JP2022512732A - 流体サンプル中の運動性オブジェクトの運動性ベースのラベルフリー検出のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

特定のバイオマーカーおよび内因性コントラストメカニズムとして寄生虫の移動を利用することにより、流体サンプル中の運動性オブジェクト（例えば、寄生虫）を検出するためのシステムおよび方法である。画像化プラットフォームは、１つまたは複数の実質的に光学的に透明なサンプルホルダを含む。画像化プラットフォームは、光源と、光源に関連付けられた対応するイメージセンサを含む可動の走査ヘッドを含む。光源は、サンプルを含むそれぞれのサンプルホルダに向けられ、各イメージセンサは各サンプルホルダの下に配置されて、サンプルホルダに含まれるサンプルの時変ホログラフィックスペックルパターンをキャプチャする。コンピューティングデバイスは、イメージセンサによって取得された時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを受信するように構成される。コンピューティングデバイスは、サンプル内の運動性オブジェクトの３Ｄコントラストマップを生成し、深層学習ベースの分類ソフトウェアを使用して運動性オブジェクトを識別する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
［０００１］この出願は、２０１８年１０月１８日に出願された米国暫定特許出願番号６２／７４７，２８５の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９およびその他の該当する法令に従って優先権が主張される。

技術分野
［０００２］技術分野は一般に、体液中の動く物体を検出するために使用される装置および方法に関する。１つの特定の実施形態は、体液中の寄生虫を検出およびカウントすることを含む。このデバイスと方法は、ホログラフィックスペックル分析と深層学習を利用して、体液中の寄生虫などの移動物体を検出する。

［０００３］寄生虫感染症は世界中の何十億もの人々に影響を及ぼし、多大な社会経済的負担をもたらすものである。通常、低所得国で問題となっているが、寄生虫感染症は先進国でも健康上の懸念になりつつある。米国だけでも、何百万人もの人々が様々な寄生虫の影響を受けており、深刻な病気や死に至る場合がある。運動性（Motility）は、単細胞の病原性細菌や寄生原虫から多細胞の寄生虫や外部寄生虫まで、病気の原因となる生物に共通している。運動性とは、細胞または生物が独自のエネルギーを使用して独自に動く能力である。ある場所から別の場所に移動する生物の能力は、感染と伝染を成功させるための明らかな利点があり、運動性はしばしば病原性の中核となる。寄生虫のライフスタイルにおける運動性の重要性にも拘わらず、寄生虫の運動性は十分に研究されていない領域であり、運動性に基づく診断は大きく未発展である。

［０００４］睡眠病としても知られるヒトアフリカトリパノソーマ症（ＨＡＴ）、およびシャーガス病（すなわち、アメリカトリパノソーマ症）は、運動性原生寄生虫によって引き起こされる「顧みられない熱帯病（ＮＴＤ）」の例である。ＮＴＤとして、これまであまり注目されておらず、世界で最貧層の人々に偏って影響を及ぼし、診断と治療のための適切な医学的介入が不足している。ワクチンはなく、既存の化学療法剤は高い毒性と薬剤耐性を持っている。これらの２つの壊滅的な病気、ＨＡＴとシャーガス病は、関連するトリパノソーマ寄生虫によって引き起こされる。ブルーストリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｇａｍｂｉｅｎｓｅおよびＴ．ｂｒｕｃｅｉ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ亜種）はＨＡＴの原因であり、近縁種は動物の病気を引き起こし、世界の最貧地域でかなりの経済的負担をもたらす。この寄生虫はツェツェバエによって人間に感染し、血液や組織の細胞外で生き延び、中枢神経系（ＣＮＳ）に劇的な影響を与える。ＨＡＴは、サハラ以南のアフリカの約３０か国で流行しており、感染のリスクがあるのは約６，５００万人である。報告された症例数は過去最低にまで減少しているが、過去には症例数の減少の後に大流行が発生している。したがって、ＨＡＴは依然として重要な人間の健康リスクである。一方、シャーガス病は、クルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）によって引き起こされる。クルーズトリパノソーマは、宿主細胞内に侵入して複製し、宿主組織内に重篤な病状を引き起こす。シャーガス病は主にオオサシガメの咬傷によって感染するが、他の感染経路には輸血や汚染された食料や飲料の摂取が含まれる。この病気はラテンアメリカの風土病であり、６００万人以上が罹患している。米国では３０万人以上が感染していると推定されており、グローバリゼーションと気候変動が病気を媒介する媒介生物の分布に影響を与えるため、さらに増加すると予想される。

［０００５］両方のトリパノソーマ症は、トリパノソーマが血流を循環し、治療が最も効果的である初期段階（Ｉ期ＨＡＴおよび急性シャーガス病）と、治癒が不可能ではないにしても非常に困難な後期段階（ＩＩ期ＨＡＴおよび慢性シャーガス病）に分類される。したがって、早期発見は両方の病気にとって非常に重要である。しかしながら、特にリソースが限られている場合は、迅速で高感度の診断が依然として困難である。ＨＡＴの診断では、適切な治療戦略を決定するために、病気の段階を評価することも不可欠である。Ｉ期ＨＡＴではトリパノソーマが血液とリンパ液に留まっているのに対し、ＩＩ期ＨＡＴでは、トリパノソーマが血液脳関門を通過して中枢神経系（ＣＮＳ）に侵入し、神経症状を引き起こし、治療しないと最終的に死に至ることが特徴である。Ｉ期とＩＩ期のＨＡＴの治療に使用される薬剤は互換性がなく、ＩＩ期の薬剤は毒性が高いことがあるため、治療レジメンの選択のために疾患の病期を特定することが非常に重要である。病期の判定は現在、腰椎穿刺によって脳脊髄液（ＣＳＦ）を収集し、白血球（ＷＢＣ）とトリパノソーマの存在について顕微鏡下でＣＳＦを検査することによって行われている。

［０００６］両方のトリパノソーマ種は、通常、長さが約２０μｍ、幅が約３μｍであり、寄生虫の推進力にべん毛を介した運動性を使用する。血液やＣＳＦなどの大量の体液中のこれらの運動性寄生虫の検出は重要な臨床的課題である。何十年もの間、Ｔ．Ｂ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅＨＡＴの標準的なスクリーニングテストは、特定の寄生虫抗原に対する抗体の存在を検出するトリパノソーマ症のカード凝集テスト（ＣＡＴＴ）であった。しかしながら、ＣＡＴＴには、一部の領域での低い特異性や感度が低いなど、実際的な制限がある。さらに、ＣＡＴＴ検査がポジティブの場合、通常、血液サンプルを直接目視で確認する必要がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や迅速診断検査（ＲＤＴ）など、いくつかの分子的および免疫学的検出方法が開発されているが、これらの方法は、特異性または感度が不十分、高度な機器と高度な訓練を受けた要員が必要、または製造コストが高いなどの制限がある。そのため、依然として一次または二次診断に顕微鏡評価が広く使用されており、ＨＡＴのステージ判定にはＣＳＦの直接観察が依然として唯一の方法となっている。全血１ミリリットルには、通常、数十億の赤血球（ＲＢＣ）、数百万の白血球（ＷＢＣ）、および数億の血小板が含まれている。対照的に、血液中の寄生虫量は感染の過程で変動し、１００個／ｍＬ未満となることも多いため、トリパノソーマの顕微鏡による同定は針の穴を通すような問題となる。また、直接観察法では感度が低いため、遠心分離やイオン交換精製などの分析分離装置が必要であり、リソースが限られた環境での分析が部分的に制限されてしまう。したがって、コストを削減し、診断を簡素化するために、高感度でスループットの高い新しい方法の開発に対する大きなニーズが依然としてある。

［０００７］この重要な課題に対処するために、本発明は、例えば体液中の寄生虫を検出する際に利用可能な、サンプル中の運動性オブジェクトを検出するためのシステムおよび方法に関する。本システムおよび方法は、様々な体液および濁った媒体中の運動性寄生虫をラベルフリーで高スループットかつ高感度に検出するために、レンズレスの時間分解ホログラフィックスペックルイメージングに基づいた、コスト効率が高く現場で持ち運び可能な光学デバイスを利用する。この技術では、対象となる分析物を染色したり、分子バイオマーカーを使用するのではなく、自己推進する寄生虫（または他の運動性微生物や細胞）の運動を、バイオマーカーおよび内因性のコントラストメカニズムとして利用する。その結果、サンプルの前処理は非常にシンプルかつ迅速となり、ベンチトップスケールのサンプル処理装置／機器を必要とせず、冷蔵、遠心、精製も必要なくなる。

［０００８］したがって、本発明の一実施形態は、サンプル中の運動性オブジェクトのラベルフリー検出のための画像化プラットフォームに関する。例えば、運動性オブジェクトは、寄生虫などの生物または他の適切な運動性オブジェクトであり得る。画像化プラットフォームは、キャピラリーチューブまたは他の適切なサンプルホルダなどの１つまたは複数の実質的に光学的に透明なサンプルホルダを含む。画像化プラットフォームはまた、１つまたは複数のコヒーレント光源と、当該１つまたは複数のコヒーレント光源に関連付けられた対応するイメージセンサとを含む可動の走査ヘッドを有する。例えば、走査ヘッドは、単一のコヒーレント光源（例えば、レーザダイオード）および単一のイメージセンサ（例えば、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ））のみであり得るか、または走査ヘッドは、コヒーレント光源および各サンプルホルダに１つのイメージセンサを有してもよい。コヒーレント光源は、それぞれのサンプルホルダに向けられ、それぞれのイメージセンサは、それぞれのサンプルホルダの下に配置されて、サンプルホルダに含まれるサンプルの画像シーケンスを取得する。一例として、イメージセンサは、サンプルホルダに含まれるサンプルの時変ホログラフィックスペックルパターン（例えば、「動画」）を記録することができる。

［０００９］画像化プラットフォームは、イメージセンサによって取得された時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを受信するように構成されたコンピューティングデバイスを有する。このコンピューティングデバイスは、１つまたは複数のサンプルホルダ内の運動性オブジェクトの三次元（３Ｄ）コントラストマップを生成するように構成された計算機運動分析ソフトウェアを有する。コンピューティングデバイスは、三次元（３Ｄ）コントラストマップ内の運動性オブジェクトを識別するための深層学習ベースの分類ソフトウェアも有する。

［００１０］別の態様では、画像化プラットフォームはまた、１つまたは複数のサンプルホルダに沿って可動走査ヘッドを並進させるように構成された並進ステージを含み得る。例えば、並進ステージは、走査ヘッドを１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダに沿って直線的に移動させて、走査ヘッドがサンプルホルダの異なる複数のセクション、例えばサンプルホルダの長さに沿った異なるセクションで画像シーケンスを取得できるように構成され得る。

［００１１］画像化プラットフォームの別の態様では、サンプルは、血液などの生物学的流体を含む。さらに別の態様では、生物学的流体は、血液または脳脊髄液を含む。

［００１２］さらに別の態様では、サンプルホルダは、１つまたは複数のキャピラリーチューブである。例えば、キャピラリーチューブは、細長い長方形の管（すなわち、長方形の断面を有する）であり得る。

［００１３］画像化プラットフォームの別の態様では、１つまたは複数のコヒーレント光源は、１つ以上のサンプルホルダに光を投射するレーザダイオード、発光ダイオード、および／またはレーザ、または前述の任意の組み合わせであり得る。

［００１４］さらに別の態様では、並進ステージは、可動走査ヘッドを保持する１つまたは複数の線形運動シャフトと、ベルトを介して可動走査ヘッドに結合されたステッピングモータとを含み得る。並進ステージは、走査ヘッドを動かして、サンプルホルダの異なる領域または範囲に沿って時変ホログラフィックスペックルパターンをキャプチャするように構成することができる。

［００１５］画像化プラットフォームの別の構成において、可動走査ヘッドは、イメージセンサのための１つまたは複数のヒートシンクをさらに含み得る。例えば、ヒートシンクは、イメージセンサに機能的に接続された回路基板で生成された熱を放散するように配置され得る。ヒートシンクは、カスタマイズされた金属（例えば、アルミニウム）要素とすることができ、回路基板と各イメージセンサとの間に配置されて、過熱によるイメージセンサの損傷または誤動作を防止し得る。

［００１６］別の態様では、計算機運動分析ソフトウェアは、オブジェクト関数正規化（ＯＦＮ）を実行して、サンプル内の強く散乱するオブジェクトを抑制するように構成される。

［００１７］本発明の別の実施形態は、例えば、流体サンプル中の運動性オブジェクトを検出するために、画像化プラットフォームを使用する方法に関する。この方法は、流体サンプルを１つまたは複数の実質的に光学的に透明なサンプルホルダに装填するステップを含む。可動の走査ヘッドが、１つまたは複数のサンプルホルダの様々な領域に移動される。イメージセンサは、流体サンプルの時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを取得する。次に、コンピューティングデバイスが、深層学習ベースの分類ソフトウェアを使用して、サンプル内の１つ以上の運動性オブジェクトを識別する。

［００１８］この方法の別の態様では、コンピューティングデバイスは、計算機運動分析ソフトウェアを使用して画像シーケンス内の運動性オブジェクトの三次元（３Ｄ）コントラストマップを生成し、次に深層学習ベースの分類ソフトウェアを使用して、運動性オブジェクトの三次元（３Ｄ）コントラストマップ内で運動性オブジェクトを識別することによって、画像シーケンス内の運動性オブジェクトを識別する。

［００１９］画像化プラットフォームを使用する方法の別の態様では、流体サンプルをサンプルホルダに装填する前に、流体サンプルを最初に溶解緩衝液に曝露する。

［００２０］この方法のさらに別の態様では、可動走査ヘッドおよびイメージセンサを並進させる前に流体サンプルを沈降させてから、流体サンプルの時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを取得する。

［００２１］この方法のさらに別の態様では、深層学習ベースの分類ソフトウェアは、サンプル内の運動性オブジェクトの数を特定および／または出力する。さらに別の態様では、深層学習ベースの分類ソフトウェアは、サンプル内の運動性オブジェクトの濃度を特定および／または出力する。

［００２２］この方法の別の態様では、深層学習ベースの分類ソフトウェアは、サンプルのポジティブまたはネガティブの分類を出力する。これは、サンプル内の運動性オブジェクトのカウントおよび／または濃度の取得とは別に、またはそれに加えて行うことができる。例えば、深層学習ベースの分類ソフトウェアを使用して、サンプル内の運動性種の数をカウントし、それを使用して、サンプル（所与の既知の量のサンプル）内の運動性オブジェクトの濃度を計算し、運動性オブジェクトの数または濃度に基づいて、特定のサンプルをターゲットの運動性オブジェクトのポジティブ（＋）またはネガティブ（－）に分類する。例えば、しきい値カットオフ値を使用して、ポジティブのサンプルとネガティブのサンプルを区別することができる。

［００２３］この方法の別の態様では、サンプルは生物学的サンプルを含む。さらに別の態様では、サンプルは環境サンプルを含む。別の態様では、運動性オブジェクトは寄生虫を含む。

［００２４］本発明の別の実施形態は、サンプル中の運動性オブジェクトを検出する方法に関する。この方法は、１つまたは複数のコヒーレント光源および当該１つまたは複数のコヒーレント光源に関連付けられた対応するイメージセンサを含む可動走査ヘッドを使用して、サンプルの複数の時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを取得するステップを含む。複数の時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスは、イメージセンサによって取得された時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを受信するように構成されたコンピューティングデバイスで処理される。コンピューティングデバイスは、１つまたは複数のサンプルホルダ内の運動性オブジェクトの三次元（３Ｄ）コントラストマップを生成するように構成された計算モーション分析ソフトウェアと、三次元（３Ｄ）コントラストマップの運動性オブジェクトを識別する深層学習ベースの分類ソフトウェアとを有する。

