ES2643462T3 - Composiciones de hemoglobina - Google Patents

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Description

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básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido de origen natural.
"Péptido" y "polipéptido" se refieren a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y se unen entre sí a través de enlaces amida, denominados alternativamente polipéptido. Adicionalmente, se incluyen también aminoácidos no naturales, por ejemplo, β-alanina, fenilglicina y homoarginina. Los aminoácidos que no están codificados por el gen también se pueden usar en la presente invención. Además, también se pueden usar en la invención aminoácidos que han sido modificados para incluir grupos reactivos, sitios de glicosilación, polímeros, unidades estructurales terapéuticas, biomoléculas y similares. Todos los aminoácidos usados en la presente invención pueden ser ya sea el isómero D o L. El isómero L es generalmente preferido. Además, otros peptidomiméticos también son útiles en la presente invención. Como se usa en este documento, “péptido” se refiere tanto a péptidos glicosilados como no glicosilados. También se incluyen péptidos que están incompletamente glicosilados por un sistema que expresa el péptido. Para una revisión general, véase, Spatola, A. F., in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983). Un péptido de ejemplo es la hemoglobina.
El término “conjugado de péptido”, y “conjugado de hemoglobina” se refiere a especies de la invención en las que un polipéptido de hemoglobina se conjuga con un polímero soluble en agua, por ejemplo, poli(etilenglicol) (PEG), como se expone en este documento.
"Hemoglobina", como se usa en este documento, se refiere a un polipéptido activo, que se une a oxígeno (o unión a CO) que no está reticulado químicamente mediante tratamiento con agentes químicos de reticulación, por ejemplo, dialdehídos, etc. Una hemoglobina de ejemplo es la proteína nativa sin otras modificaciones que la conjugación de uno
o más de PEG (por ejemplo, m-PEG). Como se usa en este documento, "sustancialmente libre de agentes químicos de reticulación", se refiere a moléculas de hemoglobina que no están reticuladas a propósito con agentes químicos de reticulación. Estas preparaciones de hemoglobina incluyen menos del 5%, menos del 3% o menos del 1% de hemoglobina reticulada.
El término "soluble en agua" se refiere a unidades estructurales que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de polímeros solubles en agua incluyen péptidos, sacáridos, poli(éteres), poli(aminas), poli(ácidos carboxílicos) y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas de estar compuestos de un único aminoácido, por ejemplo, poli(lisina). Un polisacárido de ejemplo es poli(ácido siálico). Un poli(éter) de ejemplo es poli(etilenglicol). La poli(etilenimina) es una poliamina de ejemplo y el ácido poli(acrílico) es un poli(ácido carboxílico) representativo. El término "soluble en agua" como en un "polímero soluble en agua" es un polímero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Por lo general, una solución de un polímero soluble en agua transmitirá al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de luz, transmitida por la misma solución después de filtrar. Sobre una base de peso, un polímero o segmento soluble en agua del mismo será preferiblemente al menos aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, más preferiblemente al menos aproximadamente 50% (en peso) soluble en agua, aún más preferiblemente aproximadamente 70% (en peso) soluble en agua, y aún más preferiblemente aproximadamente 85% (en peso) soluble en agua. Sin embargo, es muy preferido que el polímero o segmento soluble en agua sea aproximadamente 95% (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua.
Como se usa en este documento, el término "polímero soluble en agua" incluye aquellos polímeros solubles en agua que son biocompatibles y no inmunogénicos y excluyen específicamente cualquier segmento polimérico soluble en agua que no sea biocompatible ni inmunogénico. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si los efectos beneficiosos asociados con el uso de la sustancia sola o con otra sustancia (por ejemplo, agente activo) en relación con tejidos vivos (por ejemplo, administración a un paciente) compensan cualquier efecto perjudicial evaluado por un médico, por ejemplo, un médico. Con respecto a la no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunogénica si el uso previsto de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmune indeseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmune, que dicha respuesta no se considera clínicamente significativa o importante como evaluada por un clínico. Se prefiere particularmente que los segmentos poliméricos solubles en agua descritos en este documento, así como los conjugados sean biocompatibles y no inmunogénicos.
El esqueleto polimérico del polímero soluble en agua puede ser poli(etilenglicol) (esto es, PEG). Sin embargo, se debe entender que otros polímeros relacionados son también apropiados para uso en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli(etilenglicol) se pretende que sea inclusivo y no exclusivo a este respecto. El término PEG incluye poli(etilenglicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG alcoxi, PEG difuncional, PEG multiarmado, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG colgante (esto es, PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales colgantes del esqueleto del polímero), o PEG con enlaces degradables en el mismo.
El esqueleto del polímero puede ser lineal o ramificado. Los esqueletos de polímeros ramificados son generalmente conocidas en la técnica. Por lo general, un polímero ramificado tiene una unidad estructural de núcleo de ramificación central y un grupo de cadenas de polímero lineal unido al núcleo de rama central. El PEG se usa comúnmente en
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formas ramificadas que se pueden preparar por adición de óxido de etileno a diversos polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La unidad estructural de rama central también se puede derivar de varios aminoácidos, tales como lisina. El poli(etilenglicol) ramificado se puede representar en forma general como R(-PEG-OH)m en la que R representa la unidad estructural de núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, y m representa el número de ramas. Las moléculas de PEG multiarmadas, tales como las descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 5,932,462, también se puede usar como el esqueleto del polímero.
Muchos otros polímeros también son apropiados para la invención. Los esqueletos de polímero que no son peptídicos y son solubles en agua, con desde 2 a aproximadamente 300 terminales, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros apropiados incluyen, pero no se limitan a, otros poli(alquilenglicoles), tales como poli(propilenglicol) (“PPG”), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli(-hidroxiácido), poli(alcohol vinílico), polifosfazeno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,629,384, y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos. Aunque el peso molecular de cada cadena del esqueleto del polímero puede variar, está por lo general en el intervalo desde aproximadamente 100 Da a aproximadamente 100,000 Da, a menudo desde aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da.
Aunque el peso molecular del polímero soluble en agua (así como el reactivo polimérico utilizado para formar el conjugado) puede variar, el peso molecular satisfará uno o más de los siguientes valores: mayor que 100 Dalton; mayor que 200 Dalton; mayor que 400 Dalton; mayor que 500 Dalton, mayor que 750 Dalton; mayor que 900 Dalton; mayor que 1,000 Dalton, mayor que 1,400 Dalton; mayor que 1,500 Dalton, mayor que 1,900 Dalton; mayor que 2,000 Dalton; mayor que 2,200 Dalton; mayor que 2,500 Dalton; mayor que 3,000 Dalton; mayor que 4,000 Dalton; mayor que 4,900 Dalton; mayor que 5,000 Dalton; mayor que 6,000 Dalton; mayor que 7,000 Dalton; mayor que 7,500 Dalton, mayor que 9,000 Dalton; mayor que 10.000 Dalton; mayor que 11,000 Dalton; mayor que 14,000 Dalton, mayor que 15,000 Dalton; mayor que 16,000 Dalton; mayor que 19,000 Dalton; mayor que 20.000 Dalton; mayor que 21,000 Dalton; mayor que 22,000 Dalton, mayor que 25,000 Dalton; y mayor que 30,000 Dalton. Se entiende que el límite máximo de peso molecular para cualquier segmento de polímero soluble en agua dado útil en este documento es aproximadamente 300,000 Dalton.
El peso molecular del polímero soluble en agua (así como todo el reactivo polimérico usado para formar el conjugado) también se puede expresar como un valor dentro de un intervalo de pesos moleculares. Ejemplos de intervalos incluyen: desde aproximadamente 100 Dalton a aproximadamente 100,000 Dalton; desde aproximadamente 500 Dalton a aproximadamente 80,000 Dalton; desde aproximadamente 1,000 Dalton a aproximadamente 60,000 Dalton; desde aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 50,000 Dalton; y desde aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 40,000 Dalton.
