ES2600554T3

ES2600554T3 - Prevención de la reducción del peso molecular del polímero, de la formación de impurezas y de la gelificación en composiciones poliméricas

Info

Publication number: ES2600554T3
Application number: ES04778698.3T
Authority: ES
Inventors: B. C. Thanoo; James Murtagh; Gonto Johns
Original assignee: Oakwood Laboratories LLC
Current assignee: Oakwood Laboratories LLC
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-19
Publication date: 2017-02-09
Anticipated expiration: 2024-07-19
Also published as: DK1660039T3; US20050042294A1; US9017715B2; EP2462923A3; CA2819769C; JP2008518881A; US20160310601A1; US20130165377A1; EP1660039B1; EP1660039A2; WO2005007122A3; EP2462923A2; CA2533314C; US10561734B2; CA2819769A1; US8343513B2; CA2533314A1; JP2011148812A; WO2005007122A2; CA2915574C

Abstract

Una solución de polímero que comprende: un polímero biocompatible y biodegradable, en la que el polímero biocompatible y biodegradable se selecciona entre el grupo que consiste en poli(ácido d,lláctico), poli(ácido l-láctico) o poli (ácido glicólico), o un copolímero de poli(ácido d,l-láctico) o poli(ácido l-láctico) y poli(ácido glicólico), o policaprolactona, o un copolímero de caprolactona con láctido y glicólido, o un copolímero de láctido y glicólido con polietilenglicol, poli(ácido d,l-láctico) con polietilenglicol, y polianhídrido; al menos un ingrediente nucleofílico, en donde el ingrediente nucleofílico es acetato de leuprólida o acetato de octreótido, y una cantidad de un aditivo ácido tal que el polímero de la formulación sea menos susceptible a la reducción del peso molecular en comparación con la formulación sin el aditivo ácido, y en la que el aditivo ácido comprende uno o más ácidos que tienen un pKa de 5,0 o inferior, seleccionándose dichos ácidos entre el grupo que consiste en ácido acético, ácido propanoico, ácido glicólico, ácido glicérico, ácido láctico, oligómeros de ácido láctico terminados en carboxi, oligómeros de ácido glicólico terminados en carboxi o la combinación de estos ácidos en cualquier relación que tenga un peso molecular no mayor de 1000, y en donde la cantidad de aditivo ácido es del 2 % al 50 % en peso del polímero.

Description

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Ahora, en referencia a leuprólida, un agonista de GnRH, como ejemplo, se explican el(los) enfoque(s) requerido(s) para aumentar la solubilidad de la leuprólida a altos niveles en disolventes (es decir, a los niveles normalmente utilizados para preparar formulaciones y microesferas). Leuprólida es más soluble que ornitida en disolventes tales como agua o metanol. Sin embargo, para disolver un alto nivel de leuprólida puede seguirse uno o más de los

5 enfoques que aumentan la solubilidad descritos anteriormente con respecto a la ornitida. En general, añadir una pequeña cantidad de un ácido (un ácido con un pKa bajo) a leuprólida o una leuprólida que contiene DP debe, en su mayor parte superar la solubilidad y los problemas de gelificación. De esta manera, cuando se utilizan agonistas criodesecados de GnRH como materia prima puede seguirse, aunque no es imprescindible, un determinado orden de adición de componentes para preparar la fase dispersa.

En el contexto de análogos de GnRH tales como leuprólida, una cantidad traza de anión polivalente en el material de partida de la leuprólida puede inducir también problemas de precipitación/gelificación/solubilidad de la leuprólida, independientemente del nivel de leuprólida, en fase dispersa o incluso en una solución de disolventeleuprólida sencilla (metanol o DMSO). Dicha insolubilidad inducida por impurezas puede superarse eliminando aquellos iones

15 que utilizan agentes tales como EDTA u otros agentes quelantes adecuados. El mismo procedimiento puede aplicarse a análogos de GnRH que son antagonistas.

Las formulaciones de liberación sostenida descritas en el presente documento pueden utilizarse para aplicaciones humanas, así como para animales no humanos, tales como perros, cerdos, monos, ratas, ratones, conejos y otros animales.

Ejemplo(s)

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Los ejemplos siguientes se llevan a cabo

25 utilizando técnicas normalizadas, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, excepto cuando se describen en detalle de otra forma. Los ejemplos son ilustrativos.

A. Reducción del peso molecular de la matriz de poliéster y su control en la fase dispersa preparada con metanol

Se llevó a cabo la reducción del peso molecular en el blanco y un péptido que contenía la fase dispersa preparada usando metanol como disolvente y el control de la reducción del peso molecular como se detalla a continuación:

1. Leuprólida como péptido en la fase dispersa

35 Se estudió el control de la reducción del peso molecular del PLGA en la fase dispersa (DP) con leuprólida o sin leuprólida (es decir, blanco). La DP es una solución de PLGA o PLA en disolventes. Se utilizaron los siguientes materiales y procedimientos para demostrar el control de la reducción del peso molecular del PLGA en la fase dispersa.

Acetato de leuprólida, Lote n.º FLEUP 9905 (Bachem, CA); RG503H, Lote n.º 290103 (Boehringer Ingelheim); RG503, Lote n.º 1002249 (Boehringer Ingelheim); Ácido láctico, Lote racémico n.º (Sigma) con un contenido de agua del 10 % o menor, conseguido mediante una solución de secado al 8590 % en una cámara desecadora al vacío durante un día; ácido glicólico, 98 %, Calidad ultra, Lote n.º 118H3449 (Sigma); Oligómero, obtenido degradando RG502H Lote n.º 34035 (BI) mediante una temperatura y humedad superiores (este era un líquido de color amarillo

45 oscuro viscoso y el peso molecular mediante GPC mostró un Mw= 533 y Mn= 393); dimetil sulfóxido (DMSO), Lote n.º CC939 (Burdick & Johnson); Dimetilacetamida (DMAc), Lote n.º CS08952AS (SigmaAldrich); Diclorometano (DCM), calidad HPLC, Lote n.º BZ200 (Burdick & Johnson); metanol (MeOH), calidad HPLC, Lote n.º CE075 (Burdick & Johnson); Tetrahidrofurano (THF), calidad HPLC, Lote n.º BW062, (Burdick & Johnson).

Procedimiento GPC: Las muestras de la DP se diluyeron con THF y se evaluaron para el peso molecular mediante el procedimiento GPC. Específicamente, la fase dispersa se diluyó adecuadamente con THF para conseguir la concentración de PLGA a aproximadamente 10 mg/ml. Leuprólida no es soluble en THF y precipitará. Incluso si la solución aparecía trasparente, las muestras de GPC se filtraron siempre a través de un filtro con jeringa PTFE de 0,45 micrómetros antes del análisis. Se descartaron las primeras muestras de pocos ml.

55 Las columnas utilizadas en el procedimiento eran Waters, Styragel HR2, 30 x 100 mm, Para MW 50020.000, Lote n.º T11991, Pieza n.º WAT045865 y Waters, Styragel HR4, 30 x 100 mm, Para MW 5000500.000, Lote n.º T13211, Pieza n.º WAT045865 conectado en serie. La temperatura de las columnas era de 35 ºC. Se usó THF (100 %) como fase móvil. El caudal era de 0,4 ml/min. El detector utilizado era un detector de índice de refracción eran patrones de poliestireno con una distribución de pesos moleculares estrecha procedentes de Polymer Laboratories Inc, Amherst, MA. Los patrones de poliestireno usados tenían un MW 283.300, MW 68.900, MW 21.000, MW 4920, y MW 1260.

