KR20120071405A - 단일 칩 상에서의 비간섭성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 - Google Patents

단일 칩 상에서의 비간섭성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 Download PDF

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KR20120071405A
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imaging
sample holder
image
sensor array
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KR1020127012934A
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아이도간 오즈칸
세르한 오메르 이시크만
세틴 오즈토크락
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명의 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템은 세포학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더를 포함한다. 공간적 필터는 샘플 홀더의 제1 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z1에 배치되고, 공간적 필터에는 조명의 통과를 허용하도록 구성된 개구가 내부에 배치되어 있다. 이미징 센서 어레이는 샘플 홀더의 제2 대향 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z2에 배치된다. 조명원은 개구를 통해 세포학적 샘플을 조명하도록 구성되고, 공간적 필터는 조명원과 샘플 홀더 사이에 개재된다.

Description

단일 칩 상에서의 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 {INCOHERENT LENSFREE CELL HOLOGRAPHY AND MICROSCOPY ON A CHIP}
관련 출원
본 출원은 2009년 10월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/253,276호와 2010년 5월 5일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/331,500호에 대한 우선권을 주장한다. 미국 특허 출원 제61/253,276호 및 제61/331,500호는 본 명세서에 전체가 기술되어 있는 것처럼 참조로 통합되어 있다. 우선권은 35 U.S.C.§119 및 임의의 다른 적용가능한 법령에 준하여 주장된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 이미징 시스템 및 방법에 관한 것으로, 특히, 세포, 세포기관, 세포형 입자 등 같은 작은 입자의 이미징 및 분석에 특정 용례를 갖는 이미징 시스템에 관한 것이다.
수십 년 동안 광학 검경(optical microscopy)은 공학, 물리 과학, 의학 및 생물학을 포함하는 다양한 분야에서 많은 일을 담당하여 왔다. 그 긴 역사에도 불구하고, 비교적 최근까지 광학 현미경의 디자인 및 작동 원리에는 큰 변화가 없었다. 지난 십년간, 나노-세계의 영역을 더 양호하게 이해하기 위한 탐구에 의해 부분적으로 자극되어, 초고해상도 기술은 회절 한계(diffraction limit) 같은 광학 이미징의 가장 근본적인 한계 중 일부를 해결함으로써 광학 검경의 부흥을 시작하였다. 이들 초고해상도 기술들 이외에, 광학 검경의 현 기술 상태를 더 양호한 속도, 신호대 잡음비(SNR), 대비(contrast), 처리량, 특수성 등을 향해 개선시키기 위해 다수의 다른 신규한 이미징 체계가 또한 구현되었다. 검경의 이러한 최근의 진보는 이미징의 근본적 장벽을 극복하기 위해 다양한 혁신적 기술을 사용하였으며, 새로운 발견이 이루어질 수 있게 함으로써 다양한 분야들의 집단에 현저한 자극을 생성하였다.
그러나, 이러한 진보와 함께, 광학 이미징 플랫폼의 전체적 복잡성 및 비용이 증가되었다. 고가의, 그리고, 종종 거대한, 광학 이미징 시스템은 빈번히, 장비가 잘 갖춰진 실험실을 초월하여 이들 발전된 광학 이미징 중 일부를 폭넓게 사용하는 것을 제한하고 있다.
한편, 더 작은 화소, 더 양호한 동적 범위, 프레임 속도 및 신호대 잡음비를 갖는 현저히 더 큰 면적을 구비한 매우 저렴한 이차원 고상 검출기 어레이 및 매우 더 신속하고, 더 저렴하며, 더 강력한 디지털 프로세서들 및 메모리에 의해 디지털 기술의 급속한 발전이 이루어졌다. 또한, 진보된 이미징 이론 및 수치 알고리즘과 조합될 때 이러한 진행중인 디지털 혁신은 광학 이미징 및 검경이 광학 이미징 장치의 단순화를 향한 이러한 르네상스의 다른 차원에 마주할 기회를 생성함으로써 가능하게는 그 성능의 절충 없이 현저히 더욱 소형이고, 비용 효율적이며, 사용이 용이해지게 한다.
수십년 동안 렌즈는 이미지의 해상도 및 원하는 시계에 의해 결정되는 최저 가능 공간 대역폭 제품에서 검출기(아날로그 또는 디지털)가 동작하는 것을 도와 왔다. 그러나, 상술한 디지털 혁신은 상술한 디지털 해상도가 천만 내지 이천만까지의 2D 공간 대역폭 제품이 오늘날 쉽게 가용하도록 디지털 이미저를 위한 기술 상태를 이미 진보시켰다. 이는 오늘날 검출기 어레이가 이제 회절에 의해 유발되는 정보 왜곡을 취급하기에 매우 더 적합하다는 것을 의미하며, 이는 따라서 광학 이미징의 렌즈 사용에 대한 절대적 필요성에 대한 의문을 발생시킬 수 있다. 또한, 신규 알고리즘과 함께 오늘날의 디지털 프로세서는 검출기 단부에서 취득된 정보를 거의 순간적으로 처리하여 물리적 렌즈의 역할을 수행하기에 더욱 양호한 형상이다. 이러한 상황에서 볼 때, 광학 이미징시의 렌즈(또는 유사한 파면 성형 요소)의 광범위한 사용은 이제 광학적 구성요소의 복잡성의 결여를 디지털 도메인에서 보상하는 비용 효율적이고, 소형이며, 매우 더 단순한 광학적 아키텍쳐(optical architecture)에 의해 다수의 용례 요구(구체적으로 세포 검경을 위한)를 잠재적으로 대체할 수 있다. 이 접근법은 특히 자원이 제한된 환경의 요건 및 요구를 해결하여야만 하며, 가능하게는 감염 질환들을 수반하는 다양한 글로벌 건강 관련 문제에 대한 투쟁에 약진을 제공한다.
매우 중요하게, 자원이 제한된 환경에서의 검경은 진보된 실험실에서의 요건들과는 현저히 다른 요건들을 가지며, 이런 이미징 장치는 사용 및 동작이 단순하여야하고, 비용 효율적이어야하고, 소형 및 경량이어야하고, 동시에, 적절히 정확하여야한다. 무렌즈, 소형 및 비용 효율적 온칩 디지털 이미저로부터 방대한 이득을 얻을 수 있는 다른 분야는 마이크로유체의 분야이다. 지난 십년에 걸쳐, 마이크로유체는 필요한 장치 및 시약 체적과 관련 비용을 현저히 감소시킴으로써 세포 취급을 위해 가용한 도구세트를 혁신시켰다. 이는 일부 예들에서 소위 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 용례를 가능화하였다. 광학 기술을 마이크로유체(microfluid)와 병합시키는데 이루어진 모든 진전에 불구하고, 여전히 비교적 저수율, 고부피 및 고가로 남아있는 한 가지 영역은 이런 장치 상에서 발견되는 마이크로유체 특징과 광학 검경 플랫폼의 통합이다. 수율의 증가와 함께 이미징 플랫폼의 현저한 소형화 및 단순화 없이는 특히 혈구계산 용례를 위해 진정한 범주의 마이크로유체 혁신이 완전히 실현될 수는 없다.
이러한 인지의 결실은 다양한 무렌즈 온칩 이미징 아키텍쳐(lensfree on-chip imaging architecture)가 성공적으로 예시되어 있는 문헌에서 이미 나타나 있다. 예를 들어, Xu. W., Jericho, M.H. Meinertzhagen, I.A. 및 Kruezer, H.J의 생물학적 용례를 위한 디지털 인라인 홀로그래피(Digital in-line holography for biological applications)[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11301-11305 (2001)] 참조. 이들 접근법들 중에, 무렌즈 디지털 홀로그래피는 새로운 연산 알고리즘 및 수학적 모델에 의해 이 디지털 혁신 중 대부분을 달성할 잠재력을 갖기 때문에, 특별한 관심을 받을 가치가 있다. 이에 관하여, 무렌즈 디지털 인라인 홀로그래피는 상술한 Xu 등에서 설명된 바와 같이 세포 및 다른 미생물의 고해상도 검경에 대하여 이미 성공적으로 예시되어 있다. 그러나, 종래의 응집성 무렌즈 인라인 홀로그래피 접근법은 조명에 대해 거의 완벽한 공간적 응집성을 요구하며, 따라서, 공간적 필터링을 위한 파장 정도로 크기설정된 작은 개구 상에 레이저광을 집속시키는 것을 필요로 한다. 작은 개구 크기(예를 들어, 1-2 ㎛)의 사용은 개선된 광 처리량을 위해 개구에 레이저 방사선을 효과적으로 결합하기 위하여 집속 렌즈와 함께 기계적으로 안정적이고 주의깊게 정렬된 시스템을 필요로 한다. 이는 적절한 광학적 정렬 및 기계적 안정성을 보증하기 위해 강건한 시스템을 필요로 할 수 있다. 추가적으로, 연장된 시간 기간에 걸쳐 이런 작은 개구를 깨끗하고 동작가능하게 유지하는 것은 특히 실험실 환경 외부에서의 용도에 대해 다른 과제가 될 수 있다.
또한, 종래의 무렌즈 인라인 홀로그래피에서, 관련 세포는 통상적으로 센서 표면으로부터 매우 멀리(예를 들어, 1 내지 2 cm 초과하여) 위치되며, 그래서, 각 세포의 홀로그래픽 서명은 전체 센서 영역에 걸쳐 실질적으로 분산되고, 모든 세포의 특정 홀로그래픽 "서명(signature)"은 현저히 중첩된다. 이런 접근법은 불행히도 세포 평면에서 이미징 시계(FOV)를 제한한다. 모든 이들 요건은 광학 기구의 비용 및 크기를 증가시킨다. 또한, 이들 제약들은 종래의 무렌즈 응집성 인라인 홀로그래피 접근법이 현장에서 같이 자원이 제한된 환경들에 사용하기에 불편하게 한다.
홀로그래피의 비응집성 또는 부분 응집성 소스(partially coherent source)가 또한 다양한 렌즈 기반 광학 아키텍쳐에 사용되어 왔다. 그러나, 이들 홀로그래픽 이미징 기술은 "온칩"으로서 분류되지 않으며, 그 이유는 이들이 다양한 부피 큰 광학 구성요소를 사용하기 때문이며, 따라서, 이들은 이들이 실험실 외부에서 사용되기에 매우 부적합해지게하는 상술한 진보된 이미징 양식들과 동일한 범주 하에 있는 것으로 간주될 수 있다. 부분 응집성 무렌즈 인라인 홀로그래피를 사용하는 매우 더 단순한 접근법이 라텍스 입자의 이미징을 위해 최근에 예시되었지만, 이들 기술은 또한 이들이 센서 표면으로부터 멀리 이격하여 관련 대상물을 위치시키기 때문에 작은 시계의 단점을 갖고 있다. 예를 들어, Dubois, F., Requena, M.N., Minetti, C., Monnom, O. 및 Istasse, E.의 레이저 소스를 사용한 디지털 홀로그래피 검경에서의 부분 공간 응집성의 효과(Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source)[Appl. Opt. 43, 1131-1139(2004)] 참조. 또한, 이들 연구들은 현미경 대물 렌즈 같은 조명을 위한 결합 광학장치를 사용하며, 비교적 조잡한 이미징 성능을 가진다.
본 발명의 일 양태에서, 세포 또는 다세포 유기체의 디지털 인식 및 검경 이미징을 가능하게 하도록 비용 효율적 및 소형 광학 구성요소를 사용하는 대안적 비응집성 세포 홀로그래피 및 검경 플랫폼이 개시되어 있다. 이 플랫폼 및 방법은 (비록, 렌즈가 통합될 수 있지만) 어떠한 렌즈도 필요로 하지 않고, 레이저 같은 응집성 소스나 다른 부피 큰 광학 구성요소 없이, 큰 시계에 걸쳐 서브셀(sub-cellular) 해상도를 가능하게 한다. 이러한 무렌즈 시스템에서, 그 2D 홀로그래픽 서명에 기초한 각 세포 유형의 후속 디지털 인식 및 자동 계수를 위해 다양한 세포 유형의 개별 위상 및 진폭 홀로그램을 기록할 수 있다. 또한, 시스템 및 방법은 약 40만 cells/μL에 달하는 세포 밀도에서도 큰 시계에 걸쳐 서브셀 해상도를 특징화하는 검경 이미지를 정확하게 재구성할 수 있게 한다. 이 플랫폼은 오정렬에 내성적인 간단하고, 소형이며, 경량이고, 비용 효율적인 광학 구성요소를 사용하기 때문에, 또한, 자원이 빈약한 환경에서 세포 생물학, 마이크로유체 및 원격의료 기반 혈구계산 용례에 중요한 도구를 제공할 수 있다. 예로서, 플랫폼은 말라리아, HIV 및 결핵 같은 다양한 감염성 질환의 진단 및 연구를 위해 사용될 수 있는 비교적 작은 장치에 통합될 수 있다. 이 장치는 또한 질환 유발 기생충 또는 다른 감염성 질환에 대해 물을 검사할 수 있다.
이를 위해, 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 플랫폼의 성능은 최소의 샘플 준비 단계로 과립구, 단구 및 림프구를 서로 구별하기에 충분한 공간적 해상도로 전체 혈액 세포를 자동 계수 및 검경 이미징하기 위해 예시되어 있다.
