KR20110033874A - 바이오연료 전지 및 센서에 사용하기 위한 효소 고정화 - Google Patents

바이오연료 전지 및 센서에 사용하기 위한 효소 고정화 Download PDF

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Abstract

4차 암모늄으로 처리된 나피온® 중합체 막, 및 상기 나피온® 중합체 내에 혼입된 디히드로게나제를 포함하는 바이오애노드가 개시된다. 디히드로게나제는 유기 연료의 산화를 촉매하고, 아데닌 디뉴클레오티드를 환원시킨다. 이온 전도성 중합체 막은 폴리메틸렌 그린 산화환원 중합체 막에 병렬로 위치하고 있으며, 이는 환원된 아데닌 디뉴클레오티드를 전기적으로 산화시킨다. 바이오애노드는 연료 전지 내에서 사용되어 높은 전력 밀도를 생성한다.

Description

바이오연료 전지 및 센서에 사용하기 위한 효소 고정화{ENZYME IMMOBILIZATION FOR USE IN BIOFUEL CELLS AND SENSORS}
본 발명은 일반적으로 연료 전지 및 전기 생성 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이온 전도성 중합체와 같은 고정화 물질 내에 혼입된 생물학적 효소를 함유하는 애노드, 및 이를 사용하여 전기를 생성하는 방법에 관한 것이다.
바이오연료 전지는, 중합체 전해질 막("PEM")에 의해 분리된 캐소드 및 애노드로 구성된다는 점에서, 전통적인 중합체 전해질 막 연료 전지와 유사하다. 바이오연료 전지는 전기화학 반응을 촉진시키는데 사용되는 물질이 전통적인 연료 전지와 다르다. 바이오연료 전지는 귀금속을 촉매로 사용하기 보다는, 효소와 같은 생물학적 분자에 의존하여 반응을 수행한다. 초기의 바이오연료 전지 기술은 전체 미생물의 대사 경로를 이용하였지만, 이 방법과 연관된 문제는 전체 생물의 낮은 부피 촉매 활성 및 비실용적인 전력 밀도 출력을 포함한다[1]. 효소 단리 기법이 부피 활성 및 촉매 역량을 증가시킴으로써 바이오연료 전지 분야의 진보에 박차를 가하였다[1]. 단리된 효소 바이오연료 전지는 세포막의 전자 전달 방해와 관련된 간섭을 극복하는것에 의한 전력 밀도 출력의 증가 및 연료를 소비하는 미생물 성장의 결핍을 낳는다.
효소는 매우 효율적인 촉매이긴 하지만, 이것을 연료 전지에 혼입시키는 것이 문제로 되어왔다. 초기의 효소 기재 연료 전지는 효소를 전극 표면에 고정시키기 보다는 용액에 함유하였다[1, 및 본원에 참고문헌으로 인용되는 1에 포함된 참고문헌]. 용액 중의 효소는 수 일 동안만 안정하나, 고정된 효소는 수 개월 동안 안정할 수 있다. 효소 기재 바이오연료 전지의 주된 장애 중 하나는, 전극 표면의 막에 효소를 고정하고(이는 효소의 수명을 연장할 것이다), 전극 표면에 전기 용량 영역을 형성하지 않으면서 기계적 및 화학적으로 안정한 층을 형성하는 것이다. 대부분의 H2/O2 연료 전지에서, 전극 표면에서 촉매를 고정하는 결합제는 나피온(Nafion, 등록상표)이다. 나피온은 이온 전도체로서 우수한 성질을 갖는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체이다. 그러나, 나피온은, 효소의 수명 및 활성을 감소시키는 산성 막을 형성하므로, 바이오연료 전지 전극의 표면에서 효소를 고정하는데 성공적이지 못하였다.
발명의 요약
본 발명의 다양한 측면 중 하나는 연료 유체, 전자 매개체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며, 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질, 및 (d) 전자 전도체에 인접한 전기촉매(electrocatalyst)(전기촉매의 산화된 형태는 전자 매개체의 환원된 형태와 반응하여 전자 매개체의 산화된 형태 및 전기촉매의 환원된 형태를 생성할 수 있고, 전기촉매의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 포함하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
본 발명의 다른 측면은 연료 유체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 전자 매개체를 포함하고, 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며, 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질, 및 (d) 전자 전도체에 인접한 전기촉매(전기촉매의 산화된 형태는 전자 매개체의 환원된 형태와 반응하여 전자 매개체의 산화된 형태 및 전기촉매의 환원된 형태를 생성할 수 있고, 전기촉매의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 포함하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
본 발명의 추가의 측면은 연료 유체, 전자 매개체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 마이셀 또는 역 마이셀 구조를 포함하고, 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질, 및 (d) 전자 전도체에 인접한 전기촉매(전기촉매의 산화된 형태는 전자 매개체의 환원된 형태와 반응하여 전자 매개체의 산화된 형태 및 전기촉매의 환원된 형태를 생성할 수 있고, 전기촉매의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 포함하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
또 다른 측면은 연료 유체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 전자 매개체를 포함하고, 마이셀 또는 역 마이셀 구조를 포함하며, 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질, 및 (d) 전자 전도체에 인접한 전기촉매(전기촉매의 산화된 형태는 전자 매개체의 환원된 형태와 반응하여 전자 매개체의 산화된 형태 및 전기촉매의 환원된 형태를 생성할 수 있고, 전기촉매의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 포함하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
추가의 측면은 연료 유체, 전자 매개체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태(이 전자 매개체의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며, 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하고, 연료 유체를 산화시켜 전기를 생성하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
또 다른 측면은 연료 유체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태(이 전자 매개체의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 전자 매개체를 포함하고, 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며, 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하고, 연료 유체를 산화시켜 전기를 생성하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
본 발명의 추가의 측면은 연료 유체, 전자 매개체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태(이 전자 매개체의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 마이셀 또는 역 마이셀 구조를 포함하고, 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하며, 연료 유체를 산화시켜 전기를 생성하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
다른 측면은 연료 유체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태(이 전자 매개체의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 전자 매개체를 포함하고, 마이셀 또는 역 마이셀 구조를 포함하며, 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하고, 연료 유체를 산화시켜 전기를 생성하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
또 다른 측면은 연료 유체, 전자 매개체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태(이 전자 매개체의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체를 포함하며, 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하고, 연료 유체를 산화시켜 전기를 생성하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
추가의 측면은 연료 유체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태(이 전자 매개체의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 전자 매개체를 포함하고, 알킬암모늄 염 추출된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체를 포함하며, 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하고, 연료 유체를 산화시켜 전기를 생성하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
본 발명의 다른 측면은 연료 유체, 전자 매개체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체를 포함하며, 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질, 및 (d) 전자 전도체에 인접한 전기촉매(전기촉매의 산화된 형태는 전자 매개체의 환원된 형태와 반응하여 전자 매개체의 산화된 형태 및 전기촉매의 환원된 형태를 생성할 수 있고, 전기촉매의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 포함하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
또 다른 측면은 연료 유체, 전자의 존재하에서 산화제를 환원하여 물을 형성할 수 있는 캐소드, 및 (a) 전자 전도체, (b) 전자 매개체의 산화된 형태 및 연료 유체와 반응하여 연료 유체의 산화된 형태 및 전자 매개체의 환원된 형태를 생성할 수 있는 1종 이상의 효소, (c) 전자 매개체를 포함하고, 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체를 포함하며, 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질, 및 (d) 전자 전도체에 인접한 전기촉매(전기촉매의 산화된 형태는 전자 매개체의 환원된 형태와 반응하여 전자 매개체의 산화된 형태 및 전기촉매의 환원된 형태를 생성할 수 있고, 전기촉매의 환원된 형태는 전자를 전자 전도체에 방출할 수 있음)를 포함하는 바이오애노드를 포함하는, 전기를 생성하기 위한 바이오연료 전지이다.
추가의 측면은 상기 본 발명의 측면 중 어느 하나의 바이오연료 전지를 사용하여 전기를 생성하는 방법이다.
본 발명의 다른 측면은, 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며 효소보다 작은 화합물에 투과성인 비천연 콜로이드 고정화 물질에 고정된 효소이다.
또 다른 측면은, 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며 효소보다 작은 화합물에 투과성인 비세포성 콜로이드 고정화 물질에 고정된 효소이다.
추가의 측면은, 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며 효소보다 작은 화합물에 투과성인 마이셀 또는 역 마이셀 고정화 물질에 고정된 효소이다.
다른 측면은, 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며 효소보다 작은 화합물에 투과성인 양이온 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체에 고정된 효소이다.
