KR20110076783A - 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물 전달용 고분자 및 그 제조방법, 및 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물 전달용 고분자 및 그 제조방법, 및 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물 전달용 고분자 및 그 제조방법, 및 이를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 수평균 분자량이 7,000 달톤 이하인 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물 및 그 제조방법, 및 이를 이용한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물 전달용 고분자 및 그 제조방법, 및 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물 및 그 제조 방법{A polymer for protein, polypeptide or peptide drug delivery and a method for preparing the same, and a composition for sustained release of protein, polypeptide or peptide drug and a method for preparing the same}
본 발명은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물 전달용 고분자 및 그 제조방법, 및 이를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 수평균 분자량이 7,000 달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물 및 그 제조방법, 및 이를 이용한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, X, X' Y, Z, R, m, n, a 및 b는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
생명공학 분야의 비약적인 발전으로 단백질 또는 펩타이드의 기능과 역할이 밝혀지고 있으며, 이들의 대량생산이 가능하게 됨으로써 여러 단백질 또는 펩타이드 약물들이 상용화 되었으며, 또한 이들을 활용한 신약개발을 위한 노력이 계속되고 있다.
단백질 또는 펩타이드는 경구로 투여할 경우에 장벽의 통과가 어렵고 소화관 내에서 쉽게 변성되거나 효소에 의해 분해되기 때문에 생체 이용률이 매우 낮아서 주사제의 형태로 개발되고 있다.
주사제형의 경우 잦은 투여로 인한 환자의 불편함을 해소하기 위하여, 1회 투여로 장기간 약효가 지속되는 서방형 제제를 개발하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있으며, 이러한 시도의 예들이 문헌들에 소개되어 있다(Khaled Al-Tahami et. al., "Smart Polymer Based Delivery Systems for Peptides and Proteins", Recent Patents on Drug Delivery & Formulation 2007, vol. 1, No. 1, pp. 65-71, 2007; Fei Wu et. al. "Polymer-Based Sustained-Release Dosage Forms for Protein Drugs, Challenges, and Recent Advances", AAPS PharmSciTech, vol. 9, No. 4, pp. 1218-1229, 2008.)
상용화된 서방형 단백질 제제로서 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 단백질을 접합(conjugation)한 PEGylation 기술을 Interferon (PEGasys®PEGintron®, GCSF (Neulasta®), Asparaginase (Oncaspar®), Adenosine deaminase (Adagen®) 등에 적용한 제품들이 있는데, 이들은 분자량 5,000 ~ 50,000 달톤의 PEG와 단백질의 접합체로서, 신규 화합물에 해당하여 다른 단백질에 응용하기 위해서는 생물학적 안전성 및 유효성의 검증이 필수적으로 요구되고, 생산에 있어서 고가의 비용이 소요되는 단점이 있다.
한편, 생분해성 고분자인 폴리락트산 또는 폴리락트산-글리콜산 고분자를 미립자 전달체로 이용하여 Leuprolide acetate (Lupron® Depot), Octreotide (Sandostatin®), Goserelin acetate (Zoladex®), Triptorelin Pamoate (Trelatar® Depot) 등의 펩타이드 약물에 대한 서방형 제제들이 상용화된 바 있지만, 그 지속 방출 효과 등이 여전히 만족스럽지 못하다.
단백질 약물에 대해서는 인간 성장호르몬의 서방형 제형(Nutropin®Depot)이 유일하게 US FDA의 승인을 취득한 바 있으나, 매일 투여하는 제형에 비해 효과가 미흡하여 2004년 시장에서 완전히 철수하였다.
이와 같이, 단백질 또는 펩타이드 약물에 대하여 현재까지 개발된 폴리락트산 또는 폴리락트산-글리콜산 고분자 미립자를 이용한 제형은, 초기 과다 방출 및 미흡한 지속 방출 효과 등 서방형 제제로서의 해결해야 할 과제를 여전히 안고 있다. 또한, 제조 공정 중 약물의 변성 및 과다한 약물 손실로 인한 제조 원가의 상승 등 경제적인 요인도 문제점으로 지적되고 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 한 것으로서, 초기 과다 방출의 문제가 없고, 약물의 지속 방출성이 우수하며, 독성이 없어 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 전달용으로 특히 적합한 고분자 및 약물 전달체로서 이를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명에 따른 서방형 조성물을 유기용매를 사용하지 않고 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
상기한 기술적 과제를 해결하고자 본 발명은, 수평균 분자량이 7,000 달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서,
X 및 X'은 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이고,
Y 및 Z는 독립적으로 존재하지 않거나 알칼리 금속이며,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,
a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,
R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
상기에서 “Y 및 Z가 독립적으로 존재하지 않는다”는 것은, Y 및 Z에 독립적으로 연결된 산소가 음전하를 띠는 형태, 즉 -O- 인 형태임을 의미한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 1) 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체와 디카르복시산을 중합하여 양쪽 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체를 얻는 단계; 및 2) 상기 1) 단계에서 얻어진 폴리락트산 유도체를 유기용매에 용해한 후, 여기에 알칼리 금속염 수용액을 첨가하여 폴리락트산 유도체의 염을 얻는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법이 제공된다.
[화학식 2]
Figure pat00003
상기 화학식 2에서, X, X', R, m, n, a 및 b는 본 명세서에서 정의된 바와 같으며, Y’및 Z’는 독립적으로 알칼리 금속이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 수평균 분자량이 7,000 달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온의 착체(complex) 및 이를 포함하는 서방형 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, ii) 약물 전달체로서, 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물, 및 iii) 다가 금속이온을 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 및 ii) 약물 전달체로서, 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온의 착체(complex)를 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물이 제공된다. 이 서방형 조성물은 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온이 형성하는 복합체에 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 등의 활성성분이 봉입된 미립자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, a) i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 및 ii) 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물을 함유하는 수용액을 제조하는 단계; 및 b) 상기 a)단계의 수용액을, 다가금속 이온을 포함하는 수용액에 적가하여 침전물을 얻는 단계;를 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 고분자를 이용한 서방형 약물 전달 조성물은, 활성성분인 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 서방형 방출을 가능하게 한다. 또한 상기 조성물을 제조하는 방법은 유기용매를 사용하지 않기 때문에 제조공정 중 약물의 변성을 방지하여 약리효과를 극대화시킬 수 있고 또한 별도의 유기용매 제거공정을 요구하지 않으며, 나아가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 봉입효율을 90% 이상으로 달성할 수 있기 때문에 제조공정 중 약물의 손실을 최소화할 수 있다.
