CN107625954A - 含一氧化碳的血红蛋白制剂及其在抗炎症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含一氧化碳的血红蛋白制剂、其制备方法、其在制备抗炎症药物中的应用、一种抗炎症药物组合和一种药物包装。该含一氧化碳的血红蛋白制剂包括饱和度为20％‑100％的含一氧化碳的血红蛋白；该制备方法包括以下步骤：将一氧化碳通入含有血红蛋白的溶液，使饱和度为20％‑100％。本发明的含一氧化碳的血红蛋白制剂能够控制住多种炎症反应，具有优异的抗炎症效果，有效地降低了现有同类药物副作用，增强了接收对象的耐受性，方便、刺激性低，具有较高的安全性。

Description

含一氧化碳的血红蛋白制剂及其在抗炎症中的应用

技术领域

本发明涉及抗炎症药物领域，具体涉及一种含一氧化碳的血红蛋白制剂及其在抗炎症中的应用。

背景技术

炎症反应慢慢发展逐渐导致各种严重伤害性的疾病，如以下与炎症相关的疾病：哮喘、成人呼吸窘迫综合征、间质性肺纤维化、肺栓塞、慢性梗阻性肺病、原发性肺动脉高血压、慢性肺气肿、充血性心力衰竭、周围性血管疾病、中风、动脉粥样硬化、缺血性再灌注损伤、心脏病发作、肾小球肾炎、涉及肾发炎的病症、泌尿生殖道感染、病毒性和中毒性肝炎、肝硬化、肠梗阻、坏死性小肠结肠炎、特异性和非特异性肠炎、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、帕金森病、脓毒性休克和过敏性休克。其中脓毒症是严重创伤、休克及感染后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)。脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，病情凶险，发病率和病死率一直居高不下。研究表明，严重脓毒症后重要脏器功能衰竭，多脏器衰竭后死亡率极高。即使在医学高度发展的现代，也很难使功能衰竭的多脏器逆转，因此预防和减轻脓毒症早期的脏器损害尤其重要。脓毒症的发病机制尚未明了，涉及到复杂的全身网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤等多个方面。

在脓毒症早期凝血系统可通过外源性途径活化，在某些炎症介质，如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10等)的诱导下，血管内皮细胞以及单核细胞可表达组织因子(tissue factor，TF)。组织因子与活化的Ⅶ因子(activated factorⅦ，FⅦa)组成复合物，激活Ⅹ因子(factorⅩ，FX)，即导致凝血反应。内皮细胞也可在炎症因子，如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10等)的诱导下，表达凝血酶受体、凝血调节蛋白、生长因子和von Willebrand因子、细胞间黏附因子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等，促进内皮细胞与白细胞粘附，激活白细胞。血小板在凝血酶、肾上腺素等的诱导下即活化并表达膜表面糖蛋白ⅡbpⅢa，ⅡbpⅢa黏附到内皮细胞、血小板、胶原蛋白、纤维蛋白沉淀物表面，形成聚集。血小板活化后可分泌凝血因子和血管活性物质等，从而促进血小板的凝聚反应并促进白细胞及中性粒细胞聚集、活化，加重炎症反应及血管损伤。脓毒症后早期凝血功能即发生改变，并且与全身炎症反应严重程度密切相关，所以伤后早期能否有效改善异常的凝血功能，控制全身炎症反应与预防脓毒症的发生至关重要。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种原因不明的非特异性肠道炎症性疾病，病变主要累及大肠粘膜及粘膜下层，甚至累及全结肠及末段回肠，呈连续性病变，以腹痛、腹泻、里急后重、粘液脓血便为主要临床特点。据西方国家统计，UC的年发病率为2-20/10万，病患率为50-100/10万，可发生于任何年龄，以20-50岁多见。随着我国经济发展和人民生活水平的提高，UC在我国的年发病率已达到11.6/10万，并逐年上升。UC病理变化很复杂，按其发生、发展过程及内镜下表现，分为急性期和慢性期。UC急性期发作，若得到控制，其症状缓解并治愈，若失治误治，炎症反复发作，则转变成慢性，其中有5％-10％的UC患者易发生癌变，而病程在25年以上者癌变率高达40％。因此，UC急性期的治疗对于防止其慢性化以及癌变有重要意义，但临床上至今没有特异性根治措施。所以UC已被世界卫生组织列为现代难治病之一。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是骨科常见病和一种非特异性炎症，其特点是关节肿痛和肿胀反复发作，滑膜炎持续反复发作，可逐渐导致关节软骨退变及软骨下骨的破坏，致关节强直和畸形，功能障碍，甚至残废，严重影响生活质量。临床表现为：多发性、对称性末端关节炎、关节局部红。

前期研究发现，外源性一氧化碳(CO)预处理具有减轻器官缺血再灌注损伤的作用，但其具体的作用机制并不明确。并且体外研究发现，CO可以抑制树突状细胞(DC)的活化。在正常的肾脏间质中存在大量的固有DC(rDC)，肾移植后rDC成熟，并迁移至受者次级淋巴器官，通过直接识别模式激活受者的同种反应性T淋巴细胞，从而介导排斥反应的产生。前期的体外研究发现，外源性CO以Toll样受体(TLR)4信号通路依赖的方式抑制热缺血和冷保存后rDC的活化。

动脉粥样硬化是一种血管内的慢性炎症反应，是心脏血管疾病包括冠脉血栓、心肌梗死、脑卒中等的主要原因。牙周炎是牙周致病菌引发的慢性感染性疾病。近年来，大量流行病学调查结果表明，牙周炎是心血管疾病的重要危险因素，与动脉粥样硬化的发生发展具有密切关联性。经证实，与动脉粥样硬化的发生发展呈显著正相关的细胞因子血清C反应蛋白(C react protein,CRP)及可溶性血管细胞黏附分子-1(Soluble vascular celladhesion molecule-1,sVCAM-1)的水平在牙周炎患者血清中显著升高。同时牙周炎患者血清中炎症细胞因子水平的升高可导致脂质代谢紊乱，造成血样中氧化性低密度脂蛋白水平升高，促进并加速脂质条纹在血管内壁中的产生，进而形成粥样斑块。一氧化碳分子具有抗炎、调节白细胞粘附、舒张血管及抗血管内皮细胞凋亡等多种作用。

临床上当急性心肌梗塞发生时，常立即用血管成形术来进行治疗，以减少心肌损伤。但是此疗法在让缺血的心脏恢复血氧需求时却诱导了缺血复灌(I/R)损伤，氧化应激是缺血复灌损伤主要原因。目前有研究证实，一氧化碳能在损伤诱导的各种机体应激中起保护组织的作用，一氧化碳是一种通用信号分子，在心血管、神经和免疫的生理和病理过程中都起着重要的调节作用。它能通过可溶性鸟苷酸环化酶途径减轻肺I/R损伤和胰β细胞调亡，也可以通过一氧化氮合酶途径对抗在体心肌I/R损伤等。

