KR101961848B1 - C18:1, c18:1(oh) 또는 c18:2의 장쇄 지방산이 포함된 오일류를 포함한 방출억제제를 적용한 서방출성 마이크로스피어 및 이의 제조방법 - Google Patents

C18:1, c18:1(oh) 또는 c18:2의 장쇄 지방산이 포함된 오일류를 포함한 방출억제제를 적용한 서방출성 마이크로스피어 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성물질을 함유하는 장기 서방출성 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 생리활성물질, 생체적합성 고분자 및 방출억제제로 C18:1, C18:1 (OH) 과 C18:2의 장쇄 지방산을 함유하는 오일류를 포함하되, 상기 방출억제제가 생리활성물질이 봉입된 생체적합성 고분자를 한번 더 둘러싸는 것으로 인해 생리활성물질의 봉입률이 증가하고 초기 과다방출이 최소한으로 억제되는 탁월한 방출특성을 가지고 있어, 초기 과다방출로 인한 부작용등의 문제점이 해소된 장기 서방출성 마이크로스피어 및 이의 제조 방법을 제공한다.

Description

C18:1, C18:1(OH) 또는 C18:2의 장쇄 지방산이 포함된 오일류를 포함한 방출억제제를 적용한 서방출성 마이크로스피어 및 이의 제조방법{Sustained release-microsphere comprising oils containing C18:1, C18:1(OH) or C18:2 long chain fatty acid and method for preparing the same}
본 발명은 생분해성 고분자로 이루어진 담체에 수용성 약물을 봉입하여 지속적으로 약물의 방출을 조절할 수 있는 서방출성 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종래 생체적합성 고분자에 봉입된 생리활성물질을 포함하는 서방성 제제와는 달리, 장쇄 지방산, 구체적으로는 C18:1, C18:1(OH) 또는 C18:2의 장쇄 지방산을 포함하는 오일류를 방출억제제로 포함하여 생체적합성 고분자에 봉입된 생리활성물질을 도포하여 지질매트릭스를 형성하는 것을 특징으로 하여, 약물의 급격한 초기 과다방출 및 지연방출 없이 일정한 방출속도 및 유효한 혈중 농도를 지속적으로 유지할 수 있어 친수성 약물의 장기 서방성 제제로서 유용하게 사용될 수 있는 마이크로스피어 및 그 제조방법에 관한 것이다.
만성질환 치료용 약물의 경우 투여빈도를 감소시키기 위해 장기 방출제형으로 함으로써 단 한번의 투여만으로도 장시간 동안 유효한 치료약물농도를 유지할 수 있고 환자의 약물 치료 순응도를 향상시킬 수 있다. 이에 따라 약물의 복용 빈도수를 줄여 환자의 편의 및 순응도를 개선하면서 약물의 농도를 장기간 지속적으로 유지하기 위해서는 서방출성 주사 제형이 매우 유용하다고 여겨진다.
이 서방출성 주사 제형이란 피하 또는 근육주사 시 체내에서 약물이 생물학적 활성을 유지하면서 지속적이고 균일하게 방출될 수 있도록 제제화된 주사 제형을 말한다.
종래에 이와 같은 서방출성 주사제제들의 일반적인 제조방법은 코아세르베이션법, 용융사출(melt extrusion), 분무건조법 및 용매증발법 등이 알려져 있다. 이러한 방법 중 이중에멀젼증발법(W/O/W; water/oil/water)과 단일에멀젼증발법(O/W; oil/water)으로 분류되는 에멀젼증발법이 가장 많이 사용되고 있다.
그러나, 이와 같은 에멀젼증발법을 이용한 마이크로스피어에서 수용성 약물을 사용하는 경우에는 마이크로스피어의 제조과정 중 외부 연속상으로 약물이 확산되어 나오므로 약물의 봉입효율이 매우 나빠진다.
나아가, 이러한 다중에멀젼법에 따라 제조된 마이크로스피어에 관하여, 마이크로스피어에 봉입된 약물의 방출은 초기의 과다 방출(initial burst)와 이후의 지속 방출의 두 단계로 구별되는 특징을 갖는데, 이러한 초기 과다 방출은 실제 임상에서 적용하는 경우, 의도치 않은 약물의 과량 방출로 인한 부작용을 유발할 수 있어 제형 개발시 필수적으로 해결하여야 하는 문제점인데, 상기와 같은 제조방법은 봉입된 약물의 초기 과다방출률이 높다는 단점과 함께 활성성분인 약물을 유기용매 또는 물에 용해시킬 경우 마이크로스피어를 형성하면서 약물의 물성변화, 안정성이 떨어지는 문제점이 있다.
이와 관련하여 한국특허등록 제10-0442931호에는 약제 화합물이 용해되지 않는 적당한 유기용매 중에 중합체 담체 물질을 용해한 후, 과량의 보호콜로이드를 함유하는 수성 매질과 상 유도제를 첨가하여 마이크로캡슐 형태의 서방성 제제를 제조하는 방법이 공개되어 있다. 그러나 이러한 제조방법은 그 절차가 까다로울 뿐만 아니라 수율이 극히 낮기 때문에 제품의 단가를 상승시킬 수 있다는 단점을 갖는다.
나아가, 한국특허등록 제10-0409413호에서는 수중건조법으로 에멀젼을 제조한 후 생분해성 고분자의 유리전이온도(Tg) 이상으로 가열 건조하여 초기방출을 상당히 억제하고 유기용매를 최소화하는 방법을 개시하고 있으나, 이러한 제조방법은 유리전이온도가 최소한 47℃ 이상이어야 하며, 생리활성물질이 열에 의해 변성될 수 있다는 심각한 단점이 있다.