또 다른 측면은 바이오애노드 및 캐소드를 포함하고, (a) 상기 바이오애노드가 카본 클로쓰(cloth), 폴리메틸렌 그린의 산화환원 중합체 필름, 염 추출된 테트라부틸암모늄 브로마이드로 처리된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체 및 알코올 디히드로게나제를 포함하고, (b) 상기 알코올 디히드로게나제가 상기 염 추출된 테트라부틸암모늄 브로마이드로 처리된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체의 마이셀 구획 내에 혼입되어 있으며, (c) 상기 폴리메틸렌 그린의 산화환원 중합체 필름이 상기 염 추출된 테트라부틸암모늄 브로마이드로 처리된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체 및 상기 카본 클로쓰와 병렬되어 있는, 바이오연료 전지이다.
추가의 측면은 지지막, 산화환원 중합체, 4차 암모늄 염으로 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체 및 디히드로게나제를 포함하고, (a) 상기 디히드로게나제가 상기 4차 암모늄 염으로 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체 내에 혼입되어 있고, (b) 상기 산화환원 중합체가 상기 지지막 및 상기 4차 암모늄 염으로 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체와 병렬되어 있는 바이오애노드이다.
다른 측면은 카본 클로쓰 지지막, 폴리메틸렌 그린 산화환원 중합체, 4차 암모늄 염으로 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체 및 알코올 디히드로게나제를 포함하고, (a) 상기 디히드로게나제가 4차 암모늄 염으로 개질된 나피온 중합체 내에 혼입되어 있고, (b) 상기 산화환원 중합체가 상기 카본 클로쓰 지지막 및 상기 4차 암모늄 염으로 개질된 나피온 중합체와 병렬되어 있는 바이오애노드이다.
또 다른 측면은 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체의 마이셀 내에 혼입되어 있는 1종 이상의 효소를 포함하는, 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체이다.
추가의 측면은 유기 연료를 애노드에 혼입된 산화환원 효소의 존재 하에서 애노드에서 산화시키고, 산소를 캐소드에서 환원시키는 것을 포함하고, (a) 상기 애노드가 이온 전도성 중합체, 산화환원 중합체 막 및 지지막을 포함하고, (b) 상기 산화환원 효소가 상기 이온 전도성 중합체 내에 고정화되어 있고, (c) 보조인자가 애노드에서 산화 반응 동안 환원되며, (d) 산화환원 중합체 막이 환원된 보조인자의 산화를 촉진하는, 전력을 생성하는 방법이다.
본 발명의 다른 측면은 알코올을 애노드에서 산화시키고, 산소를 캐소드에서 환원시키는 것을 포함하고, (a) 상기 애노드가 폴리메틸렌 그린 중합체, 4차 암모늄 브로마이드로 처리된 나피온 중합체, 카본 섬유 지지막 및 알코올 디히드로게나제를 포함하고, (b) 상기 알코올 디히드로게나제가 상기 4차 암모늄 브로마이드로 처리된 나피온 중합체의 마이셀 구획 내에 고정화되어 있고, (c) NAD+가 애노드에서 알코올의 산화 반응 동안 NADH로 환원되며, (d) 상기 NADH가 상기 폴리메틸렌 그린 중합체에서 NAD+로 전기화학적으로 산화되는, 전력을 생성하는 방법이다.
본 발명의 효소 고정화 물질에 고정된 효소는, 증가된 효소 안정성이 유리한 분야에서 유용한, 특히 바이오연료 전지 및 바이오센서에서 유용한 고정된 효소이다. 고정화 물질은 기계적 및 화학적 안정성을 제공하는 장벽을 형성하며, 따라서, 이전에 공지된 것보다 더 장기간 효소를 안정화시키는 효과를 가진다. 효소가 적어도 약 30일 내지 약 365일 동안 그의 초기 촉매 활성의 약 75% 이상을 유지할 경우, 상기 효소는 "안정화된다".
도 1: 바이오연료 전지의 개략도(비율에 따르지 않음).
도 2: 에탄올의 알데히드로의 산화가 NAD+-의존성 알코올 디히드로게나제(ADH)에 의해 촉진된다. NADH는 폴리(메틸렌 그린)-개질된 전극에서 전기분해된다.
도 3: 0.60 V의 개방 전류 전압의 실온에서 에탄올/O2 바이오연료 전지에 대한 대표적 전력 곡선.
도 4는 pH 7.15 인산염 완충액 중 NAD+ 및 에탄올로 처리된 개질된 나피온 막에 고정된 알코올 디히드로게나제에서 NADH 형성의 형광 현미경사진 시리즈이며, 여기서 (a)는 비개질 나피온 막이고, (b)는 테트라메틸암모늄 브로마이드/나피온 막이고, (c)는 테트라에틸암모늄 브로마이드/나피온 막이고, (d)는 테트라프로필암모늄 브로마이드/나피온 막이고, (e)는 테트라부틸암모늄 브로마이드/나피온 막이고, (f)는 테트라펜틸암모늄 브로마이드/나피온 막이다.
도 5는 pH 7.15 인산염 완충액 중 NAD+ 및 에탄올 용액으로 처리된 테트라부틸암모늄 브로마이드/나피온 막에 고정된 가열 냉각된 알코올 디히드로게나제의 형광 현미경사진이다.
도 6은 pH 7.15 인산염 완충액 중 NAD+ 및 아세트알데히드 용액으로 처리된 테트라펜틸암모늄 브로마이드/나피온 막에 고정된 알데히드 디히드로게나제의 형광 현미경사진이다.
도 7은 나피온 막에 고정된 락카아제를 사용하는 바이오캐소드의 개략도이다.
도 8은 테트라부틸암모늄 브로마이드/나피온 막에 대한 연료를 비교하는 순환 전압-전류 그림이다.
도 9는 유리질 나 탄소 전극 상의 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)의 순환 전압-전류 그림이다.
도 10은 에탄올 센서에 대한 전류 대 시간 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 11은 바이오연료 전지에 대한 막 전극 어셈블리(MEA) 개략도이다.
도 12는 0.599 V의 개방 전류 전압을 제공하는 실온에서 작동하는 에탄올/O2 막 전극 어셈블리(MEA) 바이오연료 전지에 대한 대표적 전력 곡선이다.
본 발명의 다양한 측면 중 하나는 증가된 효소 안정성이 유리한 분야에서 유용한, 특히 바이오연료 전지 및 바이오센서에서 유용한 고정된 효소이다. 고정화 물질은 기계적 및 화학적 안정성을 제공하는 장벽을 형성하며, 따라서, 이전에 공지된 것보다 더 장기간 효소를 안정화시킨다. 본 발명의 목적상, 효소가 적어도 약 30일 내지 약 365일 동안 그의 초기 촉매 활성의 약 75% 이상을 유지할 경우, 상기 효소는 "안정화된다". 본 발명의 다양한 측면 중 다른 측면은 유기 연료(또는 수소, 암모니아 또는 탄화수소를 포함하는 연료 유체)를 이용하여 효소 매개된 산화환원(산화/환원) 반응을 거쳐 전기를 생성하는 연료 전지이다. 본 발명의 다른 측면은 바이오애노드 및 캐소드를 포함하고, 상기 바이오애노드가 전해질에 의해 캐소드로부터 분리된 바이오연료 전지이다. 상기 바이오애노드는 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하고, 효소를 고정하며, 효소를 안정화시킨다. 고정된 효소의 안정성으로 인해 바이오연료 전지는 적어도 약 30일 내지 약 365일 동안 초기 전류의 약 75% 이상을 생성할 수 있다.
A. 효소 고정화
일반적으로, 효소는 이를 고정하고 안정화시키는 고정화 물질에 고정된다. 본 발명의 고정화 물질 내에 고정된 효소는 다양한 분야에 이용될 수 있다. 이하에 기술되는 효소 및 고정화 물질은 본 발명의 분야에 사용될 수 있다.
1. 효소
효소는 목적하는 반응을 촉진하기 위해 사용된다. 일반적으로, 천연 효소, 합성 효소, 인공 효소 및 변형된 천연 효소가 고정될 수 있다. 또한, 천연 또는 지시된 진화에 의해 가공된 가공 효소도 사용될 수 있다. 달리 말하면, 효소의 성질을 흉내내는 유기 또는 무기 분자가 본 발명의 구현에 사용될 수 있다.
예시적 효소는 산화환원효소이다.
2. 효소 고정화 물질
효소는 효소 고정화 물질에 고정된다. 한 구현예에서, 효소 고정화 물질은 효소보다 작은 화합물에 투과성이며, 효소를 고정하고, 안정화시킨다. 고정된 효소는 그의 촉매 활성을 유지한 채 고정화 물질의 일정 영역에 물리적으로 구속된다. 캐리어 결합, 교차 결합 및 포획을 비롯하여, 효소 고정화에는 다양한 방법이 존재한다. 캐리어 결합은 효소를 수-불용성 캐리어에 결합시키는 것이다. 교차 결합은 이관능성 또는 다관능성 시약에 의해 효소를 분자간 교차 결합시키는 것이다. 포획은 효소를 반투성 물질의 격자 내로 혼입시키는 것이다. 예를 들면, 효소를 반투성 겔 내로 혼입하거나, 반투성 중합체 막에 넣을 수 있다. 효소 고정화의 구체적 방법은 그다지 중요하지 않으나, 고정화 물질은 (1) 연료 유체에 투과성이고, (2) 효소를 고정하며, (3) 효소를 안정화시킨다.