一氧化碳分子被发现具有抗炎症作用。一氧化碳释放分子(CORMs)是一类常用的一氧化碳复合物，该复合物为一类过渡金属羰基化合物，通常可用于制备缓释的一氧化碳(Curr.Pharm.2003；9:2525-39)。但在实际应用中发现一氧化碳释放分子毒性较大，具有一定的副作用，且由于其为外源的分子，容易引起生物体内的免疫排斥反应。另外现有作为一氧化碳载体的一氧化碳释放分子通常只能以注射的形式给药，用药方式刺激性较强，且容易产生安全问题。因此目前尚缺少一种能够有效地抗炎症并且降低免疫排斥反应、提高生物体耐受性的含一氧化碳制剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中常用的一氧化碳载体-一氧化碳释放分子(CORM)抗炎症效果不够理想且毒性较大、容易引起生物体内的免疫排斥反应、因而目前尚缺少一种能够有效地抗炎症并且降低免疫排斥反应、提高生物体耐受性的含一氧化碳制剂的技术问题，提供了一种含一氧化碳的血红蛋白制剂及其在抗炎症中的应用。本发明的含一氧化碳的血红蛋白制剂能够早期控制住脓毒症、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、器官移植免疫反应、动脉粥样硬化和心脏缺血复灌损伤等多种炎症反应，并改善凝血功能，具有优异的抗炎症效果，有效地降低了现有同类药物的免疫排斥反应和副作用，增强了药物接收对象的耐受性。且本发明提供的含一氧化碳的血红蛋白制剂可以通过口服的方式给药，方便、刺激性低，具有较高的安全性。

本发明提供以下技术方案解决上述技术问题。

本发明技术方案之一：一种含一氧化碳的血红蛋白制剂，其包括含一氧化碳的血红蛋白，所述血红蛋白的一氧化碳饱和度为20％-100％，所述百分比为所述血红蛋白制剂中结合有一氧化碳的血红蛋白的数量占血红蛋白总数的百分比。

本发明中，所述一氧化碳的饱和度为20％-100％，较佳地为60％-100％，更佳地为100％。所述一氧化碳的来源可以为本领域常规来源的一氧化碳，如实验室自己制得或通过购买获得，较佳地为将甲酸与浓硫酸进行反应或将炭不完全燃烧制得。更佳地为炭不完全燃烧制得，该方法获得的一氧化碳纯度更高。所述血红蛋白可以为本领域常规来源的血红蛋白，如从哺乳动物采取的新鲜血液中提取的血红蛋白或购买的血红蛋白。所述哺乳动物可以为常规的哺乳动物，例如，牛(Bovinae)、猪(porcus)、羊(Ovineindet)、马(Equidae)、鹿(cervidae)、鸡(pullus)、鸭(Anatidae)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Musmusculus)、人(Homo sapiens)或兔(Oryctolagus cuniculus)等。

本发明中，较佳地，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂为含一氧化碳的血红蛋白口服制剂。

本发明中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂还可以包括本领域常规的药用载体。所述药用载体可以为本领域常规的药用载体，包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂、稳定剂、增稠剂、乳化剂等。

本发明中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的形式可以为本领域常规的口服制剂形式，较佳地为粉剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊、片剂、脂质体、纳米粒或微球。

本发明中，所述粉剂可以为本领域常规形式的粉剂，较佳地为冻干粉剂，较佳地为一氧化碳饱和度为20％-100％的血红蛋白的粉末。所述粉剂较佳地通过包含下述步骤的方法制得：将一氧化碳通入到含有血红蛋白的溶液中，冷冻后冻干成粉末即得。所述含有血红蛋白的溶液可以为本领域常规的溶液，如水溶液等。所述通入可以为本领常规的操作，较佳地为将所述一氧化碳抽入注射器，将注射器连接导管后通过导管直接将所述一氧化碳通入所述含有血红蛋白的溶液。所述冷冻的温度可以为本领域常规的冷冻操作的温度，较佳地为-80℃。所述冷冻的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为24小时。所述冻干可以为本领域常规的操作，较佳地为通过冻干机进行冻干。所述冻干的时间可以为本领域常规的时长，只要冻成干粉即可，较佳地为24小时。

此处在一优选的实施方案中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂通过包括下述步骤的方法制得：将一氧化碳抽入注射器，将注射器连接导管后通过导管直接将所述一氧化碳通入所述含有血红蛋白的水溶液，使所述血红蛋白的一氧化碳饱和度达到100％，-80℃冷冻24小时后放进冷冻干燥机中，冻干24h即得。

本发明中，所述溶液剂可以为本领域常规的溶液剂，较佳地为含有前述含一氧化碳的血红蛋白的溶液。所述一氧化碳的饱和度为20％-100％，较佳地为60％-100％，更佳地为100％。所述含一氧化碳的血红蛋白的溶液的溶剂可以为本领域常规的溶剂，如0.9％NaCl溶液、5％葡萄糖溶液或医用红细胞保存液，所述百分比为质量体积百分比，单位为g/mL。若无特殊说明，本发明所述的质量体积百分比的单位为g/mL，如0.9％NaCl溶液的含义为100mLNaCl溶液中含有0.9g NaCl。所述溶液剂中的血红蛋白的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为2.94mmol/L，所述mmol/L为每升所述溶液中血红蛋白的毫摩尔数。所述溶液剂可以通过本领域常规的方法制备得到，较佳地通过包括以下步骤的方法制备得到：将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂溶于所述溶剂中即得。

此处在一优选的实施方案中，所述溶液剂为血红蛋白浓度为2.94mmol/L、血红蛋白的一氧化碳饱和度为100％的5％葡萄糖溶液，所述百分比为质量体积百分比。

此处在一进一步优选的实施方案中，上述溶液剂通过以下步骤制得：将血红蛋白的一氧化碳饱和度为100％的前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂溶于5％葡萄糖溶液即得，所述百分比为质量体积百分比。

本发明中，所述颗粒剂可以为本领域常规形式的颗粒剂，含有前述含一氧化碳的血红蛋白和药用辅料，如羧甲基纤维素钠。所述含一氧化碳的血红蛋白和所述药用辅料的质量比可以为本领域常规的比例，如5∶95。所述颗粒剂可以通过本领域常规的制备方法制得，较佳地，按照包括以下步骤的制备方法制得：

1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和药用辅料分别过筛后混合，加入蒸馏水混合均匀，制得软材；

2)将步骤1)所制得的软材过筛后均匀摊开，干燥至恒重即得。

本发明中，上述步骤1)中，所述过筛可以为本领域常规的操作，较佳地为过40目筛。所述混合可以按本领域常规的质量比将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和所述药用辅料进行混合，较佳地为按5∶95的质量比混合。所述蒸馏水与所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和所述药用辅料的总质量的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为5∶95。步骤2)中，所述过筛可以为本领域常规的操作，较佳地为过20目的标准筛。所述摊开可以为本领域常规的操作，较佳地为摊开在平皿中。所述干燥可以为本领域常规的操作，较佳地为真空干燥。所述干燥的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为37℃。

此处在一优选的实施方案中，所述颗粒剂含有质量比为5∶95的前述含一氧化碳的血红蛋白和羧甲基纤维素钠。

此处在一进一步优选的实施方案中，上述颗粒剂通过包括以下步骤的方法制得：1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和羧甲基纤维素钠分别过40目筛后按5∶95的质量比混合，加入蒸馏水混合均匀，制得软材，所述蒸馏水与所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和所述羧甲基纤维素钠的总质量的质量比为5∶95；2)将步骤1)所制得的软材过20目标准筛后均匀摊开在平面皿，真空37℃干燥至恒重即得。其中，步骤1)中，所述过筛可以为本领域常规的操作，较佳地为过40目筛。所述混合可以按本领域常规的质量比将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和所述药用辅料进行混合，较佳地为按5∶95的质量比混合。所述蒸馏水与所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和所述药用辅料的总质量的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为5∶95。步骤2)中，所述过筛可以为本领域常规的操作，较佳地为过20目的标准筛。所述摊开可以为本领域常规的操作，较佳地为摊开在平皿中。所述干燥可以为本领域常规的操作，较佳地为真空干燥。所述干燥的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为37℃。