또한, 한국특허등록 제10-0293882호에는 염기성기를 함유하는 펩티드로부터 유도된 양이온과 카르복시 말단 폴리에스테르로부터 유도된 음이온으로 이루어지는 신규 염 및 이들 염의 제조방법과 서방성 제제 조성물의 제조에 있어서의 이들 염의 용도에 관한 방법이 서술되어 있다. 그러나 이 방법은 약물과 고분자 중합체를 동결 소적하고 진공하에서 건조하여 투명한 필름을 얻은 후, 다시 디클로로메탄에 분산하여 재건조하고, 이를 압축, 성형하는 과정을 거쳐 직경이 비교적 큰(예로, 16 또는 18 게이지) 주사바늘로 투여하기 때문에 환자에게 공포심을 유발하는 문제가 있다.
미국특허 제6,419,961호, 제5,585,460호 및 제4,652,441호에서는, 다중 에멀젼 방법을 이용하여 류프로레린 아세테이트(leuprorelin acetate) 등의 펩타이드 (peptide)계 약물을 함유하는 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체 마이크로스피어를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 특히 미국특허 제4,652,441호의 경우 내부수상에 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 펙틴(pectin), 아가(agar) 등의 수용성 고분자들을 약물과 함께 도입함으로써 내부 수상의 점도가 높아지고, 결과적으로 젤라틴과 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체의 이중 봉입(double encapsulation)이 유도되어 장기 서방형 주사제를 제조할 수 있었다. 그러나, 내부수상의 점도를 상승시키기 위해 젤라틴을 사용하는 경우, 1차 에멀젼 용액의 제조 시 약물이 용액 내에서 균일하게 분포하도록 하기 위해 80℃의 고온으로 가열하여야 하며, 상기 1차 에멀젼 용액을 외부 연속상에 재분산시킬 때 20℃ 내지 30℃까지 냉각시켜야 하기 때문에 마이크로스피어의 제조공정이 복잡하다는 문제점이 있었다. 또한 상기의 제조방법은 열에 대하여 안정성을 가지고 있는 약물의 제조에만 이용할 수 있다는 한계점을 가지고 있었다.
또한, Qingguo Xu 등의 문헌(Controlled release of amoxicillin from hydroxyapatite-coated poly(lactic-co-glycolic acid)microspheres, Journal of Controlled Release 127 (2008); 146-153)에 의하면 생분해성 마이크로스피어 외부를 하이드록시아파타이트로 코팅하여 초기 방출을 억제하며 장기간의 생리활성물질 방출이 가능한 방법이 공개되어 있으나, 장시간이 요구되는 번거로운 코팅 제조방법으로 생산화하기가 힘든 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 기존 단일 유화법(W/O emulsion) 또는 이중유화법 (W/O/W emulsion)에서 상기 명시한 제조 과정상 온도 및 농도, 교반 속도에 따라 미립자가 다공성을 나타내고 이는 초기 약물 과다 방출(Initial burst)을 높이며 약물의 봉입률을 저하시키는 단점들을 해결하고자 하였다.
따라서 본 발명은 C18 : 1, C18 : 1 (OH) 또는 C18 : 2의 장쇄지방산(long chain fatty acid)이 포함된 오일류의 방출억제제를 사용하여 종래의 용매증발법 내지는 용매추출법, 또는 유화법(emulsion)에서 발생하는 문제점인 초기 과다방출 문제가 억제된 마이크로스피어를 제조하기 위하여, 마이크로스피어 표면에 생기는 다공을 없애고 표면적을 줄이며 외부 수분의 침투를 지연시켜 보다 안정한 장기 서방출성 마이크로스피어의 제조방법을 제공하여 장기간 동안 유효한 혈중농도를 유지할 수 있는 약물 방출 프로파일을 가지는 수용성 약물 함유 서방성 마이크로스피어 및 그 제조방법을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한, 하나의 양태로서, 본 발명은 생리활성물질, 생체적합성 고분자 및 방출억제제를 포함하되,
상기 생리활성물질이 봉입된 생체적합성 고분자가 방출억제제에 의해 추가로 봉입되고, 상기 방출억제제는 C18:1, C18:1(OH) 또는 C18:2의 장쇄 지방산을 포함하는 오일류인 것을 특징으로 하는 서방출성 마이크로스피어에 관한 것이다.
본 발명에 적용할 수 있는 생리활성물질로는 생리활성 펩타이드 및 단백질 등을 포함하며, 생리활성 펩타이드와 단백질들은 2개 이상의 아미노산들로 분자량이 약 200 내지 100,000으로 구성되며 이들 펩타이드 및 단백질 약물들의 예는 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터루킨, 마크로파지 활성 인자, 마크로파지 펩타이드, B세포 인자, T세포 인자, 단백질 A, 알러지 억제 인자,세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제 인자, 전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민과 그 단편 폴리펩타이드, 아포리포단백질-E, 에리트로포이에틴, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 플라즈미노젠 활성인자, 유로키나제, 스트렙토키나제, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제재, 콜라지나제 억제재, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 오스테오제닉 성장 인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 카틸리지 유도 인자, 결합 조직 활성인자, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장 인자, 파라타이로이드 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린-유사 성장 인자, 아드레노코티코트로픽 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출 인자, 타이로이드 자극 호르몬, 각종 바이러스, 박테리아, 독소등에 대한 단일클론성 또는 폴리클론성 항체, 각종 바이러스 유래백신 항원 등을 포함한다.