Extracción del péptido procedente de la DP: Se extrajo el acetato de leuprólida de la fase dispersa tras diluir la DP con DCM. Hasta aproximadamente 50 mg de DP, se añadieron 2 ml de DCM y se añadieron 9 ml de tampón acetato 65 0,1 M, pH 4. Se mezcló el contenido durante aproximadamente 1 hora utilizando una rueda giratoria. A continuación se centrifugaron los contenidos para obtener una fase acuosa exenta de gotículas de DCM para el ensayo de HPLC.

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viales precintados. Después de 24 horas, se evaluaron el peso molecular del polímero y la pureza de la octreotida. En la Tabla 8 se muestran el peso molecular del polímero en diversas muestras de DP y el cambio tras el almacenamiento.

Tabla 8: Valores del Mw de PLGA en la DP

Componentes de la DP: Mw inicial 25 ºC24 Horas 40 ºC24 Horas

Mw: % de cambio en el Mw Mw % de cambio en el Mw

RG503H + DCM + Octreotida+ MeOH: 42512 14539 65,8 7085 83,3

RG503H + DCM + MeOH + Octreotida + G.AA: 45061 16931 62,4 7222 84,0

RG503H + DCM + MeOH + Octreotida + G.AA + PA: 47509 23952 49,6 10353 78,2

RG53H + DCM + MeOH + Octreotida + LA: 51207 31317 38,8 14869 71,0

RG503H + DCM + MeOH + Octreotida + GA: 49888 33026 34,8 16018 67,9

RG503H + DCM + MeOH Octreotida +Oligómero: 50427 31594 37,4 16363 67,6

Como se muestra en la Tabla 8, se produjo una considerable reducción en el peso molecular del polímero en la DP que contenía la octreotida sin el(los) ácidos.

10 Se muestra en la Figura 4 una comparación del cambio del Mw del PLGA en blanco y la DP de la octreotida almacenada a 25 ºC y la Figura 5 es una comparación del cambio del Mw del PLGA en blanco y la DP de la octreotida produjo la reducción del peso molecular en el PLGA, y la presencia de ácidos fuertes incluso en pequeñas cantidades controló la reducción del peso molecular. A 25 ºC, los aditivos ácidos (ácido láctico, ácido glicólico, y los ácidos oligoméricos) ayudaron en la reducción del peso molecular de PLGA inducida por leuprólida. A 40 ºC, la

15 reducción del Mw del PLGA en la leuprólida que contiene la DP era muy alta incluso en presencia de los aditivos ácidos.

B. Reducción del peso molecular de la matriz de poliéster y su relación con la formación del aducto del polímero peptídico en la DP

20 La reducción del peso molecular de PLGA en la DP que contenía un péptido con grupo(s) nucleofílico(s) condujo al aumento proporcional en la formación de aductos entre el péptido y el material polimérico (denominado también en el presente documento sustancia relacionada o los conjugados). 1. DP de leuprólida

25 Se analizó la leuprólida extraída de la DP incubada mediante HPLC para determinar el contenido de aductos. Se observaron aductos múltiples procedentes de diferentes fragmentos de PLGA. Estos aductos se eluyeron después del pico de leuprólida. En la Tabla 9 se muestra el contenido de sustancia relacionada con la leuprólida en las muestras de DP incubadas.

30 Tabla 9: Contenido de sustancia relacionada con la leuprólida en las muestras de DP incubadas

Componentes de la DP: Inicial 25 ºC durante 24 horas 40 ºC durante 24 horas

RG503H + Leuprólida + DCM + MeOH: 0 1,19 5,23

RG503H + Leuprólida + DCM + MeOH + G.AA: 0,05 0,35 2,18

RG503H + Leup + DCM + MeOH + LA: 0,05 0,15 0,63

RG503H + Leup + DCM + MeOH + GA: 0,05 0,15 0,46

RG503H + Leup + DCM + MeOH + Oligomer: 0,05 0,15 0,93

Aunque la DP que contiene el ácido acético glacial como aditivo ácido ralentizó la formación de la sustancia relacionada, la DP que contiene el ácido láctico o el ácido glicólico mostró una reducción considerable en la formación de la sustancia relacionada. Asimismo, se observó una relación evidente entre la reducción del peso

35 molecular y la formación de sustancias relacionadas como se ilustra en la Figura 3. Específicamente, se observó un aumento exponencial en la formación de la sustancia relacionada al de la reducción del peso molecular.

2. Octreotida DP

40 La formación de impurezas debido al ataque nucleófilo de los péptidos de PLGA es otro problema, que afecta a la calidad de las microesferas que contienen el péptido. Se analizó el octreótido extraído de la DP incubada mediante HPLC para determinar el contenido de aductos. Se había demostrado anteriormente que estos aductos se eluyen después del pico de octeotrida, y que existirán múltiples aductos formados a partir de diferentes fragmentos de PLGA que interactúan con los dos grupos amino reactivos, el grupo terminal DPhe y la lisina. Más adelante en el

45 presente documento, testas impurezas hidrófobas se denominarán sustancias relacionadas con octreotida.

Las muestras de DP mostradas en la Tabla 7, incubadas a 25 ºC y 40 ºC, se analizaron para determinar el contenido de sustancias relacionadas, que se comparó con las muestras iniciales sin incubación. Los datos comparativos se

muestran en la Tabla 10 siguiente. Tabla 10: Contenido de sustancias relacionadas con la octreotrida en las muestras de DP incubadas

RG503H + DCM + Octreotida+ MeOH: 0 13,95 47,59

RG503H + DCM + MeOH + Octreotida + G.AA: 0 3,04 23,30

RG503H + DCM + MeOH + Octreotida + G.AA + PA: 0 0,95 8,10

RG53H + DCM + MeOH + Octreotida + LA: 0 1,24 4,31

RG503H + DCM + MeOH + Octreotida + GA: 0 0,99 2,68

RG503H + DCM + MeOH Octreotida +Oligómero: 0 0,22 6,04

5 La Figura 6 muestra la relación entre la reducción del Mw en PLGA y la formación de la sustancia relacionada. Existe una relación entre la formación de las sustancias relacionadas y la reducción del peso molecular. La inclusión de ácidos de pKa bajo ayuda a reducir las sustancias relacionadas.

C. Microesferas preparadas a partir de la DP incubada con y sin un aditivo ácido

10 Como se muestra anteriormente, el peso molecular del PLGA y la pureza de la leuprólida se vieron afectadas por el almacenamiento de la DP a 25 ºC.

Se muestra aquí el efecto del almacenamiento de la DP sobre la carga de fármaco y la eficacia de encapsulamiento

15 del fármaco. Se prepararon dos fases dispersas. Véase, Tabla 6: Poco después de la preparación de la fase dispersa, se retiraron aproximadamente 0,125 g para hacer un seguimiento del Mw del PLGA y se retiraron aproximadamente 0,025 g para hacer un seguimiento de la pureza de la leuprólida. La DP restante se colocó a 30 ºC durante 16 horas (durante la noche) en un recipiente precintado. Después del almacenamiento, se retiró una parte pequeña de la DP para determinar el Mw del PLGA y la pureza de la leuprólida como se llevó a cabo inicialmente. La

20 DP restante se sometió a las formulaciones de las microesferas.

Tabla 11: Formulaciones en fase dispersa para las microesferas de leuprólida

Componente: Leup DP Leup DP + LA

RG503H: 4,12 g 4,11 g

acetato de leuprólida,: 0,99 g 0,99 g

DCM: 18,93 g 18,74 g

MeOH: 5,27 g 5,27 g

Ácido láctico: 0 0,114 g

% de ácido láctico basado en el peso de RG503H: N.A. 2,7 %

Tabla 12: Propiedades de la DP antes y después del almacenamiento

Propiedad: Leup DP Leup DP + LA

Mw inicial: 46585 46128

Sustancias relacionadas con la leuprólida inicial: 0 0

Mw después del almacenamiento: 14326 28359

% de reducción en el Mw: 69,2 % 38,5 %

Sustancias relacionadas con la leuprólida tras el almacenamiento: 0,53 0

Como se muestra en la Tabla 12, ambas formulaciones de la DP mostraron un peso molecular más bajo para la PLGA pero la presencia de ácido láctico en la DP disminuyó la reducción del peso molecular, y evitó la formación de 30 las sustancias relacionadas.