도 1은 제조예 1에서 제조된 폴리락트산 유도체 화합물을 CDCl3에 용해하여 얻은 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 나트륨염을 CDCl3에 용해하여 얻은 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 실험예 1에서 얻은, 랫트에 있어서 인간 성장호르몬 함유 제형의 약물동태를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 2에서 얻은, 뇌하수체를 적출한 랫트에 인간 성장호르몬 함유 제형을 피하주사한 후 생성되는 혈중 IGF-1 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 2에서 얻은, 뇌하수체를 적출한 랫트에 인간 성장호르몬 함유 제형을 피하주사한 후 체중의 증가를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실험예 3에서 얻은, 랫트에 있어서 에리스로포이에틴 함유 제형의 약물동태를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험예 4에서 얻은, 랫트에 있어서 엑세나타이드 함유 제형의 약물동태를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
1. 폴리락트산 유도체 화합물 및 그 제조방법
본 발명에 따라 제공되는, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 전달용 폴리락트산 유도체 화합물은 양쪽 말단에 카르복실기를 갖고, 하기 화학식 1로 표시된다:
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 화학식 1에서,
X 및 X'은 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이고,
Y 및 Z는 독립적으로 존재하지 않거나, 알칼리 금속이며,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,
a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,
R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
상기에서 “Y 및 Z가 독립적으로 존재하지 않는다”는 것은, Y 및 Z에 독립적으로 연결된 산소가 음전하를 띠는 형태, 즉 -O- 인 형태임을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화학식 1에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수 1~4의 알킬 또는 탄소수 1~4의 알킬로 치환 또는 비치환된 탄소수 6의 아릴이고, 보다 구체적으로는 수소, 메틸 또는 페닐이며, 보다 더 구체적으로는 메틸이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화학식 1에서, Y 및 Z는 독립적으로 존재하지 않거나 알칼리 금속이다. Y 및 Z가 알칼리 금속인 경우에는 구체적으로 화학식 2로 나타낼 수 있고, 존재하지 않는 경우에는 화학식 1의 고분자 말단이 음이온 형태를 의미하며 구체적으로는 화학식 3으로 나타낼 수 있다, 알칼리 금속은 구체적으로는 독립적으로 나트륨, 칼륨 또는 리튬이다.
[화학식 2]
Figure pat00005
상기 화학식 2에서, X, X', R, m, n, a 및 b는 상기에서 정의된 바와 같으며, Y’및 Z’는 독립적으로 알칼리 금속이며;
[화학식 3]
Figure pat00006
상기 화학식 3에서, X, X', R, m, n, a 및 b는 상기에서 정의된 바와 같으며;
본 발명의 일 구체예에 따르면, R은 - (CH2)k- 이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
상기 화학식 1에서 R이 탄소수가 2~10인 2가 알케닐 또는 탄소수가 6~20인 2가 아릴인 경우, 이들은 각각 독립적으로 히드록시기 또는 C1~C5 알킬로 치환될 수도 있다.
상기 화학식 1에서, m 및 n은 바람직하게는 10 < m + n <70을 만족한다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 폴리락트산 유도체 화합물은 하기 화학식 4로 표시된다:
[화학식 4]
Figure pat00007
상기 화학식 4에서, Y, Z, R, m, n, a 및 b는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물은 수용성이며, 그 수평균 분자량은 7,000달톤 이하, 바람직하게는 500 내지 7,000달톤, 더 바람직하게는 700 내지 5,000달톤, 더욱 더 바람직하게는 1,000 내지 4,000달톤이다. 수평균 분자량이 7,000달톤을 초과하면 폴리락트산 유도체 화합물이 물에 용해되지 않아 약물 전달체로 이용하기 적합하지 않다. 또한 수평균 분자량이 500달톤 이하이면 분자량이 작아서 체내 분해가 너무 빨라 약물의 지속 방출을 기대하기 어려울 수 있다.
본 발명의 폴리락트산 유도체 화합물은 디카르복시산을 중심으로 예컨대, 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리만델릭산, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 블록을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리락트산 유도체 화합물은 폴리락트산, 락트산과 만델릭산의 공중합체, 락트산과 글리콜산의 공중합체 및 락트산과 카프로락톤의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 블록을 포함한다. 더 구체적으로 상기 폴리락트산 화합물은 폴리락트산의 2개의 블록을 포함한다.
상기 디카르복시산으로 바람직하게는 탄소수 3-10개의 디카르복시산, 예를 들어, 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜리산, 수베르산, 아제라인산(azelaic acid), 세바신산(sebacic acid), 도데칸디오인산(dodecanedioic acid), 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 푸마르산 또는 말레인산 등의 C4~C12 불포화 디카르복시산, 프탈산 또는 테레프탈산 등의 C8~22 아릴 디카르복시산도 사용 가능하다.
본 발명의 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물은 양 말단이 이온성이며, 양 말단은 알칼리 금속이온과 이온 결합을 하거나 하지 않은, 구체적으로 각각 화학식 2 또는 화학식 3의 형태일 수 있다. 상기 말단의 음이온은 직접 다가 금속이온과 결합하거나 알칼리 금속이온의 경우에는 다가 금속 이온에 의해 치환되어 이온 결합 착체(complex)를 형성할 수 있게 하는 역할을 한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 1) 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체와 디카르복시산을 중합하여 양쪽 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체를 얻는 단계; 및 2) 상기 1) 단계에서 얻어진 폴리락트산 유도체를 유기용매에 용해한 후, 여기에 알칼리 금속염 수용액을 첨가하여 폴리락트산 유도체의 염을 얻는 단계;를 포함하는, 상기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법의 1)단계에서 단량체로서 사용가능한 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체는, 예를 들어, 락트산, 락타이드, 글리콜라이드, 만델릭산, 카프로락톤, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체와 디카르복시산의 사용량의 비에는 특별한 제한이 없으며, 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물을 얻을 수 있는 범위 내에서 자유롭게 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체의 100 중량부 당 디카르복시산 1 내지 20 중량부가 사용될 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법의 1)단계에서는, 상기 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체인 단량체와 탄소수 3-10개의 디카르복시산의 혼합물을 80℃ 내지 180℃로 가열하고, 0.5~4시간 동안 물을 제거한 후, 150~250℃의 온도에서 10~48시간 동안 중합 반응하여 양쪽 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체를 제조할 수 있다. 상기의 제조 공정 과정에서, 물을 제거한 후의 중합 반응에서 반응온도가 150℃ 이하이거나 반응시간이 10시간 이내이면 원하는 분자량의 고분자를 얻기가 어려워지며, 반응온도가 250℃ 이상이거나 반응시간이 48시간을 초과하면 고분자의 열분해가 발생하는 문제점이 있을 수 있다.
본 발명의 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법의 2)단계에서는, 상기 1)단계에서 얻어진 양쪽 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체를 유기용매에 용해한 후, 여기에 알칼리 금속염 수용액을 첨가하여 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물을 얻는다.
상기 알칼리 금속은, 예컨대 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨, 탄산리튬 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 구체적으로는 탄산수소나트륨 또는 탄산수소칼륨을 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 수혼화성 유기용매를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 아세토니트릴 또는 아세톤을 사용할 수 있다. 제2)단계에서, 상기 양쪽 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체와 알칼리 금속염의 사용량의 비에는 특별한 제한이 없으며, 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물을 얻을 수 있는 범위 내에서 자유롭게 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 양 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체 1 mole에 대하여 알칼리 금속염 2 내지 10 mole이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법은, 상기 2)단계 이후, 얻어진 고분자 용액에 예컨대 염화나트륨을 첨가한 뒤, 유기용매층을 분리시켜 회수하고, 회수된 유기용매층으로부터 유기용매를 진공건조시켜 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이를 거쳐 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물을 얻을 수 있다.