［００２５］別の態様では、この方法は、コンピューティングデバイスが計算機運動分析ソフトウェアを使用して、１つまたは複数のサンプルホルダ内の運動性オブジェクトの三次元（３Ｄ）コントラストマップを生成するステップをさらに含む。次に、コンピューティングデバイスが、深層学習ベースの分類ソフトウェアを使用して、三次元（３Ｄ）コントラストマップ内の運動性オブジェクトを識別する。

［００２６］別の態様では、この方法は、コンピューティングデバイスが運動性オブジェクトのカウントを特定および／または出力するステップも含む。さらに別の態様では、この方法は、コンピューティングデバイスがサンプル内の運動性オブジェクトの濃度を特定および／または出力するステップを含む。

［００２７］画像化プラットフォームの一例では、スクリーニングされる流体サンプルは、コヒーレント光源（例えば、レーザダイオード）によって照射され、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサがサンプルの下に配置されて、サンプルの時変ホログラフィックスペックルパターン（例えば「動画」）を記録する。時変ホログラフィックスペックルパターンは、分析されるサンプルを含む三次元ボリュームの異なる領域に移動する走査ヘッドを使用して取得することができる。走査ヘッドは、複数のサンプルを並行して（または単一のサンプルを複数のテストボリュームに分割して）画像化することができる複数の光源およびイメージセンサを含んでもよい。もちろん、他の実施形態では、単一の光源とイメージセンサのみを使用してもよい。

［００２８］次に、イメージセンサによって取得された画像シーケンスは、ホログラフィーに基づくカスタムメイドの計算機運動分析（ＣＭＡ）アルゴリズムによって分析され、サンプルボリューム内の寄生虫の運動に固有の三次元（３Ｄ）コントラストマップが生成される。最後に、深層学習ベースの分類器を使用して、再構成された３Ｄ運動マップを使用して、寄生虫（または他の運動種）の信号パターンを自動的に検出しカウントする（図３Ａ～３Ｍを参照）。

［００２９］本発明による例示的な画像化プラットフォームは、スループットを増加させ、大量の流体（約３．２ｍＬ以上）の迅速なスクリーニングのための検出限界（ＬｏＤ）を低減するように構築および構成された。この例では、画像化プラットフォームには、並進ステージに取り付けられた３つの同一のレンズレススペックルイ画像化モジュールが含まれており、３つの個別のサンプルチューブを並行してスクリーニングする。各画像化モジュールは、液体サンプルを含んでいるキャピラリーチューブの様々なセクションへと並進され、ここでＣＭＯＳイメージセンサが高フレームレートの映像シーケンスをキャプチャしてから、次のセクションに進む。このアプローチを使用すると、例示的な画像化プラットフォームを使用して、約３．２ｍＬ以上の流体サンプルを、すべて約２０分以内に準備、スクリーニング、および分析することができる。標準的なベンチトップ光学顕微鏡と比較して、この画像化プラットフォームの設計では、スクリーニングされるサンプル量が桁違いに増加する（これは低濃度の寄生虫の検出にとって非常に重要である）。さらに、画像化プラットフォームは、大幅にコンパクトで軽量となり得る（例えば、重量約１．６９ｋｇ以下）。さらに、比較的大量のサンプルが軸方向に計算でスクリーニングされるため、画像化デバイスはオプトメカニカル設計で高精度を必要とせず、プラットフォームの費用対効果も高く、部品のコストは非常に少量の製造でも合計約１，８５０ドル以下になり得る。

［００３０］例示的な画像化プラットフォームは、モバイルプラットフォームをテストするためにトリパノソーマを使用してテストされ、ＨＡＴの診断とステージ判定、および急性シャーガス病の診断に重要な、添加された全血およびＣＳＦサンプル中の寄生虫を検出する能力を示した。添加実験を、Ｔ．ｂ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．Ｂ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、ｔ．ｃｒｕｚｉのモデル寄生虫としてＴ．ｂｒｕｃｅｉ（トリパノソーマの非ヒト感染性亜種）を使用して一連の濃度で実施した。深層学習ベースの分類により、画像化プラットフォームを使用して、全血１ｍＬあたり１０個の寄生虫とＣＳＦ１ｍＬあたり３個の寄生虫を確実に検出できることが示された。さらに、米国で３７０万人、世界で２億７５００万人が罹患している最も一般的な非ウイルス性性感染症（ＳＴＤ）であるトリコモナス症の原因となる原生動物の寄生虫である膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を画像化することにより、体液中の他の運動性寄生虫を検出するプラットフォームの成功が実証された。このように、運動性を利用したラベルフリーの寄生虫検出プラットフォームは、リソースが限られた環境でトリパノソームなどの運動性寄生虫を迅速かつ高感度にスクリーニングするための費用対効果の高いポータブルなアプローチを提供することができ、また、運動性生物を３Ｄで研究するための高スループット分析研究ツールとしても利用することができる。本書に記載の例示的な画像化プラットフォームは、寄生虫を検出するために使用しているが、このプラットフォームは寄生虫ではない他の運動性種の検出に使用され得ることを理解されたい。例えば、これには精子やその他の運動性のある多細胞または単一細胞種が含まれる。

［００３１］前述および他の実施形態の態様が、添付の図面を参照してさらに詳細に説明され、ここで同じ参照番号は同じ要素を指し、同じ要素の説明は、関連する場合はいつでも、説明されたすべての実施形態に適用され得る。同じ番号で異なる文字を有する参照番号（例えば、ｌ０４ａ、ｌ０４ｂ、ｌ０４ｃ）は、同様の要素を指し、詳細な説明における文字のない番号の使用は、それぞれの同様の要素を指す。
図１Ａは、本発明の一実施形態による、サンプル中の運動性オブジェクトを検出するための画像化プラットフォームの概略図である。このデバイスは、レンズレスホログラフィック時間分解スペックルイメージングに基づいている。寸法は説明のためのみであり、図１Ａに具体的に示されているものを超えて変化してもよい。図示のデバイスは、約２０分以内に約３．２ｍＬの体液サンプルをスクリーニングおよび分析する高スループット体液スクリーニングデバイスである。 図１Ｂは、図１Ａの概略図に従って作製された画像化プラットフォームの例示的な実施形態の写真である。図１Ｂの画像化プラットフォームは、取得されたデータの処理にも使用されるコンピューティングデバイス（例えば、ラップトップ）によって制御される。 図１Ｃは、図１Ａ～１Ｂの画像化プラットフォーム用のプリント回路基板の電子概略図であり、選択された電子部品およびコンピューティングデバイス（例えば、ラップトップコンピュータ）とのインターフェースを示す。 図２は、本発明の一実施形態による、図１Ａの画像化プラットフォームを使用して全血および脳脊髄液（ＣＳＦ）をテストするために使用されるサンプル調製および画像化プロセスの図である。 図３Ａ～３Ｍは、本発明の一実施形態による、溶解血液中のトリパノソーマの高感度でラベルフリーの検出のための、深層学習ベースの識別と組み合わされたＯＦＮを用いたＣＭＡアルゴリズムを示す。これらのステップは、リスト通りの順序（ステップａ～ｋ）で実行され、オプションのステップ（１）および（ｍ）がある。 図４Ａ～４Ｅは、本発明の一実施形態による、約１４．７ｍｍ^２の視野（ＦＯＶ）にわたって運動性トリパノソーマ寄生虫を添加した溶解血液サンプルにＣＭＡアルゴリズムおよびＯＦＮを適用した実験的実証結果を示す画像である。図４Ａは、本発明の一実施形態による、図１Ａに示すイメージセンサまたは画像化プラットフォームによってキャプチャされたサンプルの回折またはスペックルパターンの時系列である。図４Ａ～４Ｃは、イメージセンサによってキャプチャされた、溶解され、トリパノソーマが添加された全血サンプルの生のスペックルパターンを示している。図４Ｂおよび４Ｃは、生の画像シーケンス内のフレームの１つの拡大図を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、本発明の一実施形態による、ＣＭＡアルゴリズムによって処理された後に検出された運動性寄生虫を示す。図４Ｅは、本発明の一実施形態による、逆伝播回折パターンの振幅および位相チャネルの焦点の合った動画を作成するために利用可能なホットスポットの計算された３Ｄ位置の例を示す。 図５Ａ～５Ｄは、溶解された全血および人工ＣＳＦサンプル中のトリパノソーマを検出するために構築および試験された例示的な画像化プラットフォームのＬｏＤの定量化を示すグラフである。図５Ａは、溶解した全血中のトリパノソーマ検出の検量線（対数目盛）である。破線は期待値を示す（ｙ＝ｘ）。測定値は、データポイントを示すドットで示す。エラーバーは、データポイントを示すドットで示す３つの独立した測定値の標準偏差を示す。図５Ｂは、図５Ａの拡大図であり、ネガティブ対照（トリパノソーマなし）を含む低濃度測定（線形スケール）を示す。３つのネガティブ対照サンプルではフォルスポジティブは見つからなかった。図５Ｃおよび５Ｄは、図５Ａおよび５Ｂと同様に、人工ＣＳＦにおけるトリパノソーマ検出の検量線である。図５Ｄの破線は、ネガティブ対照結果の平均＋３×ＳＤに対応する。 図６Ａおよび６Ｂは、例示的な画像化プラットフォームを使用して、ＷＢＣを添加された人工ＣＳＦ内のトリパノソーマの画像化結果を示す画像である。図６Ａは、画像シーケンスにおける生のホログラムの１つである。図６Ｂは、ＯＦＮを用いたＣＭＡアルゴリズムによって処理される画像の例である。図６Ｂは、５つの信号スポットを示している。 図７Ａおよび７Ｂは、例示的な画像化プラットフォームを使用したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内の膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の画像化結果を示す画像である。図７Ａは、画像シーケンスにおける生のホログラムの１つである。図７Ｂは、ＣＭＡアルゴリズムで処理された画像の例である。トリコモナスは強い光学位相を有するため、ここではＯＦＮは適用されない。図７Ｂは、３つの信号スポットを示している。 図８Ａおよび８Ｂは、例示的な画像化プラットフォームを使用した、培養培地内の膣トリコモナスの画像化結果を示す画像である。図８Ａは、画像シーケンスにおける生のホログラムの１つである。図８Ｂは、ＯＦＮなしでＣＭＡアルゴリズムで処理された画像の例である。図８Ｂは、３つの信号スポットを示している。 図９Ａ～９Ｄは、差分分析のための減算フレーム間隔δ_Ｆおよび合計分析フレームＮ_Ｆの最適化を示すグラフである。信号対雑音比（ＳＮＲ）を、最適化の基準として使用している。図９Ａおよび９Ｂは、溶解血液中のトリパノソーマ検出の最適化を示し、ここでδ_Ｆ＝４およびＮ_Ｆ＝６１であり、３５．２９ｄＢの最適なＳＮＲをもたらす。図９Ｃおよび９Ｄは、ＣＳＦでのトリパノソーマ検出の最適化を示している。ここでδ_Ｆ＝４およびＮ_Ｆ＝４１であり、４５．００ｄＢの最適なＳＮＲをもたらす。 図１０Ａ～１０Ｃは、イメージセンサによって加熱された後の対流によるガラス管内の速度場のシミュレーションを示している。図１０Ａは、高さ１ｍｍのガラス管が７秒間加熱された後の速度の大きさの分布を示す図である（側面図）。ガラス管の中央の断面が図示されている。図１０Ｂは、加熱されている時間の関数としての、ガラス管内の最大流体速度の大きさを示すグラフである。異なる曲線は、ガラス管の異なる内部高さに対応する。図１０Ｃは、チャネル高さの関数として７秒間加熱された後の最大流体速度の大きさを示すグラフである。 図１１Ａ～１１Ｆは、溶解した血液中に現れる、粒子の強い散乱による潜在的な「フォルスポジティブ」をＯＦＮがどのように抑制するかを示す画像である。ＴＰは、トリパノソーマに対応する「トゥルーポジティブ」スポットを示す。ＦＰは「フォルスポジティブ」を示す。ネガティブ対照サンプル図１１Ｃにおけるフォルスポジティブは、ＯＦＮを適用した後に図１１Ｄに示すように抑制され、一方でトゥルーポジティブシグナルは維持される（図１１Ａおよび１１Ｂの「ＴＰ」）。ポジティブサンプルでは、気泡（図１１Ａの左下の「ＦＰ」）のために強いフォルスポジティブが生成され、そのホログラムおよび逆伝播された振幅画像が図１１Ｅおよび図１１Ｆにそれぞれ示されている。図１１Ｂに示すように、強いフォルスポジティブは、ＯＦＮによって効果的に排除されている。 図１２Ａ～１２Ｄは、人工ＣＳＦで実証された、強く散乱する粒子による潜在的な「フォルスポジティブ」をＯＦＮがどのように抑制するかを示す画像である。ＴＰは、トリパノソーマに対応する「トゥルーポジティブ」スポットを示す。ＦＰは「フォルスポジティブ」を示す。図１２Ｃに示すネガティブ対照サンプルにおいて明らかである添加されたＷＢＣによるフォルスポジティブは、図１２Ｄに示すように、ＯＦＮを適用した後に抑制され、一方でトゥルーポジティブは、図１２Ａおよび図１２Ｂに示すポジティブサンプルに維持されている。 図１３は、トリパノソーマによって生成された信号を自動的に検出するための畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）の構造を示す図である。図１３において、Ｃはチャネルの数、Ｋは畳み込みフィルタのサイズ、Ｓはストライド、Ｐはドロップアウトの確率である。 図１４は、様々な既存の検出方法を今般開示した方法と比較した表である。 図１５は、図１Ａ～１Ｃの画像化プラットフォームと共に使用するための例示的なニューラルネットワークの概略図である。

［００４９］本発明は、サンプル中の運動性オブジェクト２００のラベルフリー検出のための画像化プラットフォームに関する。（図２を参照）。図１Ａ～１Ｃは、本発明の一実施形態による、サンプル１０１のレンズレスホログラフィック時間分解スペックルイメージングを実行するための画像化プラットフォーム１００を示す。画像化プラットフォーム１００は、５つの主要モジュールから構成される：（１）１つまたは複数のレンズレスホログラフィックスペックルイメージャ１０４を有する走査ヘッド１０２（図１Ａおよび１Ｂに示され、本書で説明される画像化プラットフォーム１００の図示された実施形態は、３つのイメージャｌ０４ａ、ｌ０４ｂ、ｌ０４ｃを有する）；（２）並進ステージ１０６；（３）画像化プラットフォーム１００のコンポーネントを保持するメインハウジング１０８；（４）画像化プラットフォーム１００の様々な機能を制御および自動化するように構成された電子回路１１０；（５）グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）１１５を提供する制御プログラム１１４を有するコンピューティングデバイス１１２である。ＧＵＩ１１５は、画像取得パラメータのカスタマイズ、回折パターンのライブビューの実行、スナップショットの取得、結果の照会、サンプル追跡、レポート生成および出力、撮像停止などの他の様々な機能に加えて、ユーザが現在のサンプルのスクリーニングを開始できるように構成される。

