KR20120052221A - 헤모글로빈 조성물 - Google Patents

헤모글로빈 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20120052221A
KR20120052221A KR1020127000555A KR20127000555A KR20120052221A KR 20120052221 A KR20120052221 A KR 20120052221A KR 1020127000555 A KR1020127000555 A KR 1020127000555A KR 20127000555 A KR20127000555 A KR 20127000555A KR 20120052221 A KR20120052221 A KR 20120052221A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hemoglobin
oxygen
fraction
molecules
stabilizer
Prior art date
Application number
KR1020127000555A
Other languages
English (en)
Inventor
아브라함 아부쵸우스키
스티븐 슬로쉬버그
케이쓰 오하리
Original Assignee
프로롱 파마슈티컬스, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42779888&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20120052221(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 프로롱 파마슈티컬스, 엘엘씨 filed Critical 프로롱 파마슈티컬스, 엘엘씨
Publication of KR20120052221A publication Critical patent/KR20120052221A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/10—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Anti-Oxidant Or Stabilizer Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 헤모글로빈, 특히 PEG화된 헤모글로빈을 함유하는 조성물을 제공한다. 상기 PEG화된 헤모글로빈 분자는 상기에 결합된 산소 또는 일산화 탄소를 상기와 근접해 있는 조직으로 운반할 수 있다. 본 발명의 예시적인 PEG화된 헤모글로빈 제형은 바이러스 불활성화된다. 본 발명의 다양한 조성물은 하나 이상의 수용성 중합체와 결합될 수 있는 산소 제거된 헤모글로빈을 포함한다. PEG화된 헤모글로빈은 상기 헤모글로빈 분자의 철 원자가 산소 또는 임의의 다른 종에 결합되지 않은 종들, 및 산소 이외의 종, 예를 들어 일산화 탄소가 상기 철 원자에 결합된 헤모글로빈 분자를 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 PEG화된 헤모글로빈의 저장성, 등장성 또는 고장성 용액으로서 제형화된다. 상기 조성물은 조직 및/또는 기관의 산소 공급을 제공함으로써 질병, 손상 및 상해를 치료 및/또는 개선시키기에 유용하다.