2. 착체 , 서방형 조성물 및 그 제조방법
본 발명의 다른 측면에 따르면, 약물전달체로서 유용한, 수평균 분자량이 7,000 달톤 이하인 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온의 착체(complex)가 제공된다.
본 발명의 화학식 1의 폴리락트산 유도체는 상기에서 설명한 바와 같으며, 말단이 음이온을 띤다. 따라서, 다가 금속이온과 2몰 이상의 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 이온 결합을 통하여 착체를 형성할 수 있다. 본 발명의 상기 착체에 있어서 다가 금속이온은 2가 또는 3가의 금속이온일 수 있으며, 예컨대 아연(Zinc), 칼슘(Calcium), 마그네슘(Magnesium) 및 철(Iron)로 이루어진 군 중에서 선택된 금속의 다가 이온일 수 있다. 상기 다가 금속 이온은 예컨대, 이들 금속의 염화염과 같은 염 화합물의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 착체의 일 구체예에 따르면, 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물은 앞서 설명한 화학식 3의 폴리락트산 유도체 화합물이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, ii) 약물 전달체로서, 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물, 및 iii) 다가 금속이온을 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 및 ii) 약물 전달체로서, 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온의 착체(complex)를 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물이 제공된다.
본 발명의 서방형 조성물의 일 구체예에 따르면, 상기 다가 금속이온과 2몰 이상의 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 이온 결합을 통하여 착체를 형성할 수 있고, 이 착체가 약물 전달체로서 기능하여, 그 내부에 활성성분이 봉입되어 미립자를 형성한다.
본 발명의 서방형 조성물의 일 구체예에 따르면, 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물은 앞서 설명한 화학식 3의 폴리락트산 유도체 화합물이다.
본 발명의 서방형 조성물에 있어서, 활성성분은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드이며, 본 명세서에서 이들 용어 중 어느 하나가 단독으로 사용된 경우라도, 특별히 언급된 경우를 제외하고는, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 모두 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 용어 "서방형", "서방형 전달" 또는 "서방형 약물 전달"은 1회 투여로 약물의 유효 혈중 농도를 장시간, 예컨대 72시간 이상 유지하는 것을 의미한다. 특히 폴리펩타이드의 일반적인 투여 경로는 피하, 근육 또는 정맥주사 등인데, 효과적인 치료를 위해 자주 주사해야 하는 단점이 있었다. 이러한 빈번한 투여로 인한 불편함을 해소하기 위한 서방형 전달체의 개발 및 제공이 본 발명이 목적하는 바이다.
본 발명의 서방형 조성물에 있어서 활성성분의 예로는 성장 호르몬, 에리스로포이에틴, 단일클론 항체, 과립세포 콜로니 자극인자, 대식세포 콜로니 자극인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, 트롬보포이에틴, 인슐린 유사 성장인자, 상피 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 전이 성장인자, 인터페론, 인터루킨, 종양 괴사 인자, 스트렙토키나제, 유로키니제, 스타필로키나제, 디엔에이즈, 글루코세레브로시다제, 알파 갈락토시다제, 엑세나타이드, 옥트레오타이드, 인슐린, 글루카곤, 황체형성호르몬 분비호르몬, 고세렐린(Goserelin), 루프로렐린(Leuprorelin), 여포자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 퍼티렐린(Fertirelin), 칼시토닌(Calcitonin), 코르티코트로핀 방출 인자(Corticotropin Releasing Factor), 두뇌 나트리유레틱 펩티드 (Brain Natriuretic Peptide), 티모펜틴(Thymopentin), 코르티코트로핀(Corticotropin), 엘카토닌(Elcatonin), 베타 아밀로이드(Beta Amyloid), 트립토렐린(Triptorelin), 부세렐린(Buserelin), 티모신(Thymosin), 소마토스타틴(Somatostatin), 아라렐린(Alarelin), 안지오텐신(Angiotensin), 아르기프레신(Argipressin), 아토시반(Atosiban), 비발리루딘(Bivalirudin), 세트로렐릭스(Cetrorelix), 데스로렐린(Deslorelin), 데스모프레신(Desmopressin), 엘카토닌(Elcatonin), 엔푸비르티드(Enfuvirtide), 엡티피바티드(Eptifibatide), GLP-1, 고난도렐린(Gonandorelin), 리스프레신(Lyspressin), 나파렐린(Nafarelin), 네시리티드(Nesiritide), 옥시토신(Oxytocin), 프람린티드(Pramlintide), 세크레틴(Secretin), 터이파라티드(Teriparatide), 터리프레신(Terlipressin), 테트라코삭티드(Tetracosactide), 바프레오티드(Vapreotide) 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
본 발명의 서방형 조성물에 있어서 상기 활성성분은, 본 발명의 서방형 조성물 건조 중량을 기준으로 0.01 내지 60중량%, 구체적으로 0.05 내지 50중량%이 되도록 사용할 수 있다. 활성성분의 함량이 서방형 조성물 건조 중량의 0.01 중량%에 못 미치면 의도한 약리효과를 얻기 어려워지고, 60중량%를 초과하면 약물의 초기 과다방출로 인한 문제점이 있을 수 있다.
본 발명의 서방형 조성물에 있어서 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물은, 본 발명의 서방형 조성물 건조 중량을 기준으로 39.9 내지 99.9 중량%, 구체적으로 50 내지 99 중량%로 포함되도록 사용할 수 있다. 상기 폴리락트산 유도체 화합물 함량이 서방형 조성물 건조 중량의 39.9 중량%에 못 미치면 서방형 방출효과를 얻을 수 없는 문제가 있을 수 있고, 99.9 중량%를 초과하면 통상적인 방법으로 인체에 1회 투여할 수 있는 용량을 초과하는 문제점이 있을 수 있다.
본 발명의 서방형 조성물에 있어서 상기 다가 금속이온은, 본 발명의 서방형 조성물 건조 중량을 기준으로 바람직하게는 0.01 내지 20중량%, 더 바람직하게는 0.05 내지 15중량%로 포함되도록 사용할 수 있다. 다가 금속이온의 함량이 서방형 조성물 건조 중량의 0.01 중량%에 못 미치면 서방형 방출효과를 얻을 수 없는 문제가 있을 수 있고, 20중량%를 초과하면 금속이온에 의한 독성이 발현되는 문제점이 있을 수 있다.
이렇게 형성된 활성성분 함유 고분자 복합체는 수용액에서 입자로 침전된다.
본 발명에 따른, 폴리펩타이드 등을 함유한 서방형 미립자 조성물은 5 ~ 250㎛, 구체적으로 50 ~ 150㎛의 균일한 크기의 미립자이다.