［００５０］走査ヘッド１０２は、走査ヘッドハウジング１９０（例えば、３Ｄ印刷されたプラスチック、成形プラスチック、成形金属など）内に収容された１つまたは複数のレンズレスイメージャ１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃを具える。各レンズレスイメージャ１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃは、照明源１１６を具える。照明源１１６は、出力電力が約１ｍＷの６５０ｎｍレーザダイオード（製品番号ＡＭＬ－Ｎ０５６－６５０００１－０１、Ａｒｉｍａ Ｌａｓｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、台湾桃園）といったレーザダイオード、またはその他の適切な照明装置であり得る。例えば、レーザダイオード以外の照明源１１６としては、発光ダイオード（ＬＥＤ）や別のレーザ光源などを含む。

［００５１］照明源１１６から放出された光１１７は、オプションのアパーチャ１１８を通過する。アパーチャ１１８は、３Ｄ印刷されたアパーチャあるいは他の適切に構築されたアパーチャ（例えば、成形、機械加工など）であり得る。アパーチャ１１８は、放出光の放出角度を制限し、隣接するイメージャ１０４への光漏れを回避するように機能する。このアパーチャ１１８はオプションであり、すべての実施形態に存在し得るわけではない。アパーチャ１１８は、近くのイメージセンサ１２４への光漏れを防ぐのに役立つ。光漏れが問題にならない（例えば、レンズレスイメージャ１０４の間隔または構成が光漏れの影響を受けない）実施形態では、アパーチャは省略することができる。

［００５２］サンプル１０１は、実質的に光学的に透明な流体ホルダ１２０ａ、ｌ２０ｂ、ｌ２０ｃ（「サンプルホルダ」とも呼ばれる）に装填される。「実質的に光学的に透明」の語は、この要素が、サンプル１０１内の運動性オブジェクト２００を識別するのに十分な品質で、この要素を通してサンプル１０１の画像１６８を取得するのに十分に透明であることを意味する。一実施形態では、各流体ホルダ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、ガラスのキャピラリーチューブである。このキャピラリーチューブは、断面プロファイルが長方形であり得るが、円形、楕円形などの他の適切な断面プロファイルであってもよい。流体ホルダ１２０は、サンプル１０１（例えば、スクリーニングされる体液）で満たされ、照明源１１６の下にｚ_１距離１２２で配置される。図示の実施形態では、ｚ_１距離１２２は、照明源１１６の下約７ｃｍである。この場合も、アパーチャ１１８はオプションであり、すべての実施形態に存在しなくてもよい。アパーチャ１１８は、隣接するイメージャ１０４の近くのイメージセンサ１２４への光漏れを防ぐのに役立つ。光漏れが問題にならない（例えば、レンズレスイメージャ１０４の間隔または構成が光漏れの影響を受けない）実施形態では、アパーチャ１１８を省略してもよい。

［００５３］イメージャ１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃのそれぞれは、それぞれの照明源１１６からそれぞれの流体ホルダ１２０の反対側に配置されたイメージセンサ１２４を有し、それにより、走査ヘッド１０２の位置に基づくサンプル１０１の区画でサンプル１０１を通る照明源１１６から放出された光１１７の回折またはスペックルパターンを画像化することができる。例えば図示の実施形態では、イメージセンサ１２４は、流体ホルダ１２０の下に配置され、照明源１１６は流体ホルダ１２０の上に配置されている。イメージセンサ１２４は、１．６７μｍのピクセルサイズおよび６．４ｍｍ×４．６ｍｍ（２９．４ｍｍ^２）の活性領域を有する１０メガピクセルのＣＭＯＳイメージセンサ（製品番号ａｃＡ３８００－１４ｕｍ、Ｂａｓｌｅｒ、アーレンスバーグ、ドイツ）といった任意の適切なイメージセンサであり得る。イメージセンサ１２４は、照明源１１６からｚ_２距離１２６だけ下に配置される。ｚ_１距離１２２は、通常、ｚ_２距離よりはるかに大きい。図示の実施形態では、イメージセンサ１２４と流体ホルダ１２０の底面との間のｚ_２距離１２６（すなわち、エアギャップ）は、イメージセンサ１２４からサンプル１０１への熱伝達を低減するために、約１～１．５ｍｍ、または１～３ｍｍ、または０．５～５ｍｍである。図１は、いくつかの実施形態においてｚ_２距離１２６が約３ｍｍであり得ることを示す。

［００５４］各イメージセンサ１２４は、発熱する１つまたは複数の回路基板１２５を有するので、オプションでヒートシンク１２８が回路基板１２５の間に挿入され走査ヘッド１０２の側に配置されて、熱を放散してイメージセンサ１２４の誤動作および／または損傷を防止する。ヒートシンク１２８は、カスタムメイドのアルミニウムヒートシンク、または他の材料および構造を含む他の適切なヒートシンクであり得る。

［００５５］本書記載の実施例で使用される実施形態は、３つの異なるキャピラリーチューブ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃを画像化する３つの同一のレンズレスイメージャ１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃを具える走査ヘッド１０２を使用する。これらのキャピラリーチューブｌ２０ａ、ｌ２０ｂ、ｌ２０ｃには、異なる患者または同じ患者からのサンプルを装填することができる。より多くの（または少ない）レンズレスイメージャ１０４を使用してもよいことを理解されたい。

［００５６］並進ステージ１０６は、イメージャ１０４を流体ホルダ１２０に対して移動させるために走査ヘッド１０２を移動するように構成され、イメージャ１０４は、それぞれの流体ホルダ１２０に含まれるサンプル１０１の異なる領域の画像１６８を取得できる。図示の実施形態では、並進ステージ１０６は、走査ヘッド１０２を流体ホルダ１２０の長さに沿って直線方向に移動させるため、線形並進ステージ１０６と呼ばれる。図示の実施形態では、線形並進ステージ１０６は、流体ホルダ１２０の長手方向軸に平行に整列して取り付けられた２つの線形運動シャフト１３０ａ、１３０ｂを具える。これらの運動シャフトｌ３０ａ、ｌ３０ｂは、製品番号８５４２１，Ｍａｋｅｂｌｏｃｋ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、深セン、中国、またはその他の適切な運動シャフトであり得る。線形並進ステージはまた、運動シャフト１３０ａ、１３０ｂに対して結合され、制御可能に移動可能な２つの線形運動スライダ１３２を有する。線形運動スライダ１３２は、製品番号８６０５０、Ｍａｋｅｂｌｏｃｋ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、深セン、中国であり得る。線形並進ステージ１０６はまた、２つのタイミングプーリーｌ３６ａ、ｌ３６ｂ（例えば、製品番号６１５４１８、ＳｅｒｖｏＣｉｔｙ、Ｗｉｎｆｉｅｌｄ、ＫＳ、またはその他の適切なタイミングプーリー）およびステッピングモータ１３８（例えば、製品番号３２４、Ａｄａｆｒｕｉｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＬＬＣ．、ニューヨーク州ニューヨーク市、または他の適切なモータ）に機能的に連結されたタイミングベルト１３４（例えば、製品番号Ｂ３７５－２１０ＸＬ、ＳｅｒｖｏＣｉｔｙ、Ｗｉｎｆｉｅｌｄ、ＫＳ、または他の適切なタイミングベルト）を具えてもよい。

［００５７］走査ヘッド１０２は、ねじや他の適切な留め具を使用して運動スライダ１３２に取り付けられる。運動スライダ１３２が取り付けられた走査ヘッド１０２は、静止した線形運動シャフト１３０ａ、１３０ｂに沿って移動する。ステッピングモータ１３８は、連結されたタイミングベルト１３４とタイミングプーリー１３６を駆動して、走査ヘッド１０２を線形運動シャフト１３０ａ、１３０ｂに沿って前後に動かすための動力を提供する。本書で利用および開示す特定の線形並進ステージ１０６は、画像化プラットフォーム１００に使用することができるが、流体ホルダ１２０に対して直線方向に走査ヘッド１０２を移動させるように構成される他の並進機構およびデバイスも利用できることを理解されたい。これらは、直線運動を与えるために走査ヘッド１０２に機械的に連結またはリンクされたモータまたはサーボベースのデバイスを具え得る。同様に、並進ステージ１０６は、走査されるサンプル量に応じて、異なる方向に並進されてもよい。例えば、三次元ボリュームを直交（または他の方向）に走査して、サンプルボリュームをカバーすることができる。したがって、様々な異なる並進動作を並進ステージ１０６と組み合わせて使用することができる。

［００５８］コンピューティングデバイス１１２は、画像化プラットフォーム１００の動作を制御するように構成される。図示の実施形態では、コンピューティングデバイス１１２はラップトップコンピュータであるが、コンピューティングデバイス１１２は、他のコンピュータベースのデバイス（例えば、パーソナルコンピュータまたは場合によってはタブレットコンピュータまたは他のポータブルコンピューティングデバイス）を含み得る。コンピューティングデバイス１１２は、１つまたは複数のマイクロプロセッサ１１１、記憶デバイス１６０、グラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）１６１、およびディスプレイ１６３を含み得る。

［００５９］図１Ｃの概略図を参照すると、電子回路１１０は、画像化プラットフォーム１００を自動化するように構成されたプリント回路基板（ＰＣＢ）１４２を含む。ＰＣＢ１４２は、ＵＳＢ２．０インターフェース（または他の適切なインターフェース）を介してコンピューティングデバイス１１２に機能的に接続されたマイクロコントローラ１４４（例えば、Ｔｅｎｅｓｙ ＬＣ，ＰＪＲＣ）を含む。マイクロコントローラ１４４はまた、照明ドライバ回路１４６（例えば、レーザダイオードドライバ回路または他の適切なドライバ回路）、およびステッピングモータドライバ回路１４８を含む。照明ドライバ回路１４６は、定電流回路から構築され得る。例えば、レーザダイオードドライバ回路の場合、照明ドライバ回路１４６は、製品番号ＬＭ３１７ＤＣＹＲ、テキサスインスツルメンツから構築され得る。ステッピングモータ駆動回路１４８は、製品番号ＴＢ６６１２、Ａｄａｆｒｕｉｔ、またはその他の適切なステッピングモータドライバー回路であり得る。

［００６０］図示の実施形態では、照明源１１６（例えば、レーザダイオード）およびステッピングモータ１３８は、１２Ｖ電源アダプタ１５０を使用して電力供給される。金属酸化膜半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）から構築された様々なデジタルスイッチ１５６ａ、ｌ５６ｂ、ｌ５６ｃが、マイクロコントローラ１４４からのデジタル出力によって制御され、レーザダイオード１１６およびイメージセンサ１２４が使用されていないときにそれらへの電力を遮断する。具体的には、イメージセンサ１２４への電力の切断を含む、イメージセンサ１２４への電力を制御するために、イメージセンサ１２４のＵＳＢ３．０ケーブルの電力線が遮断され、ＭＯＳＦＥＴベースのデジタルスイッチ１５６ａが電力線に挿入される。

［００６１］コンピューティングデバイス１１２は、画像化プラットフォーム１００から取得されたデータを制御および相互作用するために使用される制御プログラム１１４を含む。例えば、本明細書に開示す特定の実施形態では、制御プログラム１１４は、ＣＳｈａｒｐプログラミング言語（Ｃ＃）で書かれたウィンドウズ（登録商標）ベースのアプリケーションである。制御プログラム１１４は、ユーザが現在のサンプル１０１のスクリーニングを開始できるようにすることに加えて、画像取得パラメータのカスタマイズ、回折パターンのライブビューの実行、スナップショットの取得、および取得の停止などの他の様々な機能を実現するＧＵＩ１１５を含む。他のプログラミング言語またはスクリプトも使用できることを理解されたい。

［００６２］したがって、制御プログラム１１４は、画像化プラットフォーム１００を制御して、時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを取得する。サンプル１０１を画像化プラットフォーム１００上の流体ホルダ１２０ａ、ｌ２０ｂ、ｌ２０ｃに装填した後、所定の待機時間（例えば、３～４分の待機時間、例えば溶解した全血の場合は４分、人工ＣＳＦの場合は３分、詳細は図２を参照）の間サンプル１０１を沈降させ、ユーザーはＧＵＩ１１５の「記録」ボタンを押して取得を開始する。制御プログラム１１４は、画像化プラットフォーム１００をプログラムして、流体ホルダ１２０ａ、ｌ２０ｂ、ｌ２０ｃを所定数の離散位置でスキャンして、流体ホルダ１２０ａ、ｌ２０ｂ、ｌ２０ｃ内のサンプル１０１の異なる領域を画像化するように構成される。例えば、図示の実施形態では、画像化プラットフォーム１００は、互いに約４．７ｍｍ離れた３６の別個の位置で流体ホルダ１２０ａ、１２０ｂ、ｌ２０ｃをスキャンするようにプログラムされ得る。これにより、合計スクリーニング量は３６（個別のスキャン位置）×２９．４ｍｍ^２（イメージセンサ１２４のＦＯＶ）×１ｍｍ（キャピラリーチューブ１２０のチャネル高さ）≒レンズレススペックルイメージャ１０４あたり１．０６ｍＬ、３つの並列イメージャを組み合わせたものでは約３．１８ｍＬとなる。３６の位置のそれぞれで、高フレームレート（約２６．６ｆｐｓ）を達成するために、イメージセンサ１２４のＦＯＶは、２つの半部（すなわち、ピクセルの上部１３７４行および下部１３７４行）に分割され、それぞれが６１フレーム（溶解血液の場合）または４１フレーム（ＣＳＦの場合）を順次半分キャプチャする（図９Ａ～９Ｄを参照）。

［００６３］イメージセンサ１２４は電力を供給されると温度が上昇し、液体サンプル１０１の温度勾配によって対流が誘発される。例示的な画像化プラットフォーム１００の温度勾配によって誘発される対流の例を図１０Ａ～１０Ｃに示す。これらの問題を軽減するために、２つの対策を講じることができる。第１に、３６の位置を一方向にスキャンする代わりに、画像化プラットフォーム１００を前後にスキャンするように構成することができる。例えば、３６の位置が、空間的に順序付けられた位置＃１、＃２、．．．、＃３６で表されるとする。＃１、＃２、…、＃３６の順序で走査する代わりに、制御プログラム１１４は、位置９個分のより大きなステップサイズで走査するように画像化プラットフォーム１００をプログラムし、走査ヘッド１０２がこのステップサイズで進めなくなったら（位置９個分のステップが端部位置＃１または＃３６を超えて移動するため）、走査ヘッド１０２は、走査していない最も小さい番号の位置に移動される。言い換えれば、この例では、画像化プラットフォーム１００は、最初に位置＃１、＃１０、＃１９、および＃２８をスキャンする。次に、走査ヘッド１０２が位置＃２に戻され、続いて＃１１、＃２０、および＃２９というように移動される。この走査パターンは、走査ヘッド１０２がその近くに戻る前に冷却するのに十分な時間を有するキャピラリーチューブ１２０の所与のセクションでの熱の蓄積を殆ど防止する。第２の手段として、所定の「ダウンタイム」（例えば、６秒の「ダウンタイム」、または５～１０秒の「ダウンタイム」）を走査位置の間に追加して、イメージセンサ１２４を冷却することができる。所与の位置で取得を完了した後、イメージセンサ１２４への電力は、ＵＳＢ３．０ケーブルに追加されたＭＯＳＦＥＴベースのデジタルスイッチ１５６ａによって遮断される。所定の待機時間（例えば、６秒）の後、ステッピングモータ１３８は、走査ヘッド１０２を次の位置に移動させ、そこで、イメージセンサ１２４への電力が復旧されて、次の画像のセット１６８がキャプチャされる。