Description

헤모글로빈 조성물{HEMOGLOBIN COMPOSITIONS}
본 발명은 산소 또는 일산화 탄소를 조직으로 전달할 수 있는 중합체-개질된 단백질, 예를 들어 헤모글로빈을 포함하는 대용 혈액 및 소생액 제형 분야에 있다.
본 출원은 2010년 6월 9일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 61/185,547 호에 대한 우선권을 청구한다.
외상은 미국에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 높은 사망률의 주 이유는 손상 시기와 의료 시설에서의 수술 시기 사이에 환자의 조직 산소공급(oxygenation)을 유지할 수 없는 것이다. 산소 공급이 결여된 결과 조직 손상, 기관 부전 및 사망이 발생한다. 따라서, 외상성 쇼크를 치료함에 있어서 주요 초점은 상기 환자의 말단 조직 및 기관까지 가능한 한 많은 산소를 제공하는 치료제를 투여하는 것이다.
산소공급을 유지하는 명백한 접근법은 수혈이다. 그러나, 광범위한 이유로, 보관된 인간 혈액을 의료 시설 밖에서의 용도에 통상적으로 사용하는 것을 비현실적으로 만드는 중대한 실제적인 치료 관련 혈액 사용 문제들이 존재한다. 외상을 치료하기 위한 표준적인 접근법은 주로 등장액, 고장액 또는 고삼투액(hyperoncotic solution)의 투여를 통한 혈관 내 순환 부피의 유지를 수반한다. 이러한 치료는 허혈 및 기관 부전을 효과적으로 방지하기에 충분히 내부 조직 및 기관의 산소 공급을 균일하게 증가시킬 수 없다.
그 결과 외상 환자의 산소 운반 능력을 복원할 수 있는 헤모글로빈 기재 산소 운반체(HBOC)를 개발하는데 큰 노력이 있어왔다. HBOC는 보관된 인간 혈액 사용에 대해 다수의 이점, 예를 들어 감소된 질병 전염 기회, 비 면역 반응성, 혈액형 분류 불필요, 및 가장 중요하게는 감소된 보관 요구에 따른 개선된 유효성이 있다. 다수의 그룹들이 HBOC를 개발해 왔으며 여러 회사가 그들의 헤모글로빈 기재 제품을 대용 혈액으로서 개발하고자 임상 시험을 수행하여 왔다. 인간 또는 동물 혈액으로부터 단리된 헤모글로빈(HGB), 또는 합성적으로 생산된 산소 운반체, 예를 들어 퍼플루오로카본이, 임상 시도된 2 가지 유형의 대용 혈액들이다. 다른 적혈구 대용물들이 또한 개발되었으며 환자에게 사용하기 위해 특성화 되었다(예를 들어 문헌[Red Blood Cell Substitutes, 1998,(Eds.) A.S. Rudolph, R. Rabinovici, and G.Z. Feuerstein, Dekker, New York, N.Y.] 참조). 상기와 같은 적혈구 대용물은 표준 의료 요법들, 예를 들어 수혈용 혈액 또는 혈액 제품과 함께 사용될 수 있다. 구체적인 예로서, 엔존사(Enzon, Inc.)(Piscataway, N.J.)는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-개질된 소 헤모글로빈(PEG-HGB로 약기함)을 개발하였다. PEG-HGB는, 예를 들어 미국 특허 제 5,386,014 및 5,234,903 호(Nho et al.)에 개시된 바와 같이, PEG의 가닥들을 HGB 분자의 표면에 가교결합시키는 방법에 의해 제조된다. 다른 구체적인 예로는 헤모퓨어(Hemopure)TM 및 옥시글로빈(Oxyglobin)(Biopure, Cambridge, Mass.)이 있다. 그러나 이들 제품 중 어느 것도 조직 산소공급에 현저한 증가를 생성시키는데 확립되지 못했으며 어느 것도, 효과가 없거나 현저한 독성의 발생으로 인해, FDA 승인을 받지 못했다.
적합한 HBOC의 결여는 조직 산소공급의 생리학, 및 쇼크 및 잇따르는 조직 손상에 관련된 중요한 기전들에 대한 우리의 이해를 위한 기본적인 연구에 큰 장애가 되었다. 임상 시험들을 겪고 현저한 독성을 생성시킨 HBOC에 관하여, 이들 독성의 이유에 대한 위협적인 정보를 얻을 수 있다.
따라서, 외상 유발된 출혈의 치료 방법은 현재 불충분하다. 수혈이 조직에 산소를 복원시킬 수 있고 상실된 순환 부피를 다시 보충할 수 있지만, 의료 시설 밖에서의 출혈을 치료하기 위한 수단으로서 혈액을 사용하는 것은 중대한 실제 상의 문제가 있다. 무엇보다도 입수할 수 있는 혈액의 양이 일반적으로 제한되고 면역 반응을 통해 상기 환자가 사망하는 것을 방지하기 위해서는 치료받는 각 사람들에 대한 혈액형 분류가 필요하다. 그러나 외상 환자를 의료 시설 밖에서 치료하기 위해 혈액을 사용하는데 있어서 가장 중요한 문제는 상기 조직 사용에 본질적인 보관 및 패키징 제약이다. 따라서, 수혈은 외상 환자의 치료에 관하여 통상적으로 사용되지 않는다.
실제로, 외상을 치료하기 위한 표준적인 접근법은 주로 등장액, 고장액 또는 고삼투액의 투여를 통한 혈관 내 순환 부피의 유지를 수반한다. 이러한 접근법은 단기간에 순환 부피를 재보충하고자 하는 것이며 또한 혈류 및 따라서 조직으로의 산소 전달을 증가시킬 수 있다. 그러나, 출혈이 심한 경우, 상기 치료는 허혈 및 기관 부전을 효과적으로 방지할 정도로 충분히 내부 조직 및 기관의 산소공급을 균일하게 증가시킬 수 없다. 결과적으로, 우리는 심한 외상을 입은 개인들로부터 높은 사망률을 갖게 된다.
수년간 외상환자에게 산소를 제공할 수 있는 헤모글로빈 기재 산소 운반체(HBOC)를 개발하고자 하였다. HBOC는 보관된 인간 혈액의 사용에 대해 외상 치료를 위한 혈액 사용과 관련된 다수의 문제 없이 다수의 이점을 갖는다. 이러한 이점은 감소된 질병 전염 기회, 비 면역 반응성, 혈액형 분류 불필요, 및 가장 중요하게는 감소된 보관 요구에 따른 개선된 유효성을 포함한다. 이상적으로 HBOC는 산소와 결합하여 필요한 조직에 상기 산소를 방출할 수 있어야 한다. 상기 운반체는 대부분의 환경 조건, 특히 외상 환자가 치료를 필요로 하는 치료 조건에 관하여 통상적으로 마주하게 되는 조건 하에서 수개월간 안정한 형태인 용액으로 사용할 준비가 되어 있어야 한다.
수년간에 걸쳐 고유 또는 재조합 인간 헤모글로빈, 인간 헤모글로빈으로부터 변형된 형태 또는 다른 종들로부터의 헤모글로빈의 변형된 형태를 사용하여 산소 치료제로서 HBOC를 개발하고자 하는 다수의 시도가 수행되어 왔다. 변형되지 않은 헤모글로빈을 산소 치료제로서 사용할 수 있으나, 상기는 NOx와 결합하여 심한 혈관수축 및 고혈압을 유발할 수 있다. 헤모글로빈은 그의 분자량 때문에 중대한 독성, 특히 신장에 대해 독성을 유발하고 상기 신장에서 사구체 기관을 막아버린다. 결과적으로, 인간에서 시험된 대부분의 헤모글로빈은 그의 반감기가 연장되고 그의 독성이 감소하도록 변형된다.
본 발명의 목적은 대용 혈액으로서 작용하고/하거나 치료 활성을 가질 수 있는 신규의 산소 및 일산화 탄소 운반 및 전달 분자, 및 상기 분자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 안정화되고 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 및 수혈 약물에서 치료제로서 유용한 수용성 중합체를 갖는 헤모글로빈 결합체를 제공하는 것이며, 상기 바이러스 불활성화는 상기 고유 헤모글로빈 및 생성되는 헤모글로빈 제형에 전염성의 감염인자가 필수적으로 없게 만든다. 상기 결합체는 상기 헤모글로빈에 결합된 산소 또는 일산화 탄소를 조직으로 전달할 수 있다.
발명의 요약
다수의 실시태양 중에서, 본 발명은 포유동물 혈관 구조 중에 및 상기 혈관 구조와 접촉하고/하거나 헤모글로빈과 접촉하여 조직 내로 산소 또는 일산화 탄소(CO)를 운반 및 확산시킬 수 있는 PEG-헤모글로빈("PEG-Hb") 분자를 제공한다. 본 발명의 조성물은 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함한다. 상기 조성물은 작용성 그룹인 고유 헤모글로빈 분자를 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획을 포함한다. 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원은 산소 제거된(deoxygenated) 상태이며, 화학적 가교결합제가 실질적으로 없고, 예시적인 실시태양에서 약 22 ㎜ Hg 내지 약 26 ㎜ Hg의 P50을 갖는다. 상기 조성물은 또한 수용성 안정제 분획을 포함한다. 상기 안정제 분획은 상기 헤모글로빈 분자 그룹이 산소 제거된 상태로 유지하는 것을 돕는다. 다양한 실시태양에서, 상기 안정제 분획은 안정화제를 포함한다. 예시적인 안정화제는 상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자보다 산소(또는 반응성 산소 종(ROS))와 더 반응성인 구조 요소를 갖는다. 상기 조성물 중에는 수성 희석제 분획이 임의로 포함된다. 상기 희석제 분획은 상기 헤모글로빈 분획 및 안정제 분획이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 화합물은 바이러스 불활성이며, 이는 상기 조성물을 바이러스 활성이 필수적으로 없게 만든다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 산소 또는 일산화 탄소를 상기 헤모글로빈 분자로부터 생체 내 조직으로(예를 들어 조직으로) 운반할 수 있는 헤모글로빈 결합체를 제공한다. 상기 조성물은 작용성, 산소 제거된 고유 헤모글로빈 분자와 하나 이상의 수용성 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜) 부분 간의 공유 결합체를 포함한다. 헤모글로빈을 수용성 중합체와 결합시키는데, 예를 들어 PEG화시키는데, 그 이유는 상기 변형이 천연 헤모글로빈의 반감기를 연장하기 때문이다. 이는 고유 헤모글로빈 자체, 및 앞서 개발된 HBOC들 중 일부의 짧은 생체 내 반감기의 주요 문제를 극복한다. 더욱 또한, 상기와 같은 중합체의 결합을 통해, 상기 헤모글로빈의 반감기를 연장시킴으로써, 상기 분자의 물리적인 크기가 증가한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 결합은 보다 적은 파괴 생성물의 형성을 유도하고, 이는 고유 헤모글로빈뿐만 아니라 다른, 덜 안정성인 HBOC에서 발견되는 신장 독성의 기회를 감소시킨다. PEG화는 헤모글로빈의 면역 인식을 감소시킨다. 따라서, 비-인간 종으로부터의 헤모글로빈을 본 발명의 조성물 및 방법에 사용할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 상기 헤모글로빈은 소 헤모글로빈이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 결합체 조성물이다.
다양한 실시태양에서, 상기 조성물은 헤모글로빈 분자 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획을 포함한다. 상기 헤모글로빈 분자 그룹은 산소 제거되며 하나 이상의 수용성 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜) 부분에 공유 결합된다. 예시적인 수용성 중합체 결합체는 상기 수용성 중합체가 아미노산 잔기의 아민 부분을 통해 상기 폴리펩타이드에 결합함을 통해 형성되지만, 임의의 헤모글로빈 아미노산 잔기를 통해 상기 결합체를 형성함은 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 헤모글로빈 분획 중의 헤모글로빈 결합체는 화학적 가교결합제가 실질적으로 없으며; 약 9 ㎜ Hg 내지 약 12 ㎜ Hg의 P50을 갖는다. 예시적인 조성물은 또한 수용성 안정제 분획을 포함하여, 상기 헤모글로빈 분자 그룹을 내산화성으로 만든다. 상기 안정제 분획은 안정화제를 포함한다. 예시적인 안정제는 상기 산소 제거된 헤모글로빈의 재산소화(reoxygenation)를 방지하는 구조 요소를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 안정화제는 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 구성원들보다 산소와 더 반응성이다. 다양한 실시태양들에서, 상기 조성물은 또한 희석제 분획을 포함한다. 예시적인 희석제 분획은 상기 헤모글로빈이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 바이러스 활성이 필수적으로 없으며, 약 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 조성물을 제공한다. 상기 조성물을, 산소 제거된 헤모글로빈 및 안정화제의 용액을 열 바이러스 불활성화 공정에 가함을 포함하는 방법에 의해 제조한다. 상기 열 바이러스 불활성화 공정은 상기 용액을 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성을 불활성화시키기에 충분히 상승된 온도에 노출시킴을 포함한다. 상기 상승된 온도 처리는 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성의 불활성화가 성취되기에 충분한 시간 동안이다. 상기 안정화제는 상기 산소 제거된 헤모글로빈의 재산소화를 방지하는 구조 요소를 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 구조 요소는 상기 요소가 상기 산소 제거된 헤모글로빈보다 산소 또는 ROS와 더 반응성이도록 선택된다. 상기 안정화제는 상기 산소제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합을 최소화하는 작용을 한다. 다양한 실시태양에서, 상기 용액은 상기 열 바이러스 불활성화 공정 동안 약 10% 초과의 메트헤모글로빈의 형성을 방지하기에 충분한 양의 안정화제를 포함한다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 헤모글로빈 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함한다. 상기 조성물을 바이러스 불활성화시키는 경우, 이는 전구체 헤모글로빈 용액을 약 12 시간 까지(예를 들어 약 1 내지 약 4 시간) 약 60 ℃로 가열함을 포함하는 방법에 의해 임의로 제조된다. 상기 전구체 용액은 안정화제를 포함한다. 상기 안정화제는 상기 산소 제거된 헤모글로빈의 재산소화를 방지하는 구조 요소를 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 구조 요소는 상기 요소가 상기 산소 제거된 헤모글로빈보다 산소와 더 반응성이도록 선택된다. 상기 안정화제는 상기 산소제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합을 최소화하는 작용을 한다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 헤모글로빈 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 조성물은 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 작용성의 고유 헤모글로빈 분자의 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획을 포함하며, 여기에서 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원은 산소 제거된 상태이며, 화학적 가교결합제가 실질적으로 없고, 약 22 ㎜ Hg 내지 약 26 ㎜ Hg의 P50을 갖는다. 다양한 실시태양에서, 상기 조성물은 안정화제를 포함하는 수용성 안정제 분획을 포함한다. 상기 안정화제는 상기 산소 제거된 헤모글로빈의 재산소화를 방지하는 구조 요소를 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 구조 요소는 상기 요소가 상기 산소 제거된 헤모글로빈보다 산소와 더 반응성이도록 선택된다. 상기 안정화제는 상기 산소제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합을 최소화하는 작용을 하며, 이에 의해 상기 헤모글로빈 분자는 산소 제거된 상태로 유지된다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 희석제 분획을 포함한다. 다양한 실시태양들에서, 상기 희석제 분획은 상기 헤모글로빈이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함한다. 다양한 조성물은 바이러스 활성이 필수적으로 없으며, 약 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 바이러스 불활성화된다. 상기 바이러스 불활성화된 조성물의 예시적인 제조 방법은 상기 헤모글로빈 분획 및 안정제 분획을 포함하는 혼합물을 열 바이러스 불활성화 공정에 가함을 포함한다. 예시적인 열 바이러스 불활성화 공정은 상기 혼합물을 상기 혼합물 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성을 불활성화시키기에 충분하게 상승된 온도에 노출시킴을 포함한다. 상기 혼합물이 상기 상승된 온도로 있는 동안의 기간은 상기 혼합물 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성의 불활성화를 성취하기에 충분하다.
상기 나타낸 각각의 조성물들에서, 상기 헤모글로빈은 임의로 산소 제거된다. 하나의 실시태양에서, 상기 헤모글로빈은 바이러스 불활성화에 이어서 산소 제거된다. 한편으로, 상기 헤모글로빈은 일산화 탄소에 결합된다. 일산화 탄소에의 결합은 상기 조성물의 제조 도중 또는 상기 조성물의 제조 후 필수적으로 임의의 시점에서 발생할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 상기 산소 제거된 조성물에서 상기 헤모글로빈의 Fe(II)는 일산화 탄소에 결합된다.
본 발명은 또한 외상, 쇼크, 허혈, 및 조직 또는 기관의 산소 또는 일산화 탄소 함량을 증대시킴으로써 개선될 수 있는 다른 질병들의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 조직 산소 공급을 빠르게 복원시키며 중증 외상성 쇼크(피실험자의 50% 이상이 통상적으로 출혈성 쇼크로 사망한다)의 동물 모델에서 산소 부채를 충분히 갚는다. 예시적인 제형을 사용하는 경우, 본 발명 조성물의 단일 단위는 모든 주요 기관들에 대한 산소 부채를 갚으며, 미소 혈관계를 개방하고, 평균 동맥압을 복원한다. 본 발명의 다양한 조성물은 농축 적혈구보다 산소 부채를 더 유효하고 빠르게 역전시킨다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 제형은 피실험자에게 상기 제형의 투여 후 약 60 분 내지 약 160 분 안에 상기 피실험자의 산소 부채의 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 이상을 갚는다. 한편으로, 본 발명의 조성물은 조직 중의 일산화 탄소 농도를 증가시킨다. 예시적인 실시태양에서, 산소 부채를 갚거나 조직 일산화 탄소 함량을 증대시키는 상기 제형은 본 발명의 PEG화된 헤모글로빈 결합체를 포함한다.
따라서, 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 산소 또는 일산화 탄소를 이의 전달이 필요한 피실험자의 조직 및 기관 중에서 선택된 구성원에 전달하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 하나 이상의 조직 및/또는 기관에 산소 또는 일산화 탄소의 전달을 수행하기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 출혈성 쇼크를 앓고 있는 피실험자의 조직 및 기관 중에서 선택된 구성원 중의 산소 부채의 역전 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 피실험자에게 상기 산소 부채를 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다. 질병, 상해 등으로 인한 일산화 탄소 함량의 손실에 응하던지 또는 건강하거나 병든 상태의 조직에서 발현되는 정상 수준 이상의 조직 중 일산화 탄소 함량의 증가로부터 치료 이점을 얻는 수단으로서든지 간에, 조직의 일산화 탄소 함량을 증가시키기 위한 유사한 방법을 제공한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 혈관형성을 유도하기에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 피실험자에게 투여함으로써 상기 피실험자의 조직에서 혈관형성을 유도하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 혈관형성을 산소 결핍증을 앓고 있는 조직 중에서 유도한다. 추가의 예시적인 실시태양에서, 혈관형성을 유도하는 조직 또는 기관은 산소 결핍증을 앓고 있는 피실험자의 조직 또는 기관이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 상기 산소 결핍증을 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 산소 결핍증을 앓고 있는 조직으로의 혈류를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 피실험자에게 산소 결핍증을 앓고 있는 조직으로의 혈류를 증가시키기에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여하는 것으로 이루어진다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조직 또는 기관은 불충분한 혈류로 고통받는 피실험자의 조직 또는 기관이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 상기 불충분한 혈류를 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 산소 결핍증을 앓고 있는 조직에서 신경학적 손상 및/또는 경색된 조직을 감소시키는 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 피실험자에게 산소 결핍증을 앓고 있는 조직에서 신경학적 손상 및/또는 경색을 감소시키기에 충분한 양의 본 발명의 조성물을 투여함을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 상기 경색되고/되거나 신경학적으로 손상된 조직의 양을 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
상기 나타낸 각각의 실시태양들에서, 상기 제형 중의 헤모글로빈은 산소, 일산화 탄소에 결합되거나 또는 상기 중 어느 것에도 결합되지 않을 수 있다. 더욱이, 상기 헤모글로빈 결합체가 혼입되는 제형은 상기 피실험자 혈액의 긴장성에 비해 저장성, 등장성 또는 고장성일 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명하다.
본 발명은 산소 또는 일산화 탄소를 조직으로 전달할 수 있는 중합체-개질된 단백질을 이용함으로써 질병, 상해 및 손상, 급성 출혈에 의한 혈액 손실, 빈혈, 쇼크로부터 생성되는 저산소증을 치료하거나 예방할 수 있다.
도 1은 예시적인 PEG-Hb의 생산에 대한 흐름도이다.
도 2는 외상성 쇼크의 동물 모델에서 산소 부채를 역전시키기 위한 PEG-Hb/HS와 다른 치료의 그래프 비교이다.
도 3은 수혈이 없거나 또는 중심 대뇌 동맥 폐쇄(MCAO) 20 분째에 10 ㎖/㎏의 PEG-알부민 또는 PEG-COHb를 수혈한 래트 그룹에서 2 시간 동안의 MCAO 및 재 관류의 처음 30 분째에, 동맥압(A) 및 측부 두정엽 피질에 대해 측정되고 기준선 퍼센트로서 나타낸 레이저-도플러 플럭스를 도시한다(평균±SE; n = 그룹당 10).
도 4는 수혈이 없거나 또는 MCAO 20 분째에 PEG-알부민 또는 PEG-COHb를 수혈한 그룹에서 MCAO 2 시간 후에 재 관류 1 또는 24 시간째에 0 내지 4 등급(0 = 손상 없음)의 신경 손상 점수를 도시한다(평균±SE; n = 10). *P<0.05 PEG-COHb 그룹 대 비 수혈 및 PEG-알부민 그룹 간.
도 5는 대뇌 피질(A) 및 선조체(B)에 대한 각 7 개 관상 절편의 경색 부피, 및 상기 대뇌 피질과 선조체에 대한 7 개 절편들에 대해 합계된 총 경색 부피(C)를 나타내는 그래프이다. 값들을 대측성 전체 구조의 퍼센트로서 나타낸다(평균±SE; n = 10). *P<0.05 PEG-COHb 그룹 대 비 수혈 및 PEG-알부민 그룹 간.
도 6은 생명력 있는 뇌 조직(짙게 염색된)의 양이 본 발명의 PEG-COHb를 주입하지 않은 대조용 래트(좌측 상)에서보다, 본 발명의 PEG-COHb를 수혈한(우측 상) 래트에서 더 큰 것을 나타낸다.
도입
질병, 상해 및 손상, 예를 들어 혈액 손실(예를 들어 급성 출혈로부터 또는 수술 도중)로부터 생성되거나, 빈혈(예를 들어 악성 빈혈 또는 겸상 적혈구성 빈혈)로부터 생성되거나, 또는 쇼크(예를 들어 부피 결핍 쇼크, 과민성 쇼크, 패혈성 쇼크 또는 알러지성 쇼크)로부터 생성되는 저산소증을 치료하거나 예방하기 위해 산소 운반제가 필요하다. 상기 능력의 전혈 또는 혈액 분획의 사용은 단점이 따른다. 예를 들어, 전혈의 사용은 종종 간염-발생 바이러스 및 AIDS-발생 바이러스를 포함하여 임의의 수의 바이러스의 전염 위험을 동반하며, 이는 환자의 회복을 복잡하게 하거나 환자를 사망케 할 수 있다. 또한, 전혈의 사용은 면역혈액학적 문제 및 제공자 간 부적합성을 피하기 위해 혈액형 분류 및 교차 시험을 요한다.
또한 산소 또는 일산화 탄소를 피실험자의 조직에 전달할 수 있는 치료제가 필요하다. 상기 치료제는 특히 혈액 손실 및 허혈과 관련된 병의 치료에 유용하다.
본 발명은 이러한 필요성을 PEG-헤모글로빈 제형(여기에서 상기 헤모글로빈은 산소에 결합하거나, 일산화 탄소에 결합하거나 상기 중 어느 것에도 결합하지 않는다)의 제공에 의해 충족시킨다. 상기 헤모글로빈 결합제를 상기 제형이 투여되는 피실험자의 혈액의 긴장성에 대해 저장성이거나, 등장성이거나 고장성인 매질 중에서 제형화한다.
산소 전달제, CO 전달제 및/또는 대용 혈액으로서 인간 헤모글로빈은 삼투 활성 및 산소를 운반 및 이동시키는 능력을 갖지만, 신장 경로에 의해 및 혈관 벽을 통해 순환으로부터 빠르게 제거되어 기관 손상 및 매우 빠른, 따라서 만족스럽지 못한 반감기를 생성시킨다는 단점을 갖는다. 더욱이, 인간 헤모글로빈은 또한 독성 수준의 내독소, 세균 및/또는 바이러스에 의해 빈번히 오염된다.
비-인간 헤모글로빈은 인간 헤모글로빈과 동일한 결함들이 문제가 된다. 또한, 비-인간 공급원으로부터의 헤모글로빈은 수혈자에게서 면역계 반응을 유발할 가능성이 있다.
본 발명은 질병, 손상 및 상해로 인한 저산소증을 치료 및 개선하거나, 또는 상기 상태의 조직으로 CO를 전달하기 위한 헤모글로빈 제형 및 상기 제형의 사용 방법을 제공한다. 예시적인 제형은 바이러스 불활성화되며, 몇몇 실시태양에서 상기 헤모글로빈은 수용성 중합체와 결합된다, 예를 들어 PEG화된다. 본 발명의 예시적인 헤모글로빈은 천연 인간 헤모글로빈의 경우와 상이한 P50을 갖는 헤모글로빈 분자를 포함한다. 본 발명의 헤모글로빈 제형은 중증 외상의 동물 모델에서 입증된 바와 같이, 외상 시 산소 부채를 역전시키며, 이는 상기 제형이 다른 제품들에 비해 탁월한 생체 내 산소 운반 능력을 가짐을 가리킨다. 본 발명의 예시적인 제형은, 피실험자의 50% 이상이 출혈성 쇼크로부터 통상적으로 사망하는 중증 외상성 쇼크의 동물 모델에서 입증되는 바와 같이, 조직 산소공급을 빠르게 복원시키고 외상 시 산소 부채를 충분히 갚는다. 본 발명의 예시적인 제형의 단일 단위는 모든 주요 기관들에 대한 산소 부채를 갚고, 미소 혈관계를 개방하고, 평균 동맥압을 복원한다. 예시적인 제형은 또한 임의의 다른 HBOC보다 탁월한 안정성 및 저장 능력을 제공한다. 예시적인 제형은 본 발명의 예시적인 제형이 치료 응급 상황에 관하여 유용함을 입증하는 극단적인 환경 조건인 45 ℃(113 ℉)에서 4 주 이상 보관 후 동물 모델에서 충분히 효능 있게 남아있을 정도로 충분히 안정하다.
임상용의 본 발명의 다양한 제형들은 PEG화된 헤모글로빈, 예를 들어 소 헤모글로빈, 및 등장성 또는 고장성 염수(PEG-Hb/HS), 및 높은 염 농도와 함께 또는 상기 없이(즉 등장성 또는 고장성) CO 형태의 PEG화된 헤모글로빈(PEG-Hb-CO)을 포함한다. 이들 실시태양에 따른 예시적인 제형은 그의 헤모글로빈 함량을 통한 혈액의 산소 운반 능력을 증가시키고, 혈관계를 확장시키고(그의 고장성-삼투 작용 또는 CO의 효과를 통해) 적혈구와 조직 간의 산소 운반제로서 작용함으로써 산소의 조직으로의 전달을 향상시킨다. 본 발명의 예시적인 제형은 또한 겸상 적혈구성 빈혈, 당뇨로 인한 쇼크 또는 말초 허혈의 치료에 유용하다. 예시적인 제형은 PEG-Hb-CO를 포함하며, 고도로 안정하고 바람직한 약물학적 성질을 갖는다. 다양한 실시태양들에서, 상기 PEG-Hb-CO는 혈관확장 성질을 갖는다. 다양한 실시태양에서, 상기 PEG-Hb-CO는 산화방지 성질을 갖는다. 다양한 실시태양들에서, 본 발명의 PEG-Hb 제형은 조직 손상을 유발시킬 정도로 충분한 양의 반응성 산소 종을 생성시키지 않는다. 상기 제형을 본 발명에 논의된 질병, 손상 또는 상해들 중 임의의 것의 치료에 사용할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 상기 제형은 허혈의 치료에 사용된다. 상기 조성물에 의해 치료 가능한 허혈의 예시적인 유형은 대뇌 허혈 및 당뇨성 허혈을 포함한다. 따라서, 본 발명은 허혈 사건으로부터의 하부 손상을 치료, 개선 및 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물에 의해 치료 가능한 허혈의 예시적인 유형은 말초 허혈, 예를 들어 말초 당뇨성 허혈이다.
정의
"CO"는 일산화 탄소를 지칭한다.
"HS"는 고 농도 염, 고장성 제형을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "상귀네이트(Sanguinate)TM"는 본 발명의 PEG-H bCO 조성물을 지칭한다.
"대용 혈액", "소생액", "PEG-Hb", "PEG-CO-Hb", "헤모글로빈-기재 산소 운반체"(HBOC) 및 "PEG-Hb/HS"란 용어는 본 발명의 PEG화된 Hb 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 제형을 지칭한다. 상기 용어는 또한 상기 조성물 및 그의 제형의 예시적인 용도의 개시를 수반한다. 예를 들어, "대용 혈액"은 예를 들어 외상, 발작, 허혈/재관류 손상, 수술, 빈혈 또는 다른 손상, 상해 및 수혈이 지시될 수도 있는 질병과 관련하여 혈액을 대체하는데 유용하다. 상기 용도는, 본 발명에 사용된 바와 같이, 또한 산소 또는 일산화 탄소를 조직으로 운반할 수 있는 Hb 제형을 지칭한다. 상기 제형은 적합한 혈액 부피를 갖지만, 상기 혈액이 산소 또는 일산화 탄소를 조직으로 운반 및/또는 전달하는데 부적합한 능력을 갖는 피실험자를 특징으로 하는 손상, 상해 및 질병에 유용하다. 상기 PEG-헤모글로빈 유도체를 저장성, 등장성 또는 고장성 염 용액 중에서 제형화한다. 따라서, Fe(II)가 결합되지 않거나 CO에 결합된 예시적인 산소 제거된 PEG-Hb 조성물을 등장성 또는 고장성 용액 중에서 제형화할 수 있다. 유사하게, 예시적인 산소 제거된 PEG-Hb를 등장성 또는 고장성 운반체 중에서 제형화할 수 있다.
"아미노산"이란 용어는 천연, 예를 들어 시스테인 및 합성 아미노산뿐만 아니라 상기 천연 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 동족체 및 아미노산 유사물질을 지칭한다. 천연 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화되는 것들뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산들, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 동족체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실 그룹, 아미노 그룹 및 R 그룹에 결합되는 α 탄소를 갖는 화합물들, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 상기와 같은 동족체는 변형된 R 그룹(예를 들어 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 주쇄를 가지나, 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 유사물질은 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.
"펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 단량체들이 아미노산이고 아미드 결합을 통해 함께 결합하는 중합체를 지칭하며, 한편으로는 폴리펩타이드로서 지칭된다. 또한, 비 천연 아미노산, 예를 들어 β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌이 또한 포함된다. 유전자-암호화되지 않는 아미노산을 또한 본 발명에 사용할 수 있다. 더욱 또한, 반응성 그룹, 글리코실화 부위, 중합체, 치료 부분, 생물분자 등을 포함하도록 변형된 아미노산들을 또한 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 아미노산들은 모두 D- 또는 L-이성체일 수 있다. 상기 L-이성체가 일반적으로 바람직하다. 또한, 다른 펩타이드 유사물질이 또한 본 발명에 유용하다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "펩타이드"는 글리코실화된 및 글리코실화되지 않은 펩타이드 모두를 지칭한다. 또한 상기 펩타이드를 발현하는 시스템에 의해 불완전하게 글리코실화된 펩타이드가 포함된다. 일반적인 고찰을 위해서, 문헌[Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)]을 참조하시오. 예시적인 펩타이드는 헤모글로빈이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "펩타이드 결합체" 및 "헤모글로빈 결합체"는 헤모글로빈 폴리펩타이드가 본 발명에 나타낸 바와 같이 수용성 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 결합된 본 발명의 종들을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "헤모글로빈"은 화학적 가교결합제, 예를 들어 다이알데하이드 등에 의한 처리를 통해 화학적으로 가교결합되지 않은 산소 결합(또는 CO-결합), 활성 폴리펩타이드를 지칭한다. 예시적인 헤모글로빈은 하나 이상의 PEG(예를 들어 m-PEG) 부분의 결합 이외의 변형은 없는 고유 단백질이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "화학적 가교결합제가 실질적으로 없는"은 화학적 가교결합제와 의도적으로 가교결합되지 않은 헤모글로빈 분자를 지칭한다. 상기 헤모글로빈 제제는 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만의 가교결합된 헤모글로빈을 포함한다.
"수용성"이란 용어는 일부 검출 가능한 정도의 수 용해도를 갖는 부분을 지칭한다. 수 용해도의 검출 및/또는 정량화 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 수용성 중합체는 펩타이드, 사카라이드, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카복실산) 등을 포함한다. 펩타이드는 단일 아미노산으로 구성된 혼합된 시퀀스, 예를 들어 폴리(리신)을 가질 수 있다. 예시적인 폴리사카라이드는 폴리(시알산)이다. 예시적인 폴리(에테르)는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 폴리(에틸렌 이민)은 예시적인 폴리아민이며, 폴리(아크릴)산은 전형적인 폴리(카복실산)이다. "수용성 중합체"에서와 같이 "수용성"이란 용어는 실온에서 물에 용해성인 중합체이다. 전형적으로, 수용성 중합체의 용액은 여과 후 동일한 용액에 의해 투과된 빛의 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상을 투과시킬 것이다. 중량 기준으로, 수용성 중합체 또는 그의 분절은 바람직하게는 물에 약 35 중량% 이상 용해성, 보다 바람직하게는 물에 약 50 중량% 이상 용해성, 훨씬 더 바람직하게는 물에 약 70 중량% 이상 용해성이고, 훨씬 더 바람직하게는 물에 약 85 중량% 이상 용해성일 것이다. 그러나, 상기 수용성 중합체 또는 분절은 물에 약 95 중량% 용해성이거나 물에 완전히 용해성인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "수용성 중합체"란 용어는 생체적합성이고 비 면역원성인 수용성 중합체들을 포함하며 생체적합하지 않고 비 면역원성인 임의의 수용성 중합체 분절들은 특별히 제외한다. 생체적합성에 관하여, 물질을 살아있는 조직과 관련하여 단독으로 또는 또 다른 물질(예를 들어 활성제)과 함께 사용하는 것(예를 들어 환자에 투여)과 관련된 유리한 효과가 임상의, 예를 들어 의사에 의해 평가 시 임의의 유해한 효과보다 더 큰 경우 상기 물질을 생체적합성으로 간주한다. 비-면역원성과 관련하여, 물질의 의도된 생체 내 용도가 바람직하지 못한 면역 반응(예를 들어 항체의 형성)을 생성시키지 않거나, 또는 면역 반응이 생성되는 경우, 따라서 상기와 같은 반응이 임상의에 의해 평가 시 임상적으로 현저하거나 중요하지 않은 것처럼 보이는 경우, 상기 물질을 비 면역원성으로 간주한다. 본 발명에 개시된 수용성 중합체 분절뿐만 아니라 결합체는 생체적합성이고 비 면역원성인 것이 특히 바람직하다.
상기 수용성 중합체의 중합체 주 쇄는 폴리(에틸렌 글리콜)(즉 PEG)일 수 있다. 그러나, 다른 관련된 중합체들도 또한 본 발명의 실시에 사용하기에 적합하며 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)이란 용어를 이 점에서 포함하고자 하며 제외하고자 하는 것은 아님은 물론이다. PEG란 용어는 그의 형태들 중 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어 알콕시 PEG, 이작용성 PEG, 다중 가지 PEG, 갈라진 PEG, 분지된 PEG, 펜던트 PEG(즉 중합체 주 쇄에 매달린 하나 이상의 작용기들을 갖는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 내부에 분해성 결합들을 갖는 PEG를 포함한다.
