완전히 건조시킨 후, F-SERS 도트 펠렛의 초점을 라만 레이저에 맞추어 SERS 강도를 측정하였다. 이 시스템에서, 라만 산란 신호는 180° 산란 기하학(scattering geometry)에서 수집하였고, 열전기적으로 냉각되는 CCD 검출기가 구비된 분광광도계로 검출되었다. 아르곤이온 레이저(Melles Griot, 35-MAP-321)의 지속파(continuous wave)로부터 나오는 514.5nm 레이저 선이 광 여기 소스(photo-excitation source)로서, 시료에서 1.7mW의 레이저 파워로 이용되었다. 라만 분산 광은 x10 현미경 대물렌즈(Olympus, 0.25 NA)로 수집되었고, 상기 대물렌즈는 여기 레이저 광의 초점을 맞추는 데에도 이용되었다. 그 다음 강력한 레일리(Rayleigh) 산란광은 홀로그래픽 노치 필터(holographic notch filter)를 이용하여 거부하였다. F-SERS 도트로부터 유도된 모든 스펙트럼의 습득 시간은 20초이고, 측정 부위는 임의적으로 선택되었다.

실시예 1-7: 세포 배양 및 F-SERS 도트 처리

아벨손 쥐과 백혈병 바이러스 유도 종양 세포(Abelson murine leukemia virus-induced tumor cells) RAW 264.7은 ATCC(The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 입수하였다. 상기 세포를 10% FBS(fetal bovine serum, Hyclone, Logan, UT, USA) 및 100 units/ml 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, CA, USA)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, PAA Laboratories, Pasching, Austria)에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO₂-95% 공기를 보유한 습한 환경에 정치하였다. 배지에서 성장시킨 후, 세포를 트립신/EDTA 용액 (Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 배양 플라스크로부터 분리하고 원심분리로 회수하였다. 그 후 세포를 1xPBS 용액 (8.1 mM Na₂HPO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCL, pH 7.4)으로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 2시간 동안 4℃에서 고정하였다. 고정제를 원심분리로 제거한 후, 세포 현탁액을 비특이적 결합 자리를 차단하기 위해, 1시간 동안 실온에서 1xPBS에 녹인 3% BSA(bovine serum albuminA)와 정치하였다. 차단 후, 1㎍/ml DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)(Sigma-Aldrich, MO, USA)로 핵 염색을 수행하고, 세포를 1xPBS 용액으로 한 차례 더 깨끗하게 세척하였다. Sca-1 항체와 콘주게이션된 F-SERS 도트 및 CD34 콘주게이션된 F-SERS 도트를 각각 다른 세포 현탁액(in 1% BSA 용액)에 첨가하고 세포를 하룻밤동안 4℃에서 정치하였다. 정치 및 강력한 세척 후에, 세포를 공초점 레이져 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

실시예 1-8: 조직 준비 및 F-SERS 도트 처리

폐 조직 시료는 15 주령의 비소폐암(non small lung cancer (NSLC)) 실험 동물 모델인 K-ras null 마우스로부터 수집하였다. 포르말린 고정되고, 파라핀으로 포매된 조직 절편을 4㎛로 절단하고 현미경 슬라이드 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)로 옮겼다. 조직 절편을 자일렌에서 탈파라핀 처리하고 알코올 구배를 통해 재수화하였다. 항원 복구를 위해 150ml의 프로테인아제 K로 정치하고 1xTBS (100 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.5)로 세척한 후, 얼음으로 차게 한 메탄올 아세톤 혼합물(v:v 1:1)로 10분 동안 고정하였다. 조직 절편을 1xTBS로 세척한 후, 조직 절편을 1x TBS에 녹인 0.025% Triton X-100에서 10분 동안 씻어주어 표면 장력을 감소시킨 후, TBS-T (0.1% Tween 20을 포함한 TBS)에 녹인 3% BSA로 1시간 동안 실온에서 정치하여 비특이적인 결합 자리를 차단하였다. 차단 후에, 1㎍/ml DAPI로 핵 염색을 실시하였다. 조직 절편을 TBS-T로 10분 동안 세척하고, 3종의 F-SERS 도트의 혼합물을 10% 글리세롤 및 0.003% Triton X-100으로 보충된 1xPBS에서 희석하여 조직 슬라이드에 추가하였다. 슬라이드를 어두운 조건 하에서 4℃에서 하룻밤 동안 정치하였다. 정치 및 강력한 세척 후, 커버 슬립을 봉입제(DAKO, Carpinteria, CA, USA)를 사용하여 표본 제작하고, 조직을 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰하였다.