혈구계산 용례 및 마이크로유체 시스템의 세포 생물학을 위해 매우 유리하게 하는 이들 무렌즈 비응집성 세포 홀로그래피 플랫폼의 다수의 양태들이 존재한다. 먼저, 이 홀로그래픽 접근법의 광원은 레이저가 될 필요는 없다. 오히려, 어떠한 렌즈도 다른 부피 큰 광학 구성요소도 필요로 하지 않고 완전한 비응집성 소스가 사용될 수 있다. 이러한 특징은 광학 구성을 크게 단순화함으로써, 비용효율적이고 소형이 될 수 있게 하며, 세포 홀로그램의 응집성 스페클(speckle) 잡음 및 기판 유도 다중 반사 간섭 효과를 제거한다. 두 번째로, 무렌즈 비응집성 세포 홀로그래피 접근법은 조명을 위해 작은 개구 크기를 필요로 하지 않으며, 따라서, 세포 홀로그램 패턴 분석 또는 디지털 이미지 재구성에 대한 문제를 유발하지 않고 수십배 만큼 이미징 시스템의 광 처리량을 개선시킨다. 또한, 큰 개구 크기(예를 들어, 50-100 ㎛)는 대부분의 종래의 홀로그래피 접근법과는 달리 소스와 개구 평면 사이의 어떠한 결합/집속 광학장치의 사용도 제거한다. 이 특징은 기계적 오정렬 또는 잠재적 폐색 문제에 강건해지게 한다. 이는 재정렬에 대한 필요성이나 이미징 아티팩트 없이 긴 동작 시간을 가능하게 함으로써, 연속 용도(filed use)에 매우 적합해지게 한다. 세 번째로, 관련 세포가 광원에 대해서보다 센서 어레이에 매우 더 근접하게 배치되기 때문에(~1의 프린지 배율), 통상적으로 종래의 무렌즈 인라인 홀로그래픽 현미경보다 50 내지 100배만큼 더 큰 또는 광학 현미경보다 10배를 초과하여 더 큰 시계를 이미징할 수 있게 한다.
또한, 이 특성은 어떠한 렌즈 또는 고가 박막 형광 필터도 필요로 하지 않는 큰 시계에 걸친 형광 신호의 동시적 온칩 검출을 가능하게 하며, 이는 무렌즈 이미징 플랫폼의 특수성 및 기능성을 증가시키도록 형광 검출과 비응집성 홀로그래픽 검경을 병합할 수 있는 하이브리드 온칩 이미징 플랫폼을 생성하기 위해 매우 중요하다. 마지막으로, 내장(embedded) 광학 위상의 홀로그래픽 처리를 통해 세포의 검경 이미지를 재구성하는 것과 별개로, 이 시스템은 또한 각 세포에 대응하는 고유한 이차원 홀로그래픽 텍스쳐(즉, 핑거프린트)를 검출할 수 있으며, 이는 재구성된 세포 이미지를 보완하는 정보의 대안적 소스를 제공한다. 이런 홀로그래픽 세포 서명(cell signature)의 패턴 및/또는 텍스쳐 분석(위상 및 진폭 양자 모두)을 통해, (디지털 재구성 없이) 관련 각 세포의 상태 및 유형을 인식하는 것이 가능하며, 이는 특히, 혈구계산 용례에 중요하다. 예로서, 관찰된 홀로그램 서명은 매우 신속한 진단 판정(예를 들어, 건강한 세포 대 질병 세포의 홀로그램 서명의 비교)을 가능하게 할 수 있다. 본 명세서에 설명된 무렌즈 홀로그래픽 이미징 시스템 및 방법은 특히, 자원이 제한된 환경에서 세포 생물학, 혈구계산 및 의료 진단에 대한 충족되지 않은 필요성 중 일부에 대한 변형 해법을 제공하기 위해 디지털 전자장치와 조합될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템은 세포학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더 및 샘플 홀더의 제1 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z1에 배치된 공간적 필터를 포함하며, 공간적 필터는 조명의 통과를 가능하게 하도록 구성된 개구가 내부에 배치되어 있다. 시스템은 개구를 통해 세포학적 샘플을 조명하도록 구성된 조명원 및 샘플 홀더의 제2 대향 측부 상에 샘플 홀더로부터 거리 z2에 배치된 이미징 센서 어레이를 더 포함하며, 공간적 필터는 조명원과 샘플 홀더 사이에 개재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 시스템은 샘플 홀더와 공간적 필터 사이에 개재된 프리즘과 프리즘을 통해 세포학적 샘플을 조명하도록 구성된 형광 조명원을 더 포함할 수 있으며, 입사 형광 조명의 실질적 모두가 내부 전반사(TIR; total internal reflection)를 통해 반사된다. 홀로그래픽 조명원이 상단으로부터 하향 안내되는 동안 입사 형광 조명은 측부로부터 또는 소정 각도로 이루어질 수 있다. 샘플 내의 하나 이상의 종(species)으로부터의 형광 방출물은 이미징 센서 어레이에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포학적 샘플을 이미징하는 방법은 적어도 부분적 비응집성 광을 방출하는 조명원으로 세포학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더의 전방 측부를 조명하는 것을 포함하며, 적어도 부분적 비응집성 광은 세포학적 샘플을 조명하기 이전에 개구를 통과한다. 샘플 홀더의 후방 측부 상에 또는 그에 인접하게 배치된 이미징 센서 어레이로부터 하나 이상의 이미지 프레임이 얻어진다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 휴대형 시스템은 세포학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더를 갖는 이동 통신 장치를 포함하며, 이동 통신 장치는 소지(hand-held) 휴대성을 위해 치수설정된다. 휴대형 시스템은 샘플 홀더의 제1 측부 상에 샘플 홀더로부터 거리 z1에 배치된 공간적 필터로서, 조명의 통과를 가능하게 하도록 구성된 개구가 내부에 배치되어 있는 공간적 필터와, 이동 통신 장치 내에 위치되고 샘플 홀더의 제2 대향 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z2에 배치된 이미징 센서 어레이를 포함한다. 휴대형 시스템은 개구를 통해 세포학적 샘플을 조명하도록 구성된 조명원을 포함하며, 공간적 필터는 조명원과 샘플 홀더 사이에 개재되어 있다. 이동 통신 장치는 이동 전화 또는 개인 휴대용 정보 단말기(PDA; personal digital assistant)를 포함할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 시스템의 개략도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 시스템의 개략도이다.
도 3은 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 기능이 내부에 통합되어 있는 이동 통신 장치의 부분 분해도이다.
도 4는 시스템의 바이어(Bayer) 패턴 출력으로부터 단색 홀로그래픽 이미지를 생성하도록 개발된 탈바이어(de-Bayering) 알고리즘의 개략도를 예시한다.
도 5는 형광 이미징 기능을 포함하는 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 시스템의 다른 실시예를 예시한다.
도 6a 내지 도 6k는 형광 및 비형광 비드를 포함하는 이종 용액(heterogeneous solution)을 위해 순차적으로 얻어지는 동일 시계의 무렌즈 홀로그래픽 및 형광 이미징을 예시한다.
도 7은 트랜스제닉 C.선충(transgenic C. elegans)의 무렌즈 온칩 형광 이미지를 예시한다.
도 8은 서로 다른 이미징 센서 어레이를 사용한 트랜스제닉 C. 선충의 무렌즈 온칩 형광 이미지를 예시한다.
도 9는 형광 이미징 기능을 포함하는 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 시스템의 다른 실시예를 예시한다.
도 10a는 광학 면판(optic-faceplate)의 사용과 함께 형광 이미징 기능을 포함하는 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피 및 검경 시스템의 일 실시예를 예시한다.
도 10b는 광학-면판의 검경 이미지를 예시한다.
도 11은 시스템이 관련 대상물의 이미지를 디지털 재구성하는 방식의 상위 레벨 흐름도를 예시한다.
도 12는 백혈구의 세 가지 주요 유형(즉, 과립구, 림프구 및 단구)의 홀로그래픽 서명을 예시하는 혈액 도말 샘플의 비응집성 무렌즈 이미징 결과를 예시한다.
도 13a는 자동 홀로그래픽 계수치와 세포의 현미경 수동 계수치의 정확도를 비교하는 그래프를 예시한다.
도 13b는 10X 현미경 대물 시야와 함께 세포의 다양한 밀도에 대한 원본 홀로그램 및 재구성 이미지를 예시한다.
도 14는 40만 cells/μL의 밀도에서 RBC를 위한 이미지를 예시한다. 상단 좌측 이미지는 모든 세포 홀로그램이 중첩하는 원본 홀로그램 평면이다. 상단 우측 이미지는 재구성된 세포 이미지를 도시한다. 저부 이미지는 상단 좌측 이미지의 원 내에 도시된 세 개의 선택된 RBC의 격리된 위상 및 진폭 홀로그래픽 서명을 예시한다.
도 1은 일 실시예에 따른 세포학적 샘플(12)을 이미징하기 위한 시스템(10)을 예시한다. 이 시스템은 세포학적 샘플(12)을 보유하도록 구성된 샘플 홀더(14)를 포함한다. 샘플 홀더(14)는 (커버 슬립을 구비하거나 구비하지 않는) 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 용기, 큐벳 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 샘플 홀더(14)는 적어도 시스템(10)이 동작하는 광의 파장에서 광학적으로 투명인 재료로부터 형성된다. 세포학적 샘플(12)은 이미징 대상 생물학적 요소, 즉, 세포 또는 세포형 특징부(cellular feature)를 포함한다. 샘플(12)은 혈액, 땀, 타액, 콧물 또는 심지어 환경적 샘플(예를 들어, 연못 또는 시내로부터의 물)을 포함할 수 있다. 세포학적 샘플(12)은 준비된 샘플일 수 있거나, 준비 없이 샘플 홀더(14) 상에 배치된 직접 생물학적 샘플일 수 있다. 예로서, 샘플로서의 적혈구의 경우에, 혈액 샘플은 1 x 포스페이트 버퍼 용액(PBS; phosphate buffered solution) 또는 혈액 은행 식염수(예를 들어, Fisherbrand, Blood Bank Saline, Fisher Scientific) 중 어느 하나로 희석될 수 있다.
샘플 홀더(14)는 이미징 센서 어레이(16) 위에 위치된다. 말하자면, 이미징 센서 어레이(16)는 샘플 홀더(14)의 후방 측부에 인접하게 배치된다. 이미징 센서 어레이(16)의 표면은 샘플 홀더(14)의 후방 측부와 접촉하거나 후방 측부와 매우 근접하게 존재한다. 이미징 센서 어레이(16)는 예로서, 전하 결합 소자(CCD; charged coupled device) 또는 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS; complementary metal oxide semiconductor)를 포함할 수 있다. 이미징 센서 어레이(16)는 단색성 또는 컬러일 수 있다. 이미징 센서 어레이(16)는 일반적으로 크기가 9.0㎛ 미만인, 특히, 크기가 5.0㎛보다 더 작은(예를 들어, 2.2㎛ 이하인) 작은 화소 크기를 갖는다. 일반적으로, 더 작은 화소 크기를 갖는 센서는 더 높은 해상도를 산출한다. 본 명세서에 설명된 이미징 방법의 한 가지 장점은 화소 크기보다 양호한 공간적 해상도가 얻어질 수 있다는 것이다.
도 1을 계속 참조하면, 시스템(10)은 샘플 홀더(14)의 상단 표면으로부터 이격 배치된 공간적 필터(18)를 포함한다. 공간적 필터(18)는 조명 통과를 허용하도록 구성된 개구(20)가 내부에 포함되어 있다. 개구(20)는 통상적으로 50㎛ 내지 약 100㎛ 범위 이내인 직경(D)을 갖는다. 도 1은 세포 평면(22)을 예시하며, 이 세포 평면은 샘플(12) 내에 포함된 생물학적 요소(예를 들어, 세포)와 교차하는 평면을 나타낸다. 일반적으로, 이 세포 평면(22)은 실질적으로 세포학적 샘플을 포함하는 샘플 홀더(14)의 표면에 배치된다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 공간적 필터(18)는 세포 평면(22)으로부터 거리 z1에 위치되어 있다. 이미징 센서 어레이(16)의 이미징 평면은 세포 평면(22)으로부터 거리 z2에 위치되어 있다. 본 명세서에 설명된 시스템(10)에서, z2 << z1이다. 예로서, 거리 z1은 약 1 cm 내지 약 10 cm 정도일 수 있다. 다른 실시예에서, 이 범위는 예로서, 약 5 cm 내지 약 10 cm 사이로 더 작을 수 있다. 거리 z2는 약 0.05 mm 내지 2 cm 정도일 수 있지만, 다른 실시예에서, 이 거리 z2는 약 1 mm 내지 2 mm 사이일 수 있다.
시스템(10)은 도 2에 예시된 바와 같이 조명원(24)을 포함한다. 조명원(24)은 바람직하게는 비응집성 또는 부분적 비응집성 광원이다. 발광 다이오드(LED)는 조명원(24)으로서 사용될 수 있는 광원(24)의 일 예이다. LED는 비교적 저가이며, 내구성있고, 대체로 낮은 전력 요구를 갖는다. 시스템(10)의 현저한 장점 중 하나는 이 디자인이 조명원(24), 공간적 필터(18) 및 이미징 센서 어레이(16) 사이의 불완전 정렬이 존재하는 경우에도 시스템(10)이 여전히 동작하도록 기계적 공차의 약간의 변동을 허용한다는 점이다.