효소 고정화 물질은 효소보다 작은 화합물에 투과성이다. 달리 말하면, 고정화 물질은 효소보다 작은 화합물이 그것을 통과하여 상기 화합물이 상기 고정화 물질 상에 또는 그 내부에 고정된 효소와 접촉할 수 있도록 한다. 효소 고정화 물질은, 상기 화합물이 고정화 물질을 통과하도록 하나, 효소를 고정화 물질 내의 실질적으로 동일한 공간에 구속하는 공극, 채널, 개구 또는 이들의 조합을 함유하도록 제조될 수 있다.
효소 고정화 물질은 효소를 실질적으로 상기 물질의 특정 영역에 물리적으로 구속하며, 효소가 그의 촉매적 활성을 유지하도록 할 것이다. 한 구현예에서, 바람직하게는, 효소는 그와 실질적으로 동일한 크기 및 형상의 공간에 구속되며, 상기 효소는 그의 촉매 활성 모두를 실질적으로 유지한다. 효소 고정화 물질은 공극, 채널, 개구 또는 이들의 조합을 함유하며, 상기 공극, 채널, 개구 또는 이들의 조합은 효소가 실질적으로 그의 공간으로부터 이동하지 못하게 하나, 효소보다 작은 화합물이 상기 고정화 물질을 통과하여 효소와 접촉하게 한다. 상기 공극, 채널 또는 개구는 상기 요건을 만족하는 물리적 치수를 가지며, 고정될 특정 효소의 크기 및 형상에 의존한다.
한 구현예에서, 바람직하게는, 효소는 고정화 물질의 공극 내에 위치하며, 연료 유체가 수송 채널을 통하여 고정화 물질의 안팎으로 이동한다. 상기 공극 및 수송 채널의 상대 크기는 공극은 효소를 고정하기에 충분히 크나, 수송 채널은 효소가 이것을 이동할 수 없을 정도로 작을 수 있다. 추가의 구현예에서, 바람직하게는, 수송 채널은 약 10 nm 이상의 직경을 갖는다. 다른 구현예에서, 공극 대 수송 채널의 직경의 비는 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 그 이상이다. 또 다른 구현예에서, 바람직하게는, 수송 채널은 약 10 nm 이상의 직경을 가지며, 공극 대 수송 채널의 직경의 비는 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 그 이상이다.
또한, 효소 고정화 물질은 효소를 안정화시킨다. 효소 고정화 물질은 효소를 변성으로부터 보호함으로써 효소를 안정화시키기 위해 화학적 및 기계적 장벽을 제공한다. 달리 말하면, 고정화 물질은 효소 환경을 완충하고, 효소 변성을 늦춘다. 또한, 고정화 물질은 효소를 물리적으로 구속하며, 상기 물리적 구속은 효소에 비폴딩(unfolding) 공간을 제공하지 않는다. 폴딩된 입체 구조로부터의 비폴딩은 효소 변형의 기작이다. 한 구현예에서, 바람직하게는, 고정화 물질은 효소가 그의 촉매 활성을 적어도 약 30일 내지 약 365일 동안 유지하도록 효소를 안정화시킨다. 촉매 활성의 유지는 효소가 그의 초기 활성의 약 75% 이상을 유지하는 일 수로 정의된다. 효소 활성은 화학발광, 전기화학, UV-Vis, 방사화학 또는 형광 분석에 의해 측정될 수 있으며, 여기서 특성의 강도가 초기에 측정된다. 강도가 초기 강도의 약 75% 이상일 때 효소는 촉매 활성을 유지하는 것으로 고려된다. 전형적으로, 형광 분석이 효소 활성을 측정하는데 사용된다. 용액 중의 자유 효소는 수 시간 내지 수 일 내에 그의 촉매 활성을 잃는다. 따라서, 효소의 고정화는 안정성에 상당한 이점을 제공한다. 다른 구현예에서, 바람직하게는, 고정된 효소는 적어도 약 30일, 45일, 60일, 75일, 90일, 105일, 120일, 150일, 180일, 210일, 240일, 270일, 300일, 330일, 365일 또는 그 이상 동안 그의 초기 촉매 활성의 약 75% 이상을 유지하며, 바람직하게는 적어도 약 30일, 45일, 60일, 75일, 90일, 105일, 120일, 150일, 180일, 210일, 240일, 270일, 300일, 330일, 365일 또는 그 이상 동안 그의 초기 촉매 활성의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다.
추가의 구현예에서, 효소 고정화 물질은 비천연 콜로이드 물질이다. 또 다른 구현예에서, 효소 고정화 물질은 리포좀과 같은 비세포성 콜로이드 물질이다. 비세포성 물질은 세포로 형성되지 않고, 세포를 함유하지 않는다. 콜로이드 물질은 다른 물질에 분산된 입자로 이루어진 물질이며, 상기 입자는 보통의 광학 현미경으로 분별할 수 없을 정도로 작으나, 반투성 막을 통과할 수 없다. 추가의 구현예에서, 콜로이드 물질은 원자나 보통의 분자보다는 상당히 크지만 육안으로 볼 수 없을 정도로 작은 입자로 이루어진 물질이다. 이들은 크기가 약 10-7 내지 10-3 cm 범위일 수 있고, 다양한 방법으로 서로 연결되거나 결합된다.
다른 구현예에서, 효소 고정화 물질은 마이셀 또는 역 마이셀 구조를 갖는다. 일반적으로, 마이셀을 구성하는 분자는 애노드성, 즉, 극성인 친수성기와 비극성인 소수성기를 함유한다. 상기 분자는 응집하여 마이셀을 형성할 수 있고, 이 때 극성기는 응집체의 표면 상에 존재하고, 탄화수소의 비극성기는 응집체의 내부에 격리된다. 역 마이셀은 극성기와 비극성기의 배열이 반대이다. 응집체를 구성하는 애노드성 분자는, 극성기가 서로 근접해 있고 비극성기가 서로 근접해 있는 이상, 스스로 다양한 방법으로 배열될 수 있다. 또한, 상기 분자는 비극성기가 서로를 향해 있고, 극성기가 서로 떨어져 있는 이중층을 형성할 수 있다. 또는, 극성기가 서로를 향해 있고, 비극성기가 서로 떨어져 있는 이중층이 형성될 수 있다.
일반적으로, 마이셀 또는 역 마이셀 고정화 물질은 중합체, 세라믹, 리포좀일 수 있거나, 또는 마이셀 또는 역 마이셀 구조를 형성하는 다른 분자로부터 형성될 수 있다. 마이셀 또는 역 마이셀 고정화 물질의 예는 퍼플루오로술폰산-폴리테트라플루오로 에틸렌(PTFE) 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) (나피온 또는 플레미온(Flemion, 등록상표)), 개질된 퍼플루오로술폰산-폴리테트라플루오로 에틸렌(PTFE) 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) (개질된 나피온 또는 개질된 플레미온), 폴리술폰, 마이셀 중합체, 폴리(에틸렌 옥사이드) 기재 블록 공중합체, 마이크로에멀젼 및(또는) 마이셀 중합화로부터 형성된 중합체, 및 알킬 메타크릴레이트, 알킬 아크릴레이트 및 스티렌의 공중합체이다. 마이셀 또는 역 마이셀 고정화 물질의 다른 예는 세라믹, 나트륨 비스(2-에틸헥실)술포숙시네이트, 나트륨 디옥틸술폰숙시네이트, 지질, 인지질, 나트륨 도데실 술페이트, 데실트리메틸암모늄 브로마이드, 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드, (4-[(2-히드록실-1-나프탈레닐)아조]벤젠술폰산 1 나트륨염), 리놀레산, 리놀렌산, 콜로이드, 리포좀 및 마이셀 네트워크이다.
한 구현예에서, 바람직하게는, 마이셀 고정화 물질은 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) (개질된 나피온 또는 개질된 플레미온) 막이다. 상기 퍼플루오르화 이온 교환 중합체 막은 암모늄(NH4+) 이온보다 더 큰 소수성 양이온으로 개질된다. 상기 소수성 양이온은 여러 기능을 갖는다. 첫 째, 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체)를 소수성 양이온과 혼합-주조(mixture-cast)하여 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) (나피온 또는 플레미온) 막을 생성하는 것은 공극 크기가 소수성 양이온의 크기에 의존하는 고정화 물질을 제공한다. 따라서, 소수성 양이온이 클수록, 공극 크기가 커진다. 소수성 양이온의 이러한 기능은 소수성 양이온의 크기를 변화시킴으로써 공극 크기를 더 크거나 작게 하여 특정 효소에 맞출 수 있다.