본 발명에서 생리활성물질은 특별히 한정되는 것은 아니며, LHRH(luteinizing hormone-release hormone) 동족체(analogue) 또는 펩타이드 약물이나 이들의 염 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, LHRH 동족체 중 작용제(agonist)에는 고세렐린, 루프로라이드, 트립토렐린, 부세렐린, 나파렐린 등이 있고, 길항제(antagonist)에는 세트로렐릭스, 알지타이드 그리고, 그 외 이용가능한 펩타이드 약물에는 옥트레오타이드 등을 들 수 있다. 이들 LHRH 동족체 중 작용제는 체내에 투여되었을 때 뇌하수체(pituitary gland)에 작용하여 황체형성 호르몬(luteinizing hormone)의 분비를 억제(작용제의 경우에는 초기에는 분비를 촉진하나, 지속적으로 방출될 경우에는 억제됨)하여 성호르몬인 테스토스테론, 에스트로겐의 분비를 억제함으로써 호르몬 반응성으로 진행되는 전립선암, 유방암, 자궁내막증 등에서 치료효과를 나타내는 펩타이드 물질이다. 또한 상기 펩타이드 염의 예로, 이에 제한되는 것은 아니나, 펩타이드의 산부가염, 구체적으로는 고세렐린 아세테이트가 바람직하다.
본 발명에서, 용어 "생체적합성 고분자"는 생분해성 고분자로도 알려져 있는 물질들을 의미하며, 약제학적으로 마이크로캡슐의 제조시 사용되는 통상의 고분자들이 이용될 수도 있으며, 바람직하게는 본 발명에서는 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone), 폴리아미노산 (Polyaminoacids), 폴리하이드록시부티레이트 (Polyhydroxybutyrate), 폴리옥시에틸렌글라이콜레이트 (Polyoxyethylene glycolate), 폴리언하이드레이드 (Polyanhydrides), 폴리락타이드(Polylactides), 폴리글라이콜라이드(Polyglycolides), 이들의 공중합체인 폴리(락티드-코-글리코리드) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 폴리(락티드-코-글리코리드)(Poly Lactic-co-Glycolic Acid, PLGA) 이다.
본 발명에 사용될 수 있는 생체적합성 고분자(PLGA)는 중량 평균 분자량이 60,000 이하인 것을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 분자량 약 13,000인 폴리(락티드-코-글리코리드)(50:50), 분자량 약 33,000인 폴리(락티드-코-글리코리드)(50:50), 분자량 약 52,000인 폴리(락티드-코-글리코리드)(50:50), 분자량 약 20,000인 폴리(락티드-코-글리코리드)(75:25), 분자량 약 16,000인 폴리(락티드)(100:0) 등을 사용하는 것이 가능하다. 이와 같은 생체적합성 고분자는 베링거 잉겔하임사의 RG502H, RG503H, RG504H, RG752H, R202H 등을 들 수 있다.
본 발명에서 생체적합성 고분자는 제조되는 최종 마이크로스피어 전체 중량에 대하여 70 내지 99 중량%, 보다 바람직하게는 80 내지 98중량%, 가장 바람직하게는 85 내지 97 중량%가 포함될 수 있다. 본 발명에서 생체적합성 고분자가 70 중량% 미만으로 포함되면 생리활성물질 분포가 상대적으로 증가하여 초기 과다 방출 내지 원하는 기간 동안 약효를 유지시키지 못하는 문제가 있을 수 있고, 99 중량%를 초과하여 포함되면 환자에게 투여해야 할 양이 너무 많아져 투여가 힘들거나 투여 자체가 불가능해질 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로스피어에서, 상기 생체적합성 고분자는 상기 생리활성물질을 1차적으로 봉입하며, 추후 이하의 방출억제제에 의해 추가로 봉입되게 된다.
본 발명에서 방출억제제는 생리활성물질의 봉입률 및 효과적인 방출제어를 위해 포함되어, 상기 생리활성물질을 봉입한 생체고분자의 외부를 둘러싼 지질매트릭스를 형성하게 되는 것으로, 바람직하게는 탄소수가 16개 이상인 장쇄 지방산, 구체적으로 C18 : 1, C18 : 1(OH) 또는 C18 : 2 지방산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 장쇄 지방산, 즉, C18 : 1 또는 C8 : 2 지방산을 포함하는 오일류의 예로는, 리놀레산(linoleic acid) (C18 : 2) 64%; 팔미트산(palmitic acid) (C16 : 0) 14%; 올레산(oleic acid) (C18 : 1) 10%; 리놀렌산(linolenic acid) (C18 : 3) 7%; 스테아르산(stearic acid) (C18 : 0) 4% 등으로 구성된 대두 레시틴, 또는 리놀레산(linoleic acid) (C18 : 2) 39.3%; 올레산(oleic acid) (C18 : 1) 33.1%; 팔미트산(palmitic acid) (C16 : 0) 19.1%; 스테아르산(stearic acid) (C18 : 0) 1.9%; 아라키딘산(arachidic acid) (C20 : 0) 0.6%; 미리스트산(myristic acid) (C14 : 0) 0.3% 등을 갖는 면실유, 또는 리시놀레산(ricinoleic acid) (C18 : 1 (OH)) (87%); 올레산(oleic acid) (C18 : 1) 7%; 리놀레산(linoleic acid) (C18 : 2) 3%; 팔미트산(palmitic acid) (C16:0) 2%; 스테아르산(stearic acid) (C18 : 0) 1% 등을 갖는 피마자유 또는 리놀레산(linoleic acid) (C18 : 2) 58.9%; 올레산(oleic acid) (C18 : 1) 25.8%; 팔미트산(palmitic acid) (C16:0) 11.0%; 스테아르산(stearic acid) (C18 : 0) 1.7%; 리놀렌산(linolenic acid) (C18 : 3) 1.1% 등을 갖는 옥수수유 또는 리놀레산(linoleic acid) (C18 : 2) 66 %; 리놀렌산(linolenic acid) (C18 : 3) 0.5%; 올레산(oleic acid) (C18 : 1) 26%; 팔미트산(palmitic acid) (C16 : 0) 4%; 스테아르산(stearic acid) (C18 : 0) 2% 등을 갖는 해바라기유 또는 팔미트산(palmitic acid) (C16:0) 7.5-20.0%; 팔미톨레산(palmitoleic acid) (C16:1), 0.3-5.0%; 스테아르산(stearic acid) (C18:0), 0.5-5.0%; 올레산(oleic acid) (C18:1), 55.0-83.0%; 리놀레산(linoleic acid) (C18:2), 3.5-21.0% 등을 갖는 올리브유 또는 리놀레산(linoleic acid) (C18:2) 40.4%; 올레산(oleic acid) (C18:1) 45.4%; 팔미트산(palmitic acid) (C16:0) 9.1%; 스테아르산(stearic acid) (C18 : 0) 4.3% 등을 갖는 참기름 또는 리놀레산(linoleic acid) (C18:2) 50-57%; 레놀렌산(linolenic acid) (C18 : 3) 5-10%; 올레산(oleic acid) (C18 : 1) 17-26%; 팔미트산(palmitic acid) (C16 :0) 9-13%; 스테아르산(stearic acid) (C18:0) 3-6% 등을 갖는 대두유 또는 아라크딘산(arachidic acid) (C20 : 0) 2.4%; 팔미트산(palmitic acid) (C16 : 0) 8.3%; 스테아르산(stearic acid) (C18:0) 3.1%; 리놀레산(linoleic acid) (C18 : 2) 26.0%; 올레산(oleic acid) (C18 : 1) 56.0% 등을 갖는 땅콩유를 들 수 있으며, 특별히 한정되는 것은 아니나, 그 중 가장 많은 리시놀레산(ricinoleic acid) (C18:1 (OH)) (87%); 올레산(oleic acid) (C18:1) (7%)을 갖는 피마자유가 바람직하다.