상기 중합체 주쇄는 선형이거나 분지될 수 있다. 분지된 중합체 주쇄는 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 전형적으로, 분지된 중합체는 중심 분지 코어 부분 및 상기 중심 분지 코어에 결합된 선형 중합체 쇄들의 그룹을 갖는다. PEG는 통상적으로 다양한 폴리올, 예를 들어 글리세롤, 펜타에리쓰리톨 및 솔비톨에 에틸렌 옥사이드를 첨가하여 제조될 수 있는 분지된 형태로 통상적으로 사용된다. 상기 중심 분지 부분은 또한 여러 아미노산, 예를 들어 리신으로부터 유래할 수 있다. 상기 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)을 화학식 R(-PEG-OH)m로서 나타낼 수 있으며, 여기에서 R은 코어 부분, 예를 들어 글리세롤 또는 펜타에리쓰리톨이고, m은 가지의 수를 나타낸다. 다중 가지 PEG 분자, 예를 들어 미국 특허 제 5,932,462 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 것들을 또한 중합체 주 쇄로서 사용할 수 있다.
다수의 다른 중합체들이 또한 본 발명에 적합하다. 비-펩타이드 및 수용성이고, 2 내지 약 300 개의 말단을 갖는 중합체 주 쇄가 본 발명에 특히 유용하다. 적합한 중합체의 예로는 비 제한적으로 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들어 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시프로필메트아크릴아미드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모폴린), 예를 들어 미국 특허 제 5,629,384 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 것들, 및 이들의 공중합체, 3원 중합체 및 혼합물이 있다. 상기 중합체 주 쇄의 각 쇄의 분자량은 다양할 수 있지만, 전형적으로는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da의 범위이다.
상기 수용성 중합체(뿐만 아니라 결합체의 형성에 사용되는 중합체성 시약)의 분자량은 다양할 수 있지만, 상기 분자량은 하기의 값들 중 하나 이상을 만족할 것이다: 100 달톤 초과; 200 달톤 초과; 400 달톤 초과; 500 달톤 초과, 750 달톤 초과; 900 달톤 초과; 1,000 달톤 초과, 1,400 달톤 초과; 1,500 달톤 초과, 1,900 달톤 초과; 2,000 달톤 초과; 2,200 달톤 초과; 2,500 달톤 초과; 3,000 달톤 초과; 4,000 달톤 초과; 4,900 달톤 초과; 5,000 달톤 초과; 6,000 달톤 초과; 7,000 달톤 초과; 7,500 달톤 초과, 9,000 달톤 초과; 10,000 달톤 초과; 11,000 달톤 초과; 14,000 달톤 초과, 15,000 달톤 초과; 16,000 달톤 초과; 19,000 달톤 초과; 20,000 달톤 초과; 21,000 달톤 초과; 22,000 달톤 초과, 25,000 달톤 초과; 및 30,000 달톤 초과. 본 발명에 유용한 임의의 주어진 수용성 중합체 분절에 대한 분자량의 최대 한계는 약 300,000 달톤인 것으로 생각된다.
상기 수용성 중합체(뿐만 아니라 결합체의 형성에 사용되는 전체 중합체성 시약)의 분자량을 또한 일련의 분자량 범위 내의 값으로서 나타낼 수 있다. 예시적인 범위는 하기를 포함한다: 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤; 약 500 달톤 내지 약 80,000 달톤; 약 1,000 달톤 내지 약 60,000 달톤; 약 2,000 달톤 내지 약 50,000 달톤; 및 약 5,000 달톤 내지 약 40,000 달톤.
중합체성 시약 내의 임의의 주어진 수용성 중합체(뿐만 아니라 상기 전체 중합체 시약)에 대한 예시적인 분자량은 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 5,000 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 75,000 달톤, 및 약 80,000 달톤을 포함한다.
당해 분야의 통상적인 숙련가들은 실질적으로 수용성 중합체에 관한 상기 논의가 결코 총 망라된 것은 아니고 단지 예시적인 것이며, 상술한 성질들을 갖는 모든 중합체성 물질들이 고려됨을 알 것이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "중합체성 시약"이란 용어는 일반적으로 수용성 중합체 및 작용기를 포함할 수 있는 전체 분자를 지칭한다. "수용성 중합체"란 용어는 일반적으로 보다 큰 분자 구조의 한 부분, 예를 들어 중합체성 시약, 전구체 분자, 결합체 등을 논의하는데 사용하기 위해 마련된 것이다.
본 발명에 개시된 상기 중합체성 시약 및 다른 구조들의 각 부분(예를 들어 작용기, 활성제, 수용성 중합체 등)을 직접 공유 결합을 통해 서로 직접 결합시킬 수 있다. 그러나, 보다 전형적으로는, 각 부분은 단일화된 전체로 함께 각 부분을 구속하는 작용을 하는 하나 이상의 원자들로 구성된 이격자 부분을 통해 결합된다.
본 발명에 개시된 중합체성 시약 및 다른 구조들의 다양한 부분들에 대한 바람직한 이격자 부분은 탄소, 질소, 산소 및/또는 황 원자들로 만들어진 원자들의 쇄를 포함한다. 상기 원자들의 쇄에, 하나 이상의 다른 원자, 예를 들어 탄소, 질소, 산소, 황 및 수소가 결합될 수 있다. 상기 쇄는 짧을 수 있으며 2 내지 5 개 원자 정도로 짧은 쇄를 포함할 수 있다. 보다 긴 쇄, 예를 들어 길이가 10, 15 또는 그 이상인 원자들의 쇄가 또한 고려된다. 또한, 상기 이격자 부분은 방향족일 뿐만 아니라 포화, 및 불포화될 수 있다. 이격자 부분은, 존재하는 경우, 바람직하게는 임의의 분지화 원자를 제외하고 일련의 약 1 내지 20 개 원자들을 포함한다. 바람직하게는, 상기 이격자 부분을 구성하는 원자(임의의 분지화 원자 포함)는 산소, 탄소, 질소, 황 및 수소 원자의 일부 조합을 포함한다. 이격자 부분은 임의의 유용한 포맷을 가질 수 있다.
환자에 대한 약물의 투여와 관련하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "반감기" 또는 "t½"이란 용어는 환자에서 약물의 혈장 농도가 1/2까지 감소하는데 필요한 시간으로서 정의된다. "반감기"에 대한 추가의 설명은 문헌[Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101 -120)]에서 발견된다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 PEG 결합체의 반감기는 약 12 내지 약 22 시간이며, 이는 비-PEG화된 헤모글로빈보다 상당히 더 길다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 상기 결합체와 병용 시, 상기 결합체의 활성을 유지하고 피실험자의 면역계와 비 반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로서 비 제한적으로 표준 약학 담체들 중 임의의 것, 예를 들어 포스페이트 완충된 염수 용액, 물, 유화액, 예를 들어 오일/수 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제가 있다. 다른 담체는 또한 멸균 용액, 코팅된 정제를 포함한 정제 및 캡슐을 포함할 수 있다. 전형적으로 상기와 같은 담체는 부형제, 예를 들어 전분, 우유, 당, 몇몇 유형의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 그의 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 활석, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글리콜, 또는 다른 공지된 부형제를 함유한다. 상기와 같은 담체는 또한 향 및 색상 첨가제, 또는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 상기와 같은 담체를 포함하는 조성물을 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화한다. 예시적인 담체는 고장성 염화 나트륨 및 등장성 염화 나트륨(예를 들어 포스페이트 완충된 염수)이다. 고장성 및 등장성 담체는 본 발명의 산소 제거된 PEG화된 헤모글로빈(예를 들어 일산화 탄소 결합된 철, 및 결합되지 않은 철) 및 철 원자가 산소에 결합된 본 발명의 PEG화된 헤모글로빈의 제형화에 유용하다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "투여"는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 병변 내, 또는 피하 투여를 의미한다. 비 경구 투여는 예를 들어 정맥 내, 근육 내, 소 동맥 내, 피 내, 피하, 복강 내, 심실 내, 및 두개 내를 포함한다.
"개선하는" 또는 "개선하다"란 용어는 증상의 개선, 완화 또는 감소 또는 환자의 신체적 또는 정신적 안녕의 개선과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 매개변수를 포함한, 병리상태 또는 병의 치료에 있어서 임의의 성공의 표시를 지칭한다. 증상의 개선은 신체 검사 및/또는 정신 검사의 결과를 포함하여, 객관적 또는 주관적 매개변수들에 근거할 수 있다.
"요법"이란 용어는 질병의 증상 또는 부작용으로부터의 완화(완화 치료 포함)를 제공하고, 상기 질병을 경감시킴(상기 질병의 회귀를 유발함)을 포함한 질병 또는 병을 "치료함" 또는 이의 "치료"를 지칭한다. 상기 용어는 또한 출혈성 쇼크, 발작, 허혈/재 관류 손상, 외상 등의 치료를 지칭한다. 다양한 실시태양에서, 상기 용어는 또한 상기 질병 또는 병이, 상기 질병에 대해 소인이 있을 수 있지만 상기 질병의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 피실험자에서 발생하는 것을 방지하여(예방학적 치료), 상기 질병을 억제함(상기 병의 발생을 늦추거나 저지함)을 지칭한다.
"유효량" 또는 "에 유효한 양" 또는 "치료 유효량"이란 용어 또는 임의의 문법적으로 동등한 용어는 질병, 병 또는 상해의 치료를 위해 피실험자에게 투여 시, 상기 질병의 치료를 수행하기에 충분한 양을 의미한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 용어는 질병, 상해 또는 손상에 기인할 수 있는 조직 또는 기관 산소 부채의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 약 100% 이하까지 갚기에 충분한 본 발명의 결합체(또는 본 발명의 결합체를 포함하는 제형)의 임의의 양을 지칭한다. CO의 조직으로의 전달과 관련하여 사용 시, 상기 용어는 CO의 조직으로의 전달로부터 검출 가능한 치료 효과를 획득하기에 충분한 투여량을 지칭한다.
본 발명의 예시적인 헤모글로빈 조성물을 "결합된 산소 및 일산화 탄소 중에서 선택된 구성원을 조직으로 운반할 수 있는 것"으로서 언급한다. 상기 어구는 상기 헤모글로빈의 철 원자에 결합된 산소 또는 일산화 탄소를 조직으로 운반하는 능력을 갖는 헤모글로빈 조성물을 지칭한다. 예시적인 조성물에서, 상기 운반은 조직 매개변수(예를 들어 혈관확장, 조직 산소 공급)의 변경에 의해 또는 임상적으로 관련된 종점(예를 들어 괴사 과정의 종결, 감소된 허혈/재 관류 손상)의 검출 가능한 변경에 의해 측정 가능하다. 예시적인 실시태양에서, 일산화 탄소 또는 산소의 조직으로의 운반을 선택된 부피의 본 발명 조성물을 산소 부채가 있는 피실험자(또는 조직)에 투여함으로써 "갚은(repaid)" 산소 부채의 양에 관하여 측정한다. 또 다른 예시적인 실시태양에서, 조직으로 전달된 산소 또는 일산화 탄소의 양을, 소정의 투여량의 본 발명 조성물의 투여에 의해 소정 질량의 조직으로 운반된 산소 또는 CO의 질량(예를 들어 1 그램)에 의하여 측정한다. 산소 또는 CO를 조직으로 운반하는 능력을 또한 생체 내에서 작용적으로, 및 공지된 헤모글로빈 기재 대용 혈액과의 비교에 의해 측정할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 상기 헤모글로빈을, 상기가 산소 또는 일산화 탄소를 전달하는 조직과 "접촉" 시키거나 또는 "작용적으로 접촉시킨다". Bu 작용적 접촉은 상기 헤모글로빈이, 상기 산소 또는 일산화 탄소가 중간 운반체를 통해 또는 조직으로의 확산을 통해 직접 운반되는 조직에 충분히 근접함을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "고유 헤모글로빈"은 또 다른 종에 의도적으로 화학적으로 가교결합 또는 결합되지 않은 헤모글로빈을 지칭한다. 고유 헤모글로빈은, 철 원자가 결합되지 않거나, 산소에 결합되거나, 또는 일산화 탄소에 결합되어 있는 헤모글로빈 분자를 포함한다. 본 발명에 따라, 고유 헤모글로빈은 본 발명의 PEG-Hb 결합체의 헤모글로빈 코어를 형성할 수 있다.
"산소 제거된"은 철(II) 원자가 산소 이외의 종(예를 들어 일산화 탄소)에 결합되거나 또는 산소 또는 임의의 다른 종에 결합되지 않은 헤모글로빈을 지칭한다.
"단리된"이란 용어는 자연적으로 물질에 동반되거나 상기 물질의 생산에 사용되거나 또는 상기 물질의 생산으로부터의 부산물 또는 분해 산물인 성분들이 실질적으로 또는 필수적으로 없는 물질을 지칭한다. 본 발명의 펩타이드 결합체의 경우, "단리된"이란 용어는 상기 펩타이드 결합체의 제조에 사용된 혼합물 중에 상기 물질에 통상적으로 동반되는 성분들이 실질적으로 또는 필수적으로 없는 물질을 지칭한다. "단리된" 및 "고유"는 호환적으로 사용된다. 전형적으로, 본 발명의 단리된 펩타이드 결합체는 바람직하게는 범위로서 표현된 순도의 수준을 갖는다. 상기 펩타이드 결합체의 순도 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 상기 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 초과이다. 본 발명의 바이러스 열 불활성화된 헤모글로빈 조성물을 일반적으로는 수용성 중합체와의 결합 전에 단리한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 결합체의 제조에 사용되는 헤모글로빈을 단리한다. 다양한 실시태양에서, 상기 헤모글로빈 PEG 결합체를 단리한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 헤모글로빈 또는 PEG 헤모글로빈 결합체를, 안정화제 또는 다른 부형제의 존재를 제외하고 단리한다. 다양한 실시태양들에서, 상기 헤모글로빈 또는 PEG 헤모글로빈 결합체를 다른 단백질 및 특히 헤모글로빈 이량체 또는 올리고머 및 다른 산소 운반 단백질 중에서 선택된 단백질로부터 단리한다.
상기 펩타이드 결합체가 약 90%를 초과하여 순수한 경우, 그의 순도를 또한 바람직하게는 범위로서 표현한다. 상기 순도 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 상기 순도 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다. 본 발명의 목적을 위해서, "순수한" 결합체 또는 순수한 결합체의 용액은 안정화제를 포함할 수 있다.
순도를 임의의 당해 분야에서 인정된 분석 방법(예를 들어 은 염색된 젤 상의 밴드 강도, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동, HPLC, 또는 유사한 수단)에 의해 측정한다.
"반응성" 또는 "활성화된"이란 용어는 특정 작용기와 함께 사용될 때 또 다른 분자 상의 친전자체 또는 친핵체와 쉽게 반응하는 반응성 작용기를 지칭한다. 이는 반응을 위해서 강한 촉매 또는 고도로 비현실적인 반응 조건을 요하는 그룹들(즉 "비반응성" 또는 "불활성" 그룹)과 대조적이다.
"그룹의 각 구성원"이란 표현은 특정한 특성을 갖는 본 발명의 제형 중의 한 하위집단의 구성원들을 지칭하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 제형 분획 중의 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원을 언급하는 것은 상기 제형 중의 모든 헤모글로빈 분자가 상기 인용된 특성을 가짐을 반드시 의미하는 것이 아니고, 상기 인용된 특성을 갖는 제형 중의 헤모글로빈 분자의 그룹(하위 집단)을 지칭하는 것이다.
"안정화제"란 용어는 산소 제거된 헤모글로빈의 재산소화를 방지하거나 지연시키는 종을 지칭한다. 예시적인 안정화제는 아민 함유 화합물, 편의상, 독점적인 것은 아니지만, 아미노산이다. 임의의 아민 함유 화합물은 본 발명의 제형 중에서 안정화제로서 작용할 수 있다. 추가의 예시적인 안정화제는 산소와 반응하는 헤모글로빈에 대해 산소와 우선적으로 반응하는 하나 이상의 구조 요소를 갖는다. 본 발명의 안정화제 상에서 발견되는 예시적인 구조 요소는 티올 부분이다. 안정화제로서 유용한 예시적인 설프하이드릴 화합물로는 비 제한적으로 N-아세틸-L-시스테인(NAC) D,L-시스테인, γ-글루타밀-시스테인, 글루타치온, 2,3-다이머캅토-1-프로판올, 1,4-부탄다이티올, 및 다른 생물학적으로 적합한 설프하이드릴 화합물이 있다. 상기 안정화제는 생체 적합성이고 본 발명의 조성물 및 제형에 포함되는 양으로 무독성인 것이 일반적으로 바람직하다. 예시적인 실시태양에서, 상기 PEG는 그 자체가 안정화 시약이다. 따라서, 다양한 실시태양에서, 상기 Hb에 결합된 PEG는 별도의 안정화제 또는 별도의 수용성 안정화 분획에 대한 필요성을 제거한다. 따라서, 본 발명은 수용성 안정화 분획(실제로는 상기 분획을 포함하지 않는다)을 포함하는 본 발명에 나타낸 것들과 동등한 제형들을 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "피실험자", "환자" 및 "포유동물"과 같은 용어는 호환적으로 사용되며, 인간으로 예시된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "산화 질소 공여체" 또는 "NO 공여체"는 일산화 질소 종을 제공하고, 방출하고/하거나 직접 또는 간접적으로 운반하고/하거나 생체 내 산화 질소 또는 내피-유래된 이완 인자(EDRF)의 내생적인 생산을 자극하고/하거나 생체 내 산화 질소 또는 EDRF의 내생 수준을 증가시키고/시키거나 산화되어 산화 질소를 생산하고/하거나 산화 질소 신타제 및/또는 시토크롬 P450에 대한 기질인 화합물들을 지칭한다. "NO 공여체"는 또한 L-아르기닌의 전구체, 효소 아르기나제의 억제제 및 산화 질소 매개체인 화합물을 포함한다.
"산화 질소"란 용어는 하전되지 않은 산화 질소(NO) 및 하전된 일산화 질소 종, 바람직하게는 하전된 일산화 질소 종, 예를 들어 나이트로소늄 이온(NO+) 및 나이트록실 이온(NO-)을 포함한다. 산화 질소의 반응성 형태는 기상 산화 질소에 의해 제공될 수 있다. 상기 일산화 질소 방출, 전달 또는 운반 화합물은 F-NO 구조를 가지며, 여기에서 F는 일산화 질소 방출, 전달 또는 운반 부분이고, 일산화 질소를 그의 의도하는 목적에 활성인 형태로 그의 의도하는 작용 부위에 제공하는 임의의 및 모든 상기와 같은 화합물을 포함한다.
"NO 부가물", "NO 전구체", 및 "NO-방출제"란 용어는 호환적으로 사용된다.
예시적인 실시태양에서, "고장성"이란 용어는 약 3% 내지 약 7% 염을 갖는 PEG화된 Hb 용액을 지칭한다.
실시태양
하기 나타낸 논의는 본 발명에서 하기에 나타낸 실시태양들뿐만 아니라 상기 및 첨부된 청구의 범위에 나타낸 것들과 밀접한 관련이 있다. 이들 실시태양의 요소들을 어떤 것이든 임의의 방식으로 조합하고자 하며, 본 발명에 제공된 논의는 예시적인 조합들을 예시하며 제한이 아니다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 조성물을 제공한다. 예시적인 조성물은 바이러스 불활성화된다. 상기 조성물은 수용성 헤모글로빈 분획을 포함하며, 상기 분획은 작용성의 고유 헤모글로빈 분자 그룹을 포함한다. 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원은 산소 제거된 상태이며, 화학적 가교결합제가 없고, 약 22 ㎜ Hg 내지 약 26 ㎜ Hg의 P50을 갖는다. 한편으로, 다양한 실시태양들에서, 상기 헤모글로빈의 P50은 약 9 ㎜ Hg 내지 약 12 ㎜ Hg이다. 상기 조성물은 또한 수용성 안정제 분획을 임의로 포함한다. 상기 안정제 분획은 상기 헤모글로빈 분자 그룹이 산소 제거된 상태로 유지하는 것을 돕는다. 다양한 실시태양에서, 상기 안정제 분획은 안정화제를 포함한다. 예시적인 안정화제는 상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 갖는다. 상기 조성물 중에는 수성 희석제 분획이 또한 포함된다. 상기 희석제 분획은 상기 헤모글로빈 분획 및 안정제 분획이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 조성물은 바이러스 활성이 실질적으로 없다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함한다.
본 발명의 상기 종들 중 임의의 종의 산소 제거된 헤모글로빈의 Fe(II)는 CO에 결합되거나 또는 산소 또는 CO에 필수적으로 결합되지 않을 수 있다. 다양한 실시태양에서, 상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자의 Fe(II)는 산소에도 일산화 탄소에도 결합되지 않는다. 다양한 실시태양에서, 상기 헤모글로빈 분자는 헤모글로빈 분자 집단의 구성원이다. 이 실시태양에서, 헤모글로빈 분자의 예시적인 집단은 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 상기 산소 제거된 상태의 헤모글로빈 분자를 포함한다.
상기 조성물의 안정화 분획은 상기 산소 제거된 헤모글로빈의 산화를 방지하거나 지연시키는 작용제를 포함한다. 임의의 편리하고 유효한 안정화제를 사용할 수 있다. 다양한 실시태양에서, 상기 안정화제는 생물계에서 잘 허용되는 것이며 포유동물에게 안전하게 투여될 수 있다. 상기 안정화 분획 중의 예시적인 안정화제는 아민, 예를 들어 아미노산, 또는 티올 화합물이다. 예시적인 안정화제는 티올 함유 아미노산, 아미노산 동족체 또는 아미노산 유사물질이다. 다양한 실시태양에서, 상기 아미노산은 천연 및 비 천연 아미노산 중에서 선택된다, 예를 들어 시스테인이다.
다양한 실시태양에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 염을 포함하는 희석제 분획을 포함한다. 상기 염은 필수적으로 임의의 염 중에서 선택될 수 있지만, 본 발명에 바람직한 염은 포유동물에게 전달하기에 약학적으로 허용 가능한 염이다. 다양한 실시태양에서, 상기 조성물은 염화 나트륨을 포함한다. 본 발명의 조성물은 등장성, 고장성 또는 저장성이다. 다양한 실시태양에서, 상기 조성물은 고장성이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조성물은 상기 조성물을 고장성으로 만들기에 충분한 염화 나트륨을 포함하였다. 다른 실시태양에서, 상기 희석제는 긴장성 포스페이트 완충된 염수이다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 2 개 이상의 헤모글로빈 분자를 공유 결합시키는 합성 가교결합 그룹이 필수적으로 없는 헤모글로빈 분획을 제공한다. 헤모글로빈 분자들 간에 작은 퍼센트의 가교결합이 본 발명 조성물의 생산 또는 저장 도중 형성될 수도 있지만, 이들 가교결합된 종들은 전체 헤모글로빈 중 작은 퍼센트를 나타내며 정제 도중 일부러 제조되거나 선택되지 않는다. 따라서, 본 발명의 예시적인 조성물은 전형적으로는 전체 헤모글로빈 함량의 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이, 가교결합된 상태의 2 개 이상의 헤모글로빈 분자의 형태인 헤모글로빈 분자 집단을 포함한다.
본 발명에 유용한 헤모글로빈은 실질적으로 임의의 포유동물 출처로부터 유래한다. 헤모글로빈의 예시적인 출처는 통상적인 가축 동물, 예를 들어 소, 돼지, 양 등을 포함한다. 본 발명은 상기 헤모글로빈의 출처에 의해 제한되지 않는다. 다양한 실시태양에서, 상기 헤모글로빈은 소 헤모글로빈이다.
본 발명의 헤모글로빈 조성물은 최소량의 메트헤모글로빈을 포함한다. 다양한 조성물에서, 상기 메트헤모글로빈의 양은 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이다.
예시적인 실시태양에서, 상기 헤모글로빈을 안정화 분획과 배합 전에 단리한다.
본 발명은 헤모글로빈과 수용성 중합체와의 공유 결합체를 제공한다. 다수의 수용성 중합체들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며 본 발명의 실시에 유용하다. 수용성 중합체란 용어는 예를 들어 사카라이드(예를 들어 덱스트란, 아밀로스, 하이아루론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예를 들어 폴리(아스파트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 중합체(예를 들어 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜); 펩타이드, 단백질 등과 같은 종을 포함한다. 본 발명을 임의의 수용성 중합체를 사용하여 실행할 수 있지만, 상기 중합체가 상기 결합체의 나머지가 결합될 수 있는 지점을 포함해야한다는 것이 유일한 제한이다.
따라서, 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈 분자와 하나 이상의 수용성 중합체 부분간의 공유 결합체를 포함하는, 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 헤모글로빈 분자의 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획을 포함한다. 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원은 산소 제거된다. 예시적인 실시태양에서, 상기 수용성 중합체는 아미노산 잔기의 아민 부분을 통해 상기 헤모글로빈에 공유 결합된다. 상기 헤모글로빈은 도입된, 화학적 가교결합제가 필수적으로 없다. 다양한 실시태양에서, 상기 헤모글로빈은 약 22 ㎜ Hg 내지 약 26 ㎜ Hg의 P50을 갖는다. 다양한 실시태양들에서, P50은 약 9 ㎜ Hg 내지 약 12 ㎜ Hg이다. 상기 조성물은 또한 상기 헤모글로빈 분자 그룹을 내산화성으로 만드는 수용성 안정제 분획을 포함한다. 상기 안정제 분획은 안정화제를 포함한다. 예시적인 안정화제는 상기 헤모글로빈 분자의 그룹보다 산소와 더 반응성인 하나 이상의 구조 요소를 포함한다. 다양한 제형은 상기 헤모글로빈 분획이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 희석제 분획을 또한 포함한다. 예시적인 제형은 바이러스 활성이 필수적으로 없고 약 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함한다.
중합체의 활성화 방법들을 또한 WO 94/17039, 미국 특허 제 5,324,844 호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제 5,219,564 호, 미국 특허 제 5,122,614 호, WO 90/13540, 미국 특허 제 5,281,698 호, 및 더욱 WO 93/15189에서 찾을 수 있으며, 활성화된 중합체와 펩타이드 간의 결합체의 경우, 예를 들어 응고 인자 VIII(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자 (미국 특허 제 4,412,989 호), 리보뉴클레아제 및 초과산화물(Veronese at al ., App . Biochem . Biotech. 11: 141-45 (1985)을 찾을 수 있다.
본 발명의 조성물에 유용한 수용성 중합체, 예를 들어 PEG와 관련하여 분자량을 수 평균 분자량 또는 중량 평균 분자량으로서 나타낼 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명에서 분자량에 대한 모든 언급은 중량 평균 분자량에 관한 것이다. 수 평균 및 중량 평균 모두의 분자량 측정을 젤 투과 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 기법을 사용하여 측정할 수 있다. 분자량 값을 측정하기 위한 다른 방법들, 예를 들어 수 평균 분자량을 측정하기 위한 단부 그룹 분석 또는 총괄성 성질(예를 들어 어는점 강하, 끓는점 상승, 또는 삼투압)의 측정의 사용, 또는 중량 평균 분자량을 측정하기 위한 광 산란 기법, 초원심분리 또는 점도측정의 사용을 또한 사용할 수 있다. 본 발명의 중합체 시약은 전형적으로는 다분산성(즉 상기 중합체들의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 같지 않다)이며, 바람직하게는 약 1.2 미만, 보다 바람직하게는 약 1.15 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1.05 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산성 값을 갖는다. 예시적인 수용성 중합체는 상기 중합체 샘플 중의 중합체 분자의 실질적인 부분이 대략적으로 동일한 분자량을 갖는 것들이며; 상기와 같은 중합체는 "단분산성"이다.
본 발명을 폴리(에틸렌 글리콜) 결합체를 기준으로 추가로 예시한다. PEG의 작용화 및 결합에 대한 여러 평론 및 연구 논문들을 입수할 수 있다. 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: Harris, Macronol . Chem . Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al ., Enzyme Microb . Technol . 14: 866-874 (1992); Delgado et al ., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995); and Bhadra, et al ., Pharmazie, 57:5-29 (2002). 반응성 PEG 분자의 제조 및 반응성 분자를 사용한 결합체의 형성을 위한 경로들은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,672,662 호는 선형 또는 분지된 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀 알콜) 및 폴리(아크릴로모폴린) 중에서 선택된 중합체 산의 활성 에스터의 수용성이고 단리 가능한 결합체를 개시한다.
미국 특허 제 6,376,604 호는 수용성 비-펩타이드 중합체의 말단 하이드록실을 유기 용매 중에서 다이(1-벤조트라이아졸)카보네이트와 반응시킴으로써 상기 중합체의 수용성 1-벤조트라이아졸릴카보네이트 에스터를 제조하는 방법을 나타낸다. 상기 활성 에스터를 사용하여 생물 활성제, 예를 들어 단백질 또는 펩타이드를 갖는 결합체를 형성시킨다.
WO 99/45964는 안정한 결합을 통해 중합체 주 쇄에 결합된 하나 이상의 말단을 갖는 상기 중합체 주 쇄를 포함하는 활성화된 수용성 중합체 및 생물학적 활성제를 포함하는 결합체를 개시하며, 여기에서 하나 이상의 말단은 상기 분지 부분에 결합된 근위 반응성 그룹을 갖는 분지화 부분을 포함하고, 이때 상기 생물 활성제는 상기 근위 반응성 그룹들 중 하나 이상에 결합된다. 다른 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)은 WO 96/21469에 개시되어 있으며, 미국 특허 제 5,932,462 호는 반응성 작용기를 포함하는 분지된 말단을 포함하는 분지된 PEG 분자와 형성된 결합체를 개시한다. 상기 유리 반응성 그룹을 생물 활성 종, 예를 들어 단백질 또는 펩타이드와의 반응에 이용하여, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)과 상기 생물 활성 종 간의 결합체를 형성시킬 수 있다. 미국 특허 제 5,446,090 호는 이작용성 PEG 링커 및 각각의 PEG 링커 말단에 펩타이드를 갖는 결합체의 형성에 있어서 그의 용도를 개시한다.
분해 가능한 PEG 결합을 포함하는 결합체가 WO 99/34833; 및 WO 99/14259뿐만 아니라 미국 특허 제 6,348,558 호에 개시되어 있다. 상기와 같은 분해 가능한 결합들을 본 발명에 적용할 수 있다.
상기 나타낸 중합체 활성화에 대해 당해 분야에서 인정된 방법들은 본 발명에 나타낸 분지된 중합체들의 형성 및 또한 이들 분지된 중합체의 다른 종들, 예를 들어 당, 당 뉴클레오타이드 등에의 결합에 대해 본 발명의 상황에서 유용하다.
예시적인 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)이다. 본 발명에 사용되는 폴리(에틸렌 글리콜)은 임의의 특정 형태 또는 분자량 범위로 제한되지 않는다. 직 쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 경우, 상기 분자량은 바람직하게는 500 내지 100,000이다. 2000 내지 60,000의 분자량이 바람직하게 사용되며 약 5,000 내지 약 40,000이 바람직하다. 예시적인 실시태양에서, 상기 사용된 PEG는 메톡시-PEG이며, 평균 분자량은 약 5,000이다.
또 다른 실시태양에서 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 하나보다 많은 PEG 부분이 결합된 분지된 PEG이다. 분지된 PEG의 예들이 미국 특허 제 5,932,462 호; 미국 특허 제 5,342,940 호; 미국 특허 제 5,643,575 호; 미국 특허 제 5,919,455 호; 미국 특허 제 6,113,906 호; 미국 특허 제 5,183,660 호; WO 02/09766; 문헌[Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994)]; 및 [Yamasaki et al., Agric. Biol . Chem ., 52: 2125-2127, 1998]에 개시되어 있다. 바람직한 실시태양에서 상기 분지된 PEG의 각 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 40,000 달톤 이하이다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 PEG 부분이 결합된 헤모글로빈 결합체를 제공한다. 상기 PEG-헤모글로빈은 CO 형태이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 결합체는 포스페이트 완충된 염수 중에서 제형화된다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 PEG 부분이 결합된 헤모글로빈 결합체를 제공한다. 다양한 실시태양에서, 상기 PEG-헤모글로빈은 산소 제거되고 CO 형태가 아니다. 다른 실시태양에서, 상기 PEG-헤모글로빈은 CO 형태이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 결합체는, 상기 PEG-Hb가 산소화되거나, CO 또는 결합되지 않은 형태이거나 간에, 고장성 염수(고 농도 염) 중에서 제형화된다. 상기 고장성 제형에 유용한 예시적인 염(예를 들어 NaCl) 농도는 약 4% 내지 약 8%, 약 4.5 내지 약 7.5%, 또는 약 5% 내지 약 7%이다. 예시적인 제형은 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 또는 약 8% 염을 포함한다. 하나의 제형에서 상기 염 농도는 7.5%이다. 다양한 실시태양에서, 상기 염은 NaCl이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 제형의 삼투질 농도는 약 300 내지 400, 또는 약 325 내지 375, 또는 약 340 내지 360 mOsmol이다. 예시적인 실시태양에서 상기 염은 NaCl이다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 응고 장애의 교정에서 신선한 동결된 혈장과 동등한 효능의 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 약 100%의 효능을 갖는 PEG-Hb-기재 소생액을 제공한다. 이 실시태양에 따른 예시적인 제형은 응고 인자, 혈소판 또는 응고 장애의 완화에 도움이 되는 것으로 공지된 다른 물질들을 추가로 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 약 450 ㎖의 전체 유체 부피를 가지며 1 단위의 농축 적혈구 세포, 바람직하게는 인간 적혈구 세포와 동등한 산소 운반 및/또는 산소 확산 능력을 갖는 PEG-Hb 소생액을 제공한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 CO를 운반하고 이를 조직에 확산시킬 수 있는 PEG-Hb 제형(예를 들어 소생액)을 제공한다. 예시적인 제형은 약 450 ㎖의 전체 유체 부피를 가지며, 치료학적으로 적절한 양의 CO를 조직으로 운반하기에 충분한 CO 운반 및/또는 CO 확산 능력을 갖는다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 응고 인자들이 존재하는 PEG-Hb 소생액을 제공한다. 다양한 실시태양에서, 상기 응고 인자는 신선한 동결된 혈장의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 양으로 존재한다.
예시적인 실시태양에서, 상기 소생액은 혈소판을 포함한다. 혈소판을 포함하는 본 발명의 소생액은 단일 성분 채집 단위의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 대략적으로 동등한 세포 수 및 활성을 갖는다.
보관에 대한 안정성은 본 발명의 중요한 목적이다. 다양한 실시태양에서, 본 발명은 주변 온도(약 25 ℃)에서 4 개월 이상, 6 개월 이상, 9 개월 이상 또는 12 개월 이상 안정한 PEG-Hb 소생액을 제공한다.
본 발명은 또한 다양한 실시태양에서 현재 은행에 예치된 혈액 제품보다 더 면역원성이지 않은 PEG-Hb 소생액을 제공한다. 현재 은행에 예치된 혈액 제품보다 더 혈전형성성이지 않은 PEG-Hb 소생액을 또한 제공한다.
본 발명에 따른 예시적인 제형은 이들 특성들 중 하나 이상을 임의의 조합으로 포함한다: 약 4.0 내지 4.6 중량% Hb, 약 1.0 내지 5.0 중량% Met, 약 0.0 내지 5.0%의 HbO2, 약 95.0 내지 100.0%의 HbCO, 약 8.10 내지 8.20의 pH, 약 325 내지 370 mOsmol의 삼투질 농도, 약 10.00 내지 14.00의 P50(mm Hg), 및 각각 약 1.4 및 1.9의 흡광도, 2.5 내지 3.0의 568 ㎚/500 ㎚에서의 피크 비를 갖는 538 ㎚ 및 568 ㎚에서의 주요 피크를 갖는 광학 스펙트럼. 다른 예시적인 제형에서, 상기 제형은 541 및 576 ㎚에서 주요 피크를 갖는 광학 스펙트럼을 갖는다.
