KR100321854B1 - 루테이나이징 호르몬 릴리싱 호르몬 동족체를 함유하는 장기 서방출성 미립구 및 그의 제조방법 - Google Patents

루테이나이징 호르몬 릴리싱 호르몬 동족체를 함유하는 장기 서방출성 미립구 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자인 락타이드ㆍ글리코라이드 공중합체(poly (lactide-co-glycolide) polymer)에 LHRH 동족체를 봉입하여 지속적으로 약물의 방출을 조절할 수 있는 미립구와 그 제조방법에 관한 것이다. 이는 펩타이드계 약물을 생분해성 폴리에스테르계 고분자 미립구에 봉입하는데 있어 생분해성 폴리에스테르계 고분자와 펩타이드 이온간의 상호작용과 혼합 용매로 사용한 N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone)의 작용, 그리고 첨가제로 사용한 올레인산나트륨(Na-Oleate)의 작용으로 초기 과다 방출을 줄여 방출속도를 조절할 수 있다. 이와 같은 결과는 사용한 혼합용매와 생분해성 폴리에스테르계 고분자의 조성비 및 첨가제의 사용량을 조절하여 이루어진다.
따라서 본 발명의 특징은 보조용매를 사용하여 LHRH 동족체를 용해한 후 고분자를 용해시킨 유기용매에 가하여 하나의 유상을 제조하고 이를 수상에 분산시키는 단일 유화방법을 사용하여 제조한 비다공성 내부구조의 미립구는 치밀하고 균일한 내부구조를 형성하고 있으므로 일정하게 약물을 방출 및 함유율을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 간편하게 제조할 수 있다.

Description

ＬＨＲＨ 동족체를 함유하는 장기 서방출성 미립구 및 그의 제조방법
본 발명은 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자로 이루어진 담체에 LHRH(Luteinizing Hormone Releasing Hormone) 동족체를 봉입하여 지속적으로 약물의 방출을 조절할 수 있는 미립구와 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 지방족 폴리에스테르계 고분자로서 락타이드와 글리코라이드 공중합체(poly (lactide-co-glycolide) copolymer)로서 LHRH(Luteinizing Hormone Releasing Hormone) 동족체를 유효성분으로 함유하는 미립구(microsphere)의 제조방법에 관한것이다.
생리학적으로 혈중 테스토스테론이나 에스트로젠 농도가 낮은 경우나 시상하부방출호르몬(hypothalamic releasing hormone)의 반응으로 인해 시상하부(hypothalamus)에서 고나도트로핀 방출호르몬(Gonadotropin Releasing Hormone: GnRH, LHRH)이 유리된다. 이는 시상하부-뇌하수체 문맥시스템(hypothalamic- pituitary portal system)을 경유하여 뇌하수체(pituitary gland)로 이송된 다음 이들은 황체형성호르몬(Luteinizing hormone: LH)과 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone: FSH)의 합성 및 분비를 자극함으로써 테스토스테론, 에스트로겐이 분비된다. LHRH 동족체는 뇌하수체(pituitary gland)에 작용하여 LH의 분비를 억제하여 테스토스테론, 에스트로겐의 분비를 억제함으로써 호르몬 반응성으로 진행되는 전립선암, 유방암, 자궁내막증 등에서 치료효과를 발현하게 된다. 그러나 이러한 LHRH의 작용은 일반적인 펩타이드성 약물의 경우와 마찬가지로 위장관내 안정성이 매우 나쁘고 흡수도가 낮아 주사제로만 투여가 가능하며 이 경우도 생체이용률이 매우 낮아서 매일 주사(daily injection)가 필요하다. 또한 치료기간도 매우 길어서 환자의 순응도와 치료효율 및 처치에 많은 어려움이 있다. 본 발명은 생체 내에서 자발적으로 분해되는 생분해성 고분자를 이용한 미립구를 제조하여 이에 함유된 LHRH 동족체가 오랜 기간 방출되도록 함으로서 테스토스테론, 에스트로젠 농도를 낮게 유지하여 치료효과의 향상과 순응도를 개선하였다.
생체 분해성 고분자인 락타이드와 글리코라이드의 공중합체(Poly lactide-co- glycolide: PLGA)를 이용하여 단백질 및 펩타이드를 함유한 제어 방출성 제형 연구는 많은 연구가 이루어져 왔으나 분자량이 큰 단백질의 경우 방출 형태와 구조의 안정성 문제 때문에 상품화에 어려움을 겪고 있다. 따라서 단백질의 활성을 유지하면서 상품화하기 위하여 여러 외부 첨가제를 넣거나 새로운 제조방법을 개발하고자 하였다.