Ejemplos de pesos moleculares para cualquier polímero hidrosoluble dado (así como el reactivo polimérico completo) dentro de un reactivo polimérico incluyen aproximadamente 100 Dalton, aproximadamente 200 Dalton, aproximadamente 300 Dalton, aproximadamente 400 Dalton, aproximadamente 500 Dalton, aproximadamente 600 Dalton, aproximadamente 700 Dalton, aproximadamente 750 Dalton, aproximadamente 800 Dalton, aproximadamente 900 Dalton, aproximadamente 1,000 Dalton, aproximadamente 2,000 Dalton, aproximadamente 2,200 Dalton, aproximadamente 2,500 Dalton, aproximadamente 3,000 Dalton, aproximadamente 4,000 Dalton, aproximadamente 4,400 Dalton, aproximadamente 5,000 Dalton, aproximadamente 6,000 Dalton, aproximadamente 7,000 Dalton, aproximadamente 7,500 Dalton, aproximadamente 8,000 Dalton, aproximadamente 9,000 Dalton, aproximadamente
10.000 Dalton, aproximadamente 11,000 Dalton, aproximadamente 12,000 Dalton, aproximadamente 13,000 Dalton, aproximadamente 14,000 Dalton, aproximadamente 15,000 Dalton, aproximadamente 20.000 Dalton, aproximadamente 22,500 Dalton, aproximadamente 25,000 Dalton, aproximadamente 30,000 Dalton, aproximadamente 40,000 Dalton, aproximadamente 50,000 Dalton, aproximadamente 60,000 Dalton, aproximadamente 75,000 Dalton, y aproximadamente 80,000 Dalton.
Los expertos en el arte reconocerán que la discusión anterior relativa a polímero sustancialmente soluble en agua no es en modo alguno exhaustiva y meramente ilustrativa, y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas anteriormente. Como se usa en este documento, el término "reactivo polimérico" se refiere generalmente a una molécula entera, que puede comprender un polímero soluble en agua y un grupo funcional. El término "polímero soluble en agua" se reserva generalmente para su uso en la discusión de una porción de una estructura molecular más grande tal como un reactivo polimérico, una molécula precursora, un conjugado, y así sucesivamente.
Cada parte (por ejemplo, grupo funcional, agente activo, polímero soluble en agua, etc.) del reactivo polimérico y otras estructuras descritas en este documento se pueden unir directamente entre sí a través de un enlace covalente directo. Más por lo general, sin embargo, cada parte está unida a través de una unidad estructural espaciadora compuesta por uno o más átomos que sirven para atar cada parte conjuntamente en un todo unificado.
Las unidades estructurales espaciadoras preferidas a través de los cuales las diversas partes de los reactivos poliméricos y otras estructuras descritas en este documento incluyen una cadena de átomos formada por átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Unidos a esta cadena de átomos, pueden ser uno o más otros átomos tales
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masa preestablecida de tejido (por ejemplo, un gramo) mediante la administración de una dosis preseleccionada de una composición de la invención. La capacidad de transferir oxígeno o CO a un tejido también se puede medir funcionalmente in vivo y por comparación con sustitutos conocidos de la sangre a base de hemoglobina. En una realización de ejemplo, la hemoglobina está en "contacto" o "contacto operativo" con el tejido al que está suministrando oxígeno o monóxido de carbono. Se entiende por contacto operativo Bu la hemoglobina está lo suficientemente próxima al tejido que el oxígeno o monóxido de carbono se transfiere directamente, a través de un portador intermedio o por difusión al tejido.
Como se usa en este documento, "hemoglobina nativa" se refiere a hemoglobina que no está intencionalmente reticulada químicamente o conjugada con otra especie. La hemoglobina nativa incluye moléculas de hemoglobina en las que el átomo de hierro no está unido, está unida al oxígeno o está unida al monóxido de carbono. De acuerdo con la presente invención, la hemoglobina nativa puede formar el núcleo de hemoglobina de los conjugados de PEG-Hb de la invención.
"Desoxigenada" se refiere a la hemoglobina en la que el átomo de Fe (II) está unido a una especie distinta del oxígeno (por ejemplo, monóxido de carbono) o no está unido al oxígeno o a ninguna otra especie.
El término "aislado" se refiere a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes, que acompañan naturalmente al material, se usan para producir el material o son productos secundarios o de degradación de producir el material. Para conjugados peptídicos de la invención, el término "aislado" se refiere a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material en la mezcla utilizada para preparar el conjugado peptídico. "Aislado" y "puro" se usan indistintamente. Por lo general, los conjugados peptídicos aislados de la invención tienen un nivel de pureza expresado preferiblemente como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza para los conjugados peptídicos es aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% y el extremo superior del intervalo de pureza es aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o más de aproximadamente 90 %. Las composiciones de hemoglobina inactivadas por calor viralmente de la invención se aíslan generalmente antes de la conjugación con un polímero soluble en agua. En realizaciones de ejemplo, se aísla la hemoglobina utilizada para preparar el conjugado. En diversas realizaciones, el conjugado de hemoglobina PEG se aísla. En realizaciones de ejemplo, la hemoglobina o el conjugado de hemoglobina de PEG se aísla con la excepción de la presencia de un agente estabilizante u otros excipientes. En diversas realizaciones, el conjugado de hemoglobina de PEG o hemoglobina se aísla de otras proteínas y particularmente de proteínas seleccionadas de dímeros u oligómeros de hemoglobina y otras proteínas portadoras de oxígeno
Cuando los conjugados peptídicos son más de aproximadamente 90% puros, sus purezas también se expresan preferiblemente como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza es de aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente 96% o aproximadamente 98%. El extremo superior del intervalo de pureza es de aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente 96%, aproximadamente 98% o aproximadamente 100% de pureza. Para los propósitos de esta invención, un conjugado o solución "pura" de un conjugado puro puede incluir un agente estabilizante.
La pureza se determina mediante cualquier método de análisis reconocido en la técnica (por ejemplo, intensidad de banda en un gel teñido con plata, electroforesis en gel de poliacrilamida, HPLC, o medios similares).
El término "reactivo" o "activado" cuando se usa junto con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. Esto contrasta con los grupos que requieren fuertes catalizadores o condiciones de reacción altamente impracticables para reaccionar (esto es, un grupo "no reactivo" o "inerte").
La expresión "cada miembro de un grupo" se usa para referirse a los miembros de una subpoblación en una formulación de la invención que tiene una característica particular. De este modo, al referirse a cada miembro de un grupo de moléculas de hemoglobina en una fracción de una formulación de la invención, no implica necesariamente que cada molécula de hemoglobina en la formulación tenga la característica descrita, sino que se refiere a un grupo (subpoblación) de moléculas de hemoglobina en la formulación que tiene la característica citada.
El término "agente estabilizante" se refiere a una especie que previene o retarda la reoxigenación de la hemoglobina desoxigenada. Un agente estabilizante de ejemplo es un compuesto que contiene amina, convenientemente, aunque no exclusivamente, un aminoácido. Cualquier compuesto que contiene amina puede servir como un agente estabilizante en las formulaciones de la invención. Un agente estabilizante de ejemplo adicional tiene uno o más elementos estructurales que reaccionan con oxígeno de preferencia a la hemoglobina que reacciona con el oxígeno. Un elemento estructural de ejemplo encontrado en los agentes estabilizantes de la invención es una unidad estructural tiol. Ejemplos de compuestos sulfhidrilos de uso como agentes estabilizantes incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-L cisteína (NAC) D, L-cisteína, -glutamil-cisteína, glutatión, 2,3-dimercapto-1-propanol, 1,4-butanoditiol, y otros compuestos sulfhidrilos biológicamente compatibles. Se prefiere generalmente que el agente estabilizante sea biocompatible y no sea tóxico en las cantidades en las que está incluido en las composiciones y formulaciones de la invención. En una realización de ejemplo, el PEG es en sí mismo un reactivo estabilizante. De este modo, en diversas realizaciones, el PEG conjugado con la Hb obvia la necesidad de un agente estabilizante separado o una fracción estabilizadora soluble en agua
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separada. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona formulaciones equivalentes a las expuestas en el presente documento que incluyen una fracción estabilizadora soluble en agua, que, de hecho, no incluye esta fracción.