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De esta manera, la reducción del Mw inducida por metanol fue mucho mayor en comparación con la reducción del Mw inducida por acetato de leuprólida.

Se siguieron también las muestras de DP para la formación de la sustancia relacionada. Tabla 19 compara la sustancia relacionada formada en la DP que contiene DMSO incubada durante 24 horas.

Tabla 19: Formación de la sustancia relacionada en la DP de leuprólida que contiene DMSO

Inicial: 25 ºC durante 24 horas 40 ºC durante 24 horas

RG503H + Ac.Leup. + DCM + DMSO: 0 3,00 18,55

RG503H + Leuprólida + DCM + DMSO + G.AA10: 1,39 8,46

RG503H + Leuprólida + DCM + DMSO + G.AA20: 0,98 6,49

RG503H + Leup + DCM + DMSO + LA1: 0 0,34 1,80

RG503H + Leup + DCM + DMSO + LA2: 0 0 1,48

RG503H + Leup + DCM + DMSO + GA1: 0 0 0,56

RG503H + Leup + DCM + DMSO + GA2: 0 0 0,24

RG503H + Leup + DCM + DMSO + Oligómero1: 0 0,18 1,61

RG503H + Leup + DCM + DMSO + Oligómero2: 0 0,28 1,15

Como se muestra en la Tabla 19, La DP sin aditivo ácido produjo una cantidad mayor de la sustancia relacionada en

10 presencia de DMSO. La reducción del Mw fue menor en la DP que contenía DMSO, debido a que la escisión del enlace éster fue solo mediante acetato de leuprólida. La escisión del enlace éster inducida por acetato de leuprólida podría estar asociada con la formación de la sustancia relacionada. El metanol puede estar compitiendo con el acetato de leuprólida por la escisión del enlace éster produciendo por tanto menos sustancia relacionada. Asimismo, existe una posibilidad de que el metanol puede estar convirtiendo posteriormente la sustancia relacionada con

15 leuprólida en leuprólida. La presencia de una pequeña cantidad de ácido redujo notablemente la formación de sustancias relacionadas. No se observó relación entre la reducción en el Mw y la formación de péptido relacionado en presencia de f DMSO en la DP.

E. Microesferas con dp que tienen metanol o dmso

20 Se prepararon microesferas de PLGA cargadas con acetato de leuprólida mediante un procedimiento de extracción del disolvente. En resumen, se disolvieron acetato de leuprólida (0,3 g) y ácido acético (0,15 g) tanto en MeOH (1,8 g) como en DMSO (1,8 g). A continuación se combinaron las soluciones con una solución que contenía polímero (2,7 g de RG503H) en DCM (9 g). Las muestras de DP preparadas de esta manera se almacenaron en

25 recipientes precintados a 25 ºC durante 24 horas.

Se prepararon las microesferas dispersando las formulaciones de la DP en una solución acuosa que contenía 0,35 % (p/vol) de poli(alcohol polivinílico) (fase continua (CP) utilizando un homogeneizador tal como un homogeneizador (Silverson Machines, Waterside Reino Unido). La suspensión de microesferas formada de esta

30 manera se transfirió a un recipiente de eliminación de disolvente de 3 litros para completar la eliminación del disolvente. A continuación, el precipitado se filtró, se lavó y se secó durante la noche a temperatura ambiente.

Se prepararon dos lotes de microesferas que contenían leuprólida utilizando RG503H, con metanol) en la fase dispersa, y con DMSO en la fase dispersa. La DP que contenía el metanol se preparó mezclando una solución de 35 2,7 g de RG503H en 9 g de DCM, y una solución de 0,3 g de acetato de leuprólida (puro) en 0,15 g de ácido acético glacial y 1,8 g de metanol.

La DP que contenía el DMSO se preparó mezclando una solución de 2,7 g de RG503H en 9 g de DCM, y una solución de 0,3 g de acetato de leuprólida (puro) en 0,15 g de ácido acético glacial y 1,8 g de DMSO.

40 Las muestras de DP preparadas de esta manera se almacenaron en un recipiente precintado a 25 ºC durante 24 horas. Se preparó el lote de microesferas BT040303 utilizando la DP que contiene metanol que se almacenó durante 24 horas, y se preparó el lote de microesferas utilizando la DP que contiene metanol que también se había almacenado durante 24 horas.

45 Se prepararon microesferas dispersando la DP en una CP de 1,5 litros que es una solución de PVA al 0,35 %. Se consiguió la dispersión utilizando un homogeneizador Silverson, agitando a 5000 RPM. Mientras se agitaba la CP, se administró la DP, exactamente por debajo de la cabeza del homogeneizador. La suspensión de microesferas formada de esta manera se transfirió a un biorreactor encamisado de 3 litros (Applikon) agitando a 800 RPM. Se

50 calentó la suspensión a 40 ºC con un barrido de aire para la eliminación completa de DCM. La suspensión se enfrió posteriormente a temperatura ambiente, se filtró, se lavó con abundante agua, y se secó durante la noche al vacío a temperatura ambiente. Las propiedades de los dos lotes de microesferas fueron como se muestra en la Tabla 20 siguiente.

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Tabla 20 Propiedades de las microesferas.

Propiedad: BT040303 GJ040303

Componentes en la DP: DCM, MeOH, Acetato de leuprólida, RG503H, Ácido acético glacial DCM, DMSO, Acetato de leuprólida, RG503H, Ácido acético glacial

Carga diana del acetato de leuprólida en la microesfera: 10 % 10 %

Contenido real de leuprólida en el ensayo: 8,506 ± 0,002 9,093 ± 0,002

Eficacia de encapsulación del fármaco, %: 85 % 91 %

% de sustancia relacionada en la microesfera: 1,83±0,28 1,39±0,04

Peso molecular del polímero en la microesfera: Pm: 18983 Mn: 7771 Pm: 35789 Mn: 15690

% de Rendimiento: 77 % 71 %

Densidad a granel g/ml: 0,82 0,41

Nota: el peso molecular (Mw) del polímero bruto RG503H utilizado para los lotes era: 40812 y el Mn: 19491.

Las microesferas preparadas con DMSO y metanol en la DP tuvieron buena eficacia de encapsulación del fármaco. La densidad a granel de la microesfera preparada con DMSO es mayor, debido probablemente a que el DMSO es 5 un buen disolvente para el polímero, que no da lugar a que el polímero precipite en las gotículas de la DP.

Se prepararon ambos lotes de microesferas de una DP que contenía ácido acético glacial. Por tanto, la cantidad de sustancias relacionadas en la microesfera es comparativamente baja, incluso aunque estas microesferas se preparen con la DP almacenada (comparar con la Tabla 13).

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F. Microesferas 1 de octreotida.