그러나 펩타이드 약물의 경우 단백질 약물의 경우 보다 비교적 크기가 작고 안정성이 있으므로 제품화가 용이하여 그중 상품화된 것으로 분자량이 1.2kDa로 비교적 작은 펩타이드 약물인 LHRH 동족체의 서방형 DDS 제제가 있다.
PLGA로 제조한 미립구는 생체내 환경에서 일어나는 가수분해를 통해 젖산과 글리콜산으로 분해되어 배설되므로 독성이나 분해산물로 인한 부작용이 없으며 목적하는 약물방출기간동안 일정한 속도로 약물을 방출시키는 특성을 가지고 있다.
본 발명에서 사용한 락타이드ㆍ글리코라이드 공중합체(poly lactide-co- glycolide)는 락타이드(lactide)와 글리코라이드(glycolide)가 각각 몰 비율로 1:1로 결합된 공중합체(copolymer)를 사용하였다. 특히 본 발명에서는 펩타이드 약물을 지속적으로 방출시키기 위해서 고분자 말단에 카르복실기가 붙어있는 고분자와 도데실기가 붙어있는 고분자 2가지를 적절한 비율로 혼합하여 미립구의 분해속도의 조절 및 약물의 함량을 높였다. 말단에 카르복실기를 가지고 있는 생분해성 고분자의 경우 음전하를 띄게 되므로 펩타이드 물질의 구성아미노산의 양전하와 이온결합을 하여 미립구 제조시 약물의 함량을 높이는 작용을 하게 되며, 약물이 확산에 의해 분비되어 초기에 과다 방출되는 것을 조절할 수 있다. 또한 미립구의 분해속도의 경우 말단에 도데실기를 가지는 생분해성 고분자와 함께 사용하여 미립구의 분해속도를 조절한다.
본 발명과 관련된 종래 기술로서 미국특허 4,711,782호도 유사한 고분자를 사용하여 W/O/W(water in oil in water) 이중 유화방법으로 미세다공성 미립구를 제조하였다. 이 방법은 수용성 약물을 봉입하는 방법으로 많이 사용되는데 젤라틴(gelatin)을 이용하여 수용성 펩타이드 약물을 물 층에 녹여 봉입율을 높이고 이 물 층을 고분자가 녹아있는 유기용매 층에 호모게나이저(homogenizer)로 분산시켜 일차 유제(primary emulsion)를 만든다. 그리고 다시 이 일차 유제를 폴리비닐알코올이 계면활성제로 들어있는 물 층으로 분산시켜 이차유제(secondary emulsion)를 만들어 유기용매가 물 층으로 확산되면 증발해서 날아가게 되고 고분자는 고체화되어 미립구를 형성한다. 이와 같이하여 얻은 미립구를 동결건조하여 제조하는 방법은 수용성 펩타이드를 용해시키기 위하여 물을 사용하며 다공성의 구조를 갖는 미립구를 얻게 되고 초기 펩타이드 약물의 방출속도가 빨라져 약물의 함유율이 낮게 되는 문제점이 있다.
본 발명은 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자로 이루어진 담체에 LHRH 동족체를 봉입하여 지속적으로 약물방출을 조절할 수 있는 비다공성 내부구조를 갖는 미립구를 제조하는데 있어 단일 유화방법에 의해 간편하게 제조할 수 있다. 또한 미립구는 매우 치밀하고 균일한 내부구조를 형성하고 있으므로 약물의 함유율도 증가시키는데 있다.
도 1은 본 발명의 미립구의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy, SEM)사진이다.
도 2는 본 발명의 미립구의 단면을 촬영한 SEM사진이다.
도 3은 본 발명의 미립구의 in vitro 방출시험결과를 나타내는 도표이다.
도 4는 본 발명의 미립구의 시간에 따른 미립구의 중량감소를 나타내는
도표이다.
도 5는 본 발명의 미립구의 in vivo 방출시험결과를 나타내는 도표이다.