또한, 소수성 양이온은 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) 막 상의 -SO3 -기에 대한 반대이온으로서 상기 소수성 양이온을 양성자로 교환함으로써 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) 막의 특성을 변화시킨다. 이러한 반대이온의 변화는 pH에 완충 효과를 제공하는데, 소수성 양이온이 양성자보다 -SO3 - 부위에 대한 친화성이 훨씬 더 크기 때문이다. 이러한 막의 완충 효과는 용액의 pH가 변해도 공극의 pH를 실질적으로 변화되지 않은 상태로 유지한다. 또한, 상기 막은 막에 고정된 효소를 보호하는 기계적 장벽을 제공한다. 이 완충 효과와 기계적 장벽 둘 다는 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) 막에 고정된 효소의 안정성에 유리한 영향을 미친다.
하기 표 1은 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 막의 완충 효과를 나타낸다. 수치는 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 막 1 g 당 양성자에 이용가능한 교환 부위의 수를 나타낸다. 양성자에 이용가능한 교환 부위의 수가 감소할수록, 고정화 효소에 대한 막의 완충력은 증가한다. 막 약어는 다음 막을 나타낸다: NH4Br은 암모늄 브로마이드로 개질된 나피온 막, TMABr은 테트라메틸암모늄 브로마이드로 개질된 나피온 막, TEABr은 테트라에틸암모늄 브로마이드로 개질된 나피온 막, TpropABr은 테트라프로필암모늄 브로마이드로 개질된 나피온 막, TBABr은 테트라부틸암모늄 브로마이드로 개질된 나피온 막, TpentABr은 테트라펜틸암모늄 브로마이드로 개질된 나피온 막.
막 혼합-주조 (x10-6 몰/g) 염 추출 (x10-6 몰/g)
나피온 907 ±68
NH4Br 521 ±74 591 ±95
TMABr 171 ±19 458 ±27
TEABr 157 ±4 185 ±22
TpropABr 133 ±6 138 ±77
TBABr 8.68 ±2.12 96 ±23
TpentABr 2.71 ±0.6 1.78 ±1.66
개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) 막을 제조하기 위하여, 제1 단계는 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체), 특히 나피온(Nafion; 등록상표)의 현탁액을 소수성 양이온의 용액과 주조하여 막을 형성하는 것이다. 과량의 소수성 양이온 및 이의 염을 최초 막으로부터 추출한 후, 막은 재-주조한다. 재-주조에 의하여, 막은 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) 막의 -SO3 - 부위와 함께 소수성 양이온을 함유한다.
더욱 안정하고 재현가능한 4차 암모늄 염-처리된 나피온(Nafion; 등록상표) 막을 제조하기 위하여, 과량의 브로마이드 이온은 주조 용액으로 제거되어야 한다. 상기 염-추출된 막은 과량의 4차 암모늄 브로마이드 및 HBr 염이 최초 막으로부터 추출된 후 혼합물-주조 막을 재-주조하는 것에 의해 형성된다. 막의 염 추출은 술폰산 교환 부위에서 4차 암모늄 양이온의 존재를 유지하나, 포어 중 포획될 수 있거나 또는 평형 막 중 공극을 유발할 수 있는 과량의 염의 문제를 배제한다. 염-추출된 막의 화학적 및 물리적 성질은 효소 고정화에 선행하여 전압전류법(voltammetry), 이온 교환 능력 측정 및 형광 현미경검사에 의해 특정화될 수 있다.
소수성 양이온의 예로는 암모늄계 양이온, 4차 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 알킬트리에틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥스데실피리디늄, 에티디움, 비올로겐, 메틸 비올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀) 이미늄, 금속 착물, 비피리딜 금속 착물, 페난트롤린계 금속 착물, [Ru(비피리딘)3]2+ 및 [Fe(페난트롤린)3]3+가 있다.
한 실시태양에서, 바람직하게는, 큰 소수성 양이온은 암모늄계 양이온이다. 특히, 큰 소수성 양이온은 4차 암모늄 양이온이다. 다른 실시태양에서, 4차 암모늄 양이온은 하기 화학식 1로 나타낸 것이다.
Figure pat00001
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소 이외의 것이다. 다른 실시태양에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실이고, 여기서, R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소 이외의 것이다. 또 다른 실시태양에서, R1, R2, R3 및 R4는 동일하고, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실이다. 또 다른 실시태양에서, 바람직하게는, R1, R2, R3 및 R4는 부틸이다.
도 4-6은 NAD+ 및 pH 7.15 포스페이트 완충액 중 연료 유체 용액으로 처리된 다양한 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체에 고정화된 효소의 형광 현미경검사를 도시한다. 형광을 나타내는 형광 현미경검사는 특정 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTEE 공중합체 막 중에 고정화된 효소가 고정화 후 여전히 촉매적으로 활성 효소임을 나타낸다. 이는 특정 고정화 물질이 효소를 고정화하고 안정화시키는 한편 효소의 촉매 활성을 유지하는지 확인하는 한 방법이다.
4차 암모늄 염 (예를 들면, 테트라부틸암모늄 브로마이드) 및 나피온(Nafion; 등록상표)의 혼합물-주조 필름은 필름을 통한 작은 분해물의 대량 수송을 증가시키고, 음이온에 대한 막의 선택성을 감소시킨다 [2]. 이들 막은 비개질된 나피온과 매우 유사한 전도도를 가지나, 이들은 막 중의 양자에 대한 가능한 교환 부위의 수의 적정한 것에 의해 나타난 바와 같이, 양자 보다 4차 암모늄 브로마이드에 대하여 더 높은 선호도를 갖는다. 따라서, 이들 필름은 유사한 전기적 성질을 가지나, 매우 상이한 산/염기 성질을 갖는다. 처리된 막은 넓은 범위의 완충액 pH에 걸쳐서 중성 pH를 유지한다.
B. 바이오연료 전지
상기 기술한 고정화된 효소를 이용하는 바이오연료 전지는 본 발명의 다양한 측면 중 하나이다. 바이오연료 전지에서, 애노드에서 일어나는 반응은 전자의 동시 방출과 함께 연료 유체의 산화이고; 전자는 전기적 접속을 통하여 캐소드로 향하고, 여기서 산화제가 물로 환원된다. 본 발명의 바이오연료 전지는 바이오연료 전지 외부의 전기 로드를 위한 에너지원 (전기)를 제공한다. 연료 유체의 산화를 촉진하기 위하여, 바이오애노드는 전자 전도체, 전자 매개체용 전기촉매(예: 산화환원 중합체) (또한, 보조인자로 알려져 있음) 및 효소를 함유한다. 전자 매개체는 전자를 수용하거나 전자를 공여할 수 있는 화합물이다.
먼저, 산화된 형태의 전자 매개체가 연료 유체 및 효소와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체 및 환원된 형태의 전자 매개체를 생성한다. 후속하여 또는 동시에, 환원된 형태의 전자 매개체는 산화된 형태의 전기촉매와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 환원된 형태의 전기촉매를 생성한다. 이어서, 환원된 형태의 전기촉매는 애노드에서 산화되고, 전자를 생성하여 전기를 발생시킨다. 연료 유체의 산화를 제외하고, 바이오애노드에서의 산화환원 반응은 가역적이어서 효소, 전자 매개체 및 전기촉매는 소비되지 않는다. 임의로, 전자 매개체가 첨가되어 추가 반응물을 제공하는 경우, 산화환원 반응은 비가역적일 수 있다.
별법으로, 바이오애노드와 접촉하는 전자 매개체가 비개질된 탄소계 전극에서 산화 및 환원 형 간에 전자를 전달할 수 있는 것인, 전자 전도체 및 효소를 이용할 수 있다. 전자 매개체가 비개질된 탄소계 전극에서 산화 및 환원 형 간에 전자를 전달할 수 있는 경우, 전기촉매 및 전자 매개체 간의 후속 반응은 필요하지 않고, 전자 매개체 자체가 애노드에서 산화되어 전자, 따라서 전기를 생성한다.
본 발명의 바이오연료 전지는 바이오애노드 및 캐소드를 포함한다. 전자의 방출은 바이오애노드에서 일어나고, 산화제의 환원은 캐소드에서 일어나며, 여기서 전기 로드는 바이오애노드 및 캐소드 사이에 걸린다.
1. 바이오애노드
일반적으로, 바이오애노드는 전자가 방출되고 외부 전기 로드로 향하는 연료 유체의 산화에 영향을 주는 요소를 포함한다. 전기 부하는 전기를 이용하는 장치이다. 외부 전기 로드는 산화제가 환원되는 캐소드와 접촉한다. 전기 접속을 통한 연료 유체로부터 바이오애노드의 구성요소로, 전기 로드로의 및 캐소드로의 전자의 흐름은 전기 로드를 위한 에너지원 (전기)를 제공한다.