1. Preparación de las microesferas

15 Se prepararon microesferas de PLGA y PLA cargadas con acetato de octreotida mediante un procedimiento de extracción del disolvente En resumen, se disolvió acetato de octreotida en metanol, y se combinó con una solución de polímero/cloruro de metileno. A continuación se dispersó la mezcla posterior de octreotida/polímero (fase dispersa) en una solución acuosa que contenía alcohol polivinílico al 0,35 % (p/vol.) (Fase continua (CP) utilizando un homogeneizador tal como un homogeneizador Silverson (Silverson Machines, Waterside Reino Unido). La

20 suspensión de microesferas formada de esta manera se transfirió a un recipiente de eliminación de disolvente de 3 litros para completar la eliminación del disolvente. A continuación, el precipitado se filtró, se lavó y se secó durante la noche a temperatura ambiente.

Se prepararon diversas microesferas de octreotida a partir de una fase dispersa transparente que contenía el

25 polímero, octreotida, cloruro de metileno (DCM) y metanol. Se obtuvo acetato de octreotida de Polypeptide Laboratories o Peninsula Lab. Se varió la concentración del polímero en los lotes para obtener un tamaño de partícula adecuado y también para obtener una carga del fármaco eficaz. Se aumentó la relación del metanol (MeOH) a DCM preparando a la vez lotes de carga de fármaco mayores para conseguir una fase dispersa trasparente. La fase continua era una solución de PVA al 0,35 % en todas las preparaciones. En una preparación

30 típica, se introdujo la CP en un vaso de precipitados y se agitó utilizando un homogeneizador Silverson (filtro emulsionante normalizado). A la CP en agitación, se añadió la fase dispersa exactamente por debajo de la cabeza Silverson utilizando una jeringuilla de laboratorio con una aguja doblada. Después de 30 s a 1 minuto de homogeneización, se transfirió toda la suspensión a un biorreactor Applikon de 3 litros para la eliminación del disolvente. La eliminación del disolvente de la microesfera se consiguió mediante la sustitución de la CP inicial con

35 agua seguido por el calentamiento de la suspensión a 40 ºC junto con un barrido de aire. Después de la eliminación del disolvente se recogieron las microesferas en un filtro de membrana, se lavaron y se secaron al vacío.

Se prepararon un tamaño de lote de 3g y superior mediante un proceso de flujo continuo. La fase dispersa y la CP se administraron en una mezcla en línea, mientras que se recogió la suspensión de microesferas con agitación en

40 un biorreactor Applikon y se llevó a cabo la eliminación del disolvente como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.945.126. Los parámetros de preparación de las microesferas de octreotida fueron como se resume en la Tabla 21.

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2. Aductos de péptidopolímero (o sustancias hidrófobas relacionadas) en las microesferas que contienen el fármaco de octreotida.

Se determinó el contenido del fármaco disolviendo las microesferas secas en DCM y extrayendo el fármaco en

5 tampón acetato, pH 4,0. El extracto procedente de la mayoría de lotes de microesferas mostró impurezas hidrófobas (hidrófobas en comparación con la octreotida) en cantidad variable. Se encontró que la incubación de estas microesferas a una temperatura de 37 ºC en tampón fosfato a pH 7,4 potenció estas impurezas, especialmente las procedentes de un polímero PLGA50:50 La estructura de las sustancias hidrófobas relacionadas se determinó mediante HPLCEM/EM. Se analizó el extracto de octreotida procedente de las microesferas RG503H que se había

10 incubado a 37 ºC durante dos semanas en tampón fosfato a pH 7,4. La Figura 7 muestra el cromatograma de HPLC del extracto de octreotida con identidad de picos. El cromatograma de HPLC del fármaco extraído mostró picos adicionales que aparecían después del pico de octreotida.

La Tabla 22 relaciona la estructura de las sustancias relacionadas. La mayoría de los picos son sustancias

15 relacionadas formadas con un segmento de glicólido. Resulta evidente a partir de estos análisis que el PLGA con más contenido de glicólido produjo más impurezas. El nivel de impurezas totales que se encuentra en cada uno de los lotes (es decir, la suma de las sustancias relacionadas eluidas después del pico de octreotida) se relaciona en la Tabla 23.

20 Tabla 22: La estructura de las sustancias relacionadas identificadas en la Figura 7

N.º Pico, según HPLC (Véase, Fig. 1): Estructura

1: HDPheCysPheDTrpLysThrCysThrol (Octreotida)

2: HDPheCysPheDTrp[Lys+G]ThrCysThrol

3a: HDPheCysPheDTrp[Lys+G-G]ThrCysThrol

3b: HDPheCysPheDTrp[Lys+L]ThrCysThrol

4: HDPheCysPheDTrp[Lys+G-G-G]ThrCysThrol

6: HDPheCysPheDTrp[Lys+L-G]ThrCysThrol

7: HDPheCysPheDTrp[Lys+L-L]’ThrCysThrol

8: HD[Phe+G]CysPheDTrpLysThrCysThrol

9: HD[Phe+G]CysPheDTrp[Lys+G]ThrCysThrol

11: HD[Phe+G]CysPheDTrp[Lys+G-G]ThrCysThrol

Tabla 23. Porcentaje de sustancias relacionadas eluidas después del pico de octreotida en HPLC

Lote: Polímero % de láctido Mw (Aprox) Carga diana % % Impurezas totales N.º ácido

BT021799: RG504H 50 41.000 11 7,91 5,9

BT020999: RG503 50 32.000 11,1 14,03 0,5

BT120798: RG503H 50 30.000 11,1 6,71 7,4

BT011599: RG503H 50 30.000 16,0 10,99 7,4

MG091099: RG503H 50 30.000 13,0 9,24 7,4

MG092299: RG503H 50 30.000 15,0 11,73 7,4

GJ042800: RG503H 50 30.000 11,1 7,21 7,4

GJ032400: 50:50DL2.5A 50 24.000 10 5,88 15,2

GJ033100: 50:50 DL2.5A 50 24.000 16 10,11 15,2

BT121198: RG502H 50 8.500 13,0 1,38 29,3

GJ051600: RG502H 50 8.500 10 0,92 29,3

GJ032800: 75:25DL3A 75 39.000 20 11,38 6,7

GJ032700: 75:25DL2.5A 75 24.000 12 7,98 11,0

GJ040500: 75:25DL2.5A 75 24.000 16,5 8,35 11,0

GC122001: 7525DL2A 75 12.000 12,5 1,76 14,8

MG090899: PLGA75:25H 75 14.000 13,0 2,87 14,0

GJ050100: PLGA85:15 85 17.000 11 3,73 9,4

GJ040300: 85:15DL2A 85 14.000 13 0,65 19,2

GJ042700: 85:15DL2A 85 14.000 10,0 0,1 19,2

GJ051100: 85:15 DL2A 85 14.000 15 1,96 19,2

GJ050300: 90:10 PLGA 90 6500 11 0,15 31,0

GJ050900: 100DL2A 100 14.000 14 0,54 22,2

GJ050800: PLA iv 0.11 100 7000 11 0,23 19,9

3. Efecto del peso molecular de PLGA sobre las sustancias relacionadas en microesferas de octreotida

Se ha demostrado el efecto del peso molecular sobre la formación de sustancias relacionadas utilizando microesferas de octreotida con PLGA 50:50 y PLGA 75:25. Las cargas dianas de estos lotes fueron similares. Se observó una relación entre el peso molecular del polímero y el nivel de las sustancias relacionadas. Véase la Figura

imagen17

Tabla 26: Porcentaje de sustancias relacionadas que se encuentran durante diversas etapas de la formación de microesferas

Etapa de preparación: Tiempo para la formación de DP, min % Sustancias relacionadas

Fase dispersa (antes de formar MS): 0 0,30

Poco después de la formación de MS: 5 1,78

Después del intercambio con agua a TA: 25 2,61

Tras rampa de calentamiento: 74 4,55

30 minutos de eliminación de disolventes: 104 6,02

60 minutos de eliminación de disolventes: 134 6,58

Microesfera final: 181 7,21

Fase dispersa (almacenada a 40 ºC durante 4 horas): 240 2,64 o 5,07

Las sustancias relacionadas formadas procedían del proceso de preparación de microesferas. En la fase dispersa

5 solo se encontró una pequeña cantidad de sustancias relacionadas (0,3 %). Poco tiempo después de que se formaran las microesferas, las sustancias relacionadas aumentaron al 1,78 %. Hubo un aumento en las sustancias relacionadas calentando la suspensión a 40 ºC y durante la eliminación del disolvente se formaron más sustancias relacionadas. Almacenar la fase dispersa a 40 ºC aumenta las sustancias relacionadas desde el 0,3 % al 2,86 % o más. Se estudiaron también los tiempos de retención y los niveles individuales de las sustancias relacionadas (no se

10 muestran los datos).