Como se usa en este documento, los términos tales como "sujeto", "paciente" y "mamífero" se usan indistintamente y se ejemplifican por un ser humano.
Como se usa en este documento, un "donante de óxido nítrico" o "donante de NO" se refiere a compuestos que donan, liberan y/o transmiten directa o indirectamente una especie de monóxido de nitrógeno y/o estimulan la producción endógena de óxido nítrico o factor relajante derivado del endotelio (EDRF) in vivo y/o elevan los niveles endógenos de óxido nítrico o (EDRF) in vivo y/o se oxidan para producir óxido nítrico y/o son sustratos para el óxido nítrico sintasa y/o citocromo P450. "Donante de NO" también incluye compuestos que son precursores de L-arginina, inhibidores de la enzima arginasa y mediadores de óxido nítrico.
El término "óxido nítrico" abarca el óxido nítrico (NO) cargado y las especies de monóxido de nitrógeno cargadas, preferiblemente las especies de monóxido de nitrógeno cargadas, tales como el ion nitrosonio (NO+) y el ion nitroxilo (NO-). La forma reactiva del óxido nítrico puede ser proporcionada por óxido nítrico gaseoso. Los compuestos que liberan suministran o transfieren monóxido de nitrógeno tienen la estructura F-NO, en la que F es una unidad estructural de liberación, suministro o transferencia de monóxido de nitrógeno e incluyen cualquiera y todos los compuestos que proporcionan monóxido de nitrógeno al sitio de acción deseado en una forma activa para su propósito previsto.
Los términos "aductos de NO", “precursor de NO”, y “agente liberador de NO" se usan indistintamente.
En realizaciones de ejemplo, el término "hipertónico" se refiere a una solución de Hb PEGilada que tiene desde aproximadamente 3% a aproximadamente 7% de sal.
Las realizaciones
La discusión expuesta a continuación es pertinente a las realizaciones expuestas a continuación, así como las expuestas anteriormente y en las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de las realizaciones están destinados a ser combinados de cualquier manera, y la discusión presentada en este documento es ilustrativa de combinaciones de ejemplo y no es limitativa.
La invención proporciona una composición que comprende hemoglobina nativa soluble en agua, funcional, opcionalmente desoxigenada. Las composiciones se inactivan viralmente. La composición incluye una fracción de hemoglobina soluble en agua, que comprende un grupo de moléculas de hemoglobina nativas funcionales. Cada miembro de este grupo de moléculas de hemoglobina está generalmente en un estado desoxigenado, está libre de agentes químicos de reticulación y tiene una P50 de 9 mm Hg a 14 mm Hg. Alternativamente, en diversas realizaciones, la P50 de la hemoglobina es desde aproximadamente 9 mm Hg a aproximadamente 12 mm Hg. La composición también incluye una fracción estabilizadora soluble en agua. La fracción estabilizadora ayuda a mantener el grupo de moléculas de hemoglobina en un estado desoxigenado. La fracción estabilizante incluye un agente estabilizante. Los agentes estabilizantes tienen un elemento estructural más reactivo con el oxígeno que las moléculas de hemoglobina.
También se incluye en la composición una fracción diluyente, generalmente una fracción diluyente acuosa. La fracción diluyente incluye un diluyente farmacéuticamente aceptable en el que la fracción de hemoglobina es soluble, adecuadamente la fracción estabilizadora también es soluble. La composición está esencialmente libre de actividad viral. La composición comprende menos del 5% de metahemoglobina.
El Fe (II) de la hemoglobina desoxigenada de cualquiera de las especies de la invención se puede unir a CO o puede estar esencialmente no unido a ya sea oxígeno o CO. En diversas realizaciones, el Fe (II) de las moléculas de hemoglobina desoxigenada no está unido a oxígeno ni monóxido de carbono. En diversas realizaciones, la molécula de hemoglobina es un miembro de una población de moléculas de hemoglobina. En esta realización, un ejemplo de población de moléculas de hemoglobina incluye menos del 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o menos del 1% moléculas de hemoglobina en el estado oxigenado.
La fracción estabilizante de la composición incluye un agente que previene o retarda la oxidación de la hemoglobina desoxigenada. Se puede usar cualquier agente estabilizante conveniente y efectivo. En diversas realizaciones, el agente estabilizante es uno bien tolerado en sistemas biológicos y se puede administrar con seguridad a mamíferos. Un agente estabilizante de ejemplo en la fracción estabilizante es una amina, tal como un aminoácido, o un compuesto tiol. Un agente estabilizante de ejemplo es un aminoácido que contiene tiol, un análogo de aminoácido o un mimético de aminoácido. En diversas realizaciones, el aminoácido se selecciona de aminoácidos de origen natural y de origen no natural, por ejemplo, cisteína.
La composición incluye una fracción diluyente farmacéuticamente aceptable que puede comprender una sal. La sal se puede seleccionar entre esencialmente cualquier sal, aunque las sales actualmente preferidas son sales que son farmacéuticamente aceptables para su administración a mamíferos. En diversas realizaciones, la composición incluye cloruro de sodio. Las composiciones de la invención son isotónicas, hipertónicas o hipotónicas. En diversas
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ejemplo son aquellos en los que una proporción sustancial de las moléculas de polímero en una muestra del polímero tienen aproximadamente el mismo peso molecular; tales polímeros son "homodispersos".
La presente invención se ilustra adicionalmente haciendo referencia a un conjugado de poli(etilenglicol). Existen varias revisiones y monografías sobre la funcionalización y conjugación de PEG. Véase, por ejemplo, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol.
14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); y Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002). Las rutas de preparación de moléculas reactivas de PEG y formar conjugados usando las moléculas reactivas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,672,662 describe un conjugado soluble en agua y aislable de un éster activo de un ácido polimérico seleccionado entre poli(óxidos de alquileno) lineales o ramificados, poli(polioles oxietilados), poli(alcoholes olefínicos), y poli(acrilomorfolina).
La Patente de los Estados Unidos No. 6,376,604 establece un método de preparación de un éster de 1benzotriazolilcarbonato soluble en agua de un polímero soluble en agua y no peptídico haciendo reaccionar un hidroxilo terminal del polímero con di(1-benzotriazoil)carbonato en un solvente orgánico. El éster activo se usa para formar conjugados con un agente biológicamente activo tal como una proteína o un péptido.
El documento WO 99/45964 describe un conjugado que comprende un agente biológicamente activo y un polímero soluble en agua activado que comprende un esqueleto polimérico que tiene al menos un extremo unido al esqueleto del polímero a través de un enlace estable, en el que al menos un extremo comprende una unidad estructural ramificada que tiene grupos reactivos proximales unidos a la unidad estructural ramificante, en el que el agente biológicamente activo está unido a al menos uno de los grupos reactivos proximales. En el documento WO 96/21469 se describen otros poli(etilenglicoles) ramificados, la Patente de los Estados Unidos No. 5,932,462 describe un conjugado formado con una molécula de PEG ramificada que incluye un término ramificado que incluye grupos funcionales reactivos. Los grupos reactivos libres están disponibles para reaccionar con una especie biológicamente activa, tal como una proteína o péptido, formando conjugados entre el poli(etilenglicol) y las especies biológicamente activas. La Patente de los Estados Unidos No. 5,446,090 describe un enlazante de PEG bifuncional y su uso en la formación de conjugados que tienen un péptido en cada uno de los extremos del enlazante de PEG.
Los conjugados que incluyen enlaces degradables de PEG se describen en el documento WO 99/34833; y WO 99/14259, así como en la Patente de los Estados Unidos No. 6,348,558. Tales enlaces degradables son aplicables en la presente invención.
Los métodos reconocidos en la técnica de activación de polímeros expuestos anteriormente son de uso en el contexto de la presente invención en la formación de los polímeros ramificados expuestos en este documento y también para la conjugación de estos polímeros ramificados con otras especies, por ejemplo, azúcares, nucleótidos de azúcar y similares.