한 실시태양에서, 바이오애노드는 전자 전도체, 및 효소 고정화 물질 중에 고정화된 효소를 포함한다. 다른 실시태양에서, 바이오애노드는 임의로 전자 매개체용 전기촉매를 더 포함한다. 바이오애노드가 전자 전도체에서 가역적 산화환원 반응을 수행할 수 있는 전자 매개체를 접촉하는 경우, 바이오애노드에는 전기촉매가 존재하지 않을 수 있다. 상기 규정된 바이오애노드의 구성요소는 서로 인접하고, 즉 이들은 적합한 수단에 의해 물리적 또는 화학적으로 연결되어 있다. 일 실시태양에서, 구성요소들은 이들 간에 전기적 접속을 갖는 용액으로의 배치에 의해 물리적 및 화학적으로 연결된다. 다른 실시태양에서, 바람직하게는, 구성요소들은 개별 성분들을 전자 전도체 상에 코팅하거나 또는 달리 침착시킴으로써 물리적으로 연결된다. 구성요소들은 예를 들면 층으로, 개별적으로 침착되거나, 또는 이들은 한 침착 층으로 통합될 수 있다.
a. 전자 전도체
전자 전도체는 전자를 전도하는 성분이다. 전자 전도체는 물질을 통하여 전도를 전도하는 한 성질상 유기 또는 무기일 수 있다. 전자 전도체는 탄소계 물질, 금속 전도체, 반도체, 금속 산화물 또는 개질된 전도체일 수 있다.
특히 적당한 전자 전도체는 탄소계 물질이다. 탄소계 물질의 예로는 카본 클로쓰, 카본 페이퍼, 카본 스크린 인쇄 전극, 카본 페이퍼 (Toray), 카본 페이퍼 (ELAT), 카본 블랙 (Vulcan XC-72, E-tek), 카본 블랙, 카본 파우더, 카본 섬유, 단일벽 탄소 나노튜브, 이중벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 탄소 나노튜브 어레이, 다이아몬드-코팅 전도체, 유리질 탄소 및 중간세공 카본이 있다. 또한, 다른 탄소계 물질의 예로는 흑연, 비압축 흑연 웜(worm), 박리 정제된 편상(flake) 흑연(슈페리오르(Superior; 등록상표) 흑연), 고성능 흑연 및 카본 파우더(포뮬라(Formula) BT(상품명), 슈페리오르(등록상표) 흑연), 고도로 정렬된 열분해 흑연, 열분해 흑연 및 다결정 흑연이 있다.
다른 실시태양에서, 전자 매개체는 금속 전도체로 제조될 수 있고, 적당한 전자 전도체는 금, 백금, 철, 니켈, 구리, 은, 스테인레스 스틸, 수은, 텅스텐 및 전극 구성에 적당한 다른 금속으로부터 제조될 수 있다. 또한, 금속 전도체인 전자 전도체는 코발트, 다이아몬드 및 다른 적당한 금속으로 제조된 나노입자로 구성될 수 있다. 다른 금속 전자 전도체는 은-도금 니켈 스크린 인쇄 전극일 수 있다.
또한, 전자 전도체는 반도체일 수 있다. 적당한 반도체는 규소 및 게르마늄으로부터 제조되고, 이는 다른 원소로 도핑될 수 있다. 반도체는 인, 붕소, 갈륨, 비소, 인듐 또는 안티몬 또는 이의 조합으로 도핑될 수 있다.
다른 전자 전도체는 전자 전도체로 개질된 금속 산화물, 금속 황화물, 주족 화합물 및 물질일 수 있다. 상기 유형의 전자 전도체의 예로는 나노다공성 산화티타늄, 산화주석 코팅 유리, 산화세륨 입자, 황화몰리브덴, 질화붕소 나노튜브, 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 에어로겔, 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 졸겔, 루테늄 탄소 에어로겔 및 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 중간세공 실리카가 있다.
다른 실시태양에서, 전자 전도체는 1 이상의 구성요소를 가지고, 여기서 제1 구성요소는 카본 클로쓰이고, 제2 구성요소는 상기 개시된 전자 전도체일 수 있다. 제2 전자 전도체는 카본 클로쓰에 부착되어 있으며, 이들 둘의 응집물이 전자 전도체를 구성한다.
다른 실시태양에서, 전자 전도체는 하기 단락 B.1.c.에 기술된 바와 같은 비압착 (확장형 GAT(상품명), 슈페리오르 그래파이트 캄파니(Superior Graphite Co.)) 흑연 웜으로 구성된다.
b. 전자 매개체
전자 매개체는 전자(들)을 수용 또는 공여할 수 있는 화합물이다. 달리 말하면, 전자 매개체는 전자(들)을 수용하여 환원된 형태를 형성할 수 있는 산화된 형태를 가지고, 여기서 환원된 형태는 또한 전자(들)을 공여하여 산화된 형태를 형성할 수 있다. 전자 매개체는 고정화 물질로 확산되고(되거나) 고정화 물질로 혼입될 수 있는 화합물이다.
일 실시태양에서, 전자 매개체의 확산 계수가 최대화된다. 달리 말하면, 전자 매개체의 환원된 형태의 대량 수송은 가능한 한 급속이다. 전자 매개체의 급속 대량 수송은 이것이 이용되는 바이오연료 전지의 더 큰 회로 포텐셜 및 전력 밀도를 가능하게 한다.
전자 매개체의 예로는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP) 또는 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ) 또는 이들 각각의 등가물이 있다. 전자 매개체의 다른 예로는 페나진 메토술페이트, 디클로로페놀 인도페놀, 단쇄 유비퀴논 및 포타슘 페리시아니드가 있다.
일 실시태양에서, 전자 매개체는 전자 전도체에서 혼자 산화환원 반응을 수행할 수 없다. 이 실시태양에서, 바이오애노드는 전자 전도체 에서 전자 방출을 촉진하는 전자 매개체용 전기촉매를 포함한다.
다른 실시태양에서, 0.0V ± 0.5V의 표준 환원 포텐셜을 갖는 가역적 산화환원쌍이 전자 매개체로 이용된다. 따라서, 전자 전도체 표면 상에 가역적 전기화학을 제공하는 전자 매개체가 이용될 수 있다. 전자 매개체는 전자 매개체에 의존적인 천연 발생 효소, 전자 매개체에 의존적으로으로 개질된 효소, 또는 전자 매개체에 의존적 합성 효소와 커플링된다. 전자 전도체 표면 상에 가역적 전기화학을 제공하는 전자 매개체의 예로는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ), 페나진 메토술페이트, 디클로로페놀 인도페놀, 단쇄 유비퀴논 및 포타슘 페리시아니드가 있다. 일 실시태양에서, 바람직하게는, 바이오애노드에 이용되는 전자 매개체는 PQQ이다. 전자 전도체 표면에서 가역적 전기화학을 제공하는 전자 매개체의 능력으로 인하여, 이러한 유형의 전자 매개체의 산화환원 반응을 촉매하기 위하여 전기촉매는 필요하지 않다.
c. 전자 매개체용 전기촉매
일반적으로, 전기촉매는 전자 전도체에서 전자의 방출을 촉진하는 성분이다. 달리 말하면, 전기촉매는 전자 매개체의 환원 또는 산화의 동력학(kinetic)을 개선하여 전자 매개체 환원 또는 산화가 더 낮은 표준 환원 포텐셜에서 일어날 수 있도록 한다. 전기촉매는 애노드에서 가역적으로 산화되어 전자, 따라서 전기를 생성한다. 전기촉매가 전자 전도체에 인접하는 경우, 전기촉매 및 전자 전도체는 서로 전기적으로 접촉하나, 필수적으로 서로 물리적으로 접촉하는 것은 아니다. 일 실시태양에서, 전자 전도체는 전자 매개체용 전기촉매와 연합되거나 또는 인접한다.
일반적으로, 전기촉매는 아진(azine), 전도성 중합체 또는 전기활성 중합체일 수 있다. 전기촉매의 예로는 메틸렌 그린, 메틸렌 블루, 루미놀, 니트로-플루오레논 유도체, 아진, 오스뮴 페난트롤린디온, 카테콜-펜던트 테르피리딘, 톨루엔 블루, 크레실 블루, 나일 블루, 뉴트럴 레드, 페나진 유도체, 티오닌, 아주르 A, 아주르 B, 톨루이딘 블루 O, 아세토페논, 메탈로프탈로시아닌, 나일 블루 A, 개질된 전이 금속 리간드, 1,10-페난트롤린-5,6-디온, 1,10-페난트롤린-5,6-디올, [Re(펜-디온)(CO)3Cl], [Re(펜-디온)3](PF6)2, 폴리(메탈로프탈로시아닌), 폴리(티오닌), 퀴논, 디이민, 디아미노벤젠, 디아미노피리딘, 페노티아진, 페녹사진, 톨루이딘 블루, 브릴리언트 크레실 블루, 3,4-디히드록시벤즈알데히드, 폴리(아크릴산), 폴리(아주르 I), 폴리(나일 블루 A), 폴리(메틸렌 그린), 폴리(메틸렌 블루), 폴리아닐린, 폴리피리딘, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리(티에노[3,4-b]티오펜), 폴리(3-헥실티오펜), 폴리(3,4-에틸렌디옥시피롤), 폴리(이소티아나프텐), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(디플루오로아세틸렌), 폴리(4-디시아노메틸렌-4H-시클로펜타[2,1-b;3,4-b']디티오펜), 폴리(3-(4-플루오로페닐)티오펜) 및 폴리(뉴트럴 레드)가 있다.