10. Efecto de la adición de ácidos a la fase dispersa sobre la formación de sustancias relacionadas

A 1,5 mg de octreotida se añadieron 20 mg de PLGA/PLA y se disolvieron en 0,5 ml de DCM y 0,1 ml de metanol. A

15 esto, se añadieron 10 mg de ácido acético glacial, trietilamina, 85 % de ácido láctico, ácido glicólico o ácido esteárico. Se colocaron las muestras a 40 ºC durante un periodo de 24 horas y 48 horas, seguido de la adición a la muestra de 2 ml de DCM y se extrajo el fármaco en tampón acetato 0,1 M y se evaluó mediante HPLC. En la Tabla 27 se relacionan las muestras incluidas en el estudio.

20 En la Figura 12 se muestran las sustancias hidrófobas relacionadas que se encuentran en estas muestras después de un periodo de 24 y 40 horas. La elución de la muestra del control mostró sustancias que son impurezas (2,5 %) pero no las sustancias relacionadas, y unas pocas de aquellas impurezas se encontraron también en el patrón de octreotida. La presencia de RG503H aumentó las sustancias relacionadas a 47 %. Una repetición del estudio de RG503H mostró hasta un 18 % de sustancias relacionadas en 48 horas de incubación. La presencia de ácido láctico

25 en el sistema RG503H redujo las sustancias relacionadas y las hizo comparables a las del control El ácido glicólico evitó también la formación de sustancias relacionadas en el sistema de la octreotida RG503H. El ácido acético y el ácido esteárico fueron menos eficaces que los ácidos láctico y glicólico en la reducción de la formación de las sustancias relacionadas en la mezcla de octreotida RG503H.

30 En el experimento en el que se incubaron RG503H y octeotrida en DCM/ metanol durante 24 y 48 horas, se añadió ácido láctico y la incubación continuó durante otras 24 horas. Se extrajo el fármaco mediante el procedimiento usual. Mediante este proceso, el ácido láctico no tiene ningún efecto en la reducción de las sustancias relacionadas ya que estas se produjeron ya en el sistema antes de la incorporación del ácido láctico. Esto muestra que la presencia de ácido láctico inicialmente en la fase dispersa evitó la cantidad de sustancias relacionadas. Sin embargo, la posterior

35 adición no convertirá las sustancias relacionadas en el fármaco nativo. RG503 mostró un nivel de sustancias relacionadas muy alto después de 48 horas de incubación. Los poli(ácido láctico), PLA iv 0.11 y R203H y también PLGA 85:15 mostraron muy pocas sustancias relacionadas incluso menores que el control. La presencia de trietilamina produjo algunas impurezas, sin embargo, no muestra similitud con la sustancia relacionada debido al tiempo de retención. TEA con RG503H produjo una enorme cantidad de sustancias relacionadas con RG503H, y en

40 una extensión menor con PLA iv 0.11. De esta manera, se ha demostrado que la adición de ácidos inicialmente en la fase dispersa reduce la cantidad de sustancias relacionadas.

Tabla 27. Estudio de cribado para evaluar las condiciones de sustancias relacionadas con octeotrida

n.º: Código Composición Nota

1: Control Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

2: Control + LA Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)+ 85 % de ácido láctico (10 ml)

3: RG503H RG503H (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

4: RG503H+LA RG503H (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + 85 % de ácido láctico (10 ml)

5: RG503H+AA RG503H (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + Ácido acético glacial (10 ml)

6: RG503H+GA RG503H (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + Ácido glicólico (10 mg) II

7: RG503H+SA RG503H (20 mg) + + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + Ácido esteárico (10 mg)

8: SA Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + Ácido esteárico (10 mg)

9: RG503H40+LA+40 RG503H (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + 85 % de ácido láctico (10 ml) III

10: RG503 RG503 (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

11: PlA 0.11 PlA IV 0,11 (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

12: PlA 0,11+TEA PlA IV 0,11 (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + Trietilamina (40 ml) IV

13: 85:15 PlGA PlGA 85:15 (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

14: R203H R203H (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

15: RG503H+TEA RG503H (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + Trietilamina (10 ml)

16: TEA Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml) + Trietilamina (10 ml)

17: Policarbonato Policarboxilato (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

18: Polisulfona Polisulfona (20 mg) + Octreotida (1,5 mg) + DCM (0,5 ml) + MeOH (0,1 ml)

Nota: II: GA fue solamente parcialmente soluble en la fase dispersa incluso a 40 ºC, III Al extracto preparado como el n.º 3, se añadieron 10 ml de ácido láctico al 85 % y se incubó adicionalmente a 40 ºC durante 24 horas. IV: Cuatro veces la cantidad en n.º 16 y n.º 17, ya que el grupo terminal ácido del polímero es grande y neutralizará parte del TEA.

Tabla 28: Propiedades de las microesferas utilizadas para la incubación in vivo

11. Formación del péptido relacionado con octreotida durante la incubación in vivo

Las microesferas analizadas se prepararon con RG503H (GJ091001), 8515DL1AP (GJ031401) y 100DL1AP (GJ012401). Se usaron como blanco microesferas sin octeotrida en el estudio. Las propiedades de las microesferas se muestran en la Tabla 28.

GC091001: GJ031401 GJ012401

Polímero: RG503H 8515DL1AP 100DL1AP

Número de ácido del polímero: 7,4 13,6 21,5

Carga diana: 11 % 11 % 10 %

Método para fabricar MS: Proceso O/W Proceso O/W Proceso O/W

Carga de fármaco: 8,5 % 10,2 % 8,5 %

10 Estas microesferas se inyectaron en ratas por vía subcutánea y se recuperaron en un momento adecuado. En este ejemplo de trabajo, se suspendieron 100 a 250 microesferas en 0,3 a 0,5 ml de diluyente consistente en manitol al 6 %, carboximetilcelulosa al 0,5 % y Tween 80 al 0,1 % en agua. Se inyectó la suspensión en la región subcutánea de las ratas, en el sitio marcado con un marcador permanente, En un punto temporal adecuado, se sacrificaron las ratas, y las microesferas procedentes de los sitios de inyección se escindieron y se criodesecaron. Posteriormente,

15 se disolvieron las partículas en una mezcla de 2 ml de dimetilsulfóxido y 2 ml de DCM, y se extrajo añadiendo 6 ml de tampón acetato 0,1 M a pH 4,0. Se evaluaron los extractos mediante HPLC para el fármaco puro y la sustancia relacionada, y se confirmaron mediante un espectrofotómetro de masas. El control (microesferas blancas) no muestra ningún pico mediante HPLC.

20

imagen18

PLGA y el PLGA con un mayor contenido de láctido. La formación de la sustancia relacionada redujo considerablemente las microesferas de 85:15PLGA y PLA mientras que las microesferas basadas en PLGA 50:50 siguieron mostrando sustancia relacionada.