本发明中，所述胶囊可以为本领域常规形式的胶囊，较佳地包括前述颗粒剂和胶囊壳，前述颗粒剂在所述胶囊壳内。所述胶囊壳可以为本领域常规的胶囊壳，如药级明胶制得的胶囊壳。较佳地，所述胶囊壳为肠溶胶囊壳或结肠溶胶囊壳。所述胶囊中前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的颗粒剂与所述胶囊壳的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为5∶95。

本发明中，所述胶囊可以通过本领域常规的制备方法制得，较佳地通过包括以下步骤的方法制得：

1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂和药用辅料分别过筛后混合，加入蒸馏水混合均匀，制得软材；

2)将步骤1)所制得的软材过筛后均匀摊开在平面皿，干燥至恒重，制得颗粒剂；

3)将步骤2)所制得的颗粒剂分装到药级明胶制得的胶囊壳中，即得。

此处在一优选的实施方案中，所述胶囊包括上述含有质量比为5∶95的前述含一氧化碳的血红蛋白和羧甲基纤维素钠的颗粒剂和药级明胶制得胶囊壳，上述含有质量比为5∶95的前述含一氧化碳的血红蛋白和羧甲基纤维素钠的颗粒剂被封装在所述药级明胶制得胶囊壳中。

此处在一进一步优选的实施方案中，上述胶囊通过包括以下步骤的方法制得：1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂和羧甲基纤维素钠分别过40目筛后按5∶95的质量比混合，加入蒸馏水混合均匀，制得软材，所述蒸馏水与所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂和所述羧甲基纤维素钠的总质量的质量比为5∶95；2)将步骤1)所制得的软材过20目标准筛后均匀摊开在平面皿，真空37℃干燥至恒重，制得颗粒剂；3)将步骤2)所制得的颗粒剂分装到药级明胶制得的胶囊壳中，即得。

本发明中，所述片剂可以为本领域常规的片剂，较佳地，为肠溶包衣片剂。较佳地，所述片剂含有所述含一氧化碳的血红蛋白、淀粉和羧甲基纤维素钠。所述含一氧化碳的血红蛋白、淀粉和羧甲基纤维素钠的质量比可以为本领域常规的比例，如5∶90∶5。所述片剂可以通过本领域常规的制备方法制得，较佳地通过湿法制得，包括以下步骤：

1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂、所述淀粉和所述羧甲基纤维素钠分别过筛；

2)将步骤1)中过筛后的所述含一氧化碳的血红蛋白冻干制剂的粉剂、所述淀粉和所述羧甲基纤维素钠混合，用淀粉浆作交联剂制成湿粒；

3)将步骤2)中所述湿粒干燥后过筛整粒，最后压片即得。

本发明中，上述步骤1)中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂、淀粉和羧甲基纤维素钠的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为5∶90∶5；所述过筛可以为过本领域常规的筛，较佳地为过20目筛；步骤3)中，所述过筛可以为过本领域常规的筛，较佳地为过16目筛。

本发明中，较佳地，所述的肠溶包衣片剂可由包括以下步骤的方法制得：

1)片芯的制备：将淀粉、糊精过80目筛，硬脂酸镁过30目筛，含一氧化碳的血红蛋白冻干粉过20目筛，淀粉∶糊精∶硬脂酸镁∶蛋白冻干粉的质量比为1∶8:2∶100；其中淀粉先用冷的纯水打湿后加入适量沸水配成10％(w/w)的淀粉浆，再将过20目筛后的含一氧化碳的血红蛋白冻干粉和糊精和硬脂酸镁干粉混匀，慢慢加入淀粉浆制备湿粒，将湿粒整粒过12目筛，放于平皿中37℃干燥过12目筛后压片，即得片芯；

2)包衣液的制备：在洁净的不锈钢桶内加入聚丙烯酸树脂Ⅱ、95％(v/v)乙醇和聚山梨酯，搅拌至聚丙烯酸树脂Ⅱ完全溶解；再加入聚乙二醇6000、95％(v/v)乙醇后放入糖浆锅里加热直至聚乙二醇6000完全溶解，然后加入到前述的聚丙烯酸树脂Ⅱ溶液中；最后加入邻苯二甲酸二乙酯和蓖麻油混匀；其中上述含一氧化碳的血红蛋白冻干粉末∶聚丙烯酸树脂Ⅱ∶95％(v/v)乙醇∶聚山梨酯∶聚乙二醇6000∶95％(v/v)乙醇∶邻苯二甲酸二乙酯∶蓖麻油的质量比为200∶10∶130∶2∶1∶10∶2∶2。

3)包衣：将步骤1)所得的片芯倒入GBS-150高效包衣机中，设定转速为2-12转/分，进风温度为50-80℃，喷枪高度20-25cm，开始预热片芯，当物料温度达到35-44℃开始喷步骤2)制得的包衣液，控制雾化压力为2.0+0.5bar，停止后，降低锅速、关闭热风、保持排风，待包衣片冷却至室温出片。

此处在一优选的实施方案中，所述片剂含有质量比为5∶90∶5的前述含一氧化碳的血红蛋白、淀粉和羧甲基纤维素钠。

此处在一进一步优选的实施方案中，上述片剂通过包括以下步骤的方法制得：1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂、淀粉和羧甲基纤维素钠分别过20目筛；2)将步骤1)中所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂、所述淀粉和所述羧甲基纤维素钠按5∶90∶5的质量比混合，用淀粉浆作交联剂制成湿粒；3)将步骤2)中湿粒37℃干燥后过16目筛整粒，最后压片即得。

本发明中，所述脂质体可以为本领域常规的脂质体，较佳地，所述脂质体含有所述含一氧化碳的血红蛋白、磷脂和膜材料。所述磷脂可以为本领域常规的磷脂，如蛋黄卵磷脂。所述膜材料可以为本领域常规的膜材料，如DSPE-PEG-2000(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000)。所述含一氧化碳的血红蛋白、所述含一氧化碳的血红蛋白、磷脂和所述膜材料的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶15∶0.64。

本发明中，所述脂质体可以通过本领域常规的制备方法制得，较佳地，按照包括以下步骤的制备方法制得：

1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂和所述磷脂分别溶于甲醇，另外加入所述膜材料、混合，得混合液1；

2)将步骤1)所得混合液1旋转蒸发成膜后干燥，水化后超声，即得。

本发明中，前述步骤1)中，前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂、所述磷脂和所述膜材料的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶15∶0.64。前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂溶于甲醇后的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为1mg/mL。所述磷脂溶于甲醇后的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为15mg/mL。所述膜材料溶于甲醇后的浓度为0.64mg/mL。步骤2)中，所述蒸发成膜的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为37℃。所述旋转蒸发成膜可以为本领域常规的操作，例如通过旋转蒸发仪来进行。所述干燥可以为本领域常规的干燥，较佳地为真空干燥。所述干燥的温度可以为本领域常规的干燥温度，较佳地为37℃。所述干燥的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为12小时。所述水化可以为本领域常规的操作，较佳地为加入PBS水化。所述PBS的体积可以为本领域常规的体积，例如1mL。所述水化的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为2小时。所述超声可以为本领域常规的操作。所述超声的功率可以为本领域常规的功率，较佳地为630w。所述超声的模式可以为本领域常规的模式，较佳地为超声10s停顿5s，循环10次。