［００６４］取得された一連の画像１６８（例えば、動画またはクリップ）は、処理のために記憶装置１６０（例えば、ハードドライブ）に保存される。非圧縮の８ビット画像１６８をキャプチャした３つのイメージセンサ１２４はすべて、約４２１ＭＢ／秒の合計データレートを生成し、これはハードドライブ（例えばソリッドステートハードドライブ（ＳＳＤ））といった典型的な記憶装置１６０（図１Ｃを参照）の平均書き込み速度をわずかに超える。したがって、取得した画像データを一時的にバッファするために、各イメージセンサ１２４のランダムアクセスメモリ１５８（ＲＡＭ）にキューが作成され、画像データをバッファからストレージデバイス１６０（例えば、ＳＳＤ）に絶えず移動させるために別のスレッドが作成される。しかしながら、残りのすべての画像データは、上記の位置間のダウンタイム中にストレージデバイス１６０（例えば、ＳＳＤ）に完全に保存できるので、テストあたりの総画像取得時間は書き込み速度の制限のためには増加しない。時間効率の良い代替案として、取得画像１６８は、各画像シーケンスに対応するバッチで処理するために常にＧＰＵに移動されている間、一時的にＲＡＭに格納され得る。このようにして、画像処理を画像取得と同時に実行できるため、テストごとの合計時間が短縮される。

［００６５］ＣＭＡアルゴリズム１６２（例えば、ＣＭＡソフトウェア１６２にプログラムされている）は、ノイズの多いホログラムにおける粒子移動およびスペックル干渉パターンから３Ｄコントラストデータを生成するのに利用され、また、関心のある寄生虫に対応する信号を識別するために深層学習ベースの分類を適用する。一例として、図３Ａ～３Ｍは、溶解した全血からトリパノソーマを検出するために使用される例示的なプロセス（すなわち、ＣＭＡアルゴリズムおよび深層学習ベースの分類方法）を示すが、他のアプリケーション設定（例えば、ＣＳＦにおけるトリパノソーマ検出）では、後述するように僅かな変更が手順に加えられる。ＣＭＡアルゴリズム１６２は、入力として、各走査位置で各イメージセンサ１２４によって取得された生のホログラフィック回折パターンを取得するように構成される。ＣＭＡソフトウェア１６２を使用して、サンプル１０１内の運動性種の数をカウントし、これを使用してサンプル１０１の種の濃度を計算することができる（サンプルの既知の量が与えられる）。ＣＭＡソフトウェア１６２はまた、運動性種の数または濃度に基づいて、特定のサンプルをポジティブ（＋）またはネガティブ（－）として分類することができる。例えば、しきい値カットオフ値を使用して、ポジティブサンプルとネガティブサンプルを区別することができる。分析結果は、ＧＵＩ１１５上でユーザに提示され得る。さらに、運動性オブジェクト２００の動きの動画を、ＧＵＩ１１５を使用して見ることができる。本明細書に記載されるように、画像化プラットフォーム１００は、寄生虫の検出に特に適しているが、他の運動性種（例えば、精子または他の生物学的運動性種）にも使用することができる。サンプル１０１は生物学的サンプルを含み得るが、他の実施形態では環境サンプルも含み得る。

［００６７］ホログラフィックスペックル分析を使用した３Ｄでの寄生虫の移動の検出
［００６８］寄生虫検出技術に不可欠な高フレームレート（約２６．６ｆｐｓ）を維持するために、各イメージセンサ１２４の全視野（ＦＯＶ）をそれぞれ約１４．７ｍｍ^２の２つの半部に分割した。図４Ａ～４Ｃは、イメージセンサ１２４によってキャプチャされた、溶解されトリパノソーマを添加した全血サンプルの生のスペックルパターンを示す。この単純な溶解プロセスによって血液サンプルの密度が大幅に低下した場合でも、溶解した血液中の細胞破片に起因するランダムな光散乱のために、干渉パターン（例えば、図４Ｂ～４Ｃを参照）は依然として非常に高密度である。結果として、光学的に透明で弱く散乱するトリパノソーマの回折パターン（図４Ｃに矢印で示す）は、スペックルパターンの下に埋もれ、それらの直接検出は非常に困難である。

［００６９］この課題に対処するために、血液中の運動性トリパノソーマの急速移動に起因する、検出されたスペックルパターンの時空間変動を利用することができる。これを利用したＣＭＡアルゴリズム１６２（またはＣＭＡソフトウェア１６２）が開発され、これには、ホログラフィック逆伝播、差分イメージング（トリパノソーム移動用に最適に調整されたフレーム間隔を使用）、および時間平均が含まれ、サンプルボリューム内の水平断面ごとに行われる。オブジェクト関数の正規化（ＯＦＮ）が各差分イメージングステップに導入され、サンプル内の望まない強く散乱するオブジェクトによる潜在的な誤検出（false positive）を抑制した。このアルゴリズムの後に、画像後処理と深層学習ベースの分類が行われ、トリパノソーマによる信号を識別した（詳細は後述する）。図４Ｄ～４Ｅは、この計算プロセスの結果を例示しており、処理された画像１６８の「ホットスポット」は運動性トリパノソーマに対応している。これをよりよく示すために、図４Ｅの（白い矢印で示されている）３つのホットスポットの計算された３Ｄ位置に基づいて、逆伝播された回折パターンの振幅チャネルと位相チャネルの焦点の合った動画を作成した。これらのトリパノソーマの急速な移動がこの映像で観察できるが、サンプル内の他の非運動性オブジェクト（細胞破片など）によって生じる干渉パターンによって部分的に隠れている。

［００７０］同様に、ＷＢＣを添加した人工ＣＳＦサンプル内のトリパノソーマを画像化した結果を図６Ａ～６Ｂに示す。ＣＳＦは殆どが透明な媒体であるため、媒体内の準静的散乱体によって生じるバックグラウンドノイズレベルは、運動性トリパノソーマの信号レベル（すなわち図６Ｂのホットスポット）と比較して大幅に低くなる。デジタルフォーカスされた振幅と位相の動画は、これらの運動性トリパノソーマの低ノイズの再構成も示している。

［００７１］以下の表１に詳述されるように、これらのトリパノソームを画像化し検出するための総画像処理時間の８０％超は、記録された画像シーケンスごとに約６メガピクセル画像１６８の数千の高速フーリエ変換を含むＣＭＡアルゴリズム１６２に費やされる（詳細は以下の「方法」セクション参照）。したがって、グラフィックスプロセッシングユニット（ＧＰＵ）１６４ベースの並列演算が、ＣＭＡアルゴリズム１６２の高速化に役立つ。単一のＧＰＵ１６４を使用する場合、１つの実験の画像処理タスク全体（３つの並列イメージセンサ１２４で合計２１６の画像シーケンス）は、血液サンプルとＣＳＦサンプルでそれぞれ約２６分と約２１分かかる。２つのＧＰＵ１６４を用いると、各ＧＰＵ１６４には、特定の時間に処理すべき画像シーケンスが個別に与えられるため、ＧＰＵ１６４間の干渉が最小限に抑えられ、最大の並列処理を実現できる。したがって、２つのＧＰＵ１６４を使用すると約２倍の速度向上が観察され、血液実験とＣＳＦ実験の合計画像処理時間はそれぞれ約１３分と約１１分になる。他のすべてのサンプル準備ステップと組み合わせると、テストあたりの合計検出時間は、血液サンプルとＣＳＦサンプルでそれぞれ約２０分と約１７分になる（詳細は図２参照）。

［００７２］トリパノソーマのＬｏＤの定量化
［００７３］例示的な画像化プラットフォーム１００のＬｏＤが、連続希釈実験を実施することによって溶解された全血中のトリパノソーマを検出するために判定され、その結果が図５Ａ～５Ｂに示されている。これらの実験では、トリパノソーマに感染したマウスの血液を非感染の血液に感染させて、０ｍＬ^－１（ネガティブ対照）、１０ｍＬ^－１、１００ｍＬ^－１、１０００ｍＬ^－１、１０，０００ｍＬ^－１、１００，０００ｍＬ^－１を含む一連の寄生虫濃度を生成した。ここで、各濃度でＮ＝３回の反復実験が実施された。図５Ａに示すように、３つのネガティブ対照サンプルではフォルスポジティブは見られなかったが、３つの１０ｍＬ^－１実験では、検出された濃度は７．５５±３．７０ｍＬ^－１であった。したがって、ＬｏＤは全血１ｍＬあたり約１０トリパノソーマであり、現在利用可能な最良の寄生虫学的検出方法（すなわち、ミニ陰イオン交換遠心分離技術、ｍＡＥＣＴ、図１４の表を参照）よりも５倍優れていると結論付けることができる。図５Ａ～５Ｂはまた、この技術の収率（検出されたトリパノソーマ濃度を添加された濃度で割ったもの）が（試験された濃度の下限で）約６８％～７６％～（上限で）３８％～３９％であったことを示す。この濃度に依存する収率は、高濃度ではトリパノソーマ同士が近接しているため、６４×６４ピクセルのトリミング画像に複数のトリパノソーマが存在し、深層学習ベースの分類器によってネガティブとして誤分類される可能性があり（詳細は後述する）、サンプル中の真のトリパノソーマ数の過小評価されることに関連すると考えられる。高濃度で観察された収率のこの低下は、キャリブレーションによって潜在的に補償することができる。

［００７４］Ｔ．ｂｒｕｃｅｉの場合、最も適切な治療法を決定するには、病期の決定が重要である。これは現在、腰椎穿刺によってＣＳＦを収集し、顕微鏡でＣＳＦを検査することによって行われている。ＷＢＣが５μＬ^－１未満で、ＣＳＦにトリパノソーマがない患者はステージＩに分類される。それ以外の場合、ＷＢＣが５μＬ^－１を超える場合、またはＣＳＦにトリパノソームが見つかった場合はステージＩＩとして分類される。高スループットのＣＳＦスクリーニングでこの必要性に対処するために、ＣＳＦ中のトリパノソーマを検出するための例示的な画像化プラットフォーム１００のＬｏＤも定量化された。この目的のために、ヒトＷＢＣを添加した人工ＣＳＦサンプルを使用し、ネガティブ対照に加えて、培養したトリパノソーマを３ｍＬ^－１、１０ｍＬ^－１、１００ｍＬ^－１、および１０００ｍＬ^－１の濃度で人工ＣＳＦ溶液に添加した（各濃度でＮ＝３）。添加されたヒトＷＢＣの濃度は２０ＷＢＣ／μＬとし、ＷＢＣ濃度がステージ判定で使用される５μＬ^－１しきい値より４倍高いシナリオでトリパノソーマを検出するデバイスのパフォーマンスを評価した。血液サンプルとは異なり、ＣＳＦ溶液は光学的に透明であり、溶解が不要であったため、ＬｏＤをさらに改善することができた。図５Ｃ～５Ｄに示すように、例示的な画像化プラットフォーム１００は、１ｍＬあたり３トリパノソーマという非常に低いＬｏＤで、ＣＳＦに添加されたトリパノソーマを検出することができた。

［００７５］膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の検出
［００７６］画像化プラットフォーム１００の運動性ベースの検出アプローチを検証するために寄生虫Ｔ．ｂｒｕｃｅｉを選択したが、このアプローチは、様々な運動性微生物の検出に広く適用できることが理解される。完全に異なる運動性寄生虫に対する例示的な画像化プラットフォーム１００の性能の予備試験として、膣トリコモナスを選択した。膣トリコモナスは、トリコモナス症の原因となる原生動物の寄生虫であり、これは米国および世界中で最も一般的な非ウイルス性性感染症である。膣トリコモナスは、女性と男性の両方の泌尿生殖器に感染する。多くの場合無症候性であるが、膣トリコモナス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、早期陣痛、骨盤内炎症性疾患、前立腺癌などの他の健康状態に関連するリスクの増加と関連している。トリコモナス症の診断では、細胞培養とそれに続く顕微鏡検査が依然として最良で最も信頼性の高い方法であり、これは感度が高く、１ｍＬあたりわずか３つの寄生虫を含む接種材料から膣トリコモナスを検出できるからである。しかしながら、コストが高く、不便で、検査時間が長く、サンプルの汚染を受けやすいという制限がある。最も一般的な診断方法であるウェットマウント顕微鏡法は、感度が低い（５ｌ％～６５％）という問題がある。したがって、高感度のレンズレス時間分解ホログラフィックスペックルイメージング法が、実質的な利益となり得る。

［００７７］ＣＭＡアルゴリズム１６２にわずかな調整を加えるだけで（以下の説明を参照）、例示的な画像化プラットフォーム１００がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液および培養培地中の膣トリコモナスを検出できることが実証された（図７Ａ～７Ｂ、８Ａ～８Ｂ参照）。これらの実験に基づいて、膣トリコモナスは、ＣＳＦ中のトリパノソームと比較して有意に強い信号強度を生成することがわかり（図６Ａ～６Ｂを参照）、これは膣トリコモナスの激しい移動と強い光散乱に関連づけられる。これは、このプラットフォームを用いて膣トリコモナスで同程度以上の感度レベル、例えば、１ｍＬあたり３未満の寄生虫を達成できる可能性があることを示唆している。希釈された膣分泌物から、または尿から直接膣トリコモナスを検出するなど、様々な臨床ニーズに対応して、培地や尿などの様々な環境から膣トリコモナスのＬｏＤを確立するためにさらにテストが必要になる場合がある。

［００７８］実施例についての議論
［００７９］レンズレス時間分解ホログラフィックスペックルイメージングに基づいて、新規な画像化プラットフォーム１００および運動性ベースの寄生虫検出のための方法が提示された。新規な画像化プラットフォーム１００は、溶解した血液およびＣＳＦ内のトリパノソーマの迅速な検出に効果的であり、現在の寄生虫学的方法よりも優れたＬｏＤを達成することが実証された（図５Ａ～５Ｄおよび図１４を参照）。この自動化された技術は、ＰＣＲベースまたは顕微鏡による検出方法に不可欠な高度に専門化された高価な機器や専門知識の必要性を減らしながら、寄生虫のスクリーニング効率を向上させることができる。ラップトップ１１２を除く、実施例で使用される例示的な画像化プラットフォーム１００のすべての部分の総コストは、１８５０ドル未満である。そして、このコストは大量生産の下で簡単に５００～１０００ドルに削減できる。すべてのサンプル準備ステップを含む総分析時間はわずか約２０分であり、これはほとんどの既存の方法に匹敵するか、それよりも高速である（図１４を参照）。この運動性ベースの方法は、特殊な検出試薬、冷蔵、遠心分離、または精製を必要とせずに高感度を実現し、様々なタイプのサンプル（血液、ＣＳＦなど）の分析にさらに汎用性を高め、寄生虫亜種間の違いや、世界の領域間の隔たりの影響を受けにくい。したがって、提示されたプロトタイプは、電気またはバッテリ電源にアクセスできる確立されたクリニックまたはモバイルクリニックに容易に適合させることができ、既存の診断方法への有用な追加となる可能性のある進歩を表している。