5 13. Formación de sustancias hidrófobas relacionadas mediante el procedimiento de extracción de fármacos

El procedimiento de extracción de fármacos no produce las sustancias hidrófobas relacionadas. Para mostrar esto, se mezcló aproximadamente 1 mg de acetato de octreotida con 10 mg de polímero (R203H, R202H, PLA 0.11, PLGA 90:10 (iv 0.11), PLGA 85:15DL2A, PLGA 75:25H (BI), RG504H y RG503H). A la mezcla, se añadieron 2 ml de 10 acetonitrilo/agua (9:1) y se disolvió el contenido completo. Se obtuvo una solución trasparente en todos los casos. A esta se añadieron 8 ml de tampón acetato (0,1 M, pH 4,0) y se mezcló bien durante 10 minutos. La solución turbia se filtró a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0,45 micrómetros y se evaluó mediante HPLC. Se incluyeron también controles sin fármaco y sin polímero en el estudio. No se encontraron sustancias hidrófobas relacionadas en el extracto. La recuperación del fármaco fue ligeramente superior al 100 % (los valores reales fueron 101103 %) lo

15 que muestra que no hubo pérdidas de fármaco y prueban también que el método de recuperación del fármaco da como resultado un valor preciso (no se muestran los datos

14. Estabilidad en almacenamiento

20 Para demostrar la estabilidad durante el almacenamiento de las microesferas de PLGA que contienen octreotida, se prepararon lotes de microesferas con 85:15PLGA y 50:50 PLGA y se almacenaron en condiciones de temperatura diferentes.

En la Tabla 32 se proporcionan las propiedades del polímero, la composición de la fase dispersa y las propiedades 25 de las microesferas.

Tabla 32: Propiedades del polímero, solución de polímero y microesferas

GC 100903: GC111703

Propiedades de los polímeros: Composición de comonómero 85 % de láctido 15 % de glicólido 50 % de láctido 50 % de glicólido

Mw del polímero: 10 kDa 30 kDa

Número de ácido: 17,2 7,4

Composición de la fase dispersa: Polímero en la DP, % 33,88 16,47

Acetato de octreotida en la DP, %: 3,76 1,24

Cloruro de metileno en la DP, %: 53,01 70,14

Metanol en la DP, %: 5,33 7,02

Ácido acético glacial en la DP, %: 4,02 5,08

Fármaco diana en la microesfera, %: 10 7

Propiedades de la microesfera: Carga de fármaco en la microesfera, % 7,82 5,65

Eficacia de encapsulación, %

% Impurezas (totales): Ninguna detectada 3,4

Densidad a granel, g/ml: 0,61 0,72

Tamaño de partículas, Vol. dest

10 % bajo: 4,17 2,82

25 % bajo: 10,3 11,94

50 % bajo: 23,9 26,32

75 % bajo: 37,8 38,99

90 % bajo: 46,8 49,04

La microesfera GC100903 preparada a partir de 85:15 PLGA que tiene un número de ácido 17,2 no muestra ninguna

30 impureza, mientras que GC111703 preparada a partir de 50:50 PLGA que tiene un número de ácido de 7,4 mostró un 3,4 % de impureza inicial, a pesar de la carga diana más baja. Estas microesferas se sometieron a análisis de estabilidad durante el almacenamiento y se compararon con la microesfera de octreotida comercial, Sandostatina LAR. Las microesferas se almacenaron a 20 ºC, 28 ºC (refrigerado), 25 ºC y a 40 ºC. Después de tres meses de almacenamiento, el lote GC100903 mostró mejor estabilidad durante el almacenamiento en comparación con

35 GC111703 y Sandostatina LAR. En la Tabla 33 se muestran los datos de estabilidad.

Tabla 33. Porcentaje de impurezas (sustancias relacionadas) en microesferas que contienen octreotrida tras el almacenamiento

Duración del almacenamiento: Condición almacenamiento de GC 100903 GC111703 Sandostatina LAR

Inicial: N.A. Ninguna detectada 3,4 % 6,6 %

3 meses: 20 ºC Ninguna detectada 3,3 % 6,2 %

28 ºC: Ninguna detectada 3,3 % 6,1 %

25 ºC: Ninguna detectada 6,9 % 8,4 %

40 ºC: 1,8 % 17,2 % 23,3 %

Como se muestra en el presente documento, las microesferas de octreotida preparadas a partir de una solución

5 polimérica que contiene 85 % de láctido se pueden almacenar a temperatura ambiente con sustancias relacionadas con péptidos indetectables, mientras que la microesfera de octreotida comercialmente disponible, Sandostatina LAR, requiere al menos refrigeración durante el almacenamiento.

15. Eficacia de microesferas de octreotida que no tienen impurezas detectables

10 Se prepararon soluciones poliméricas que contenían acetato de octreotida utilizando algunos polímeros PLGA85:15 (GC091903, GC091203, GC091503, GC091703 y GC091603). El número de ácido de los polímeros varió de 14 a 18 Se prepararon microesferas dispersando la fase dispersa en la fase continua (solución de alcohol polivinílico al 0,35 %) mediante el proceso de flujo continuo descrito en las patentes de Estados Unidos 5945126 y 6270802. Las

15 propiedades del polímero, la composición de diversos componentes en la fase dispersa, y las propiedades de las microesferas fueron como se muestra en la Tabla 34 siguiente.

Las microesferas preparadas de esta manera se recuperaron y formularon en un diluyente, que es una solución de carboximetilcelulosa, manitol y tween80. Cada vial tenía 5 mg de acetato de octreotida. Las microesferas tuvieron

20 una eficacia de encapsulación del fármaco que variaba de 76 a 81 % y no hubo impurezas detectables (sustancias relacionadas) en las microesferas. A continuación se criodesecaron las suspensiones de microesferas en el diluyente para conseguir la formulación que es adecuada para la evaluación in vivo.

Tabla 34: Propiedades de los polímeros 85:15 PLGA, Formulaciones de la fase dispersa y propiedades de las 25 microesferas

Lote de polímero: GC091903 GC091203 GPC091503 GC091703 GC091603

Propiedades de los polímeros: N.º de lote de polímero 02012105 03001085 03001097 03001105 03001114

Composición de comonómero: 85 % de láctido y 15 % de glicólido 85 % de láctido y 15 % de glicólido 85 % de láctido y 15 % de glicólido 85 % de láctido y 15 % de glicólido 85 % de láctido y 15 % de glicólido

Número de ácido del polímero: 14,8 17,5 17,8 17,1 17,2

Mw del polímero: 13395 11546 10307 10507 10961

Composición de la fase dispersión: Polímero en la DP, % 29,7 29,7 29,7 29,7 29,7

Acetato de octreotida en la DP, %: 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3

Cloruro de metileno en la DP, %: 57,3 57,3 57,3 57,3 57,3

Metanol en la DP, %: 5,7 5,7 5,7 5,7 5,7

Ácido acético glacial en la DP, %: 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Fármaco diana en la microesfera, %: 10 % 10 % 10 % 10 % 10 %

Propiedades de la microesfera: Carga de fármaco en la microesfera, % 8,1 7,7 7,8 7,6 7,7