도 2는 다수의 추가적 구성요소와 연계하여 시스템(10)을 예시한다. 일 실시예에서, 데이터 취득 및 이미지 처리를 위해 이미징 센서 어레이(16)로부터 컴퓨터(26)로 이미지(예를 들어, 이미지 프레임)가 전달되도록 랩탑, 데스크탑 등 같은 컴퓨터(26)가 시스템(10)에 작동식으로 연결된다. 컴퓨터(26)는 더 상세히 본 명세서에 설명된 바와 같이, 홀로그래픽 진폭 또는 강도(intensity)를 포함하는 샘플(12)의 이미지를 취득하는 소프트웨어를 구동하는 하나 이상의 프로세서(미도시)를 포함한다. 이때, 컴퓨터(26) 상의 소프트웨어는 이미지의 소실된 위상을 회복한다. 동일 이미지의 홀로그래픽 진폭 및 회복된 위상 양자 모두를 구비하면, 그후 소프트웨어는 샘플(12)의 이미지를 재구성한다. 이 재구성된 이미지(12)는 예로서, 디스플레이(28) 등 상에서 사용자에게 표시될 수 있다. 또한, 소프트웨어는 그 홀로그래픽 서명에 기초하여 관련 특정 세포를 식별하고 표시할 수 있다. 예로서, 소프트웨어는 과립구 및 단구를 무시하면서 샘플 내의 림프구를 식별하도록 프로그램될 수 있다. 그 고유의 홀로그래픽 서명에 의해 식별되는 이들 림프구는 그후 디스플레이(28) 상에서 사용자를 위해 표시된다. 또한, 소프트웨어는 세포 개체군(cell population) 또는 세포 아개체군(cell sub-population)을 계수할 수 있으며, 이 정보도 디스플레이(28) 상에 표시될 수 있다. 또한, 고유 홀로그래픽 서명은 질병 상태를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 예로서, 적혈구(RBC)는 낫형 적혈구 빈혈(sickle cell anemia) 또는 말라리아에 의한 감염 같은 질환 상태를 관찰하기 위해 소프트웨어에 의해 평가될 수 있다. 이 정보는 디스플레이(28)를 통해 사용자에게 다시 보고될 수 있다.
다른 대안적 실시예에서, 이동 통신 장치(30)가 시스템(10)에 작동식으로 연결된다. 이미지(예를 들어, 이미지 프레임)는 이동 통신 장치(30)에 포함된 하나 이상의 프로세서를 사용한 데이터 취득 및 이미지 처리를 위해 이미징 센서 어레이(16)로부터 이동 통신 장치(30)로 전달될 수 있다. 대안적으로, 이동 통신 장치(30)는 단순히 통신 네트워크(32)를 거쳐 데이터를 전달하고, 이 데이터는 추가 처리를 위해 원격 컴퓨터(34)로 추후 전달될 수 있다. 통신 네트워크(32)는 예로서, 인터넷 같은 광역 네트워크를 포함할 수 있거나 종래의 이동 통신 장치(30)에서 데이터를 송신 및 수신하기 위해 사용되는 무선 네트워크를 포함할 수 있다. 데이터는 동일한 통신 네트워크(32)를 사용하여 이동 통신 장치(30)로 다시 전송될 수 있다.
이하에 더 상세히 설명된 바와 같은 또 다른 대안 실시예에서, 시스템 구성요소는 이동 통신 장치(30)에 통합된다. 즉, 이동 통신 장치(30)는 이미징 센서 어레이(16), 조명원(24), 공간적 필터(18)를 포함하며, 이동 통신 장치(30)를 사용한 분석을 위해 샘플 홀더(14)를 수용하도록 구성된다. 본 실시예에서, 이동 통신 장치(30)에 포함된 하나 이상의 프로세서는 이미지 분석 및 처리를 위한 소프트웨어를 포함한다. 대안적으로, 이동 통신 장치(30)는 이미지 처리 및 분석을 위해 원격 컴퓨터(34)가 사용되는 경우 통신 네트워크(32)를 거쳐 단순히 원본 이미지 파일(raw image file)을 전달할 수 있다. 그후, 결과는 통신 네트워크(32)를 거쳐 이동 통신 장치(30)로 다시 전송될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 조명원(24), 공간적 필터(18) 및 이미징 센서 어레이(16)는 샘플 홀더(14)를 수용하도록 구성된 자립형 유닛에 포함될 수 있다. 자립형 유닛은 유선 연결(예를 들어, USB) 또는 무선 연결[예를 들어, 블루투스(Bluetooth)]을 통해 컴퓨터(26)에 연결될 수 있다. 대안적으로, 자립형 유닛은 유사한 유선 또는 무선 연결을 통해 이동 통신 장치(30)에 연결된다.
도 3은 무렌즈 홀로그래픽 이미징 시스템이 이동 통신 장치(30)와 통합되는 시스템(10)의 일 실시예를 예시한다. 이동 통신 장치(30)는 이동 전화, 개인 휴대용 정보 단말기(PDA) 또는 다른 휴대형 전자 장치를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이동 통신 장치(30)는 이미지, 데이터 및 결과가 통신 네트워크(32)를 통해 외지(offsite) 위치로 원격 전송될 수 있도록 무선 기능을 갖는다. 이런 무선 전송은 데이터를 전달하기 위해 사용되는 종래의 무선 스펙트럼 및 데이터 프로토콜(예를 들어, CDMA 네트워크, GSM 네트워크 등)을 거쳐 이루어질 수 있다. 또한, 데이터는 블루투스, WiFi 등 같은 다른 단거리 무선 프로토콜을 통해 다른 컴퓨터 또는 유사 장치에 전송될 수 있다.
이미징 센서 어레이(16)(도 3에는 미도시)는 이동 통신 장치(30) 내에 위치된다. 이미징 센서 어레이(16)는 이런 장치(예를 들어, CMOS, CCD 또는 균등물)에서 화상 또는 동영상을 촬상하기 위해 사용되는 동일한 이미징 하드웨어를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이미징 센서 어레이(16)는 특히 홀로그래픽 이미징 용례를 위해 생성된 특수화된 구성요소일 수 있다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 이동 통신 장치(30)는 샘플 홀더(14)를 보유하도록 구성된 샘플 탑재기(38)를 포함한다. 예로서, 샘플 탑재기(38)는 샘플 홀더(14)가 샘플 탑재기(38) 내에 위치되는, 도 3에 예시된 바와 같은, 개방 위치로 이동될 수 있다. 그후, 샘플 탑재기(38)는 폐쇄 위치로 이동되고, 여기서, 샘플(12)을 갖는 샘플 홀더(14)가 이미징 센서 어레이(16) 위의 위치에 위치된다. 대안적으로, 다른 실시예에서, 샘플 홀더(14)(예를 들어, 슬라이드, 큐벳 등)는 샘플 탑재기(38)의 도움없이 이동 통신 장치(30) 내로 직접적으로 삽입될 수 있다. 각 경우에, 샘플(12)은 세포 평면(22)이 검출기 평면에 근접하도록 이미징 센서 어레이(16) 상에 또는 그 위에 직접적으로 배치된다. 이미징 센서 어레이(16) 위의 광학적 투명 층(미도시)은 이 거리를 고정할 수 있다.
도 3을 계속 참조하면, 시스템(10)은 공간적 필터(18)와 함께 조명원(24)을 수용하도록 구성된 연장부 또는 하우징(40)을 포함한다. 비록, 다른 형상 및 기하형상이 사용될 수 있지만, 연장부(40)는 관형 하우징 등의 형상일 수 있다. 연장부(40)는 이동 통신 장치(30)에 영구적으로 고정되거나, 대안적으로 연장부(40)는 모듈식이고 이동 통신 장치(30)에 대해 선택적으로 탈/부착될 수 있다. 일부 실시예에서, 연장부(40)의 길이는 조절가능할 수 있다. 바람직하게는, 조명원(24)은 도 3에 예시된 바와 같은 LED 같은 비응집성 또는 부분 비응집성 광원이다. 조명원(24)은 이동 통신 장치(30)의 내부 배터리에 의해 구동 또는 급전될 수 있거나, 대안적으로, 연장부(40)는 조명원(24)에 급전하기 위해 필요한 구동 회로 및/또는 배터리(42)를 포함할 수 있다. 또 다른 대안에서, 도 2의 컴퓨터(26) 같은 로컬 컴퓨터로부터의 전원이 (예를 들어, USB 케이블 등을 통해) 조명원(24)을 구동하기 위한 전원을 제공할 수 있다.
연장부(40)는 내부에 개구(20)를 포함하는 공간적 필터(18)를 더 포함한다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 발명의 시스템(10)의 주된 장점은 이 디자인이 조명원(24), 공간적 필터(18) 및 이미징 센서 어레이(16) 사이의 완전한 정렬이 존재하지 않는 경우에도 이미징 시스템이 여전히 동작할 수 있도록 기계적 공차의 약간의 변동을 허용한다는 것이다. 따라서, 현장에서 이런 장치(30)에 예상될 수 있는 바와 같이 이동 통신 장치(30)가 현저한 기계적 방해를 받는 경우에도 이 시스템은 여전히 동작하고 이미지를 제공할 수 있다.
연장부(40)는 일반적으로 세포 평면(22)으로부터 소정 거리(즉, z1) 이격하여 개구(20)를 배치하는 길이를 갖는다. 일반적으로, 세포 평면(22)과 개구(20) 사이의 거리는 약 1 cm 내지 약 10 cm의 범위 내에 있다. 물론, 이 거리는 이 범위를 초과하여 변할 수 있다. 이 비교적 작은 거리는 연장부(40)가 이동 통신 장치(30)에 부착되거나 다른 방식으로 고정될 때에도 여전히 이동 통신 장치(30)가 소지 및 휴대가능해 지게 한다. 세포 평면(22)과 이미지 센서 어레이(16) 사이의 거리는 이동 통신 장치(30) 내에 쉽게 수용될 수 있지만, 일반적으로 0.05 mm 내지 2 cm 사이의 범위 이내에 든다.
상술된 바와 같이, 연장부(40)는 예로서, 대안적 조명원(24)을 제공하도록 교체 또는 교환될 수 있는 모듈식 구성요소일 수 있다. 예로서, 일 연장부(40)는 소정 색상의 LED를 포함할 수 있고, 다른 연장부는 다른 색상의 LED를 포함할 수 있다. 이들 다양한 연장부(40)는 또한 다양한 이미징 특성을 제공하도록 길이가 변할 수 있다. 이들 연장부(40)는 현장에서 이미징 키트의 일부로서 보유될 수 있다. 대안적으로, 단일 연장부(40)가 다수의 조명원(24)(예를 들어, 하나보다 많은 색상의 LED)를 포함할 수 있다. 이들 LED는 개별적으로 또는 동시에 함께 급전될 수 있다. 단일 연장부(40)가 또한 (동일 색상 또는 다양한 색상의) 다중 LED 구성을 포함할 수 있기 때문에, 조명원 모두가 이미징을 위해 동시에 켜질 수 있거나, 대안적으로, 각 조명원(24)이 순차적으로 켜질 수 있고, 이미징 센서 어레이(16)는 시간의 함수로서 샘플(12)의 홀로그램들을 포획한다. 이들 다수의 조명원(24)의 다양한 조합이 동일 이미징 필드의 다중 홀로그램을 생성하도록 켜질 수 있다.
사용시, 샘플(12)은 이미징 센서 어레이(16) 위에 배치된다. 샘플(12)은 전체적 혈액, 소변, 땀, 타액 등 같은 샘플을 보유하는 마이크로유체 장치 또는 현미경 슬라이드 같은 샘플 홀더(14) 내로 또는 샘플 홀더(14) 상으로 탑재될 수 있다. 그후, 샘플 홀더(14)는 직접적으로 또는 별개의 샘플 탑재기(38)의 사용을 통해 이동 통신 장치(30)에 삽입된다. 대안적으로, 샘플(12)은 (예를 들어, 적하기 또는 피펫 등을 사용하여) 이미징 센서 어레이(16) 위로 직접적으로 적하될 수 있다.
조명원(24)이 켜지고, 샘플(12)의 하나 이상의 이미지 프레임이 이미징 센서 어레이(16)에 의해 포착된다. 본 발명의 일 양태에서, 이동 통신 장치(30)의 프로세서(들)는 이미징 처리 및 분석을 위해 사용되는 이미징 소프트웨어를 구동할 수 있다. 대안적으로, USB 또는 다른 공지된 연결(예를 들어, 블루투스)은 별개의 컴퓨터 등[예를 들어, 컴퓨터(26)]을 통해 이미징 소프트웨어를 구동하기 위해 사용될 수 있다. 이에 관하여, 이미징 처리는 이동 통신 장치(30) 상에서 또는 이동 통신 장치(30) 외부의 별개의 컴퓨터[예를 들어, 로컬 컴퓨터(26) 또는 도 2의 컴퓨터(34)] 내에서 이루어질 수 있다. 예로서, 원본 이미지 데이터는 다른 원격 컴퓨터(34)에 통신 네트워크(32)를 통해 무선으로 통신될 수 있으며, 이 원격 컴퓨터(34)는 그후 이미지를 처리할 수 있다. 그후, 결과는 동일 무선 통신 네트워크(32)를 통해 이동 통신 장치(30)로 다시 중계될 수 있다. 대안적으로, 무선 통신 장치(30)는 자립형일 수 있으며, 이미지를 처리할 수 있고, 결과를 사용자에게 직접적으로 보고할 수 있다.
내부에 무렌즈 홀로그래픽 이미징 시스템(10)이 통합되어 있는 무선 통신 장치(30)는 경량이며 여전히 휴대가능하게 유지된다. 이동 통신 장치(30)에 추가되는 추가적 이미징 구성요소는 통상적으로 일부 예에서는 40g 미만의 단지 소폭의 양의 추가적 중량만을 추가한다. 일반적으로, 이런 장치는 큰 이미징 시계(FOV; Field Of View)를 제공한다. 통상적으로, 달성가능한 FOV는 24 mm2보다 크고, 이는 광학 현미경보다 10배넘어 더 크다. 시스템(10)은 비용효율적이고, 소형이며, 오정렬에 내성적인 구성요소를 사용하기 때문에, 이는 특히 자원이 열악한 환경들에서도 검경, 혈구계산(cytometry) 및 의학적 진단 요구들에 대한 적응력있는(transformative) 해법을 제공한다.