［００８０］この診断方法は、ＣＳＦの寄生虫症が従来の方法のＬｏＤ以下であり、ＣＳＦのＷＢＣがまだ少ない場合に、血流ＨＡＴまたはシャーガス感染症の診断を改善したり、ステージＩＩのＨＡＴ症例の早期発見を容易にするために有益である。画像化プラットフォーム１００はまた、疾患治療後のフォローアップにも有用であり、患者をスクリーニングして再発を早期かつ高感度に検出することができる。これらの進歩は、患者の治療結果を改善し、病気の治癒率を高めることにつながる。ＨＡＴに加えて、動物のトリパノソーマ症は経済発展を著しく制限する。そのため、運動性に基づく検出を適用して、感染した家畜のスクリーニングと媒介生物制御オプションの開発を支援することで、流行地域を貧困から引き上げるのに役立つ可能性がある。シャーガス病の場合、この技術を献血者や血液製剤、サトウキビジュース、アサイージュース製品のスクリーニングに適用して、様々な感染経路を減らすことができる。リスクのある人口が多いことを考えると、様々な種類のサンプル／液体を簡単かつ自動化された方法で迅速に分析する能力は、撲滅活動によって病気の発生率が低下した地域でサンプルをスクリーニングする実行可能な戦略を開発するために特に重要である。

［００８１］画像化プラットフォーム１００およびラベルフリー検出方法は、寄生虫の移動パターンを利用して、検出信号対雑音比（ＳＮＲ）を最大化する。トリパノソーマは絶え間なく動くことで知られており、運動性は宿主における病原性だけでなく、その生存にも重要である。トリパノソーマの遊泳行動は非常に複雑である。べん毛は細胞体の側方に付着しているため、寄生虫の移動は細胞体の回転を伴い、「コークスクリュ」水泳パターンとなる。さらに、細胞の移動に加えて、べん毛は高速で三次元の拍動パターンを生成する。Ｔ．ｂｒｕｃｅｉの平均拍動周波数は、前進する細胞で１８．３±２．５Ｈｚ、後退する細胞で１３．１±０．８Ｈｚと推定されるが、前進する細胞の回転周波数は２．８±０．４Ｈｚである。ナイキストのサンプリングレートによると、平均拍動周波数（前進）に一致するフレームレートは３６．６ｆｐｓに相当する。言い換えると、少なくとも３６．６ｆｐｓのフレームレートで、各べん毛ストロークに対応するスペックル変化を記録することができ、さらに高いフレームレートであれば、べん毛ストローク中の様々な時点に対応するスペックル変化を、より細かい時間分解能で記録することができる。最適な減算時間間隔（Δｔ）と時間窓（Ｔ）が使用されると仮定すると（図９Ａ－９Ｂを参照して後述）、フレームレートが高いほど、運動性寄生虫によって誘発されるスペックル変化の時間分解情報が豊富になるとともに、平均化に使用できるフレーム数も多くなり、全体としてＳＮＲを向上させることができる。ただし、目標は拍動パターンの忠実な記録ではなく、運動に基づいてコントラストを生成することであるため、検出目的であれば３６．６ｆｐｓ未満のフレームレートでも問題ない。走査時間および取得データ量を考慮すると、約２６．６ｆｐｓのフレームレートを画像化プラットフォーム１００にうまく利用することができる。画像化プラットフォーム１００の性能は、より高速のイメージセンサ１００およびデータインターフェースを使用してより高いフレームレートを達成することによって改善され、それにより、データ取得時間を増加させることなくＳＮＲを向上させることができる。

［００８２］Ｔ．ｂ．ｂｒｕｃｅｉトリパノソーマは、ヒトに対して非病原性であり、実験を安全に行うことができるため、トリパノソーマの研究のモデル微生物として広く使用されている。本書に開示す画像化プラットフォーム１００および方法は、Ｔ．ｂ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｂ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｃｒｕｚｉにも容易に適用することができ、これらは基本的に動きが似ているためである。安全上の懸念からマウスの血液と人工的なＣＳＦ溶液をテスト全体で使用したが、溶解バッファはヒトの血液でも機能する。今後は、流行地域の患者サンプルをテストして、様々なトリパノソーマ症の診断における今回の技術の感度と特異性を確立する予定である。

［００８３］多くの運動性生物が人間に感染を引き起こす可能性がある。画像化プラットフォーム１００および開示された方法はまた、異なる寄生虫を自動的に区別するように構成することができる。例えば、検出された信号ごとに生成される振幅および位相の動画（図３Ｍを参照）により、訓練を受けた臨床医は、形態、サイズ、および運動パターンに基づいて異なる運動性寄生虫を区別することができ、これは、明視野および位相コントラスト顕微鏡下で生きた寄生虫をそれぞれ観察することに類似している。これらは、任意でＧＵＩ１１５上でユーザに提示することができる。地域における特定の病原体の蔓延も、この点で役立つ可能性がある。さらに、例えば畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）または再帰的ニューラルネットワーク（ＲＮＮ）に基づくトレーニングされた映像分類器を用いて、十分なトレーニングデータを使用して、様々な寄生虫を識別し自動的に識別することができる。画像化プラットフォーム１００を使用して運動性寄生虫の特性を特定するための例示的なニューラルネットワーク１６６の概略図が図１５に示されている。トレーニングされたニューラルネットワーク１６６は、画像１６８のシーケンスを分析し、サンプル１０１内の運動性寄生虫の特性、例えば検出された寄生虫の種類、流体ホルダ１２０中のサンプル１０１の３Ｄボリューム内の寄生虫の３Ｄ位置、および寄生虫オブジェクトの数を特定する。

［００８４］実施例では、トリパノソーマを利用して、寄生虫感染の検出に使用されるレンズレス時間分解ホログラフィックスペックルイメージングの実現可能性を実証している。このアプローチではトリパノソーマの運動性を利用したが、このプラットフォームは、膣トリコモナスなどの他の真核生物の寄生虫（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂを参照）や、ここでテストしたもの以外の他の流体サンプルを含む他の運動性寄生虫に広く適用することができる。原理的には、このプラットフォームは血液サンプル中のロア糸状虫（Ｌ．ｌｏａ）ミクロフィラリアの検出にも使用できるが、このミクロフィラリアは今回調査した寄生虫と比較して大幅に大きい（長さ約０．２～０．３ｍｍ）である。このような大きな運動性寄生虫については、Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏらは代替アプローチとして、イメージングチャンバ内のＬ．ｌｏａミクロフィラリアとの衝突によって生じるＲＢＣの変位を利用して、携帯電話を利用した検出方法を用いた。（参照：D'Ambrosio, M. V. et al. Point-of-care quantification of blood-borne filar parasites with a mobile phone microscope. Sci. Transl. Med. 7, 286re4-286re4 (2015)）。この設計は非常にコンパクトで費用対効果に優れるが、約０．８ｍＬの全血または約３．２ｍＬのＣＳＦをスクリーニングして自動的に処理する本方法と比較して、検出量がはるかに少ない（約０．０１ｍＬ）という問題があり、Ｌ．ｌｏａと比較して大きさと質量が１桁以上小さく、寄生虫症が少なく、光散乱がはるかに弱いトリパノソーマなどの寄生原虫の検出に使用することは非常に困難である。

［００８５］運動性細菌はまた、多くの人間の病気の原因となる。細菌は通常、トリパノソーマよりもはるかに小さいが、光学倍率と組み合わせた運動性ベースの検出の概念は、細菌性病原体のラベルフリー検出にも利用することができる。尿や希釈された粘膜分泌物や糞便サンプルなどの他の体液をスクリーニングするための運動性ベースの検出の潜在的な用途が考えられる。したがって、本明細書に開示す画像化プラットフォーム１００および方法は、様々な世界的な健康上の課題に対処する大きな可能性を有する。最後に、運動性をバイオマーカーおよび内因性コントラストとして使用すると、臨床診断を超えた新しい可能性を生み出すことができる。光散乱および光学的に高密度の媒体に対して強いラベルフリーの３Ｄイメージングモダリティとして、様々な流体環境における運動性微生物を高スループットで研究するためにも利用することができる。

［００８６］実施例の材料と方法
［００８７］サンプル調製
［００８８］溶解緩衝液の調製：４４ｍＭ塩化ナトリウム（製品番号７１３７９，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、５７ｍＭリン酸二ナトリウム（製品番号３０４１２，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、３ｍＭリン酸一カリウム（製品番号６０２２０，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、５５ｍＭグルコース（製品番号Ｇ８２７０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．２４％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（製品番号Ｌ４３９０，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、試薬グレードの水（製品番号２３－２４９－５８１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、マグネチックミキサーでマグネチックステアバーを使用して２時間混合した。その後、使い捨て濾過ユニット（製品番号０９－７４０－６５Ｂ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濾過して滅菌し、室温で保存した。この緩衝液は、ＲＢＣおよびＷＢＣを含む全血の全成分を溶解するが、トリパノソーマは溶解しない。

［００８９］人工ＣＳＦの調製：従来方法に従い、１．２５Ｍ塩化ナトリウム、２６０ｍＭ重炭酸ナトリウム（製品番号ＳＸ０３２０－１、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１２．５ｍＭ塩基性リン酸ナトリウム（製品番号Ｓ６５６６、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および２５ｍＭ塩化カリウム（製品番号Ｐ５４０５、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をよく混合し、１０ｍＭ塩化マグネシウム（製品番号２０８３３７、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて１０倍の人工ＣＳＦを作成した。その後、使い捨て濾過ユニットを使用して溶液を濾過し減菌した。１０倍の原液を試薬グレードの水で１０倍に希釈して、１倍の人工ＣＳＦを作成した。

［００９０］トリパノソーマの培養：４２７由来の血流単一マーカートリパノソーマ（Ｔ．ｂ．ｂｒｕｃｅｉ）を、Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S. & Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. in Methods in Cell Biology 93, 21-57 (Elsevier, 2009)に記載のように、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（製品番号１０４３８０２６，Ｇｉｂｃｏ）を含むＨＭＩ－９培地で５％ＣＯ_２で３７℃で培養した。

［００９１］トリパノソーム感染マウスの血液採取：マウスを用いるすべての実験は、UCLA Institutional Animal Care and Use Committee（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインと規制、NIH Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Animals、USDA Animal Welfareの認定基準、およびＡＡＡＬＡＣ国際認定基準に従い、ＩＡＣＵＣ承認プロトコルＡＲＣ＃２００１－０６５に基づいて実施された。マウス感染は、Kisalu, N. K., Langousis, G., Bentolila, L. A., Ralston, K. S. & Hill, K. L. Mouse infection and pathogenesis by Trypanosoma brucei motility mutants. Cell. Microbiol. 16, 912-924 (2014)の記載の方法を、以下のように変更して用いた：雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（製品番号０００６５１，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１１～２４週齢）に、１％グルコースを含む０．１～０．２ｍＬの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｇ）中の５×１０^５～１×１０^６個の寄生虫を腹腔内に注射した。血球計数器でカウントすることにより寄生虫症をモニタし、寄生虫症が約１０^７～１０^８寄生虫／ｍＬに達したときに感染血液サンプルを採取した。感染血液は、伏在静脈または安楽死後の心臓穿刺によってヘパリン処理されたキャピラリーチューブ（製品番号２２－２６０９５０、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはヘパリン処理されたコレクションチューブ（製品番号８８８１３２０２５６、Ｃｏｖｉｄｉｅｎ）に採取した。

［００９２］ヒト血液からのＷＢＣの分離：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（製品番号４５－００１－７５１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造元の指示に従って密度勾配分離を用いて血液からの単核細胞のインビトロ分離に利用した。ヒトの血液サンプルは、患者と関連情報を匿名化した上でＵＣＬＡ血液および血小板センターから取得され、血液からのＷＢＣの分離に使用した。２ｍＬのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理した血液を、２ｍＬの滅菌ＰＢＳ（製品番号１０－０１０－０４９、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と５ｍＬ遠心チューブ（製品番号１４－２８２－３００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内でピペット混合し、混合物を引き出した。３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭを１５ｍＬのコニカル遠心チューブ（製品番号１４－９５９－５３Ａ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、希釈した血液サンプルをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭに注意深く重ねた。この懸濁液を、スイングアウトローター付き遠心分離機（ＡｌｌｅｇｒａＸ－２２Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、１９℃で４０分間４００×ｇで遠心分離した。遠心分離後、血漿と血小板を含む上層を除去し、単核細胞を滅菌した遠心分離管に移した。分離した細胞を洗浄するために、６ｍＬのＰＢＳと混合し、４００×ｇ、１９℃で１３分間遠心分離した。この洗浄ステップを２回繰り返し、ペレットを１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。ＷＢＣの濃度を血球計数器でカウントすることによって特定し、ＰＢＳ中の８×１０^５ＷＢＣ／ｍＬのストック溶液に適宜希釈した。

［００９３］血液サンプルの検量線分析のプロトコル：新たに収集したトリパノソーマ感染マウスの血液を、感染していないマウスの血液（Ｂａｌｂ／Ｃ、雌、プール、ヘパリンナトリウム、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｃ．）で約１０^６寄生虫／ｍＬの濃度に希釈した。このトリパノソーマ感染血液のサンプルを３倍量の溶解緩衝液で溶解し、血球計数器でカウントすることによりトリパノソーマ濃度を測定した。その後、トリパノソーマ感染血液を感染していない血液で希釈して、検量線分析に必要な濃度を得た。

［００９４］ＣＳＦサンプルの検量線分析のプロトコル：一貫した寄生虫の運動性を確保するために、各測定で培養トリパノソーマを新たに採取した。トリパノソーマを約１×１０^６～１．５×１０^６細胞／ｍＬの濃度まで増殖させ、１２００×ｇで５分間遠心分離して回収した。細胞ペレットを１ｍＬのＰＢＳ－Ｇに再懸濁し、ＰＢＳ－Ｇで約１０倍に希釈して１０^５細胞／ｍＬにした。血球計数器でカウントすることによりトリパノソーマ濃度を測定し、その後サンプルをそれに応じて１×人工ＣＳＦに希釈して、検量線分析に必要な濃度を得た。

［００９５］イメージングのためのサンプル準備：血液および人工ＣＳＦサンプルを使用して実験を行った。ホウケイ酸キャピラリーチューブ（内寸：高さ１ｍｍ×幅１０ｍｍ×長さ約３０ｃｍ、製品番号ＬＲＴ－１－１０－６７、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ＆Ｄｉｍｍｏｃｋ，Ｉｎｃ．）を、キャピラリーチューブの一端（流体ホルダ１２０）をワセリンゼリーに浸して端を塞ぐことによって準備した。ガラスの代わりに、アクリル製などの樹脂製キャピラリーを使用してもよい。キムワイプ（製品番号０６－６６６、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して余分なゼリーを除去し、チューブの端をパラフィルム（製品番号１３－３７４－１２、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で密封した。各チューブに４ｍＬのサンプルを準備した。血液サンプルは、３ｍＬの溶解バッファーと１ｍＬの未感染または感染した全血とを遠心分離管で混合した。ＣＳＦサンプルは、１００μＬのＷＢＣストック溶液をトリパノソーマに感染させた人工ＣＳＦに入れて、最終的に２×１０^４ＷＢＣ／ｍＬ（すなわち２０ＷＢＣ／μＬ）になるように混合した。キャピラリーチューブに装填する前に、混合物をピペットに出し入れすることにより、各サンプルを十分に混合した。その後、キャピラリーチューブの開放端をゼリーとパラフィルムを使用して密封した。その後、メタノールで湿らせたキムワイプ（製品番号Ａ４５２ＳＫ－４、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してガラスキャピラリーを洗浄し、デバイスに装着した。

［００９６］膣トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の培養：膣トリコモナスＧ３株（Ｂｅｃｋｅｎｈａｍ、ＵＫ１９７３、ＡＴＣＣ－ＰＲＡ－９８）を、１０％馬血清（Ｓｉｇｍａ）、１０Ｕ／ｍｌペニシリン－１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１８０μＭ硫酸第一鉄アンモニウム、および２８μＭスルホサリチル酸を添加した改変ＴＹＭ培地で３７℃^５２培養した。培養物を毎日継代し、約１×１０^６細胞／ｍＬの濃度に維持した。