본 발명의 단일 유화방법은 보조용매를 사용하여 LHRH 동족체(Goserelin acetate, Nafarelin acetate, Buserelin acetate, Leuprorelin acetate)를 용해한 후 고분자를 용해시킨 유기용매에 가하여 하나의 유상을 제조하고 이를 수상에 분산시키는 방법이다. 이때 사용하는 유기용매는 메틸렌클로라이드(MC: methylene chloride)등을 사용하며, 수상은 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol)을 용해하여 수상으로 이용하고, 보조용매로는 LHRH를 용해하며 사용된 유기용매인 MC와 물에 모두 혼합될 수 있는 용매를 보조용매로 사용한다. 이러한 용매로는 엔-메틸-2-피로리돈(N-methyl-2-pyrrolidone:NMP), 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO), 디메틸포름아마이드(dimethyl foramide:DMF), 아세톤(acetone), 에탄올(ethanol), 초산에틸(ethyl acetate), 메틸에틸케톤(methyl ethyl ketone:MEK)등이 있으며 본 발명에서는 엔-메틸-2-피로리돈(NMP)을 단일 유화방법의 보조용매로 사용하여 미립구가 비다공성의 치밀한 구조를 갖도록 하였다.
또한 보다 정확한 LHRH 동족체의 방출속도를 제어하기 위하여 LHRH 동족체와 소수성 이온결합 할 수 있는 물질로 미립구내에서 LHRH 동족체의 방출을 고분자 분해에 따른 1차 제어와 함께 2차적으로 제어하여 계획된 방출패턴을 유지하도록 하는 상승효과가 있다. 이런 방출속도 제어 물질로는 특징적으로 LHRH 동족체와 소수성이온쌍짓기(hydrophobic ion pairing)를 할 수 있으며 유기용매에 직접 가용화되는 올레인산나트륨(sodium oleate), 디옥시콜린산(deoxycholic acid), 콜린산(cholic acid), 지방산(fatty acids), 포스파티딘산(phosphatidic acids)등이다.
본 발명의 생분해성 미립구는 도 1, 도 2에서와 같이 내부구조가 매우 치밀하며 비다공성의 구조를 갖는다.in vitro방출시험한 결과를 표시한 도 3에서 일정한 속도의 약물방출이 각 실시예의 미립구에서 나타났으며 도 4에서는 제조된 미립구의 중량감소를 통해 생분해 속도를 측정 할 수 있으며, 그 결과 약 45일 전후로 완전한 분해가 관찰되었다. 도 5는 실시예에 따라 제조한 각 미립구를 실제로 생체 환경에서 약물방출을 실험한 결과로서 실험실적 방법으로 시행한in vitro결과와 좋은 상관성을 갖는다.
본 발명을 다음의 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 하며 이들 실시예가 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
＜실시예 1＞ 초산 류프로렐린 함유 생분해성 미립구의 제조
생분해성 고분자로 사용한 PLGA 미립구의 제조는 O/W(oil in water)단일 유화방법을 사용하였다. 도데실기를 말단에 갖고 조성은 락타이드와 글리코라이드가 50:50인 PLGA로 분자량 12,000(RH502, Boehringer Ingelheim)과 카르복실기를 말단에 가진 분자량 8,600의 PLGA(RH502H, Boehringer Ingelheim)를 사용하였다. RG502H와 RG502의 비율을 중량비 1:1로 하여 각각 350mg씩을 3ml의 메틸렌클로라이드에 용해하였다. 초산 류프로렐린 100mg을 1ml의 N-메틸-2-피롤리돈에 용해한 다음 고분자가 용해된 메틸렌클로라이드 용액과 충분히 혼합하였다. 중량백분율로 0.5%의 폴리비닐알코올을 함유하도록 용해한 증류수 250ml에 2g의 메틸렌클로라이드를 가하여 미리 포화시킨 고분자와 약물이 용해된 용액을 가하여 30분 동안700rpm의 교반기로 유화시켰다. 3시간 동안 상압하에서 교반하면서 N-메틸-2-피롤리돈은 물로 추출해내고, 메틸렌클로라이드는 증발 제거하여 고형화된 미립구를 제조하였다. 30분간 8,000rpm에서 원심분리하여 얻은 미립구를 다시 증류수로 2회 원심분리하여 잔류용매와 미봉입 약물을 제거한 후 동결건조 하였다.