본 발명에서 방출억제제는 바람직하게는 상기 생체적합성 고분자 100 중량부에 대하여 0.1 내지 20.0 중량부, 더 바람직하게는 0.1 내지 10.0 중량부, 가장 바람직하게는 0.1 내지 5.0 중량부의 양으로 포함될 수 있다. 포함되는 방출억제제의 양이 0.1 중량부 미만이면 방출억제제의 계면활성 효과가 미비해져 약물 봉입률에 문제가 있을 수 있고, 20.0 중량부를 초과하면 과량의 성분으로 인하여 약물의 방출이 지연되거나, 마이크로스피어 형성에 방해를 받을 수 있다.
본 발명에 따른 서방출성 마이크로스피어는 바람직하게는 생리활성물질을 마이크로스피어 전체 중량에 대하여 1.0 내지 30 중량%, 보다 바람직하게는 2.0 내지 20 중량%, 가장 바람직하게는 3.0 내지 10 중량% 포함한다. 본 발명에서 생리활성물질이 1.0 중량% 미만으로 포함되면 환자에게 투여하게 될 마이크로스피어 양이 너무 많아져 투여가 불가능하게 되거나 투여시 문제가 있을 수 있고, 30 중량%를 초과하여 포함되면 초기 과다 방출 억제가 어렵다는 문제가 있을 수 있다.
본 발명에 따른 서방출성 마이크로스피어는 생리활성물질이 생체적합성 고분자에 의해 봉입되고, 이러한 봉입된 생체적합성 고분자가 방출억제제에 의해 추가로 봉입되어 지질매트릭스를 형성하는 형태를 가짐으로 인해, 종래 마이크로스피어들에 비해 탁월한 생리활성물질의 봉입률을 나타내고, 생리활성물질의 초기 과다 방출로 인해 야기되는 부작용 등의 문제점을 해결하였다.
나아가, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 수용성 생리활성물질을 생분해성 고분자와 방출억제제를 용해시킨 유기용매에 현탁, 분산시키거나 생리활성물질을 용해시킨 수성용매와 생분해성 고분자를 용해시킨 유기용매를 혼합하여 현탁액 또는 에멀젼을 형성시키고 나서, 방출억제제를 혼합한 후 이를 수성 매질에 투입하여 마이크로스피어를 제조하고, 유기용매를 제거함으로써 서방출성 마이크로스피어를 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 따른 제조 방법을 구체적으로 설명한다.
본 발명은
i) 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
ⅱ) 상기 i) 단계에서 제조된 생체적합성 고분자가 용해된 유기용매에 생리활성물질을 현탁 또는 분산시켜 현탁액을 제조하거나, 생리활성물질에 용해보조제를 첨가하고 상기 i) 단계에서 제조된 생체적합성 고분자가 용해된 유기용매에 상기 용해보조제를 첨가한 생리활성물질을 용해시켜 비수성 용액을 제조하는 단계
ⅲ) 상기 ⅱ) 단계에서 제조된 현탁액 또는 비수성 용액에 방출억제제를 혼합하는 단계;
ⅳ) 상기 ⅲ) 단계에서 형성된 용액 또는 에멀젼을 수성 매질에 투입하여 마이크로스피어를 형성시키고, 이후 입도를 조절하는 단계; 및
ⅴ) 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 서방출성 마이크로스피어의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어, 생리활성물질, 생체적합성 고분자 및 방출억제제에 관하여는 상기 서방출성 마이크로스피어에 관한 사항이 동일하게 적용된다.
본 발명의 상기 i) 단계는 오일 분산상(oil dispersion phase)을 제조하기 위한 전 단계로 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계이다.
또한, 상기 i) 단계에서 생체적합성 고분자를 용해하는데 사용될 수 있는 유기용매는 생체적합성 고분자를 용해할 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들면 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세토니트릴, 디메틸설폭시드, 디메틸포름아마이드 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매 등이 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 상기 ⅱ) 단계는 i) 단계에서 제조된 생체적합성 고분자가 용해된 유기용매에 생리활성물질 자체를 현탁, 분산시켜 현탁 용액을 제조하거나, 또는 i) 단계에서 제조된 생체적합성 고분자가 용해된 유기용매와 함께, 생리활성물질에 용해보조제를 첨가하여 이에 용해시킨 후 이들을 서로 혼합시켜 비수성 용액을 제조하는 단계이다.