훨씬 더 구체적으로, 본 발명의 예시적인 제형은 이들 특성들 중 하나 이상을 임의의 조합으로 포함한다: 약 4.5 중량% Hb, 약 1.1 중량% Met, 약 1.2%의 HbO2, 약 99.4%의 HbCO, 약 8.14의 pH, 약 356 mOsmol의 삼투질 농도, 약 12.2의 P50(mm Hg), 및 각각 약 1,493 및 1,465의 흡광도 및 약 2.6의 568 ㎚/500 ㎚에서의 피크 비를 갖는 538 ㎚ 및 568 ㎚에서의 주요 피크를 갖는 광학 스펙트럼.
결합체의 제조
바이러스 활성 제거된 헤모글로빈의 제조
본 발명의 결합체의 제조에 유용한 전구체 헤모글로빈을 적혈구(RBC)로부터 단리할 수 있다. 적합한 RBC 출처는 인간 혈액, 소 혈액, 양 혈액, 돼지 혈액, 다른 피실험자들로부터의 혈액 및 트랜스제닉하게 생성된 헤모글로빈, 예를 들어 문헌[BIO/TECHNOLOGY, 12:55-59(1994)]에 개시된 트랜스제닉 Hb를 포함한다.
상기 혈액을 살아 있거나 또는 새로 도살된 공여체로부터 채혈할 수 있다. 소 전혈의 한 가지 채혈 방법이 미국 특허 제 5,084,558 호 및 5,296,465 호(Rausch et al에게 허여됨)에 개시되어 있다. 상기 혈액을 위생적인 방식으로 채혈하는 것이 바람직하다.
헤모글로빈의 단리 및 정제를 위한 다수의 방법이 공지되어 있으며; 상기 방법을 본 발명의 조성물에 일반적으로 적용할 수 있다. 하기 본 발명의 논의는 예시적인 것이며 제한이 아니다.
다양한 실시태양에서, 채혈 시 또는 채혈 후 바로, 혈액을 하나 이상의 응고방지제와 임의로 혼합하여 상기 혈액의 현저한 응고를 방지한다. 적합한 혈액용 응고 방지제는 당해 분야에 전통적으로 공지되어 있으며 예를 들어 나트륨 시트레이트, 에틸렌다이아민테트라아세트산 및 헤파린을 포함한다. 혈액과 혼합 시, 상기 응고 방지제는 고체 형태, 예를 들어 분말, 또는 수용액일 수 있다.
상기 혈액 용액을 상기 응고 방지 단계 전에 또는 상기 단계 동안, 예를 들어 거르기(straining)에 의해 걸러, 큰 응집체 및 입자들을 제거할 수 있다. A600 메쉬 스크린이 적합한 스트레이너의 예이다.
이어서 상기 혈액 용액 중의 RBC를 적합한 수단에 의해, 예를 들어 정용여과에 의해 또는 하나 이상의 용액, 예를 들어 등장성 용액과 함께 별도의 희석 및 농축 단계의 조합에 의해 임의로 세척하여 RBC를 세포 외 혈장 단백질, 예를 들어 혈청 알부민 또는 항체(예를 들어 면역글로불린(IgG))로부터 분리시킨다. 상기 RBC를 배치 또는 연속적인 공급 방식으로 세척할 수 있는 것으로 생각된다.
허용 가능한 등장성 용액이 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 제형에 일반적으로 사용될 수 있다. 예시적인 등장성 용액은 중성 pH 및 약 285 내지 315 mOsm의 삼투질 농도를 갖는다. 등장성 용액의 비 제한적인 예로는 RBC의 세포막을 파괴하지 않는 pH 및 삼투질 농도를 갖고 전혈의 혈장 부분을 대체하는 시트레이트/염수 용액과 같은 용액이 있다. 예시적인 상기 등장성 용액은 나트륨 시트레이트 다이하이드레이트(6.0 g/L) 및 염화 나트륨(8.0 g/L)의 수용액으로 구성된다.
본 발명의 방법에 유용한 물은 증류수, 탈이온수, 주사용 수(WFI) 및/또는 저 발열원 수(LPW)를 포함한다. WFI(바람직함)는 주사용 수에 대한 미국 약전 명세를 충족하는 탈이온화된 증류수이다. WFI는 문헌[Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23(1991)]에 추가로 개시되어 있다. LPW(바람직함)는 0.002 EU/㎖ 미만을 함유하는 탈이온수이다.
상기 혈액 용액 중의 RBC를 정용 여과에 의해 세척할 수 있다. 적합한 정용 여과기(diafilter)는 RBC를 실질적으로 더 작은 혈액 용액 성분들로부터 분리시키는 기공 크기, 예를 들어 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 필터(예를 들어 0.2 ㎛ 필터)를 갖는 미세다공성 멤브레인을 포함한다. 동시에, 여과된 등장성 용액을 상기 정용 여과기를 통한 여액 상실 속도(또는 부피)와 동일한 속도로, 보충물(makeup)로서 연속적으로(또는 배치식으로) 첨가한다. RBC 세척 중에, RBC보다 직경이 현저하게 더 작거나, 또는 혈장과 같은 유체인 상기 혈액 용액의 성분들은 상기 여액 중에서 상기 정용 여과기의 벽을 통과한다. RBC, 혈소판 및 상기 희석된 혈액 용액의 보다 큰 무리, 예를 들어 백혈구는 남게 되고, 연속적으로 또는 배치식으로 첨가되는 등장성 용액과 혼합되어 투석된 혈액 용액을 형성한다.
상기 RBC를 또한 일련의 순차적인(또는 역 순차적인) 희석 및 농축 단계를 통해 세척할 수 있으며, 여기에서 상기 혈액 용액을 하나 이상의 등장성 용액에 의해 희석하고 필터를 통해 유동시킴으로써 농축시켜 투석된 혈액 용액을 형성시킨다.
RBC 세척은 상기 RBC를 오염시키는 혈장 단백질 수준이 실질적으로 감소될 때(전형적으로 약 90% 이상) 완료된다. 추가적인 RBC 세척은 상기 RBC로부터 세포 외 혈장 단백질을 추가로 분리시킬 수 있다. 예를 들어, 6 배 부피의 등장성 용액에 의한 정용 여과는 상기 혈액 용액으로부터 약 99% 이상의 IgG를 제거할 수 있다.
이어서 상기 투석된 혈액 용액을, 상기 투석된 혈액 용액 중의 RBC를 백혈구 및 혈소판으로부터 분리시키는 수단, 예를 들어 원심분리에 임의로 노출시킨다.
RBC를 다른 혈액 성분들로부터 분리시키기 위해 당해 분야에 일반적으로 공지된 다른 방법들을 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 침강이 있는데, 여기에서 분리 방법은 RBC를 다른 혈액 성분들로부터 분리시키기 전에, RBC의 현저한 양의 세포막, 예를 들어 상기 RBC의 약 30% 미만의 세포막을 파괴하지 않는다.
상기 RBC의 분리에 이어서, 상기 RBC로부터 헤모글로빈을 추출하여 헤모글로빈-함유 용액을 형성시킨다. 상기 RBC의 용해 및 저 삼투압 팽창을 포함한 다양한 방법들에 의해 추출을 수행할 수 있다. 용해는 헤모글로빈의 산소 운반 및 방출 능력을 현저하게 손상시키지 않으면서 상기 Hb을 방출시키는 다양한 용해 방법들, 예를 들어 기계적 용해, 화학적 용해, 저장성 용해 또는 다른 공지된 용해 방법을 사용할 수 있음을 의미한다.
한편으로, 재조합적으로 생산된 헤모글로빈, 예를 들어 문헌[Nature, 356:258-260(1992)]에 개시된 재조합 생산된 헤모글로빈을 RBC 대신에 본 발명의 방법에서 처리할 수 있다. 상기 헤모글로빈을 함유하는 세균 세포를 세척하고 상술한 바와 같이 오염물질로부터 분리시킨다. 이어서 상기 세균 세포를 당해 분야에 공지된 수단, 예를 들어 볼 밀에 의해 기계적으로 파괴하여 상기 세포로부터 헤모글로빈을 방출시키고 용해된 세포 상을 형성시킨다. 이어서 상기 용해된 세포 상을 용해된 RBC 상과 같이 처리한다.
용해에 이어서, 상기 용해된 RBC 상을 임의로 한외여과하여 보다 큰 세포 찌꺼기, 예를 들어 약 100,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 단백질을 제거한다. 일반적으로, 세포 찌꺼기는 Hb를 제외한 모든 완전 및 단편화된 세포 성분들, 보다 작은 세포 단백질, 전해질, 조효소 및 유기 대사 중간체을 포함한다. 허용 가능한 한외 여과기는 예를 들어 100,000 달톤 필터를 포함한다.
상기 용해된 RBC 상으로부터 Hb를 분리시키는 다른 방법들, 예를 들어 침강, 원심분리 또는 미세여과를 사용할 수 있다. 이어서 상기 Hb 여액을 한외 여과하여 보다 작은 세포 찌꺼기, 전해질, 조효소, 대사 중간체 및 분자량이 약 30,000 달톤 미만인 단백질, 및 상기 Hb 한외 여액으로부터의 물을 제거할 수 있다. 적합한 한외 여과기는 30,000 달톤 한외 여과기를 포함한다.
이어서 상기 농축된 Hb 용액을 하나 이상의 병렬 크로마토그래피 컬럼을 향하게 하여 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상기 헤모글로빈을 다른 오염물질, 예를 들어 항체, 내독소, 인지질 및 효소 및 바이러스로부터 추가로 분리시킬 수 있다. 적합한 매질의 예로는 음이온 교환 매질, 양이온 교환 매질, 소수성 상호작용 매질 및 친화성 매질이 있다. 하나의 실시태양에서, 크로마토그래피 컬럼은 Hb를 비-헤모글로빈 단백질로부터 분리시키기에 적합한 음이온 교환 매질을 함유한다. 적합한 음이온 교환 매질은 예를 들어 실리카, 알루미나, 티타니아 젤, 가교결합된 덱스트란, 아가로스 또는 유도체화된 부분, 예를 들어 폴리아크릴아미드, 폴리하이드록시에틸메트아크릴레이트 또는 스타이렌 다이비닐벤젠(양이온 화학 작용기, 예를 들어 다이에틸아미노에틸 또는 4급 아미노에틸 그룹으로 유도체화되었다)을 포함한다. 다른 단백질 및 오염물질(용해된 RBC 상 중에 있을 듯한)에 비해 Hb의 선택성 흡수 및 흡착에 적합한 음이온 교환 매질 및 상응하는 용출제는 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
상기 Hb 용액을, 산화된 헤모글로빈(메트Hb)의 형성의 변성으로부터 발생하는 바와 같이, 상기 Hb 용출물 중의 Hb가 산소를 운반하고 방출하는 능력을 현저하게 감소시키지 않으면서 상기 Hb를 실질적으로 산소 제거하는 수단에 의해 임의로 산소 제거하여 산소 제거된 Hb 용액(이후부터 데옥시-Hb)을 형성시킨다.
상기 Hb 용출물을 상 멤브레인을 가로질러 불활성 기체의 기체 운반에 의해 산소 제거할 수 있다. 상기와 같은 불활성 기체는 예를 들어 질소, 아르곤 및 헬륨을 포함한다. 당해 분야에 공지된 헤모글로빈 용액의 산소 제거를 위한 다른 수단들을 상기 Hb 용출물의 산소 제거에 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 상기와 같은 다른 수단은 예를 들어 상기 Hb 용출물의 질소 살포, 환원제, 예를 들어 N-아세틸-L-시스테인(NAC), 시스테인, 나트륨 다이티오나이트 또는 아스코르베이트에 의한 화학적 소거, 또는 빛에 의한 광분해를 포함할 수 있다. 상기 산소 제거된 헤모글로빈을 CO 형태로 전환시킬 수 있다.
산소 제거를, 상기 Hb 용액의 pO2가 목적하는 수준으로 감소할 때까지, 예를 들어 상기 Hb 용액 중의 산소 공급된 Hb(옥시헤모글로빈 또는 HbO2) 함량이 약 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하 또는 1% 이하일 때까지 계속한다.
산소 제거 중에, 상기 Hb 용액의 온도를 전형적으로는 메트헤모글로빈 형성 속도에 대해 산소 제거 속도가 균형을 이루는 수준에서 유지시킨다. 온도를 메트헤모글로빈 함량이 20% 미만으로 제한되도록 유지시킨다. 최적 온도는, 상기 Hb 용액을 여전히 산소 제거하면서, 약 5% 미만의 메트헤모글로빈 함량, 및 바람직하게는 약 2.5% 미만의 메트헤모글로빈 함량을 생성시킬 것이다. 전형적으로, 산소 제거 중 상기 Hb 용액의 온도를 약 15 ℃ 내지 약 35 ℃에서 유지시킨다. 산소 제거 중 및 후속적으로 본 발명 방법의 나머지 단계들 전체를 통해 상기 Hb를 상기 Hb에 의한 산소 흡수를 최소화하는 낮은 산소 환경에서 유지시킨다.
상기 산소 제거된-Hb를, 안정화제, 예를 들어 설프하이드릴 화합물을 함유하는 저 산소 함량 보관 완충제로 임의로 평형시켜 산화-안정화된 데옥시-Hb를 형성시킨다. 적합한 설프하이드릴 화합물은 무독성 작용제, 예를 들어 N-아세틸-L-시스테인(NAC), D,L-시스테인, γ-글루타밀-시스테인, 글루타치온, 2,3-다이머캅토-1-프로판올, 1,4-부탄다이티올, 및 다른 생물학적으로 적합한 설프하이드릴 화합물을 포함한다. 보관 기간에 걸쳐 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만으로 메트헤모글로빈 함량을 유지하도록 산소를 소거하는 설프하이드릴 농도를 확립시키는 양의 설프하이드릴 화합물을 가한다. 전형적으로, 상기 첨가되는 설프하이드릴 화합물의 양은 약 0.05 내지 약 0.2 중량%의 설프하이드릴 농도를 확립시키기에 충분한 양이다.
본 발명은 다양한 실시태양에서, 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 산소 제거된 헤모글로빈 및 안정화제의 용액을 열 바이러스 불활성화 공정에 가함을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 예시적인 실시태양에서, 상기 열 바이러스 불활성화 공정은 상기 용액을 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성을 불활성화시키기에 충분하게 상승된 온도에 노출시킴을 포함하며; 상기 열을 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성의 불활성화를 성취하기에 충분한 시간 동안 상승시킨다. 예시적인 안정화제는 상기 용액 중의 산소 제거된 헤모글로빈보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하고, 이에 의해 상기 산소 제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합이 최소화된다. 상기 용액은 상기 열 바이러스 활성 제거 공정에서 약 10%, 8%, 6%, 4% 또는 2% 초과의 메트헤모글로빈의 형성을 방지하기에 충분한 양의 안정화제를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 안정화제는 메트헤모글로빈 농도를 약 5% 이하에서 유지시키기에 충분한 양으로 선택되고 존재한다.
다양한 실시태양에서, 상기 조성물은 헤모글로빈과 상기 헤모글로빈에 결합된 적어도 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 약 10 이상의 수용성 중합체 부분 간의 공유 결합체를 포함한다. 상기 수용성 중합체는 상기 헤모글로빈 상의 임의의 적합한 잔기에 결합된다. 본 발명의 예시적인 결합체에서, 상기 수용성 중합체 부분 중 하나 이상이 아미노산 측 쇄, 예를 들어 리신 잔기의 ε-아민 부분에 결합된다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 각각의 Hb 분자가 7, 8, 9 또는 10 PEG 부분들에 결합되는 상기 나타낸 바와 같은 PEG-Hb 결합체를 제공한다. 다양한 실시태양에서, 본 발명은 Hb 분자당 PEG 부분의 평균 수가 약 7 내지 약 10, 또는 약 8 및 약 9인 PEG-Hb 결합체의 집단을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 PEG 부분은 PEG 5000 부분이다.
상기 결합체의 합성
다양한 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 수용성 중합체 부분과 헤모글로빈 폴리펩타이드 간의 결합체를 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 전구체 헤모글로빈은 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 조성물이다. 상기 조성물은 산소 제거된 헤모글로빈 및 안정화제의 용액을 열 바이러스 불활성화 공정에 가함을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 예시적인 실시태양에서, 상기 열 바이러스 불활성화 공정은 상기 용액을 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성을 불활성화시키기에 충분하게 상승된 온도에 노출시킴을 포함하며; 상기 열을 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성의 불활성화를 성취하기에 충분한 시간 동안 상승시킨다. 예시적인 안정화제는 상기 용액 중의 산소 제거된 헤모글로빈보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하고, 이에 의해 상기 산소 제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합이 최소화된다. 상기 용액은 상기 열 바이러스 활성 제거 공정에서 약 10%, 8%, 6%, 4% 또는 2% 초과의 메트헤모글로빈의 형성을 방지하기에 충분한 양의 안정화제를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 안정화제는 메트헤모글로빈 농도를 약 5% 이하에서 유지시키기에 충분한 양으로 선택되고 존재한다.
다양한 실시태양에서, 상기 전구체 헤모글로빈 폴리펩타이드는 수용성, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 조성물이다. 상기 조성물은 약 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하며, 전구체 헤모글로빈 용액을 약 12 시간까지, 예를 들어 약 1 시간 내지 약 4 시간 동안 약 60 ℃로 가열함을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 상기 전구체 용액은 안정화제를 임의로 포함한다. 상기 안정화제는 상기 용액 중의 헤모글로빈 분자보다 산소 또는 반응성 산소 종과 더 쉽게 반응하는 구조를 포함하고, 이에 의해 상기 산소 제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합이 최소화되고, 이에 의해 상기 조성물이 형성된다.
상기 수용성 중합체와 상기 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 펩타이드 간의 결합체는 적합한 조건 하에서 상기 수용성 중합체의 활성화된 유도체와 헤모글로빈의 반응에 의해 형성될 수 있다. 다양한 실시태양에서, 상기 수용성 중합체를 아미노산 잔기의 측쇄, 예를 들어 리신 잔기의 ε-아민 부분을 통해 상기 헤모글로빈에 결합시킨다. 본 발명의 예시적인 결합체는 상기 헤모글로빈에 결합된 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 수용성 중합체 부분을 포함한다.
본 발명 결합체의 예시적인 형성 방법에서, 전구체 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 조성물을 산소 공급하고 상기 산소 공급된 헤모글로빈을 상기 헤모글로빈의 아미노산 잔기에 상보성인 반응성의 활성화된 수용성 중합체 분자와 접촉시켜, 상기 산소 공급된 헤모글로빈 용액 중에 상기 수용성 중합체와 산소 공급된 헤모글로빈 분자 간의 공유 결합체를 형성시킨다. 예시적인 실시태양에서, 상기 공유 결합체의 헤모글로빈은 산소 제거되거나 CO에 결합된다. 상기 산소 제거는 기계적이거나 화학적일 수 있으며, 철이 결합되지 않거나 CO에 결합된 헤모글로빈 분자를 제공할 수 있다.
일반적으로, 상기 수용성 중합체(예를 들어 PEG) 부분 및 폴리펩타이드는 반응성 그룹의 사용을 통해 함께 결합되며, 상기 반응성 그룹은 전형적으로는 새로운 유기 작용기 내로의 결합 공정에 의해 변형되거나 또는 생리학적으로 관련된 조건 하에서 비 반응성인 종이다. 상기 반응성 작용기(들)는 상기 펩타이드 및 수용성 중합체 상의 임의의 위치에 위치한다. 본 발명의 실시에 유용한 반응성 그룹 및 반응 부류들은 일반적으로 생물결합 화학 분야에 널리 공지된 것들이다. 반응성 아미노산 부분과 함께 이용할 수 있는 현재 유리한 반응 부류는 비교적 순한 조건 하에서 진행되는 것이다. 여기에는 비 제한적으로 친핵성 치환(예를 들어 아민 및 알콜과 아실 할라이드, 활성 에스터와의 반응), 친전자성 치환(예를 들어 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 대한 첨가(예를 들어 마이클 반응, 딜스-알더 첨가)가 포함된다. 상기 및 다른 유용한 반응들은 예를 들어 하기의 문헌들에 논의되어 있다: March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney et al ., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.
헤모글로빈 폴리펩타이드 또는 수용성 중합체에 매달린 유용한 반응성 작용기는 비 제한적으로 하기를 포함한다:
(a) 카복시 그룹 및 그의 다양한 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시벤즈트라이아졸 에스터, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스터, p-나이트로페닐 에스터, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스터;
(b) 예를 들어 에스터, 에테르, 알데하이드 등으로 전환될 수 있는 하이드록실 그룹,
(c) 할로알킬 그룹, 여기에서 상기 할라이드는 나중에 친핵성 그룹, 예를 들어 아민, 카복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카보음이온, 또는 알콕사이드 이온으로 치환되어 상기 할로겐 원자의 작용기에서 새로운 그룹의 공유 결합을 생성시킬 수 있다;
(d) 딜스-알더 반응에 참여할 수 있는 친다이엔성 그룹, 예를 들어 말레이미도 그룹;
(e) 카보닐 유도체, 예를 들어 이민, 하이드라존, 세미카바존 또는 옥심의 형성을 통해, 또는 그리냐르 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 기전을 통해 후속의 유도체화를 가능하도록 하는 알데하이드 또는 케톤 그룹,
(f) 아민과 후속 반응으로, 예를 들어 설폰아미드를 형성하는 설포닐 할라이드 그룹;
(g) 예를 들어 말레이미드와의 반응에 의해 다이설파이드로 전환되거나 또는 아실 할라이드와 반응하거나, 또는 티오에테르로 전환될 수 있는 티올 그룹;
(h) 예를 들어 아실화되거나, 알킬화되거나 산화될 수 있는 아민 또는 설프하이드릴 그룹;
(i) 예를 들어 가환, 아실화, 마이클 첨가 등을 겪을 수 있는 알켄;
(j) 예를 들어 아민 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드; 및
(k) 예를 들어 아민 및 설프하이드릴과 반응할 수 있는 말레이미드.
상기 반응성 작용기를 상기 작용기가 상기 반응성 중합체성 개질 그룹(예를 들어 PEG)의 조립에 필요한 반응들에 참여하지 않거나 이를 방해하지 않도록 선택할 수 있다. 한편으로, 반응성 작용기를 보호 그룹의 존재에 의해, 상기 반응에 참여하는 것으로부터 보호할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 특정 작용기가 선택된 일련의 반응 조건들을 방해하지 않도록 보호하는 방법을 이해한다. 유용한 보호 그룹들의 예에 대해 예를 들어 문헌[Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참조하시오.
적합한 결합 조건은 중합체성 시약과 활성제 간의 결합을 수행하기에 충분한 시간, 온도, pH, 시약 농도, 시약 작용기(들), 상기 활성제 상의 이용 가능한 작용기들, 용매 등의 조건이다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 상기 특정 조건은 다른 것들 중에서도 특히 활성제, 목적하는 결합 유형, 반응 혼합물 중의 다른 물질들의 존재 등에 따라 변한다. 임의의 특정한 경우에 결합을 수행하기에 충분한 조건을 본 발명의 내용의 판독, 관련 문헌에 대한 참조 및/또는 통상적인 실험을 통해 당해 분야의 숙련가에 의해 결정할 수 있다.
예를 들어, 상기 중합체성 시약이 N-하이드록시숙신이미드 활성 에스터(예를 들어 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 카보네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트)를 함유하고 상기 활성제가 아민 그룹(예를 들어 폴리펩타이드 상의 말단 아민 그룹 및/또는 리신 함유 폴리펩타이드의 엡실론 아민)을 함유하는 경우, 결합을 실온에서 약 7.5 내지 약 9.5의 pH에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 중합체성 시약이 비닐설폰 반응성 그룹 또는 말레이미드 그룹을 함유하고 상기 약물학적 활성제가 설프하이드릴 그룹(예를 들어 시스테인 함유 또는 메티오닌 함유 폴리펩타이드의 설프하이드릴 그룹)을 함유하는 경우, 결합을 실온에서 약 7 내지 약 8.5의 pH에서 수행할 수 있다. 더욱이, 상기 중합체성 시약과 회합된 반응성 그룹이 알데하이드 또는 케톤이고 상기 약물학적 활성제가 1차 아민을 함유하는 경우, 결합을, 상기 약물학적 활성제의 1차 아민이 상기 중합체의 알데하이드 또는 케톤과 반응하는 환원적 아민화에 의해 수행할 수 있다. 환원적 아민화는 약 6 내지 약 9.5의 pH에서 일어나는 경우, 상기 약물학적 활성제와 중합체가 이민 결합을 통해 결합되는 결합체를 생성시킨다. 상기 이민 함유 결합체의 적합한 환원제, 예를 들어 NaCNBH3에 의한 후속 처리는 상기 이민을 2차 아민으로 환원시킨다.
예시적인 결합 조건은 상기 결합 반응을 약 4 내지 약 10의 pH, 및 예를 들어 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10.0의 pH에서 수행함을 포함한다. 상기 반응은 약 5 분 내지 약 72 시간, 예를 들어 약 30 분 내지 약 48 시간, 예를 들어 약 4 시간 내지 약 24 시간 진행이 허용된다. 결합이 일어날 수 있는 온도는 전형적으로는, 반드시 그런 것은 않지만, 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃의 범위이며, 종종 실온 이하이다. 상기 결합 반응을 종종 포스페이트 완충제 용액, 나트륨 아세테이트 또는 유사한 시스템을 사용하여 수행한다.
시약 농도에 관하여, 전형적으로는 과잉의 상기 중합체성 시약을 헤모글로빈과 배합한다. 중합체성 시약 대 헤모글로빈의 예시적인 비는 약 1:1(중합체성 시약:헤모글로빈), 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1 또는 30:1의 몰 비를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 결합 반응은 추가의 결합이 실질적으로 일어나지 않을 때까지(이는 시간에 대한 반응의 진행을 모니터함으로써 일반적으로 측정될 수 있다) 진행이 허용된다.
상기 반응의 진행을, 다양한 시점에서 상기 반응 혼합물로부터 분액들을 회수하고 상기 반응 혼합물을 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분광측정 또는 임의의 다른 적합한 분석 방법에 의해 분석함으로써 모니터할 수 있다. 일단 상기 형성된 결합체의 양 또는 남아있는 결합되지 않은 중합체성 시약의 양에 관하여 평탄역에 도달하면, 상기 반응은 완료된 것으로 추정된다. 전형적으로, 상기 결합 반응은 어디에서든 수 분 내지 수 시간(예를 들어 5 분 내지 24 시간 또는 그 이상) 걸린다. 상기 생성되는 생성물 혼합물을 바람직하게는, 반드시 그런 것은 아니지만, 정제시켜 과잉의 중합체성 시약, 결합되지 않은 반응물(예를 들어 활성제) 및 바람직하지 못한 다중 결합된 종들을 분리시킨다. 이어서 생성되는 결합체를 MALDI, 모세관 전기영동, 젤 전기영동, 및/또는 크로마토그래피와 같은 분석 방법들을 사용하여 추가로 특성화할 수 있다.
상기 중합체-헤모글로빈 결합체를 정제하여 상이한 결합 종들을 수득/단리할 수 있다. 한편으로, 및 보다 바람직하게는 보다 낮은 분자량(예를 들어 약 20,000 달톤 미만, 보다 바람직하게는 약 10,000 달톤 미만)의 중합체성 시약을 결합체의 형성에 사용하는 경우, 상기 생성물 혼합물을 정제하여 활성제당 수용성 중합체 분절의 분배를 획득할 수 있다. 예를 들어 상기 생성물 혼합물을 정제하여 Hb 분자당 중합체성 시약의 목적하는 평균 결합 수, 전형적으로는 Hb 분자당 약 7, 8, 9 또는 10의 평균 결합을 획득할 수 있다. 최종 결합체 반응 혼합물의 정제 전략은 다수의 인자, 예를 들어 사용되는 중합체성 시약의 분자량, 특정한 Hb 제형, 목적하는 투여 섭생, 및 개별적인 결합체(들)의 잔류 활성 및 생체 내 성질에 따라 변할 것이다.
경우에 따라, 상이한 분자량을 갖는 결합체들을 젤 여과 크로마토그래피를 사용하여 단리할 수 있다. 즉, 젤 여과 크로마토그래피를 사용하여 상이한 분자량을 기준으로(상기 차이가 수용성 중합체 분절의 평균 분자량에 필수적으로 상응하는 경우) 상이한 수의 중합체성 시약 대 활성제 비(예를 들어 1-머, 2-머, 30 머 등, 여기에서 "1-머"는 활성제에 대한 1 중합체성 시약, "2-머"는 활성제에 대한 2 중합체성 시약 등을 가리킨다)를 분류한다. 예를 들어, 100,000 달톤 단백질이 약 20,000 달톤의 총 분자량을 갖는 분지된 PEG에 랜덤하게 결합되는 예시적인 반응에서(여기에서 상기 분지된 PEG의 각 중합체 "가지"는 약 10,000 달톤의 분자량을 갖는다), 생성되는 반응 혼합물은 개질되지 않은 단백질(약 100,000 달톤의 분자량을 갖는다), 모노PEG화된 단백질(약 120,000 달톤의 분자량을 갖는다), 이중 PEG화된 단백질(약 140,000 달톤의 분자량을 갖는다) 등을 함유할 수 있다.
상기 접근법을 사용하여 PEG 및 상이한 분자량을 갖는 다른 중합체-활성제 결합체를 분리시킬 수 있지만, 상기 접근법은 상기 단백질 내에 상이한 중합체 결합 부위를 갖는 위치 이성체들을 분리시키기에는 일반적으로 유효하지 않다. 예를 들어, 젤 여과 크로마토그래피를 사용하여 PEG 1-머, 2-머, 3- 머 등의 혼합물을 서로 분리시킬 수 있지만, 회수된 PEG-머 조성물들은 각각 활성제 내에 상이한 반응성 아미노 그룹(예를 들어 리신 잔기)에 결합된 PEG를 함유할 수도 있다.
이러한 유형의 분리를 수행하기에 적합한 젤 여과 컬럼은 애머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)(Piscataway, NJ)로부터 입수할 수 있는 수퍼덱스(Superdex)TM 및 세파덱스(Sephadex)TM 컬럼을 포함한다. 특정 컬럼의 선택은 목적하는 분류 범위에 따라 변할 것이다. 용출을 일반적으로는 적합한 완충제, 예를 들어 포스페이트, 아세테이트 등을 사용하여 수행한다. 수거된 분획들을 다수의 상이한 방법, 예를 들어 (i) 단백질 함량의 경우 280 ㎚에서의 광학 밀도(OD), (ii) 소 혈청 알부민(BSA) 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대한 요오드 시험(Sims et al. (1980) Anal . Biochem, 107:60-63), 및 (iv) 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS PAGE)에 이어서 바륨 요오다이드에 의한 염색에 의해 분석할 수 있다.
다양한 실시태양에서, 상기 수용성 중합체는 PEG이며 대략 1 kD, 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 30 kD 또는 40 kD의 분자량을 갖는다. 상기 PEG 부분은 선형 또는 분지된 PEG 종들이다. 상기 PEG 부분(폴리펩타이드에 또는 상기 폴리펩타이드에 결합된 링커에 결합되지 않는다)의 말단은 OH 또는 또 다른 부분, 예를 들어 O-(C1-C4) 치환되거나 비 치환된 알킬 그룹일 수 있다. OMe(이때 Me는 메틸 그룹이다)가 현재 바람직하다.
예시적인 실시태양에서, 상기 수용성 중합체는 선형 또는 분지된 PEG이다. 다양한 실시태양에서, 상기 결합체는 펩타이드당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 PEG 부분을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 수용성 중합체는 선형 PEG이며 상기 결합체는 펩타이드 분자당 대략 6, 7, 8, 9 또는 10 PEG 부분을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시태양에서, 상기 수용성 중합체는 분지된 PEG이며 상기 결합체는 펩타이드 분자당 대략 1, 2, 3, 4 또는 5 PEG를 포함한다.
상기 PEG가 선형 종인 예시적인 실시태양에서, 상기 PEG 부분은 약 200 D 내지 약 20 kDd인 분자량을 갖는다. 상기 PEG 부분이 선형 PEG 부분인 다양한 실시태양에서, 상기 선형 PEG의 분자량은 약 200 D 이상, 약 500 D 이상, 약 1 kD 이상, 약 2 kD 이상, 약 5 kD 이상, 약 10 kD 이상, 약 20 kD 이상, 약 30 kD 이상, 또는 40 kD 이상이다.
본 발명에 유용한 예시적인 PEG 종은 2 개 이상의 PEG 가지를 갖는 분지된 PEG이다. 상기 실시태양의 예는 측쇄 아미노산, 예를 들어 세린, 시스테인 또는 리신 및 이들 아미노산으로부터 개별적으로 또는 함께 형성된 다이-, 트라이- 및 테트라-펩타이드를 기본으로 한다.
상기 PEG 종이 분지된 다른 예시적인 실시태양에서, 상기 분지된 PEG는 2 내지 6 개의 선형 PEG 가지를 포함한다. 예시적인 PEG 가지는 약 200 D 내지 약 30 kD의 분자량을 갖는다. 다양한 실시태양에서, 각각의 가지는 약 2 kD 이상, 약 5 kD 이상, 약 10 kD 이상, 약 15 kD 이상, 약 20 kD 이상, 약 30 kD 이상, 또는 40 kD 이상인 개별적으로 선택된 분자량을 갖는다.
다양한 실시태양에서, 상기 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 부분은 상기 헤모글로빈 분자의 아미노산 잔기의 아민 부분을 통해 공유 결합된다. 예시적인 실시태양에서, 상기 아미노산 잔기는 리신 잔기이며 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 부분은 상기 리신 잔기의 ε-아민 부분에 공유 결합된다. 예시적인 결합 동기들은 아미드 및 유레탄 중에서 선택된 구성원인 결합을 통해 존재한다.
상기 결합체의 안정성
다양한 실시태양에서, 본 발명은 메트헤모글로빈의 형성에 대한 내성에 의해 측정 시, 고도로 안정한 PEG-헤모글로빈 결합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 45 ℃에서 약 4일 이상, 약 5일 이상, 약 6일 이상, 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 또는 약 15일 이상 동안 보관 후 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 또는 3% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 결합체를 제공한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 메트헤모글로빈의 형성에 대한 내성에 의해 측정 시, 고도로 안정한 PEG-헤모글로빈 결합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 4 ℃에서 약 5주 이상, 약 6주 이상, 약 7주 이상, 약 8주 이상, 약 9주 이상, 약 10주 이상, 약 11주 이상, 약 12주 이상, 약 13주 이상, 약 14주 이상, 약 15주 이상, 또는 약 16 주 이상 동안 보관 후 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 또는 3% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 결합체를 제공한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 상기 PEG-헤모글로빈 결합체의 일산화 탄소(CO) 형태를 제공한다. 상기 형태는 표 3에 나타낸 바와 같이 %MET-Hb 형성을 낮게 유지시킴에 관하여 특히 안정한 것으로 보인다. 예를 들어, 상기 CO 형태는 37 ℃에서 16 주 동안 보관 후 단지 4.0% %MET-Hb 만을 나타내었다. 이는 기계적으로 산소 제거된 형태보다 더 안정하다.
본 발명의 예시적인 결합체는 45 ℃에서 약 3 주 이상, 약 4 주 이상 또는 약 5 주 이상 동안 보관 후에 저 혈량성 쇼크의 동물 모델에서 충분히 효능이 있다.
상기 각각의 설명에 따른 예시적인 제형에서, 상기 결합체의 헤모글로빈은 CO 형태이다. 다양한 실시태양에서, 본 발명은 4 ℃에서 약 3 개월 이상, 약 6 개월 이상, 약 9 개월 이상, 또는 약 12 개월 이상 동안 안정한 PEG-Hb-CO 결합체를 제공한다.
복합 제형
다양한 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 PEG-Hb 결합체 또는 제형을, 또 다른 치료제, 또는 상기 제형 중의 PEG-Hb 결합체의 활성을 강화하거나, 보완하거나 증대시키는 작용제와 함께 포함하는 복합 제형을 제공한다. 예시적인 작용제는 비 제한적으로 응고 방지제 또는 응고 방지제에 대한 전구체, 산화방지 효소, 및 허혈/재 관류 손상에 대한 예방 또는 치료를 제공하는 작용제를 포함한다. 이들 예에 따른 예시적인 종들을 하기에 나타낸다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 PEG-Hb 조성물을 혈소판과 함께 포함하는 제형을 제공한다.
혈소판은 혈관 손상 부위에의 결합에 의해서 및 혈장 피브린 응괴의 형성을 촉진함으로써, 상처 입은 포유동물을 혈액 손실로부터 보호하는 무핵 골수-유래된 혈액 세포이다. 골수 결핍에 의해 순환 혈소판이 고갈된 인간은 생명에 위협이 되는 자발적인 출혈, 및 외상 또는 수술에 따른 출혈 합병증에 기인하는 혈소판의 덜 심한 결핍을 앓는다.
인간 혈소판 세포에 대해 공지된 것은 많다. 혈소판의 보관을 위한 기법, 물질 및 방법을 개시하는 일반적인 발행물들은 하기와 같다: Murphy et al., Blood 60(1):194-200 (1982); Murphy in "The Preparation and Storage of Platelets for Transfusion", Mammon, Barnhart, Lusher, and Walsh, PJD Publications, Ltd., Westbury, N.Y. (1980); Murphy in "Platelet Transfusion", Progress in Hemostasis and Thrombosis, Vol. III, Ed. by T. Spaet, Grune and Stratton, Inc. (1976); Murphy et al., Blood 46(2):209-218 (1975); Kilkson et al., Blood 64(2):406-414 (1984); Murphy in "Platelet Storage for Transfusion", Seminars in Hematology 22(3): 165-177 (1985); Simon et al., Transfusion 23:207-212 (1983); Cesar et al., Transfusion 27(5):434-437 (1987).