다른 실시태양에서, 바람직하게는, 전자 전도체는 조립(fabrication)에 앞서서 전자 매개체용 전기촉매 (또는 산화환원 중합체), 구체적으로는 메틸렌 그린으로 처리된 비압착 흑연 웜으로 구성되고, 수력 프레스와 같은 통상적인 방법에 의해 요망되는 형상으로 압축된다. 전자 전도체를 위한 압축 조건은 충분한 두께인 가요성 물질을 제조하도록 최적화되었다. 전자 전도체를 압축한 후, 메틸렌 그린은 메틸렌 그린 용액 중에서 시클릭 전압전류법에 의해 중합되었다. 전자 전도체를 세척하고 건조한 후, 제1 물질은 카본 클로쓰에 부착되었다.
d. 효소
효소는 연료 유체의 산화를 촉매하기 위하여 필요하다. 일반적으로, 상기 기술된 효소가 이용될 수 있다. 바이오애노드에 사용하기 위한 효소의 예로는 옥시도리덕타제가 있다. 일 실시태양에서, 바람직하게는 옥시도리덕타제는 공여체의 CH-OH기 또는 CH-NH기에 작용한다.
다른 실시태양에서, 바람직하게는 효소는 디히드로게나제이다. 다른 실시태양에서, 효소는 알코올 디히드로게나제, 알데히드 디히드로게나제, 포르메이트 디히드로게나제, 포름알데히드 디히드로게나제, 글루코스 디히드로게나제, 글루코스 옥시다제, 락테이틱 디히드로게나제, 락토스 디히드로게나제, 또는 피루베이트 디히드로게나제이다. 또 다른 실시태양에서, 더욱 바람직하게는 효소는 알코올 디히드로게나제이다. 또 다른 실시태양에서, 효소는 PQQ-의존성 디히드로게나제이다.
e. 효소 고정화 물질
효소 고정화 물질이 바이오연료 전지에서 이용된다. 일 실시태양에서, 효소 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이고, 효소를 고정화하고 안정화한다. 상기 기술된 효소 고정화 물질은 연료 유체에 대하여 투과성인 경우 바이오연료 전지의 실시태양에서 이용될 수 있다. 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이어야 연료의 산화 반응이 고정화된 효소에 의해 촉매될 수 있다. 달리 말하면, 고정화 물질은 이를 통한 연료 유체의 움직임을 가능하게 하여 전지가 고정화 물질 상에 또는 고정화 물질 내에 고정화된 효소와 접촉할 수 있다. 고정화 물질은 고정화 물질을 통한 연료 유체의 움직임을 가능하게 하나, 효소를 고정화 물질 내에서 실질적으로 동일 공간으로 한정하는 내부 포어, 채널, 개구부 또는 이의 조합을 함유하는 방식으로 제조될 수 있다.
다른 실시태양에서, 바람직하게는 효소는 고정화 물질의 포어 내에 위치하고, 연료 유체는 수송 채널을 통하여 고정화 물질 내로 및 외로 이동한다. 포어 및 수송 채널의 상대적 크기는 포어가 효소를 고정화하기 충분할 정도로 크나, 수송 채널은 효소가 이를 통하여 이동하지 못할 정도로 작은 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 바람직하게는 수송 채널은 적어도 약 10 nm의 직경을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 공극 대 수송 채널의 직경비는 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7;1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 그 이상이다. 또 다른 실시태양에서, 바람직하게는 수송 채널은 적어도 약 10 nm의 직경을 갖고, 공극 대 수송 채널의 직경비는 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7;1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 그 이상이다.
f. 바이오애노드 실시태양
다른 실시태양에서, 바람직하게는 바이오애노드는 전자 매개체용 전기촉매를 전자전도체 상에 흡착, 중합 또는 공유 결합하는 것에 의해 개질된 전자 전도체로 구성된다. 상기 실시태양은 전자 전도체의 표면적이 증가되는 잇점을 갖는다. 조립에 선행하여 전자 전도체의 표면 상에 전기 촉매를 흡착시키는 것 및 후속하여 전기 촉매의 화학적 또는 전기화학적 중합에 의한 전자 전도체의 처리는 비처리된 전자 전도체와 비교하여 더 높은 활성에 이른다.
다른 실시태양에서, 더욱 바람직하게는 바이오애노드는 조립에 선행하여 메틸렌 그린으로 처리된 비압축 흑연 웜으로 이루어지고 수력 프레스로 요망되는 형상으로 압출되는 전자 전도체로 구성된다. 전자 전도체를 압축한 후, 메틸렌 그린은 메틸렌 그린 용액 중에서 시클릭 전압전류법에 의해 중합되었다. 전자 전도체를 세척 및 건조한 후, 최종 물질은 카본 클로쓰에 부착되어 전자 전도체를 완성하였다. 후속하여, TBAB-개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 TBAB-개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) 막을 제조하기 위하여 테트라부틸 암모늄 브로마이드(TBAB)로 개질된 퍼플루르 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화 이온교환 중합체) 막은 상기 기술한 바와 같이 및 실시예에서와 같이 제조되었다. 효소는 재-주조 후 용액에 첨가되었다. 고정화된 효소를 함유하는 TBAB-개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 TBAB-개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체) 막을 피펫팅하고(하거나) 전자 전도체 상에 페인팅하였으며, 건조되도록 하였다.
일 실시태양에서, 바람직하게는 바이오애노드 및 캐소드는 막 전극 어셈블리 (membrane electrode assembly; MEA)로 조립된다. 이 실시태양에서, 캐소드는 통상적인 캐소드, 예를 들면 백금 로딩된 (단일 또는 이중 측면 로딩) 가스 확산 전극, 또는 하기 기술된 바와 같은 바이오캐소드일 수 있다. 일반적으로, 캐소드는 하부에 설비되고, 한 조각의 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 막이 캐소드 상부에 배치되며, 바이오애노드가 막의 상부에 배치된다. 모든 조각은 수력 프레스의 가열 요소 간에 배치되고, 압력은 프레스의 상부 및 하부 판이 접착을 시작하도록 가해졌고, 이어서 프레스는 가열되었으며 최종적으로 추가 압력이 가해졌다. 별법으로, MEA는 몇 적의 액체 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 막 또는 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 막이 바이오애노드와 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 막의 조각 사이 및 캐소드와 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 막의 조각 사이 모두에 배치되는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 조립되고 가열없이 상기와 같이 압축될 수 있다.
다른 실시태양에서, 전자 매개체는 효소에 물리적으로 결합될 수 있다. 물리적 결합은 전자 매개체 및 효소 간의 공유 또는 이온 결합일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 전자 매개체가 전자 전도체에서 가역적 전기화학이 가능하다면, 전자 매개체는 효소에 물리적으로 결합될 수 있고, 전자 매개체 또한 전자 전도체에 물리적으로 결합될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 전자 매개체는 고정화 물질에 고정화될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 바람직하게는 산화된 NAD+는 양이온-개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (양이온-개질된 나피온(Nafion; 등록상표)) 막에 고정화된다. 연료 유체가 전지에 첨가된 후, NAD+는 NADH로 환원되고, NADH는 양이온-개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (양이온-개질된 나피온(Nafion; 등록상표)) 막을 통하여 확산될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 염-추출된 테트라부틸암모늄/퍼플루오르화 이온 교환 중합체 막 (예: 나피온(Nafion; 등록상표) 막 또는 플레미온(Flemion; 등록상표) 막 [일본 동경 소재 아사히 글래스 캄파니(Asahi Glass Co.)]) 중 고정화 디히드로게나제 효소를 포함한다. 염-추출된 중합체 현탁액은 중성이고, 완충된 효소 용액이 상기 현탁액에 첨가될 수 있다. 혼합물은 애노드로 주조되어 개질된 전극을 형성하고, 여기서 효소는 전극의 표면 근처에 고정화된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 중합체 마이셀 내에 중성 pH를 가져오는 개질, 및 개질된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체의 마이셀 내에 혼입된 1 이상의 효소를 포함하는, 퍼플루오르화 이온 교환 중합체를 포함한다. 바람직한 퍼플루오르화 이온 교환 중합체는 나피온(Nafion; 등록상표) 중합체이다. 바람직한 효소는 유기 연료의 산화 및 보조인자의 환원을 촉매하는 디히드로게나제와 같은 산화환원 효소이다. 보조인자로는 NAD+, NADP+ 및 FAD를 들 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명은 바이오애노드가 산화환원 중합체 필름, 개질된 이온 교환 중합체 막 및 디히드로게나제를 포함하는 것인 바이오애노드 및 캐소드를 포함하는 연료 전지를 포함한다. 디히드로게나제는 개질된 이온 교환 중합체 막의 마이셀 구획 내에 혼입된다. 바람직하게는, 개질된 이온 교환 중합체 막은 염-추출된 4차 암모늄 처리된 퍼플루오르화 이온 교환 중합체이다. 시판되는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체로는 나피온(Nafion; 등록상표) (DuPont) 및 플레미온(Flemion; 등록상표) (Asahi Glass)를 들 수 있다. 바람직하게는, 퍼플루오르화 이온 교환 중합체는 나피온(Nafion; 등록상표) 중합체 또는 플레미온(Flemion; 등록상표) 중합체이다. 바람직한 4차 암모늄 염은 테트라부틸암모늄 브로마이드를 포함한다. 바람직한 산화환원 중합체 필름은 폴리메틸렌 그린이다. 바이오애노드는 1 이상의 상이한 디히드로게나제, 예를 들면 알코올 디히드로게나제 및 알데히드 디히드로게나제를 포함할 수 있다.