또한, i) 단계에서 제조된 유기용매에 생리활성물질을 현탁, 분산시키는 경우에 사용되는 ii) 단계의 용해보조제는 생리활성물질을 용해할 수 있는 한 특별한 제한은 없다.
본 발명에서 생리활성물질을 용해하는데 사용될 수 있는 용해보조제는 바람직하게는 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 N-메틸-2-피롤리디논(NMP) 이다. 상기 용해보조제는 상기 생리활성물질의 중량 대비 200 내지 1,000%의 중량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 ⅱ) 단계에서는 현탁액의 바람직한 물성이나 에멀젼 형성을 돕기 위하여 선택적으로 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제는 당 분야에서 관용적으로 사용되고 있는 것인 이상 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 계면활성제는 예를 들면, 실리콘오일(silicone oil), 폴리소르베이트(polysorbate, 상품명 Tween), 소르비탄 에스테르(sorbitan ester, 상품명 Span), 폴록사머 (poloxamer), 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol) 및 토코페롤 (tocopherol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 계면활성제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 iii) 단계는 i) 단계 및 ii) 단계에서 제조된 물질과 방출억제제를 혼합하여, 예를 들어 투명한 에멀젼 형태과 같은 오일 분산상을 제조하는 단계로서, 상기 단계에서 사용되는 방출억제제는 수용성인 생리활성물질의 방출을 지연 내지는 억제할 수 있는 기능을 가진 수난용성 내지는 수불용성 성분으로 초기 생리활성물질의 과다 방출을 지연 내지는 억제하거나 목적하는 기간 동안 생리활성물질의 방출을 지연시키고 제조되는 마이크로스피어의 약물 봉입률을 증가시키는 것을 목적으로 사용하는 성분을 의미한다.
본 발명에서 상기 ⅳ) 단계에서 수성 매질은 바람직하게는 주사용수가 사용될 수 있으며, 선택적으로 에멀젼의 확산을 억제하기 위하여 저점도 고분자를 혼합하여 사용할 수도 있다. 이때 사용되는 저점도 고분자로는, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈 (5.5-8.5 mPas of 10% w/v aqueous solutions at 20 ℃), 폴리비닐알코올 (4.0-7.0 mPas of 4% w/v aqueous solution at 20 ℃)등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 상기 iv) 단계의 수성 매질과 함께, 선택적으로 공용매를 더 사용할 수도 있고, 이러한 공용매의 예로는 탄화수소의 수소원자가 수산화기(hydroxy, -OH)로 치환된 알코올, 또는 초산 및 유기산, 또는 아세톤, 또는 석탄산(carbolic acid)등을 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올,　데칸올의 1가 알코올 들을 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올을 들을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 1가 알코올, 아세톤, 초산등의 공용매를 사용하는 경우에 제조된 마이크로스피어의 응집이 감소될 수 있다. 그러나 공용매를 과량 사용시 약물의 봉입률이 저하될 수 있으며, 소량 사용시에는 마이크로스피어의 응집효과에 의하여 약물의 용출이 제한될 수 있다. 따라서 이때, 방출억제제제 대 공용매 비율은 1:1~1:10.000, 또는 바람직하게는 1:10~1:1,000, 가장 바람직하게는 1:20~1:400이다.
또한, iv) 단계에서, 입도 조절은 공지의 마이크로스피어의 입도 조절 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 고압균질기를 사용하여 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 v) 단계에서 유기용매를 제거하는 방법은 당 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 유기용매를 제거하는 방법은 예를 들면 교반, 가열, 질소퍼지(N2 purge) 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 있어, 현탁용액 또는 에멀젼 용액에 방출억제제를 혼합한 다음 이를 수성 매질에 투입하여 마이크로스피어 형성시 수불용성 또는 수난용성인 방출억제제가 마이크로스피어 내, 외부에 분포하면서 수용성인 생리활성물질이 외부 수성매질과의 접촉을 줄임으로써 초기 용출률을 줄이게 된다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 제조방법에서는 상기 v) 단계에서 유기용매를 제거한 후 수득된 마이크로스피어를 동결하는 단계가 더 포함될 수 있다. 또한 상기 동결 단계 전, 원심분리를 하는 단계 및/또는 투석(Dialysis)하는 단계 및/또는 여과 단계를 더 포함할 수 있다.
즉, 상기 과정을 거쳐 제조되는 마이크로스피어는 약물인 생리활성물질의 봉입률을 증가시키고, 사용되는 생체적합성 고분자의 분자량 및 락타이드의 함유비와 상관없이 약물의 과도한 초기 방출(initial burst)이 없는 0차 방출특성을 부여한다.
상기와 같이 제조되는 본 발명의 마이크로 캡슐은 동물에 투여되었을 때 약물의 혈중 농도 패턴은 다르지만, 28일까지 3ng/ml 이상의 약물농도를 유지하므로 1개월 이상의 장기 서방출성 제제로서 제형화가 가능하다.