순환 혈소판 수가 약 70,000/㎕ 이하로 감소하는 것은, 들리는 바에 의하면, 표준화된 피부 출혈 시간 시험을 연장시키고, 상기 출혈 간격이 연장되어, 상기 혈소판 수가 0까지 떨어짐에 따라 거의 무한대로 외삽된다. 20,000/㎕ 미만의 혈소판 수를 갖는 환자는 점막 표면으로부터의 자발적인 출혈에 대단히 민감한 것으로 생각된다.
본 발명의 혈소판 PEG-Hb 제형은 골수 결핍, 예를 들어 재생불량성 빈혈, 급성 및 만성 백혈병, 전이성 암, 특히 이온화 방사선 및 화학요법에 의한 암 치료로부터 생성되는 골수 결핍증을 앓고 있는 환자의 치료에 유용하다. 더욱이, 상기 제형은 큰 수술, 상해(예를 들어 외상) 및 패혈증과 관련된 혈소판 감소증의 치료 및 개선에 유용하다.
상기 혈소판 및 PEG-Hb 제형을 임의의 실용적이고 효능 있는 방식으로 배합할 수 있다. 따라서, 예시적인 실시태양에서, 상기 혈소판 및 PEG-Hb를 상기 생성 조성물을 환자에게 투여하기 조금 전에 배합한다. 다른 예시적인 실시태양에서, 상기 혈소판-PEG-Hb 제형을 제조하고 적합한 시간 동안 보관한다.
다양한 실시태양에서, 상기 혈소판을 단독으로 또는 상기 PEG-Hb 제형과 함께 안정화제에 의해 안정화시킨다. 본 발명에 유용한 예시적인 안정화제는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제 7,241,282 호 및 5,466,573 호를 참조하시오. 상기 혈소판 공급원은 또한 임의로, 미국 특허 제 6,649,072 호에 개시된 바와 같은 혈소판 및 피브리노겐 풍부한 혈액 조성물이다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 2 개(또는 그 이상)의 성분이 존재하고 배합 전에 별도로 보관되는 키트를 제공한다. 예를 들어 다양한 실시태양에서 본 발명은 상기 혈소판 및 PEG-Hb 제형을 배합하기 위한 장치를 제공한다. 상기 장치는 인자(들)의 수거 또는 보관을 위한 제 1 용기; 및 상기 PEG-Hb 제형이 보관되는 제 1 용기와 유체 연통하는 하나 이상의 부속 용기를 포함한다. 사용 시, 상기 제 1 및 부속 용기 사이에는, 봉인의 파열 시 상기 제형의 두 성분이 혼합되고 후속적으로 상기 제형이 필요한 피실험자에게 투여되도록 하는 봉인 파손 장벽이 삽입되어 있다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 상기 개시된 장치의 등가물들을 입수할 수 있으며 이들은 본 내용의 진의 및 범위 내에 있다. 예를 들어, 키트는 2 개 이상의 앰풀을 포함할 수 있고, 이들은 각각 본 발명의 복합 제형의 요소를 액체 또는 건조된 형태로 함유한다. 상기 앰풀의 내용물을 상기 복합 제형이 필요한 피실험자에게 상기 제형을 투여하기 전 적합한 시기에, 적합한 방식으로 혼합할 수 있다.
추가의 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 PEG-Hb 제형이 하나 이상의 응고 인자와 배합된 제형을 제공한다. 상기와 같은 제형은 몇몇 응고 질환(예를 들어 유전성 또는 후천성 혈액 응고 결함), 급성 출혈의 치료, 및 다른 용도들 중에서도 특히 수술 전 출혈 예방에 유용하다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 PEG-Hb 제형 및 인자 II, V, VII, VIII, IX, X, XI 및 XII, 및 이들의 조합 중에서 선택된 구성원인 응고 인자를 포함하는 복합 제형을 제공한다. 다양한 예시적인 실시태양에서, 상기 인자는 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX 및 이들의 조합 중에서 선택된다.
혈액의 응고는 다수의 성분들(이들 중 거의 모두가 단백질이다)의 연속적인 상호작용을 요하는 복잡한 과정이다. 이들 성분은 피브리노겐 및 인자 II, V, VII, VIII, IX, X, XI 및 XII를 포함한다. 이들 성분 중 임의의 성분, 또는 비작용성 성분의 결여는 필요 시 혈액을 응고시킬 수 없게 하고, 그 결과 환자에게 과도하고 생명 위협적인 혈액 손실을 생성시킬 수 있다.
당해 분야는 응고 인자 농축물 다양한 흡수제의 확립된 제조 방법들로 충만하다. 예를 들어, 인자 VIII 복합체의 정제는, 약 90% 이상의 순도 수준을 가지며 동결 건조된 형태로 장기간 보관에 충분히 안정성인 인자 VIII 제제를 생성시켰다. 예를 들어 미국 특허 제 4,650,858 호 및 미국 특허 제 5,399,670 호를 참조하시오. 인자 VIII 제형을 또한 입수할 수 있다. 여기에는 인간 인자 VIII(휴메이트( Humate)TM, 모노클레이트(Monoclate)TM, 임뮤네이트(lmmunate)TM, 및 헤모필( Hemofil)TM과 활성 원소가 같다), 재조합 인간 인자 VIII(PCT 특허 출원 WO 91/09122에 개시된 r-VIII SQ(리팩토(ReFacto)TM의 활성 원소 또는 코게네이트(Kogenate)TM 또는 리콤비네이트(Recombinate)TM의 활성 원소)와 같다), 돼지 인자 VIII(입센 사(Ipsen, Inc., USA)에 의해 판매되는 제품인 하이에이트(Hyate):CTM의 활성 원소이다), 또는 재조합 돼지 인자 VIII(예를 들어 특허 출원 WO 01/68109에 개시되고 "POL1212"로서 확인되는 것과 같은 돼지 인자 VIII의 변형된 B-무 도메인 형태)가 포함된다.
본 발명에 유용한 추가적인 인자 VIII 제형들은 미국 특허 제 5,565,427 호, 미국 특허 제 5,605,884 호, 미국 특허 제 5,763,401 호, 미국 특허 제 5,874,408 호, 미국 특허 제 5,962,650 호, 미국 특허 제 5,972,885 호, WO 89/09784, 및 WO 94/07510에 개시된 것들을 포함한다.
다른 인자들을 유사하게 입수할 수 있으며 이들은 본 발명에 유용하다. 예시적인 실시태양에서, 인자 VII를 본 발명의 PEG-Hb 제형에 혼입시킨다. 인자 VII는, 혈액 내로 분비되어 여기에서 자이모겐 형태로 순환하는 406 개 아미노산의 단쇄 당단백질(분자량 50,000)이다. 시험관 내에서, FVII는 활성화된 응고 인자들인 인자 X(FXa), 인자 IX(FIXa), 인자 XII(FXIIa) 또는 인자 II(FIIa)의 작용에 의해 활성화된 인자 FVII 또는 FVIIa로 단백질 분해에 의해 활성화될 수 있다. FVIIa는 혼자서 응고를 촉진하는 것이 아니고, 손상 부위에 노출된 조직 인자(TF)와 연합할 수 있다. 상기 FVIIa/TF 복합체는 FX를 FXa로 전환시키고, 이에 의해 손상 부위에 국소적인 지혈을 유도할 수 있다. FVII의 FVIIa로의 활성화는 Arg-152와 Ile-153 사이의 단일 펩타이드 결합의 단백질 분해적 절단을 수반하여, 단일의 다이설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 152 아미노산 잔기의 경 쇄 및 254 아미노산 잔기의 중 쇄로 이루어진 2-쇄 분자를 생성시킨다.
인자 VII의 제조 및 정제 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제 6,329,176 호를 참조하시오. FVII의 일부 단백질 조작된 변체들이 보고되었다. 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: Dickinson et al., J. Bio . Chem. 272:19875-19879 (1997), Kemball-Cook et al., J. Biol . Chem. 273:8516-8521 (1998), Bharadwaj et al., J. Biol . Chem. 271:30685-30691 (1996), Ruf et al., Biochemistry, 38:1957-1966 (1999); WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935; 및 미국 특허 제 5,580,560 호. FVII는 BHK 및 다른 포유동물 세포들(WO 92/15686, WO 91/11514 및 WO 88/10295)에서 발현되었으며 진핵생물 세포(WO 00/28065)에서 FVII 및 kex2 엔도프로테아제가 함께 발현되었다. 인간 재조합 FVIIa의 상업적인 제제가 노보세븐(NovoSeven)TM으로서 판매된다. 노보세븐TM은 A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈 에피소드의 치료에 지시된다.
B형 혈우병은 혈액의 응고 성질에 영향을 미치는 인자 IX라 지칭되는 혈장 단백질의 결핍에 의해 유발된다. 상기 질환은, 결함 유전자가 X 염색체상에 위치하는, 유전되는 X-연관 열성 형질에 의해 유발된다. 따라서, 상기 질환은 주로 남성에서 발생한다. 인간 인자 IX는 혈액 응고에서 중요한 역할을 하는 비타민 K-의존성 자이모겐이다. 인자 IX는 55,000 달톤의 분자량을 갖는 415-아미노산 단 쇄 자이모겐으로서 순환하며, 대략 5 ㎍/㎖로 정상 혈장 중에 존재한다.
인자 IX 농축물의 여러 상업적인 형태들을, B형 혈우병을 앓고 있는 환자의 대체 요법을 제공하는데 이용할 수 있다. 예를 들어, 혈액 유래된 인자 IX 복합체 제품들(다른 인자들을 함유한다)이 베뷸린(Bebulin) VHTM(Baxter Healthcare, Vienna, Austria), 코닌(konyne) 80TM(Bayer Corporation, Elkhart Ind.), 프로필닌(Profilnine) SDTM(Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles Calif.), 및 프로플렉스(Proplex)TM(Baxter Healthcare, Glendale Calif.) 브랜드로 판매된다. 인자 IX 제품의 어느 정도 더 정제된 형태들이 알파닌(Alphanine) SDTM(Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles Calif.) 및 모노닌(Mononine)TM(Aventis Behring, Kankakee Ill.) 브랜드로 판매된다. 재조합적으로 제조된 인자 IX 농축물에 관하여, 현재 입수할 수 있는 하나의 제품은 베네픽스(Benefix)TM(Wyeth/Genetics Institute, Cambridge Mass.)이다.
다른 응고 인자들의 재조합 합성 및 정제 및 이들 인자의 본 발명의 제형 내로의 혼입은 당해 분야의 숙련가들의 능력 내에 있다.
인자(들) 및 PEG-Hb 제형을 임의의 실용적이고 효능 있는 방식으로 배합할 수 있다. 따라서, 예시적인 실시태양에서, 상기 인자(들) 및 PEG-Hb를 상기 생성되는 조성물을 피실험자에게 투여하기 조금 전에 배합한다. 다른 예시적인 실시태양에서, 상기 인자(들)-PEG-Hb 제형을 제조하고 적합한 시간 동안 보관한다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은, 2 개(또는 그 이상)의 성분이 존재하고 배합 전에 별도로 보관되는 키트를 제공한다. 예를 들어 다양한 실시태양에서 본 발명은 상기 인자(들) 및 PEG-Hb 제형을 배합하기 위한 장치를 제공한다. 상기 장치는 인자(들)의 수거 또는 보관을 위한 제 1 용기; 및 상기 PEG-Hb 제형이 보관되는 제 1 용기와 유체 연통하는 하나 이상의 부속 용기를 포함한다. 사용 시, 상기 제 1 및 부속 용기 사이에는, 봉인의 파열 시 상기 제형의 두 성분이 혼합되고 후속적으로 상기 제형이 필요한 피실험자에게 투여되도록 하는 봉인 파손 장벽이 삽입되어 있다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 상기 개시된 장치의 등가물들을 입수할 수 있으며 이들은 본 내용의 진의 및 범위 내에 있다. 예를 들어, 키트는 2 개 이상의 앰풀을 포함할 수 있고, 이들은 각각 본 발명의 복합 제형의 요소를 액체 또는 건조된 형태로 함유한다. 상기 앰풀의 내용물을 상기 복합 제형이 필요한 피실험자에게 상기 제형을 투여하기 전 적합한 시기에, 적합한 방식으로 혼합할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 NO의 공급원과 본 발명의 PEG-Hb 제형 간의 복합 제형을 제공한다. 상기 본 발명의 실시태양을 다양한 NO-공여체 분자를 기준으로 예시하나, 숙련가는 NO의 공급원이 이들 예시적인 예시들로 제한되지 않고 NO의 다른 공급원들을 본 발명의 복합 제형에 혼입할 수 있음을 쉽게 알 것이다.
산화 질소(NO)는 혈소판 응집 방지 및 혈소판 활성화 방지, 혈관 이완, 신경전달, 및 면역 반응에서 중요한 생리학적 역할을 하는 중요한 세포 내 및 세포 간 전령 분자이다. NO(산화 질소)는 혈압을 감소시키고 다른 작용들 중에서도 혈소판 작용을 억제하는 생물학적 "전령 분자"이다. NO는 내피로부터 혈관 평활근 및 혈소판으로, 및 신경세포 시냅스를 가로질러 자유롭게 확산하여 생물학적 반응들을 일으킨다.
혈액 및 산소가 고갈된 조직은 비가역적인 기관 손상의 가능성과 함께 허혈성 괴사 또는 경색을 겪는다. 일단 상기 기관 또는 조직에 대한 혈액 및 산소의 흐름이 복원되면, 상기 기관은 정상적인 허혈 전 상태로 바로 회복되지 않는다. 허혈 후 기능장애는 다양한 인자들에 기인할 수 있다. 산소 유리 라디칼은, 기절 심근에서의 유리 라디칼의 발생이 입증되었고 유리 라디칼 제거제가 수축성 기능장애를 약화시키는 것으로 나타났으므로, 한 역할을 할 수 있다. 초기 재 관류 중 손상된 세포 내 칼슘 처리 및 칼슘 과부하는 허혈 후 기능장애의 원인일 수도 있다.
유리 라디칼로 인한 과도한 산화 스트레스가 생물학적 조직을 손상시킬 수 있음은 잘 확립되어 있다. 세포 및 조직의 천연 방어는, 세포 및 조직을 높은 수준의 산화 스트레스에 대해 보호하도록 진화된 산화방지 기전 주위를 선회한다. 우리의 산소 풍부 분위기에서 특정 스트레스 시기의 산소의 존재는 해가 될 수도 있으며; 이를 산소 역설이라 칭하였고 이는 유리 라디칼 과정의 발생 및 참여에 있어서 산소의 역할에 관한 것이다. 조직으로의 제한된 혈류 주기와 관련된 몇몇 질병 상태, 예를 들어 심장 마비, 발작 및 사지로의 제한된 흐름, 무 흐름의 간헐적인 에피소드에 이은 혈액의 재 흐름은 허혈/재 관류(I/R) 산화 스트레스를 구성한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 NO 공여체란 용어는 임의의 일산화 질소 방출, 전달 또는 운반 화합물, 예를 들어 S-나이트로소티올, 나이트라이트, 나이트레이트, S-나이트로티올, 시드논이민, 2-하이드록시-2-나이트로소하이드라진, (NONOate), (E)-알킬-2-((E)-하이드록시이미노)-5-나이트로-3-헥센아미드(FK-409), (E)-알릴-2-((E)-하이드록시이미노)-5-나이트로-3-헥센아민, N-((2Z,3E)-4-에틸-2-(하이드록시이미노)-6-메틸-5-나이트로-3-헵테닐)-3-피리딘카복스아미드(FR 146801), N-나이트로소아민, N-하이드록실 나이트로스아민, 나이트로스이민, 다이아제틴 다이옥사이드, 옥사트라이아졸 5-이민, 옥심, 하이드록실아민, N-하이드록시구아니딘, 하이드록시유레아, 벤조퓨록산, 퓨록산뿐만 아니라 산화 질소를 합성하는 내생 효소들에 대한 기질을 포함한다.
적합한 NONOate는 비 제한적으로 (Z)-1-(N-메틸-N-(6-(N-메틸-암모니오헥실)아미노))다이아젠-1-이움-1,2-다이올레이트("MAHMA/NO"), (Z)-1-(N-(3-암모니오프로필)-N-(n-프로필)아미노)다이아젠-1-이움-1,2-다이올레이트("PAPA/NO"), (Z)-1-(N-(3-아미노프로필)-N-(4-(3-아미노프로필암모니오)부틸)-아미노)다이아젠-1-이움-1,2-다이올레이트(스페르민 NONOate 또는 "SPER/NO") 및 나트륨(Z)-1-(N,N-다이에틸아미노)다이아제늄-1,2-다이올레이트(다이에틸아민 NONOate 또는 "DEA/NO") 및 이들의 유도체를 포함한다. NONOate는 또한 미국 특허 제 6,232,336, 5,910,316 및 5,650,447 호에 개시되어 있으며, 이들 특허는 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 상기 "NO 부가물"은 생물학적 활성 형태의 일산화 질소에 대해 자연적으로 민감하거나 또는 인공적으로 제공된 다양한 결합 부위에서 일-나이트로실화, 다중-나이트로실화, 일-나이트로소화 및/또는 다중-나이트로소화될 수 있다.
적합한 퓨록산은 비 제한적으로 CAS 1609, C93-4759, C92-4678, S35b, CHF 2206, CHF 2363 등을 포함한다.
적합한 시드논이민은 비 제한적으로 몰시도민(N-에톡시카보닐-3-모폴리노시드논이민), SIN-1(3-모폴리노시드논이민) CAS 936(3-(시스-2,6-다이메틸피페리디노)-N-(4-메톡시벤조일)-시드논이민, 피르시도민), C87-3754(3-(시스-2,6-다이메틸피페리디노)시드논이민, 린시도민, C4144(3-(3,3-다이메틸-1,4-티아잔-4-일)시드논이민 하이드로클로라이드), C89-4095(3-(3,3-다이메틸-1,1-다이옥소-1,4-티아잔-4-일)시드논이민 하이드로클로라이드 등을 포함한다.
적합한 옥심은 비 제한적으로 NOR-1, NOR-3, NOR-4 등을 포함한다.
NO 부가물의 한 그룹은 S-나이트로소티올이며, 이는 하나 이상의 SNO 그룹을 포함하는 화합물이다. 상기 화합물은 S-나이트로소-폴리펩타이드("폴리펩타이드"란 용어는 확인된 생물학적 작용을 갖지 않는 단백질 및 폴리아미노산 및 그의 유도체를 포함한다); S-나이트로실화된 아미노산(천연 및 합성 아미노산 및 이들의 입체 이성체 및 라세미 혼합물 및 이들의 유도체를 포함한다); S-나이트로실화된 당; S-나이트로실화된, 변형된 및 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드(바람직하게는 5 이상, 및 보다 바람직하게는 5 내지 200 뉴클레오타이드를 갖는다); 직쇄 또는 분지된, 포화 또는 불포화된, 지방족 또는 방향족, 치환 또는 비 치환된 S-나이트로실화된 탄화수소; 및 S-나이트로소 헤테로사이클릭 화합물을 포함한다. S-나이트로소티올 및 이의 제조 방법은 미국 특허 제 5,380,758 호 및 5,703,073 호; WO 97/27749; WO 98/19672; 및 문헌[Oae et al, Org . Prep . Proc . Int ., 15(3):165-198 (1983)](이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다.
또 다른 적합한 NO 공여체 부류는, 나이트로소 그룹이 황 함유 아미노산 또는 그의 유도체의 황 그룹에 결합된 S-나이트로소 아미노산이다. 상기와 같은 화합물은 예를 들어 S-나이트로소-N-아세틸시스테인, S-나이트로소-캅토프릴, S-나이트로소-N-아세틸페니실아민, S-나이트로소-호모시스테인, S-나이트로소-시스테인, S-나이트로소-글루타치온, S-나이트로소-시스테이닐-글리신등을 포함한다.
적합한 S-나이트로실화된 단백질은 효소를 포함한 다양한 작용성 부류들로부터의 티올 함유 단백질(이때 NO 그룹은 아미노산 또는 그의 아미노산 유도체 상의 하나 이상의 황 그룹에 결합된다), 예를 들어 조직 유형 플라스미노겐 활성제(TPA) 및 카텝신 B; 수송 단백질, 예를 들어 리포단백질; 헴 단백질, 예를 들어 헤모글로빈 및 혈청 알부민; 및 생물학적으로 보호성인 단백질, 예를 들어 면역글로불린, 항체 및 사이토킨을 포함한다. 상기와 같은 나이트로실화된 단백질은 WO 93/09806에 개시되어 있으며, 이는 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 예로서 다중 나이트로실화된 알부민(여기에서 상기 단백질 중의 하나 이상의 티올 또는 다른 친핵성 중심이 변형된다)을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 NO 부가물의 또 다른 그룹(이때 상기 NO 부가물은 산화 질소를 제공하거나, 운반하거나 방출하는 화합물이다)은 하나 이상의 ONO 또는 ONN 그룹을 포함하는 화합물을 포함한다. 하나 이상의 ONO- 또는 ONN 그룹을 포함하는 화합물은 바람직하게는 ONO 또는 ONN-폴리펩타이드("폴리펩타이드"란 용어는 확인된 생물학적 작용을 갖지 않는 단백질 및 폴리아미노산 및 그의 유도체를 포함한다); ONO 또는 ONN-아미노산(천연 및 합성 아미노산 및 이들의 입체 이성체 및 라세미 혼합물을 포함한다); ONO- 또는 ONN-당; ONO 또는 ONN 변형되거나 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드(5 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5 내지 200 뉴클레오타이드를 포함한다); ONO 또는 ON 직쇄 또는 분지된, 포화 또는 불포화된, 지방족 또는 방향족, 치환 또는 비 치환된 탄화수소; 및 ONO, ONN 또는 ONC-헤테로사이클릭 화합물을 포함한다. 하나 이상의 ON-O 또는 ON-N 그룹을 포함하는 화합물의 바람직한 예는 부틸 나이트라이트, 아이소부틸 나이트라이트, 3급-부틸 나이트라이트, 아밀 나이트라이트, 아이소아밀 나이트라이트, N-나이트로스아민, N-나이트로스아미드, N-나이트로소유레아, N-나이트로소구아니딘, N-나이트로소카바메이트, N-아실-N-나이트로소 화합물(예를 들어 N-메틸-N-나이트로소유레아); N-하이드록시-N-나이트로스아민, 쿠페론, 알라노신, 도파스틴, 1,3-이치환된 나이트로스이미노벤즈이미다졸, 1,3,4-티아다이아졸-2-나이트로스이민, 벤조티아졸-2(3H)-나이트로스이민, 티아졸-2-나이트로스이민, 올리고나이트로소 시드논이민, 3-알킬-N-나이트로소-시드논이민, 2H-1,3,4-티아다이아진 나이트로스이민을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 NO 부가물의 또 다른 그룹은 산화 질소를 제공하거나, 운반하거나 방출하는 화합물, 예를 들어 하나 이상의 O2NO, O2NN 또는 O2NS 그룹을 포함하는 화합물을 포함한다. 이들 화합물 중에서 바람직한 것은 O2NO, O2NN 또는 O2NS 폴리펩타이드("폴리펩타이드"란 용어는 확인된 생물학적 작용을 갖지 않는 단백질 및 폴리아미노산 및 그의 유도체를 포함한다); O2NO, O2NN 또는 O2NS 아미노산(천연 및 합성 아미노산 및 이들의 입체 이성체 및 라세미 혼합물을 포함한다); ONO, O2NN 또는 O2NS 당; O2NO-, O2NN 또는 O2NS 변형되거나 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드(5 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5 내지 200 뉴클레오타이드를 포함한다); O2NO, O2NN 또는 O2NS 직쇄 또는 분지된, 포화 또는 불포화된, 지방족 또는 방향족, 치환 또는 비 치환된 탄화수소; 및 O2NO, O2NN 또는 O2NS 헤테로사이클릭 화합물을 포함한다. 하나 이상의 O2NO, O2NN 또는 O2NS 그룹을 포함하는 화합물의 바람직한 예는 아이소솔바이드 다이나이트레이트, 아이소솔바이드 모노나이트레이트, 클로나이트레이트, 에리쓰리틸 테트라나이트레이트, 만니톨 헥사나이트레이트, 나이트로글리세린, 펜타에리쓰르톨테트라나이트레이트, 펜트리니트롤, 프로파틸나이트레이트 및 설프하이드릴-함유 아미노산을 갖는 유기 나이트레이트, 예를 들어 SPM 3672, SPM 5185, SPM 5186 및 미국 특허 제 5,284,872, 5,428,061, 5,661,129, 5,807,847 및 5,883,122 호 및 WO 97/46521, WO 00/54756 및 WO 03/013432에 개시된 것들을 포함한다.
NO 부가물의 또 다른 그룹은 산화 질소를 제공하거나, 운반하거나 방출하고 화학식 R1 "R2 "NN(OM+)NO로 나타내는 N-옥소-N-나이트로소아민이며, 여기에서 R1 " 및 R2" 은 각각 독립적으로 폴리펩타이드, 아미노산, 당, 변형되거나 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드, 직쇄 또는 분지된, 포화되거나 불포화된, 지방족 또는 방향족, 치환되거나 비 치환된 탄화수소, 또는 헤테로사이클릭 그룹이고, M+ 은 유기 또는 무기 양이온, 예를 들어 알킬 치환된 암모늄 양이온 또는 I족 금속 양이온이다.
상기 NO 공여체와 함께, 피실험자에게 NO의 치료 효과를 강화시키는 치료 유효량의 제 2 화합물을 투여할 수 있다. 상기 제 2 화합물은 예를 들어 포스포다이에스테라제 억제제(예를 들어 2-o-프로폭시페닐-8-아자퓨린-6-온[ZaprinastTM], 다이피리다몰, 테오필린, 실데나필[ViagraTM], 또는 1,3-다이메틸-6-[2-프로폭시-5-메탄설포닐아미도페닐]-피라졸[3,4-D]피리미딘-4-[5H]-온) 또는 초산화물 디스뮤타제일 수 있다. 상기 제 2 화합물은 한편으로 항혈전제, 예를 들어 티클로피딘, 스트렙토키나제, 유로키나제, t-PA 또는 그의 동족체(예를 들어 메트-t-PA, RetevaseTM, 또는 FE1X), 헤파린, 히루딘 또는 그의 동족체(예를 들어 Hurulog.TM), 비 스테로이드성 소염제(예를 들어 인도메타신 또는 아스피린), 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손), 또는 세포독성제(예를 들어 메토트렉세이트); 또는 백혈구 억제제, 예를 들어 항백혈구 항체일 수 있다.
산화 질소의 투여는 허혈/재 관류 손상의 예방 및 치료로서 사용되어 왔다. 예를 들어 미국 특허 제 6,656,452 호 및 상기 중에 인용된 참고문헌들을 참조하시오. 따라서, 본 발명의 목적은 허혈-재 관류 손상의 치료를 위한 NO의 공급원을 포함하는 헤모글로빈 기재 대용 혈액의 제형을 제공하는 것이다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 대용 혈액을 NO-공여체 분자와 배합한다. 상기 배합은 상기 대용 혈액의 제조 시 또는 초기 제조 이후의 임의의 시점에서 있을 수 있다. 예를 들어 본 발명은 2-구획 장치 또는 2 개의 별도의 용기를 제공한다. 하나의 구획 또는 용기 중에 상기 대용 혈액을 보관하고 두 번째 구획 또는 용기에 NO-공여체 분자를 공급한다. 상기 2 구획 또는 용기의 내용물을 상기가 필요한 피실험자에게 투여하기 전에 혼합하고, 생성되는 제형을 상기 피실험자에게 투여한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명의 제형은 초산화물 디스뮤타제 또는 카탈라제를 추가로 포함한다. 이들 단백질은 자체가 수용성 중합체, 예를 들어 PEG에 임의로 결합된다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 허혈/재 관류 손상 및/또는 제형이 투여되는 피실험자의 하나 이상의 조직에 대한 산화 스트레스를 개선, 예방 또는 감소시키는데 유용한 제형을 제공한다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은, 2 개(또는 그 이상)의 성분이 존재하고 배합 전에 별도로 보관되는 키트를 제공한다. 예를 들어 다양한 실시태양에서 본 발명은 상기 NO 공여체 및 PEG-Hb 제형을 배합하기 위한 장치를 제공한다. 상기 장치는 상기 NO 공여체의 수거 또는 보관을 위한 제 1 용기; 및 상기 PEG-Hb 제형이 보관되는 제 1 용기와 유체 연통하는 하나 이상의 부속 용기를 포함한다. 사용 시, 상기 제 1 및 부속 용기 사이에는, 봉인의 파열 시 상기 제형의 두 성분이 혼합되고 후속적으로 상기 제형이 필요한 피실험자에게 투여되도록 하는 봉인 파손 장벽이 삽입되어 있다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 상기 개시된 장치의 등가물들을 입수할 수 있으며 이들은 본 내용의 진의 및 범위 내에 있다. 예를 들어, 키트는 2 개 이상의 앰풀을 포함할 수 있고, 이들은 각각 본 발명의 복합 제형의 요소를 액체 또는 건조된 형태로 함유한다. 상기 앰풀의 내용물을 상기 복합 제형이 필요한 피실험자에게 상기 제형을 투여하기 전에 적합한 시기에, 적합한 방식으로 혼합할 수 있다.
상기 나타낸 각각의 복합 제형에서, 상기 PEG-Hb는 산소, 일산화 탄소에 결합되거나 또는 상기 중 어느 것에도 결합되지 않을 수 있다. 상기 PEG-Hb 자체 또는 전체 제형을 피실험자 혈액의 긴장성에 대해 저장성, 등장성 또는 고장성이도록 제형화할 수 있다.
사용 방법
혈액 손실로부터(예를 들어 급성 출혈로부터 또는 수술하는 동안) 발생하거나, 빈혈(예를 들어 악성 빈혈 또는 겸상 적혈구성 빈혈)로부터 발생하거나, 또는 쇼크(예를 들어 부피 결핍 쇼크, 과민성 쇼크, 패혈성 쇼크 또는 알러지성 쇼크), 심근 경색, 발작 또는 외상성 뇌 손상으로부터 발생하는 저산소증을 치료 또는 예방하기 위한 산소 운반제에 대한 필요성이 존재한다. 또한 방사선 요법 또는 화학요법의 치료 효과를 개선시키기 위해 종양에 고-산소 공급이 필요하다. 본 발명은 상기 및 예를 들어 혈액 손실, 허혈 또는 저산소증과 관련된 다른 병을 치료 및 예방하는데 유용한, 본 발명에서 상기에 예시된 바와 같은 화합물 및 방법을 제공한다.
본 발명에 나타낸 각각의 제형들은 쇼크, 출혈, 빈혈 또는 혈액의 산소 운반 기능의 다른 기능장애와 관련된 병의 치료 및 예방을 위한 다양한 방법들에 유용하다. 본 발명의 방법은 수술(예를 들어 이식 수술(특히 신장 또는 심장 이식 수술) 또는 심장 우회술), 혈전용해, 발작, 외상-유발된 일시적인 저혈압, 또는 혈관 중재술, 예를 들어 레이저, 풍선, 또는 스텐트의 사용을 포함한 죽상반 절제술 또는 혈관성형술에 의해 유발된 것들을 포함한 허혈-재 관류 손상을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 상기 방법을 사용하여 경피적 관상동맥 확장 성형술 후 허혈-재 관류 손상을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 치료되거나 예방되는 손상은 임의의 비-폐 조직, 예를 들어 신장, 심장 또는 뇌에서 발생할 수 있다
저혈량성 쇼크는 심장이 혈액 손실 또는 부적합한 혈량으로 인해 신체에 충분한 혈액을 공급할 수 없는 특정한 형태의 쇼크이다. 정상 혈량의 대략 1/5 또는 그 이상의 손실이 저혈량성 쇼크를 발생시킨다. 상기 손실은 임의의 원인, 예를 들어 외부 출혈(절단 또는 상해로부터), 위장관 출혈, 다른 내부 출혈로부터, 또는 다른 체액의 과도한 손실(예를 들어 설사, 구토, 화상 등에 의해 발생할 수 있는)로부터 생성되는 감소된 혈량으로부터 있을 수 있다. 일반적으로, 보다 크고 보다 빠른 혈량 손실이 보다 심한 쇼크 증상을 생성시킨다. 일반적으로, 보다 순한 정도의 쇼크를 갖는 환자가 보다 심한 쇼크를 갖는 환자들보다 더 양호한 경향이 있다. 그러나, 중증 저혈량성 쇼크의 경우, 즉각적인 치료에도 불구하고 사망할 수 있다. 노인은 쇼크로부터 불량한 결과를 가질 위험이 증가한다.
전투중, 총알 및 탄약 폭발로부터의 관통 파편은 흔히 생명을 위협하는 출혈을 유발한다. 생명과학 연구성은 방혈성 출혈이 과거 전투에서 전사한 부상 군인의 50% 이하에 대한 사망 기전이었던 것으로 추정하며, 이는 잠재적으로 구조 가능한 전장 사상자의 주요 사망 원인인 것으로 간주된다. 부상당한 사지로부터의 출혈은 단독으로 모든 전투 사망의 거의 1/10의 원인이며, 이중 일부는 적합한 입원 전 치료가 제공되었으면 방지가능한 것으로 간주되었다.
빈혈은 혈액에 건강한 적혈구가 결핍된 경우 발병하는 임의의 병에 대한 일반적인 용어이다. 한편으로, 상기 혈액에는 충분한 적혈구가 있을 수 있지만 헤모글로빈이 결핍되어 있다. 빈혈은 약 350만 명의 미국인이 걸린 미국에서 가장 흔한 혈액 병이다. 여성 및 만성 질병이 있는 사람들이 상기 병의 위험성이 증가한다. 400 가지 유형이 넘는 빈혈이 존재하며, 이들을 광범위하게 3 개의 범주로 분류할 수 있다: 1) 혈액 손실로 인한 빈혈, 2) 감소된 또는 결함 적혈구 생산에 의해 유발된 빈혈, 또는 3) 적혈구의 파괴에 의해 유발된 빈혈.
상기 원인과 상관없이, 상당 수의 개인이 PEG-Hb 제형의 사용에 의해 개선될 수도 있는 일부 형태의 임상적인 산소 부족을 앓고 있다. 상기와 같은 제품에 대한 필요성 및 상업적인 기회는 거의 끝이 없다. 예를 들어, 겸상 적혈구성 빈혈은 미국에서, 약 72,000 명의 미국인이 걸린 가장 흔한 유전성 혈액 질환이다. 상기 질환은 위독 상태에서 특히 고통스럽고 쇠약하게 한다. 상기 환자를 매달 기준으로 단일 단위의 PEG-Hb로 치료하여 위독 상태를 예방하고 조직에 산소를 공급할 수 있음을 짐작할 수 있다. 이는 상기 징후에만 864,000 단위의 PEG-Hb를 필요로 할 것이다.
모세관 또는 보다 큰 동맥이, 예를 들어 혈관 수축 또는 상기 혈관을 차단하거나 부분적으로 차단하는 고형 색전에 의해 폐쇄되는 경우, 산소 공급은 산소에 대해 혈관들에 의존하는 조직들과 타협하게 된다. 조직 저산소증은 종종 부적합한 혈류에 기인한, 충분한 산소 운반의 실패, 즉 허혈로부터 발생한다. 저산소증은 내출혈(예를 들어 대뇌 저산소증을 생성시키는 뇌내출혈), 빈혈 또는 외상으로부터 생성될 수 있다. 허혈은 혈관의 작용성 수축 또는 실제 폐색으로 인한 조직으로의 산소 공급의 결핍이다. 예를 들어, 심근 허혈은 관상 동맥의 폐색 또는 수축으로 인한 심근으로의 산소 공급의 결핍이다. 허혈이 수 초 넘게 계속되면, 상기 허혈-유발된 조직 저산소증과 관련된 일련의 복잡한 생화학적 사건들로부터 조직 손상이 발생할 수 있다.
색전에 의해 발생한 저산소증 또는 허혈성 병은 상기 손상된 조직이 심장 조직 또는 중추 신경계(CNS)의 신경 조직인 경우 특히 쇠약하게 하는 조직 손상을 발생시킬 수 있다. 색전의 2 가지 가장 심각한 결과는 심근 허혈로부터 발생하는 심장 마비(급성 심근 경색 또는 AMI), 및 뇌 조직 허혈로부터 발생하는 발작이다. AMI 또는 발작으로 되지 않는 허혈은, 그럼에도 불구하고, 개인에게서 흉통(협심증), 부분 마비, 착란, 방향감각 상실 및/또는 기억 상실과 같은 심한 증상들을 생성시킨다.
혈관 질병, 특히 죽상동맥경화증이 있는 개인은 특히, AMI 또는 발작을 생성시킬 수 있는 색전 발병 위험이 있다. 허혈성 심장 질병은 세계적으로 수 백만명의 사람들이 걸리며, 이는 종종 AMI에 의한 돌연사에 이르게 된다. 고체 색전이 나와 모세관 중의 순환계 저장소를 통해 이동하거나 혈관 중의 또 다른 플라크 침착물에 부착하여 상기 혈관 또는 모세관을 완전히 또는 부분적으로 폐색시키는 플라크의 부분으로부터 생성될 때 허혈이 발생할 수 있다. 죽상판 입자가, 임의의 죽상동맥경화성 혈관(예를 들어 경동맥, 관상동맥, 대동맥, 대퇴부 또는 오금 동맥 혈관)을 촉진하거나 교란하는 혈관 및 심장 수술 시술(예를 들어 삽관술, 클램핑) 중에 또한 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 산소를, 상기 산소의 전달이 필요한 피실험자의 조직 및 기관으로부터 선택된 구성원으로 전달하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 하나 이상의 조직 및/또는 기관으로 산소의 전달을 수행하기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법을 사용하여 저산소증, 허혈, 빈혈 및 겸상 적혈구성 빈혈과 같은 병을 치료한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 출혈성 쇼크를 앓고 있는 피실험자의 조직 및 기관 중에서 선택된 구성원 중의 산소 부채를 역전시키는 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 상기 산소 부채를 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 피실험자에게 혈관형성의 유발에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여하는, 상기 피실험자의 조직 중에 혈관형성을 유발시키는 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 혈관형성은 산소 결핍증을 앓고 있는 조직에서 유발시킨다. 추가의 예시적인 실시태양에서, 혈관형성을 유발시키는 조직 또는 기관은 산소 결핍증을 앓고 있는 피실험자의 조직 또는 기관이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 상기 산소 결핍증을 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 산소 결핍증을 앓고 있는 조직으로의 혈류를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 피실험자에게 산소 결핍증을 앓고 있는 조직으로의 혈류의 증가에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여하는 것으로 이루어진다. 예시적인 실시태양에서, 상기 조직 또는 기관은 불충분한 혈류로 고통받는 피실험자의 조직 또는 기관이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 상기 불충분한 혈류를 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 산소 결핍증을 앓고 있는 조직에서 신경 손상 및/또는 경색된 조직을 감소시키는 방법을 제공한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 피실험자에게 산소 결핍증을 앓고 있는 조직에서 신경 손상 및/또는 경색을 감소시키기에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 투여함을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 방법은 상기 피실험자에게 상기 경색 및/또는 신경 손상된 조직을 역전시키기에 충분한 양의 본 발명의 임의의 조성물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 형성된 산소 운반제를 수용할 수 있는 피실험자는 포유동물, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 래트, 말 또는 양을 포함한다. 더욱이, 상기 산소 운반제를 수용할 수 있는 피실험자는 태아(태아 피실험자), 출생 후 피실험자, 또는 출생 시 피실험자를 포함한다.