Eficacia de encapsulación, %: 81 77 78 76 77

% Impurezas (totales): <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1

Densidad a granel, g/ml: 0,70 0,70 0,61 0,65 0,74

Tamaño de partículas, Vol. dest

10 % bajo: 2,19 2,76 3,16 2,59 2,80

25 % bajo: 9,61 10,0 13,3 8,72 10,6

50 % bajo: 20,8 23,1 25,4 21,6 24,9

75 % bajo: 30,2 33,3 35,0 30,8 34,4

90 % bajo: 37,8 41,5 43,6 38,3 42,1

A continuación se reconstituyeron las formas farmacéuticas criodesecadas con agua y las suspensiones de microesferas resultante se inyectaron por vía s.c. a ratas; cinco ratas para cada formulación de microesferas. Se extrajeron muestras de sangre a intervalos adecuados y se siguió también la velocidad de crecimiento de las ratas 5 La Figura 14 muestra los datos del nivel de octreotida en suero inyectado en ratas con microesferas de octreotida (lotes de microesferas GC091903, GC091203, GC091503, GC091703 y GC091603) que no contienen impurezas detectables. Las ratas del control recibieron solo diluyente (sin microesferas) y la concentración de octreotida que se encuentra en el suero es cero o despreciable. La Figura 15 muestra los datos del porcentaje de aumento en el peso corporal en comparación con el tiempo cuando reciben en primer lugar las microesferas de octreotida (lotes de

10 microesferas GC091203, GC091503, GC091603, GC091703 y GC091903) que no contienen impurezas detectables. El control indica el peso corporal de las ratas que recibieron solo diluyente. Los valores indicados son el promedio de cinco ratas.

Las microesferas eran formulaciones de liberación en un mes. Es sabido en la técnica que la octreotida en suero

15 controla la hormona del crecimiento (GH) y el factor1 de crecimiento de tipo insulina (IGF1) en pacientes con acromegalia (McKeage et al., 2003, Octreotide LongActing Release (LAR) A Review of its Use in the Management of Acromegaly, Drugs 63 (22): 24732499. Se muestra por medio de este ejemplo en el presente documento que las microesferas de octreotida exentas de impurezas descritas en el presente documento son eficaces en el control o en la reducción de la velocidad de crecimiento de las ratas.

20

G. Microesferas 1 de leuprólida.

1. Microesferas PLGA de leuprólida

25 Se prepararon tres lotes de microesferas con PLGA 50:50 a partir de una fase dispersa trasparente mediante el mismo procedimiento descrito anteriormente para las microesferas de octreotida. Véase la Tabla 35 siguiente.

Tabla 35. Microesferas de leuprolida con PLGA50:50

Lote: PLGA usado Número de ácido Carga diana Carga de fármaco % Impurezas

TV061297: RG503H 7,4 18 % 14,0 % 3,46

BT073096: RG503H 7,4 12,5 % 9,5 % 2,32

BT103196: RG502H 29,3 12,5 % 9,4 % 0,21

: 30 2. Efecto del peso molecular (o efecto del número de ácido):

Otro lote, BT103196, se preparó con el polímero de bajo peso molecular RG502H. La carga diana era el 12,5 % y la carga real era el 9,4 %. El porcentaje de impurezas, como aducto de polímerofármaco es solo del 0,21 %.

: 35 3. Efecto de la carga diana:

Se prepararon microesferas de acetato de leuprólida con RG503H en dos cargas diana. Se preparó el lote TV061297 con la carga diana del 18 % y dio como resultado microesferas con un 14 % de carga diana. Las microesferas resultantes tenían un 3,46 % de impurezas como un aducto de fármacopolímero. Se preparó el lote

40 BT073096 con el mismo polímero RG503H en un 12,55 de la carga diana. Las microesferas resultantes tenían un 9,5 % de carga diana y un 2,32 % de impurezas.

En la Figura 16 se muestra el cromatograma de HPLC del extracto procedente de una microesfera RG503H TV061297. Se identificaron las estructuras de las impurezas marcadas en la Figura 16 mediante HPLCMS, y se 45 muestran a continuación:

ID del Pico: Estructura

1: [5OxoLProlil][Lhistidil][Ltriptofil][LSeril][LTirosil][DLeucil][LLeucil]L[Larginil][Netilprolinamida] (Acetato de leuprólida)

2: [5OxoLProlil][Lhistidil][Ltriptofil][LSeril][LTirosil][DLeucil][LLeucil]L[LarginilGLY][Netilprolinamida]

3: [5OxoLProlil][Lhistidil][Ltriptofil][LSeril][LTirosil][DLeucil][LLeucil]L[LarginilGLY·GLY][Netilprolinamida]

4: [5OxoLProlil][Lhistidil][Ltriptofil][LSeril][LTirosil][DLeucil][LLeucil]L[LarginilGLY·LAC][Netilprolinamida]

5: [5OxoLProlil][Lhistidil][Ltriptofil][LSeril][LTirosil][DLeucil][LLeucil]L[LarginilLAC·LAC][Netilprolinamida]

4. Microesferas de leuprólida con PLA

Se prepararon tres lotes de microesferas de leuprólida con poliláctido. Véase la Tabla 36 siguiente. Tabla 36. Microesferas de leuprolida con PLA

Lote: Polímero N.º de ácido Carga diana % Carga real, % % Impurezas totales

GJ110899: PLA0.22 9,6 15,5 10,2 % 0,67

GJ110299: PLA, IV 0.11 19,9 15,5 % 11,0 % 0,29

GJ111999: PLA, IV0.11 19,9 15,0 % 10,6 % 0,27

Como se muestra en la tabla 36, las microesferas de leuprólida con poliláctido produjeron menos impurezas con 10 respecto a las microesferas de PLGA. Asimismo, se ha mostrado que al disminuir el peso molecular (número de ácido mayor), disminuye la impureza.

5. Castración química en pacientes de cáncer de próstata tratados con microesferas de leuprólida con PLA 15 Se prepararon microesferas que contenían leuprólida a una escala de 480 g utilizando una fase dispersa que

contenía ácido acético glacial En la Tabla 37 se muestra la composición de la fase dispersa. Tabla 37. Composición de la fase dispersa

Cantidad, g: % Composición

Poliláctido: 401 25,0

Diclorometano: 852 53,0

acetato de leuprólida,: 79,1 4,92

Ácido acético glacial: 6,7 0,42

Metanol: 268 16,7

20 Se prepararon microesferas de la fase dispersa mediante el proceso de flujo continuo en condiciones asépticas utilizando el procedimiento descrito en las patentes de Estados Unidos 5.945.126 y 6.270.802. Las microesferas preparadas de esta manera se formularon en un diluyente, que era una solución estéril de carboximetilcelulosa, manitol, y tween 80. A continuación se introdujo la suspensión de microesferas en diluyente en viales para tener 22,5 mg de acetato de leuprólida por vial (más el exceso para acomodar la pérdida de transferencia) y se

25 criodesecó. En la Tabla 38 siguiente se muestran las propiedades de la forma farmacéutica acabada.

Tabla 38. Propiedades de la microesfera

Contenido de acetato de leuprolida por vial*: 23,2 mg

Carga de acetato de leuprolida en la microesfera: 13,4 %

Tamaño de partículas, distribución en vol.

10 % bajo: 3 micrómetros

25 % bajo: 12 micrómetros

50 % bajo: 25 micrómetros

75 % bajo: 36 micrómetros

90 % bajo: 45 micrómetros

pH tras reconstitución: 6,9

Contenido de humedad, %: 0,1 %

Liberación de fármaco acelerada

5 horas: 20 % de liberación de fármaco

24 horas: 50 % de liberación de fármaco

48 horas: 73 % de liberación de fármaco

72 horas: 86 % de liberación de fármaco

* Rellenado con un exceso de ~10 % e intento de administrar 22,5 mg de acetato de leuprólida

Una comparación del peso molecular del polímero utilizado para la preparación de microesferas y del peso molecular del polímero en la microesfera (datos presentados en la Tabla39 siguiente) mostró que el Mw del polímero no cambia tras la formación de microesferas.