실시예 1-9: 세포 및 조직 시료의 라만 분석

라만 기계의 사용은 현미경 대물렌즈, 레이저 파워 및 습득 시간을 제외하고는, 전술된 F-SERS 도트의 평균 강도를 측정하는 경우와 동일하였다. 타겟 세포 의 선택된 영역은 1㎛ x 1㎛ 스텝에 의해, 자동화된 X-Y 단계를 이용하여 x, y 방향으로 스캐닝되었고, 라만 신호는 각 스텝별로 10초 동안 수집되었다. 라만 분산 광은 x100 현미경 대물렌즈(Olympus, 0.90 NA)로 수집되었고, 상기 대물렌즈는 여기 레이저 광의 초점을 맞추는 데에도 이용되었다. x100 현미경 대물렌즈의 경우, 시료에서 레이저 파워는 490μW이었다.

실시예 2: F-SERS 도트(_MT-FITC-CD34/_{BT-AF647-Sca1}/_NT-AF647-SPC)의 합성

지지 물질로서 실리카 나노입자(약 120nm)가 성공적으로 합성되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 은 나노입자가 Sn²⁺환원 방법으로 제조되어 실리카 나노입자 상에 포매되었고(도 2a), MPTS와 함께 MT, BT 및 NT와 같은 라만 화합물로 작제되었다. Ag 나노입자가 포매되고, 라만 화합물을 함유한 실리카 나노입자는 실리카 셸(shell)로 오버코팅되었다. 도 2b에 나타낸 라만 스펙트럼은 라만 화합물이 성공적으로 코딩되었음을 보여준다. 그 후 나노입자를 염기성 조건에서 APS-유기 염료 (FITC 또는 AF647)/TEOS로 처리하여 F-SERS 도트를 형성하였다. 특정 크기의 나노입자가 거의 균일하게 형성되었다(도 2c). F-SERS 도트와 항체를 콘주게이션하기 위해, F-SERS 도트의 표면을 친수성 스페이서 및 아민기(mPEG600-Si 및 APS)로 수식하였다. 도 2d에 나타낸 TEM 이미지는 F-SERS 도트의 형태가 표면 기능성(functionalization)을 보유함을 보여준다. 아민 말단기를 카르복실 말단기로 전환하기 위해, F-SERS 도트를 숙신산 무수물로 처리하였다. 그 후에, F-SERS 도 트는 EDC 커플링법을 통해 줄기 세포 동정을 위한 항체와 성공적으로 콘주게이션될 수 있었다. F-SERS 도트 합성의 각 단계는 TEM, EDX 및 Raman 분광법을 통해 분석되었다. F-SERS 도트의 크기 및 형태는 고해상도 투과 전자 현미경(HR-TEM, JEM-3010, Jeol Inc., NY, USA)으로 관찰되었다. EDX 스펙트럼은 HR-TEM 에너지 분산 X-ray 분광광도계 (Jeol Inc., JEM-3010)로 기록되었다.

실시예 3: F-SERS 도트의 피크 높이 분석

SERS 강도 측정을 일반화하기 위해, 피크 높이를 계산하는 분석 방법을 확립하였다. 조직에서 라만 결과를 SERS 강도의 측면에서 객관적으로 제공하기 위하여, 조직에서 라만 결과로부터 추출된 라마 스펙트럼을 이용함으로써 피크 높이 분석의 예시를 적시하였다. 도 3a, 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이 각 F-SERS 도트의 특이적 라만 밴드는 스펙트럼의 오버랩핑(overlapping)이 없는 조건에서 MT에서는 1593 cm^-1, BT에서는 997 cm^-1, NT에서는 1378 cm^-1이었다. 양측의 불규칙한 피크를 평균화하기 위하여, 8 cm^-1 구간에서 좌측 및 우측 기준을 각각 설정하였다. 그런 다음 좌측 및 우측 기준선 영역의 SERS 강도의 평균을 구하였다. 이로부터 타겟 피크의 양측에 있는 기준 영역의 평균 강도를 구할 수 있었다. 피크 탑 강도로부터 그 값을 뺄셈하여 최종적으로 타겟 피크의 피크 높이를 계산하였다. 표 1에 피크 높이 분석에 대한 계산 결과를 나타내었다.