此处在一优选的实施方案中，所述脂质体含有质量比为1∶15∶0.64的前述含一氧化碳的血红蛋白、蛋黄卵磷脂和膜材料DSPE-PEG-2000。

此处在一进一步优选的实施方案中，上述脂质体按照包括以下步骤的制备方法制得：1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂和所述蛋黄卵磷脂分别溶于甲醇，终浓度分别为1mg/mL与15mg/mL，另外再加入膜材料DSPE-PEG-2000至终浓度为0.64mg/mL，混合，得混合液1；2)将步骤1)所得混合液1在37℃旋蒸成膜后真空干燥12小时，加入1mL PBS水化2小时后630w超声，超声10s停顿5s，循环10次即得。

本发明中，所述纳米粒可以为本领域常规的纳米粒，较佳地，所述纳米粒含有前述含一氧化碳的血红蛋白和戊二醛。所述含一氧化碳的血红蛋白和戊二醛的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶0.47。

本发明中，所述纳米粒可以通过本领域常规的制备方法制得，较佳地，按照包括以下步骤的制备方法制得：1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂溶于碳酸盐缓冲液，伴随着搅拌匀速滴加乙醇溶液，得混合体系A；

2)向步骤1)制得的所述混合体系A中加入戊二醛溶液，固化，减压浓缩去除乙醇，即得。

本发明中，前述步骤1)中，所述碳酸盐缓冲液可以为本领域常规的碳酸盐缓冲盐，如0.2mol/L碳酸钠和0.2mol/L碳酸氢钠的混合溶液。所述碳酸盐缓冲液的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为0.2mol/L。所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂的质量与所述碳酸盐缓冲液的质量体积百分比可以为本领域常规的比值，较佳地为1％。所述碳酸盐的缓冲液的pH值可以为本领域常规的pH值，较佳地为pH＝9。所述滴加乙醇溶液与所述碳酸盐缓冲液的体积比可以为本领域常规的比例，较佳地为6∶1。所述搅拌的速度可以为本领域常规的转速，较佳地为1500rpm。所述匀速滴加可以为本领域常规的滴加速度，较佳地为1mL/min。步骤(2)中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂与所述戊二醛的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶0.47。所述固化的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为25℃。所述固化的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为12小时。

在此处一优选的实施方案中，所述纳米粒含有质量比为1∶0.47的前述含一氧化碳的血红蛋白和戊二醛。

此处在一优选的实施方案中，所述纳米粒按照包括以下步骤的制备方法制得：1)将1mg前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂溶于0.1mL的0.2mol/L碳酸钠-0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液，伴随着1500rpm搅拌以1mL/min的速度匀速滴加0.6mL乙醇溶液，得混合体系A；2)向步骤1)制得的所述混合体系A中加入戊二醛溶液至终浓度为1.69μmol/L，25℃固化12小时，减压浓缩去除乙醇，即得。

本发明中，所述微球可以为本领域常规的微球，较佳地，所述微球包含前述含一氧化碳的血红蛋白、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与聚乙烯醇。所述含一氧化碳的血红蛋白与所述PLGA的质量比可以为本领域常规的质量比，较佳地为1.25∶100。

所述微球可以通过本领域常规的制备方法制得，较佳地通过复乳溶剂挥发法制得。所述复乳溶剂挥发法较佳地包括以下步骤：

1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂溶于纯水，制得水相；将乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷和丙酮的混合液，制得有机相；

2)将步骤1)中的所述水相加入所述有机相中，超声成初乳，然后在冰浴搅拌下滴加所述初乳到聚乙烯醇溶液中，形成复乳；

3)25℃下搅拌步骤2)的所述复乳使有机溶剂挥发、离心并用纯水洗涤，吹干即得。

本发明中，前述步骤1)中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂与所述PLGA的质量比可以为本领域常规的质量比，较佳地为1.25∶100。所述水相与所述有机相的体积比可以为本领域常规的体积比，较佳地为1∶40。所述水相中所述含一氧化碳的血红蛋白的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为50mg/mL。所述有机相中所述PLGA的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为100mg/mL。步骤2)中，所述超声可以为本领域常规的超声操作。所述超声的功率较佳地为600w，所述超声的模式较佳地为超声10s，停顿5s，重复5次。所述搅拌的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为1000rpm。所述滴加的速度可以为本领域常规的速度，较佳地为2mL/min。所述聚乙烯醇溶液的浓度为较佳地为3％，所述百分比为质量体积百分比。步骤3)中，所述搅拌的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为1000rpm。所述离心的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为2000rpm。所述吹干可以为本领域常规的吹干方法，较佳地为使用吹氮仪吹干。

此处在一优选的实施方案中，所述微球包含所述含一氧化碳的血红蛋白、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与聚乙烯醇，所述含一氧化碳的血红蛋白与所述PLGA的质量比为1.25∶100。

此处在一进一步优选的实施方案中，所述微球通过包括以下步骤的复乳溶剂挥发法制得：1)将前述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂溶于纯水，制得水相；将PLGA溶于二氯甲烷和丙酮的混合液，制得有机相；所述水相中含一氧化碳的血红蛋白的浓度为50mg/mL，所述有机相中PLGA的浓度为100mg/mL，所述水相与所述有机相的体积比为1∶40，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂与所述PLGA的质量比为1.25∶100；2)将步骤1)中的所述水相加入所述有机相中，超声成初乳，超声功率为600w，超声时间为超声10s，停顿5s，重复5次，然后在冰浴1000rpm搅拌下以2mL/min的速度滴加所述初乳到3％聚乙烯醇溶液中，形成复乳，所述百分比为质量体积百分比；3)25℃1000rpm搅拌步骤3)的所述复乳使有机溶剂挥发，2000rpm离心并用纯水洗涤3次，使用吹氮仪吹干即得。

本发明技术方案之二：如前所述含一氧化碳血红蛋白制剂的制备方法，其包括以下步骤：将一氧化碳通入含有血红蛋白的溶液，使一氧化碳饱和度为20％-100％，所述百分比为所述含有血红蛋白的溶液中结合有一氧化碳的血红蛋白的数量占血红蛋白总数的百分比。

本发明中，将所述一氧化碳通入含有血红蛋白的溶液，为本领域常规的操作，具体同前面技术方案之一所述，这里不再重复。

本发明中，所述一氧化碳的来源可以为本领域常规来源的一氧化碳，如实验室自己制得或通过购买获得，较佳地为将甲酸与浓硫酸进行反应或将炭不完全燃烧制得。更佳地为炭不完全燃烧制得。

本发明中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的形式可以为本领域常规的口服制剂形式，较佳地为粉剂、溶液、颗粒剂、胶囊、片剂、脂质体、纳米粒或微球。所述胶囊为本领域常规的胶囊，较佳地为普通胶囊、肠溶胶囊或结肠溶胶囊。所述片剂为本领域常规的片剂，较佳地为普通片剂或肠溶包衣片剂。具体制备方法同前面技术方案之一所述，这里不再重复。