La composición de la presente invención incluye un conjugado covalente entre una molécula de hemoglobina nativa funcional y al menos una molécula de poli(etilenglicol), por ejemplo, metoxi-poli(etilenglicol). El poli(etilenglicol) usado en la presente invención no está restringido a ninguna forma particular o intervalo de peso molecular. Para moléculas de poli(etilenglicol) de cadena lineal, el peso molecular está preferiblemente entre 500 y 100,000. Se usa preferiblemente un peso molecular de 2000-60,000 y preferiblemente desde aproximadamente 5,000 a aproximadamente 40,000. En una realización de ejemplo, el PEG utilizado es un metoxi-PEG, con un peso molecular promedio de aproximadamente 5,000.
En otra realización, el poli(etilenglicol) es un PEG ramificado que tiene más de una unidad estructural de PEG unida. Ejemplos de PEG ramificados se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,932,462; la Patente de los Estados Unidos No. 5,342,940; la Patente de los Estados Unidos No. 5,643,575; la Patente de los Estados Unidos No. 5,919,455; la Patente de los Estados Unidos No. 6,113,906; la Patente de los Estados Unidos No. 5,183,660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); y Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998. En una realización preferida, el peso molecular de cada poli(etilenglicol) del PEG ramificado es menor o igual a 40,000 dalton.
En diversas realizaciones, la invención proporciona un conjugado de hemoglobina que tiene una o más unidades estructurales de PEG unidas a este. La PEG-hemoglobina está en forma de CO. En una realización de ejemplo, este conjugado se formula en solución salina reguladora con fosfato.
La invención proporciona un conjugado de hemoglobina que tiene una o más unidades estructurales de PEG unidos a este. En diversas realizaciones, la PEG-hemoglobina está desoxigenada y no está en la forma de CO. En otras realizaciones, la PEG-hemoglobina está en la forma de CO. En una realización de ejemplo, este conjugado, ya sea que el PEG-Hb esté en la forma oxigenada, CO o no unida, se formula en solución salina hipertónica (sal alta). Las concentraciones de sal de ejemplo (por ejemplo, NaCl) de uso en estas formulaciones hipertónicas son desde aproximadamente 4% a aproximadamente 8%, desde aproximadamente 4.5% a aproximadamente 7.5% o desde aproximadamente 5% a aproximadamente 7%. Las formulaciones de ejemplo incluyen aproximadamente 4%,
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aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7% o aproximadamente 8% de sal. En una formulación la concentración de sal es de 7.5%. En diversas realizaciones, la sal es NaCl. En realizaciones de ejemplo, la osmolalidad de la formulación es desde aproximadamente 300-400, o desde aproximadamente 325-375, o desde aproximadamente 340-360 mOsmol. En una realización de ejemplo, la sal es NaCl.
En una realización de ejemplo, la invención proporciona un fluido de reanimación basado en PEG-Hb que tiene al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% al menos un 95% o aproximadamente un 100% de la eficacia igual al plasma fresco congelado en la corrección de la coagulopatía. Las formulaciones de ejemplo de acuerdo con esta realización incluyen además factores de coagulación, plaquetas u otras sustancias conocidas para ayudar en la mitigación de la coagulopatía.
En diversas realizaciones, la invención proporciona un fluido de reanimación de PEG-Hb que tiene un volumen de fluido total desde aproximadamente 450 mL y que tiene una capacidad de transporte de oxígeno y/o capacidad de difusión de oxígeno equivalente a una unidad de glóbulos rojos empaquetados, preferiblemente glóbulos rojos humanos.
En diversas realizaciones, la invención proporciona una formulación de PEG-Hb (por ejemplo, un fluido de reanimación) capaz de transportar CO y difundirlo en tejidos. Una formulación de ejemplo tiene un volumen de fluido total de aproximadamente 450 mL, y que tiene una capacidad de transporte de CO y/o capacidad de difusión de CO suficiente para transferir una cantidad terapéuticamente relevante de CO a un tejido.
En una realización de ejemplo, la invención proporciona un fluido de reanimación de PEG-Hb que tiene factores de coagulación presentes. En diversas realizaciones, los factores de coagulación están presentes en una cantidad no inferior al 60%, no inferior al 70%, no inferior al 80% o no inferior al 90% del plasma fresco congelado.
En una realización de ejemplo, el fluido de reanimación incluye plaquetas. Se prefiere generalmente que los fluidos de reanimación de la invención incluyendo las plaquetas tengan un recuento y actividad celular que no sea inferior al 60%, no inferior al 70%, no inferior al 80%, no inferior al 90%, o es aproximadamente igual al de una sola unidad de aféresis.
La estabilidad al almacenamiento es un objeto importante de la presente invención. En diversas realizaciones, la presente invención proporciona un fluido de reanimación de PEG-Hb que es estable a temperatura ambiente (~ 25ºC) durante al menos 4 meses, al menos seis meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses.
La presente invención también proporciona, en diversas realizaciones, un fluido de reanimación de PEG-Hb que no es más inmunogénico que los productos sanguíneos en depósito corrientes. También se proporciona un fluido de reanimación de PEG-Hb que no es más trombogénico que los productos sanguíneos en depósito corrientes.
Las formulaciones de ejemplo de acuerdo con la invención incluyen una o más de estas características en cualquier combinación: aproximadamente 4.0-4.6 % en peso de Hb, aproximadamente 1.0-5.0 % en peso de Met, aproximadamente 0.0-5.0% de HbO2, aproximadamente 95.0-100.0% de HbCO, a pH de aproximadamente 8.10-8.20, osmolalidad de aproximadamente 325-370 mOsmol, una P50 (mm Hg) de aproximadamente 10.00-14.00, y un espectro óptico con picos principales a 538 nm y 568 nm con absorbancia de aproximadamente 1.4 y 1.9, respectivamente, una proporción de picos a 568 nm/500 nm de 2.5-3.0. En otras formulaciones de ejemplo, la formulación tiene un espectro óptico con picos principales a 541 y 576 nm.
Incluso más específicamente, las formulaciones de ejemplo de la invención incluyen una o más de estas características en cualquier combinación: aproximadamente 4.5 % en peso de Hb, aproximadamente 1.1 % en peso de Met, aproximadamente 1.2% de HbO2, aproximadamente 99.4% de HbCO, un pH de aproximadamente 8.14, osmolalidad de aproximadamente 356 mOsmol, una P50 (mm Hg) de aproximadamente 12.2, y un espectro óptico con picos principales a 538 nm y 568 nm con absorbancia de aproximadamente 1,493 y aproximadamente 1,465, respectivamente, y una proporción de picos a 568 nm/500 nm de aproximadamente 2.6.
Preparación de los Conjugados
Preparación de hemoglobina viralmente desactivada
La hemoglobina precursora de uso en la preparación de los conjugados de la invención se puede aislar a partir de glóbulos rojos (RBC). Las fuentes de RBC apropiadas incluyen sangre humana, sangre bovina, sangre ovina, sangre porcina, sangre de otros sujetos y hemoglobina producida transgénicamente, tal como la Hb transgénica descrita en BIO/TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994).
La sangre se puede recoger de donantes vivos o recién sacrificados. Un método para recoger sangre entera bovina se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,084,558 y 5,296,465, concedidas a Rausch et al. Se prefiere que la sangre se recoja de una manera sanitaria.
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Se conocen muchos métodos en la técnica para el aislamiento y la purificación de la hemoglobina; estos métodos son generalmente aplicables a las composiciones de la presente invención. La siguiente discusión en este documento es ilustrativa y no limitativa.
En diversas realizaciones, en o poco después de la recogida, la sangre se mezcla opcionalmente con al menos un anticoagulante para prevenir la coagulación significativa de la sangre. Los anticoagulantes apropiados para la sangre son como se conocen clásicamente en la técnica e incluyen, por ejemplo, citrato de sodio, ácido etilendiaminotetraacético y heparina. Cuando se mezcla con sangre, el anticoagulante puede estar en forma sólida, tal como un polvo, o en una solución acuosa.
La solución sanguínea puede ser filtrada antes o durante la etapa de anticoagulación, por ejemplo, mediante filtración, para eliminar grandes agregados y partículas. Un tamiz de malla 600 es un ejemplo de un filtro apropiado.