본 발명은 본 발명에 따른 서방출성 마이크로스피어는 생리활성물질 특히, 펩타이드와 그 염을 함유하는 장기 서방출성 제제의 제조방법을 제공하며, 특히 초기 과다방출 억제 특성이 우수하여 투여 시 인체 내에서 1개월 이상 생리활성물질을 지속적이고 균일하게 방출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 마이크로스피어의 인비트로(in vitro) 장기 용출실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 마이크로스피어의 고세렐린 봉입률 측정 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 마이크로스피어의 형태측정 실험결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
< 비교예 > 일반적인 수중유화법 (O/W)에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 표 1 및 표 2에 제시된 함량에 따라 DMSO 0.2ml에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다(DP, Dispersion phase). 이 용액을 25℃에서 L4R 믹서(Silverson)로 격렬히 교반 (10,000 rpm) 되는 0.5% 폴리비닐알코올(Mw=30,000~70,000, 시그마) 수용액 90ml 와 에탄올 (99.5%) 10ml 혼합액에 시린지 펌프 (1ml/min)를 이용하여 서서히 적가하였다. 1분 후 이 O/W 액을 고압균질기 (Buffalo)에서 압력을 조절하여 마이크로스피어의 사이즈가 3±0.5μm 가 되도록 조절하여 10회 반복적으로 통과시켜 균질한 O/W액을 조제하였다. 이 O/W액을 교반기에서 400rpm 속도로 12시간 동안 유기용매를 휘발시켰다. 이후 마이크로스피어를 수득하기 위하여 원심분리(10,000g, 20분)하여, 증류수로 2회 세척한 후 72시간 동안 동결 건조하였다.
< 비교예 1> 고유점도가 다른 생체적합성 고분자를 이용한 고세렐린 함유 마이크로스피어의 제조
비교예1 -1 비교예1 -2 비교예1 -3
API 봉입량 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml
PLGA PLGA 502H1 )
500mg		 PLGA 503H2 )
500mg		 PLGA 504H3 )
500mg
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml
1)락타이드:글리콜리드=50:50, 베링거잉겔하임사, i.v.=0.20dl/g, Resomer TM
2) 락타이드:글리콜리드=50:50, 베링거잉겔하임사, i.v.=0.39dl/g, Resomer TM
3) 락타이드:글리콜리드=50:50, 베링거잉겔하임사, i.v.=0.52dl/g, Resomer TM
비교예 2> 락타이드 / 글리콜라이드의 조성이 다른 생체적합성 고분자를 이용한 제제설계
비교예2 -1 비교예2 -2 비교예2 -3
API 봉입량 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml
PLGA PLGA 502H1 )
500mg		 PLGA 752H2 )
500mg		 PLGA 202H3 )
500mg
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml
1) 락타이드:글리콜리드=50:50, 베링거잉겔하임사, i.v.=0.20dl/g, Resomer TM
2) 락타이드:글리콜리드=75:25, 베링거잉겔하임사, i.v.=0.20dl/g, Resomer TM
3) 락타이드:글리콜리드=100:0, 베링거잉겔하임사, i.v.=0.20dl/g, Resomer TM
비교예 3> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Medium chain triglyceide, MCT )의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 표 14에 따라 DMSO에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로 C6:0~C12:0으로 조성된 Medium chain triglyceide (MCT)를 표 3에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
비교예3 -1 비교예3 -2 비교예3 -3 비교예3 -4
API 봉입량 50mg 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
MCT* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 1> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Lecithin, 레시틴)의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로써, 레씨틴을 표 4에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예1 -1 실시예1 -2 실시예1 -3 실시예1 -4
API 봉입량 50mg 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Lecithin* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 2> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Cottonseed oil, 면실유)의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 면실유를 표 5에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예2 -1 실시예2 -2 실시예2 -3 실시예2 -4
API 봉입량 50mg 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Cottonseed oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 3> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Castor oil, 피마자유)의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 피마자유를 표 6에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예3 -1 실시예3 -2 실시예3 -3 실시예3 -4
API 봉입량 500mg 500mg 500mg 500mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Castor oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 4> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Corn oil, 옥수수유)의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 옥수수유를 표 7에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예4 -1 실시예4 -2 실시예4 -3 실시예4 -4
API 봉입량 500mg 500mg 500mg 500mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Corn oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 5> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Safflower oil, 해바라기유 )의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 해바라기유를 표 8에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예5 -1 실시예5 -2 실시예5 -3 실시예5 -4
API 봉입량 500mg 500mg 500mg 500mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Safflower oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 6> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Olive oil, 올리브유)의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 올리브유를 표 9에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예6 -1 실시예6 -2 실시예6 -3 실시예6 -4
API 봉입량 500mg 500mg 500mg 500mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Olive oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 7> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Sesame oil, 참기름)의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 참기름을 표 10에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예7 -1 실시예7 -2 실시예7 -3 실시예7 -4