시스템(10)에서, 조명원(24)은 공간적 필터(18)의 개구(20)를 통해 광을 통과시킨다. 이 공간적으로 필터링된 LED 광은 통상적으로 수 cm인 거리를 공기 중에서 이동한 이후 샘플(12)과 상호작용하고, 샘플(12) 내의 각 세포/입자는 그 크기, 3D 모폴로지, 아세포 요소 및 굴절 지수에 기초하여 입사 LED 광을 산란 및 굴절시킨다. 비산란 LED 광과 세포를 통과한 광파의 간섭은 각 세포의 홀로그램을 생성하며, 이 홀로그램은 이미징 센서 어레이(16)를 사용하여 검출된다. 각 세포의 무렌즈 홀로그램은 극도로 선명(rich)하고, 디지털 처리를 통해 그 검경 이미지의 신속한 재구성을 가능하게 한다.
일 양태에서, 사용되는 이미지 센서 어레이(16)는 이동 통신 장치(30)와 함께 제조 또는 설치되는 색상 기반 이미지 센서이다. 색상 기반 이미지 센서 어레이(16)는 단색의 것과는 달리 적-녹-청(RBG) 화소의 주기적 어레이로 구성된 바이어 패턴(Bayer pattern)이라 공지된 바를 산출하는 컬러 필터를 각 화소에 구비한다. 정규 무렌즈 홀로그래픽 현미경에서, 색상 센서는 거의 최적의 선택이 되며, 그 이유는 모든 화소들이 준-단색 조명(예를 들어, ~ 587 nm) 하에서 충분한 광을 수용하는 것은 아니기 때문이다. 이미지의 바이어 패턴에 기인한 홀로그램 왜곡의 이러한 문제를 해결하기 위해, 디지털 이미지 재구성 프로세스는 원본 포맷(바이어 패턴 이미지)을 세포 또는 입자의 이미지의 홀로그래픽 재구성 수행 이전에 단색 등가 이미지로 변환하는 여분의 단계를 포함한다.
디지털 컬러 이미지는 화소의 어레이로서 표현되며, 각 화소는 원색의 혼합에 의해 표현된다. 상용 카메라(consumer camera)의 대부분이 사용하는 표준 원색은 적색, 녹색 및 청색(RGB)이다. 이상적 경우에, 이들 색상은 각각 하나의 색상을 기록하는 세 개의 서로 다른 센서 상으로 광 비임을 분할함으로써 개별적으로 기록될 수 있다. 그러나, 비용상의 이유로, 이동 통신 장치(30)의 카메라는 통상적으로 다양한 패턴으로 설계된 컬러 필터 어레이(CFA; Color Filter Array)에 의해 덮여지는 단일 이미지 센서 칩을 사용한다. 이미지 취득 산업에서 가장 폭넓게 사용되는 CFA 패턴은 하나의 청색, 하나의 적색 및 두 개의 녹색 필터로 구성되는 반복적 2 x 2 패턴을 사용하는 소위 바이어 패턴이다. 따라서, 일반적으로 바이어 패턴 이미지라 지칭되는 바이어 패턴 CFA를 사용하는 이미지 센서 어레이(16)의 원본 출력은 세 개의 주 채널 중 하나에 관한 정보를 전달하는 화소로 이루어진다. 완전 컬러 이미지를 획득하기 위해 이들 세 개의 채널을 병합하는 프로세스는 디모자이이싱(demosaicing)이라 지칭된다.
다양한 용례의 필요성에 각각 응답하는, 디모자이싱을 위한 다양한 방법에 대한 방대한 양의 문헌이 존재한다. 그러나, 홀로그래픽 휴대 전화 검경의 목적을 위해, 이런 표준 디모자이싱 알고리즘은 일반적으로 홀로그래픽 재구성 프로세스에 필요한 고 주파수 진폭 발진을 배제(wash out)한다. 따라서, 그 가장 순수한 포맷으로 기록된 정보의 사용은 종래의 디모자이싱 알고리즘에 의해 도입될 수 있는 임의의 원하지 않는 아티팩트(artifact)를 방지하는 현저한 장점을 갖는다. 검경 대상물의 홀로그래픽 회절 서명을 보전하기 위해, 취득된 홀로그래픽 패턴에 대한 최소의 왜곡으로 그레이스케일 이미지를 획득하도록 디모자이싱 알고리즘이 개발되었다. 화소간 및 채널간 상관성을 보전하면서 각 화소에서의 소실 채널을 보간함으로써 RGB 이미지를 출력하는 것을 목적으로 하는 종래의 디모자이싱 알고리즘과는 달리, 이 디모자이싱 알고리즘의 주 목적은 공간적 상관성을 최대화하는 것이다. 따라서, 이동 통신 장치(30)의 원본 출력은 개선될 패턴화된 아티팩트를 갖는 단색 이미지로서 처리된다.
컬러 센서에 의해 샘플링된 무렌즈 홀로그래픽 패턴에 대하여, 조명 파장은 최적의 공간적 샘플링 성능을 보증하는데 매우 중요하다. 상술한 바와 같이, 바이어 패턴 CFA를 사용하는 컬러 센서 상의 화소의 50%는 녹색에 응답하고, 25%는 청색에 응답하고, 25%는 적색에 응답한다. 잡음 레벨을 초과한 다수의 불포화 화소를 가능한 많이 갖는 것이 바람직하기 때문에, 조명원(24)(예를 들어, LED)의 파장은 적색 및 녹색 화소 양자 모두가 높은 검출 효율을 갖는 대역 내에 있도록 선택된다. 따라서, ~ 587 nm에서 사용되는 LED는 적색 및 녹색 채널을 위해 적합한 성능을 갖는다.
그러나, 이 준-단색성 조명하에서, 컬러 센서에서 결과적인 원본 홀로그래픽 이미지는 주로 두 가지 아티팩트를 갖는다. 첫 번째로, 적색 및 녹색 채널이 높은 신호대 잡음비를 갖는 정보를 전달하더라도, 이들은 균등하게 조명되지 않으며, 따라서, 이들 두 채널에 속하는 값들 사이에서 균등화가 수행될 필요가 있다. 두 번째로, 청색 화소가 충분히 민감하지 않은 파장을 선택한 결과로서, 제3 채널(청색)은 잡음에 의해 크게 훼손된다. 따라서, 이웃하는 녹색 및 적색 화소를 사용하여 모든 청색 화소를 예측할 필요가 있다.
녹색 및 적색 채널의 강도 레벨 사이의 검출 불균형은 대상물의 무렌즈 홀로그램의 포획을 위해 사용되었던 동일한 조명 조건으로 취득된 배경 이미지를 사용하여 보상된다. 이 배경 이미지는 홀로그래픽 이미지 상의 각 화소를 위한 스케일링 인자를 결정하는 정규화 계수 매트릭스를 제공한다. 이 방법은 녹색 및 적색 채널을 균등화할 뿐만 아니라, 센서 평면에서 비균일 조명에 의해 유발되는 임의의 잠재적 아티팩트를 보상한다.
이 채널 균등화 단계가 수행된 이후, 나머지 문제는 소실 청색 채널의 예측이다. 청색 화소의 보간을 위한 접근법은 추산 단계를 포함하며, 이 추산 단계는 에지-인식 보간(edge-aware interpolation)과, 후속하는, 정제 단계를 사용하여 수행되고, 이 정제 단계는 무렌즈 홀로그래픽 이미지의 재구성을 위해 적응되어 있는 위상 회복 방법(후술됨)을 사용하여 반복적으로 이 초기 예측을 개선시킨다.
3 x 3 화소의 더 큰 블록이 고려될 때, 이 소실 채널 예측 문제는 또한 8개 알려진 화소(적색 및 녹색)에 의해 둘러싸여진 소실 화소(청색)의 추산치로서 해석될 수도 있다. 이 알려지지 않은 화소를 추산하기 위한 가장 간단한 방식은 모든 8개 이웃하는 화소의 단순한 평균화이다. 그러나, 이런 접근법은 무렌즈 홀로그램의 고주파수 변화를 검사하여야 한다. 대신, 4개 방향 각각의 공간적 도함수(spatial derivative)의 크기에 기초하여 소실 화소의 추산치를 조절하는 에지-인식 보간 알고리즘이 사용된다. 알고리즘의 추가적 세부사항은 본 명세서에 전체가 기술된 것처럼 참조로 본 명세서에 통합되어 있는, Tseng 등에 의한 명칭이 "휴대 전화 상에서의 무렌즈 검경(Lensfree Microscopy on Cellphone)(Lab Chip, 2010 Jul. 21, 10(14):1787-92)"인 발간물에서 찾을 수 있다.
도 4는 본 발명의 시스템(10)의 바이어 패턴화된 출력으로부터 단색 홀로그래픽 이미지를 생성하도록 개발된 탈-바이어링(de-Bayering) 알고리즘의 개략도를 예시한다. 취득된 원본 홀로그래픽 이미지의 적색 및 녹색 채널은 대상물과 동일한 조명 조건으로 기록된 배경 이미지를 사용하여 균등화된다. 청색 화소는 에지-인식 보간 접근법을 사용하여 (높은 SNR 정보를 포함하는) 그 적색 및 녹색 이웃들로부터 추산되며, 자동으로 생성된 대상물 지지 마스크의 도움으로 반복적 회복 프로세스를 통해 추가로 정제된다. 마지막으로, 회복된 홀로그램은 업샘플링되고(up-sampled), 대상물의 대응 검경 이미지를 생성하도록 홀로그래픽 재구성 알고리즘에 공급된다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 시스템(50)을 예시한다. 이 대안적 시스템(50)에서, 온칩 이미징 플랫폼(on-chip imaging platform)은 무렌즈 홀로그래픽 이미징을 포함하거나, 무렌즈 홀로그래픽 이미징(예를 들어, 도 1)을 큰 시계에 걸친 무렌즈 형광 검출과 병합한다. 이 시스템은 상술된 디지털 홀로그래피를 위한 비응집성 조명원을 제공하는 조명원(24)을 포함한다. 또한, 개구(20)와 함께 공간적 필터(18)가 포함된다. 이 시스템(50)은 내부에 샘플(12)을 포함하는 샘플 홀더(14)를 더 포함한다. 샘플(12)은 도 5에 예시된 바와 같은 세포(52) 같은 마이크로 대상물을 포함한다. 샘플 홀더(12)는 세포(52)를 전달 또는 수송하기 위한 채널 등을 포함하는 마이크로유체 기반 장치를 포함할 수 있다.
도 5를 계속 참조하면, 시스템(50)은 형광 여기를 위해 하나 이상의 파장에서 방사선을 방출하도록 구성되는 형광 여기원(52)을 포함한다. 이 여기원(52)은 단색분광기에 의해 조율되는 LED 또는 제논 램프를 포함할 수 있다. 형광 여기원(52)은 바람직하게는 샘플 홀더(14)에 관하여 각지게 배향된다. 형광 여기원(52)으로부터의 형광 방사선은 프리즘(56)(예를 들어, 마름모꼴 프리즘)을 통해 샘플 체적에 전달된다. 샘플 홀더(14) 아래에는 내부 전반사(TIR; total internal reflection) 표면(60)을 통해 여기 방사선을 반사하기 위해 사용되는 유리층(58)이 배치된다. 유리층(58)은 약 100㎛ 정도의 두께를 가질 수 있다. 이미징 센서 어레이(16)는 유리층(58)의 후방측 상에 배치되며 홀로그래픽 이미지 및 형광 이미지를 포획하기 위해 사용된다. 흡수 필터(60)가 TIR 유리층(58)과 이미징 센서 어레이(16) 사이에 개재된다. 흡수 필터(60)는 일반적으로 100㎛ 미만인 두께를 갖도록 얇다.
도 5에 도시된 바와 같이, 프리즘(56)의 높이는 17 mm이다. 이미징 센서 어레이(16)의 치수(w1 x w2)는 25 x 35 mm이다. 용액 저장조의 깊이(k)는 10 내지 100 ㎛ 사이이다. 수직 소스의 깊이(h)는 약 5 내지 10 cm이다. 형광 여기원의 거리(f)는 약 1 - 2 cm이다. 이들 구체적으로 상술한 것들을 제외한 다른 치수들은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것을 의도한다는 것을 이해하여야 한다. 도 5에 도시되어 있지는 않았지만 선택적인, 지수 정합-겔이 또한 프리즘(56)의 저부 페싯에서의 비의도적 산란 및 TIR을 피하기 위해 사용될 수도 있다. 도 5에 예시된 얇은 흡수 필터(62)는 이 경우에 보호층으로서 작용함으로써 샘플 홀더(14)의 마이크로 채널들로부터 이미징 센서 어레이(16)의 활성 영역을 격리시킨다. 예시적 흡수 필터(62)는 Roscolux로부터 얻어질 수 있다(예를 들어, 600 nm 미만에서 30 dB; 0.075 mm 두께)(Rosco Laboratories, Inc., 코네티컷 주 스탬포드).
입자들/세포들의 여기 이후, 형광 방사선 "펌프 비임"이 TIR 표면(60)에서 내부 전반사(TIR)를 통해 필터링 제거된다. 또한, 동일 상단 또는 평판 프리즘(56) 인터페이스는 동일 시계를 위해 비응집성 무렌즈 홀로그래피가 동시에 수행될 수 있게 한다. 렌즈 이미지들 내의 각 형광 스팟의 질량 중심은 2D 공간에서 형광 입자의 재구성된 홀로그래픽 이미지들과 중첩하며, 이는 동일 시계 내에서 서로로부터, 그리고, 비형광 입자들로부터 형광 입자들의 분리를 가능하게 한다. 이런 이중 이미징 기능은 특히 무렌즈 온칩 이미징의 특이성 및 기능성을 증가시키는데 매우 유용하다. 이들 결과들은 다른 무렌즈 홀로그래픽 접근법들에서 가능하지 않으며, 그 이유는 큰 샘플-센서 거리(예를 들어, 1 mm 이상)에서, 이때, 각 형광 스팟을 어떠한 렌즈들도 사용하지 않고 칩 상에서 검출하는 것이 매우 어렵기 때문이다.