＜실시예 2＞ 초산 고세렐린 함유 생분해성 미립구의 제조
RG502H와 RG502의 비율을 중량비 1:1로 하여 각각 100mg씩을 3ml의 메틸렌클로라이드에 용해하였다. 초산 고세렐린(Goserelin acetate) 25mg을 1ml의 N-메틸-2-피롤리돈에 용해한 다음 고분자가 용해된 메틸렌클로라이드 용액과 충분히 혼합하였다. 증류수200ml에 0.3w%의 폴리비닐알코올이 용해된 용액에 2g의 메틸렌클로라이드를 가하여 미리 포화시킨 후 고분자와 약물이 용해된 용액을 가하여 30분 동안 700rpm의 교반기로 유화시킨후 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
＜실시예 3＞ 초산 나파렐린 함유 생분해성 미립구의 제조
RG502H와 RG502의 비율을 중량비 1:1로 하여 각각 200mg씩을 5ml의 메틸렌클로라이드에 용해하였다. 초산 나파렐린(Nafarelin acetate) 50mg을 1ml의 N-메틸-2-피롤리돈에 용해한 다음 고분자가 용해된 메틸렌클로라이드 용액과 충분히 혼합하였다. 증류수 250ml에 0.3w%의 폴리비닐알코올이 용해된 용액에 2g의 메틸렌클로라이드를 가하여 미리 포화시킨 후 고분자와 약물이 용해된 용액을 가하여 30분 동안 500rpm의 속도로 교반기를 이용하여 유화 시킨 다음 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
＜실시예 4＞ 호모게나이저를 이용한 초산 류프로렐린 함유 생분해성 미립구의제조
RG502H와 RG502의 비율을 중량비 1:1로 하여 각각 200mg씩을 5ml의 메틸렌클로라이드에 용해하였다. 초산 류프로렐린50mg을 1ml의 N-메틸-2-피롤리돈에 용해한 다음 고분자가 용해된 메틸렌클로라이드 용액과 충분히 혼합하였다. 증류수 250ml에 0.5w%의 폴리비닐알코올이 용해된 용액에 2g의 메틸렌클로라이드를 가하여 미리 포화시킨 후 약물이 용해된 용액을 가하여 30분 동안 700rpm의 속도로 호모게나이저로 유화시킨 후 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
＜실시예 5＞ 올레인산나트륨을 첨가한 초산 류프로렐린 함유 생분해성 미립구의 제조
RG502H와 RG502의 비율을 중량비 1:1로 하여 각각 200mg씩을 1ml의 메틸렌클로라이드에 용해하였다. 올레인산나트륨 3.105mg과 초산 류프로렐린 50mg을 1ml의 N-메틸-2-피롤리돈에 용해한 다음 고분자가 용해된 메틸렌클로라이드 용액과 충분히 혼합하였다. 증류수 250ml에 0.3w%의 폴리비닐알코올이 용해된 용액에 2g의 메틸렌클로라이드를 가하여 미리 포화시킨 후 고분자와 약물이 용해된 용액을 가하여 30분 동안 700rpm의 속도로 호모게나이저로 유화시킨 다음 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
＜실시예 6＞ 올레인산나트륨/초산 류프로렐린 복합체를 함유한 생분해성 미립구의 제조
17.5mg의 올레인산나트륨과 50mg의 초산 류프로렐린을 증류수에 반응시킨 다음 얻어진 침전물을 회수하고 동결건조하였다. 이를 RG502H와 RG502를 중량비 1:1로 하여 각각 200mg씩 용해된 메틸렌클로라이드와 N-메틸-2-피롤리돈이 각각 1.33ml, 0.66ml인 혼합용매에 용해하였다. 증류수 250ml에 0.3w%의 폴리비닐알코올이 용해된 용액에 2g의 메틸렌클로라이드를 가하여 미리 포화시킨 증류수 250ml에 고분자와 약물이 용해된 용액을 가하여 30분 동안 700rpm의 속도로 호모게나이저로 유화 시킨 다음 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
표 1. 본 발명 미립구의 약물봉입율 및 평균입자크기
실시예 약물봉입율(%) 평균입자크기(㎛)
1 10.76 138.5
2 9.98 106.8
3 10.21 122.1
4 10.71 11.2
5 10.32 10.6
6 11.21 10.4
＜시험예 1＞ 미립구의 in vitro 약물 방출시험
본 발명의 실시예에서 제조된 생분해성 고분자 미립구에 대하여in vitro방출시험은 다음과 같이 실시하였다. 5mg의 동결건조된 미립구를 0.05%의 tween 80을 함유하는 10ml의 0.333M 인산염완충액(pH 7.0)이 담겨 있는 바이알에 분산시킨 후 28일간 37℃에서 방출하였다. 방출시험 개시일로 부터 3일 간격으로 30일까지 총 10회에 걸쳐 시료를 채취한 후 원심분리하여 상층액과 미립구를 분리하고 미립구내에 잔류하는 초산 류프로렐린의 양을 HPLC로 정량하였다. 이때 분석조건은 0.25M 초산암모늄과 메탄올을 1:1.5로 배합한 용매를 이동상으로 하여 280nm에서 유속 1.0ml/min로 측정하여 도 3에 나타냈다.