本发明技术方案之三：前述含一氧化碳的血红蛋白制剂在制备抗炎症药物中的应用。

本发明中，所述炎症是常规的，包括多种疾病所引起的炎症，如脓毒症、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎、器官移植免疫反应、缺血性再灌注损伤和类风湿性关节炎。另由于哮喘、成人呼吸窘迫综合征、间质性肺纤维化、肺栓塞、慢性梗阻性肺病、原发性肺动脉高血压、慢性肺气肿、充血性心力衰竭、周围性血管疾病、中风、心脏病发作、肾小球肾炎、涉及肾发炎的病症、泌尿生殖道感染、病毒性和中毒性肝炎、肝硬化、肠梗阻、坏死性小肠结肠炎、特异性和非特异性肠炎、阿尔茨海默氏病、帕金森病、脓毒性休克和过敏性休克也伴随有炎症反应，且细胞因子如IL-6、TNFα与脓毒症、溃疡性结肠炎和类风湿性关节炎表现一致，由此推测含一氧化碳的血红蛋白制剂对以上疾病也有一定作用。

其中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂对溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、器官移植免疫反应和器官保护疗效确切。

另外可用本发明的方法治疗以下炎症疾病：呼吸道疾病、肝疾病、肾疾病、胃肠道疾病等。

呼吸道疾病

呼吸道疾病如哮喘、自发性肺病、间质性肺病、支气管炎、肺损伤、任何类型的肺癌、原发性肺动脉高血压、继发性肺动脉高血压等等。本发明的方法可以有效的控制以上的呼吸道疾病。

肝疾病

肝疾病不仅仅限于肝炎、肝硬化和感染疾病。肝炎的诱因包括感染，如特异性肝炎病毒感染，或者肝毒剂，如肝毒性药物(甲基多巴、异烟肼等)。

肾疾病

肾疾病常见的有慢性肾小球肾炎、肾盂肾炎、肾病综合征、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、肾结石、肾囊肿(多囊肾)、糖尿病肾病、高血压肾病。紫癜性肾炎、狼疮性肾炎、小儿肾病。肾疾病的常见症状有水肿、高血压、尿少或无尿、多尿、尿频、血尿、尿中泡沫增多、腰酸痛及其他一些全身性症状。本发明方法能有效减轻肾疾病的症状并缓解炎症反应。

本发明中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂可以通过本领域常规的方式施用，较佳地通过口服给药方式施用。

本发明技术方案之四：一种抗炎症药物，其含有前述含一氧化碳的血红蛋白制剂和药学上可接受的载体。

其中，所述药学上可接受的载体可以为本领域常规的载体，较佳地为选自0.9％NaCl溶液、5％葡萄糖和水中的一种，更佳地为生理0.9％NaCl溶液，所述百分比为质量体积百分比。

本发明中，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂可以通过本领域常规的方式施用，较佳地通过口服给药方式施用。

本发明技术方案之五：一种药物包装，其包含前述含一氧化碳的血红蛋白制剂及所述含一氧化碳的血红蛋白制剂施用的说明书。

本发明技术方案之六：所述含一氧化碳的血红蛋白制剂在抗炎反应症中的应用。

本发明中，所述炎症是常规的，包括多种疾病所引起的炎症，如脓毒症、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎、器官移植免疫反应、缺血性再灌注损伤和类风湿性关节炎。具体同前面技术方案之三所述，这里不再重复。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的含一氧化碳的血红蛋白制剂能够早期控制住脓毒症、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎、器官移植免疫反应、缺血性再灌注损伤和类风湿性关节炎等多种炎症反应，具有优异的抗炎症效果，并且有效地降低了现有同类药物副作用，增强了药物接收对象的耐受性。另外本发明提供的口服制剂通过口服的方式给药，方便、刺激性低，具有较高的安全性。

附图说明

图1为制备实施例8中含一氧化碳的血红蛋白制剂的微球显微镜成像图。

图2为制备实施例6中含一氧化碳的血红蛋白制剂的脂质体的粒径分布图。

图3为制备实施例7中含一氧化碳的血红蛋白制剂的纳米粒的粒径分布图。

图4为应用实施例1中各组小鼠生存曲线图。

图5为应用实施例2中各组小鼠IL-6检测图。

图6为应用实施例2中各组小鼠TNF-α检测图。

图7为应用实施例3中各组小鼠组织石蜡切片、HE染色图。

图8为应用实施例4中LPS型脓毒症各组小鼠生存曲线图。

图9为应用实施例5中LPS型脓毒症各组小鼠IL-6检测图。

图10为应用实施例5中LPS型脓毒症各组小鼠TNF-α检测图。

图11为应用实施例6中各组小鼠体重变化平均值图。

图12为应用实施例7中各组大鼠平均后足容积图。

图13为应用实施例7中各组大鼠TNF-α检测图。

图14为应用实施例8中各组小鼠存活时间图。

图15为应用实施例9中各组大鼠血清C反应蛋白(CRP)含量图。

图16为应用实施例9中各组大鼠氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)含量。

图17为应用实施例10中各组大鼠左心室舒张末期压力(LVEDP)变化图。

图18为应用实施例10中各组大鼠左心室发展压(LVDP)变化图。

图19为应用实施例11中各组小鼠体重变化图。

图20为应用实施例11中各组小鼠疾病活动指数图。

图21为应用实施例11中小鼠结肠切片图。其中图21A为模型组，图21B为COHb高剂量组。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中的MedLad生物信号采集处理系统由第三军医大学附属医院大坪医院提供。

本发明中的昆明小鼠、Balb/c小鼠和SD大鼠购自重庆市中药研究院；TNF-α检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；IL-6检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；脂多糖购自Sigma公司。小鼠和大鼠的饲养按照西南大学药学院中医药学院实验动物动物伦理委员学会原则进行。

本发明中所用到的一氧化碳通过以下反应制备：

(1)甲酸在浓硫酸的催化、脱水下分解而制得一氧化碳，反应方程式是或者，

(2)炭不完全燃烧，收集气体CO和CO₂的混合物；

但本领域人员应当理解，包括通过商业购买在内的任何其他来源的一氧化碳均可用于本发明。

制备实施例1制备含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂

将一氧化碳抽入注射器，将注射器连接导管后通过导管直接将所述一氧化碳通入所述含有血红蛋白的水溶液，使所述血红蛋白的一氧化碳饱和度达到100％，-80℃冷冻24h后放进冷冻干燥机中，冻干24h即得含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂。

制备实施例2制备含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液剂

将制备实施例1制得的含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的粉剂溶5％葡萄糖溶液，使含一氧化碳的血红蛋白制剂的浓度为2.94mmol/L，所述mmol/L为每升所述溶液中血红蛋白的微摩尔数，即得含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液，所述百分比为质量体积百分比，单位为g/mL。

制备实施例3制备含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的颗粒剂

1)将制备实施例1所制得的含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的粉剂和羧甲基纤维素钠分别过40目筛后按5∶95的质量比混合，加入蒸馏水混合均匀，制得软材，所述蒸馏水与所述含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的粉剂和所述羧甲基纤维素钠的总质量的质量比为5∶95；

2)将步骤1)所制得的软材过20目标准筛后均匀摊开在平面皿，真空37℃干燥至恒重即得含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的颗粒剂。

制备实施例4制备含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的胶囊

1)将制备实施例1所制得的含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的粉剂和羧甲基纤维素钠分别过40目筛后按5∶95的质量比混合，加入蒸馏水混合均匀，制得软材，所述蒸馏水与所述含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的粉剂和所述羧甲基纤维素钠的总质量的质量比为5∶95；