Los RBC en la solución sanguínea son a continuación opcionalmente lavados por medios apropiados, tales como por diafiltración o por una combinación de etapas de dilución y concentración discretas con al menos una solución, tal como una solución isotónica, para separar los RBC de las proteínas plasmáticas extracelulares, tales como albúminas séricas
o anticuerpos (por ejemplo, inmunoglobulinas (IgG)). Se entiende que los RBC se pueden lavar en un modo de alimentación discontinua o continua.
También se conocen en la técnica soluciones isotónicas aceptables y son de utilidad general en la preparación de las formulaciones de la invención. Una solución isotónica de ejemplo tiene un pH neutro y una osmolaridad entre aproximadamente 285-315 mOsm. Ejemplos no limitantes de solución isotónica incluyen soluciones, tales como una solución citrato/salina, que tiene un pH y una osmolaridad que no rompe las membranas celulares de los glóbulos rojos y que desplaza la parte de plasma de la sangre entera. Un ejemplo de la solución isotónica se compone de una solución acuosa de citrato de sodio dihidratado (6.0 g/L) y de cloruro de sodio (8.0 g/L).
El agua útil en el método de la invención incluye agua destilada, agua desionizada, agua para inyección (WFI) y/o agua baja en pirógenos (LPW). WFI, que se prefiere, es agua destilada, destilada que satisface las especificaciones farmacológicas de los EE.UU. para el agua para inyección. WFI se describe adicionalmente en Pharmaceutical Engineering, 11, 15 -23 (1991). LPW, que se prefiere, es agua desionizada que contiene menos de 0.002 EU/ml.
Los RBC en la solución sanguínea se pueden lavar por diafiltración. Los diafiltros apropiados incluyen membranas microporosas con tamaños de poro que separarán los RBC de componentes de la solución sanguínea sustancialmente más pequeños, tales como un filtro de 0.1 µm a 0.5 µm (por ejemplo, un filtro de 0.2 µm). Al mismo tiempo, una solución isotónica filtrada se adiciona continuamente (o en lotes) como composición a una velocidad igual a la velocidad (o volumen) de filtrado perdido a través del diafiltro. Durante el lavado de los RBC, los componentes de la solución sanguínea que son significativamente más pequeños en diámetro que los RBC, o son fluidos tales como el plasma, pasan a través de las paredes del diafiltro en el filtrado. Los RBC, las plaquetas y los cuerpos más grandes de la solución sanguínea diluida, tales como los glóbulos blancos, se retienen y se mezclan con una solución isotónica, que se adiciona continuamente o por lotes para formar una solución sanguínea dializada.
Los RBC también se pueden lavar a través de una serie de etapas de dilución y concentración secuencial (o secuencial inversa), en donde la solución sanguínea se diluye adicionando al menos una solución isotónica, y se concentra por flujo a través de un filtro, formando así una solución sanguínea dializada.
El lavado de RBC se completa cuando el nivel de proteínas plasmáticas que contaminan los RBC se ha reducido sustancialmente (por lo general al menos aproximadamente 90%). El lavado adicional de RBC puede separar aún más las proteínas plasmáticas extracelulares de los RBC. Por ejemplo, la diafiltración con 6 volúmenes de solución isotónica puede eliminar al menos aproximadamente el 99% de IgG de la solución sanguínea.
La solución sanguínea dializada se expone entonces opcionalmente a medios para separar los RBC en la solución sanguínea dializada de los glóbulos blancos y plaquetas, tal como por centrifugación.
Se entiende que pueden emplearse otros métodos generalmente conocidos en la técnica para separar los RBC de otros componentes sanguíneos. Por ejemplo, la sedimentación, en la que el método de separación no rompe las membranas celulares de una cantidad significativa de los RBC, tales como menos de aproximadamente el 30% de los RBC, antes de la separación de los RBC de los otros componentes sanguíneos.
Después de la separación de los RBC, la hemoglobina se extrae de los RBC para formar una solución que contiene hemoglobina. La extracción se puede realizar por diversos métodos, incluyendo la lisis y la hinchazón hipoosmótica de los RBC. La lisis significa que se pueden usar diversos métodos de lisis, tales como lisis mecánica, lisis química, lisis hipotónica u otros métodos de lisis conocidos que liberan hemoglobina sin dañar significativamente la capacidad de la Hb para transportar y liberar oxígeno.
Alternativamente, la hemoglobina producida de forma recombinante, tal como la hemoglobina producida de forma recombinante descrita en Nature, 356: 258-260 (1992), se puede procesar en el método de la invención en lugar de los
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La invención proporciona en diversas realizaciones, una composición de hemoglobina inactivada viralmente que comprende hemoglobina nativa soluble en agua, funcional, opcionalmente desoxigenada. La composición se prepara mediante un método que comprende someter una solución de hemoglobina desoxigenada y un agente estabilizante a un procedimiento térmico de inactivación viral. En una realización de ejemplo, el procedimiento térmico de inactivación viral incluye exponer la solución a una temperatura elevada suficientemente para inactivar esencialmente toda la actividad viral en dicha solución; el calor se eleva durante un tiempo suficiente para lograr la inactivación de esencialmente toda la actividad viral en la solución. El agente estabilizante incluye un elemento estructural más reactivo con el oxígeno que la hemoglobina desoxigenada en la solución, minimizando así la unión del oxígeno por la hemoglobina desoxigenada. La solución incluye una cantidad del agente estabilizante suficiente para prevenir la formación de más de 5%, 4% o 2% de metahemoglobina en el procedimiento térmico de desactivación viral. El agente estabilizante se selecciona y está presente en una cantidad suficiente para mantener la concentración de metahemoglobina a aproximadamente 5% o menos.
En diversas realizaciones, la composición incluye un conjugado covalente entre la hemoglobina y al menos al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos aproximadamente 10 unidades estructurales de polímeros solubles en agua unidos a la hemoglobina, donde el conjugado covalente incluye al menos una molécula de poli(etilenglicol). Cada miembro de dicho grupo de moléculas de hemoglobina está covalentemente conjugado con al menos una molécula de dicho poli(etilenglicol) a través de una unidad estructural amina de un residuo de aminoácido. Los polímeros solubles en agua están unidos a cualquier residuo apropiado sobre la hemoglobina. En un conjugado de ejemplo de la invención, uno o más de las unidades estructurales de polímeros solubles en agua está unido a una cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, una unidad estructural ε-amina de un residuo de lisina. En una realización de ejemplo, la invención proporciona un conjugado de PEG-Hb como se ha expuesto anteriormente en el que cada molécula de Hb está conjugada con 7, 8, 9 ó 10 unidades estructurales de PEG. En diversas realizaciones, la invención proporciona una población de conjugados de PEG-Hb en los que el número medio de unidades estructurales de PEG por molécula de Hb es desde aproximadamente 7 a aproximadamente 10, o aproximadamente 8 y aproximadamente 9. En una realización de ejemplo, la unidad estructural de PEG es una unidad estructural de PEG 5000.
Síntesis de los conjugados
En diversas realizaciones, la invención proporciona conjugados entre una o más moléculas de poli(etilenglicol) y un polipéptido de hemoglobina. La hemoglobina precursora es una composición de hemoglobina inactivada viralmente que comprende hemoglobina nativa funcional, opcionalmente desoxigenada, soluble en agua. La composición se prepara mediante un método que comprende someter una solución de hemoglobina desoxigenada y un agente estabilizante a un procedimiento térmico de inactivación viral. En una realización de ejemplo, el procedimiento térmico de inactivación viral incluye exponer la solución a una temperatura elevada suficientemente para inactivar esencialmente toda la actividad viral en dicha solución; el calor se eleva durante un tiempo suficiente para lograr la inactivación de esencialmente toda la actividad viral en la solución. El agente estabilizante incluye un elemento estructural más reactivo con el oxígeno que la hemoglobina desoxigenada en la solución, minimizando así la unión del oxígeno por la hemoglobina desoxigenada. La solución incluye una cantidad del agente estabilizante suficiente para prevenir la formación de más de 5%, 4% o 2% de metahemoglobina en el procedimiento térmico de desactivación viral. El agente estabilizante se selecciona y está presente en una cantidad suficiente para mantener la concentración de metahemoglobina a aproximadamente 5% o menos.