피크 높이 분석에 대한 계산 결과

라만표지	특이적 피크 밴드(cm^-1)	좌측 기준 범위(cm^-1)	우측 기준 범위(cm^-1)	좌측 및 우측 기준의 평균강도(a.u.)	피크 탑의 강도(a.u.)	피크 강도(a.u.)
MT	1593	1578~1586	1600~1608	2280.0	2877.0	597.0
BT	997	982~990	1003~1011	2355.5	3028.0	672.5
NT	1378	1364~1372	1387~1395	2596.0	2951.0	355.0

실시예 4: F-SERS 도트의 특이적인 세포의 표적

F-SERS 도트의 특이적 타겟능을 조사하였다. RAW 264.7 세포(Abelson murine leukemia virus-induced tumor cells)가 모델 시스템으로서 선택되었다. 상기 세포는 세포 표면에 Sca-1 항원을 발현하지만, CD34 항원은 발현하지 않는다(B. Brachvogel et al. Experimental Cell Research, 313, 2730-2743 (2007)). Sca-1 항체가 콘주게이션된 F-SERS 도트 및 CD34 항체가 콘주게이션된 F-SERS 도트를, 비특이적인 흡수를 억제하고 반응하지 않은 말레이미드기를 차단하기 위하여 BSA(bovine serum albumin)을 함유하는 두 개의 상이한 세포 현탁액에 처리하였다. 도 4a는 라만 프로브로서 BT가 태그되고, AF647(적색)이 고정되고, Sca-1 항체가 콘주게이션된 F-SERS 도트가 세포 표면에 결합하였음을 보여준다. F-SERS 도트의 적색 형광 신호는 대부분의 세포에서 검출되었다. 반면에 라만 프로브로서 MT가 태그되고, FITC(녹색)이 고정되고 CD34 항체가 콘주게이션된 F-SERS 도트로 처리된 RAW 264.7 세포에서는 형광 신호가 관찰되지 않았다. 도 4a와 4b의 (b)의 상단 이미지는 라만 분광법을 이용한 스캐닝 영역을 나타낸 것이고, 도 4a와 4b의 (b)의 하단 이미지는 상기 이미지에 나타낸 영역에 상응하는 997 cm^-1 BT 라만 밴드 및 1593 cm^-1 MT 라만 밴드에 대한 SERS 강도 맵을 나타낸 것이다. 각각 선택된 라만 스펙트럼을 도 4a 및 4b의 (c)에 나타내었다. F-SERS 도트 _{BT-AF647-Sca1}로 처리된 Raw 264.7 세포는 형광 및 SERS 신호에 의해 검출되었지만, F-SERS 도트 _MT-FITC-CD34로 처리된 세포는 검출되지 않았다. 결과적으로, F-SERS 도트는 특정 단백질을 표적하는데 적합하다는 것을 평가하였다.

실시예 5: 3종 F-SERS 도트(_MT-FITC-CD34/_{BT-AF647-Sca1}/_NT-AF647-SPC)로 처리된 쥐과 폐의 CLSM 분석