본 발명의 서방형 조성물은, 상기한 성분들 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충액 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물 함유 서방형 조성물은 약학적으로 사용가능한 분산매에 분산하여 인체에 투여할 수 있다. 상기 분산매의 예로는 주사용 증류수, 5% 포도당, 생리 식염수, 미네랄 오일, 모노(mono)-, 디(di)- 및 트리(tri)-글리세라이드 등을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, a) i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 및 ii) 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물을 함유하는 수용액을 제조하는 단계; 및 b) 상기 a)단계의 수용액을, 다가금속 이온을 포함하는 수용액에 적가하여 침전물을 얻는 단계;를 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
구체적으로, 본 발명의 서방형 조성물 제조 방법의 a) 단계에서는 활성성분과 상기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물을 동시에 첨가 또는 일 성분을 먼저 첨가 후 다른 성분을 첨가하는 순차적 첨가에 의해 수용액을 제조할 수 있다. 예컨대, (a-1) 활성성분 및 상기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물을 물에 용해하여 수용액을 제조하거나; (a-2) 먼저 양 말단이 카르복시산인 폴리락트산 유도체 및 알칼리 금속염 수용액을 물에 용해하여 상기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물을 제조하고, 여기에 활성성분을 투입하여 수용액을 제조하거나; 또는 (a-3) 먼저 양 말단이 카르복시산인 폴리락트산 유도체 및 활성성분을 물에 용해하고, 여기에 알칼리 금속염 수용액을 투입하여 상기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물 및 활성성분을 함유하는 수용액을 제조함으로써 수용액을 제조할 수 있다.
즉, 본 발명의 서방형 조성물의 제조는 상기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물을 시작물질로 사용할 수도 있고 (a-1), 다르게는 양쪽 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체로부터 출발하여 이를 알칼리 금속염에 의해 상기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물로 변경시킨 후 사용할 수도 있다(a-2 및 a-3).
본 발명의 서방형 조성물 제조 방법의 일 구체예에 따르면, 상기 수용액을 구성하는 수성 매질은 증류수, 또는 아세테이트 염, 시트레이트염, 글리신염, 인산염 및 탄산염의 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 완충액일 수 있다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물은 제형의 조성, 특히 pH에 민감하게 반응하며, 그에 따라 구조가 변화하거나 활성이 감소될 수 있다.
본 발명의 서방형 조성물 제조방법의 상기 b)단계에서는 상기 a)단계에서 얻어진 수용액을, 다가금속 이온을 포함하는 수용액에 서서히 적가하여 침전물을 형성시킨다. 이때, 활성성분은 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온과의 착체(complex) 내부에 분산되어 침전될 수 있다. 이 단계에서 다가금속 이온으로는 예컨대 아연(Zinc), 칼슘(Calcium), 마그네슘(Magnesium) 및 철(Iron)로 이루어진 군 중에서 선택된 금속의 다가 이온일 수 있다. 상기 다가 금속 이온은 예컨대, 이들 금속의 염화염과 같은 염 화합물의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 다가 이온 수용액의 농도는 1~ 300mg/ml 이고, 구체적으로 1 ~ 100mg/ml 이다. 고분자 착체가 형성되는 경우, 다가 금속이온은 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물의 음이온과 직접 이온 결합을 하거나 알칼리 금속이온을 치환하면서 이온 결합을 하여 착체가 된다. 그리고 이 착체 내부에는 폴리펩타이드 등의 활성성분이 봉입되며, 이렇게 형성된 활성성분 함유 고분자 복합체는 수용액에서 미립자로 침전된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 활성성분 및 상기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물을 포함하는 수용액은, b) 단계에서 부피비로 1~30배의 다가 이온 수용액에 적가하여 침전시킬 수 있다.
본 발명의 서방형 조성물 제조방법은, 상기 b)단계 이후에, 상기 b)단계에서 얻은 침전물을 원심분리한 후 물로 세척하는 c)단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 c)단계는 저온, 예를 들어 4℃가 유지되는 원심분리기에서 b)단계의 침전물을 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리한 후, 침전물을 물로 세척하는 방식으로 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 서방형 조성물 제조방법은, 상기 c)단계 이후에, 상기 c)단계에서 분리된 침전물을 동결건조하는 d)단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 d)단계에서 동결건조시 동결건조 보조제를 첨가할 수 있으며, 동결 건조 보조제로는, 당, 당알코올 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 상기 당은 락토스, 말토스, 슈크로스 및 트레할로스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 당알코올은 만니톨, 솔비톨, 말티톨, 자일리톨 및 락티톨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로 1 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 30 중량%이다.
본 발명에 따른, 폴리펩타이드 등을 함유한 서방형 미립자 조성물은 임의로 b), c) 또는 d) 단계 이후 전동체를 이용하여 분쇄하거나 초음파 분쇄(sonication) 방법 등을 통해 바람직하게는 5 ~ 250㎛, 보다 바람직하게는 50 ~ 150㎛의 균일한 크기의 미립자로 제조될 수 있다.
본 발명의 서방형 조성물 제조방법은 유기용매를 사용하지 않고 수용액을 사용하기 때문에 공정 중에 별도의 유기용매 제거공정이 요구되지 않으며, 제조공정 중 약물의 변성을 방지하여 약리효과를 극대화할 수 있는 장점이 있다. 또한, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 봉입효율이 90% 이상으로서 제조공정 중 약물의 손실을 최소화할 수 있다.
본 발명에 따른 서방형 조성물이 체내에 투여되면, 복합체를 구성하는 고분자가 체내에서 분해되면서 내부에 봉입된 약물을 서서히 방출한다. 종래에는 서방형, 즉, 약물의 방출 시간을 지연하기 위해서 분자량이 수만 달톤 이상의 고분자량인 고분자를 사용해야 했는데, 이러한 고분자량의 고분자는 물에 용해되지 않기 때문에 미립자와 같은 전달체의 제조 공정에서 단백질 또는 펩타이드의 변성을 야기할 수 있는 유기용매를 사용해야 하는 단점이 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 서방형 미립자 조성물은 물에 용해되는 저분자량의 고분자를 사용하므로, 서방형 조성물 제조시에 유기용매의 사용이 불필요하다. 또한, 다가 금속 이온에 의해 고분자가 착체를 형성할 수 있으므로, 본 발명의 서방형 조성물을 체내에 투여하면 우수한 지속방출 효과를 얻을 수 있다.
이하 본발명을 제조예, 실시예 및 실험예 등을 통하여 보다 상세히 설명하지만, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 제조예 1] 폴리락트산 유도체의 제조
D,L-락트산 500g (5.56 mole)과 숙시닉 산(succinic acid) 18.9g (0.16 mole)을 1L 의 2구 둥근바닥 플라스크에 넣고, 자석막대로 교반하면서 질소 퍼징할 수 있도록 장치하였다. 가열용 유조(Oil bath)를 160℃로 가열하고, 질소를 2000mL/min의 흐름 속도로 반응물 내부로 퍼징하였다. 반응 중에 생성되는 물은 질소의 흐름을 따라 반응기 밖으로 배출하였다. 1시간 동안 물을 제거하고, 유조를 200℃로 가열하였다. 24시간 반응을 시킨 후 반응을 종결하였다. 그 결과, 정제되지 않은 상태의 양 말단이 카르복실산으로 된 D,L-폴리락트산 유도체 368g을 얻었다. 제조된 폴리락트산 유도체에 대한 NMR 스펙트럼을 도 1에 나타내었다. 하기 NMR 분석법으로 측정한 결과, 제조된 폴리락트산 유도체의 수평균 분자량은 2,315달톤이었다.