En diversas realizaciones, el polipéptido precursor de hemoglobina es una composición de hemoglobina inactivada viralmente que comprende hemoglobina nativa, desoxigenada funcional, soluble en agua. La composición comprende menos de 5% de metahemoglobina y se prepara por un método que comprende calentar una solución precursora de hemoglobina a aproximadamente 60ºC, durante aproximadamente 12 horas, por ejemplo, desde aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas. La solución precursora incluye un agente estabilizante. El agente estabilizante incluye una estructura que reacciona más fácilmente con oxígeno o especies de oxígeno reactivo que las moléculas de hemoglobina en la solución, minimizando así la unión de oxígeno por la hemoglobina desoxigenada y, formando así dicha composición.
Los conjugados entre polímeros solubles en agua y el péptido de hemoglobina viralmente inactivado se puede formar por reacción de un derivado activado del polímero soluble en agua y la hemoglobina bajo condiciones apropiadas. En diversas realizaciones, el polímero soluble en agua se conjuga con la hemoglobina a través de una cadena lateral de un residuo de aminoácido, por ejemplo, una unidad estructural ε-amina de un residuo de lisina. Ejemplos de conjugados de la invención incluyen al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 unidades estructurales de polímero soluble en agua unidos a la hemoglobina.
En un método de formación de un conjugado de la invención, se oxigena una composición precursora de hemoglobina inactivada viralmente y se pone en contacto la hemoglobina oxigenada con una molécula activada de poli(etilenglicol) de reactividad complementaria a un residuo de aminoácido de la hemoglobina, formando así un conjugado covalente entre las moléculas de poli(etilenglicol) y de hemoglobina oxigenada en la solución de hemoglobina oxigenada. En una realización de ejemplo, la hemoglobina del conjugado covalente está desoxigenada o unida a CO. La desoxigenación
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Por ejemplo, cuando el reactivo polimérico contiene un éster activo de N-hidroxisuccinimida (por ejemplo, succinato de succinimidilo, carbonato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, y butanoato de succinimidilo), y el agente activo contiene un grupo amina (por ejemplo, un grupo amina terminal en un polipéptido y/o una épsilon amina de un polipéptido que contiene lisina), la conjugación se puede efectuar a un pH desde aproximadamente 7.5 a aproximadamente 9.5 a temperatura ambiente. Además, cuando el reactivo polimérico contiene un grupo reactivo de vinilsulfona o un grupo de maleimida y el agente farmacológicamente activo contiene un grupo sulfhidrilo (por ejemplo, un grupo sulfhidrilo de un polipéptido que contiene cisteína o que contiene metionina), la conjugación se puede efectuar a un pH desde aproximadamente 7 a aproximadamente 8.5 a temperatura ambiente. Por otra parte, cuando el grupo reactivo asociado con el reactivo polimérico es un aldehído o cetona y el agente farmacológicamente activo contiene una amina primaria, la conjugación se puede efectuar mediante aminación reductora en la que la amina primaria del agente farmacológicamente activo reacciona con el aldehído o cetona del polímero. Teniendo lugar a pH desde aproximadamente 6 a aproximadamente 9.5, la aminación reductora origina inicialmente un conjugado en el que el agente farmacológicamente activo y el polímero están unidos mediante un enlace imina. El tratamiento posterior del conjugado que contiene imina con un agente reductor apropiado tal como NaCNBH3 reduce la imina a una amina secundaria.
Ejemplos de condiciones de conjugación incluyen llevar a cabo la reacción de conjugación a un pH desde aproximadamente 4 a aproximadamente 10, y, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, o 10.0. Se deja que la reacción pase desde aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 72 horas, por ejemplo, desde aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas, por ejemplo, desde aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas. La temperatura bajo la cual puede tener lugar la conjugación es por lo general, aunque no necesariamente, en el intervalo desde aproximadamente 0°C a aproximadamente 40°C, y es a menudo a temperatura ambiente o menos. Las reacciones de conjugación se llevan a cabo a menudo usando una solución reguladora de fosfato, acetato de sodio o un sistema similar.
Con respecto a la concentración del reactivo, un exceso del reactivo polimérico se combina por lo general con la hemoglobina. Las proporciones de ejemplo de reactivo polimérico a hemoglobina incluyen proporciones molares de aproximadamente 1:1 (reactivo polimérico: hemoglobina), 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1 o 30:1. En diversas realizaciones, se permite que la reacción de conjugación continúe hasta que prácticamente no se produzca ninguna conjugación adicional, lo que generalmente se puede determinar controlando el progreso de la reacción a lo largo del tiempo.
El progreso de la reacción se puede controlar retirando partes alícuotas de la mezcla de reacción en diversos puntos temporales y analizando la mezcla de reacción mediante SDS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF o cualquier otro método analítico apropiado. Una vez que se alcanza una meseta con respecto a la cantidad de conjugado formado o la cantidad de reactivo polimérico no conjugado que queda, se supone que la reacción es completa. Por lo general, la reacción de conjugación toma desde minutos hasta varias horas (por ejemplo, de 5 minutos a 24 horas o más). La mezcla de producto resultante está preferiblemente, pero no necesariamente purificada, para separar el exceso de reactivo polimérico, los reactivos no conjugados (por ejemplo, el agente activo) y las especies no conjugadas múltiples no deseadas. Los conjugados resultantes se pueden caracterizar posteriormente mediante métodos analíticos tales como MALDI, electroforesis capilar, electroforesis en gel y/o cromatografía.
Los conjugados de polímero-hemoglobina se pueden purificar para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. Alternativamente, y más preferiblemente para reactivos poliméricos de menor peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 20,000 Dalton, más preferiblemente menos de aproximadamente 10,000 Dalton) usados para formar conjugados, la mezcla de productos se puede purificar para obtener la distribución de segmentos poliméricos solubles en agua por agente activo. Por ejemplo, la mezcla de productos se puede purificar para obtener un promedio de un número deseado de uniones del reactivo polimérico por molécula de Hb, por lo general un promedio desde aproximadamente 7, 8, 9 ó 10 uniones por molécula de Hb. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción conjugada final dependerá de una serie de factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, la formulación particular de Hb, el régimen de dosificación deseado y la actividad residual y las propiedades in vivo del(los) conjugado(s) individual(es).
Si se desea, se pueden aislar conjugados que tienen diferentes pesos moleculares usando cromatografía de filtración en gel. Es decir, la cromatografía de filtración en gel se usa para fraccionar las proporciones poliméricas de agente reactivo-agente activo numeradas de forma diferente (por ejemplo, 1-mer, 2-mer, 3-mer, y así sucesivamente, en donde "1-mer" indica 1 polímero reactivo al agente activo, "2-mer" indica dos reactivos poliméricos al agente activo, y así sucesivamente) sobre la base de sus diferentes pesos moleculares (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de los segmentos poliméricos solubles en agua). Por ejemplo, en una reacción de ejemplo en la que una proteína de 100,000 Dalton se conjuga al azar con un PEG ramificado que tiene un peso molecular total de aproximadamente 20,000 Dalton (en el que cada "rama" polimérica del PEG ramificado tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 Dalton) la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 100,000 Dalton), proteína monoPEGilada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 120,000 Dalton), proteína diPEGilada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 140,000 Dalton), y así sucesivamente.
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Aunque este enfoque se puede usar para separar PEG y otros conjugados de agente activo polimérico que tienen diferentes pesos moleculares, este enfoque es generalmente ineficaz para separar isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de unión de polímero dentro de la proteína. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de filtración en gel para separar entre sí las mezclas de PEG 1-mers, 2-mers, 3-mers, y así sucesivamente, aunque cada una de las composiciones PEG-mer recuperadas pueden contener PEG unidos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) dentro del agente activo.