2)将步骤1)所制得的软材过20目标准筛后均匀摊开在平面皿，真空37℃干燥至恒重即含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的颗粒剂；

3)将步骤2)所制得的颗粒剂分装到药级明胶制得的胶囊壳中，即得含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的胶囊。

制备实施例5制备含一氧化碳的兔血红蛋白制剂的片剂

1)将前述含一氧化碳的兔血红蛋白制剂的粉剂、淀粉和羧甲基纤维素钠分别过20目筛；

2)将步骤1)中所述含一氧化碳的兔血红蛋白制剂的粉剂、所述淀粉和所述羧甲基纤维素钠按5∶90∶5的质量比混合，用淀粉浆作交联剂制成湿粒；

3)将步骤2)中湿粒37℃干燥后过16目筛整粒，最后压片即得。

制备实施例6制备含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂的脂质体

1)将质量比为1∶15∶40的制备实施例1制得的含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂的粉剂和所述蛋黄卵磷脂分别溶于甲醇，终浓度分别为1mg/mL与15mg/mL，另加膜材料DSPE-PEG-2000至终浓度为0.64mg/mL，其中含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂的粉剂、蛋黄卵磷脂与膜材料DSPE-PEG-2000的质量比为1∶15∶0.64，DSPE-PEG-2000即为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000，混合，得混合液1；

2)将步骤1)所得混合液1在37℃旋蒸成膜后真空干燥12h，加入1mL PBS水化2h后630w超声，超声10s停顿5s，循环10次即得含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂的脂质体。

将制得的脂质体取1mL加入粒径池里，利用马尔文粒度仪测粒径。图2显示含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂的脂质体的平均粒径为64nm。

制备实施例7制备含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂的纳米粒

1)将1mg制备实施例1制得的含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂的粉剂溶于0.1mL的0.2mol/L碳酸钠-0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液，伴随着1500rpm搅拌以1mL/min的速度匀速滴加0.6mL乙醇溶液，得混合体系A；

2)向步骤1)制得的所述混合体系A中加入戊二醛溶液至终浓度为1.69μmol/L，25℃固化12h，减压浓缩去除乙醇，即得含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂的纳米粒。

称取1mg所制备的含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂的纳米粒溶于1ml纯水中，均匀分散后加入粒径池里并用马尔文粒度仪检测粒径。结果如图3所示，含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂的纳米粒的平均粒径为43nm。

制备实施例8制备含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球

1)将制备实施例1制得的含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的粉剂溶于纯水，制得水相；将PLGA溶于二氯甲烷和丙酮的混合液，制得有机相；所述水相中含一氧化碳的牛血红蛋白的浓度为50mg/mL，所述有机相中PLGA的浓度为100mg/mL，所述水相与所述有机相的体积比为1∶40，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂与所述PLGA的质量比为1.25∶100；

2)将步骤1)中的所述水相加入所述有机相中，超声成初乳，超声功率为600w，超声时间为超声10s，停顿5s，重复5次，然后在冰浴1000rpm搅拌下以2mL/min的速度滴加所述初乳到质量体积百分比为3％聚乙烯醇水溶液中，形成复乳；

3)25℃1000rpm搅拌步骤3)的所述复乳使有机溶剂挥发，2000rpm离心并用纯水洗涤3次，使用吹氮仪吹干即得含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球。

称取1mg制得的微球溶于纯水中1ml中，移液枪吸取滴一滴在干净的载玻片上，盖上盖玻片，4倍显微镜下观察。结果如图1所示，含一氧化碳的血红蛋白制剂的微球平均粒径为80μm，微球大小较均一，表面光滑圆整。

制备实施例9制备含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂

将一氧化碳抽入注射器，将注射器连接导管后通过导管直接将所述一氧化碳通入所述含有血红蛋白的水溶液，使所述血红蛋白的一氧化碳饱和度达到20％，-80℃冷冻24h后放进冷冻干燥机中，冻干24h即得含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂。

制备实施例10制备含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂

将一氧化碳抽入注射器，将注射器连接导管后通过导管直接将所述一氧化碳通入所述含有血红蛋白的水溶液，使所述血红蛋白的一氧化碳饱和度达到60％，-80℃冷冻24h后放进冷冻干燥机中，冻干24h即得含一氧化碳的血红蛋白制剂的冻干粉剂。

制备实施例11制备含一氧化碳的血红蛋白制剂的溶液剂

将制备实施例10制得的含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂溶于0.9％NaCl溶液，使含一氧化碳的血红蛋白制剂的浓度为2.94mmol/L，所述mmol/L为每升所述溶液中血红蛋白的微摩尔数，即得含一氧化碳的血红蛋白制剂的溶液。

应用实施例1

本应用实施例中采用制备实施例2中制得的含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液。

取雌性昆明小鼠，5-7周龄，体重20±2克，随机分为2组，含一氧化碳的血红蛋白制剂组(n＝9)和生理盐水组(n＝9)。采用盲肠结扎穿孔制造脓毒症模型。给药按以下剂量进行：含一氧化碳的血红蛋白制剂以含一氧化碳的猪血红蛋白质量为50mg/kgbw口服给药。造模后立即给药，每天给药1次，连续给药4天，观察各组小鼠的存活率并统计。

结果如图4所示，含一氧化碳的血红蛋白制剂组的存活率在100小时内明显高于生理盐水组。

应用实施例2

本应用实施例中采用制备实施例1中制得的含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的粉剂。

取5-7周龄雌性昆明小鼠，体重20±2克，随机分为2组：含一氧化碳的血红蛋白制剂的粉剂组(n＝9)和生理盐水组(n＝9)。腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，采用盲肠结扎穿孔制造脓毒症模型，造模后立即给药，给药按以下剂量进行：含一氧化碳的血红蛋白制剂以含一氧化碳的猪血红蛋白质量为50mg/kgbw口服给药。给药后24h麻醉处死各组小鼠，等体积从每只小鼠取血，等重量取每只小鼠的肺、肝组织，匀浆后用白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒检测其O.D值。其中，IL-6浓度与O.D成负相关；TNF-α浓度与O.D成正相关。

结果如图5和图6所示，含一氧化碳的血红蛋白制剂组的血、肺、肝组织中的IL-6的O.D值明显高于生理盐水组，而TNFα值明显低于生理盐水组，说明含一氧化碳的血红蛋白制剂能明显降低血液及组织中的IL-6和TNFα水平，即有效的控制了脓毒症炎症反应。

应用实施例3

本应用实施例中采用制备实施例3中制得的含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的颗粒剂。

取5-7周龄雌性昆明小鼠，体重20±2克，随机分为2组：含一氧化碳的血红蛋白制剂的颗粒剂组(n＝9)和生理盐水组(n＝9)。腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，采用盲肠结扎穿孔制造脓毒症模型，造模后立即给药，给药按以下剂量进行：含一氧化碳的牛血红蛋白制剂以含一氧化碳的血红蛋白质量为50mg/kgbw口服给药。每天给药一次，连续给药3天后处死各组小鼠，取肺、肝、肾组织石蜡切片，HE染色后观察组织病理学特征。

结果如图7所示，在200倍视野下对两组切片进行观察比较，可见两组切片都有不同程度病变，但生理盐水组明显比含一氧化碳的血红蛋白制剂的颗粒剂组严重，说明含一氧化碳的血红蛋白制剂的颗粒剂能有效的控制脓毒症引起的炎症反应。