도 5에 예시된 무렌즈 이중-이미징 구성은 다수의 장점들을 갖는다. 먼저, 여기 비임을 차단하기 위한 TIR의 사용은 높은 펌프 파워의 배제에 매우 효율적이며, 여기 및 방출 파장에 독립적으로 작용한다. 추가적으로, 대면적 이미징 센서 어레이(16)(예를 들어, 3.5 cm x 3.5 cm)가 형광 마이크로-대상물에 매우 근접하게 배치됨으로써 광자 검출을 위해 매우 효율적이 되게 하기 때문에 시스템(50)의 검출 개구수(NA)는 1.0에 가깝다. 달리 말해서, ~1과 ~1.3 사이(채널 내의 매체의 굴절 지수)의 개구수를 구성하는 경사 형광 광선만이 검출 어레이에 도달하지 않고 소실된다. 한편, 렌즈 기반 검경과는 달리, 이 큰 검출 개구수는 그 무렌즈 동작에 기인하여 시스템(50) 내의 공간적 해상도에 직접적으로 기여하지 않는다.
또한, 파장 및 조명 방향 의존성이어서 이들이 무렌즈 동작에 비효율적이고 고가가 되게 하는 박막 기반 형광 필터의 사용을 피하기 때문에, 이 TIR 표면(60)은 매우 유용하다. 추가적으로, 저가 플라스틱 기반 흡수 필터(62)가 TIR에 준하지 않는 약하게 산란된 여기 광을 필터링 제거하기 위해 사용될 수 있다. 여기 비임을 배제하는 TIR의 효율에 기인하여 이 필터의 성능에 대한 요건은 크게 감소되며, 즉, 30 dB 미만의 배제율을 갖는 저가 흡수 필터(62)로 무렌즈 형광 온칩 이미징을 위해 충분하다.
도 6a 내지 도 6k는 이종 용액(heterogeneous solution)을 위해 순차적으로 얻어지는 동일 시계의 무렌즈 홀로그래픽 및 형광 이미징을 예시한다. 여기 및 홀로그래픽 이미징 비임[예를 들어, 조명원(24) 및 형광 여기원(54)]의 타이밍을 제어함으로써, 어떠한 렌즈, 레이저, 박막 필터 또는 다른 기계적 구성요소도 사용하지 않고 동일 시계의 형광 및 홀로그래픽 이미지 양자 모두를 기록할 수 있다. 도 6a는 10 ㎛ 형광(여기/방출 중심 λ: 580 nm/605 nm), 10 ㎛ 비형광, 20 ㎛ 비형광 마이크로비드(NON-fluorescent microbead)로 구성되는 이종 용액의 무렌즈 형광 이미지를 예시한다. 예상된 바와 같이, 단지 형광 입자들만이 이런 이미지에 나타난다. 이 이미지를 위한 통합 시간은 1초이다.
도 6b는 동일 시계의 무렌즈 홀로그래픽 이미지를 예시하며, 이때, 이 용액 내의 입자들 모두는 센서 상에 음영을 투사한다. 도 6e, 도 6h 및 도 6k는 도 6b에 도시된 원본 홀로그램 이미지로부터 취해진 관련 확대 영역이다. 도 6d, 도 6g 및 도 6j는 동일 확대 영역의 재구성 이미지이다. 예상된 바와 같이, 모든 입자들이 이 재구성된 홀로그래픽 이미지 내에 존재한다. 도 6c, 도 6f 및 도 6i는 비교 목적들을 위한 동일 시계의 투과 현미경 이미지이다. 동일 시계의 무렌즈 형광 이미지에 기초하여, 재구성된 홀로그래픽 이미지 내의 비형광 입자들로부터 형광 입자들을 식별할 수 있다. 저 비용으로 매우 비용 효율적인 구성요소의 사용을 가능하게 하는 흡수 필터(62)의 입자형 구조에 의해 홀로그래픽 재구성이 영향을 받지 않는 다는 것을 인지하여야 한다.
도 6a 내지 도 6k는 형광 비드의 이미징을 예시하지만, 동일 시스템(50)은 세포 또는 심지어 전체 장기 같은 생리학적 대상물을 이미징하기 위해 사용될 수 있다. 시스템(50)은 예로서, 10 ㎛ 이하의 공간적 해상도를 갖는 예를 들어, 2 내지 8 cm2를 초과하는 초광폭 시계(FOV)에 걸쳐 트랜스제닉 꼬마선충(transgenic Caenorhabditis elegans)[C. 선충(C. elegans)]의 무렌즈 온칩 형광 이미징을 위해 사용된다. 도 5에 예시된 것 같은 시스템(50)은 C. 선충을 이미징하기 위해 사용된다. 이 벌레의 전체 몸체와 상호작용한 이후, 펌프 광자(pump photon)는 TIR 표면(60)에서 발생하는 TIR에 의해 배제된다. 충분한 어두운 필드 배경을 생성하기 위해, TIR에 준하지 않는 약하게 산란된 펌프 광자는 추가적 흡수 필터(62)에 의해 배제되며, 그 결과, 대상물로부터의 형광 방출만이 이미징 센서 어레이(16)에 의해 검출된다.
종래의 렌즈 기반 형광 검경과는 달리, 본 발명의 플랫폼 내의 박막 간섭 필터(62)의 사용은 평범한 것이 아니며, 그 이유는 무렌즈 이미징 구성의 펌프 광자의 배제는 펌프 광자의 큰 각도 범위를 차단하기 위해 매우 더 두꺼운 간섭 필름의 증착을 필요로 하기 때문이라는 것을 주의하여야 한다. 이는 비용을 증가시킬 뿐만 아니라 더 두꺼운 필름 내의 더 높은 응력에 기인하여 현저히 두꺼운 기판의 사용을 필요로함으로써 형광 점 확산 함수(PSF; point-spread function)의 SNR을 현저히 약화시켜 역시 달성가능한 해상도를 열화시킨다. 따라서, 초박 유리 기판(~30 ㎛) 상에 코팅된 염료를 가지는 흡수 기반 필터가 제조된다.
얇은 흡수 필터(62)의 제조 레시피는 소량의 시클로펜타논 내에 오라졸(Orasol) 염료를 용해시키고, 그후, KMPR 1005 포토레지스트(~0.4 g ml-1 염료 농도)를 추가하는 것을 포함하며, 그후, 잉여 염료 재료가 0.45 ㎛ 직경 기계적 필터를 사용하여 제거된다. 이 단계에는 2000 rpm으로 20초 동안 스핀 코팅, 100℃에서의 300초 동안의 베이킹, 35초 동안의 13 mW/cm2에서의 전면 노광(flood exposure) 및 100℃에서의 다른 120초 동안의 최종 베이킹이 이어진다. 이 레시피에 기초하여, 다양한 장파 통과 흡수 필터들이 각각 황색 2RLN, 오랜지색 G 및 적색 BL을 포함하는 다양한 유형의 오라졸 염료를 사용하여 510 nm, 540 nm 및 600 nm의 차단 파장으로 제조된다. 이들 제조된 흡수 필터의 배제율(~30-40 dB)은 필요한 어두운 필드 배경(TIR과 함께)을 생성하기에 충분히 커서 이들이 무렌즈 형광 온칩 이미징 용례들에 매우 유용해지게 한다.
제조 이후, 이들 흡수 필터들(총 두께 ~40 ㎛; 10 ㎛ 필터 + 30 ㎛ 유리 기판)은 이미징 센서 어레이(16)의 활성 영역의 상단 상에 직접적으로 배치됨으로써 또한 나체 센서 표면(bare sensor surface)을 위한 보호 층으로서 작용한다. 추가적 일회용 초박 유리 기판(~30 ㎛ 두께)이 또한 샘플과 흡수 필터(62) 사이에 사용된다.
여기에 대하여, 단색분광기(MS260i, Newport)를 통해 ~580 nm(15 nm 대역폭 구비)으로 스펙트럼 조율된 제논 램프로부터 결합된 비응집성 광원(54)이 사용된다. 실험 동안, 총 여기 파워는 2 cm2보다 큰 FOV에 대하여 ~1.0-1.5 mW로 유지된다.
무렌즈 형광 이미징에 추가로, 도 5에 도시된 동일 온칩 플랫폼은 또한 형광 여기에 사용된 동일 프리즘(56)의 상단 페싯을 통해 동일 샘플의 무렌즈 홀로그래픽 이미징을 가능하게 한다. 이 수직 조명은 동일 온칩 플랫폼 내의 홀로그래픽 투과 이미징을 달성하기 위해 개구(20)(~0.05-0.1 mm)로 공간적으로 필터링된 비응집성 광원(24)(즉, LED, 632 nm 피크 및 ~20 nm 대역폭)에 의해 달성된다.
본 연구에 사용된 트랜스제닉 C. 선충은 근육 세포와 관련 운동 신경 사이의 연결을 보다 양호하게 이해하기 위해 널리 연구되었다. 이를 위해, UNC 122 유전자가 표현형 표시자(phenotypic marker)(mCherry: 방출 파장: 610 nm)와 함께 벌레 내에 동시주입된다. 온칩 이미징을 위한 이들 트렌스제닉 C. 선충의 준비를 위해, 선충류 성장 매체(NGM; nematode growth medium)의 작은 덩어리가 살균된 도구로 배양판으로부터 추출되었다. 이 표본은 레바미솔(Levamisole) 10 mM으로 준비된 마비 매체(~200 μL) 내에 용해되었다. 겔 매체(gel medium)로부터 벌레를 분리하기 위해, 분별액(aliquot)이 온건하게 와동 및 원심분리된다. 피펫을 사용하여, 그후, 트랜스제닉 벌레가 무렌즈 온칩 이미징을 위해 샘플 홀더(14)에 전달된다.
부동화 시약, 즉, 레바미솔이 흐린 이미지를 피하기 위해 사용되며, 이는 또한 종래의 형광 현미경을 사용하여 동일 샘플의 포획 비교 이미지를 가능하게 한다. 또한, 성체 벌레에 대한 물리적 손상을 피하기 위해, 비형광 입자(~50-100 ㎛ 직경) 같은 기계적 스페이서가 또한 이미징 실험에 사용되었다는 것을 주의하여야 한다.
이들 이미징 실험의 결과가 도 7 및 도 8에 요약되어 있으며, 이 도면들은 또한 비교 목적을 위해 동일 샘플의 종래의 형광 검경 이미지를 제공한다. 벌레의 원본 무렌즈 형광 서명은 폭넓은 PSF에 기인하여 매우 흐려진다. 그러나, 각 플랫폼의 측정된 PSF를 사용하여, 이들 무렌즈 서명은 정규 렌즈 기반 형광 현미경을 사용하여 얻어진 이미지와 매우 잘 일치하는 C. 선충 본체 내에 위치된 형광 영역의 매우 높은 해상도의 이미지를 디지털 산출하기 위해 압축 디코딩될 수 있다.
도 7은 KAF-8300 이미징 센서 어레이(16)(KODAK KAF-8300 - 5.4 ㎛ 화소 크기, ~2.4 cm2 활성 이미징 영역)를 사용하여 표시된 세 개의 개별 동물에 대한 트렌스제닉 C. 선충의 무렌즈 온칩 형광 이미지를 예시한다. 이미지[(a4), (b4) 및 (c4)]는 검출기 평면에서 모두 흐리게 보이는 무렌즈 형광 원본 이미지를 예시한다. 이하에 더 상세히 설명된, 이들 흐린 패턴의 압축 디코딩은 (a5), (b5) 및 (c5)에 각각 도시된 바와 같은 이들 C. 선충 샘플의 매우 고 해상도 형광 이미지의 디지털 재구성을 가능하게 한다. 또한, (a2), (b2) 및 (c2)에 도시된 동일 벌레의 10X 대물 렌즈 형광 현미경 이미지는 디코딩된 무렌즈 형광 이미지와 잘 일치한다. 형광 이미징에 추가로, 동일 무렌즈 플랫폼은 또한 (a6), (b6) 및 (c6)에 도시된 바와 같은 재구성된 홀로그래픽 이미지와 디코딩된 무렌즈 형광 이미지를 중첩시킴으로써 혼성 이미지가 생성될 수 있도록 동일 샘플의 홀로그래픽 투과 이미징을 가능하게 한다.
동일 샘플의 현미경 비교가 또한 각각 (a3), (b3) 및 (c3)에 제공되어 있다. 이들이 서로 다른 실험들에서 취득되었기 때문에 무렌즈 디코딩된 이미지와 그 현미경 비교 이미지 사이에서 벌레들의 미소한 회전이 관찰되었다.
도 8은 KAF-11002 이미징 센서 어레이(16)(KODAK KAF-11002 - 9 ㎛ 화소 크기, 11 MPixel)를 사용하여 나타내진 트렌스제닉 C. 선충의 무렌즈 온칩 형광 이미지를 예시한다. 도 7과 유사하게, 트렌스제닉 C. 선충 샘플의 디코딩된 무렌즈 형광 이미지는 동일 벌레의 종래의 형광 현미경 이미지(10X 대물 렌즈로 취득됨, NA=0.25)에 대한 양호한 일치도를 제공한다. 이들 둘이 서로 다른 실험에서 취득되기 때문에, 무렌즈 디코딩된 이미지와 그 현미경 비교 이미지 사이에 벌레의 미소한 회전이 관찰된다.