Las columnas de filtración en gel apropiadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas SuperdexTM y SephadexTM disponibles en Amersham Biosciences (Piscataway, N.J.). La selección de una columna particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución se lleva a cabo generalmente usando una solución reguladora apropiada, tal como fosfato, acetato, o similares. Las fracciones recogidas se pueden analizar mediante diversos métodos, por ejemplo, (i) densidad óptica (DO) a 280 nm para el contenido de proteína, (ii) análisis de proteína de albúmina de suero bovino (BSA), (iii) ensayo de yodo para PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), y (iv) electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE), seguido por tinción con yoduro de bario.
El polímero soluble en agua es PEG y en diversas realizaciones, tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kD, 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 30 kD o 40 kD. Las unidades estructurales de PEG son especies de PEG lineales o ramificadas. El término de la unidad estructural de PEG, que no está unido al polipéptido (o a un enlazante unido al polipéptido), puede ser ya sea OH u otra unidad estructural, por ejemplo, grupo alquilo O-(C1-C4) sustituido o no sustituido. OMe (donde Me es un grupo metilo) se prefiere actualmente.
En una realización de ejemplo, el polímero soluble en agua es un PEG lineal o ramificado. En diversas realizaciones, los conjugados incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades estructurales de PEG por péptido. En una realización de ejemplo, el polímero soluble en agua es un PEG lineal y el conjugado incluye aproximadamente 6, 7, 8, 9 o 10 unidades estructurales de PEG por molécula peptídica. En otra realización de ejemplo, el polímero soluble en agua es un PEG ramificado y el conjugado incluye aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 unidades estructurales de PEG por molécula peptídica.
En realizaciones de ejemplo, en las que el PEG es una especie lineal, la unidad estructural de PEG tiene un peso molecular que es desde aproximadamente 200 D a aproximadamente 20 kD. En diversas realizaciones, en las que la unidad estructural de PEG es una unidad estructural de PEG lineal, el peso molecular del PEG lineal es al menos aproximadamente 200 D, al menos aproximadamente 500 D, al menos aproximadamente 1 kD, al menos aproximadamente 2 kD, al menos aproximadamente 5 kD, al menos aproximadamente 10 kD, al menos aproximadamente 20 kD, al menos aproximadamente 30 kD o al menos aproximadamente 40 kD.
Una especie PEG de ejemplo de uso en la invención es un PEG ramificado que tiene dos o más ramas de PEG. Un ejemplo de esta realización se basa en un aminoácido de cadena lateral, por ejemplo, serina, cisteína o lisina y di-, tri-y tetrapéptidos formados a partir de estos aminoácidos individualmente o en combinación.
En otras realizaciones de ejemplo en las que la especie PEG está ramificada, el PEG ramificado incluye desde 2 a 6 ramas lineales de PEG. Ramas de PEG de ejemplo tienen un peso molecular desde aproximadamente 200 D a aproximadamente 30 kD. En diversas realizaciones, cada rama tiene un peso molecular seleccionado individualmente que es al menos aproximadamente 2 kD, al menos aproximadamente 5 kD, al menos aproximadamente 10 kD, al menos aproximadamente 15 kD, al menos aproximadamente 20 kD, al menos aproximadamente 30 kD o al menos aproximadamente 40 kD.
En la presente invención, al menos una unidad estructural poli(etilenglicol) está covalentemente conjugada a través de una unidad estructural amina de un residuo de aminoácido de las moléculas de hemoglobina. En una realización de ejemplo, el residuo de aminoácido es un residuo de lisina y al menos una unidad estructural poli(etilenglicol) está covalentemente conjugada con una unidad estructural ε-amina del residuo de lisina. Ejemplos de unidades estructurales de conjugación son a través de un enlace que es un miembro seleccionado entre una amida y un uretano.
Estabilidad de los Conjugados
En diversas realizaciones, la invención proporciona conjugados de PEG-hemoglobina que son altamente estables, según se mide por su resistencia a la formación de metahemoglobina. En una realización, la invención proporciona un conjugado que incluye menos del 5%, 4% o 3% de metahemoglobina después del almacenamiento a 45°C, durante al menos aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 6 días, al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 8 días, al menos aproximadamente 9 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 11 días, al menos aproximadamente 12 días, al menos aproximadamente 13 días, al menos aproximadamente 14 días, o al menos aproximadamente 15 días.
En diversas realizaciones, la invención proporciona conjugados de PEG-hemoglobina que son altamente estables, según se mide por su resistencia a la formación de metahemoglobina. En una realización, la invención proporciona un conjugado que incluye menos de aproximadamente 5%, 4% o 3% de metahemoglobina después del almacenamiento a 4ºC, durante al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos
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En una realización de ejemplo, la invención proporciona un kit en el que los dos (o más) componentes están presentes y almacenados por separado antes de su combinación. Por ejemplo, en diversas realizaciones la invención proporciona un dispositivo para combinar las plaquetas y la formulación de PEG-Hb. El dispositivo incluye un primer recipiente para recoger o almacenar Factor(es); y al menos un recipiente satélite en comunicación fluida con el primer recipiente en el que se almacena la formulación de PEG-Hb. Durante el uso, se interpone una barrera de sellado por rotura entre el recipiente primero y el satélite de manera que, al romper el cierre hermético, los dos componentes de la formulación se pueden mezclar y posteriormente administrar a un sujeto que lo necesite. Como apreciará un experto, los equivalentes del dispositivo descrito están disponibles y caen dentro del espíritu y alcance de esta divulgación. Por ejemplo, un kit puede incluir dos o más ampollas, conteniendo cada una un elemento de la formulación de combinación de la invención en forma líquida o seca. El contenido de las ampollas se puede mezclar en un momento apropiado y de una manera apropiada antes de la administración de la formulación de combinación a un sujeto que lo necesite.
En una realización de ejemplo adicional, la invención proporciona una formulación en la que una formulación de PEG-Hb de la invención se combina con uno o más factores de coagulación. Tales formulaciones son útiles en el tratamiento de ciertos trastornos de la coagulación (por ejemplo, una deficiencia hereditaria o adquirida en la coagulación de la sangre), hemorragia aguda y profilaxis prequirúrgica de la hemorragia entre otros usos.
En una realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación de combinación que incluye una formulación de PEG-Hb de la invención y un factor de coagulación que es un miembro seleccionado entre los Factores II, V, VII, VIII, IX, X, XI y XII y una combinación de los mismos. En diversas realizaciones de ejemplo, el Factor se selecciona entre Factor VII, Factor VIII y Factor IX o una combinación de los mismos.
La coagulación de la sangre es un procedimiento complejo que requiere la interacción secuencial de un gran número de componentes, casi todos los cuales son proteínas. Estos componentes incluyen fibrinógeno y Factores II, V, VII, VIII, IX, X, XI y XII. Una falta de cualquiera de estos componentes, o un componente no funcional, puede conducir a una incapacidad de la sangre para coagular cuando sea necesario, con la consiguiente pérdida de sangre excesiva y potencialmente mortal para el paciente.
La técnica está repleta de métodos establecidos para la preparación de concentrados de factor de coagulación de diversos sorbentes. Por ejemplo, la purificación del complejo Factor VIII ha dado como resultado preparaciones de Factor VIII que tienen un nivel de pureza de aproximadamente 90% o más y que son suficientemente estables para almacenamiento durante largos períodos de tiempo en una forma liofilizada. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,650,858; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,399,670. También están disponibles formulaciones de Factor VIII. Estos incluyen factor VIII humano (como los principios activos de Humate™, Monoclate™, lmmunate™, y Hemofil™), factor VIII humano recombinante (como r-VIII SQ que se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 91/09122 (el principio activo de ReFactoTM) o los principios activos de Kogenate™ o RecombinateTM), el factor VIII porcino (que es el principio activo del producto Hyate:C™) vendido por Ipsen, Inc., EE.UU.) o el factor VIII porcino recombinante (por ejemplo, una forma modificada sin dominio B de factor VIII porcino como la descrita en la solicitud de patente WO 01/68109 e identificada como "POL1212".
Las formulaciones del Factor VIII adicionales de uso en la presente invención incluyen las descritas en la Patente de los Estados Unidos No.5,565,427, la Patente de los Estados Unidos No. 5,605,884, la Patente de los Estados Unidos No. 5,763,401 la Patente de los Estados Unidos No. 5,874,408, la Patente de los Estados Unidos No. 5,962,650, la Patente de los Estados Unidos No. 5,972,885, WO 89/09784, y WO 94/07510.