［００９７］高スループットのレンズレス時間分解スペックル画像化プラットフォームの設計
［００９８］図１Ａ～１Ｂに示すように、画像化プラットフォーム１００は、５つの主要モジュールから構成される：（１）３つのレンズレスホログラフィックスペックルイメージャ１０４を有する走査ヘッド１０２、（２）線形並進ステージ１０６、（３）走査ヘッドハウジング１０９、（４）電子回路１１０、および（５）制御プログラム１１４を有するコンピューティングデバイス１１２。これらはそれぞれ、実施例で用いられる例示的な画像化プラットフォーム１００に関して以下に詳述される。

［００９９］（１）走査ヘッド１０２：３つの同一のレンズレスイメージャ１０４が互いに隣接して構築され、３Ｄプリンタ（Ｏｂｊｅｔ３０Ｐｒｏ、Ｓｔｒａｔａｓｙｓ）を使用して３Ｄ印刷された樹脂でなる走査ヘッドハウジング１０９に収容される。図１Ａに示すように、各レンズレスイメージャ１０４は、６５０ｎｍレーザダイオード（製品番号ＡＭＬ－Ｎ０５６－６５０００１－０１、Ａｒｉｍａ Ｌａｓｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、台湾桃園）を照明源１１６として使用し、出力電力は約１ｍＷである。放出光１１７は、３Ｄ印刷されたアパーチャ１１８を通ってその照射角度が制限され、隣接するイメージャ１０４への光漏れが回避される。流体ホルダ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃはそれぞれ、スクリーニングされるサンプル１０１（体液）が充填されたガラスキャピラリーチューブを含み、レーザダイオードの下約７ｃｍ（ｚ_１距離１２２）に配置される。イメージセンサ１２４は、１．６７μｍピクセルサイズと６．４ｍｍ×４．６ｍｍ（２９．４ｍｍ^２）の活性領域を有する１０メガピクセルのＣＭＯＳイメージセンサ（製品番号ａｃＡ３８００－１４ｕｍ、Ｂａｓｌｅｒ、アーレンスバーグ、ドイツ）であり、キャピラリーチューブの下に配置される。イメージセンサ１２４とガラスキャピラリーチューブの底面との間の空隙は、イメージセンサ１２４からサンプル１０１への熱伝達を低減するために約１～１．５ｍｍである。各イメージセンサ１２４は、発熱する複数の回路基板１２５を有するので、カスタムメイドのアルミニウムヒートシンク１２８が回路基板１２５の間に挿入され、熱を放散し、イメージセンサの誤動作および／または損傷を防ぐために走査ヘッド１０２の側面に配置される。

［００１００］（２）線形並進ステージ１０６：線形並進ステージ１０６は、２つの線形運動シャフトｌ３０ａ、ｌ３０ｂ（製品番号８５４２１、Ｍａｋｅｂｌｏｃｋ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、深セン、中国）、２つの線形運動スライダｌ３２ａ、ｌ３２ｂ（製品番号８６０５０，Ｍａｋｅｂｌｏｃｋ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、深セン、中国）、タイミングベルト１３４（製品番号Ｂ３７５－２１０ＸＬ、ＳｅｒｖｏＣｉｔｙ、Ｗｉｎｆｉｅｌｄ、ＫＳ）、２つのタイミングプーリｌ３６ａ、ｌ３６ｂ（製品番号６１５４１８、ＳｅｒｖｏＣｉｔｙ、Ｗｉｎｆｉｅｌｄ、ＫＳ）およびステッピングモータ１３８（製品番号３２４，Ａｄａｆｒｕｉｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＬＬＣ．、ニューヨーク市、ニューヨーク）から構築される。走査ヘッド１０２は、ねじを使用して運動スライダｌ３２ａ、ｌ３２ｂに取り付けられる。

［００１０１］（３）走査ヘッドハウジング１０９：走査ヘッド１０２のハウジング１０８は、３Ｄ印刷樹脂から作られる。画像化プラットフォームの外側シェル（画像化プラットフォーム１００のメインハウジング１０８）は、レーザカットされた１／４インチのアクリルシートから作られる。

［００１０２］（４）電子回路１１０：プリント回路基板（ＰＣＢ）１４２は、画像化プラットフォーム１００を自動化するようにカスタム構成されており、ＵＳＢ２．０を介してラップトップコンピュータ１１２に接続されたマイクロコントローラ１４４（ＴｅｎｅｓｙＬＣ、ＰＪＲＣ）、定電流回路で構築されたレーザダイオードドライバ回路１４６（製品番号ＬＭ３１７ＤＣＹＲ、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、およびステッピングモータドライバ回路１４８（製品番号ＴＢ６６１２、Ａｄａｆｒｕｉｔ）を具える。レーザダイオード１１６およびステッピングモータ１３８は、１２Ｖ電源アダプタ１５０を使用して電力供給される。金属酸化膜半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）で構築された様々なデジタルスイッチ１５６ａ、ｌ５６ｂ、ｌ５６ｃが、マイクロコントローラ１４４からのデジタル出力によって制御され、使用しないときにはレーザダイオード１１６およびイメージセンサ１２４への電力をカットする。具体的には、イメージセンサ１２４への電力を遮断するために、イメージセンサのＵＳＢ３．０ケーブルの電源線が遮断され、ＭＯＳＦＥＴベースのデジタルスイッチが電力線に挿入される。

［００１０３］（５）制御プログラム１１４：グラフィカルユーザインターフェース１１５を備えたＣ＃で書かれたウィンドウズアプリケーションは、ユーザが、現在のサンプルのスクリーニングを開始することに加えて、画像取得パラメータのカスタマイズ、回折パターンのライブビューの実行、スナップショット取得、取得の停止といった他の様々な機能を実現する。

［００１０４］画像取得サンプルが画像化プラットフォーム１００に装填され、３～４分の待機時間（溶解された全血については４分、人工ＣＳＦについては３分、詳細は図２を参照）の間沈降させた後、ユーザはＧＵＩ１１５の「記録」ボタンを押して、取得を開始する。スクリーニング中、デバイスは、空間的に隣接するものの間の距離が約４．７ｍｍである、３６の別個の位置でキャピラリーチューブｌ２０ａ、ｌ２０ｂ、ｌ２０ｃをスキャンするようにプログラムされている。これにより、合計スクリーニング量は３６（個別のスキャン位置）×２９．４ｍｍ^２（イメージセンサのＦＯＶ）×１ｍｍ（キャピラリーチューブのチャネル高さ）≒レンズレススペックルイメージャあたり１．０６ｍＬ、３つの並列イメージャの組み合わせで約３．１８ｍＬとなる。３６の位置のそれぞれで高フレームレート（約２６．６ｆｐｓ）を実現するために、イメージセンサのＦＯＶは２つの半部（すなわちピクセルの上部１３７４行と下部１３７４行）に分割され、それぞれの半部が６１フレーム（溶解血液の場合）または４１フレーム（ＣＳＦの場合）を順次（図９Ａ～９Ｄを参照）キャプチャする。

［００１０６］電力が供給されるとイメージセンサ１２４の温度が上昇し、液体サンプル１０１の温度勾配によって対流が誘発される（図１０Ａ～１０Ｃを参照）。これらの問題を軽減するために、本明細書で説明するように、走査位置のステッピング法と走査位置間のダウンタイム法が利用される。上記のように、３６の位置を一方向に走査するのではなく、画像化プラットフォーム１００は前後に走査する。３６の位置を、空間的に並んだ位置＃１、＃２、．．．、＃３６で表すとする。制御プログラム１１４が＃１、＃２、…、＃３６の順序で走査する代わりに、位置９個分の大きなステップサイズで走査するように画像化プラットフォーム１００をプログラムし、走査ヘッド１０２がこのステップサイズで前進できなくなったら、位置番号が最も小さい未走査の位置に戻るようにする。すなわち、画像化プラットフォーム１００は、最初に位置＃１、＃１０、＃１９、および＃２８を走査する。次に、走査ヘッド１０２は位置＃２に戻り、続いて＃１１、＃２０、および＃２９というように位置を変える。この走査パターンによって、走査ヘッド１０２がその近くに戻ってくる前に冷却するための十分な時間があり、キャピラリーチューブ１２０の所与のセクションでの熱の蓄積が大部分防止される。第２の手段として、走査位置ごとに６秒の「ダウンタイム」を加えて、イメージセンサ１２４が冷却できるようにする。所与の位置で取得を完了した後、イメージセンサ１２４への電力が、ＵＳＢ３．０ケーブルに追加されたＭＯＳＦＥＴベースのデジタルスイッチ１５６ａによって遮断される。６秒の待機時間の後、ステッピングモータ１３８が走査ヘッド１０２を次の位置へと移動させ、そこでイメージセンサ１２４への電力が回復されて、次の画像のセット１６８が取り込まれる。

［００１０７］実施例のテスト中に、取得された画像１６８は、処理のためにＳＳＤ１６０に保存される。非圧縮８ビット画像１６８をキャプチャする３つのイメージセンサ１２４はすべて、約４２１ＭＢ／秒の合計データレートを生成し、これはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）の平均書き込み速度をわずかに超える。そこで、イメージセンサ１２４ごとにラップトップコンピュータ１１２のＲＡＭ１５８にキューを作成して、受信画像データを一時的にバッファリングし、別のスレッドを作成して、バッファからＳＳＤに画像データを常時移動させる。ただし、前述の位置間のダウンタイムで残りのすべての画像データをＳＳＤに完全に保存することができるため、書き込み速度の制限によるテストごとの合計画像取得時間は増加しない。より時間効率の良い代替案として、取得された画像１６８をＲＡＭ１５８に一時的に保存する一方で、各画像シーケンスに対応するバッチで処理するためにＧＰＵ１６４に常時移動してもよい。このようにして、画像処理を画像取得と同時に実行することができ、テストあたりの合計時間を短縮することができる（上記の結果、図２、および表１を参照）。

［００１０８］ＣＭＡと深層学習ベースの識別を使用した画像処理
［００１０９］ＣＭＡアルゴリズム１６２は、ノイズの多いホログラムおよびスペックル干渉パターンにおける粒子移動から３Ｄコントラストを生成するために使用され、関心のある寄生虫に対応する信号を識別するために深層学習ベースの分類を適用する。一例として、図３は、溶解した全血からトリパノソーマを検出するために使用される手順を示しているが、他の用途設定（例えば、ＣＳＦにおけるトリパノソーマ検出）では、以下に詳述するように、手順に僅かな変更が加えられる。ＣＭＡアルゴリズム１６２は、入力として、各走査位置で各イメージセンサによって取得された生のホログラフィック回折パターンを取得する。Ａ_ｉ（ｉ＝１，．．．，Ｎ_Ｆ）は生のフレームとして表され、Ｎ_Ｆは各シーケンスで記録されるフレームの総数である。本実施例の実験では、アルゴリズムには次の手順が含まれる。

［００１１０］１．照明の変動と不均一性を軽減するためのホログラム前処理
［００１１１］各イメージセンサによって取得されたすべての８ビット生画像（図３Ａを参照）が、レーザダイオード照明源の不均一性を表す「背景」強度パターンによって分割される。このパターンは、ネガティブ対照実験においてガウス平滑化され、平均化された生画像１６８から予め計算さたものであり、他の実験で使用するために保存されている。その後、ホログラムはそれ自体の平均値によってさらに正規化（分割）され、照明補正されたホログラム

（ｉ＝１，．．．，Ｎ_Ｆ）が生成される（図３Ｂを参照）。

［００１１２］２．試験中の流体サンプルの軸方向距離の範囲の特定
［００１１３］溶解血液の場合、ほとんどの細胞破片は４分の待機時間で完全に沈降する傾向があるため（図２を参照）、「勾配のタムラ係数」（ＴｏＧ）オートフォーカス基準を適用して流体サンプルの底部のｚ距離を自動的に特定し（図３Ｃを参照）、これをｚ_ｂとする。次に、デジタルｚ走査の範囲を［ｚ_ｂ－２００μｍ、ｚ_ｂ＋１２００μｍ］として、５０μｍのステップサイズで定義する。これは、１ｍｍのチャネル高さに加えて、チャネル高さの誤差、チャネルの傾斜、オートフォーカスの誤差などを考慮して、±２００μｍの走査範囲を追加したものである。これにより、走査ヘッド１０２の設計および流体ホルダ１２０の配置において厳しい公差を必要としないため、ハードウェアの複雑さが大幅に低減され、安価なものとなる。

［００１１４］オブジェクト／粒子がまばらであるＣＳＦなどの透明媒体の場合、チャネルの底部へのオートフォーカスは困難な場合がある。したがって、各キャピラリーチューブのｚ_ｂ距離を事前に較正し（以下を参照）、実験全体で使用する。ｚ_ｂ距離が事前に較正されるため、つまりサンプルごとに適応的に計算されないため、５０μｍのステップサイズで、デジタルｚ走査の範囲をより広く［ｚ_ｂ－５００μｍ、ｚ_ｂ＋１５００μｍ］と指定する。なお、ｚ_ｂはデバイスの３つのチャネルごとに微妙に異なり、それぞれ較正される。

［００１１５］３．移動からコントラストを生成するＣＭＡアルゴリズム
［００１１６］前のステップで決定された走査されるｚ距離はｚ_ｊ（_ｊ＝１，．．．，Ｎ_ｚ）として表され、

の各要素は、ハイパスフィルタ処理されたコヒーレント伝達関数（図３Ｄ参照、詳細は後述）を用いてｚ_ｊのそれぞれにデジタル伝播され、以下を得る。
［０１１７］
（式１）

［００１１８］ここで、Ｐは角度スペクトルベースの逆伝播を表し、ＨＰはハイパスフィルタリングを表し、ｉ＝１、．．．、Ｎ_Ｆ、ｊ＝１、．．．、Ｎ_ｚである。

［００１１９］次に、ＯＦＮを用いた時間平均微分解析を適用し（図３Ｅ参照）、以下を得る：
［００１２０］
（式２）

［００１２１］ここで、δ_Ｆは減算フレーム間隔、

はＯＦＮ係数、γはＯＦＮに関連するパラメータで、溶解血液（γ＝２）とＣＳＦ（γ＝３）の実験にそれぞれ調整されている。時間平均は、運動性微生物の真の信号を維持しながら、ランダムな画像ノイズや不要な粒子／オブジェクトのランダムな動きを平滑化することにより、ＳＮＲを大幅に改善する。ＯＦＮはさらに、例えば、細胞破片などの強く散乱する不要な粒子／物体に起因する潜在的なフォルスポジティブ信号を抑制する（以下および図１１Ａ～１１Ｆ、１２Ａ～１２Ｄを参照）。このステップの結果Ｃ_ｊは、三次元画像スタックである。

［００１２２］４．ポストイメージ処理とセグメンテーション
［００１２３］ｚスタックＣ_ｊ（ｊ＝１，．．．，Ｎ_ｚ）は、主にハイパスフィルタ処理された逆伝播やフレーム減算を実行するときに残る生画像１６８の高周波ノイズに起因する低空間周波数バックグラウンドに悩まされている。したがって、図３Ｆ～３Ｈでは、３ＤのｚスタックＣ_ｊを、最初に平均減算ガウスカーネル（σ_ｚ＝２５０μｍ）でｚ方向にハイパスフィルタ処理し、ネガティブピクセルをゼロにクリップし、Ｄｊ（ｊ＝１，．．．，Ｎ_ｚ）を得る。次に、これが最大強度投影（ＭＩＰ）で２Ｄ画像Ｅに投影される。ハイパスフィルタリングが２Ｄ（平均減算ガウスカーネル、σ_ｘ＝σ_ｙ＝２５μｍ）で再度適用され、残りの背景が削除され、ネガティブのピクセルを再びゼロにクリップしＦを得る。