압축 디코딩은 무렌즈 이미징 플랫폼의 측정된 PSF에 기초한 대상물 평면에서 형광 분포의 정확한 재구성을 가능하게 함으로써, 2 - 8 cm2를 초과하는 FOV에 걸쳐 예를 들어, ~10 ㎛의 공간적 해상도를 달성한다. 이 수치 레시피는 그 미달 샘플링된 표현으로부터 부족한 신호를 재구성하기 위해 새로운 방법을 제공하는 압축 샘플링 이론에 의존한다. 정의에 의거한 칩 상의 C. 선충 샘플들의 광시야 형광 이미징은 FOV의 대부분이 이미 어둡기 때문에(즉, 비형광) 이미징 플랫폼에 희유성(sparsity)을 초래한다. 압축 샘플링 이론에 대한 이 연계에 기초하여, 무렌즈 원본 형광 이미지는 플랫폼의 해상력을 충분히 증가시키도록 (측정된 형광 PSF를 사용하여) 신속히 디코딩될 수 있다.
이 압축 디코딩 프로세스는 l 1 -정규화된 최소 자승 문제로서 수학식 1과 같이 정형화될 수 있다.
Figure pct00001
여기서, F det는 센서 어레이에서의 검출된 원본 형광 이미지이고, P conv 는 시스템의 형광 PSF에 기초한 2D 컨벌루션 매트릭스를 나타내고,
Figure pct00002
는 이미징 센서 어레이(16)의 평면에서 무렌즈 이미지를 생성하는 형광원 분포이고, α는 비음성 정규화 파라미터이고,
Figure pct00003
는 벡터(
Figure pct00004
)의
Figure pct00005
놈(norm)을 나타낸다. 이 연구에 사용된 최적화 알고리즘은 수학식 1에 기초한 희유 형광 해(
Figure pct00006
)로 신속히 수렴하는 절단 뉴턴 내부점(truncated Newton interior point) 방법에 기초한다.
이들 실험 결과는 CCD 칩의 전체 활성 영역(예를 들어, 2 내지 8 cm2 초과)을 덮는 초광역 FOV 위에서 무렌즈 형광 온칩 이미징을 사용하여 트랜스제닉 C. 선충 샘플을 이미징하기 위한 압축 디코딩 접근법의 효율을 성공적으로 예시한다. 상술한 바와 같이, 형광 이미징에 추가로, 시스템(50)은 또한 형광 여기에 사용되는 프리즘(56)의 상단 인터페이스를 사용한 벌레의 홀로그래픽 투과 이미징을 가능하게 한다. 이 무렌즈 홀로그래픽 이미징 접근법에서, 발광 다이오드(LED) 같은 공간적 비응집성 준-단색성 광원(24)은 큰 개구(20)(예를 들어, 0.05-0.1 mm 직경)에 의해 공간적으로 필터링된 이후의 관련 샘플을 조명한다. 이 비응집성 광원은 이미징 센서 어레이(16) 상의 벌레의 무렌즈 인라인 홀로그램을 기록하기에 충분히 큰 부분적 공간적 응집성을 취득한다. 그후, 이들 취득된 인라인 홀로그램은 형광 채널의 이미징 FOV와 일치하는 이미징 센서 어레이(16)의 전체 활성 영역 위의 C. 선충 샘플의 무렌즈 투과 이미지를 생성하기 위해 반복적 회복 알고리즘을 사용하여 신속히 처리될 수 있다. 도 7 및 도 8은 샘플의 이런 재구성된 무렌즈 홀로그래픽 이미지를 예시하며, 여기서, 동일 벌레의 무렌즈 형광 이미지가 또한 디지털식으로 중첩됨으로써 C. 선충의 혼성 이미지(즉, 형광 및 투과 양자 모두)를 생성한다. 플랫폼의 공간적 해상도가 정규 렌즈 기반 현미경에 비해 적절하다는 것은 이들 무렌즈 이미지로부터 명백하다. 다른 한편, 본 발명의 플랫폼의 주된 장점은 자동화된 마이크로 유체 시스템 내의 C. 선충 샘플의 초고 처리량 스크리닝에 상당한 일치도를 제공하는 그 초광폭 FOV 및 소형 디자인이다.
도 9는 C. 선충 샘플의 형광 이미징을 또한 수행할 수 있는 대안적 무렌즈 이미징 시스템(70)을 예시한다. 이 변형된 구조에서, 파이버 광학-면판(72, fiber optic-faceplate)이 이미징 플랫폼의 형광 PSF를 제어 및 맞춤화하기 위해 샘플 홀더(14) 아래에 삽입된다. 이들 변경된 형광 PSF를 사용한 트랜스제닉 C. 선충 샘플의 압축성 디코딩은 도 7 및 도 8과 유사한 이미징 결과를 산출한다. 이 변형된 시스템(70)은 특히 대상물과 센서 평면 사이의 더 큰 간극에서 검출 SNR을 향상시키기 위해 이미징 플랫폼의 형광 PSF를 편리하게 맞춤화할 수 있다. 이는 샘플(12)과 이미징 센서 어레이(16) 사이의 물리적 분리가 필요한 경우 중요한 장점이 될 수 있다.
파이버 광학 면판(72)의 사용은 더 양호한 검출 SNR 및 더 높은 공간적 해상도를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 파이버 광학 면판(72)은 이미징 센서 어레이(16)에 방출된 형광 광을 전달한다. 파이버 광학 면판은 각 파이버가 약 0.3의 개구수를 갖는 약 1 cm의 두께의 파이버의 어레이로 구성되는 것이 일반적이다. 도 10a는 무렌즈 온칩 형광 이미징 시스템(70)의 개략도를 예시한다. 이 이미징 시스템(70)은 이미징 시계가 센서 어레이의 전체 활성 영역(즉, 8 cm2보다 큰)과 같도록 단위 배율을 갖는다. TIR 조건은 덮개 유리의 저면 패싯[TIR 표면(60)]의 유리-공기 계면에서 이루어진다. 산란된 펌프 광자의 검출을 피하기 위해, 플라스틱 흡수 필터는 면판 이후 사용된다. 통상적 치수: w1 x w2 = 25 mm x 35 mm; p = 1.7 cm; k ~ 10-100 ㎛; f = 1-2 cm. 도 10b는 광학 면판(72)의 현미경 이미지를 예시한다.
압축 샘플링 기반 알고리즘은 센서 어레이의 전체 활성 영역에 걸쳐, 즉, 8 cm2보다 큰 이미징 FOV에 걸쳐 대략 10 ㎛ 공간적 해상도를 달성하기 위해 형광원의 희유 분포를 신속히 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 이런 시스템(10)은 특히 고 처리량 이미징 혈구계산, 희박 세포 분석(rare cell analysis) 및 마이크로 어레이 연구를 위해 충분할 수 있다. 압축 샘플링 기반 알고리즘에 관한 추가적 세부사항은 본 명세서에 그 전문이 기재된 것처럼 참조로 통합되어 있는 코스쿤(Coskun) 등의 희유 대상물의 압축 디코딩을 사용한 단일 칩 상에서의 무렌즈 광시야 형광 이미징(Lensless wide-field fluorescent imaging on a chip using compressive decoding of sparse objects)[Optics Express, Vol. 18, Issue 10, pp. 10510-10523 (2010)]으로부터 얻을 수 있다.
초기 무렌즈 형광 이미징 연구에 비교할 때, 파이버 광학 면판(72)은 FOV의 절충 없이 공간적 해상도에서 ~5배의 개선을 초래하며, 우리는 이를 파이버 광학 면판 및 수치 처리에 기초한 압축 샘플링의 사용한 결과라고 생각한다. 또한, 이 대안적 시스템(70)에서, 수직 적층된 마이크로채널의 무렌즈 형광 이미징이 모두 병렬로 사용됨으로서 추가로 처리량을 증가시킨다. 이 특정 시스템(70)은 전체 혈액 내의 순환하는 암 세포 같이 관련 타겟 세포가 희박한 용례에 매우 적합하다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 시스템(10, 50, 70)은 관련 대상물의 원본 홀로그램 진폭 이미지(hologram amplitude image)를 획득하기 위해 이미징 센서 어레이(16)를 사용한다. 소실 홀로그램 위상은 그후 회복된다. 측정된 진폭 정보와 함께 회복된 위상 정보가 관련 대상물의 이미지를 디지털 재구성하기 위해 사용된다. 도 11은 시스템(10, 50, 70)이 관련 대상물의 이미지를 디지털 재구성하는 방식의 상위 레벨 흐름도를 예시한다. 도 11의 동작 500에 도시된 바와 같이, 샘플(12)은 시스템(10, 50, 70) 내에 탑재된다. 그후, 동작 510에서, 원본 홀로그래픽 이미지가 얻어진다. 그후, 동작 520에서, "소실" 위상 정보가 회복된다. 회복된 위상 정보 및 원본 홀로그래픽 이미지에 기초하여, 동작 530에서 개요설명된 바와 같이, 그후, 샘플의 하나 이상의 이미지가 디지털 재구성된다.
그 홀로그램으로부터의 대상물 이미지의 디지털 재구성을 위해, (1) 각 대상물 홀로그램의 강도의 푸리에(Fourier) 요소의 역전파 및 (2) 각 홀로그램의 진폭의 2D 위상의 회복의 두 가지 접근법이 취해질 수 있다. 이들 두 기술은 그 원본 홀로그램으로부터 마이크로 대상물의 트윈-이미지 자유 재구성을 독립적으로 가능하게 한다. 이들 디지털 재구성 접근법은 실제로 간섭 및 비간섭 위상 복구 기술의 더 넓은 개념의 일부가 되는 것으로 고려될 수 있다. 이들 접근법 양자 모두에서, 어떠한 근사화도 없는 레일리-좀머펠트(Rayleigh-Sommerfeld) 적분의 전달 함수가 필드의 역전파를 위해 사용된다.
상술한 제1 접근법은 검출된 홀로그램의 강도에 따라 작용하며, 잘 알려진 트윈 이미지 문제에 민감하다. 이 제1 접근법의 트윈 이미지 아티팩트(twin image artifact)를 제거하기 위해, 트윈 이미지로부터 재구성된 이미지를 반복적으로 청명하게 할 수 있는 수치 알고리즘이 구현된다. 제2 재구성 방법에서, 무렌즈 홀로그램의 진폭(그 강도가 아닌)이 검출 프로세스 동안 소실되는 복잡한 회절 필드의 2D 위상 정보를 회복하기 위해 사용된다. 이 위상 회복 단계는 이들 회복된 2D 위상 홀로그램이 또한 이종 용액의 특성화를 위해 사용될 수 있도록 각 세포 유형을 위한 다른 고유한 2D 텍스쳐를 생성하기 때문에 더욱 유용하다. 전체 복합 회절 필드가 회복되고 나면, 검경 이미지는 복합 필드의 역전파를 통해 어떠한 트윈 이미지 아티팩트도 없이 계산될 수 있다.
비응집성 세포 홀로그래피를 위해, 이들 접근법 양자 모두는 매우 유사한 회복 결과를 산출한다. 그러나, 더 큰 규모의 미생물에 대하여, 상술된 2D 위상 회복 접근법은 특정 장점들을 갖는다. 대형 미생물에 대하여, 산란된 광 필드가 배경광과 항상 효과적으로 간섭할 수는 없으며, 그래서, 홀로그래픽 회절 항은 그 상대적 강도를 잃기 시작한다. 그러나, 위상 회복 접근법은 복합 회절 필드의 진폭으로서 검출된 양을 처리하며, 디지털 재구성을 위해 그 위상을 반복적으로 회복하기를 시도한다. 따라서, 위상 회복 기반 재구성 접근법은 교차 간섭 항이 홀로그래픽 회절보다 우세해지기 시작하는 고 산란 세포 또는 더 큰 규모의 미생물의 무렌즈 이미징에 특히 유용하다. 절충으로서, 검출기 단부에서 필요한 공간 대역폭 적(space-bandwidth product)은 제1 접근법에 비교시 위상 회복 기술에서 두배만큼 증가되며, 그 이유는 제1 접근법이 홀로그래픽 회절 항과 관계할 뿐만 아니라, 자체 간섭 항과도 관련하기 때문이다.
검경 재구성은 연속적 급속 푸리에 변환(FFT) 연산을 사용할 수 있으며, 각 반복의 초기 FFT 이후, 어떠한 근사화도 없이 라일리-소메필드 적분의 전달 함수가 세포 홀로그램의 푸리에 요소에 적용된다. FFT가 사용되기 때문에, 제공된 회복은 또한 디지털 연산 시간에 관한 매우 신속하며, 예를 들어, 1.6 GHz 펜티엄 프로세서를 사용하여 수초 미만의 수렴 시간을 갖는다.
제안된 비응집성 세포 홀로그래피 시스템(10, 50, 70)의 현저한 실용적 장점에도 불구하고, 비응집성 조명은 수치 재구성 프로세스에 대한 부담을 증가시키지 않는다. M>>1인 비응집성 무렌즈 세포 홀로그래피를 위해, 각 개별 세포는 여전히 응집성 광으로 조명되도록 처리될 수 있다. 또한, 그 검경 단면에 기인하여, 각 마이크로 대상물(예를 들어, 세포) 상의 입사 파는 평면 파가 되는 것으로 가정될 수 있다. 결과적으로, 각 기록된 세포 홀로그램의 재구성은 평면 파 조명을 가정하여 수행될 수 있다.
파두를 회절시키기 위해, 각도 스펙트럼 접근법이 라일리-소메필드 적분을 수치적으로 풀기 위해 사용된다. 이 연산은 아래에 표시된 바와 같이, 선형, 등방성 매체를 통한 전파의 전달 함수와 필드의 푸리에 변환의 승산을 수반한다.