Tabla 39. Peso molecular (Mw) del polímero bruto y la microesfera

Mw: % de cambio en el Mw

Polímero bruto: 14321 N.A.

MS n.º Lote 0H: 14420 +0,7

Se inyectaron las microesferas una vez cada tres meses para castrar químicamente y mantener a los pacientes de cáncer de próstata. En pacientes con cáncer de próstata conseguir niveles de testosterona sérica menores de o 10 iguales a 0,5 ng/ml (nivel de castración química) es un indicador farmacológico deseado de la acción terapéutica. De esta manera, fisiológicamente, los pacientes que recibieron la microesfera de leuprólida deben tener su nivel de testosterona sérica reducido o inferior a 0,5 ng/ml en cuatro semanas o más pronto y deben mantener el nivel de castrado durante la duración completa del tratamiento. En total, cuarenta pacientes de cáncer de próstata recibieron las inyecciones de microesferas (inyecciones intramusculares). Se realizó un seguimiento de doce pacientes para

15 determinar la leuprólida en suero para seguir la farmacocinética y se vigiló a todos los pacientes para la testosterona en suero. La Figura 17 muestra el nivel de leuprólida en suero y su nivel de testosterona. Se consiguió la castración química en los 28 días en 39 pacientes de 40. Tras conseguir la castración, todos los pacientes mantuvieron la castración durante el periodo de tratamiento completo. La segunda inyección de la formulación no produce aumento de testosterona y mantuvo el nivel de testosterona bajo.

20

H. Microesferas de ornitida

Se prepararon microesferas que contenían ornitida (AcD2NalD4CpaD3PalSerLys(Pic)DOrn(6Aminonicotinoil)LeuIlysProDAlaNH2) con algunos polímeros Se descubrió una impureza en gran cantidad 25 preparando a la vez las microesferas de ornitida con PLGA5050. Este compuesto se eluyó exactamente antes de la ornitida y se identificó como un aducto de ornitidaglicólido a través de serina. Este pico eluyó antes de la ornitida en HPLC debido a que, la ornitida es comparativamente hidrófoba. Se observaron otras pocas impurezas tras la ornitida que no se identificaron, y se supusieron que son aductos con fragmentos más grandes procedentes de PLGA. Como se ha observado con las microesferas de octreotida y leuprólida anteriores, el PLGA con un contenido mayor de

30 láctido produce menos impurezas. Las microesferas de ornitida preparadas con PLA no muestran una impureza individual suficientemente grande que notificar. A continuación, la Tabla 40 muestra ejemplos de microesferas de ornitida con PLGA

Tabla 40. Microesferas de ornitida con PLGA 35

Lote: Polímero % de láctido N.º de ácido Carga diana Carga real Aducto OrnGly Suma de otras impurezas y n.º de impurezas

GJ022300: RG504H 50 5,9 21 % 14,2 % 1,87 % 1,43 % (Cinco)

GJ022900: RG503H 50 7,4 22 % 15,2 % 1,64 % 1,38 (Cuatro)

GJ022400: 7525DL3A 75 6,7 21 % 14,0 % 0,52 % 0,57 (dos o tres)

I. Microesferas de WOC4D, WOC4D, cuya estructura se muestra a continuación, es otro análogo de somatostatina similar a octreotida.

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Se prepararon microesferas de WOC4D con varios polímeros. La microesfera de WOC4D mostró también un comportamiento similar como se ha observado con las microesferas de octreotida. El nivel de formación de aducto, 45 sin embargo, es muy inferior. La siguiente Tabla 41 muestra ejemplos de microesferas de WOC4D con PLGA

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Inicialmente, se disolvió la leuprólida fácilmente en metanol, formando una solución trasparente a una concentración de 0,24 g/g. Sin embargo, aunque esto se acercaba a la solubilidad completa, la leuprólida precipitó de la solución rápidamente, convirtiéndose en un espeso gel de color blanco. Se llevó a cabo un breve estudio de investigación sobre la solución de leuprólida en metanol y en la fase dispersa.

5 Se llevó a cabo este estudio para comparar la estabilidad de la solución de leuprólida/metanol y la estabilidad de la DP. La Tabla48 compara la estabilidad de la DP.

10 Tabla 48: Estabilidad de la solución de leuprólida en metanol y DP

Solución de leuprólida en metanol: Leuprólida en DP (Leup, MeOH, Polímero y DCM)

Proveedor/n.º de lote: Conc. (g/g) Estabilidad Polímero Tipo de DP* Estabilidad

Bachem, FLEUP9901: 0,14 Estable y trasparente durante 4 días. RG503H 30 días Estable durante 5 días

Bachem, FLEUP9805: 0,14 Estable y trasparente durante 2 días RG503H 30 días Estable durante 2 días

Bachem FLEUP9805: 0,24 Turbio después de 30 min R202H 90 días Turbio después de 30 min, gelificado el mismo día

Peninsula, 769A, purificado (n.º de lote 036973): 0,14 Estable y trasparente durante 3 días RG503H 30 días Transparente durante 2 días (viscosidad superior a Bachem Leup)

Peninsula, 769A, purificado (n.º de lote 036973): 0,24 Estable y trasparente durante 40 min R202H 90 días Estable durante 30 minutos, se volvió turbio y viscoso después de 30 min.

Bachem FLEUP9901: 0,24 Turbio después de 2 horas

Traza de ácido acético glacial y de Bachem Leup9901: 0,24 Solución transparente. Estable durante >7 días

*Nota: se obtuvo la DP de 30 días mezclando 0,612 g de una solución de 0,14 g/g de leuprólida/metanol y 2,2 g de una solución de 0,18 g/g de RG503H/DCM. Se obtuvo la DP de 90 días mezclando 1,05 g de una solución de 0,24 g/g de leuprólida/metanol y 3,95 g de una solución de 0,32 g/g de R202H/DCM.

La adición de ácido acético a la solución demostró proporcionar una excelente estabilidad para la leuprólida de Bachem frente a la gelificación/precipitación de la leuprólida de su solución de metanol, así como en la DP. Es necesario encontrar la cantidad eficaz de ácido acético requerida para mantener la DP estable durante un periodo

15 prolongado de tiempo. La formulación de la DP es muy similar a la formulación de la leuprólida de 90 días. Se prepararon soluciones de la leuprólida Bachem y Peninsula con ácido acético para evaluar la estabilidad. La Tabla 49 muestra los resultados.

Tabla 49: Ácido acético y estabilidad de la DP

Solución de leuprólida en metanol*: Comportamiento de la fase dispersa**

Composición: Rendimiento

Bachem FLEUP9805 (0,4 g) + 75 mg de ácido acético glacial + Metanol (1,27 g): Estable durante 5 días Estable durante una semana

Bachem FLEUP9805 (0,4 g) + 7,5 mg de ácido acético glacial + Metanol (1,27 g): Estable durante 56 horas Estable durante 56 horas

Purificado por Peninsula, 769A (0,4 g) + 75 mg de ácido acético glacial + Metanol (1,27 g): Estable durante 3 días Estable durante 4 días

* Se trata de una solución de 0,24 g/g** 90 Días de composición DP con polímero, R202H

La Tabla 50 muestra la mínima composición de ácido acético necesaria en la DP para obtener una solución estable. Tabla 50: Composición sugerida para la formulación DP de 90 días

Componente: Cantidad (g) % Amt en solución en metanol (wt) % Amt. En DP

Acetato de leuprólida,: 4 g 24,3 % 5,4

Ácido acético: 0,075 g 0,4 % 0,1

Metanol: 12,4 g 75,3 % 16,8

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Claims

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