2. 연료 유체
연료 유체는 전자 매개체 및 고정화된 효소의 산화 반응에서 소비된다. 고정화 물질을 통한 확산 계수가 크게 할 만큼 연료 유체의 크기는 작다. 연료 유체의 예로는 수소, 암모니아, 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소부탄올, 부탄올 및 이소프로판올), 알릴 알코올, 아릴 알코올, 글리세롤, 프로판디올, 만니톨, 글루큐로네이트, 알데히드, 탄수화물 (예를 들면, 글루코스, 글루코스-1, D-글루코스, L-글루코스, 글루코스-6-포스페이트, 락테이트, 락테이트-6-포스페이트, D-락테이트, L-락테이트, 프룩토스, 갈락토스-1, 갈락토스, 알도스, 소르보스 및 만노스), 글리세레이트, 조효소 A, 아세틸 Co-A, 말레이트, 이소시트레이트, 포름알데히드, 아세트알데히드, 아세테이트, 시트레이트, L-글루코네이트, 베타-히드록시스테로이드, 알파-히드록시스테로이드, 락트알데히드, 테스토스테론, 글루코네이트, 지방산, 지질, 포스포글리세레이트, 레티날, 에스트라디올, 시클로펜탄올, 헥사데칸올, 장쇄 알코올, 코니페릴-알코올, 신나밀-알코올, 포르메이트, 장쇄 알데히드, 피루베이트, 부탄알, 아실-CoA, 스테로이드, 아미노산, 플라빈, NADH, NADH2, NADPH, NADPH2 및 수소가 있다.
다른 실시태양에서, 바람직하게는 연료 유체는 알코올이고, 더욱 바람직히게는 메탄올 및 에탄올이고, 특히 에탄올이다.
3. 캐소드
캐소드는 통상적인 캐소드 또는 바이오애노드일 수 있다. 통상적인 캐소드에서, 캐소드는 백금계이고, 공기에 개방되어 있으며, 산화제를 환원시킨다. 통상적인 캐소드가 사용되는 경우, 이는 염 브리지에 의해 애노드로부터 이격된다. 염 브리지는 다양한 형태를 취할 수 있으며, 이온이 애노드 및 캐소드 간에 수송되도록 하는 물질일 수 있다. 일 실시태양에서, 바람직하게는 염 브리지는 중합체 전해질 막(polymer electrolyte membrane; PEM)이다.
일 실시태양에서, 연료 유체는 상기 기술한 바와 같은 바이오애노드, 및 제2 산화환원 중합체 필름, 제2 개질된 이온 교환 중합체 막 및 O2-리덕타제를 포함하는 바이오캐소드를 포함할 수 있다. 제2 개질된 이온 교환 중합체 막은 염-추출된 4차 암모늄 처리된 나피온(Nafion; 등록상표) 중합체일 수 있고, 제2 산화환원 중합체 필름은 폴리(N-비닐-이미다졸)일 수 있으며, O2-리덕타제는 락카아제(laccase)일 수 있다. 이 실시태양에 따라서, 바이오연료 전지가 바이오애노드 및 바이오캐소드를 모두 포함하는 경우, 애노드 및 캐소드를 이격시키기 위하여 "염-브리지" (즉, PEM)이 필요하지 않다. 이 실시태양은 인간과 같은 생물 숙주에 이식가능한 동력원으로 특히 유용하다.
4. 전기 발생 방법
본 발명의 다양한 측면의 하나는 본 발명의 바이오애노드를 이용하여 유기 연료 (또는 수소, 암모니아 또는 탄화수소를 포함하는 연료 유체)를 산화하는 한편 캐소드는 산소 또는 퍼옥사이드와 같은 산화물을 환원시키는 것에 의해 전력을 발생시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 다른 측면은 전기 로드가 바이오애노드 및 캐소드 사이에 위치하고, 바이오애노드, 전기 로드 및 캐소드가 전도성 물질로 연결되어 있는, 상기 기술한 바와 같은 바이오애노드 및 캐소드를 이용한 전기를 발생시키는 방법이다. 연료 유체는 바이오애노드에서 산화되고, 산화제는 캐소드에서 환원된다. 전기 로드는 전기를 이용한 장치이다. 일 실시태양에서, 바이오애노드는 연료 유체 및 전자 매개체를 함유하는 용액과 접촉하고, 캐소드는 완충된 용액과 접촉한다. 바이오애노드를 접촉하는 용액은 염 브리지 또는 PEM에 의해 캐소드와 접촉하는 용액으로부터 이격된다.
다른 실시태양에서, 전력을 발생시키는 방법은 연료 유체를 바이오애노드에서 산화하고 산화제를 캐소드에서 환원하는 단계를 포함하고, 여기서 (a) 바이오애노드는 전자 전도체, 전자 매개체용 전기촉매, 및 연료 유체에 투과성이고 효소를 안정화하는 효소 고정화 물질에 고정화된 효소를 포함하고, (b) 전자 매개체의 산화된 형태는 바이오애노드에서 연료 유체의 산화 도중에 환원되고, (c) 전자 매개체의 환원된 형태는 전기촉매에 의해 산화되고, 후속적으로 또는 동시에 전기촉매는 바이오애노드에서 산화된다.
또 다른 실시태양에서, 전력을 발생시키는 방법은 바이오애노드에서 연료 유체를 산화하고 산화제를 캐소드에서 환원하는 단계를 포함하고, 여기서 (a) 바이오애노드는 전자 전도체, 및 연료 유체에 투과성이고 효소를 안정화하는 효소 고정화 물질에 고정화된 효소를 포함하고, 여기서 전자 전도체에서 가역적 전기화학이 가능한 전자 매개체가 바이오애노드를 접촉하는 용액 중에 존재하며, (b) 전자 전도체의 산화된 형태가 바이오애노드에서 연료 유체의 산화 도중에 환원되고, (c) 전자 매개체가 바이오애노드에서 산화된다.
또 다른 실시태양에서, 전력을 발생시키는 방법은 연료 유체를 바이오애노드에서 산화하고 산화제를 캐소드에서 환원시키는 단계를 포함하며, 여기서 (a) 바이오애노드는 전자 전도체, 전자 매개체용 전기촉매, 및 마이셀 또는 역상 마이셀 효소 고정화 물질에 고정화된 효소를 포함하고, (b) 전자 매개체의 산화된 형태는 바이오애노드에서 연료 유체의 산화 도중에 환원되고, (c) 전자 매개체의 환원된 형태는 전기촉매에 의해 산화되고, 후속적으로 전기촉매가 바이오애노드에서 산화된다.
다른 실시태양에서, 전력을 발생시키는 방법은 연료 유체를 바이오애노드에서 산화시키고 산화제를 캐소드에서 환원시키는 단계를 포함하며, 여기서 (a) 바이오애노드는 전자 전도체, 및 마이셀 또는 역상 마이셀 효소 고정화 물질에 고정화된 효소 고정화 물질에 고정화된 효소를 포함하고, 여기서 전자 전도체에서 가역적 전기화학이 가능한 전자 매개체가 바이오애노드를 접촉하는 용액 중에 존재하고, (b) 전자 매개체의 산화된 형태는 바이오애노드에서 연료 유체의 산화 도중에 환원되고, (c) 전자 매개체는 바이오애노드에서 산화된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 애노드 중에 혼입된 산화환원 효소의 존재하에서 애노드에서 유기 연료를 산화하고, 산소를 캐소드에서 환원하는 것을 포함하는, 전력 발생 방법을 포함한다. 바람직한 전력 발생 방법은 애노드에서 알코올을 산화하고 캐소드에서 산소를 환원시키는 단계를 포함하며, 여기서 (a) 애노드는 폴리메틸렌 그린 중합체, 4차 암모늄 브로마이드-처리된 나피온(Nafion; 등록상표) 중합체, 카본 섬유 지지 막 및 알코올 디히드로게나제를 포함하고, (b) 알코올 디히드로게나제는 4차 암모늄 브로마이드 처리된 나피온(Nafion; 등록상표) 중합체의 마이셀 구획 내에 고정화되고, (c) NAD+는 애노드에서 알코올의 산화 도중에 NADH로 환원되고, (d) NADH는 폴리메틸렌 그린 중합체에서 NAD+로 전기산화된다.