<1H-NMR 스캔의 피크면적으로부터 수평균 분자량의 계산>
[수학식 1]
수평균 분자량 (달톤) = {(A + B) / (C/N) } X 72.1
상기 수학식 1에서,
A는 D,L-폴리락트산 유도체의 메틸렌 양성자의 피크 면적이고,
B는 고분자 말단 D,L-락트산 유도체의 메틸렌 양성자의 피크 면적이며,
C는 디카르복실산의 메틸렌 양성자의 피크 면적이고,
N은 디카르복실산의 메틸렌 양성자의 갯수이다.
[ 제조예 2] 폴리락트산 유도체의 제조
숙시닉 산 39.3g(0.33mole)을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 폴리락트산 유도체를 중합하였다. 그 결과, 정제되지 않은 상태의 양 말단이 카르복실산으로 된 폴리락트산 유도체 348g을 얻었고, 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 1,155달톤이었다.
[ 제조예 3] 폴리락트산 유도체의 정제
제조예 1에서 얻어진 폴리락트산 유도체 100g과 탄산수소나트륨(NaHCO3) 20g을 2L 비이커에 넣고 증류수 1L를 첨가하였다. 혼합물을 60℃로 가열하고, 교반하면서 1시간 동안 고분자를 용해하였다. 고분자를 용해한 후, 상온에서 염화수소(HCl) 수용액(1 N)을 고분자 수용액에 방울방울 떨어뜨리면서 고분자를 석출시켰다. 석출된 고분자는 여과하고 증류수로 세척하였다. 세척 및 여과과정을 3회 반복하여 염화수소를 제거하였다. 얻어진 고분자는 48시간 동안 동결건조하였다. 그 결과, 양 말단에 카르복실산을 가지는, 정제된 폴리락트산 유도체 72.4g을 얻었고, 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 2,703달톤이었다.
[ 제조예 4] 폴리락트산 유도체의 제조
숙시닉 산(succinic acid) 대신 글루타르산 (glutaric acid) 21.1g (0.16 mole)을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 양 말단이 카르복실산으로 된 폴리락트산 유도체 381g을 얻었고, 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 2,360달톤이었다.
[ 제조예 5] 폴리락트산 유도체의 제조
D,L-락트산 500g (5.56 mole) 1L 의 2구 둥근바닥 플라스크에 넣고, 자석막대로 교반하면서 질소 퍼징할 수 있도록 장치하였다. 가열용 유조(Oil bath)를 160℃로 가열하고, 질소를 2000mL/min의 흐름 속도로 반응물 내부로 퍼징하였다. 반응 중에 생성되는 물은 질소의 흐름을 따라 반응기 밖으로 배출하였다. 1시간 동안 물을 제거하고, 유조를 200℃로 가열하였다. 24시간 반응을 시킨 후 반응을 종결하였다. 그 결과, 정제되지 않은 상태의 양 말단이 각각 히드록실기와 카르복실산으로 된 D,L-폴리락트산을 얻었다. 여기에 숙시닉 언하이드라이드 35g (0.35 mole)를 첨가하고 120℃로 6시간 가열하여 폴리락트산 말단기인 히드록실기와 반응되도록 하였다. 제조된 폴리락트산 유도체를 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 2,240 달톤이었다.
[ 실시예 1] 폴리락트산 유도체 나트륨염의 제조
제조예 1에서 얻어진 폴리락트산 유도체 100g에 아세토니트릴 150mL를 첨가하여 용해하였다. 여기에 탄산수소나트륨 수용액(0.1g/mL) 150mL를 서서히 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반하여 고분자를 중화시켜 폴리락트산 유도체 나트륨염을 제조하였다.
이후 염석출법(salting-out)을 통해 제조된 고분자를 정제하였다. 즉, 반응 결과 용액에 염화나트륨(NaCl) 15g을 교반하면서 첨가하여 용해시키고, 분별 깔대기에서 2시간 동안 층분리시켜 수용액층을 제거하였다.
얻어진 유기용매층 고분자 용액에, 다시 증류수 100mL와 염화나트륨 10g를 첨가하여 용해시키고, 분별깔대기를 이용하여 다시 층분리시키고, 수용액층을 제거하였다. 얻어진 고분자를 포함하는 유기용매층 용액을 50℃에서 회전 분별증류하여 유기용매와 소량의 증류수를 완전히 제거하였다.
유기용매와 증류수가 제거된 고분자에 무수 아세톤 500mL를 첨가하여 고분자를 용해시키고, 용해되지 않는 침전물은 여과지를 이용하여 여과하여 제거하였다. 여과된 고분자 용액을 50℃에서 2시간 동안 회전 분별증류하여 아세톤을 완전히 제거하였다.
아세톤이 제거된 고분자를 50℃ 진공오븐 내에서 3일 동안 진공 건조하였다. 그 결과 양 말단에 카르복시산 나트륨염을 가지는, 정제된 폴리락트산 유도체의 나트륨염 91g을 얻었다. 제조된 폴리락트산 유도체 염의 NMR 스펙트럼을 도 2에 나타내었다. 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 2,178달톤이었다.
[ 실시예 2] 폴리락트산 유도체 나트륨염의 제조
제조예 2에서 얻어진 폴리락트산 유도체 100g을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 양 말단에 카르복시산 나트륨염을 가지는, 정제된 폴리락트산 유도체의 염 93g을 얻었고, 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 1,125달톤이었다.
[ 실시예 3] 폴리락트산 유도체 나트륨염의 제조
제조예 4에서 얻어진 폴리락트산 유도체 100g을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 양 말단이 카르복시산 나트륨염을 가지는, 정제된 폴리락트산 유도체의 염 91 g을 얻었고, 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 2,250달톤이었다.
[ 실시예 4] 폴리락트산 유도체 나트륨염의 제조
제조예 5에서 얻어진 폴리락트산 유도체 100g을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 양 말단에 카르복시산 나트륨염을 가지는, 정제된 폴리락트산 유도체의 염 90g을 얻었고, 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 그 수평균 분자량은 2,080달톤이었다.
[ 실시예 5] 인간 성장호르몬 (human growth hormone, hGH) 함유 서방형 조성물의 제조
실시예 1에서 제조한 폴리락트산 유도체 나트륨염 4.5g과 인간 성장호르몬(3.0 IU/mg) 500mg을 20mL의 물에 용해하여 hGH-고분자 수용액을 제조하였다.