BASCs(Bronchioalveolar stem cells)는 국소적 폐 줄기 세포 집단으로, 폐에서 암의 발달 뿐만 아니라 자가 재생 및 다능성을 보이고 있다. 그리고, 상기 집단은 BADJ(bronchioalveolar duct junction)에서 동정되었다(C. F. Kim et al. Cell, 121, 823-835 (2005); A. Giangreco et al. American Journal of Pathology, 161, 1, (2002); C. F. Kim Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 293, 1092-1098, (2007); R. N. Walston et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 294, 6 (2008)). 쥐과 폐에서 BASCs의 검출을 위해, 3종의 F-SERS 도트(_MT-FITC-CD34/_{BT-AF647-Sca1}/_NT-AF647-SPC)를 이용한 다중 면역측정법이, 면역형광(immunofluorescence, IF) 측정법과 유사한 방식으로 수행되었다. 조직 슬라이드를 F-SERS 도트 혼합물로 정치한 후에 종말 세기관지(terminal bronchiole, TB)의 이미지를 얻어, 더욱 정확한 BASCs의 인지를 위해 BADJ 영역을 800배 확대하였다(도 5의 (B)). 전술된 바와 같이, 녹색은 CD34 단백질의 발현을 나타내고(도 5의 (C)) 적색은 Sca-1 또는 SP-C 단백질의 발현을 나타낸다(도5의 (D)). 그러나, CLSM 분석을 통해서, Sca-1 및 SP-C 단백질 발현을 정확하게 구별할 수 없었다. 이들이 모두 AF647 형광 신호를 가져 적색을 나타내기 때문이다. 3개 단백질에 대한 정확한 정보를 얻기 위해, 흰색 선으로 표시된 BADJ 부분을 라만 분석을 위한 영역으로서 선택되었다.

실시예 6: BADJ의 SERS 강도 맵핑

BASCs의 3개 단백질을 동정하기 위해, 형광 이미지에서 선택된 라만 분석을 위한 영역의 맵핑을 실시하였다. MT, BT 및 NT SERS 신호에 의해 구분되는 3개의 맵핑 이미지를 얻을 수 있었다. 3개의 맵은 CD34 단백질에 상응하는 1593 cm^-1의 MT 라만 밴드(도 6의 (a)), Sca-1 단백질에 상응하는 997 cm^-1의 BT 라만 밴드(도 6의 (b)) 및 SP-C 단백질에 상응하는 1378 cm^-1의 NT 라만 밴드(도 6의 (c))의 기준선에 의해 수정된 강도를 생산함으로써 제공되었다. 도 5에 나타낸 형광 이미지와 유사하였다. BASCs를 분석하기 위하여, 황색 원으로 나타낸 바와 같은 핵 염색 이미지에 따라 CD34, Sca-1 및 SP-C를 공발현하는 세포의 경계를 지정하였다(도 6의 (d)). 도 6의 (e)는 도 6의 (d)에 나타낸 흰색 점에서의 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다.

실시예 7: BASCs에서 공발현되는 3개 단백질의 상대적 정량을 위한 라만 분석법

BASCs에서 CD34, Sca-1 및 SP-C 단백질이 얼마나 발현되는지에 대한 정보를 획득하기 위해, 각각의 BASCs에서 MT, BT 및 NT 신호의 SERS 강도를 합하였다(표 2). 그런 후, BASCs에서 SERS 강도의 규격화에 이용되는 표준 강도를 결정하기 위해, 각 F-SERS 도트에 대한 SERS 강도의 평균을 구하였다. SERS는 분자 특이성 및 고감수성과 같은 자발적 라만 측정법의 많은 장점을 제공하지만, 신뢰할 수 있는 SERS 측정을 위해서는 많은 요소들이 최적화되고 조절되어야 할 필요가 있다(S. E. Bell et al. Chem. Soc. Rev., 37, 1012-1024 (2008)). 따라서, 동일 농도의 각 F-SERS 도트를 이용하였고, 3개 F-SERS 도트의 강도 평균을 측정할 때와 동일한 조건에서 실험을 수행하였다. 동일 농도의 F-SERS 도트를 포함하는 펠렛에 라만 레이저의 초점을 맞추었고, 펠렛의 5개 지점에서 라만 신호를 임의적으로 측정하였다. 5개 스펙트럼의 SERS 강도를 평균화함으로써, SERS 강도의 평균을 얻을 수 있었고, MT, BT 및 NT의 값은 각각 1832 a.u., 2109 a.u., 및 4871 a.u.이었다(도 7a).