［００１２４］Ｆ内の候補信号点のセグメンテーションは、２Ｄメディアンフィルタリング（３×３ピクセルウィンドウ、ピクセルサイズ＝１．６７μｍ）、しきい値処理（溶解血液中のトリパノソームを検出するためのしきい値＝０．０１、ＣＳＦ中のトリパノソームを検出するためのは０．０２）に続いて、拡張（円盤形状の構造化要素、半径＝２ピクセル、ピクセルサイズ＝１．６７μｍ）を行い、連結されたピクセル領域を検索する。５ピクセル未満の連結領域は破棄される。これらの連結領域のピクセル値で重み付けされた重心を中心とする６４×６４ピクセルの画像パッチをＦから切り出し（２Ｄメディアンフィルタリングなし）、深層学習ベースの分類器による下流での識別に使用する。

［００１２５］５．運動性トリパノソーマを検出するための深層学習ベースの分類器
［００１２６］３つの畳み込みブロックとそれに続く２つの完全連結層で構成されるＣＮＮが構築され、運動性トリパノソーマによって作成された真の信号スポットを識別するようにトレーニングされる。詳細なネットワーク構造が図１３に示され、溶解血液とＣＳＦサンプルからトリパノソーマを検出するために個別にトレーニングされる（詳細は、以下の「トリパノソーマの識別のための畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）の構築とトレーニング」参照）。

［００１２７］６．テスト結果の生成
［００１２８］画像処理ステップ（図３Ａ～３Ｊを参照）は、各キャプチャ画像シーケンスおよび各イメージセンサ１２４について繰り返される。すべての位置から検出されたトリパノソーマの総数を合計し、スクリーニングされた総量（約３．１８ｍＬ）で割って、検出された寄生虫症を計算する。溶解血液の場合は、さらに溶解によって導入された希釈係数である４倍を掛けて、元の全血サンプルの寄生虫症を計算する。

［００１２９］７．運動性微生物の３Ｄ位置特定と動画生成
［００１３０］この技術は、以下のステップを用いて運動性微生物を３Ｄで位置特定し、それらの焦点の合った振幅および位相の動画を生成して、拡大観察する機能も提供する。対応するｚスタックＤ_ｊ（ｊ＝１，．．．，Ｎ_ｚ）を使用して、ＣＮＮ分類器によってポジティブと分類された各信号スポットについて、このスポットを中心としたｘ－ｙ方向に３０×３０ピクセル、かつｚ範囲全体（Ｎ_ｚ層）にまたがっている「列」のみを切り出す。次に、オートフォーカスメトリックを使用して各Ｎ_ｚ層を評価し、オートフォーカスメトリックの最大値に対応する層がその焦点位置に対応する。ＴｏＧとタムラ係数に基づく基準の両方を試したが、どちらもこの目的に非常に適している。現在のｚ位置特定の精度は、選択したｚステップサイズ（Δ_ｚ＝５０μｍ）により制限されるが、ｚセクションをより細かくすることによりさらに改善できる。現在検出されているｚ位置特定距離を初期推定として使用して、ハイパスフィルタ処理された逆伝播および差分分析（詳細は上記ステップ３．ＣＭＡアルゴリズム）を、より細かいｚステップサイズ５μｍで初期推定の周囲±１００μｍのｚ範囲で実行する。ただし、今回はＯＦＮを無効とする。すなわち、微生物のオブジェクト機能が最も強い最適な焦点距離では、ＯＦＮによって信号がわずかに弱まるという副作用があるため、式（２）の指数正規化係数を削除する。オートフォーカスは、以前と同様に、異なるｚ層上の同じ３０×３０ピクセル領域で再度実行される。新たに求めたｚ距離に加えて、先に求めたｘ－ｙの中心を、この運動性微生物の３Ｄ位置として用いる。追加のハイパスフィルタ処理された逆伝播および差分分析は、指定された各スポットの周囲の小さな関心領域（ＲＯＩ）でのみ実行すればよいため（例えば、ここで説明する実験では、５１２×５１２ピクセルのＲＯＩが使用される）、この３Ｄ位置特定は計算上効率的である。この３Ｄ位置特定機能は、動画の生成や（以下に詳述）、生物学的または生物医学的研究環境で微生物の挙動の研究に利用することができる。

［００１３１］得られた各運動性微生物の３Ｄ位置を使用して、記録された生の画像シーケンスＡｉ（ｉ＝１，．．．，Ｎ_Ｆ）またはその照明補正バージョン

の各フレームを、対応するｚ座標へデジタル逆伝播（ハイパスフィルタリングなし）することにより、検出された各微生物の動画を生成することができる。逆伝播された画像１６８の振幅および位相チャネルは、並べて表示す。生成された動画は、訓練を受けた医療関係者が利用可能な場合に、このプラットフォームの検出結果を確認するための追加の方法として利用することができる。

［００１３２］画像処理アルゴリズムのタイミング
［００１３３］ここでは、Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｅ ｉ７－６７００Ｋ中央処理装置（ＣＰＵ）１１１＠４．００ＧＨｚ、６４ＧＢのＲＡＭと、画像処理用の２つのＮｖｉｄｉａＧＴＸ１０８０ＧＰＵ１６４を搭載したラップトップ１１２を使用した。表１は、単一のＧＰＵ１６４を使用した場合と、２つのＧＰＵ１６４を同時に使用した場合の、画像処理ワークフローに必要な時間をまとめたものである。ここでは、画像取得時に、画像化デバイス１２４でキャプチャされた画像１６８は、ＣＰＵ ＲＡＭ１５８に一時的に格納され、走査位置に対応するバッチでＧＰＵメモリに常時移動され、そこでＧＰＵ１６４（または２つのＧＰＵ）で処理されることを想定している。このようにして、画像取得中に画像処理を同時に実行できるため、テストごとの所要時間を短縮することができる。この状況は、タイマーを開始する前に、ハードドライブ１６０からコンピュータ１１２のＲＡＭ１５８に既存のデータをプリロードすることで擬する（mimicked）ことができ、これは、処理の時間コストの合理的な推定が可能となる。溶解血液とＣＳＦでは取得した画像１６８の数と画像処理のワークフローが異なるため（前のサブセクションと方法を参照）、それらのタイミング結果が個別に計算される。表１では、溶解血液とＣＳＦのタイミング結果を「／」で分けている。

［００１３４］ｚ距離範囲の事前較正
［００１３５］画像化プラットフォーム１００の３つのチャネルのそれぞれのｚ距離範囲を事前に較正するために、底部外面を意図的に汚したキャピラリーチューブを１本取り付けた。次に、走査ヘッドがその走査範囲の両端と中央にあるときに３つのホログラムを撮影し、３つのホログラムをそれぞれ使用して汚れた表面にオートフォーカスした^{５３、５４}。この場合の予想されるｚ_ｂは、平均オートフォーカス距離から、ガラスキャピラリーチューブの壁の厚さを加算して算出された。この較正ステップは１回だけ実行する必要がある。

［００１３６］ハイパスフィルタ処理された計算逆伝播
［００１３７］回折パターンは、２Ｄ高速フーリエ変換（ＦＦＴ）、自由空間伝達関数使用した空間周波数領域での行列乗算、および逆ＦＦＴを含む角度スペクトル法を使用して、与えられたｚ距離に逆伝播される。ただし、トリパノソーマのおおよそのサイズが既知であるため、空間周波数領域の伝達関数にハイパスフィルタを追加して、他のノイズやアーティファクトを抑制する。

［００１３８］自由空間伝搬のコヒーレント伝達関数は以下の通りである。

［００１４０］ここで、ｚは伝搬距離、λは光波長、ｆ_ｘとｆ_ｙはそれぞれｘとｙの空間周波数である。

［００１４１］Ｈの上に、不要な干渉パターンを抑制するために、Ｈ_１とＨ_２の２つのハイパスフィルタが追加されている。Ｈ_１は２Ｄガウスハイパスフィルタで、イメージセンサの保護ガラスや流体を充填したキャピラリーチューブの様々な界面など、光路の様々な表面からの反射による低周波干渉パターンを抑制するために使用される。Ｈ_１は次の式で与えられる。

［００１４２］

［００１４３］ここで、σ_１＝２５．０５μｍである。Ｈ_２は、製造されたガラスキャピラリーチューブの望まない溝に起因する干渉パターンを抑制するために用いられる。これらの溝は、キャピラリーチューブの軸方向に沿って配向されており、キャプチャ画像のｙ方向に対応するため、それらのエネルギーは、空間周波数領域のｆ_ｘ軸の近くにほとんど集中している。そのため、Ｈ_２では、次式で与えられるｆ_ｙへのハイパスフィルタリングを実行する。

［００１４５］

［００１４５］ここで、σｉ＝１１６．９μｍである。

［００１４６］Ｈ、Ｈ_１、Ｈ_２を組み合わせた最終的なコヒーレント伝達関数は以下となる。
［００１４７］

［００１４８］ここで、ｍｉｎ｛Ｈ_１，Ｈ_２）は、Ｈ_１またはＨ_２から小さい方のフィルタ値を選択する。

［００１４９］オブジェクト関数正規化（ogject function normalization：ＯＦＮ）を用いた計算機運動分析（computational motion analysis：ＣＭＡ）アルゴリズムでの減算フレーム間隔δ_Ｆと合計分析フレームＮ_Ｆの最適化
［００１５０］減算フレーム間隔δ_Ｆおよび合計分析フレームＮ_Ｆは、検出される寄生虫（または微生物）に対して最適化する必要があるパラメータである。δ_ＦとＮ_Ｆは、以下を通じて減算時間間隔Δｔと合計分析時間Ｔに関連する。

［００１５１］

［００１５２］

［００１５３］ここで、Ｒは記録されたシーケンスのフレームレートである（すなわち本システムでは２６．６ｆｐｓ）。δ_Ｆ（またはΔｔ）を最適に選択することにより、対象の微生物の特徴的な移動による信号を、イメージセンサのノイズに加えて、サンプル内の背景オブジェクト／粒子の不要なランダムな動きを含むノイズに対して増幅することができる。一方、Ｎ_Ｆ（またはＴ）は、時間平均のウィンドウを決定する。一般に、Ｎ_Ｆが大きいほど、平均化によってランダムなバックグラウンドノイズが減少する。しかし同時に、微生物が方向性のある動きのためにＴの間に元の場所から離れて泳いだ場合、有用な信号が弱くなる可能性もある。

［００１５４］δ_ＦおよびＮ_Ｆは、血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）について、ＯＦＮを使用したＣＭＡによって処理された画像の平均信号対雑音比（ＳＮＲ）を評価することにより、トリパノソーマ検出用に最適化される（図３Ｈに対応）。信号はセグメント化されたホットスポットの最大値として定義され、一方でノイズは信号領域を除いた背景の平均値として定義される。ＳＮＲは、２０・ｌｏｇ_１０（信号／ノイズ）（ｄＢ）として計算される。１０^４ｍＬトリパノソーマ添加血液実験では１つの画像視野（ＦＯＶ）から２０個のホットスポットをランダムに選択し、１０^４ｍＬトリパノソーマ添加人工ＣＳＦ実験では４０個のホットスポットがランダムに選択した。ＳＮＲは、血液とＣＳＦでそれぞれ平均化した。δ_ＦおよびＮ_Ｆを変化させて、平均ＳＮＲに対するそれらの効果を観察した（図９Ａ～９Ｄを参照）。血液とＣＳＦのいずれかでδ_ＦおよびＮ_Ｆをそれぞれ変化させても、平均ＳＮＲの計算には同じホットスポットのセットが一貫して使用された。

［００１５５］図９Ａ～９Ｂに示すように、溶解血液の場合、δ_Ｆ＝４（Δｔ＝０．１５ｓ）およびＮ_Ｆ＝６１フレーム（Ｔ＝２．２９ｓ）が、３５．２９ｄＢという最高のＳＮＲをもたらす。図９Ｂは、より大きなＮ_Ｆ（Ｔ）を使用した場合、平均ＳＮＲはまだ増加する可能性があることを示唆する。しかしながら、診断ツールとしての本プラットフォームの実用的な時間的制約と、時間経過に伴うサンプルの加熱のため、画像シーケンスごとに６１フレームしか記録されない。

［００１５６］ＣＳＦ（図９Ｃ～９Ｄを参照）の場合、δ_Ｆに関して同様の効果が観察され、δ_Ｆ＝４でＳＮＲが最大になる。しかしながら、図９Ｄは、Ｎ_Ｆ＞４１の場合、ＳＮＲがＮ_Ｆの関数として低下することを示しており、したがって、最適なＮ_ＦはＮ_Ｆ＝４１として選択される。さらに、ＣＳＦの最適なＳＮＲ（δ_Ｆ＝４、Ｎ_Ｆ＝４１）は４５．００ｄＢであり、血液中の最適ＳＮＲよりも約１０ｄＢ高くなっている。これらの観察結果から、ＣＳＦは（溶解血液と比較して）透明な媒体であるため、低ノイズと高ＳＮＲを達成するために必要な平均化が少ない（つまり、Ｎ_Ｆが小さい）と結論付けることができる。したがって、Ｎ_Ｆが４１を超えると、平均化によるＳＮＲの向上は少なくなり、主に微生物が元の場所から徐々に移動するため、ＳＮＲを低下させる他の要因が支配的になる。

［００１５７］潜在的フォルスポジティブを排除するためのオブジェクト関数正規化（ＯＦＮ）
［００１５８］ＯＦＮは、サンプル内で粒子／オブジェクトが強く散乱するために発生する可能性のあるフォルスポジティブ（誤検出）を減らすために不可欠である（ＯＦＮを使用した場合と使用しない場合の結果の比較については、図１１および１２を参照）。照明がわずかに時間変化し、流体が漂っている状態では、溶解していない細胞、細胞破片の塊、ＣＳＦサンプル中の添加された白血球（ＷＢＣ）、さらには気泡などの強い散乱性の粒子／オブジェクトが、ＣＭＡで処理されたときに強いコントラスト（ホットスポット）を生成する場合がある。これらのホットスポットは、トリパノソーマが作るものと似ており、誤検出の原因となる。したがって、散乱が弱く運動が強い目的の寄生虫（特にトリパノソーマ）を、散乱が強く運動が弱い他の不要なオブジェクトと区別するために、オブジェクト関数自体を使用して、式（２）に対応するフレーム減算を正規化する。適切に選択されたγの指数関数は、散乱の強いオブジェクトをさらに選択的に抑制する。溶解血液中のトリパノソーマ検出の場合、「トゥルーポジティブ」信号と潜在的な「フォルスポジティブ」信号の区別の視覚的判断に基づいてγ＝２を選択し、ＣＳＦ中のトリパノソーマ検出ではγ＝３を選択した。