Otros Factores están disponibles de manera similar y de uso en la presente invención. En una realización de ejemplo, el Factor VII se incorpora en una formulación de PEG-Hb de la invención. El factor VII es una glicoproteína de cadena sencilla (peso molecular 50,000) de 406 aminoácidos que se secreta en la sangre donde circula en forma de zimógeno. In vitro, el FVII se puede activar proteolíticamente al factor FVII activado, o FVIIa, mediante la acción de factores de coagulación activados Factor X (FXa), Factor IX (FIXa), Factor XII (FXIIa) o Factor II (FIIa). FVIIa no promueve la coagulación por sí mismo, pero puede complejarse con el factor tisular (TF) expuesto en el sitio de la lesión. El complejo FVIIa/TF puede convertir FX a FXa, induciendo así la hemostasia local en el sitio de la lesión. La activación de FVII a FVIIa implica la escisión proteolítica en un solo enlace peptídico entre Arg-152 e Ile-153, dando como resultado una molécula de dos cadenas que consiste en una cadena ligera de 152 residuos de aminoácidos y una cadena pesada de 254 residuos de aminoácidos mantenidos juntos por un solo enlace disulfuro.
Los métodos de producción y purificación del Factor VII son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,329,176. Se han descrito algunas variantes de FVII manipuladas con proteínas. Véase, por ejemplo, Dickinson et al., J. Bio. Chem. 272:19875-19879 (1997), Kemball-Cook et al., J. Biol. Chem. 273:8516-8521 (1998), Bharadwaj et al., J. Biol. Chem. 271:30685-30691 (1996), Ruf et al., Biochemistry, 38:1957-1966 (1999); WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,580,560. El FVII se ha expresado en BHK y otras células de mamífero (WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y coexpresión de FVII y endoproteasa kex2 en células eucariotas (WO 00/28065). Las preparaciones comerciales de FVIIa recombinante humano se venden como NovoSeven™. NovoSeven™ está indicado para el tratamiento de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A o B.
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La hemofilia B es causada por una deficiencia de una proteína del plasma sanguíneo, llamada Factor IX que afecta a la propiedad de coagulación de la sangre. El trastorno es causado por un rasgo hereditario recesivo ligado a X, con el gen defectuoso localizado en el cromosoma X. De este modo, el trastorno se produce principalmente en los hombres. El factor IX humano es un zimógeno dependiente de la vitamina K que desempeña un papel importante en la coagulación de la sangre. El factor IX circula como un zimógeno de cadena única de 415 aminoácidos con una masa molecular de 55,000 dalton y está presente en plasma normal a aproximadamente 5 µg/ml.
Existen varias formas comerciales de concentrados de Factor IX disponibles para proporcionar terapia de reemplazo para pacientes que padecen hemofilia B. Por ejemplo, los productos complejos del Factor IX derivados de sangre (que contienen otros factores) se venden bajo las marcas Bebulin VH™ (Baxter Healthcare, Vienna, Austria), konyne 80™ (Bayer Corporation, Elkhart Ind.), Profilnine SD™ (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles Calif), y Proplex™ (Baxter Healthcare, Glendale California). Las formas algo más purificadas de los productos Factor IX se venden bajo las marcas Alphanine SD™ (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles California) y Mononine™ (Aventis Behring, Kankakee Ill). Con respecto a los concentrados de Factor IX preparados de forma recombinante, un producto, que actualmente está disponible, es Benefix.™ (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge Mass.).
La síntesis recombinante y la purificación de otros factores de coagulación y la incorporación de estos factores en una formulación de la invención es con las capacidades de los expertos en el arte.
El(los) Factor(es) y la formulación de PEG-Hb se pueden combinar de cualquier manera práctica y eficaz. De este modo, en una realización de ejemplo, el(los) Factor(es) y PEG-Hb se combinan poco antes de que la composición resultante se administre a un sujeto. En otras realizaciones de ejemplo, la formulación de Factor (s) -PEG-Hb se prepara y se almacena durante un tiempo apropiado.
En una realización de ejemplo, la invención proporciona un kit en el que los dos componentes (o más) están presentes y almacenados por separado antes de su combinación. Por ejemplo, en diversas realizaciones la invención proporciona un dispositivo para combinar el Factor (es) y la formulación de PEG-Hb. El dispositivo incluye un primer recipiente para recoger o almacenar el(los) Factor(es); y al menos un recipiente satélite en comunicación fluida con el primer recipiente en el que se almacena la formulación de PEG-Hb. Durante el uso, se interpone una barrera de sellado por rotura entre el recipiente primero y el recipiente satélite de manera que, al romper el cierre hermético, los dos componentes de la formulación se pueden mezclar y posteriormente administrar a un sujeto que lo necesite. Como apreciará un experto, los equivalentes del dispositivo descrito están disponibles y caen dentro del espíritu y alcance de esta divulgación. Por ejemplo, un kit puede incluir dos o más ampollas, conteniendo cada una un elemento de la formulación de combinación de la invención en forma líquida o seca. El contenido de las ampollas se puede mezclar en un momento apropiado y de una manera apropiada antes de la administración de la formulación de combinación a un sujeto que lo necesite.
En otra realización de ejemplo, la invención proporciona una formulación de combinación entre una fuente de NO y una formulación de PEG-Hb de la invención. Esta realización de la invención se ilustra haciendo referencia a diversas moléculas donantes de NO, sin embargo, un experto apreciará fácilmente que la fuente de NO no se limita a estas ilustraciones de ejemplo y otras fuentes de NO se pueden incorporar en la formulación de combinación de la invención.
El óxido nítrico (NO) es una importante molécula mensajera intracelular e intercelular que juega un importante papel fisiológico en la agregación antiplaquetaria y la activación antiplaquetaria, la relajación vascular, la neurotransmisión y la respuesta inmune. NO (óxido nítrico) es una "molécula mensajera" biológica que disminuye la presión arterial e inhibe la función plaquetaria, entre otras funciones. NO difunde libremente desde el endotelio hasta el músculo liso vascular y las plaquetas y a través de las sinapsis neuronales para evocar respuestas biológicas.
Los tejidos privados de sangre y oxígeno sufren necrosis isquémica o infarto con posible daño irreversible de órganos. Una vez que el flujo de sangre y oxígeno se restablece en el órgano o tejido (reperfusión), el órgano no retorna inmediatamente al estado pre-isquémico normal. La disfunción postisquémica puede deberse a una variedad de factores. Los radicales libres de oxígeno pueden jugar un papel, ya que la generación de radicales libres en el miocardio aturdido se ha demostrado y eliminadores de radicales libres se ha demostrado que atenúan la disfunción contráctil. El deterioro del manejo del calcio intracelular y la sobrecarga de calcio durante la reperfusión temprana pueden contribuir a la disfunción postisquémica.
Está bien establecido que el estrés oxidativo excesivo debido a radicales libres puede dañar tejidos biológicos. Las defensas naturales de las células y los tejidos giran en torno a los mecanismos antioxidantes que han evolucionado para proteger las células y los tejidos contra los altos niveles de estrés oxidativo. En nuestra atmósfera rica en oxígeno, la presencia de oxígeno en ciertos momentos de estrés puede ser perjudicial; esto se ha denominado la paradoja del oxígeno y se relaciona con el papel del oxígeno en la generación y participación en los procedimientos de radicales libres. En ciertos estados patológicos asociados con períodos de flujo sanguíneo restringido a los tejidos, tales como ataque cardíaco, accidente cerebrovascular y flujo restringido a las extremidades, episodios intermitentes de ausencia de flujo seguidos por reflujo de sangre constituyen el estrés oxidativo de isquemia/reperfusión (I/R).
Como se usa en este documento, el término donante de NO abarca cualquier compuesto que libere, suministre o transfiera monóxido de nitrógeno, incluyendo, por ejemplo, S-nitrosotioles, nitritos, nitratos, S-nitrotioles, sidoniminas, 2
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