Figure pct00007
여기서,fx 및 fy는 공간적 주파수이고, η은 매체의 굴절 지수이다.
상술된 바와 같이, 두 개의 서로 다른 반복 접근법이 임의의 트윈 이미지 아티팩트로부터 자유로운, 세포의 검경 이미지를 재구성하기 위해 수행된다. 양 방법은 단일 기록된 홀로그램으로 동작하고, 각 세포가 유한 지지부를 갖는다는 제약에 의존한다. 양 방법들에서, 원본 홀로그램은 반복적 재구성 절차 이전에 큐빅 스플라인 보간(cubic spline interpolation)을 사용하여 통상적으로 4 내지 6배만큼 업샘플링된다. 비록, 업샘플링은 홀로그램의 정보 내용을 즉시 증가시키지 않지만, 이는 여전히 재구성된 이미지의 더욱 정확한 위상 회복 및 더 높은 해상도를 달성하기 위해 중요한 개선을 제공한다. 첫 번째로, 홀로그램의 초기 역 투영(back-projection)에서 대상물의 에지를 평활화함으로써 더욱 정확한 대상물 지지부를 형성할 수 있게 한다. 크기 및 형상에 관한 실제 세포에 더 근접한 대상물 지지부를 사용하는 것은 반복 알고리즘의 에러를 감소시키며, 더 신속한 수렴을 보증한다. 두 번째로, 업샘플링은 홀로그램 내에 최초에 제로 에너지를 수반하는 더 높은 공간적 주파수를 도입한다. 이하에 상세히 설명된 반복적 재구성 단계를 통해, 이들 더 높은 공간적 주파수는 일반적으로 비제로 에너지를 달성하며, 이는 최종 재구성에서 서브화소 해상도를 가능하게 한다.
방법 1: 제1 방법은 간섭계 위상-검색 기술의 넓은 부류에 포함되며, 홀로그래픽 회절 항에 의해 기록된 강도가 우세해지는 경우에 적용할 수 있다. 제1 단계는 홀로그램의 디지털 재구성이며, 이는 초기 파면(
Figure pct00008
)을 산출하는 홀로그램 평면으로부터 z2의 거리 만큼 홀로그램 강도를 전파시킴으로서 달성된다. 이 연산의 결과로서, 대상물의 가상 이미지가 그 공간적으로 중첩하는 탈초점 트윈-이미지와 함께 회복된다. 기록된 강도는 또한 -z2의 거리 만큼 전파될 수 있다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 이 경우, 탈초점 가상 이미지가 트윈-이미지 형성을 초래하는 동안, 대상물의 실제 이미지가 회복될 수 있다.
본 명세서에 제공된 비응집성 홀로그래픽 검경 체계의 작은 세포-센서 거리에 기인하여, 트윈-이미지는 특히, 백혈구 같은 비교적 큰 대상물에 대해 높은 강도를 수반할 수 있다. 이런 경우에, 마이크로-대상물 내부의 미세 세부사항은 억제될 수 있다. 유사하게, 서로 근접한 서로 다른 세포의 트윈-이미지가 억제됨으로써 배경 잡음의 증가를 초래한다. 이러한 문제는 특히 고밀도 세포 용액의 검경에 대해 두드러지며, 다수 세포의 중첩 트윈 이미지는 감소된 SNR에 기인하여 계수 정확도를 저하시킨다.
트윈-이미지 아티팩트를 제거하기 위해, 유한 지지 제약을 사용하는 반복 접근법이 사용된다. 본질적으로, 이 기술은 대상물의 위상 및 진폭을 위한 이중적 정보가 대상물의 가상 및 실제 이미지가 각각 회복되는 홀로그램 평면으로부터 거리 +z2 및 -z2에 있는 두 개의 서로 다른 재구성 평면 내에 존재한다는 사실에 의존한다. 따라서,다른 평면 내의 이중적 이미지를 필터링 제거하면서, 이미지 평면 중 하나 내의 트윈-이미지가 없는 재구성이 얻어질 수 있다. 일반성의 손실 없이, 실제 이미지는 필터링 제거됨으로써 -z2에서 가상 이미지 평면 내에 트윈-이미지가 없는 재구성을 획득한다. 마이크로-대상물의 유한 크기에 기인하여, 대상물의 실제 이미지는 단지 그 지지부 내의 영역만을 점유하며, 동시에, 탈초점 트윈-이미지 이미지가 대상물 둘레에 더 넓은 영역으로 분산함으로써 또한 지지부 내부의 실제 이미지와 중첩한다. 따라서, 지지부 내부에서만 정보를 삭제하는 것은 실제 이미지가 재구성된 파면으로부터 완전히 제거되는 것을 보증한다. 그럼에도 불구하고, 지지부 내부의 가상 이미지 정보가 또한 소실되며, 반복적 기술은 가상 및 실제 이미지 평면 사이에서 전후로 진행함으로써 가상 이미지의 소실 정보를 회복하기를 시도함으로써 각 반복에서 더 많은 소실 정보를 회복한다. 이 알고리즘의 성공은 기록 형상의 프레넬(Fresnel) 수에 크게 의존하며, 이는 수학식 3에 의해 주어진다.
Figure pct00009
이 기술은 10만큼 높은 프레넬수를 위해 성공적인 것으로 보고되어 있다. 약 7 ㎛ 직경의 RBC에 대하여, 본 명세서에 제시된 통상적 기록 형상은 0.2 미만의 프레넬 수를 포함하며, 따라서, 트윈-이미지 제거 방법은 매우 만족스러운 결과를 산출한다.
트윈-이미지 제거의 단계들이 후술되어 있다.
a) 최초에, +z2의 거리에서 후방 투영된 홀로그램인 실제 이미지는 대상물 지지부를 결정하기 위해 사용된다. 대상물 지지부는 재구성된 이미지의 강도의 임계화 또는 그 국지적 최소치들에 대한 검색에 의해 형성될 수 있다.
b) 지지부 내부의 영역이 삭제되고, 상수값이 후술된 지지부 내부의 가상 이미지의 삭제된 부분을 위한 초기 추정치로서 이 영역에 할당된다.
Figure pct00010
여기서,
Figure pct00011
는 i번째 반복 이후 실제 이미지 평면에서의 필드를 나타낸다. s는 대상물 지지부에 의해 형성된 영역을 나타내고,
Figure pct00012
는 지지부 내의
Figure pct00013
의 평균값이다.
c) 그후, 실제 이미지 평면의 필드는 가상 이미지 평면으로 -2z2만큼 역전파된다. 이상적으로, 이 평면에서의 재구성은 임의의 트윈-이미지 왜곡으로부터 자유로워야 한다. 따라서, 지지부 외부의 영역은 가상 이미지 평면 내의 임의의 잔여 초점외 실제 이미지를 제거하기 위해 직류(d.c.) 배경값으로 설정될 수 있다. 그러나, 이러한 제약은 이미지를 지지부 외측에서 직류 레벨로 선명하게 설정하는 대신, 아래의 이완 파라미터(β)에 의해 결정되는 바와 같이 평활하게 인가된다.
Figure pct00014
여기서, D는 재구성된 필드의 배경이며, 이는 대상물의 부재시 측정된 배경 이미지로부터 얻어질 수 있거나, 가상 이미지 평면의 대상물 지지부 외측의 필드의 평균값으로서 단순히 선택될 수 있다. β는 1보다 큰 실제값 파라미터이고, 통상적으로 2 내지 3 정도로 선택된다. β의 증가는 더 신속한 수렴을 초래하지만, 배경 잡음에 대한 반복적 추산 정확도의 면역성을 손상시킨다.
d) 가상 이미지 평면의 필드는 실제 이미지 평면으로 순방향 전파되며, 지지부 내부의 영역은 이제 가상 이미지의 소실 부분의 더 양호한 추산치를 갖는다. 지지부 외부의 영역은
Figure pct00015
로 대체될 수 있으며, 실제 이미지 평면의 원래 재구성된 필드는 아래와 같다.
Figure pct00016
단계 c 내지 d는 최종 이미지 수렴까지 반복적으로 반복될 수 있다. 본 문헌에서 대부분의 경우에, 수렴은 10 내지 15 반복 이후 달성되며, 이는 최신 하드웨어 구성을 갖는 컴퓨터 상에서 1분 미만 이내에 이루어진다.
방법 2: 트윈-이미지를 제거하기 위해 사용되는 제2 방법은 비간섭 위상-검색 기술하에 분류되며, 기록된 이미지는 반드시 홀로그램으로서 처리되는 것이 아니며 임의의 회절 필드의 강도로서 처리된다. 대상물이 유한 지지부를 갖는다는 제약과 함께, 이 기술은 단일 강도 이미지로부터 검출기 상에 입사되는 회절 필드의 위상을 반복적으로 회복할 수 있다. 결과적으로, 강도가 아닌 세포 홀로그램의 복합 필드(진폭 및 위상)는 역방향 전파될 수 있으며, 그에 의해, 임의의 트윈-이미지 오염이 없는 대상물의 재구성을 가능하게 한다. 이 방법은 이하의 단계로 분해될 수 있다.
a) 기록된 홀로그램 강도의 자승근은 세포 평면에 -z2의 거리 만큼 전파되며, 초기 추정치로서 제로의 필드 위상을 가정한다. 알고리즘의 목적은 검출기 평면에서, 그리고, 결국, 대상물 평면에서 복합 필드의 실제 위상을 반복적으로 결정하는 것이다. 제1 반복에서, 대상물 지지부는 대상물 평면에서의 필드의 강도의 임계화 또는 그 영역 최대치들 및/또는 최소치들의 위치설정에 의해 규정된다.
b) 대상물 지지부 내부의 필드가 보전되며, 지지부 외부의 복합 필드 값은 이하에 나타난 바와 같이 배경값(
Figure pct00017
)에 의해 대체된다.
Figure pct00018
여기서,
Figure pct00019
는 세포의 부재시 동일 구성에 의해 얻어지는 이미지의 배경 강도의 자승근을 전파시킴으로써 얻어지며,
Figure pct00020
이다.
c) 대상물 평면의 변형된 필드는 검출기 평면으로 다시 전파되고, 이 필드는 이제 비제로 위상값을 갖는다. 이 필드의 진폭은, 그 위상을 위해 수렴하는 동안 진폭을 위한 어떠한 변경도 허용되지 않아야하기 때문에, 원래 기록된 홀로그램 강도의 자승근으로 대체된다. 결과적으로, i번째 반복 이후의 검출기 평면의 복합 회절 필드
Figure pct00021
는 아래와 같이 기록될 수 있다.
Figure pct00022
여기서, 상첨자는 반복 단계를 나타내며,
Figure pct00023
는 i번째 반복 이후의 필드의 위상을 나타낸다.
단계 a 내지 c는 위상 회복이 수렴할 때까지 반복될 수 있다. 통상적으로, 본 문헌에 제시된 결과는 15 반복 미만으로 얻어지며, 이는 제1 방법과 매우 유사하다.
방법 1과 방법 2의 비교: 전체 혈구 또는 마이크로비드 같은 작거나 약하게 산란하는 대상물에 대하여, 양 방법들은 비견할만한 이미지 품질의 결과를 만족스럽게 산출한다. 이런 목적들을 위해, 기록 형상의 통상적 프레넬수는 1보다 작고, 초점형성된 실제 이미지는 그 위에 트윈-이미지가 분산되는 영역의 작은 부분을 점유한다. 따라서, 실제 이미지 평면 내의 대상물 이미지를 삭제하는 것은 가상 이미지를 위한 최소의 정보 손실을 초래하며, 이는 트윈-이미지 아티팩트 없이 회복되게 된다. 그러나, 더 큰 관련 대상물에 대하여, 시스템의 프레넬수가 증가하며, 실제 이미지의 삭제는 가상 이미지 내의 과도한 정보 손실을 유발하고, 이는 반복적으로 회복하기가 더 어려울 수 있다. 또한, 강하게 산란하는 대상물에 대하여, 자체 및 교차-간섭 항이 우세해지기 시작하여 기록된 강도의 홀로그래픽 내용이 왜곡되게 될 수 있다. 따라서, 강하게 산란하는 및/또는 연장된 대상물을 위해, 상술한 제2 방법은 제1 방법에 비해 더욱 바람직해질 수 있으며, 이는 10보다 작은 프레넬수를 갖는 구성에서 홀로그래픽 항이 우세해지는 것을 요건으로 한다. 다른 한편, 제1 방법의 장점은 샘플을 구성 내에 삽입하기 이전에 반드시 별개의 배경 이미지를 취할 필요가 없다는 것이다. 비록, 대상물 평면의 필드의 평균값이 또한 사용될 수 있지만, 방법 2(단계 b)에 대하여 배경 이미지의 부재시, 최종 이미지 품질은 경험적으로 얻어진 배경에 의해 더욱 양호해진다는 것이 관찰되었다.
도 12는 세 가지 주 유형의 백혈구(즉, 과립구, 림프구 및 단구)의 홀로그래픽 서명을 예시하는 혈액 도말 샘플의 비응집성 무렌즈 이미징 결과를 예시한다. 각 경우에 동일한 시계가 또한 비교 목적을 위해 40X 대물 렌즈(스케일 바아, 20 ㎛)를 사용하여 이미징된다. 측정된 홀로그램 진폭, 회복된 홀로그램 위상, 재구성된 진폭 및 과립구(GRA), 림프구(LYM) 및 단구(MON)의 위상 이미지가 예시되어 있다. 또한, 도 12는 방법 1(반복적 트윈 이미지 제거) 및 방법 2(반복적 위상 회복)의 회복 결과들 사이의 비교를 예시한다. RBC는 40X 대물 렌즈 이미지의 적혈구를 지칭한다. 홀로그래픽 재구성이 수행되기 이전에 각 세포 홀로그램의 텍스쳐 서명은 과립구 대 림프구 같은 다른 세포 유형들 사이의 중요한 변동을 드러낼 수 있다. 또한, 이는 예를 들어, 건강한 혈구의 라이브러리에 대한 텍스쳐 비대칭성의 검출 및 감염된 RBC 홀로그램 택스쳐의 검사에 기초한 (말라리아 같은) 감염성 질환의 진단을 잠재적으로 가능하게 할 수 있는 디지털 정보의 중요한 원천이다.