［００１５９］トリパノソーマ識別のための畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）の構築とトレーニング
［００１６０］トレーニング／検証のためのポジティブ画像の生成
［００１６１］ポジティブ画像は、添加されたトリパノソーマの濃度が比較的高い実験データから手動で識別される。血液については、添加されたトリパノソーマ濃度が約１０^４／ｍＬの１回の試験（すなわち、３つのキャピラリーチューブを使用した１回の走査実験）が使用された（図５で報告されたデータと重複しない）。ＣＳＦについては、人工ＣＳＦにトリパノソーマ濃度を約１０^４／ｍＬに添加した１回の試験を使用し、試験で行ったようにサンプルにＷＢＣを添加しなかった。体液の種類ごとに、ＯＦＮを使用したＣＭＡアルゴリズム１６２を使用して画像を処理した後、画像のフィルタリングとセグメンテーションを行い（詳細は本書の説明を参照）、最初に検出された４０００個の候補スポットについて動画を生成した。２人のアノテーターが共同でこれらの動画を見て、細長い体と速い拍動を特徴とする運動性トリパノソーマの存在を各動画で判断した。各動画の結果のラベルは、「ポジティブ」（動くトリパノソーマが存在するという確信が高い）、「ネガティブ」、または「不確実」のいずれかとなった。１つの動画に複数のトリパノソーマが共存する場合には、トレーニング時にネットワークが混乱しないように「ネガティブ」とラベル付けした。ＣＳＦに関する動画では、透明な媒体にホログラフィック再構成の品質が高いため、アノテーションがはるかに簡単であった。一方、血液では、動画にトリパノソーマが含まれていないことを断言するのは困難なため、結果のラベルはほとんど「ポジティブ」または「不確実」であった。手動でアノテーションを行った後、「ポジティブ」とラベル付けしたものだけをトレーニング／検証用に保持した。「不確実」と「ネガティブ」は破棄した。これにより、血液のポジティブ画像は３６９７枚、ＣＳＦのポジティブ画像は３８９０枚になった。なお、これらの動画はラベリングのみを目的としており、トレーニング／検証ライブラリの構築には、ＣＭＡから得られた２Ｄ最大強度投影（ＭＩＰ）画像パッチを使用してしている。次に、４対１の比率を使用して、画像をトレーニングセットと検証セットにランダムに分割した。最後に、データ拡張を実行して、画像を水平、垂直、および水平と垂直の両方にミラーリングすることでトレーニング画像の数を増やすデータ補強を行い、血液とＣＳＦについて、それぞれ４倍の大きさのポジティブトレーニングライブラリを作成した。

［００１６２］トレーニング／検証のためのネガティブ画像の生成
［００１６３］ネガティブトレーニング／検証画像は、すべてネガティブ参照実験から得られたものである（図５で報告されたデータとの重複はない）。血液については、１回のネガティブ対照実験を用いてトレーニング／検証ライブラリを作成し、ＣＳＦについては試験ごとの「フォルスポジティブ（false positives）」が少ないため、２回のネガティブ対照実験を用いた。ネガティブ画像をセグメント化する際に、より多くの画像を生成するために、低い強度しきい値（血液の場合は０．００８、ＣＳＦの場合は０．０１５）を使用し、血液実験では５８３４、ＣＳＦ実験では２５８６のネガティブ画像を生成した。これらの画像を、血液とＣＳＦにそれぞれ４対１の比率でトレーニングセットと検証セットにランダムに分割した。ポジティブセットと同様に、３つの異なる方法で画像をミラーリングすることにより、ネガティブトレーニングライブラリに対してデータ拡張を実行し、ネガティブトレーニングライブラリのサイズを４倍に拡大した。さらに、トレーニングされた分類器の未知のデータに対するロバスト性を向上させるために、ネガティブ画像を複製し１．５倍することによるデータ拡張も行った。したがって、ネガティブトレーニングライブラリの拡大係数の合計は８倍となる。

［００１６４］ネットワークアーキテクチャ
［００１６５］３つの畳み込みブロックと２つの完全連結（ＦＣ）層でＣＮＮ１６６を構築した（図１３を参照）。各畳み込みブロックは、畳み込み層（フィルタサイズ＝５×５、ストライド＝１、１６チャネル）と、それに続く正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）層および最大プーリング層（フィルタサイズ＝３×３、ストライド＝２）で構成される。第１のＦＣ層には１２８個の出力ノードがあり、第２のＦＣ層には２つの出力ノードがあり、２つのクラス（トリパノソーマおよび非トリパノソーマ）を表す。次に、出力はソフトマックス層に通され、クラス確率を生成する。トレーニング時に第１のＦＣ層にドロップアウト（ｐ＝０．５）を追加した。同じネットワークアーキテクチャを、血液およびＣＳＦ内のトリパノソーマ信号を識別するために個別にトレーニングした。

［００１６６］ネットワークトレーニング
［００１６７］ＣＮＮ１６６は、ＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗ（バージョン１．７．０）およびＰｙｔｈｏｎ（バージョン３．６．２）で実装した。畳み込みカーネルは、切断正規分布（平均＝０、標準偏差＝５．５×ｌ０^－３）を使用して初期化した。ＦＣ層の重みは、Ｘａｖｉｅｒイニシャライザを使用して初期化した。すべてのネットワークバイアスはゼロに初期化した。学習可能なパラメータは、学習率１０^－３の適応モーメント推定（Ａｄａｍ）オプティマイザを用いて最適化した。バッチサイズは６４で、ネットワークは収束するまで１万回の反復トレーニングを行った。

［００１６８］ＣＭＡアルゴリズムのＣＵＤＡアクセラレーション
［００１６９］ＣＭＡアルゴリズム１６２を、ＣＵＤＡ Ｃ＋＋を用いて加速し、デュアルＮｖｉｄｉａＧＴＸ１０８０グラフィックス処理ユニット１６４（ＧＰＵ）を備えたラップトップコンピュータ１１２上で実行した。ＣＭＡアルゴリズム１６２で最も計算量の多い数学演算は、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）と逆ＦＦＴ（ＩＦＦＴ）であった。これらの演算を実行するために、ＮｖｉｄｉａＣＵＤＡ高速フーリエ変換ライブラリ（ｃｕＦＦＴ）ライブラリを使用した。画像のリダクション（すなわち、全要素の合計）を実行し、さらに画像の平均値を計算して正規化するためにＴｈｒｕｓｔライブラリを使用した。実数値や複素数値の画像に対するその他の様々な基本的な数学演算は、カスタムメイドのＣＵＤＡカーネル関数を使用して実装した。ＣＵＤＡコードは、計算を並列化し、効率を最大化し、ＧＰＵメモリ使用量を最小化するように慎重に最適化された。例えば、回折パターンを各ｚ距離に逆伝播する場合、ハイパスフィルタ処理されたコヒーレント伝達関数（式３～８）をｚ距離ごとに１回だけ計算し、これを時系列のすべてのフレームに再利用した。ＯＦＮ（式２）を用いて時間平均微分解析を実行する場合、パフォーマンスを犠牲にすることなく、所与の時間に（δ_Ｆ＋１）個の逆伝播画像（つまりＢ_ｉ）のみをＧＰＵメモリに保存すればよいため、ＧＰＵのメモリ使用量が減り、さらに大規模な問題（例えば、より多くのフレームを含む画像シーケンスや、より多くのｚ距離でのＣＭＡの実行）を処理したり、メモリの少ないローエンドのＧＰＵを使用したりすることが可能になった。

［００１７０］ＦＦＴを実行する前に、生の画像１６８（垂直：１３７４ピクセル、水平：３８４０ピクセル）を１５３６×４０９６ピクセルのサイズにパディングした。パディングされた画素には、不連続性によるアーチファクトを低減するために、パディングされていない画像の平均値を割り当てた。新しいディメンションは２と３の累乗（１５３６＝２^９×３と４０９６＝２^１２）であるため、ＦＦＴ処理はパディングなしの場合と比較して約２．４倍高速化された。ＩＦＦＴの完了後、画像１６８は他の画像処理ステップのために元のサイズに切り取られた。

［００１７１］イメージセンサによるサンプル加熱のＣＯＭＳＯＬシミュレーション
［００１７２］イメージセンサ１２４の温度は、オンになると上昇し、その上に温度勾配が生じる。そのため、ガラス管１２０内の流体サンプル１０１が徐々に流れ始め、ガラス管内の粒子が方向性をもって移動する。結果として、ＣＭＡアルゴリズム１６２によって生成された運動性微生物の信号は、「スミアリング」効果によって弱くなる。その間、他の不要な粒子の動きにより、バックグラウンドノイズとフォルスポジティブが増加し、望ましくない結果となる。対流による流体サンプル１０１の速度は、流体チャネルの高さに関係する。チャネル壁の近くの抗力により、チャネルが薄いほど、加熱開始後の特定の時間における流体速度は低下する。ただし、トレードオフとして、チャネルを薄くするとスクリーニングのスループットも低下する。

［００１７３］ＣＯＭＳＯＬマルチフィジックスシミュレーションソフトウェアを使用して、チャネル内の流速を推定した。図１０Ａに示すように、水で満たされたチャネル（内高１ｍｍ、内幅１０ｍｍ、均一な厚さ０．６７ｍｍのシリカ壁に囲まれている）を作成した。チャネルのＡ６ｃｍのセクションを、シミュレーションの対象領域として選択した。チャネルの中央に、ＣＭＯＳイメージセンサ１２４（表面温度３１３Ｋの一定の熱源としてモデル化）をチャネル底面の１ｍｍ下に配置した。約３１３Ｋは、赤外線カメラ（ＦＬＩＲ Ｃ２）で実験的に測定した、画像取得中のイメージセンサ１２４の最高温度である（「」方法」欄を参照）。基準温度（室温）は２９３Ｋとした。チャネル内の水とチャネル外の空気のモデルには非等温流を用いた。

［００１７４］図１０Ｂ～１０Ｃに、このシミュレーションの結果を示す。チャネル内の最大流体速度の大きさが示され、最悪のシナリオを表している。予想通り、流体速度は、加熱開始後の時間とチャネル高さの関数として増加する（図１０Ｂを参照）。加熱開始後ｔ＝７秒での最大流体速度とチャネル高さの関係を（ｃ）にさらにプロットしたところ、この時間は画像取得時間にほぼ一致した（イメージセンサのＦＯＶの上半分から下半分に切り替わるときに時間差がある）。ここでも、ｔ＝７秒での流体速度は、流体速度が最大になる最悪のシナリオを表している。図１０Ｃに示すように、チャネル高さが１ｍｍの場合、流体の速度は約２．９μｍ／ｓである。６１フレームの１つの画像シーケンスの期間（約２．３秒）において、流体の流れによる変位は、トリパノソーマの長さと比較して許容範囲内の上限約６．７μｍになる。逆に、チャネル高さが２ｍｍの場合、変位は上限約２８μｍとなり、強いスミアリングと信号の減少をもたらす。その結果、本書の実験ではチャネル高さを１ｍｍとして選択した。

［００１７５］本発明の実施形態を図示し説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等物を除いて、限定されるべきではない。したがって、添付の請求項の範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に様々な変更および修正を加えることができる。例えば、実施形態に記載された構成要素のすべてが必須ではなく、代替的な実施形態では、記載された構成要素の任意の適切な組み合わせを含んでもよいし、構成要素の一般的な形状および相対的なサイズを変更してもよい。 同様に、図面に見られる寸法およびその他の制限は、本発明の範囲を限定するものではない。

Claims (21)

1. サンプル中の運動性オブジェクトのラベルフリー検出のための画像化プラットフォームであって、
   １つまたは複数の実質的に光学的に透明なサンプルホルダと、
   １つまたは複数のコヒーレント光源および当該１つまたは複数のコヒーレント光源に関連付けられた対応するイメージセンサを含む可動の走査ヘッドと、
   前記１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダに沿って前記可動の走査ヘッドを並進させるように構成された並進ステージと、
   前記イメージセンサで取得された時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを受信するように構成されたコンピューティングデバイスとを具え、当該コンピューティングデバイスが、前記１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダ内の運動性オブジェクトの三次元（３Ｄ）コントラストマップを生成するように構成された計算機運動分析ソフトウェアを有し、前記コンピューティングデバイスがさらに、前記三次元（３Ｄ）コントラストマップ内の運動性オブジェクトを識別する深層学習ベースの分類ソフトウェアをさらに有することを特徴とする画像化プラットフォーム。
2. 前記サンプルが生物学的流体を含む、請求項１に記載の画像化プラットフォーム。
3. 前記生物学的流体が血液を含む、請求項２に記載の画像化プラットフォーム。
4. 前記生物学的流体が脳脊髄液を含む、請求項１に記載の画像化プラットフォーム。
5. 前記１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダが、１つまたは複数のキャピラリーチューブを含む、請求項１に記載の画像化プラットフォーム。
6. 前記走査ヘッドは、前記１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダに光を投射する、レーザダイオード、発光ダイオード、およびレーザからなる群から選択される１つまたは複数の光源を含む、請求項１に記載の画像化プラットフォーム。
7. 前記並進ステージが、前記可動の走査ヘッドを保持する１つまたは複数の線形運動シャフトと、ベルトを介して前記可動の走査ヘッドに接続されたステッピングモータとをさらに具える、請求項１に記載の画像化プラットフォーム。
8. 前記可動の走査ヘッドは、前記イメージセンサ用の１つまたは複数のヒートシンクをさらに具える、請求項１に記載の画像化プラットフォーム。
9. 前記計算機運動分析ソフトウェアは、物体機能正規化（ＯＦＮ）を実行して、サンプル内の強く散乱する物体を抑制する、請求項１に記載の画像化プラットフォーム。
10. 請求項１に記載の画像化プラットフォームを使用する方法であって、
    流体サンプルを前記１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダに装填するステップと、
    前記可動の走査ヘッドを前記１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダの異なる領域に移動させるステップと、
    前記イメージセンサを使用して、時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを取得するステップと、
    前記深層学習ベースの分類ソフトウェアを使用して、サンプル内の運動性オブジェクトを識別するステップとを含むことを特徴とする方法。
11. 前記流体サンプルが、装填前に最初に溶解緩衝液に曝露される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記可動の走査ヘッドを並進させる前に前記流体サンプルを沈降させる、請求項１０に記載の方法。
13. 前記深層学習ベースの分類ソフトウェアが、サンプル内の運動性オブジェクトのカウントを出力する、請求項１０に記載の方法。
14. 前記深層学習ベースの分類ソフトウェアが、サンプル内の運動性オブジェクトの濃度を出力する、請求項１０に記載の方法。
15. 前記深層学習ベースの分類ソフトウェアが、サンプルのポジティブまたはネガティブの分類を出力する、請求項１０に記載の方法。
16. 前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項１０に記載の方法。
17. 前記サンプルが環境サンプルである、請求項１０に記載の方法。
18. 前記運動性オブジェクトが寄生虫を含む、請求項１０に記載の方法。
19. サンプル中の運動性オブジェクトを検出する方法であって、
    １つまたは複数のコヒーレント光源および当該１つまたは複数のコヒーレント光源に関連付けられた対応するイメージセンサを含む可動の走査ヘッドを使用して、サンプルの複数の時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを取得するステップと、
    前記イメージセンサによって取得された時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを受信するように構成されたコンピューティングデバイスを用いて、複数の時変ホログラフィックスペックルパターン画像シーケンスを処理するステップとを含み、前記コンピューティングデバイスは、１つまたは複数の光学的に透明なサンプルホルダ内の運動性オブジェクトの三次元（３Ｄ）コントラストマップを生成するように構成された計算機運動分析ソフトウェアを有し、前記コンピューティングデバイスはさらに前記三次元（３Ｄ）コントラストマップ内の運動性オブジェクトを識別するための深層学習ベースの分類ソフトウェアを有することを特徴とする方法。
20. 前記コンピューティングデバイスが、前記運動性オブジェクトのカウントを出力するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記コンピューティングデバイスが、前記サンプル中の運動性オブジェクトの濃度を出力するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

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