API 봉입량 500mg 500mg 500mg 500mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Sesame oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 8> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Soybean oil, 대두유 )의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 대두유를 표 11에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예8 -1 실시예8 -2 실시예8 -3 실시예8 -4
API 봉입량 500mg 500mg 500mg 500mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Soybean oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실시예 9> 생체적합성 고분자 ( RG502H ) 와 방출억제제 (Peanut oil, 땅콩유 )의 오일분산상 ( ODP , Oil Dispersion phase) 혼합에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제로서, 땅콩유를 표 12에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예9 -1 실시예9 -2 실시예9 -3 실시예9 -4
API 봉입량 500mg 500mg 500mg 500mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Peanut oil* 0.1% 5% 10% 20%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
<실시예 10> 최소 3개월 지속적인 방출을 위한 고세렐린 아세테이트 함유 생분해성 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 표 13에 제시된 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제를 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예10-1 실시예10-2 실시예10-3
고세렐린 아세테이트
API 봉입량		 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml
PLGA 504H1) 500mg
PLGA 752H2) 500mg
PLGA 8583) 500mg
Castor oil* 10% 10% 10%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
1) 락타이드:글리콜리드=50:50, 베링거잉겔하임사, MW.=50,000, Resomer TM
2) 락타이드:글리콜리드=75:25, 베링거잉겔하임사, MW.=20,000, Resomer TM
3) 락타이드:글리콜리드=100:0, 베링거잉겔하임사, MW.=220,000, Resomer TM
< 실시예 11> 수용액상(CP)의 공용매 (에탄올)에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제를 표 14에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이 용액을 25℃에서 L4R 믹서(Silverson)로 격렬히 교반 (10,000 rpm) 되는 0.5% 폴리비닐알코올(Mw=30,000~70,000, 시그마) 수용액과 에탄올 (99.5%) 혼합액을 표 14에 제시된 함량에 따라 수성용매를 조성한 후 시린지 펌프 (1ml/min)를 이용하여 서서히 적가하였다. 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예11 -1 실시예11 -2 실시예11 -3 실시예11 -4
API 봉입량 50mg 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Castor oil* 10% 10% 10% 10%
0.5% PVA solution 100ml 99ml 90ml 50ml
EtOH (99.5%) 1ml 10ml 50ml
* PLGA 중량 대비 %
< 실시예 12> 비수용액상(ODP)의 DMSO에 의한 마이크로스피어의 제조
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 표 15에 따라 DMSO에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제를 표 15에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예12 -1 실시예12 -2 실시예12 -3 실시예12 -4 실시예12 -5
API 봉입량 50mg 50mg 50mg 50mg 50mg
DMSO# 0% 190% 400% 1000% 1000.1%
MC 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg 500mg
Castor oil* 10% 10% 10% 10% 10%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
# API 중량 대비 %
< 실시예 13> 생리활성물질의 봉입에 의한 마이크로스피어의 제조
생리활성물질 50mg을 표 16에 따라 DMSO에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제를 표 15에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실시예13 -1 실시예13 -2 실시예13 -3 실시예13 -4
루프롤리드 (Leuproride) 50mg 50mg
리라를루타이드 (Liraglutide) 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg 500mg
Castor oil* 10% 10%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
실험예 1> 약물의 시험관내 (in vitro) 방출 실험
고세렐린 아세테이트(USP급) 50mg을 DMSO 0.2ml 에 용해시키고 생체적합성고분자 500mg을 메틸렌클로라이드 1ml에 용해시킨 후 방출억제제를 표 17에 제시된 함량에 따라 용해시켜 투명한 에멀젼을 제조하였다 (ODP, Oil Dispersion phase). 이하의 제조과정은 비교예와 동일하게 실시하였다.
실험예1 -1 실험예1 -2 실험예1 -3
API 봉입량 50mg 50mg 50mg
DMSO 0.2ml 0.2ml 0.2ml
MC 1ml 1ml 1ml
PLGA 502H 500mg 500mg 500mg
Castor oil* 0.1% 10% 20.1%
0.5% PVA solution 90ml 90ml 90ml
EtOH (99.5%) 10ml 10ml 10ml
* PLGA 중량 대비 %
제조된 고분자 마이크로스피어로부터 친수성 약물이 지속적으로 방출제어 되는지 확인하기 위하여, 다음의 시험관내(in vitro) 조건으로 약물방출 실험을 진행하였다. 즉, 비교예 1-1과 실험예 1 그리고 실시예예 1~9에서 방출억제제가 10% 적용되어 제조된 고분자 마이크로스피어 그리고 3개월 제형인 실시예 10에서 제조된 고분자 마이크로스피어 50 mg을 정확하게 평량하여 방출병에 넣은 후, pH 7.4인 인산염 완충용액 50 ml을 넣어 밀봉시킨 후 37℃에서 분당 120회 속도의 진탕항온수조(shaking water bath)에 두고 28일 이상 약물이 지속적으로 방출되도록 하였다. 방출된 약물들은 방출액을 1 ml씩 취하여 20,000g에서 10분간 원심분리 한 후 그 상등액 100 ul를 그 약물의 농도를 실험예 1과 같이 HPLC 정량법으로 측정하였고, 남은액은 재분산 하여 시험관 내에 보충하여 주었다. 측정결과를 도 1 (A) 에 제시하였으며, 방출억제제가 사용되지 않은 마이크로스피어 (비교예1-1)의 1일차 약물 방출률은 70%로 초기 과다 방출(initial burst)이 나타났으며, Medium chain triglyceride (MCT) 가 10% 사용된 마이크로스피어 (비교예3-3)의 1일차 약물 방출률도 50%로 마찬가지로 초기 과다 방출이 나타난 것을 확인 할 수 있다. 그러나 실험예 1에서 방출억제제 (Castor oil)가 0.1% 도입된 마이크로스피어의 1일차 약물 방출률은 약 20%이며, 방출억제제가 100% 도입된 마이크로스피어의 1일차 약물 방출률은 약 10% 내외였다. 그러나 방출억제제가 20.1% 도입된 마이크로스피어의 28일차 약물 방출률은 약 85%로 28일 내에 약물 방출이 완전히 이루어지지 않았음을 알 수 있다. 또한 도 1(B)에 제시된, 실시예 1-9에 의하면, 장쇄 지방산(long-chain fatty acid)로 구성된 오일을 방출억제제로 사용하였을 때, 초기 용출률이 상당히 작으면서 1개월 이상 0차 방출 특성을 나타내고 있음을 알 수 있다. 그리고 도 1 (C)는 실시예 10에서 제시된 최소 3개월에 방출률을 나타낼 수 있음을 제시하였다.
실험예 2> 약물의 봉입율 측정 실험
제조된 고분자 마이크로스피어 20 mg을 정확하게 평량하여 뚜껑이 달린 시험관에 넣고, 3 ml의 메틸렌클로라이드에 충분히 용해시킨 후 5 ml의 증류수를 가하고 60분간 격렬히 교반하였다. 이후 이 용액을 3,000g으로 5분간 원심분리 하여주고, 일정량의 상층액을 취하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 약물의 농도를 측정하여 마이크로스피어 내에 봉입되어있는 약물의 봉입율을 계산하였다. 이때 사용된 컬럼은 Waters C-18 (4.6×150mm)이며, 주입량은 20㎕이고 검출파장은220nm이었다. 이동상으로는 0.1% TFA가 함유된 물(a)과 아세토니트릴(b)을 75%:25% 비율로 사용하였다.