应用实施例4

本应用实施例中采用制备实施例5中制得的含一氧化碳的兔血红蛋白制剂的片剂。

取5-7周龄雌性昆明小鼠，体重20±2克，随机分为2组：含一氧化碳的血红蛋白制剂的片剂组(n＝9)和生理盐水组(n＝9)。腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，采用腹腔注射脂多糖(LPS)制造脓毒症模型，造模后立即给药，给药按以下剂量进行：含一氧化碳的血红蛋白制剂以含一氧化碳的兔血红蛋白质量为50mg/kgbw口服给药。造模后立即给药，每天给药1次，连续给药4天，观察各组小鼠的存活率并统计。

结果如图8所示，含一氧化碳的血红蛋白制剂的片剂组在100小时以内存活率明显高于生理盐水组。

应用实施例5

本应用实施例中采用制备实施例4中制得的含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的胶囊。

取5-7周龄雌性昆明小鼠，体重20±2克，随机分为2组：含一氧化碳的血红蛋白制剂的胶囊组(n＝9)和生理盐水组(n＝9)。腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，采用腹腔注射脂多糖(LPS)制造脓毒症模型，造模后立即给药，给药按以下剂量进行：含一氧化碳的牛血红蛋白制剂以含一氧化碳的牛血红蛋白质量为50mg/kgbw口服给药。给药后24h麻醉处死各组小鼠，等体积从每只小鼠取血，等重量取每只小鼠的肺、肝组织，匀浆后用白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子a(TNF-α)试剂盒检测其O.D值。其中，IL-6浓度与O.D成负相关；TNF-α浓度与O.D成正相关。

结果如图9和图10所示，含一氧化碳的血红蛋白制剂的胶囊-组的血、肺、肝组织中的IL-6的O.D值明显高于生理盐水组，而TNFα值明显低于生理盐水组，说明含一氧化碳的血红蛋白制剂的胶囊能明显降低由脂多糖引起的脓毒症小鼠血液及组织中的IL-6和TNFα水平，即有效的控制了脓毒症炎症反应。

应用实施例6

本应用实施例中采用制备实施例6中制得的含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂的脂质体。

取6-8周龄雄性Balb/c小鼠18只，随机平均分为两组，采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎(UC)，实验组给予含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂的脂质体，对照组给予生理盐水。给药方式：实验组(n＝9)含一氧化碳的鸡血红蛋白制剂以含一氧化碳的血红蛋白质量为100mg/kgbw口服给药；对照组给药的方式和剂量与实验组相同。造模后立即给药，每天一次，连续一周。记录小鼠的体重并求得平均值。

结果如图11所示，给予含一氧化碳的血红蛋白制剂的脂质体的实验组在两周之内体重下降的绝对值明显低于给予生理盐水的对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。

应用实施例7

本应用实施例中采用制备实施例7中制得的含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂的纳米粒。

取健康雄性SD大鼠18只，体重180-220g，随机分为2组，取400μg牛Ⅱ型胶原(CⅡ)与不完全弗氏佐剂(IFA)制成混合乳剂，于SD大鼠背部及尾根部多点皮内注射诱导类风湿性关节炎(RA)动物模型，即胶原性关节炎(CIA)模型。造模后两周开始给药，实验组(n＝9)给予含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂的纳米粒，对照组(n＝9)给予生理盐水，含一氧化碳的鸭血红蛋白制剂以含一氧化碳的鸭血红蛋白质量为20mg/kgbw口服给药。计算各组大鼠平均后足容积，7周后取各组大鼠的血清按试剂盒说明检测TNF-a水平。

结果如图12和图13所示，实验组大鼠7周之内的平均后足容积增加明显较对照组大鼠缓慢，且增加的绝对值明显小于对照组。7周后，实验组大鼠血清中的TNF-浓度明显低于对照组。且上述差异均有统计学意义(P<0.05)。

应用实施例8

本应用实施例中采用制备实施例2中制得的含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液。

取8-12周龄雌性小鼠，体重20-25g，以C57BL/6J小鼠为供鼠，Balb/c小鼠为受鼠，各27只，随机分为3组，分别为含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液组(n＝9)、CORM-2组(n＝9)和生理盐水组(n＝9)，CORM-2为溶于生理盐水的浓度为10mg/kg生理盐水的溶液剂，构建生命支持型小鼠肾移植模型，该模型中受鼠双原肾在肾移植前后分别被摘除。

供肾切取及保存：供鼠经腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，取腹部大十字切口，分离左肾血管及输尿管，于4℃下用肝素化的林格液原位灌注肾脏至灰白色，再分别灌注含一氧化碳的血红蛋白制剂的溶液、CORM-2溶液和生理盐水1mL；然后，连带腹主动脉瓣、肾静脉及输尿管(近膀胱处离断)切取左肾，再分别置入含一氧化碳的血红蛋白制剂的溶液、CORM-2溶液和生理盐水中于4℃下保存24h。

受鼠手术：受鼠麻醉后，取腹部正中切口，移除右肾，游离腹主动脉和下腔静脉，钳夹后切开腹主动脉和下腔静脉，将供肾连带的腹主动脉瓣与受鼠腹主动脉行端侧吻合，供肾静脉与受鼠下腔静脉行端侧吻合，开放动脉夹恢复血液供应，行输尿管膀胱吻合术，关腹。移植后第4天行二次手术，观察移植肾情况，并移除受鼠左肾。各组受鼠术后均不给予任何免疫抑制剂。

以二次手术后即肾移植后第4天切除受鼠左肾后为术后起始时间，分别取3组各9只小鼠，观察和记录存活时间。

结果如图14所示，含一氧化碳的血红蛋白制剂组和CORM-2组小鼠的存活时间都明显高于生理盐水组，且含一氧化碳的血红蛋白制剂组小鼠的存活时间较CORM-2组长。

应用实施例9

本应用实施例中采用制备实施例8中制得的含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球。

取体重180-220g的雄性6周龄SD大鼠9只，随机分为正常组、生理盐水组和含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球组，每组各3只，生理盐水组和含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球组采用丝线结扎同时局部注射内毒素法建立牙周炎模型。生理盐水组和生理盐水组和含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球组从结扎当天起分别口服生理盐水和含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球，连续服用4周。分别于结扎后第1天、第3天、第7天、第14天及第28天经大鼠颈动脉采血，ELISA方法检测血清中血清C反应蛋白(CRP)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的含量。

结果如图15和图16所示，含一氧化碳的牛血红蛋白制剂的微球组大鼠血清中的血清C反应蛋白(CRP)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)明显低于生理盐水组，且含一氧化碳的血红蛋白制剂的微球组大鼠血清中CRP三天后趋于正常组，ox-LDL两周后也趋于正常组。说明含一氧化碳的血红蛋白制剂的微球能够明显下调牙周炎大鼠血清中动脉粥样硬化相关指标。

应用实施例10

本应用实施例中采用制备实施例2中制得的含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液。

离体心脏灌流和缺血复灌(I/R)模型的建立：取6-8周龄雄性SD大鼠，体重200-250g，称重后按20ml/kg腹腔注射10％(w/w)的水合氯醛麻醉，然后开胸，取出心脏后迅速转移并固定于Langendorff灌流装置上，用改良Krebs-Henseleit(KH)液进行常规逆行恒压灌注(76mmHg)。KH液成分为：NaCl 118.0mmol/L、KCl 4.7mmol/L、KH₂PO₄ 1.2mmol/L、MgSO₄1.2mmol/L、NaHCO₃ 25.0mmol/L、葡萄糖10.0mmol/L、CaCl₂ 1.25mmol/L、pH7.4。在灌注期间温度保持恒温37℃，灌注液用纯氧饱和。切开左心耳，将连有压力传感器的球囊送入左心室，压力传感器与MedLad生物信号采集处理系统连接。待离体鼠心收缩逐渐稳定后，往心室球囊内缓慢注入适量生理盐水，使左心室舒张末期压维持在4-8mmHg。平衡灌注20min时测定冠脉血流动力学指标，作为基础值。