4개 BASCs 중에서 3개 단백질의 상대적 발현율을 측정하기 위해, 강도 합계를 평균 SERS 강도로 나눔으로써 표준화된 비율의 백분율을 계산하였다. 표 3은 계산 결과를 나타내고, 도 7b의 각 막대는 4개 BASCs 중에서 3개 단백질의 상대적 발현율을 반영하는 결과를 나타낸 것이다. 해당 결과는 2번 세포가 다른 세포에 비하여 많은 CD34 단백질을 가지고, 4번 세포에서 가장 높은 SP-C 및 Sca-1 발현 수준을 나타내었다. 또한, 이 데이터로부터 3번 세포는 다른 세포에 비하여 3개 단백질이 모두 낮게 발현됨을 확인할 수 있었다. 이러한 방식으로 CD34, Sca-1 및 SP-C의 상대적 정량을 위한 라만 분석을 통해 BASCs의 세포 특성을 분석할 수 있었다.

BASCs에서 MT, BT 및 NT의 SERS 강도(a.u.)의 각 합계

라만 표지	타겟 단백질	세포 1	세포 2	세포 3	세포 4
MT	CD34	5591.1	8663.9	773.4	920.3
BT	Sca-1	1487.0	1273.7	570.5	1684.6
NT	SP-C	3144.2	4939.1	1302.9	2711.2

타겟 단백질의 규격화된 비율

타겟 단백질	세포 1	세포 2	세포 3	세포 4
CD34	35.1±7.4	54.3±11.4	4.8±1.0	5.8±1.2
Sca-1	39.6±2.7	25.4±2.3	11.4±1.0	33.6±3.0
SP-C	17.6±3.9	28.4±6.2	16.2±3.6	37.8±8.3

본 발명의 방법으로, 생물학적 시료내의 다중 마커를 민감, 신속, 정확하게 검출 및 정량 부석이 가능하므로, 의학 진단, 병리학, 독물학, 환경학 등 여러 기타 분야에서 폭넓게 사용가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 F-SERS 도트의 제조방법을 간략하게 나타낸 것이다.

도 2a는 은이 포매된 실리카 나노입자의 TEM 이미지(좌)와 EDX 스펙트럼(우)을 나타낸 것이다.

도 2b는 은이 포매되고 라만 화합물이 도입된 실리카 나노입자의 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2c는 은이 포매되고, 라만 및 형광 화합물이 도입된, 기능화되지 않은 F-SERS 도트의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.

도 2d는 은이 포매되고, 라만 및 형광 화합물이 도입된, 기능화된 F-SERS 도트의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.

도 3a는 MT가 도입된 F-SERS 도트의 특이적인 라만 밴드(상)와, 타겟 피크 양측의 평균 강도 계산법(하)을 나타낸 것이다.

도 3b는 BT가 도입된 F-SERS 도트의 특이적인 라만 밴드(상)와, 타겟 피크 양측의 평균 강도 계산법(하)을 나타낸 것이다.

도 3c는 NT가 도입된 F-SERS 도트의 특이적인 라만 밴드(상)와, 타겟 피크 양측의 평균 강도 계산법(하)을 나타낸 것이다.

도 4a는 F-SERS 도트 _{BT-AF647-Sca1}로 처리된 Raw 264.7 세포에 관한 것으로, (a)는 형광이미지, (b)는 스캐닝 영역(상)과 SERS 강도 맵(하), (c)는 라만 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다.

도 4b는 F-SERS 도트 _MT-FITC-CD34로 처리된 Raw 264.7 세포에 관한 것으로, (a)는 형광이미지, (b)는 스캐닝 영역(상)과 SERS 강도 맵(하), (c)는 라만 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다.

도 5는 3종 F-SERS 도트 (_MT-FITC-CD34/_{BT-AF647-Sca1}/_NT-AF647-SPC)로 처리된 쥐과 폐의 CLSM 분석 결과를 나타낸 것이다(a: 명시야 이미지; b: BADJ에 대한 확대된 이미지; c: FITC, d; AF647; e: DAPI; f: 혼합된 이미지).

도 6a는 BADJ에 대한 SERS 강도의 맵과 라만 맵핑을 나타낸 것이다(a: MT, b: BT, c: NT, d: 3개 맵의 오버랩 이미지).

도 7a는 MT, BT 및 NT별 평균 SERS 강도를 나타낸 것이다.