다가 금속염으로서 염화아연(ZnCl2) 수용액 250mL(50mg/mL)을 준비하고, 이 용액을 교반하면서 여기에 상기 hGH-고분자 수용액을 점적하여 인간 성장호르몬 함유 조성물의 침전물을 생성하였다. 이 혼합물을 4℃가 유지되는 원심분리기를 이용하여 3,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리하였다.
침전물을 여과한 후, 증류수 500mL을 가하여 2회 세척한 후 동결건조하였다. 건조된 조성물을 100~400 mesh의 체를 이용하여 걸러 50~150㎛의 미립자 조성물을 얻었다.
얻어진 동결건조 미립자 조성물 내의 인간성장 호르몬을 하기의 BCA assay (Micro BCA Protein Assay Kit), Thermo Scientific)를 이용하여 정량하였다. 정량 결과 hGH 함량 및 봉입효율은 각각 9.54중량% 및 92.6%이었다.
<BCA assay (Micro BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific)를 이용한 단백질의 함량 및 봉입 효율 측정>
(1) 단백질 함량의 측정
[수학식 2]
Figure pat00008
[수학식 3]
Figure pat00009

[ 실시예 6] 인간 성장호르몬 함유 서방형 조성물의 제조
실시예 1에서 제조한 폴리락트산 유도체 나트륨염 4.75g과 인간 성장호르몬(3.0 IU/mg) 250mg을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 인간 성장호르몬 함유 미립자 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물 내의 인간성장 호르몬을 상기 BCA assay로 정량한 결과, hGH 함량 및 봉입효율은 각각 4.72중량% 및 91.7%이었다.
[ 실시예 7] 인간 성장호르몬 함유 서방형 조성물의 제조
실시예 1에서 제조한 폴리락트산 유도체 나트륨염 4.9g과 인간 성장호르몬(3.0 IU/mg) 100mg을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 인간 성장호르몬 함유 미립자 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물 내의 인간성장 호르몬을 상기 BCA assay로 정량한 결과, hGH 함량 및 봉입효율은 각각 1.93중량% 및 93.7%이었다.
[ 실시예 8] 인간 성장호르몬 함유 서방형 조성물의 제조
실시예 2에서 제조한 폴리락트산 유도체 나트륨염을 사용한 것을 제외하고는 실시예 6과 동일한 방법으로 인간 성장호르몬 함유 미립자 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물 내의 인간성장 호르몬을 상기 BCA assay로 정량한 결과, hGH 함량 및 봉입효율은 각각 4.72중량% 및 91.7% 이었다.
[ 실시예 9] 인간 성장호르몬 함유 서방형 조성물의 제조
제조예 3에서 정제된 폴리락트산 유도체 나트륨염 4.9g, 인간 성장호르몬(3.0 IU/mg) 100 mg을 20mL의 물에 용해한 후, 여기에 탄산수소나트륨(NaHCO3) 0.3g을 가하여 hGH-고분자 수용액을 제조하였다.
다가 금속염으로서 염화아연(ZnCl2) 수용액 250mL(50mg/mL)을 준비하고, 이 용액을 교반하면서 여기에 상기 hGH-고분자 수용액을 점적하여 인간 성장호르몬 함유 조성물의 침전물을 생성하였다. 이 혼합물을 4℃가 유지되는 원심분리기를 이용하여 3,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리하였다.
침전물을 여과한 후, 증류수 500mL을 가하여 2회 세척한 후 동결건조하였다. 건조된 조성물을 100~400mesh의 체를 이용하여 걸러 50~150㎛의 미립자 조성물을 얻었다.
얻어진 동결건조 미립자 조성물 내의 인간성장 호르몬을 상기 BCA assay로 정량한 결과, hGH 함량 및 봉입효율은 각각 4.86중량% 및 94.4%이었다.
[ 실시예 10] 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO) 함유 서방형 조성물의 제조
실시예 1에서 제조한 폴리락트산 유도체 나트륨염 1g과 에리스로포이에틴 (41IU/mg) 0.4mg을 5mL의 물에 용해하여 EPO-고분자 수용액을 제조하였다.
다가 금속염으로서 염화아연(ZnCl2) 수용액 5.5mL(12.5mg/mL)을 준비하고, 이 용액을 교반하면서 여기에 상기 EPO-고분자 수용액을 가하여 에리스로포이에틴 함유 조성물의 침전물을 생성하였다. 이 혼합물을 4℃가 유지되는 원심분리기를 이용하여 3500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리하였다.
상층액을 완전히 제거한 후 얻어진 침전물을 동결건조하였다. 건조된 조성물을 100~400 mesh의 체를 이용하여 걸러 50~150㎛의 미립자 조성물을 얻었다.
얻어진 동결건조 미립자 조성물 내의 에리스로포이에틴을 상기 BCA assay로 정량한 결과, 에리스로포이에틴 함량 및 봉입효율은 각각 0.038중량% 및 92.2%이었다.
[ 실시예 11] 엑세나타이드 (Exenatide) 함유 서방형 조성물의 제조
실시예 1에서 제조한 폴리락트산 유도체 나트륨염 4.9g과 엑세나타이드 100mg을 45mL의 물에 용해한 수용액을 제조한 후, 0.45㎛ 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다.
다가 금속염으로서 염화아연(ZnCl2) 수용액 500ml(25mg/mL)을 준비하고, 여기에 상기 엑세나타이드-고분자 수용액을 3mL/min의 속도로 점적하면서 120 rpm의 속도로 교반하여 엑세나타이드 함유 조성물의 침전물을 얻었다.
침전물을 여과하고, 증류수 500mL을 가하여 2회 세척한 후, 실온에서 1일 동안 진공 건조하였다. 건조된 조성물을 분쇄기로 분쇄한 후 100~400 mesh의 체를 이용하여 걸러 50~150㎛의 미립자 조성물을 얻었다.
얻어진 건조 미립자 조성물 내의 엑세나타이드를 상기 BCA assay로 정량한 결과, 엑세나타이드 함량 및 봉입효율은 각각 1.97중량% 및 95.6%이었다.
[ 실시예 12] 엑세나타이드 (Exenatide) 함유 서방형 조성물의 제조
다가금속염으로서 염화아연(ZnCl2) 대신에 염화칼슘(CaCl2)을 사용하는 것을 제외하고 실시예 11과 동일한 방법으로 엑세나타이드 함유 미립자 조성물을 제조하였다. 얻어진 건조 미립자 조성물 내의 엑세나타이드를 상기 BCA assay로 정량한 결과, 엑세나타이드 함량 및 봉입효율은 각각 1.92중량% 및 93.2중량%이었다.
[ 실시예 13] 엑세나타이드 (Exenatide) 함유 서방형 조성물의 제조
실시예 3에서 제조한 폴리락트산 유도체 나트륨염 4.9g을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 11과 동일한 방법으로 엑세나타이드 함유 미립자 조성물을 제조하였다. 얻어진 건조 미립자 조성물 내의 엑세나타이드를 상기 BCA assay로 정량한 결과, 엑세나타이드 함량 및 봉입효율은 각각 1.94중량% 및 94.2%이었다.