본 발명의 조성물을 하나 이상의 주사 방법에 의해 피실험자의 순환계에 직접 및/또는 간접적으로 주사함으로써 상기 조성물을 상기 순환계에 투여할 수 있다. 직접 주사 방법의 예로는 혈관 내 주사, 예를 들어 정맥 내 및 동맥 내 주사, 및 심장 내 주사가 있다. 간접 주사 방법의 예는, 상기 산소 운반제가 림프계에 의해 순환계로 운반되게 하는 복강 내 주사, 피하 주사, 또는 투관침 또는 카테터에 의한 골수 내로의 주사를 포함한다. 바람직하게는, 상기 산소 운반제를 정맥 내로 투여한다.
치료되는 피실험자는 본 발명 조성물의 주입 전, 주입 중 및/또는 주입 후에 정상혈량, 과혈량 또는 저혈량성일 수 있다. 상기 조성물을 정상부 부하(top loading)와 같은 방법에 의해서 및 교환 방법에 의해서 순환계로 향하게 할 수 있다.
본 발명의 조성물을 순환계 일부 또는 전체를 통해 감소된 RBC 흐름, 빈혈 및 쇼크를 포함한 다수의 상이한 원인으로부터 생성되는 피실험자 내부의 저산소성 조직을 치료하기 위해 치료학적으로 투여할 수 있다. 더욱이, 상기 산소 운반제를, 피실험자의 조직으로의 또는 순환계 전체를 통한 RBC 흐름의 가능하거나 예상되는 감소로부터 발생할 수 있는 상기 피실험자 내부 조직의 산소 고갈을 예방하기 위해 예방학적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 저산소증을 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는데 유용하다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명은 피실험자에게 병, 손상 또는 상해의 치료를 제공하기에 충분한 양의 본 발명의 제형을 투여함으로써 상기 치료를 제공한다. 상기 헤모글로빈은 CO 형태이다. 예시적인 실시태양에서, 상기 결합체를 포스페이트 완충된 염수 중에서 제형화한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명의 PEG-Hb-CO 제형을 사용하여 허혈을 치료한다. 상기 제형에 의해 치료 가능한 예시적인 유형의 허혈은 말초 허혈, 예를 들어 말초 당뇨성 허혈, 및 허혈의 후속 영향들이다. 숙련가들이 이해하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 다른 형태의 허혈을 치료하는데 또한 유용하다.
다양한 실시태양에서 본 발명은 피실험자에게 병, 손상 또는 상해의 치료를 제공하기에 충분한 양의 본 발명의 제형을 투여함으로써 상기 치료를 제공한다. 상기 헤모글로빈은 산소 제거되거나 또는 CO 형태일 수 있으며 고장성 염 용액 중에서 제형화된다. 상기 제형에 유용한 예시적인 염 농도는 약 4% 내지 약 8%, 약 4.5% 내지 약 7.5%, 또는 약 5% 내지 약 7%이다. 예시적인 제형은 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7% 또는 약 8% 염을 포함한다. 하나의 제형에서, 상기 염 농도는 7.5%이다. 다양한 실시태양에서, 상기 염은 NaCl이다. 다양한 실시태양에서, 상기 제형을 사용하여 겸상 적혈구성 빈혈, 발작, 심근 경색 또는 외상성 뇌 손상을 치료한다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명의 PEG-Hb-CO는 혈관형성을 증가시키고, 혈관확장을 증가시키고, 심장 및 신장을 허혈로부터 보호하고, 미토콘드리아 KATP 채널을 활성화하고, 내피 백혈구 유착 및 침윤을 감소시키고, 대식세포 및 미세아교세포의 활성화를 감소시키고/시키거나 발작 유발된 기능장애로부터 뇌혈관 반응성을 보호하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 상기와 같은 결과를 성취하기 위한 본 발명 조성물의 사용 방법을 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 산소 운반제의 적합한 용량, 또는 용량들의 조합은 혈장 내에 함유될 때 약 0.1 내지 약 10 그램 Hb/㎗, 또는 약 1 내지 약 4 Hb/㎗ 또는 경우에 따라, 큰 혈량 손실을 보충하기 위해 그 이상의 상기 피실험자의 혈장 중 총 헤모글로빈 농도를 생성시키는 양이다.
본 발명의 조성물을 피실험자에게 임의의 유용한 방식으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 상기 조성물을 소정의 기간 동안 소정의 속도로 연속적인 주입으로서 투여한다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명 조성물의 부하 용량을 타당한 한 짧은 기간에 걸쳐 투여한다. 상기 초기 "연사(burst)"에 이어서 약 6 시간 이상, 약 12 시간 이상, 약 18 시간 이상 또는 약 24 시간 이상에 걸쳐 두 번째 량의 상기 제형을 투여한다. 다양한 실시태양에서, 상기 두 번째 량은 상기 초기 "연사" 투여량의 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 또는 약 120% 이상이다.
본 발명의 예시적인 조성물은 약 3% 내지 약 6%의 양으로 PEG-Hb 결합체를 포함한다. 예시적인 조성물은 약 4%의 양으로 PEG-Hb 결합체를 포함한다.
넓은 의미에서 본 발명은 또한 저산소증 조직의 재산소화를 위한 약제의 제조에 있어서 합성 헤모글로빈-수용성 중합체 결합체 기재 산소 운반제의 용도를 제공한다. 상기 저산소증은 비 제한적으로 수술, 외상, 허혈, 빈혈, 심근 경색, 발작, 쇼크, 당뇨병 및 외상성 뇌 손상을 포함한 임의의 손상, 상해 또는 질병에 기인할 수 있으며, 여기에서 상기 산소 운반 약제를 산소 결핍된 하나 이상의 조직이 있거나 있는 것으로 의심이 가는 개인에게 전신 투여한다.
상기 나타낸 각각의 방법들에서, 상기 PEG-Hb를 산소, 일산화 탄소에 결합시키거나, 이들 중 어느 것에도 결합시키지 않을 수 있다. 상기 PEG-Hb 자체 또는 전체 제형을 상기 피실험자 혈액의 긴장성에 대해 저장성, 등장성 또는 고장성으로 제형화할 수 있다.
본 발명의 선택된 실시태양을 예시하기 위해 하기의 실시예들을 제공하며 이들을, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다.
실시예
실시예 1
헤모글로빈의 정제
첫 번째 단계는 혈액 세포를 혈장 없이 세척함을 포함한다. 이를 벤치 스케일로 반복 세척, 원심분리 및 경사 분리에 의해 수행하였다. 상기 공정은 수직 연속 흐름 원심분리보다 더 효율적인 것으로 보인다.
적혈구를 완충제(10 mM 포스페이트(pH 7.8)와 함께 1.2% NaCl)로 4 회 세척한다. 이어서 상기 적혈구를 2 시간의 기간에 걸쳐 1.5 부피의 WFI의 느린 첨가에 의해 용해시킨다(헤모글로빈이 진정한 세포 용해 없이 추출된다). 상기 용해(다시, 헤모글로빈 추출)의 상태를, 전도도가 5.50 내지 7.00 μS의 범위가 될 때까지 상기 전도도를 샘플링하여 모니터한다. %Hb를 방사계 OSM3 헤목시미터(Hemoximeter)를 사용하여 측정한다. 상기 삼투질 농도를 또한 시험하며 이는 130 내지 150 mOsmol의 범위이다. 일단 헤모글로빈 추출이 완료되면, 상기 내용물을 1 ㎛ 셀룰로스 기재 뎁스 필터(depth filter)에 가압 여과한 다음, 0.45/0.2 ㎛ 멸균 폴리설폰 기재 필터를 통해 제 2 탱크(다음 단계를 위한 수용조로서 작용한다)로 여과시킨다. 이어서 상기 헤모글로빈 용액을 10 ℃에서 300Kd 한외 여과기를 통해 재킷형 탱크로 펌핑하며, 이는 초기 바이러스 제거 단계로서 작용하고 고 분자량 단백질을 제거한다.
상기 헤모글로빈을 10KD MWCO 시스템을 사용하여 농축시키고 이어서 상기 헤모글로빈 용액이 10% 미만의 HbO2 를 가질 때까지 중공 섬유 멤브레인 접촉기를 통한 재순환에 의해 산소 제거한다. 안정화제인 시스테인을 상기 산소 제거 단계의 끝 부근에서 5 mM의 최종 농도로 가한다. 상기 안정화제는 산소 수준이 10% 미만으로 유지되는 것을 도우며 또한 열 불활성화 단계 중 상기 헤모글로빈을 보호하는 작용을 한다.
헤모글로빈 생산 중 바이러스 불활성화/제거 단계의 개발
소 헤모글로빈을 인간용 제품에 사용할 수 있기 전에, 작용상 활성인 단백질을 생물학적으로 유지시키면서 임의의 잠재적인 바이러스 오염물질을 불활성화시키는 과정이 필요하다. FDA는 동물 제품으로부터 유래하는 단백질의 바이러스 불활성화를 요구한다. 이를 바이러스 불활성화가 성취될 때까지, 이 경우 4 시간 동안 60 ℃에의 노출에 의해 수행한다. 이어서 상기 용액을 냉각시키고 수용 탱크 내로 0.45/0.2 μ 여과한다. 이것이 정제된 헤모글로빈이다. 상기 생성물에 대해 FPLC(단일 피크), 가시 스펙트럼 분석(540 ㎚ 및 577 ㎚에서의 피크), SDS 젤 전기영동, %Hb, %HbO2, %MetHb, pH, 삼투질 농도, 내독소, 지질 및 유리 철에 의한 QC 분석을 수행한다.
도 1에 개시된 바와 같이, 기계적으로 산소 제거된 헤모글로빈은 바이러스 열 불활성화되었으며 상기 열 불활성화된 소 헤모글로빈은 순수하였다. 상기 환원제 첨가와 함께 기계적으로 산소 제거된 헤모글로빈의 열 불활성화 공정은 하기 차트(표 1)에 의해 입증되는 바와 같이, 그의 완전성은 보유하면서 낮은 수준의 MET-Hb(10% 미만)를 유지하였다. 10 시간 동안 60 ℃에의 노출은, %Hb 및 %METHb에 비해, 상기 산소 제거된(데옥시) 형태의 생성물(5 mM 시스테인 첨가됨)에 대해 영향을 미치지 않았다. 이는 시스테인 없이 산소 제거된 형태의 상기 단백질에 대한 경우가 아니었으며, 이 경우 소 헤모글로빈의 대략 40%가 상실되었다.
[표 1]
Figure pct00001
헤모글로빈의 PEG 화
희석 완충제(25 mM 나트륨 포스페이트, 120 mM 나트륨 바이카보네이트 및 4.5% NaCl, pH 8.0)를 가하여 상기 헤모글로빈 용액을 4 내지 5% 농도로 만든다. 헤모글로빈에 PEG를 17:1 몰 비로 사용하여 헤모글로빈을 PEG화시킨다. 상기 반응을 pH 7.6 내지 7.8에서 유지시키고 상기 반응을 1 시간 동안 진행시킨다. 이 시점에서 2 개의 공정 중 하나를 사용할 수 있다.
공정 A
15 mM 시스테인을 가하여 상기 반응을 정지시킨다. 상기 용액을 4 ℃에서 밤새 보관 후, 50 Kd 컷오프 멤브레인을 사용하여 20 부피의 완충제(5.0 mM 나트륨 바이카보네이트, 1.0 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM 염화 나트륨, 4.7 mM 염화 칼륨, 2.5 mM 마그네슘 설페이트, 0.5 mM 염화 칼슘, pH 8.1)에 대해 투석할 것이다. 이어서 상기 PEG-Hb를 4%Hb로 희석하고, 덱스트로스(5 ㎎/㎖) 및 시스테인(5 mM)을 가하고, 상기 용액을 상기 %HbO2가 10% 이하일 때까지 중공 섬유 멤브레인 접촉기를 통해 순환시킨다. 이어서 상기 용액을 채혈 주머니 내로 무균 여과한다. 상기 생성물에 대해 FPLC(단일 피크), 가시 스펙트럼 분석(540 ㎚ 및 577 ㎚에서의 피크), SDS 젤 전기영동, %Hb, %HbO2, %MetHb, pH, 삼투질 농도, 내독소, 지리 및 유리 철에 의한 QC 분석을 수행할 것이다.
공정 B
15 mM 시스테인을 가하여 상기 반응을 정지시킨다. 상기 용액을 4 ℃에서 밤새 보관 후, 50 Kd 컷오프 멤브레인을 사용하여 20 부피의 완충제(5.0 mM 나트륨 바이카보네이트, 1.0 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM 염화 나트륨, 4.7 mM 염화 칼륨, 2.5 mM 마그네슘 설페이트, 0.5 mM 염화 칼슘, pH 8.1)에 대해 투석한다. 이어서 상기 PEG-Hb를 4%Hb로 희석하고, 덱스트로스(5 ㎎/㎖) 및 L-시스테인(5 mM)을 가하고, %산소가 '0' 미만이고 일산화 탄소(CO)가 95% 이상일 때까지 일정하게 혼합하면서 상기 용액에 일산화 탄소를 서서히 발포함으로써 상기 용액을 일산화 탄소 형태로 만든다. 이어서 상기 용액을 채혈 주머니 내로 무균 여과한다. 상기 생성물에 대해 FPLC(단일 피크), 가시 스펙트럼 분석(540 ㎚ 및 577 ㎚에서의 피크), SDS 젤 전기영동, %Hb, %HbO2, %MetHb, pH, 삼투질 농도, 내독소, 지리 및 유리 철에 의한 QC 분석을 수행한다.
더욱 또한, 상기 열 불활성화된 헤모글로빈을 PEG화하였으며, 생성되는 PEG-Hb는 순수하고 활성이었다.
도 1: 37 ℃에서 PEG-Hb의 안정성
Figure pct00002
(%전체 Hb)
120일의 기간에 걸쳐, 37 ℃에서 보관된 샘플 중의 %전체 Hb, %MET-Hb, %HbCO, 및 %HbO2 변화는 없었다(도 1).
PEG - Hb 의 일산화 탄소 형태의 개발
본 연구의 목적은 PEG-헤모글로빈의 일산화 탄소(CO) 형태를 개발하는 것이었다. 상기 형태는 도 1에 나타낸 바와 같이 %MET-Hb 형성을 낮게 유지하는 것에 관하여 특히 안정한 것으로 보인다. 이것은 기계적으로 산소 제거된 형태보다 더 안정하다.
더욱 또한, PEG-Hb의 CO 형태를 4 ℃에서 보관하였으며 8 주 보관 후에 단지 1.0%만이 MET-Hb로 전환되었다. 상기 CO 형태의 PEG-Hb의 동일한 로트는 4 ℃에서 12 주 후에 1.3% MET-Hb를 갖는다. 더욱 또한, PEG-Hb의 CO 형태는 6 주 동안 18 ℃에서 보관되었고 7.9% MET-Hb를 포함하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 18 ℃에서 10 주의 끝에서 16.7% MET-Hb로 상승한다.
산소 부채를 역전시키는 PEG - Hb / HS 의 효능
산소 공급 조직에서 우리의 PEG-Hb/HS의 활성을 시험하기 위한 예비 연구에서, 중증 외상 쇼크의 돼지 모델에서 조직으로의 산소 전달을 증가시키고 산소 부채를 역전시키는 그의 능력을 시험하였다.
산소 부채는 호기성 대사를 유지하는데 필요한 수준 이하인 전혈 산소 소비 정도의 척도이다. 이는 외상 유발된 출혈성 쇼크 후 생존 및 기관 부전의 합병증과 상관이 있고 이를 예측하는 것으로 입증된 하나의 생리학적 변수이다. 상기 모델에서, 동물들을 소정의 산소 부채로 출혈시켜 동물들 간의 변이성을 감소시키며, 따라서 효과는 혈액 손실 또는 내생적인 헤모글로빈의 양에 의존하지 않는다. 상기 모델은 산소 소비(VO2), 일산화 탄소 생산(VCO2), 혼합된 정맥 헤모글로빈 산소 포화도(SvO2), 동맥 헤모글로빈 산소 포화도(SaO2), 산소 추출 비(OER), 산소 부채, 심박수, 혈압, 뇌 조직 헤모글로빈 산소 포화도(StO2 뇌), 어깨 골격근 조직 헤모글로빈 산소 포화도(StO2 어깨), 심박출량(CO)의 연속적인 측정뿐만 아니라 골격근, 간, 장 점막, 구강 점막 및 신장 중 PO2의 측정을 허용한다.
상기 모델에서, 출혈은 전투 관련된 조직 손상을 생성시키기 위한 양측성 뒷다리 골격근 손상 및 대퇴골 골절에 의해 동반된다. 이러한 유형의 조직 손상은 조직 산소 전달에 독립적으로 영향을 미치고 출혈 단독에 비해 내장 혈류의 보다 큰 감소를 생성시키는 것으로 입증되었다. 가축총을 사용한 골격근 손상 및 대퇴골 손상 후에, 동물들은 80 ㎖/㎏의 소정의 산소 부채로 출혈한다. 균일한 산소 부채로의 출혈은 모든 동물들이 그들의 최종 치료 전 손상에 제한된 변이성을 가지며 압력 구동된 출혈에 상반되게 제거된 부피 변화가 크게 감소함을 보장한다. 이들 동물에서, 산소 부채를 연속적으로 및 누적에 의해 모니터한다. 산소 부채는 골격근 손상 전에 취한 기준선 값 아래 VO2의 편차를 기본으로 하며 매 10초마다 측정된다.
상기 손상에 이어서, 상기 동물에서 산소 부채는 출혈 중에 상승한다. 상기 손상된 동물에서 표적화된 산소 부채의 100%(80 ㎖/㎏)가 도달되었을 때에, 상기 동물에게 15 분의 기간에 걸쳐(소생 기간) 500 cc의 PEG-Hb(4%의 PEG-Hb 농도 및 5 내지 7.5%의 고장성 염수 용액)를 주입하였다. PEG-Hb의 투여 후, 산소 부채는 빠르게 역전된다(4 마리의 손상된 동물들에 대한 평균 결과). 상기 소생 기간 중 조직 산소 공급의 증가는 산소 부채의 변화가 병행되었으며 이어서 3 시간의 기간 동안 안정화된다.
PEG-Hb와 대조적으로, 외상 환자의 표준 치료인, 2 마리 동물의 500 ㎖의 헤타전분(Hespan) 치료도, 대용 혈액으로서 바이오퓨어(Biopure)에 의해 개발된 HBOC 생성물인 옥시글로빈도, 산소 부채를 역전시키지 못했다. 이러한 발견은 첫 번째, 외상에 대해 현재 사용되는 치료가 조직 산소 공급에 유효하지 못함을 보이고 따라서 출혈성 쇼크 중인 환자에서 제한된 효과를 생성시키는 듯하므로 중요하다. 두 번째로, 인간에서 광범위하게 시험되고 임상 시험에서 실패한 상기 제품들 중 하나인 옥시글로빈은 조직에 산소를 공급하지 못한 것으로 보인다. 본 발명의 조성물이 산소 부채를 역전시켰다는 사실은 명백히 본 발명의 조성물과 바이오퓨어의 조성물이 매우 상이하며 외상의 치료에서 PEG-Hb/HS의 가능성을 다른 HBOC의 실패를 근거로 판단해서는 안 된다는 것을 가리킨다.
더욱 또한, 500 cc의 농축된 적혈구로 치료된 2 마리의 손상된 동물은 예상된 산소 부채의 감소를 가졌다. 그러나, 상기 역전의 크기는 PEG-Hb에 의해 유발된 경우만큼 크지 않은 것으로 보였다. 중요하게, 상기 농축된 적혈구 치료가 PEG-Hb와 동일한 효과를 생성시켰다 하더라도, 상기 결과는, HBOC의 목적이 수혈만큼 유효하다는 것이므로, 대용 혈액으로서의 PEG-Hb의 용도를 지지할 것이다.
산소 부채의 변화 및 조직으로의 산소 전달에 대한 시험 이외에, 우리는 또한 출혈 후 조직 재 관류의 척도로서 상기 출혈 동물에서 설하 미소순환을 측정하였다. 상기 작용성 모세관 밀도를 또한 상기 조직 재 관류의 척도로서 관찰 면적에 대한 모든 혈관들의 전체 길이로서 정성적으로 측정하였다. 나타난 것은 출혈 동안, 상기 모세관 밀도가 극적으로 감소한다는 것이다. 대조적으로, 상기 PEG-Hb 처리는 상기 밀도를 상기 연구의 끝 부근에서 기준선 정상 수준 부근으로 다시 가져온다. 이는 최종 헤모글로빈 수준이 12.3 g/㎗의 기준선에서 7.1 g/㎗로 떨어졌음에도 불구하고 발생한다. 나타낸 바와 같이, PEG-Hb 주입은 작용성 모세관 밀도를 헤타전분 또는 농축 적혈구보다 큰 정도로 증대시켰다.
실시예 2
이론적 설명:
대퇴 동맥 결찰에 의해 유발시킨 뒷다리 허혈의 쥐 모델에서, 당뇨병이 있는 마우스는 비 당뇨병 동물에 비해 혈류 및 혈관형성 반응의 현저하게 손상된 회복을 나타낸다. 본 연구에서, 우리는 상귀네이트의 투여가 혈류 및 혈관형성의 회복을 촉진할 것이라는 가설을 시험하였다.
방법 및 결과:
6 주된 C57BL/6 마우스를 스트렙토조토신(stz)에 의해 당뇨성으로 만들고 12 주 된 마우스에게 FA 결찰을 가한 다음 4 주간 매일 복강 내(i.p.) 주사를 통해 상귀네이트(20 ㎖/㎏/일)를 투여하였다. 비히클 처리된 당뇨성 마우스에게 같은 부피의 1xPBS를 매일 i.p. 주사하였다. 상귀네이트로 처리된 당뇨성 마우스는 비히클 처리된 그룹에 비해 FA 결찰 후 28일째에 레이저 도플러 분석에 의해 현저하게 개선된 혈류 비(허혈/모의)를 나타내었다(63.36±5.83 대 44.39±4.13 BFR(%), n≥9, p = 0.019). 근육 조직에 대한 CD31에 의한 면역조직화학 염색은 비히클 처리된 그룹에 비해 FA 결찰 후 28일째에 상귀네이트TM로 처리한 당뇨성 마우스에서 현저하게 증가된 미세혈관 밀도를 나타내었다(663.86±57.78 대 461.44±36.19 모세관/㎟, p < 0.0001). 모두 종합해보면, 상기 데이터는 마우스 모델에서 당뇨성 사지 허혈에 대한 상귀네이트의 현저한 치료 효과를 밝히고 오래 지속된의 당뇨병에서 상보적인 혈관 구조 요법으로서 상기 작용제의 사용에 대한 기준을 제공할 수도 있다.
프로토콜:
C57BL/6 마우스를 스트렙토조토신(수 회 저 용량 주사)으로 1형 당뇨성으로 만들었다. 당뇨병 유발 후 1 개월째에, 상기 마우스에게 단측성 뒷다리 허혈을 가하였다. 혈류 및 혈관형성을 본 연구에서 모니터하였다.
시술:
상기 마우스의 상부 허벅지에 피부 절개를 수행하였다. 왼쪽 다리에 외과적 시술을 수행하고, 오른쪽 다리는 대퇴 동맥 결찰을 수행하지 않은 것을 제외하고 동일한 시술을 수행하였다. 서혜부 인대 및 대퇴 동맥의 하부 절반을 노출시켰다. 상기 혈관 다발을, 가까이는 상기 서혜부 인대 아래에서 및 멀리는 표면 및 심부 대퇴 동맥으로의 분기 바로 위에서 2 개의 멸균 8/0 비-흡수성 실크 봉합사로 결찰하였다. 대퇴부 혈관의 단리된 분절에 연결된 모든 동맥 및 정맥 가지들을 8/0 비 흡수성 봉합사로 묶었다. 최종적으로, 상기 정맥과 동맥을 근위 및 원위 결찰 사이에서 절단하였다. 상기 피부 절개를 멸균 5/0 나일론 봉합사로 닫았다.
마우스 # 및 그룹:
우리의 예비 연구를 기본으로, 우리는 그룹당 >15 마우스로 시작하여, 상기 연구의 끝에서 충분한 마우스를 가지며 분석에 충분한 조직을 가짐을 확실히 하였다.
실험들을 추가적인 비히클 처리된 마우스에 대해 수행하기 위해서 엇갈리게 수행하였다.
그룹 #1 - 대퇴 동맥 결찰 후 바로 시작하는 당뇨병 WT 마우스 + 20 ㎖/㎏/일 상귀네이트(IP)
그룹 #2 - 당뇨병 WT 마우스 + PBS(20 ㎖/㎏/일 IP)
종점:
레이저 도플러 혈류 영상화(28일째)는 혈류를 왼쪽(손상됨) 및 오른쪽 다리(모의)에서 검사하고 이어서 좌/우 비로서 보고함을 나타낸다. 당뇨병/상귀네이트 및 당뇨병/PBS의 값들의 평균을 보고한다.
- CD31에 대한 염색 및 정량적인 영상화 프로그램을 사용하는 혈관형성의 정량적인 평가(28일째)(왼쪽 다리)
데이터
종점 #1: 혈관형성의 정량적인 평가
28일째에, 마우스를 죽이고 상기 대퇴 동맥 결찰의 분포에서 뒷다리 골격근을 검색하고 항-cD31 IgG를 사용하여 면역조직화학을 수행하였다. 일련의 상들을 검색하고 상 분석을 수행하여 혈관형성에 대한 상귀네이트의 효과를 측정하였다:
Figure pct00003
종점 #2: 혈류 회복
결찰된 대퇴 동맥 사지/대측성(모의) 사지를 비교하는 혈류 회복%를 레이저 도플러 영상화를 사용하여 평가하였다. 이 연구에서, 기준선 혈관 기능장애가 고려되도록 손상된 다리와 그의 대측성 모의 다리 사이의 비를 보고한다. 데이터는 하기와 같다:
Figure pct00004
결론
대퇴 동맥 결찰에 위해 유발시킨 뒷다리 허혈을 겪고 있는 당뇨성 마우스에게 상귀네이트의 투여는 비히클을 사용한 발견에 비해 혈관형성의 정량분석에서 현저한 개선을 생성시킨다. 대퇴 동맥 결찰에 위해 유발시킨 뒷다리 허혈을 겪고 있는 당뇨성 마우스에게 상귀네이트의 투여는 비히클(PBS) 처리에 비해 레이저 도플러 영상화에 의해 측정 시 혈류 회복을 현저하게 개선시킨다.
실시예 3
PEG화된 CO-헤모글로빈(PEG-COHb)의 수혈 효과를 2 시간의 집중 대뇌 허혈 및 1일의 재 관류를 가한 마취된 래트에서 평가하였다. PEG-Hb를 카복시 상태(PEG-COHb)에서 보관하여 CO의 공급원을 제공하고 자동산화를 감소시키고 반감기를 증가시켰다. 허혈 20 분째에 10 ㎖/㎏의 PEG-COHb의 수혈은 동맥 혈압을 변경시키거나 상기 허혈성 코어의 적혈구 유출을 증가시키지 않았다. 혈장 헤모글로빈은 단지 0.6 g/㎗로 증가하였으나, 경색 부피는 현저하게 감소하지 않았으며 신경 손상이 개선되었다. PEG-COHb의 조기 정상부 부하는 상기 뇌를 허혈성 발작으로부터 보호한다.
수술 준비
모든 과정은 존스 홉킨스 대학 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인되었다. 수컷 위스타 래트(250 - 350 g)를 5% 아이소플루란으로 마취시키고 수술 중 자발적인 환기와 함께 노즈 콘(nose cone)을 통해 대략2% 아이소플루란으로 마취를 유지시켰다. 아이소플루란 농도를 수술 후 대략 1.5%까지 감소시켰다. 흡입된 O2는 대략 25 내지 30%이었다. 카테터를 수혈을 위해 대퇴 정맥에 삽입하고 동맥 혈압의 측정 및 동맥혈의 샘플링을 위해 대퇴 동맥에 삽입하였다. 가열 램프를 사용하여 허혈 및 초기 재 관류 중 직장 온도를 유지시켰다. 머리 가죽에 작은 절개를 수행하고 단지 희박한 양의 뼈만 남을 때까지 측면 정수리 뼈에 작은 버홀(burr hole)을 내었다. 1-㎜ 직경의 광섬유 탐침을 상기 얇은 뼈에 고정시켰다. 상기 탐침을, 근적외선을 투과시키고 수용하며 적혈구 유출의 상대적인 변화를 계산하는 레이저-도플러 유량계에 연결하였다. 상기 레이저-도플러 플럭스 신호를 사용하여 상기 허혈 기간 동안 혈관 폐색의 타당성을 평가하였다.
일시적인 집중 대뇌 허혈을 관강 내 필라멘트 기법에 의해 유발시켜 중심 대뇌 동맥 내로의 혈류를 폐색시켰다. 오른쪽 공통 경동맥을 측면 절개를 통해 노출시키고 폐색시켰다. 오른쪽 외부 경동맥을 절개하고 결찰하고 상기 외부 경동맥의 후두 동맥 가지를 단리하고 응고시켰다. 상기 오른쪽 내부 경동맥의 근위 익구개 동맥 가지를 결찰하고, 4-0 모노필라멘트 나일론 봉합사(끝이 둥글게 된)를 상기 내부 경동맥 내로 대략 2 ㎝ 진행시켰다. 상기 필라멘트 위치를 조절하여 상기 레이저 도플러 플럭스 신호의 60% 이상의 감소를 생성시켰다. 2 시간의 폐색 후에, 상기 관강 내 봉합사를 회수하여 재 관류를 시작하였다. 상기 재 관류의 처음 30 분간 모니터 후에, 카테터를 제거하고, 절개를 봉합사로 막고, 마취를 중단하였다.
실험 디자인
PEG-알부민 및 PEG-COHb를 프로롱 파마슈티칼스(Prolong Pharmaceuticals)(South Plainfield, New Jersey)에서 합성하였다. 정제된 소 Hb 상의 표면 리신 잔기를 5000 분자량 PEG와 결합시켰다. 보관 전에 상기 PEG-Hb 용액에 CO를 발포시켜 상기 PEG-Hb의 >80%를 PEG-COHb로 전환시켰다. 4 내지 6% 단백질을 함유하는 용액을 멸균 혈액 주머니 중에서 2 내지 10 ℃에서 보관하였다. 10 마리 래트씩 세 그룹을 연구하였다: 1) 수혈 없음, 2) 소 PEG-알부민 수혈, 및 3) 소 PEG-COHb 수혈. 상기 실험일에, 상기 용액의 분액을 가온하고 10 ㎖/㎏ 체중과 동일한 정상부 부하로서 수혈하였다. 상기 수혈을 MCAO 20 분째에 시작하였다. 정맥 내 수혈 속도는 0.5 ㎖/분이었으며 대략 5 내지 7 분에 걸쳐 발생하였다. 평균 동맥압 및 레이저 도플러 흐름 변화%를 2 시간의 MCAO 및 30 분의 재 관류 동안 15 분 간격으로 기록하였다. 직장 온도를 상기 동물들이 따뜻한 환경에서 마취로부터 회복됨에 따라 1 시간의 재 관류 동안 모니터하였다. 동맥혈(약 0.7 ㎖)을 기준선, 1 시간의 MCAO 및 30 분의 재 관류에서 샘플링하였다. 동맥혈 pH, PCO2, PO2 및 전해질을 방사계 혈액 기체 분석기(ABL80) 상에서 측정하였다. 동맥 Hb 농도, O2 포화도, MetHb 및 COHb를 방사계 헤목시미터(OSM3) 상에서 측정하였다. 상기 샘플로부터의 혈장을 Hb 농도에 대해 분석하였다. 상기 래트들을 1 및 24 시간의 재 관류 시 0 내지 4 등급(0 = 손상 없음, 1 = 앉아있는 동안 앞다리를 뻗지 못함, 2 = 원형으로 돌기, 3 = 한쪽 허약, 및 4 = 자발적인 운동 활동 없음)으로 신경 손상에 대해 평가하였다. 24 시간째에, 뇌를 수확하여 경색 부피를 측정하였다. 상기 뇌를 7 개의 관상 절편(2 ㎜ 두께)으로 나누었다. 상기 절편들을 트라이페닐테트라졸륨 클로라이드(생명력 있는 영역을 적색으로 염색한다)의 1% 용액으로 염색하였다. 대뇌 피질 및 선조체의 옅은 비 생명력 면적을 각 절편의 전방 및 후방 표면상에서 측정하였다. 각 절편의 경색 부피를 상기 절편 두께 및 상기 전방 및 후방 표면상의 경색 면적의 평균으로부터 계산하였다. 상기 피질 및 선조체의 전체 경색 부피를, 각 절편으로부터의 부피를 합하여 획득하였다. 값들을 전체 구조의 퍼센트로서 나타낸다. 측정치들을 ANOVA 및 뉴만-코일스(Newman-Keuls) 다중 범위 검증에 의해 0.05의 유의수준으로 상기 세 그룹들 간에 비교하였다. 데이터를 평균±SE로서 나타낸다.
결과
동맥 pH, PCO2 및 PO2는 모든 래트 그룹에서 MCAO 및 초기 재 관류 동안 생리학적 범위에서 안정하게 남아있었다(표 1). MCAO 20 분째에 수혈된 상기 그룹들 간에 현저한 차이는 없었다. 전해질 농도는 수혈 후 상기 그룹들 간에 유사하게 남아있었다(표 2). 정상부 부하 단백질 수혈에 대해 예상된 바와 같이, 헤미토크릿의 작은 감소가 발생하였다(표 3).
수혈 없음 또는 중심 대뇌 동맥 폐색(MCAO) 20 분째 수혈 그룹들에서 2 시간의 MCAO 도중 및 상기 후의 동맥 pH 및 혈액 기체(평균±SE; n = 10) 기준선 60 분 MCAO 30 분 재 관류
pH 기준선 60 분 MCAO 30 분 재 관류
수혈 없음 7.40 ±0.01 7.41 ±0.01 7.41 ±0.01
PEG-알부민 7.41 ±0.01 7.41 ±0.01 7.39 ±0.01
PEG-COHb 7.39 ±0.01 7.40 ±0.01 7.39 ±0.01
PCO 2 ( mm Hg )
수혈 없음 45.0 ±0.9 43.0 ±1.0 43.6 ±1.1
PEG-알부민 42.0 ±1.1 42.5 ±0.7 45.4 ±0.5
PEG-COHb 43.7 ±0.8 44.3 ±1.4 44.3 ±2.0
PO 2 ( mm Hg )
수혈 없음 120 ±3 123 ±5 124 ±3
PEG-알부민 124 ±2 123 ±3 119 ±4
PEG-COHb 128 ±4 122 ±6 125 ±7
염기 과잉
수혈 없음 1.6 ±0.5 1.5 ±0.6 1.7 ±0.4
PEG-알부민 1.4 ±0.3 2.1 ±0.4 1.9 ±0.3
PEG-COHb 0.3 ±0.6 1.4 ±0.4 1.3 ±0.3
수혈 없음 또는 MCAO 20 분째 수혈 그룹들에서 2 시간의 MCAO 도중 및 상기 후의 동맥 혈 전해질(평균±SE; n = 10)
기준선 60 분 MCAO 30 분 재 관류
Na + ( mM )
수혈 없음 138.4 ±0.6 140.2 ±1.1 141.0 ±0.8
PEG-알부민 140.2 ±0.5 138.2 ±0.5 138.3 ±0.6
PEG-COHb 142.0 ±0.8 141.4 ±0.4 142.7 ±0.7
K + ( mM )
수혈 없음 4.1 ±0.1 4.5 ±0.2 4.0 ±0.1
PEG-알부민 4.1 ±0.1 4.1 ±0.1 4.0 ±0.1
PEG-COHb 4.0 ±0.1 4.1 ±0.1 4.3 ±0.1
Ca 2 + ( mM )
수혈 없음 1.36 ±0.04 1.23 ±0.06 1.20 ±0.05
PEG-알부민 1.53 ±0.26 1.34 ±0.02 1.30 ±0.05
PEG-COHb 1.28 ±0.04 1.24 ±0.02 1.21 ±0.03
Cl - ( mM )
수혈 없음 100.2 ±0.7 100.7 ±1.5 101.6 ±0.7
PEG-알부민 102.8 ±1.0 101.7 ±0.5 101.1 ±0.5
PEG-COHb 104.0 ±1.0 102.0 ±0.6 102.5 ±0.7
수혈 없음 또는 MCAO 20 분째 수혈 그룹들에서 2 시간의 MCAO 도중 및 상기 후의 전혈 헤모글로빈 분석(평균±SE; n = 10)
기준선 60 분 MCAO 30 분 재 관류
헤마토크릿 (%)
수혈 없음 37 ±1 37 ±1
PEG-알부민 38 ±1 34 ±1
PEG-COHb 36 ±1 33 ±1
헤모글로빈 (g/ dL )
수혈 없음 12.5 ±0.3 11.7 ±0.3 12.1 ±0.3
PEG-알부민 12.5 ±0.2 11.2 ±0.4 11.2 ±0.3
PEG-COHb 11.7 ±0.3 11.1 ±0.3 11.1 ±0.6
동맥 O 2 함량 ( ml O 2 / dL )
수혈 없음 16.0 ±0.3 15.3 ±0.3 16.3 ±0.4
PEG-알부민 16.3 ±0.2 14.4 ±0.4 14.1 ±0.7
PEG-COHb 14.9 ±0.7 14.8 ±0.6 14.4 ±0.7
MetHb (%)
수혈 없음 1.0 ±0.1 0.9 ±0.1 0.7 ±0.1
PEG-알부민 0.9 ±0.1 0.9 ±0.1 0.9 ±0.1
PEG-COHb 0.7 ±0.1 1.6 ±0.2* 1.5 ±0.1*
COHb (%)
수혈 없음 0.6 ±0.1 0.5 ±0.1 0.3 ±0.3
PEG-알부민 0.5 ±0.1 0.4 ±0.1 0.2 ±0.1
PEG-COHb 0.6 ±0.1 2.3 ±0.2* 2.3 ±0.1*
*PEG-알부민으로부터 P < 0.05
그러나, PEG-알부민-수혈된 그룹에 비해 PEG-COHb-수혈된 그룹에서 헤마토크릿 또는 전혈 Hb 농도에 있어서 현저한 차이는 없었다. 전혈 중의 MetHb 및 COHb의 퍼센트는 PEG-COHb의 수혈 후 약간 상승하였다(표 3). MCAO 60 분째(상기 PEG-COHb 수혈 완료 후 약 35 분째) 혈장 Hb의 분석은 0.6±0.1 g/㎗(±SE)의 농도, 및 상기 수준이 재 관류 30 분째에 비교적 변하지 않고 남아있음을 가리켰다. 상기 혈장 Hb 중의 COHb의 퍼센트는 MCAO 60 분째에 11±4% 및 재 관류 30 분째에 6±1%이었다. 평균 동맥혈압들에 대한 값을 도 3A에 나타낸다. 압력이 상기 PEG-COHb 그룹에서 연장된 MCAO 중에 약간 증가하는 경향이 있지만, 상기 값은 어떠한 시점에서도 그룹들 간에 현저하게 상이하지 않았다. 레이저-도플러 흐름을 허혈이 가장 밀집한 외측 피질에 대해 모니터하였다. 값들을 도 3B에 나타낸다. 모든 그룹에서, 흐름이 초기 기준선의 대략 25%까지 감소하였고 시간에 따라 기준선의 대략 30%까지 약간 증가하였다. 재 관류의 경우, 흐름은 모든 그룹에서 기준선의 대략 80%까지 복원되었다. 어떠한 시점에서도 그룹들 간에 현저한 차이는 없었다. 직장 온도는 상기 래트가 마취에서 깨어난 후에 허혈 중 및 재 관류 1 시간째에 36.5 내지 37.0 ℃의 범위에서 유지되었다. 더욱이, 상기 래트는 24 시간째에 발열을 나타내지 않았다. 마취에서 깨어난 후, 신경 손상 점수는 그룹들 간에 유사하였다(도 4). 그러나, 24 시간째 재 시험 시, 상기 PEG-COHb 그룹에서 신경 손상 점수가 선택적으로 개선되었다. 각 관상 동맥 수준에서의 경색 부피 및 전체 경색 부피에 대한 값들을 도 5에 나타낸다. 경색 부피는 수혈이 없는 그룹과 PEG-알부민을 수혈한 그룹에서 유사하였다. 경색 부피는 상기 수혈받지 않거나 PEG-알부민 그룹에 비해 PEGCOHb를 수혈한 그룹에서 현저하게 감소하였다. 상기 PEG-COHb 그룹에서, 경색 부피는 상기 PEG-알부민 그룹에 비해 피질에서 82% 및 선조체에서 56%까지 감소하였다(도 6). 상기 경색 부피의 감소는 상기 5 개의 대부분의 조각들에서 존재하였으며, 이에 의해 전체 중간 대뇌 동맥 분포 영역에 걸쳐 조직 구제가 확산됨을 가리켰다.
논의
일시적인 집중 대뇌 허혈 중 PEG-COHb 정상부 부하 수혈에 의한 조직 구제의 정도는 래트에서 αα-가교결합된 Hb 또는 마우스에서 중합체성 Hb에 의한 과혈량성 교환 수혈에 대해 보고된 경우보다 실질적으로 더 크다. 이러한 발견은 상기 10 ㎖/㎏ 정상부 부하에 의해 획득한 혈장 Hb 농도가 0.6 g/㎗(이는 6 g/㎗의 Hb를 함유하는 유체의 30 내지 40% 교환 수혈에 의해 전형적으로 획득되는 2 내지 2.5 g/㎗보다 상당히 적다)이었기 때문에 주목할만하다. 더욱이, 10 g/㎗에서 20 g/㎗로의 수혈 유체 중 Hb 농도의 증가에 의한 αα-가교결합된 Hb의 혈장 농도의 추가적인 증가는 경색 부피의 추가적인 감소를 생성시킨다. 이러한 비교는 PEG-COHb가 발작으로부터 뇌를 구제함에 있어서 αα-가교결합된 Hb 및 중합체성 Hb에 비해 헴 몰당 더 우수할 수 있음을 암시한다. 상기 결과는 PEG화된 COHb의 큰 혈장 농도가 상기 뇌의 구제에 필요하지 않음을 가리킨다. 상기 교환 수혈의 이론적인 이점은 헤마토크릿을 감소시킴으로써 전혈 점도를 감소시킬 수 있고 이에 의해 부수적인 혈류를 증진시킬 수 있다는 것이다. 상기 교환 수혈에 대한 상기 정상부 부하의 이점은 상기 프로토콜이 임상적인 발작에 실행하기 더 용이하며 10 ㎖/㎏ 부피가 현저한 과혈량 유발된 고혈압의 발생 없이 쉽게 허용된다는 것이다. 현저한 고혈압은 본 연구에서 관찰되지 않았다. 상기 PEG-COHb에 의한 구제는 단일 부위에서 레이저-도플러 혈류측정에 의해 평가 시 피질의 허혈 코어 중 혈류의 증가와 관련된 것으로 보이지 않았다. 그러나, 조직을 지키기에 충분한 허혈성 경계 영역에 부수적인 혈류를 개선시킬 수 있다. 상기 PEG화된 Hb 용액의 점도는 가교결합 및 중합체성 Hb의 용액에 비해 전혈의 점도에 더 가까우며 따라서 내피 전단 응력 및 관련된 NO 생산을 양호하게 유지시킬 수 있고, 이는 부수적인 동맥 확장의 유지를 도울 수 있다.
상기 PEG-알부민 및 PEG-COHb의 10 ㎖/㎏ 정상부 부하 수혈은 헤마토크릿을 대략 8 내지 10% 감소시켰다. 이러한 헤마토크릿의 비교적 작은 감소는 혈액 점도에 단지 작은 영향만을 미칠 것이며 혈액 점도의 감소에 의해 뇌 손상을 감소시키기에 충분히 관류를 개선하지는 않는 듯하다. 본 연구 및 보다 큰 혈액 희석에 대한 선행 연구에서 상기 PEG-알부민을 수혈한 그룹과 수혈이 없는 그룹 간의 경색 부피 차이의 결여는 상기 전제를 지지한다. 더욱이, PEG-COHb 정상부 부하 후 0.6 g/㎗까지의 혈장[Hb]의 증가는 상기 헤마토크릿의 감소를 상쇄시키기에 부적합하였다. 따라서, 전혈[Hb] 및 동맥 O2 함량은 PEG-COHb 수혈에 의해 증가되지 않았다. 그러나, 동맥 O2 함량 또는 혈류 증가의 부재 하에서조차 상기 혈장 중의 O2 운반체는 여러 가지 이유로 인해 허혈 조직으로의 O2 전달을 향상시킬 수 있다. 첫 번째, 혈장에 대한 산소 용해도가 낮으며 이는 상기 조직 중의 적혈구와 미토콘드리아 간의 O2 확산의 내성에 대한 주요 부위를 나타낸다. 상기 혈장 중에서 다량의 O2를 운반함으로써, 적혈구 막으로부터 내피로의 O2 운반이 촉진된다. 이에 관하여, MACO 중 Hb 중합체의 수혈 효능은 상기 용액이 주로 14 MDa 초과의 분자량을 갖는 중합체를 함유하는 경우 상실된다. 5000 분자량 PEG의 대략 8 내지 10 개 측쇄를 갖는 현행 소 PEG-Hb는 혈장 중에서 O2 운반을 촉진하기 위해 높은 운동성을 갖기에 충분히 작지만 혈관 밖 유출을 제한하기에 충분히 큰 양호한 균형을 나타내는 듯하다. 두 번째, 개별적인 미세 혈관을 통한 적혈구 유출은 이질적이며 이러한 이질성은 불완전한 허혈 중 낮은 관류 압력의 조건 하에서 증폭된다. O2를 적혈구가 고갈된 모세관에서의 혈장 흐름을 통해 전달함으로써, O2 전달은 모세관들 사이에서 더욱 균일해질 수 있다. 세 번째, 적혈구는 미립자이며 그의 표면적은 어떠한 한 순간에도 모세관 내피의 전체 표면적을 덮지 못한다. 혈장 중의 O2 운반체는 O2 확산에 유효한 표면적을 증가시킨다. 따라서, 무 세포 Hb의 정상부 부하 주입은 벌크 동맥 O2 함량 및 거시적인 혈류와 별개인 여러 O2 전달 기전을 불러일으킬 수 있다.
본 출원에 인용된 모든 발행물 및 특허 문헌들은, 각각의 개별적인 발행물 또는 특허 문헌들이 그렇게 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 출원인들은, 본 문헌에서 다양한 참고문헌들의 인용에 의해 임의의 특정 참고문헌이 그들의 발명에 대한 "우선권"임을 인정하는 것은 아니다.