도 7b는 BASCs에서 공발현되는 3개 단백질의 상대적 정량에 대한 라만 분석 결과를 나타낸 것이다.

Claims

시료내 다중 마커에 특이적인 형광-표면증강라만산란 도트 혼합물을 시료에 처리하는 단계; 및 다중 마커에 해당하는 라만 신호를 측정하여 다중 마커의 상대적인 양을 산출하는 단계를 포함하는 다중 마커의 정량 분석 방법.
제 1항에 있어서, 형광-표면증강라만산란 도트는 실리카 나노입자 표면에 금속이 포매된 금속나노입자 층; 상기 금속나노입자층에 형성된 라만 프로브 및 형광 프로브 층; 상기 층에 형성된 기능기 층; 및 상기 기능기층에 부착된 반응분자를 포함하는 형태인 방법.
제 2항에 있어서, 실리카 나노입자의 직경은 50 내지 300 nm 인 것인 방법.
제 2항에 있어서, 금속은 금, 은, 팔라듐, 백금, 알루미늄, 이리듐, 오스뮴, 로듐 및 루테늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 라만 프로브는 4-머켑토톨루엔, 3,5-디메틸 벤젠티올, 티 오페놀, 4-아미노 티오페놀, 벤젠티올, 4-브로모 벤젠티올, 2-브로모 벤젠티올, 4-이소프로필 벤젠티올, 2-나프탈렌티올, 3,4-디클로로 벤젠티올, 3,5-디클로로 벤젠티올), 4-클로로 벤젠티올, 2-클로로 벤젠티올, 2-플루오로 벤젠티올), 4-플루오로 벤젠티올, 4-메톡시벤젠티올, 3,4-디메톡시 벤젠티올, 2-머켑토 피리미딘, 2-머켑토-1-메틸 이미다졸, 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸, 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올, 벤질 머켑탄, 벤질 디설파이드, 2-아미노-4-클로로 벤젠티올, 3-머켑토 벤조산, 1-페닐테트라졸-5-티올, 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올, 2-아이오도아닐린, 페닐 이소티오시아네이트, 4-니트로페닐 디설파이드 및 4-아지도-2-브로모아세토페논으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 형광 프로브는 플루오레세인 이소티오시아네이트 , 로다민 6G, 아크리딘 호모다이머, 아크리딘 오렌지, 7-아미노액티노마이신 D, 액티노마이신 D, 에이씨엠에이, 디에이피아이, 디하이드로에티듐, 에티듐 브로마이드, 에티듐 호모다이머-1, 에티듐 호모다이머-2, 에티듐 모노아자이드, 헥시디움 아이오다이드, 비스벤지마이드, 호에크스트 33342, 호에크스트 34580, 하이드로옥시스티바미딘), 엘디에스 751, 프로피디움 아이오다이드, Cy3, Cy5, 알렉사플루오로 405, 알렉사플루오로 430, 알렉사플루오로 488, 알렉사플루오로 532, 알렉사플루오로 546, 알렉사플루오로 555, 알렉사플루오로 568, 알렉사플루오로 594, 알렉사플루오로 633, 알렉사플루오로 647, 알렉사플루오로 660, 알렉사플루오로 680 및 알렉사 플루오로 700으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 기능기는 티올기(-SH), 아민기(-NH₂) 및 카르복실기 (-COOH) 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 반응분자는 시료의 마커에 특이적으로 결합 가능한 효소기질, 리간드, 항체, 항체 단편, 단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 수용체 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 라만 신호는 라만 프로브의 특이적 파장에서의 피크 높이를 분석하는 것이며, 상기에서 피크 높이는 피크탑 강도에서 피크를 기준으로 설정된 좌측 및 우측 기준 영역에 대한 평균 강도를 감하여 얻은 수치인 것인 방법.
제 1항에 있어서, 다중마커의 상대적인 양을 산출하는 단계는, 라만 프로브 각각에 대하여, 시료에서의 형광-표면증강라만산란 도트에 대하여 라만 신호의 합 계를 산출하는 단계; 및 상기 얻은 합계를 프로브의 광-표면증강라만산란 도트 대조 평균값으로 나누어서 평준화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.