[ 비교예 1] 인간 성장호르몬 (human growth hormone, hGH) 수용액 조성물의 제조
아래 표 1에 기재된 조성물을 10mL의 주사용수에 용해하여 인간성장 호르몬 수용액을 제조하였다.
Figure pat00010
[ 비교예 2] 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO) 수용액 조성물의 제조
아래 표 2에 기재된 조성물을 1.0 mL의 주사용수에 용해하여 에리스로포이에틴 수용액을 제조하였다.
Figure pat00011

[ 실험예 1] 인간 성장호르몬 (human growth hormone, hGH) 함유 조성물의 약물동태 시험
실시예 5-9 및 비교예 1에서 제조한 인간 성장호르몬 (human growth hormone, hGH) 함유 조성물의 약물동태 시험을 실시하였다.
S.D. 랫트(190±20g, 5~6주령)를 Charles River Laboratories (Orient, Korea)로부터 공급받아서 항온, 항습이 유지되는 사육실에서 일주일 이상 적응시킨 후 일반상태를 관찰하여, 외관상 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 12시간 간격 인공조명, 조도 300~500Lux, 온도 23±1℃, 상대습도 65±10%의 조건하에서 사육하고 멸균된 고형사료와 수돗물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
각각의 조성물을 5mg/kg의 dose로 랫트에 피하주사한 후(n=5), 일정시간 간격으로 10일 동안 혈액을 채취하여 Quantikine hGH immunoassay kit (R&D Systems)으로 혈중 hGH를 정량하였다. 정량 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 인간 성장호르몬 함유 조성물은 10일 이상 1 ng/mL 이상의 혈중 인간 성장호르몬 농도를 유지하였으며, 부검 결과 본 발명의 조성물에 기인한 독성은 관찰되지 않았다.
[ 실험예 2] 인간 성장호르몬 함유 조성물의 효능시험
실시예 5-6 및 비교예 1에서 제조한 인간 성장호르몬 함유 조성물을, 뇌하수체를 적출하여 성장호르몬 결핍을 유발한 랫트(hypophysectomized rats)에 투여하여 효능시험을 실시하였다.
질환모델 동물로서 뇌하수체를 적출한 S.D. 랫트 (90±10g, 4주령, Japan SLC, Inc.)를 항온, 항습이 유지되는 사육실에서 일주일 동안 적응시킨 후 일반상태를 관찰하여, 외관상 건강하고 체중변화가 일어나지 않는 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 12시간 간격 인공조명, 조도 300~500Lux, 온도 23±1℃, 상대습도 65±10%의 조건하에서 사육하고 멸균된 고형사료와 수돗물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
실시예 5 및 6의 조성물은 5mg/kg의 dose로 1회 피하주사하고, 비교예 1의 조성물은 0.71mg/kg의 dose로 1일 1회 7일 동안 피하주사하였다(n=6). 일정시간 간격으로 혈액을 채취하여 Quantikine IGF-1 immunoassay kit (R&D Systems)으로 혈중 IGF-1(Insulin Like Growth Factor-1)의 농도를 정량하였다. 또한 동물의 체중을 측정하여 체중의 변화를 기록하였다. 정량 및 체중측정 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 성장호르몬에 의해 생성되는 IGF-1의 혈중 농도에 있어서, 본 발명의 조성물을 1회 투여했을 경우에 기존 시판 제형의 조성물을 7일 동안 매일 1회 투여한 경우에 비해 우수한 결과를 보였다.
또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물을 1회 투여했을 경우에 2주일 경과 후 체중이 약 20%의 증가하였으며, 기존 시판 제형의 조성물을 7일 동안 매일 1회 투여한 경우에 비해 우수한 결과를 보였다. 성장 호르몬을 투여하지 않은 음성 대조군(No Treatment)은 체중 증가를 보이지 않았다. 부검 결과 본 발명의 조성물에 기인한 독성은 관찰되지 않았다.
[ 실험예 3] 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO) 함유 조성물의 약물동태 시험
실시예 10 및 비교예 2에서 제조한 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO) 함유 조성물의 약물동태 시험을 실시하였다.
S.D. 랫트(190±20g, 5~6주령)를 Charles River Laboratories (Orient, Korea)로부터 공급받았으며, 실험예 1과 동일한 조건 하에서 동물을 관리하였다.
각각의 조성물을 2000 IU/kg의 dose로 랫트에 피하주사한 후(n=6), 일정시간 간격으로 혈액을 채취하여 Enzyme immunoassay kit (DEP00, R&D systems)을 사용하여 혈중 에리스로포이에틴 농도를 정량하였다. 정량 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 에리스로포이에틴 함유 조성물은, 매일 투여하는 시판 조성물에 비해 혈중 농도를 유지하는 시간이 지연되어 1주일 지속방출 효과를 보였으며, 부검 결과 본 발명의 조성물에 기인한 독성은 관찰되지 않았다.
[ 실험예 4] 엑세나타이드 (Exenatide) 함유 조성물의 약물동태 시험
실시예 11-13에서 제조한 엑세나타이드 (Exenatide) 함유 조성물의 약물동태 시험을 실시하였다.
S.D. 랫트(190±20g, 5~6주령)를 Charles River Laboratories (Orient, Korea)로부터 공급받았으며, 실험예 1과 동일한 조건 하에서 동물을 관리하였다.
실시예 11의 조성물(400㎍/rat, 800㎍/rat)과 실시예 12 및 13의 조성물(400㎍/rat)을 랫트에 피하주사한 후(n=6), 일정시간 간격으로 혈액을 채취하여 Enzyme immunoassay kit (EK-070-94, Phoenix Pharmaceuticals, Inc.)을 사용하여 혈중 엑세나타이드 농도를 정량하였다. 정량 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 엑세나타이드 함유 조성물은, 1회 투여로 1주일 이상 0.1 ng/mL 이상의 혈중 농도를 유지하였으며, 부검 결과 본 발명의 조성물에 기인한 독성은 관찰되지 않았다.

Claims (20)

  1. 수평균분자량이 7,000 달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00012

    상기 화학식 1에서,
    X 및 X'은 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이고,
    Y 및 Z는 독립적으로 존재하지 않거나 알칼리 금속이며,
    m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,
    a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,
    R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 2의 폴리락트산 유도체 화합물인 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물:
    [화학식 2]
    Figure pat00013

    상기 화학식 2에서,
    X 및 X'은 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이고,
    Y 및 Z는 독립적으로 알칼리 금속이며,
    m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,
    a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,
    R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 3의 폴리락트산 유도체 화합물인 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물:
    [화학식 3]
    Figure pat00014

    X 및 X'은 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이고,
    m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,
    a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,
    R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
  4. 1) 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체와 디카르복시산을 중합하여 양쪽 말단에 카르복시산을 갖는 폴리락트산 유도체를 얻는 단계; 및
    2) 상기 1) 단계에서 얻어진 폴리락트산 유도체를 유기용매에 용해한 후, 여기에 알칼리 금속염 수용액을 첨가하여 폴리락트산 유도체의 염을 얻는 단계;
    를 포함하는, 제2항의 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 유리산 또는 락톤 형태의 락트산 또는 그 유도체가 락트산, 락타이드, 글리콜라이드, 만델릭산, 카프로락톤, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 디카르복시산이 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜리산, 수베르산, 아제라인산(azelaic acid), 세바신산(sebacic acid), 도데칸디오인산(dodecanedioic acid), 푸마르산, 말레인산, 프탈산, 테레프탈산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 알칼리 금속염이 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨, 탄산리튬 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리락트산 유도체 화합물의 제조방법.