＜시험예 2＞ 미립구의 분해
본 발명의 실시예에서 제조된 생분해성 고분자 미립구를 약물 방출시험과 동일한 조건에서 4일 간격으로 시료를 채취하여 원심분리를 통해 얻은 미립구를 건조시킨 후 각 시료의 중량을 정밀하게 측정하여, 이를 통해 미립구의 분해속도를 계산하여 도 4에 나타냈다.
＜시험예 3＞ 미립구의 in vivo 약물 방출시험
본 발명의 실시예에서 제조된 생분해성 고분자 미립구에 대하여in vitro방출시험은 다음과 같이 실시하였다. 미립구를 랫트의 대퇴부에 근육주사한 후 5일 간격으로 주사부위를 절개하여 잔류 미립구를 적출하였다. 이 적출된 미립구를 0.02%의 tween80(Polyoxyethylene 20 oleate, Junsei Chemical Co.,)을 함유하는 10ml의 0.333M 인산염완충액(pH 7.0)으로 균질화(homogenization)한 후 상기의 완충액 10ml와 메틸렌클로라이드 10ml를 추가로 가하여 약물을 수층으로 추출한다. 이 추출액을 in vitro 방출시험과 동일한 조건으로 하여 HPLC로 정량하여 도 5에 나타냈다.
본 발명에 의해 제조한 미립구는 기존의 미립구에 비해 매우 치밀한 내부구조를 갖으며 이로 인해 방출속도의 균일성을 보장할 수 있다. 또한 미립구의 제조방법에 있어서 단일 유화계를 구성함으로써 제조공정을 간소화하여 약물함유량을 10% 이상 확보할 수 있고, 이온성 상호작용에 의한 방출조절물질의 첨가와 사용한 고분자 물질의 선정을 통해 초기 과다 방출을 최소화하고 방출속도를 일정하게 유지시킬 수 있다.

Claims (5)

  1. 락타이드와 글리코라이드의 공중합체에 LHRH 동족체를 봉입시켜 구성되는 서방출성 미립구에 있어서, 상기 미립구내에서 LHRH 동족체와 소수성이온쌍짓기가 가능하고, 유기용매에 직접 가용화되는 방출속도제어물질로서 올레인산나트륨, 디옥시콜린산, 콜린산, 지방산, 포스파티딘산의 군으로부터 선택된 1종을 함유함을 특징으로 하는 LHRH 동족체가 함유된 장기 서방출성 미립구.
  2. 제 1항에 있어서, LHRH 동족체는 초산 고세레린, 초산 나파레린, 초산 부세레린 또는 초산 루프로레린 중에서 선택된 어느 성분을 함유함을 특징으로 하는 LHRH 동족체가 함유된 장기 서방출성 미립구.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 공중합체는 말단이 도데실기와 카르복실기를 갖는 폴리락타이드와 폴리글리코라이드의 고분자공중합체로서 LHRH 동족체와 결합하여 소수성 상호작용을 하는 미립구임을 특징으로 하는 LHRH 동족체가 함유된 장기 서방출성 미립구.
  4. 보조용매를 사용하여 LHRH 동족체를 용해한 후, 락타이드와 글리코라이드의 공중합체를 용해시킨 유기용매에 상기 LHRH 동족체의 용해액을 가하여 유상을 제조하고, 상기 얻어진 유상을 수상에 분산시키는 O/W형 단일유화방법에 의해 서방출성미립구를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 LHRH 동족체의 용해시 보조용매에 방출속도제어물질로서 올레인산나트륨, 디옥시콜린산, 콜린산, 지방산, 포스파티딘산의 군으로부터 선택된 1종을 함께 용해하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 LHRH 동족체가 함유된 장기 서방출성 미립구의 제조방법.
  5. 제 4항 있어서, 상기 보조용매는 엔-메틸-2-피로리딘으로 함을 특징으로 하는 LHRH 동족체가 함유된 장기 서방출성 미립구의 제조방법.
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