제조된 마이크로스피어의 봉입량을 도 2 (A)와 (B) 에 제시하였으며, 이에 의하면 방출억제제의 농도가 0.1~20%까지 증가할수록 약물의 봉입률이 증가하였으며, 방출억제제가 도입된 제형의 약물 봉입량이 50-100%를 나타내었다. 또한 방출억제제가 5% 이상 적용된 마이크로스피어의 봉입률은 70%를 나타내었다. 그러나 방출억제제제가 도입되지 않은 비교예 1~2 제형 그리고 medium chain triglyceride가 도입된 비교예 3 제형의 약물 봉입량은 50%이내로 나타내었다. 또한 방출억제제 중 피마자유의 경우, 다른 방출억제제 보다 약 10% 높은 봉입률을 나타내어 가장 우수한 약물 봉입 효율을 나타내었다.
삭제
실험예 3> 마이크로스피어의 입자 형태측정
미립자의 외관을 관찰하기 위하여 마이크로스피어 약 50mg을 알루미늄 스터브에 고정시키고 진공도 0.1torr 및 고전압 (10kV)하에서 15분간 백금으로 코팅한 후, SEM 본체에 장착하고 이미지 분석프로그램을 사용하여 마이크로스피어의 모폴로지를 관찰하였다. 측정결과를 도 3에 제시하였으며, 이에 의하면 이에 의하면 방출억제제가 사용되지 않은 마이크로스피어와 medium chain triglyceride (MCT) 가 사용된 마이크로스피어의 표면에는 많은 다공성이 괸찰된 반면 방출억제제(Castor oil)가 적용되어 제조된 마이크로스피어의 다공성이 감소되어 마이크로스피어 표면에 도입되어 있음을 확인할 수 있다.
또한 방출억제제가 도입된 마이크로스피어에서 공용매로 사용한 에탄올에 의해 마이크로스피어의 응집이 감소되었음을 알 수 있다.

Claims (21)

  1. 생리활성물질, 생체적합성 고분자 및 방출억제제를 포함하되,
    상기 생리활성물질이 봉입된 생체적합성 고분자가 방출억제제에 의해 추가로 봉입된, 지질 매트릭스 형태의 서방출성 마이크로스피어로서,
    상기 방출억제제는 C18:1, C18:1(OH) 또는 C18:2의 장쇄 지방산을 포함하는 오일류이며, 상기 C18:1, C18:1(OH) 또는 C18:2의 장쇄 지방산을 포함하는 오일류는 레시틴, 면실유, 피마자유, 옥수수유, 해바라기유, 참기름, 대두유 및 땅콩유로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    상기 방출억제제는 생체적합성 고분자 100 중량부에 대해, 0.1 내지 20 중량부로 포함되며,
    상기 생리활성물질은 고세렐린 또는 루프롤리드이고, 마이크로스피어 전체 중량에 대해, 1.0 내지 30 중량%로 포함되며,
    상기 생체적합성 고분자는 폴리락티드-코-글리코리드(PLGA)이며 마이크로스피어 전체 중량에 대하여 70 내지 99 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 서방출성 마이크로스피어.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 생리활성물질은 마이크로스피어 전체 중량에 대하여 2.0 내지 20 중량%로 포함되는 것인, 서방출성 마이크로스피어.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생리활성물질은 고세렐린인, 서방출성 마이크로스피어.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 마이크로스피어 전체 중량에 대하여 80 내지 98 중량%로 포함되는 것인, 서방출성 마이크로스피어.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방출억제제는 상기 생체적합성 고분자 100 중량부에 대해, 0.1 내지 10 중량부로 포함되는 것인, 서방출성 마이크로스피어.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 C18:1, C18 : 1(OH) 또는 C18:2 지방산을 포함하는 오일류는 피마자유인, 서방출성 마이크로스피어.
  10. 삭제
  11. i) 생체적합성 고분자 폴리락티드-코-글리코리드(PGA)를 유기용매에 용해시키는 단계;
    ⅱ) 상기 i) 단계에서 제조된 생체적합성 고분자가 용해된 유기용매에 생리활성물질로 고세렐린 또는 루프롤리드에 용해보조제로 디메틸설폭시드(DMSO)를 상기 생리활성물질의 중량 대비 200 내지 1,000 중량%로 첨가하고, 상기 i) 단계에서 제조된 생체적합성 고분자가 용해된 유기용매에 상기 용해보조제를 첨가한 생리활성물질을 용해시켜 비수성 용액을 제조하는 단계;
    ⅲ) 상기 ⅱ) 단계에서 제조된 비수성 용액에 레시틴, 면실유, 피마자유, 옥수수유, 해바라기유, 올리브유, 참기름, 대두유, 및 땅콩유로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방출억제제를 혼합하는 단계;
    ⅳ) 상기 ⅲ) 단계에서 형성된 에멀젼을 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 및 펜탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 1가 알코올인 공용매를 방출억제제제 대 공용매 비율 1:20 내지 1: 400로 포함하는 수성 매질에 투입하여 마이크로스피어를 형성시키고, 이후 입도를 조절하는 단계; 및
    ⅴ) 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 서방출성 마이크로스피어의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 i) 단계에서 사용되는 유기용매는 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세토니트릴, 디메틸설폭시드, 디메틸포름아마이드 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매인 것인, 서방출성 마이크로스피어의 제조 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제11항에 있어서, 상기 공용매는 에탄올인 것인, 서방출성 마이크로스피어의 제조방법.
  20. 제11항에 있어서, v) 단계 이후에 제조된 서방출성 마이크로스피어를 동결건조시키는 단계를 더 포함하는 것인, 서방출성 마이크로스피어의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 동결건조시키는 단계는 원심 분리, 투석 및 여과로 이루어진 군에서부터 선택되는 어느 하나의 단계를 더 포함하는 것인, 서방출성 마이크로스피어의 제조방법.
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