Claims (42)

  1. 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 조성물로서,
    a. 작용성의 고유 헤모글로빈 분자의 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자의 그룹이
    i. 산소 제거된 상태이고;
    ii. 화학적 가교결합제가 없으며;
    iii. 약 22 ㎜ Hg 내지 약 26 ㎜ Hg의 P50을 갖는
    상기 수용성 헤모글로빈 분획;
    b. 상기 헤모글로빈 분자의 그룹을 상기 산소 제거된 상태로 유지시키는 수용성 안정제 분획으로서, 상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하는 안정화제를 포함하는 상기 수용성 안정제 분획; 및
    c. 수성 희석제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분획 및 상기 안정제 분획이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 상기 수성 희석제 분획
    을 포함하고, 바이러스 활성이 필수적으로 없으며, 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자의 Fe(II)가 산소에도 일산화 탄소에도 결합되지 않은 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자의 Fe(II)가 일산화 탄소에 결합된 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자가 상기 결합된 일산화 탄소를, 상기 산소 제거된 헤모글로빈이 접촉하고 있는 조직으로 운반할 수 있는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화제가 아민, 예를 들어 아미노산을 포함하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산이 시스테인인 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 희석제 분획이 염을 포함하는 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염이 염화 나트륨인 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염이 상기 조성물을 등장성 및 고장성 중에서 선택된 구성원으로 만들기에 충분한 양으로 존재하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 분획이 가교결합되지 않은 소 헤모글로빈으로 필수적으로 이루어진 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    5% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 분자의 상기 그룹의 각 구성원이 폴리(에틸렌 글리콜)의 하나 이상의 분자에 공유 결합되는 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 분자가 상기 헤모글로빈 분자의 아미노산 잔기의 아민 부분을 통해 공유 결합되는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 잔기가 리신 잔기이고 상기 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 분자가, 아미드 및 유레탄 중에서 선택된 구성원인 결합을 통해 상기 리신 잔기의 ε-아민 부분에 공유 결합되는 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 헤모글로빈 분획이 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 불활성화된 조성물.
  17. 작용성의 고유 헤모글로빈 분자와 폴리(에틸렌 글리콜)의 하나 이상의 분자 간의 공유 결합체를 포함하는 조성물로서,
    a. 헤모글로빈 분자의 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원이
    i. 산소 제거되고;
    ii. 아미노산 잔기의 아민 부분을 통해 상기 폴리(에틸렌 글리콜)의 하나 이상의 분자에 공유 결합되며;
    iii. 화학적 가교결합제가 없고;
    iv. 약 9 ㎜ Hg 내지 약 12 ㎜ Hg의 P50을 갖는
    상기 수용성 헤모글로빈 분획;
    b. 상기 헤모글로빈 분자의 그룹을 내산화성으로 만드는 수용성 안정제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자의 그룹보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하는 안정화제를 포함하는 상기 수용성 안정제 분획; 및
    c. 희석제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분획이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 상기 희석제 분획
    을 포함하고, 바이러스 활성이 필수적으로 없으며, 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 조성물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원이 5 개 이상의 상기 아미노산 잔기의 상기 아민 부분을 통해 5 개 이상의 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 부분에 공유 결합되는 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 잔기의 상기 아민 부분이 리신 잔기의 ε-아민 부분인 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 분자가 산소 및 일산화 탄소 중에서 선택된 구성원에 결합되는 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 분자가 상기 결합된 산소 및 상기 결합된 일산화 탄소 중에서 선택된 구성원을, 상기 헤모글로빈이 접촉하고 있는 조직으로 운반할 수 있는 조성물.
  22. 수용성의 작용성 고유 헤모글로빈을 포함하는 헤모글로빈 조성물로서,
    a. 산소 제거된 헤모글로빈 및 안정화제의 용액을, 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성을 불활성화시키기에 충분히 상승된 온도에 노출시킴을 포함하고, 상기 노출이 상기 용액 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성의 상기 불활성화를 성취하기에 충분한 시간 동안인 열 바이러스 불활성화 공정에 가함을 포함하고,
    상기 안정화제가 상기 용액 중의 상기 산소 제거된 헤모글로빈보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하고, 이에 의해 상기 산소 제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합이 최소화되고,
    상기 용액이 상기 열 바이러스 활성 제거 공정에서 약 10% 초과의 메트헤모글로빈의 형성을 방지하기에 충분한 양의 상기 안정화제를 포함하는
    방법에 의해 제조되는 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 전에, 또한 (b)를 포함하는, 산소 공급된 헤모글로빈의 용액을 산소 제거하고, 이에 의해 상기 산소 제거된 헤모글로빈의 상기 용액을 형성시킴을 또한 포함하는, 상기 방법에 의해 제조된 헤모글로빈 조성물.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 전에, 또한 (c)를 포함하는, 상기 안정화제를 갖는 상기 산소 제거된 헤모글로빈의 상기 용액을 형성시킴을 또한 포함하는, 상기 방법에 의해 제조된 헤모글로빈 조성물.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화제가 단계 (a)에서 약 5% 초과의 메트헤모글로빈의 형성을 방지하기에 충분한 양으로 존재하는 상기 방법에 의해 제조된 헤모글로빈 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 온도가 약 60 ℃인 상기 방법에 의해 제조된 헤모글로빈 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시간이 약 10 시간인 상기 방법에 의해 제조된 헤모글로빈 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산소 제거가, 산소에도 일산화 탄소에도 결합되지 않은 산소 제거된 헤모글로빈 분자를 생성시키는 헤모글로빈 조성물.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산소 제거가, 일산화 탄소에 결합된 산소 제거된 헤모글로빈 분자를 생성시키는 헤모글로빈 조성물.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    d. 상기 단계 (a)의 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 용액을 상기 헤모글로빈의 아미노산 잔기에 상보성인 반응성의 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 접촉시키고, 이에 의해 상기 용액 중에 폴리(에틸렌 글리콜)과 헤모글로빈 분자 간의 공유 결합체를 형성시킴을 또한 포함하는, 상기 방법에 의해 제조된 헤모글로빈 조성물.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 분자가 산소 및 일산화 탄소 중에서 선택된 구성원에 결합되는 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈 분자가 상기 결합된 산소 및 상기 결합된 일산화 탄소 중에서 선택된 구성원을 조직으로 운반할 수 있는 조성물.
  33. 수용성의 작용성 고유 헤모글로빈을 포함하는 헤모글로빈 조성물로서,
    10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하고,
    a. 약 60 ℃에서 약 10 시간 동안 전구체 헤모글로빈 용액을 가열하고, 상기 전구체 용액이 상기 용액 중의 상기 헤모글로빈 분자보다 산소와 더 반응성인 구조를 포함하는 안정화제를 포함하고, 이에 의해 상기 산소 제거된 헤모글로빈에 의한 산소 결합을 최소화하고 이에 의해 상기 조성물을 형성시킴
    을 포함하는 방법에 의해 제조된 상기 조성물.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화제가 아미노산인 조성물.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화제가 시스테인인 조성물.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이
    b. 상기 단계 (a)의 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 용액을 상기 헤모글로빈의 아미노산 잔기에 상보성인 반응성의 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 접촉시키고, 이에 의해 상기 용액 중에 폴리(에틸렌 글리콜)과 헤모글로빈 분자 간의 공유 결합체를 형성시킴을 또한 포함하는
    조성물.
  37. 약 60 ℃에서, 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈을 포함하는 수용성 분획을 포함하고, 상기 분획이 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 조성물.
  38. a. 작용성의 고유 헤모글로빈 분자의 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원이
    i. 산소 제거된 상태이고;
    ii. 화학적 가교결합제가 없으며;
    iii. 약 22 ㎜ Hg 내지 약 26 ㎜ Hg의 P50을 갖는
    상기 수용성 헤모글로빈 분획;
    b. 상기 헤모글로빈 분자의 그룹을 상기 산소 제거된 상태로 유지시키는 수용성 안정제 분획으로서, 상기 산소 제거된 헤모글로빈 분자보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하는 안정화제를 포함하는 상기 수용성 안정제 분획; 및
    c. 희석제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분획이 용해성인 약학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 상기 희석제 분획
    을 포함하고, 바이러스 활성이 필수적으로 없으며, 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 수용성, 작용성의 고유 헤모글로빈을 포함하는 바이러스 불활성화된 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    i. 산소 제거된 헤모글로빈 및 상기 안정화제의 용액을, 상기 혼합물 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성을 불활성화시키기에 충분히 상승된 온도에 노출시킴을 포함하고, 상기 노출이 상기 혼합물 중의 필수적으로 모든 바이러스 활성의 상기 불활성화를 성취하기에 충분한 시간 동안인 열 바이러스 불활성화 공정에 가함
    을 포함하는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 바이러스 불활성화된 헤모글로빈 용액을 상기 헤모글로빈의 아미노산 잔기에 상보성인 반응성의 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 접촉시키고, 이에 의해 상기 용액 중에 폴리(에틸렌 글리콜)과 헤모글로빈 분자 간의 공유 결합체를 형성시킴을 또한 포함하는 방법.
  40. 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈 분자와 폴리(에틸렌 글리콜)의 하나 이상의 분자 간의 공유 결합체를 포함하는 조성물로서,
    a. 헤모글로빈 분자의 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원이
    i. 산소 제거되고 CO에 결합되며;
    ii. 아미노산 잔기의 아민 부분을 통해 상기 폴리(에틸렌 글리콜)의 하나 이상의 분자에 공유 결합되고;
    iii. 화학적 가교결합제가 없으며;
    iv. 약 9 ㎜ Hg 내지 약 12 ㎜ Hg의 P50을 갖는
    상기 수용성 헤모글로빈 분획;
    b. 상기 헤모글로빈 분자의 그룹을 내산화성으로 만드는 수용성 안정제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자의 그룹보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하는 안정화제를 포함하는 상기 수용성 안정제 분획; 및
    c. 희석제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분획이 용해성인 포스페이트 완충된 염수 희석제를 포함하는 상기 희석제 분획
    을 포함하고, 바이러스 활성이 필수적으로 없으며, 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 조성물.
  41. 작용성의 산소 제거된 고유 헤모글로빈 분자와 폴리(에틸렌 글리콜)의 하나 이상의 분자 간의 공유 결합체를 포함하는 조성물로서,
    a. 헤모글로빈 분자의 그룹을 포함하는 수용성 헤모글로빈 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자 그룹의 각 구성원이
    i. 산소 제거되고 CO에 결합되지 않으며;
    ii. 아미노산 잔기의 아민 부분을 통해 상기 폴리(에틸렌 글리콜)의 하나 이상의 분자에 공유 결합되고;
    iii. 화학적 가교결합제가 없으며;
    iv. 약 9 ㎜ Hg 내지 약 12 ㎜ Hg의 P50을 갖는
    상기 수용성 헤모글로빈 분획;
    b. 상기 헤모글로빈 분자의 그룹을 내산화성으로 만드는 수용성 안정제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분자의 그룹보다 산소와 더 반응성인 구조 요소를 포함하는 안정화제를 포함하는 상기 수용성 안정제 분획; 및
    c. 희석제 분획으로서, 상기 헤모글로빈 분획이 용해성인 고장성 염수 희석제를 포함하는 상기 희석제 분획
    을 포함하고, 바이러스 활성이 필수적으로 없으며, 10% 미만의 메트헤모글로빈을 포함하는 조성물.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고장성 염수 희석제가 약 3% 내지 약 7% 농도의 NaCl을 포함하는 조성물.
KR1020127000555A 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물 KR20120052221A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18554709P 2009-06-09 2009-06-09
US61/185,547 2009-06-09