본 명세서에 설명된 시스템(10, 50, 70)이 마이크로 대상물의 이미지를 생성하기에 특히 적합하지만, 본 발명의 다른 용도는 세포 같은 마이크로 대상물의 자동 계수이다. 시스템(10, 50, 70)은 전체 세포 수를 계수하거나 심지어 더 큰 개체군으로부터 아개체군을 계수할 수 있다. 세포 식별 알고리즘은 궁극적으로 적절히 계수된 이미지를 초래하는 일련의 선형 단계들에 의해 나타내어질 수 있다. 시작을 위해, 라플라시안-오브-가우시안(LoG; Laplacian-of-Gaussian)컨벌루션 필터가 전체 이미지에 적용될 수 있다. 이는 고밀도의 샘플 내의 임의의 부분적으로 중첩하는 세포를 식별하고 배경 잡음으로부터 세포 위치를 개선하는 중요한 조치이다. 또한, LoG 필터에 의해 조명 구배, 박막 간섭 패턴 또는 화소 잡음으로부터의 임의의 문제가 완화될 수 있다. 필터링이 완료되고 나서, 관련 지점은 임계치 작업에 의해 필터링된 이미지로부터 추출될 수 있고, 그에 의해, 특정값 미만의 모든 화소값이 흑색으로 설정되며, 잔여 화소는 백색으로 설정되어 이진 흑색 및 백색 이미지를 초래한다. 그러나, 이는 매우 근접한 근접도의 세포들 또는 세포들의 클러스터들이 이진화 과정에서 결합될 수 있는 문제를 도입한다. 이 문제를 해결하기 위해, 최소 중첩의 그 최소 중첩 지점에서 두 개의 연결된 대상물을 나누는 워터세드(watershed) 필터의 적용을 통해 분리가 달성된다. 이 스테이지에서, 시계 내의 두드러진 관련 지점을 성공적으로 식별한다. 그러나, 이런 지점은 타겟 세포 위치를 나타낼 가능성이 있으며, 오류 지점으로부터 유효 지점을 식별하기 위해 적절한 스크리닝 과정이 필요하다. 이 노력의 일환으로, LoG 도메인의 그 크기, 순환성, 신호대 잡음비 및 국지적 피크 값에 기초한 각 잠재적 세포 위치와, 마찬가지로, 회복된 위상 또는 측정된 진폭 도메인에서의 그 홀로그래픽 서명에 한 세트의 서술자(descriptor)들이 적용된다. 이들 파라미터에 기초한 수용가능한 기준의 범위 내에 있지 않은 임의의 지점이 유효 계수 대상물의 세트로부터 삭감된다. 삭감 과정의 마무리에 의해, 표시자들이 원래 이미지상에 인쇄되며, 계수된 세포에 대한 통계학적 정보가 필요시 추가 분석을 위해 XML 파일에 기록된다.
도 13a는 자동 홀로그래픽 계수를 세포의 검경 수동 계수의 정확도와 비교하는 그래프를 예시한다. 비응집성 세포 홀로그래피 방법의 자동 계수 정확성은 5,000 cells/μL 미만으로부터 40만 cells/μL까지의 범위의 다양한 RBC 밀도로 예시되어 있다. 원본 세포 홀로그램의 2D 텍스쳐를 사용하여, 5% 미만의 에러율을 갖는 정확한 세포 계수가 ~100,000 cells/μL의 밀도까지 달성될 수 있는 반면, 재구성된 세포 이미지는 ~400,000 cells/μL의 세포 밀도까지 5% 미만의 에러율을 산출한다.
또한, 도 13a의 삽입도는 상업적으로 가용한 혈액학 분석기(Coulter LH750, Beckman Coulter)에 대한 홀로그래픽 재구성에 기초하여 추정된 RBC 체적 히스토그램의 비교를 예시하며, 이는 보고된 결과들에 매우 양호한 정합을 보여준다. 도 13b는 고밀도 세포 용액에 대해서도 홀로그래픽 재구성 과정의 강도 및 정확도를 예시한다.
도 13a에 예시된 바와 같이, 다양한 샘플에 대하여 3.5 x 105 cells/μL을 초과하는 밀도의 샘플에 대한 5% 미만의 에러율이 나타났다. 또한, 알고리즘은 많은 양의 세포를 갖는 매우 큰 이미지를 양호하게 스케일링한다. 적절한 하드웨어 제원을 갖는 시스템(10, 50, 70)은 1분보다 매우 작은 시간 내에 수 메가 화소의 이미지 내의 수천 세포를 갖는 샘플을 성공적으로 계수할 수 있다. 예로서, ~5,000 세포를 갖는 1 메가 화소 이미지는 2.5 GHz 프로세서 상에서 3초 미만으로 계수될 수 있다.
비응집성 무렌즈 홀로그래피 시스템(10, 50, 70)은 세포 홀로그램 군중 내의 임의의 주어진 세포의 개별 홀로그램의 격리를 가능하게 한다. 이는 40만 cells/μL의 밀도의 3개 RBC에 대하여 도 14에 예시되어 있다. 상단 좌측 이미지는 세포 홀로그램들 모두가 중첩하는 원본 홀로그램 평면이다. 상단 우측 이미지는 재구성된 세포 이미지를 도시한다. 저부 이미지는 상단 우측 이미지의 원 내에 도시되어 있는 세 개의 선택된 RBC의 격리된 위상 및 진폭 홀로그래픽 서명을 예시한다. 특히, 이 특징은 말라리아 같은 잠재적 기생충의 서명을 나타내는 세포 홀로그램 텍스쳐 비대칭성에 기초한 고밀도 용액에서 진단 판정을 수행하기 위해 유용할 수 있다.
본 명세서에 설명된 발명이 "무렌즈" 이미징 플랫폼으로서 주로 설명되었지만, 렌즈를 포함하는 다양한 광학 구성요소들이 본 명세서에 설명된 시스템 및 방법에 조합되거나 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예로서, 본 명세서에 설명된 장치는 비이미징 목적을 위해 작은 렌즈 어레이(예를 들어, 마이크로렌즈 어레이)를 사용할 수 있다. 일 예로서, 렌즈 어레이는 센서 어레이를 위한 집광 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이런 광학적 구성요소는 샘플을 이미징하고 이에 관한 유용한 결과 및 데이터를 제공하기에 필수적이지는 않지만 본 발명의 범주 내에서 여전히 사용되고 포함될 수 있다.
본 발명의 실시예를 도시 및 설명하였지만, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 변형들이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 이하의 청구범위 및 그 균등물을 제외하고는 제한되지 않아야 한다.

Claims (47)

  1. 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템이며,
    세포학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더와,
    샘플 홀더의 제1 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z1에 배치된 공간적 필터로서, 조명을 통과시킬 수 있도록 구성된 개구가 내부에 배치되어 있는 공간적 필터와,
    샘플 홀더의 제2 대향 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z2에 배치된 이미징 센서 어레이와,
    개구를 통해 세포학적 샘플을 조명하도록 구성된 조명원을 포함하고,
    공간적 필터는 조명원과 샘플 홀더 사이에 개재되는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 이미징 센서 어레이로부터 이미지 프레임을 수신하도록 구성된 적어도 하나의 프로세서를 더 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 이미지 프레임에 포함된 홀로그램 진폭을 정량화하도록 구성되는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 이미지 프레임 내에 포함된 위상 정보를 회복하도록 구성되는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 적어도 부분적으로 홀로그램 진폭 및 회복된 위상 정보에 기초하여 재구성된 이미지를 출력하도록 구성되는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 원격 배치되는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  7. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 로컬 프로세서인 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  8. 제1항에 있어서, z2<<z1인 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  9. 제1항에 있어서, z1은 약 1 cm 내지 약 10 cm의 범위 이내이고, z2는 약 0.05 mm 내지 약 2 mm의 범위 이내인 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  10. 제9항에 있어서, z1은 약 5 cm 내지 약 10 cm의 범위 이내이고, z2는 약 1 mm 내지 약 2 mm의 범위 이내인 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 공간적 필터의 개구는 약 50 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 범위 이내인 직경을 갖는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 조명원은 적어도 부분적으로 비응집성 광원을 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 조명원은 적어도 하나의 발광 다이오드(LED)를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  14. 제1항에 있어서, 이미징 센서 어레이는 CCD 또는 CMOS 장치를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 이미징 센서 어레이는 9 ㎛ 화소 크기보다 작은 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  16. 제1항에 있어서, 샘플 홀더는 광학적 투명 기판을 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  17. 제1항에 있어서, 샘플 홀더는 마이크로유체 장치를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  18. 제1항에 있어서, 공간적 필터와 샘플 홀더 사이에 개재된 프리즘과,
    프리즘을 통해 세포학적 샘플을 조명하도록 구성된 형광 조명원을 더 포함하고,
    입사 형광 조명의 실질적 모두가 내부 전반사(TIR)를 통해 반사되는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 샘플 홀더와 이미징 센서 어레이 사이에 개재된 광학 필터를 더 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  20. 제18항에 있어서, 프리즘은 마름모꼴 프리즘을 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  21. 제19항에 있어서, 프리즘과 광학 필터 사이에 개재된 복수의 파이버 광섬유를 포함하는 광학-면판을 더 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하기 위한 시스템.
  22. 세포학적 샘플을 이미징하는 방법이며,
    세포학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더의 전방 측부를 적어도 부분적 비응집성 광을 방출하는 조명원으로 조명하는 단계로서, 적어도 부분적 비응집성 광은 세포학적 샘플을 조명하기 이전에 개구를 통과하는, 조명 단계와,
    샘플 홀더의 후방 측부 상에 배치된 이미징 센서 어레이로부터 하나 이상의 이미징 프레임을 획득하는 단계를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 개구는 샘플 홀더로부터 거리 z1에 배치되며, 이미징 센서 어레이는 샘플 홀더의 대향 측부로부터 거리 z2에 배치되는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, z2<<z1인 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 하나 이상의 이미지 프레임은 이미지 프레임에 포함된 홀로그램 진폭을 정량화하기 위해 적어도 하나의 프로세서에 의해 처리되는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 이미지 프레임 내에 포함된 위상 정보를 회복하도록 추가로 구성되는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 적어도 부분적으로 홀로그램 진폭 및 회복된 위상 정보에 기초하여 재구성된 이미지를 출력하도록 구성되는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 하나 이상의 이미지 프레임은 적어도 하나의 원격 배치된 프로세서로 전송되는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  29. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 로컬 프로세서인 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  30. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 프로세서는 하나 이상의 이미지 프레임을 라이브러리와 비교하고, 적어도 부분적으로 상기 비교에 기초하여, 샘플 내에 포함된 하나 이상의 세포, 세포기관 및 입자를 식별하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 식별은 질병 상태를 식별하는 것을 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 식별은 세포 유형을 식별하는 것을 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  33. 제30항에 있어서, 식별은 세포 계수치를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포 계수치는 전체 세포 계수치를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 세포 계수치는 특정 유형의 세포의 개체군의 세포 계수치를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  36. 제24항에 있어서, 형광 여기 조명으로 세포학적 샘플을 조명하는 단계를 더 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 세포 여기 조명은 세포학적 샘플을 각지게 조명하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 이미징 센서 어레이로부터 얻어진 하나 이상의 이미지는 방출된 형광 방사선의 이미지를 포함하는 세포학적 샘플을 이미징하는 방법.
  39. 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템이며,
    세포학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 홀더를 가지는 이동 통신 장치로서, 소지 휴대성을 위해 치수설정된 이동 통신 장치와,
    샘플 홀더의 제1 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z1에 배치된 공간적 필터로서, 조명의 통과를 가능하게 하도록 구성된 개구가 내부에 배치되어 있는 공간적 필터와,
    이동 통신 장치 내에 위치되고, 샘플 홀더의 제2 대향 측부 상에서 샘플 홀더로부터 거리 z2에 배치된 이미징 센서 어레이와,
    개구를 통해 세포학적 샘플을 조명하도록 구성된 조명원을 포함하고,
    공간적 필터는 조명원과 샘플 홀더 사이에 개재되는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 이동 통신 장치는 데이터의 무선 전송을 위해 구성되는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  41. 제39항에 있어서, 이동 통신 장치는 이동 전화 또는 개인 휴대용 정보 단말기를 포함하는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  42. 제39항에 있어서, 공간적 필터와 조명원은 이동 통신 장치로부터 제거될 수 있도록 구성된 하우징에 수용되는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  43. 제39항에 있어서, 샘플 홀더는 샘플을 직접적으로 수용하도록 구성된 표면을 포함하는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  44. 제39항에 있어서, 샘플 홀더는 이동 통신 장치에 삽입되도록 구성된 기판 또는 마이크로유체 장치를 포함하는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  45. 제39항에 있어서, 이동 통신 장치는 이미징 센서 어레이로부터의 이미지를 처리하도록 구성되는 적어도 하나의 프로세서를 포함하는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  46. 제39항에 있어서, z1은 약 1 cm 내지 약 10 cm의 범위 이내이고, z2는 약 0.05 mm 내지 약 2 cm의 범위 이내인 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
  47. 제39항에 있어서, 적어도 하나의 렌즈를 더 포함하는 세포학적 샘플의 이미징을 위한 휴대형 시스템.
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