分为2组，对照组(n＝3)：将心脏固定于Langendorff灌流装置上后稳定灌注30min，用手术针牵引0号结扎线透过心肌穿过冠脉前降支，然后将此游离了前降支的结扎线穿过1mm的塑料小管系紧，从而使小管一端紧扣前降支，造成心肌局部缺血，缺血30min后松开小管造成复灌时立即换用溶剂为KH液的0.0375％(w/w)DMSO的溶液复灌10min，然后换用KH液复灌110min。实验组(n＝3)：将心脏固定于Langendorff灌流装置上后稳定灌注30min，用手术针牵引0号结扎线透过心肌穿过冠脉前降支，然后将此游离了前降支的结扎线穿过1mm的塑料小管系紧，从而使小管一端紧扣前降支，造成心肌局部缺血，缺血30min后松开小管造成复灌时立即换用溶剂为KH液的血红蛋白浓度为37.5μmol/L的含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液复灌10min，然后换用KH液复灌110min。

通过MedLad生物信号采集处理系统获得的数据观察复灌过程中左心室舒张末期压力(LVEDP)和左心室发展压(LVDP)。

结果如图17和图18所示，实验组复灌过程中左心室舒张末期压力(LVEDP)明显低于对照组，左心室发展压(LVDP)明显高于对照组。说明含一氧化碳的血红蛋白制剂的溶液能够有效减轻心脏的缺血复灌损伤。

应用实施例11

本应用实施例中采用制备实施例2中制得的含一氧化碳的猪血红蛋白制剂的溶液。

取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠50只，随机平均分为5组，空白对照组(n＝10)、实验模型组、对照药物组、COHb不同剂量组采用浓度为2.5％-5％的葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎(UC)。给药方式：COHb实验组分别灌胃给予500mg/kg、1000mg/kgCOHb，对照组灌胃给予75mg/kg 5-氨基水杨酸(5-ASA)。造模后第8天给药，每天一次，连续一周。记录小鼠的体重及便血情况。各组小鼠治疗一周后，解剖取出结肠，HE染色观察。

小鼠体重变化结果如图19所示，COHb组小鼠相较于模型组治疗效果明显，低剂量组治疗效果与对照药物5-ASA组相当，且高剂量组治疗效果明显优于5-ASA组，差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠疾病活动指数(DAI)如图20，每组小鼠给予DSS后，DAI在第8天达到最大值，药物治疗组给予药物后疾病活动指数均有降低，COHb低剂量组与5-ASA组治疗效果相差不大，高剂量组较5-ASA组效果明显。且差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠结肠切片图如图21。由图21可见，A图中肠组织全部粘膜层坏死，隐窝结构消失伴大量炎性细胞浸润(淋巴细胞，单核细胞，粒细胞)粘膜下层炎性细胞轻度浸润(淋巴细胞，中性粒细胞)；B图中肠组织局部区域粘膜上皮细胞坏死，腺体及隐窝结构消失，粘膜层可见少量炎性细胞(淋巴细胞)浸润，粘膜下层水肿伴少量炎性细胞浸润，可明显看出COHb高剂量组有显著结肠炎治疗效果。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种含一氧化碳的血红蛋白制剂，其特征在于，其包括含一氧化碳的血红蛋白，所述血红蛋白的一氧化碳饱和度为20％-100％，所述百分比为所述血红蛋白制剂中结合有一氧化碳的血红蛋白的数量占血红蛋白总数的百分比。

2.如权利要求1所述含一氧化碳的血红蛋白制剂，其特征在于，所述一氧化碳的饱和度为60％-100％；和/或，所述一氧化碳的来源为将甲酸与浓硫酸进行反应制得，或者，为将炭不完全燃烧制得；和/或，所述血红蛋白为从哺乳动物采取的新鲜血液中提取的血红蛋白或购买的血红蛋白。

3.如权利要求1所述含一氧化碳的血红蛋白制剂，其特征在于，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂还包括药用载体，所述药用载体较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂、稳定剂、增稠剂和/或乳化剂。

4.如权利要求1所述含一氧化碳的血红蛋白制剂，其特征在于，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂的形式为粉剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊、片剂、脂质体、纳米粒或微球，较佳地为冻干粉剂、肠溶胶囊、结肠溶胶囊或肠溶包衣片。

5.如权利要求4所述含一氧化碳的血红蛋白制剂，其特征在于，所述粉剂为一氧化碳饱和度为20％-100％的血红蛋白的粉末；和/或，所述溶液剂为含有如权利要求1或2所述含一氧化碳的血红蛋白的溶液；和/或，所述颗粒剂含有如权利要求1或2所述含一氧化碳的血红蛋白和药用辅料；和/或，所述胶囊包括所述颗粒剂和胶囊壳，所述颗粒剂在所述胶囊壳内；和/或，所述片剂含有如权利要求1或2所述含一氧化碳的血红蛋白、淀粉和羧甲基纤维素钠；和/或，所述脂质体含有如权利要求1或2所述含一氧化碳的血红蛋白、磷脂和膜材料；和/或，所述纳米粒含有如权利要求1或2所述含一氧化碳的血红蛋白和戊二醛；和/或，所述微球包含如权利要求1或2所述含一氧化碳的血红蛋白、乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙烯醇。

6.如权利要求5所述含一氧化碳的血红蛋白制剂，其特征在于，所述药用辅料为羧甲基纤维素钠；和/或，所述胶囊壳为药级明胶制得的胶囊壳；和/或，所述磷脂为蛋黄卵磷脂；和/或，所述膜材料为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000。

7.如权利要求1-6任一项所述含一氧化碳的血红蛋白制剂，其特征在于，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂为含一氧化碳的血红蛋白口服制剂。

8.一种如权利要求1-7任一项所述含一氧化碳血红蛋白制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将一氧化碳通入含有血红蛋白的溶液，使一氧化碳饱和度为20％-100％，所述百分比为所述含有血红蛋白的溶液中结合有一氧化碳的血红蛋白的数量占血红蛋白总数的百分比。

9.如权利要求1-7任一项所述含一氧化碳的血红蛋白制剂在制备抗炎症药物中的应用。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述炎症为脓毒症、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎、器官移植免疫反应、缺血性再灌注损伤或类风湿性关节炎。

11.一种抗炎症药物组合，其特征在于，其含有如权利要求1-7任一项所述含一氧化碳的血红蛋白制剂和药学上可接受的载体。

12.如权利要求11所述的抗炎症药物组合，其特征在于，所述药学上可接受的载体为选自0.9％NaCl溶液、5％葡萄糖和纯水中的一种，所述百分比为溶质的质量占溶液体积的质量体积百分比；和/或，所述含一氧化碳的血红蛋白制剂通过口服给药方式施用。

13.一种药物包装，其特征在于，其包含如权利要求1-7中任一项所述含一氧化碳的血红蛋白制剂和所述含一氧化碳的血红蛋白制剂施用的说明书。