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177022846A Division KR102170375B1 (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물
KR1020187033506A Division KR20180126103A (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120052221A true KR20120052221A (ko) 2012-05-23

Family

ID=42779888

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177022846A KR102170375B1 (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물
KR1020187033506A KR20180126103A (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물
KR1020187037893A KR102210133B1 (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물
KR1020127000555A KR20120052221A (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177022846A KR102170375B1 (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물
KR1020187033506A KR20180126103A (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물
KR1020187037893A KR102210133B1 (ko) 2009-06-09 2010-06-09 헤모글로빈 조성물

Country Status (31)

Country Link
US (3) US10080782B2 (ko)
EP (2) EP3266463B1 (ko)
JP (3) JP6227870B2 (ko)
KR (4) KR102170375B1 (ko)
CN (1) CN102458451B (ko)
AR (1) AR077041A1 (ko)
AU (4) AU2010258752B2 (ko)
BR (1) BRPI1010775A2 (ko)
CA (1) CA2764872C (ko)
CL (1) CL2011003091A1 (ko)
CY (1) CY1119578T1 (ko)
DK (2) DK2440239T3 (ko)
ES (2) ES2966234T3 (ko)
HK (1) HK1243628A1 (ko)
HR (1) HRP20171480T1 (ko)
HU (1) HUE037163T2 (ko)
IL (1) IL216404A (ko)
LT (1) LT2440239T (ko)
ME (1) ME02979B (ko)
MX (1) MX342787B (ko)
MY (2) MY192541A (ko)
NO (1) NO2440239T3 (ko)
NZ (1) NZ597022A (ko)
PL (2) PL2440239T3 (ko)
PT (1) PT2440239T (ko)
RS (1) RS56496B1 (ko)
RU (1) RU2589254C2 (ko)
SI (1) SI2440239T1 (ko)
TW (1) TWI626057B (ko)
WO (1) WO2010144629A1 (ko)
ZA (1) ZA201109176B (ko)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10172949B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US10172950B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
PT2440239T (pt) 2009-06-09 2017-10-19 Prolong Pharmaceuticals Llc Composições de hemoglobina
US8609815B2 (en) * 2010-09-02 2013-12-17 Sangart, Inc. Methods for preparing stable deoxygenated PEG-hemoglobin conjugate solutions comprising an antioxidant
EP2663193B1 (en) 2011-01-14 2019-05-08 Children's Hospital Los Angeles Solution of carbon monoxide for treatment of disease, including sickle cell disease
ES2432075T3 (es) 2011-07-23 2013-11-29 Sastomed Gmbh Espray para heridas
US9572833B2 (en) 2011-11-07 2017-02-21 The General Hospital Corporation Treatment of red blood cells
US10729748B2 (en) 2012-01-13 2020-08-04 Mölnlycke Health Care Ab Scarring reducing wound treatment
US8859499B2 (en) * 2012-03-20 2014-10-14 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Method of enhancing efficacy of blood transfusions
CA2908238C (en) 2012-04-03 2023-01-10 Schindler, William Succinimide-activated nitroxyl compounds and methods for the use thereof for nitroxylation of proteins
US20140106004A1 (en) * 2012-10-12 2014-04-17 Bing Lou Wong Hemoglobin-based oxygen carrier-containing pharmaceutical composition for cancer targeting treatment and prevention of cancer recurrence
KR102238718B1 (ko) * 2013-03-15 2021-04-12 쉰들러, 윌리엄 폴리알킬렌 산화물 발레르산염 헤모글로빈 접합체
WO2014205077A1 (en) * 2013-06-21 2014-12-24 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
CN103387613B (zh) * 2013-08-02 2016-12-28 西北大学 一种血红蛋白及血红蛋白氧载体病毒灭活的方法
CN103690978B (zh) * 2013-12-19 2017-01-25 陕西佰美基因股份有限公司 一种用于血红蛋白及血红蛋白氧载体灭活病毒的方法
WO2016077825A1 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 Aima Biotech Conjugated proteins
CN105749257B (zh) * 2016-01-25 2019-12-06 四川大学华西医院 一种血红蛋白类携氧纳米凝胶及其制备方法和用途
CN107007625A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 上海本素医药科技有限公司 含一氧化碳的血液制剂及其在制备抗炎症药物中的应用
CN109475511A (zh) * 2016-05-19 2019-03-15 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 还原态氧载体及其用于治疗碳氧血红蛋白血症的用途
US10662063B1 (en) * 2016-06-06 2020-05-26 University Of Puerto Rico Photosensitized release of nitric oxide
CN107625954A (zh) * 2016-07-19 2018-01-26 上海本素医药科技有限公司 含一氧化碳的血红蛋白制剂及其在抗炎症中的应用
BR112019024249A2 (pt) * 2017-05-19 2020-06-02 New Health Sciences, Inc. Métodos e tratamento de trauma
CN107952072B (zh) * 2017-11-28 2021-07-20 深圳先进技术研究院 载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法、载药载氧杂交蛋白纳米粒和应用
WO2021034416A2 (en) 2019-07-02 2021-02-25 Hbo2 Therapeutics, Llc Hemoglobin substitute mixtures including reconstituted plasma and platelets and their manufacture and use
WO2021217010A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 KaloCyte, Inc. Self-assembling oxygen carrier compositions
WO2021262803A1 (en) * 2020-06-23 2021-12-30 Virtech Bio, Inc Compositions and methods for treating hemorrhagic shock
EP4210732A1 (en) * 2020-09-08 2023-07-19 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Therapeutic carbon monoxide formulations
US11857605B2 (en) 2021-03-01 2024-01-02 Billion King International Limited Thiosuccinyl-crosslinked hemoglobin conjugates and methods of use and preparation thereof
CN113813372A (zh) * 2021-09-26 2021-12-21 云锦华彰(北京)生物科技有限公司 血红素组合物、药物组合物及其应用
WO2023091642A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Virginia Commonwealth University Modular field-stable bio-artificial blood substitute
CN113975378A (zh) * 2021-11-19 2022-01-28 润方（北京）生物医药研究院有限公司 一种聚合血红蛋白在制备治疗缺血性脑卒中药物的应用
WO2024081928A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Prolong Pharmaceuticals Llc A stable hemoglobin protein composition

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3991181A (en) 1975-06-18 1976-11-09 Warner-Lambert Company Injectable stroma free hemoglobin solution and its method of manufacture
US4401652A (en) 1980-12-31 1983-08-30 Allied Corporation Process for the preparation of stroma-free hemoglobin solutions
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
DE3481109D1 (de) 1983-05-09 1990-03-01 Novo Nordisk As Antihaemophilie-faktor-viii-konzentrat und dessen herstellungsverfahren.
US4831012A (en) 1984-03-23 1989-05-16 Baxter International Inc. Purified hemoglobin solutions and method for making same
US5281579A (en) 1984-03-23 1994-01-25 Baxter International Inc. Purified virus-free hemoglobin solutions and method for making same
EP0206448B1 (en) * 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
DK323587D0 (da) 1987-06-25 1987-06-25 Novo Industri As Protein
CA1312009C (en) 1986-11-10 1992-12-29 Carl W. Rausch Extra pure semi-synthetic blood substitute
US5084558A (en) 1987-10-13 1992-01-28 Biopure Corporation Extra pure semi-synthetic blood substitute
GB8710598D0 (en) 1987-05-05 1987-06-10 Star Medical Diagnostics Ltd Hemoglobin based blood substitute
US5605884A (en) 1987-10-29 1997-02-25 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Factor VIII formulations in high ionic strength media
WO1989009784A1 (en) 1988-04-08 1989-10-19 Commonwealth Serum Laboratories Commission Production of heat-stable factor viii concentrate
US5428061A (en) 1988-09-15 1995-06-27 Schwarz Pharma Ag Organic nitrates and method for their preparation
US5558985A (en) 1989-03-27 1996-09-24 Bionostics Incorporated Stable hemoglobin reference solution
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ES2247656T3 (es) 1989-04-19 2006-03-01 Enzon, Inc. Un proceso para formar un polipeptido modificado que comprende un polipeptido y un oxido de polialquileno.
US5342940A (en) 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
US5284872A (en) 1989-09-12 1994-02-08 Schwarz Pharma Ag Nitrato alkanoic acid derivatives, methods for their production, pharmaceutical compositions containing the derivatives and medicinal uses thereof
US5580560A (en) 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
US5386014A (en) 1989-11-22 1995-01-31 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable, non-immunogenic red blood cell substitute
US5234903A (en) 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5478806A (en) 1989-11-22 1995-12-26 Enzon, Inc. Enhancement of antitumor therapy with hemoglobin-based conjugates
US5650388A (en) 1989-11-22 1997-07-22 Enzon, Inc. Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
ATE180834T1 (de) 1990-01-29 1999-06-15 Zymogenetics Inc Antikoagulierende proteine
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
HU218890B (hu) 1991-02-28 2000-12-28 Novo Nordisk A/S Véralvadást gátló módosított VII faktorok, ezeket kódoló polinukleotid molekulák, polinukleotid molekulával transzfektált emlős sejtek és a véralvadást gátló módosított VII faktorokat tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint a készítmények ...
US5380758A (en) 1991-03-29 1995-01-10 Brigham And Women's Hospital S-nitrosothiols as smooth muscle relaxants and therapeutic uses thereof
US5376524A (en) 1991-04-01 1994-12-27 Thomas Jefferson University Platelet storage medium containing acetate and phosphate
DE4111393A1 (de) 1991-04-09 1992-10-15 Behringwerke Ag Stabilisierte faktor viii-praeparationen
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DK0676964T3 (da) 1991-11-14 2001-02-05 Brigham & Womens Hospital Nitrosylering af enzym-SH-grupper som en terapeutisk modalitet
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
AU670793B2 (en) 1992-04-30 1996-08-01 Alpha Therapeutic Corporation Improved solubilization and stabilization of factor VIII complex
US5264555A (en) 1992-07-14 1993-11-23 Enzon, Inc. Process for hemoglobin extraction and purification
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5910316A (en) 1992-08-24 1999-06-08 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Use of nitric oxide-releasing agents to treat impotency
US5650447A (en) 1992-08-24 1997-07-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Nitric oxide-releasing polymers to treat restenosis and related disorders
CA2124690C (en) 1992-10-02 2007-09-11 Thomas Osterberg Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
SE9301581D0 (sv) 1993-05-07 1993-05-07 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
DE4321306A1 (de) 1993-06-26 1995-01-05 Sanol Arznei Schwarz Gmbh Disulfide
US5407579A (en) 1993-07-02 1995-04-18 National Science Council Hemoglobin purification
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5691452A (en) 1995-03-23 1997-11-25 Biopure Corporation Method for preserving a hemoglobin blood substitute
US6271351B1 (en) 1995-03-23 2001-08-07 Biopure Corporation Method for preserving a hemoglobin blood substitute
US5703073A (en) 1995-04-19 1997-12-30 Nitromed, Inc. Compositions and methods to prevent toxicity induced by nonsteroidal antiinflammatory drugs
US5585484A (en) 1995-04-19 1996-12-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Hemoglobin crosslinkers
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5932538A (en) 1996-02-02 1999-08-03 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated α-adrenergic receptor antagonist compounds, compositions and their uses
US6310052B1 (en) 1996-06-04 2001-10-30 Queen's University At Kingston Nitrate esters and their use for neurological conditions
US5807847A (en) 1996-06-04 1998-09-15 Queen's University At Kingston Nitrate esters
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
US5833973A (en) 1996-06-28 1998-11-10 Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. Crosslinked elastomeric silicones in aqueous emulsion cosmetic compositions
US5808011A (en) 1996-07-01 1998-09-15 Biopure Corporation Method for chromatographic removal of prions
US5763401A (en) 1996-07-12 1998-06-09 Bayer Corporation Stabilized albumin-free recombinant factor VIII preparation having a low sugar content
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
CA2270118A1 (en) 1996-11-01 1998-05-14 Nitromed Inc. Nitrosated and nitrosylated phosphodiesterase inhibitor compounds, compositions and their uses
EP1011710B1 (en) * 1997-02-28 2005-08-17 The Regents of the University of California Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems
AU726861B2 (en) 1997-07-03 2000-11-23 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Novel nitric oxide-releasing amidine- and enamine-derived diazeniumdiolates, compositions and uses thereof and method of making same
AU9403098A (en) * 1997-10-10 1999-05-03 Baxter International Inc. Storage-stable hemoglobin composition
US6656452B1 (en) 1997-10-21 2003-12-02 The General Hospital Corporation Use of inhaled NO as anti-inflammatory agent
US6017882A (en) 1997-10-23 2000-01-25 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
DK1053019T3 (da) 1998-01-07 2004-04-13 Debio Rech Pharma Sa Nedbrydelige heterobifunktionelle polyethylenglycolacrylater og geler og konjugater afledt derfra
WO1999045964A1 (en) 1998-03-12 1999-09-16 Shearwater Polymers, Incorporated Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
DE19838481C1 (de) 1998-08-25 2000-03-23 Michael T Witt Anlage zur solarthermischen Energiegewinnung
US6773613B1 (en) 1998-10-15 2004-08-10 Sangart, Inc. Method for production of stroma-free hemoglobin
AU1262900A (en) 1998-11-06 2000-05-29 Novo Nordisk A/S Method for the production of fvii
US6437102B1 (en) 1999-11-24 2002-08-20 Bayer Corporation Method of separating prions from biological materials
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
DK1259563T4 (en) 1999-12-22 2016-11-21 Nektar Therapeutics PROCEDURE FOR PREPARING 1-BENZOTRIAZOLYL CARBONATE ESTERS OF WATER SOLUBLE POLYMERS
PL206148B1 (pl) 2000-02-11 2010-07-30 Bayer HealthCare LLCBayer HealthCare LLC Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego
ATE485371T1 (de) 2000-05-03 2010-11-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Varianten des menschlichen koagulationsfaktors vii
KR100396983B1 (ko) 2000-07-29 2003-09-02 이강춘 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
PL204888B1 (pl) 2000-09-13 2010-02-26 Novo Nordisk Healthcare Ag Wariant polipeptydu czynnika VII, konstrukcja kwasu nukleinowego, rekombinowana komórka gospodarza, zwierzę transgeniczne, sposób wytwarzania wariantu polipeptydu czynnika VII, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie wariantu polipeptydu czynnika VII
WO2002038162A1 (en) 2000-11-09 2002-05-16 The Scripps Research Institute MODIFIED FACTOR VIIa
CA2453433A1 (en) 2001-08-10 2003-02-20 Nitromed, Inc. Methods of use for novel sulfur containing organic nitrate compounds
US6649072B2 (en) 2001-11-16 2003-11-18 Robert Brandt Method for producing autologous platelet-rich plasma
US20030153491A1 (en) 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
US20050164915A1 (en) 2002-04-01 2005-07-28 Sangart, Inc. Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
US7001715B2 (en) 2002-02-28 2006-02-21 Biopure Corporation Purification of red blood cells by separation and diafiltration
DE10212321A1 (de) 2002-03-20 2003-10-09 Sanguibio Tech Ag Verwendung eines oder mehrerer von Plasma und Zellwandbestandteilen befreiten natürlichen oder modifizierten Sauerstoffbinder zur externen Behandlung offener, insbesondere chronischer Wunden
US7144989B2 (en) 2002-03-25 2006-12-05 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Pegylated non-hypertensive hemoglobins, methods of preparing same, and uses thereof
US6901941B2 (en) * 2002-07-10 2005-06-07 Air Products And Chemicals, Inc. Vessel with optimized purge gas flow and method using same
US20040072729A1 (en) * 2002-10-10 2004-04-15 Sunbio Inc. High oxygen affinity PEG-hemoglobin as treatment for brain stroke
JP4699028B2 (ja) 2002-11-08 2011-06-08 ザ ブライアム アンド ウィミンズ ホスピタル インコーポレーテッド 血小板の生存を延長するための組成物および方法
CN1741812B (zh) 2002-12-23 2013-04-24 犹太大学阿尔伯特爱因斯坦医学院 修饰的血红蛋白及其制备方法
ES2347805T3 (es) 2004-08-31 2010-11-04 Sangart, Inc. Metodos para aumentar la estabilidad hemodinamica usando composiciones que transportan oxigeno.
CA2600927C (en) 2005-03-07 2017-04-18 Sangart, Inc. Compositions and methods for delivering carbon monoxide (co) and nitric oxide (no) to tissue using heme proteins as carriers
JP4665791B2 (ja) 2005-04-15 2011-04-06 ニプロ株式会社 酸素運搬体の脱一酸化炭素化方法、脱一酸化炭素化された酸素運搬体、その医薬組成物及び脱一酸化炭素化装置
US8741832B2 (en) 2005-06-10 2014-06-03 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Pegylated albumin and uses thereof
JP5020525B2 (ja) * 2006-03-30 2012-09-05 財団法人生産開発科学研究所 配位子置換型輸液製剤
US7759306B2 (en) 2006-05-16 2010-07-20 Simoni Jan S Methods of treating acute blood loss
JP2008195656A (ja) * 2007-02-14 2008-08-28 Nipro Corp 人工酸素運搬体製剤
PT2440239T (pt) 2009-06-09 2017-10-19 Prolong Pharmaceuticals Llc Composições de hemoglobina
US7932356B1 (en) 2010-06-23 2011-04-26 Bing Lou Wong Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition

Also Published As

Publication number Publication date
ME02979B (me) 2018-10-20
MX2011013215A (es) 2012-09-12
EP2440239B1 (en) 2017-09-13
JP2018021032A (ja) 2018-02-08
NZ597022A (en) 2014-05-30
HUE037163T2 (hu) 2018-08-28
JP2016074710A (ja) 2016-05-12
US20100311657A1 (en) 2010-12-09
DK3266463T3 (da) 2024-01-08
DK2440239T3 (en) 2017-10-16
PT2440239T (pt) 2017-10-19
KR102210133B1 (ko) 2021-02-01
AU2010258752B2 (en) 2015-07-09
AU2018204708A1 (en) 2018-07-19
AU2017201272A1 (en) 2017-03-16
KR102170375B1 (ko) 2020-10-27
US10080782B2 (en) 2018-09-25
RU2589254C2 (ru) 2016-07-10
TWI626057B (zh) 2018-06-11
US20190000929A1 (en) 2019-01-03
CY1119578T1 (el) 2018-03-07
MY192541A (en) 2022-08-26
MX342787B (es) 2016-10-12
HRP20171480T1 (hr) 2018-01-12
HK1243628A1 (zh) 2018-07-20
RS56496B1 (sr) 2018-01-31
CA2764872A1 (en) 2010-12-16
LT2440239T (lt) 2017-12-11
US10772937B2 (en) 2020-09-15
MY184447A (en) 2021-04-01
CL2011003091A1 (es) 2012-04-27
TW201109034A (en) 2011-03-16
JP6377036B2 (ja) 2018-08-22
US10780148B2 (en) 2020-09-22
KR20180126103A (ko) 2018-11-26
RU2011153748A (ru) 2013-07-20
AU2010258752A1 (en) 2012-01-12
KR20170097241A (ko) 2017-08-25
AU2015238812A1 (en) 2015-10-29
EP3266463A1 (en) 2018-01-10
PL2440239T3 (pl) 2018-01-31
AU2017201272B2 (en) 2018-07-26
NO2440239T3 (ko) 2018-02-10
CA2764872C (en) 2018-07-24
PL3266463T3 (pl) 2024-03-18
JP6483766B2 (ja) 2019-03-13
AU2018204708B2 (en) 2019-07-25
CN102458451A (zh) 2012-05-16
CN102458451B (zh) 2016-10-05
JP2012529531A (ja) 2012-11-22
US20170072023A1 (en) 2017-03-16
WO2010144629A1 (en) 2010-12-16
IL216404A (en) 2016-06-30
AR077041A1 (es) 2011-07-27
BRPI1010775A2 (pt) 2016-03-22
EP3266463B1 (en) 2023-12-13
ZA201109176B (en) 2013-02-27
KR20190000939A (ko) 2019-01-03
EP2440239A1 (en) 2012-04-18
AU2015238812B2 (en) 2017-04-06
ES2966234T3 (es) 2024-04-18
ES2643462T3 (es) 2017-11-23
SI2440239T1 (en) 2018-01-31
IL216404A0 (en) 2012-01-31
JP6227870B2 (ja) 2017-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10772937B2 (en) Hemoglobin compositions
US10172950B2 (en) Hemoglobin compositions
JP2015515462A (ja) 輸血の有効性を高める方法
US10172949B2 (en) Hemoglobin compositions
WO2016022554A1 (en) Hemoglobin compositions
WO2014205077A1 (en) Hemoglobin compositions
WO2024081928A1 (en) A stable hemoglobin protein composition

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
A107 Divisional application of patent