  8. 수평균 분자량이 7,000 달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온의 착체(complex).
  9. 제8항에 있어서, 다가 금속이온이 아연, 칼슘, 마그네슘 및 철로 이루어진 군 중에서 선택된 금속의 다가 이온인 것을 특징으로 하는 착체.
  10. i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드,
    ii) 약물 전달체로서 제1항의 폴리락트산 유도체 화합물, 및
    iii) 다가 금속이온
    을 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물.
  11. i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 및
    ii) 약물 전달체로서 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물과 다가 금속이온의 착체(complex)
    를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 활성성분을, 조성물 건조 중량을 기준으로 0.01 내지 60중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 서방형 조성물.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 약물 전달체를 조성물 건조 중량 기준으로 39.9 내지 99.9 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 서방형 조성물.
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 활성성분이 성장 호르몬, 에리스로포이에틴, 단일클론 항체, 과립세포 콜로니 자극인자, 대식세포 콜로니 자극인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, 트롬보포이에틴, 인슐린 유사 성장인자, 상피 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 전이 성장인자, 인터페론, 인터루킨, 종양 괴사 인자, 스트렙토키나제, 유로키니제, 스타필로키나제, 디엔에이즈, 글루코세레브로시다제, 알파 갈락토시다제, 엑세나타이드, 옥트레오타이드, 인슐린, 글루카곤, 황체형성호르몬 분비호르몬, 고세렐린(Goserelin), 루프로렐린(Leuprorelin), 여포자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 퍼티렐린(Fertirelin), 칼시토닌(Calcitonin), 코르티코트로핀 방출 인자(Corticotropin Releasing Factor), 두뇌 나트리유레틱 펩티드 (Brain Natriuretic Peptide), 티모펜틴(Thymopentin), 코르티코트로핀(Corticotropin), 엘카토닌(Elcatonin), 베타 아밀로이드(Beta Amyloid), 트립토렐린(Triptorelin), 부세렐린(Buserelin), 티모신(Thymosin), 소마토스타틴(Somatostatin), 아라렐린(Alarelin), 안지오텐신(Angiotensin), 아르기프레신(Argipressin), 아토시반(Atosiban), 비발리루딘(Bivalirudin), 세트로렐릭스(Cetrorelix), 데스로렐린(Deslorelin), 데스모프레신(Desmopressin), 엘카토닌(Elcatonin), 엔푸비르티드(Enfuvirtide), 엡티피바티드(Eptifibatide), GLP-1, 고난도렐린(Gonandorelin), 리스프레신(Lyspressin), 나파렐린(Nafarelin), 네시리티드(Nesiritide), 옥시토신(Oxytocin), 프람린티드(Pramlintide), 세크레틴(Secretin), 터이파라티드(Teriparatide), 터리프레신(Terlipressin), 테트라코삭티드(Tetracosactide), 바프레오티드(Vapreotide) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 서방형 조성물.
  15. a) i) 활성성분으로서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 및 ii) 제1항의 폴리락트산 유도체 화합물을 함유하는 수용액을 제조하는 단계; 및
    b) 상기 a)단계의 수용액을, 다가금속 이온을 포함하는 수용액에 적가하여 침전물을 얻는 단계;
    를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 활성성분이 성장 호르몬, 에리스로포이에틴, 단일클론 항체, 과립세포 콜로니 자극인자, 대식세포 콜로니 자극인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, 트롬보포이에틴, 인슐린 유사 성장인자, 상피 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 전이 성장인자, 인터페론, 인터루킨, 종양 괴사 인자, 스트렙토키나제, 유로키니제, 스타필로키나제, 디엔에이즈, 글루코세레브로시다제, 알파 갈락토시다제, 엑세나타이드, 옥트레오타이드, 인슐린, 글루카곤, 황체형성호르몬 분비호르몬, 고세렐린(Goserelin), 루프로렐린(Leuprorelin), 여포자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 퍼티렐린(Fertirelin), 칼시토닌(Calcitonin), 코르티코트로핀 방출 인자(Corticotropin Releasing Factor), 두뇌 나트리유레틱 펩티드 (Brain Natriuretic Peptide), 티모펜틴(Thymopentin), 코르티코트로핀(Corticotropin), 엘카토닌(Elcatonin), 베타 아밀로이드(Beta Amyloid), 트립토렐린(Triptorelin), 부세렐린(Buserelin), 티모신(Thymosin), 소마토스타틴(Somatostatin), 아라렐린(Alarelin), 안지오텐신(Angiotensin), 아르기프레신(Argipressin), 아토시반(Atosiban), 비발리루딘(Bivalirudin), 세트로렐릭스(Cetrorelix), 데스로렐린(Deslorelin), 데스모프레신(Desmopressin), 엘카토닌(Elcatonin), 엔푸비르티드(Enfuvirtide), 엡티피바티드(Eptifibatide), GLP-1, 고난도렐린(Gonandorelin), 리스프레신(Lyspressin), 나파렐린(Nafarelin), 네시리티드(Nesiritide), 옥시토신(Oxytocin), 프람린티드(Pramlintide), 세크레틴(Secretin), 터이파라티드(Teriparatide), 터리프레신(Terlipressin), 테트라코삭티드(Tetracosactide), 바프레오티드(Vapreotide) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물을 제조하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 다가 금속이온이 아연, 칼슘, 마그네슘 및 철로 이루어진 군 중에서 선택된 금속의 다가 이온인 것을 특징으로 하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물의 서방형 조성물을 제조하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 a)단계에서
    활성성분 및 제2항의 폴리락트산 유도체 화합물을 물에 용해하여 수용액을 제조하거나,
    먼저 양 말단이 카르복시산인 폴리락트산 유도체 및 알칼리 금속염 수용액을 물에 용해하여 제2항의 폴리락트산 유도체 화합물을 제조하고, 여기에 활성성분을 투입하여 수용액을 제조하거나, 또는
    먼저 양 말단이 카르복시산인 폴리락트산 유도체 및 활성성분을 물에 용해하고, 여기에 알칼리 금속염 수용액을 투입하여 제2항의 폴리락트산 유도체 화합물 및 활성성분을 함유하는 수용액을 제조하여 a) 단계의 수용액을 얻는 것을 특징으로 하는 서방형 조성물의 제조방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 b)단계 이후에, 상기 b)단계에서 얻은 침전물을 원심분리한 후 물로 세척하는 c)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 서방형 조성물의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 c)단계 이후에, 상기 c)단계에서 분리된 침전물을 동결건조하는 d)단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 서방형 조성물의 제조방법.
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