본 발명에 따라서, 폴리(메틸렌 그린)-개질 애노드의 표면에 캐스팅한 디히드로게나제 효소-고정 이온 전도 막을 사용하여 바이오연료 전지를 제작하였다. 본 발명의 한 실시태양에서, 알코올 디히드로게나제 및 NAD+의 존재 하에 알코올 연료를 알데히드로 산화시킨다. NADH 생성물은 연료 전지를 위한 산화환원 매개체이다. 백금 및 탄소 전극 상에서의 NADH 산화의 반응 속도가 불량하고 큰 과전위에서 발생하므로[4], NAD+을 재생성시키고 NADH로부터 전극으로 전자를 운반하기 위하여 중합체-기제 전기촉매가 사용되었다. 전기촉매는 바람직하게는 폴리(메틸렌 그린)이다[5].
알코올 디히드로게나제 뿐만 아니라 알데히드 디히드로게나제를 혼입시키는 이 바이오애노드를 사용하는 에탄올/O2 바이오연료 전지는 중합체 층 중의 알코올 디히드로게나제 대 알데히드 디히드로게나제의 비에 따라 1.16 mW/cm2 내지 2.04 mW/cm2의 전력 밀도 및 0.6 V 내지 0.82 V의 개방 회로 전위를 산출하였다. 이 바이오애노드를 사용하는 메탄올/02 바이오연료 전지는 1.55 mW/cm2의 전력 밀도 및 0.71 V의 개방 회로 전위를 산출하였다.
본 발명의 한 실시태양에서, 중성 근처의 pH를 갖는 개질된 이온-전도성 중합체에 산화환원 효소를 혼입시키면 바이오연료 전지의 전력 밀도를 개선시키고 바이오애노드의 수명을 증가시킬 수 있다.
C. 효소 센서
추가의 실시태양에서, 본 발명의 고정된 효소는 센서로서 사용될 수 있다. 효소 센서는 측정될 화학종(분석물)이 검출되기 전 센서에서 효소 촉매 반응을 수행하는 센서이다. 분석물과 효소(분석물이 효소에 대한 기질이 되어야 함) 사이의 반응에 의해 2차 종이 산출되고; 2차 종의 농도는 분석물의 농도에 비례하거나 그와 동일하다. 그 후 2차 종의 농도를 변환기에 의해, 예를 들면 전극 또는 광섬유에 의해, 전기화학적 또는 분광학적으로 검출한다.
효소 센서의 효소는 전형적으로 시험액과 접촉하기에 적합한 막에 포함된다. 이 경우, 효소는 센서의 막의 일부로서 포함되거나, 예를 들면 전극의 층의 일부로서 적절히 센서에 혼입될 수 있다. 그러므로, 분석물은 센서의 바깥 부분으로 확산된 후 효소와 접촉하고, 효소/분석물 반응이 일어나고, 그 후 2차 종이 센서의 검출기 부분으로 확산된다. 마이셀 또는 역 마이셀 고정화 물질에 고정된 효소는 효소가 시험액으로 침출되는 것을 피하기 위하여 효소를 보유하면서 분석물이 시험액으로부터 효소로 제어된 방식으로 확산될 수 있도록 적절한 다공성을 가질 것이다.
한 실시태양에서, 상기한 바와 같이 유리 탄소 전극을 메틸렌 그린으로 개질하고 중합하였다. 또한, 알코올 디히드로게나제가 고정된 테트라부틸암모늄 브로마이드로 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 막으로 유리 탄소 전극을 코팅하였다. 효소 센서는 에탄올을 검출하였다.
D. 고정된 효소의 용도
일반적으로, 본 발명의 고정된 효소는 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 효소를 고정하거나 안정화하는 것이 유리한 적용분야가 특히 중요하다.
또다른 실시태양에서, 고정된 효소는 바이오리액터 및 바이오프로세싱에 사용된다. 마이셀 또는 역 마이셀 고정화 물질과 같은 고정화 물질에 고정된 효소는 촉매에 의해 기질의 화학 반응을 유도하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 기질은 고정된 효소가 화학 반응을 촉매할 수 있는 임의의 기질이다. 따라서, 기질을 함유하는 공급 스트림이 고정된 효소와 접촉하고 이 때 기질이 반응하여 생성물을 형성한다. 또한, 기질은 고정화 물질을 통과할 때 생성물로부터 물리적으로 분리되며, 이 때 미반응 기질은 보유되어 별도 수거를 위한 틀의 출구 말단을 통과한다.
바이오리액터를 사용하는 공정은 1회-통과, 연속 공급 시스템 또는 보유된 미반응 기질이 다시 공급 스트림으로 재순환되고 생성물이 고정화 물질을 통과한 후 별도로 수거되는 재순환 시스템으로 배열될 수 있다. 더 작은 생성물은 고정화 물질을 통과하고 더 큰 기질은 고정화 물질을 통한 여과로부터 배제되므로 보유된 종 및 투과성 종은 일반적으로 크기 별로 물리적으로 분리된다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 고정된 효소는 바이오어세이에 사용된다. 바이오어세이 과정은 적절한 시약, 예를 들면 효소-기질과 시험 물질의 반응, 또는 이들의 역반응과 함께 색상, 방사능, 또는 기타 물리적 특성과 같은 시약(또는 다른 물질, 시약과 반응한 지시약)의 특성의 측정에 의해 반응한 시약의 양의 직접 또는 간접적 정량적 측정을 수반한다. 시험 용액은 고정된 효소와 접촉하게 되고 이 때 고정된 복합체를 형성하면서 반응이 일어난다. 방사성 표지된 기질은 도입되어 점유되지 않은 부위에서 반응한다. 복합체에서 방사능의 결정은 시험 샘플에서 효소의 양의 측정을 가능하게 한다.
또다른 실시태양에서, 고정된 효소는 효소 요법에 사용된다. 효소 요법은 투여된 효소가 환자 자신의 결손 또는 결실된 효소가 할 수 없는 체내 반응을 촉매하는 방식으로 환자에게 효소를 투여하는 것으로 이루어진다. 고정된 효소는 안정성의 증가로 인하여 투여된 효소가 더 오래 동안 활성을 갖게 함으로써 더 적은 회수의 처치 및 더 적은 용량의 효소가 필요하게 되므로 이 적용에 있어서 유리하다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 고정된 효소는 면역어세이에 사용된다. 이러한 어세이의 하나는 여과지, 다공성 막, 플라스틱 패들 또는 기타 고체 표면의 표면에서 색상이 시각적으로 검출될 수 있는 정성적 효소 결합 면역 흡착법(ELISA)이다. 이 어세이는 정량적 어세이로 또한 색상 이외의 다른 검출가능한 신호의 사용으로 용이하게 전용할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 고정된 효소는 생체모방제(biomimics)로서 사용된다. 생체모방제에서, 생물학적 또는 자연 시스템을 모방하는 합성 시스템이 제조된다. 예를 들면, 세포 시스템 또는 더 큰 생물학적 시스템(예를 들면 심혈관 또는 내분비 시스템)을 모방하기 위하여, 생체모방 시스템은 특정 물질과 선택적으로 반응하는 것은 물론 생체모방 시스템으로부터 물질을 방출할 수 있을 필요가 있을 것이다. 선택적으로 반응하고 물질을 방출하는 한가지 방법은 반투과성 막에 고정된 고정 효소를 사용하는 것이다. 이 방법에서, 예를 들면 반투과성막은 세포막을 모방하고 효소 매개 반응은 자연 시스템에서 일어나는 많은 효소 매개 반응을 모방할 것이다.
추가적 실시태양에서, 고정된 효소는 크렙스 사이클(또는 시트르산 사이클)을 모방하는 시스템에서 사용된다. 크렙스 사이클은 아세테이트 또는 아세틸-CoA의 이산화탄소 및 물로의 산화를 포함한다. 크렙스 사이클의 생체모방제는 세포의 에너지 생산 사이클에 영향을 미치는 인자에 관한 정보를 제공할 것이다. 또한, 크렙스 사이클 및 그의 생체모방제의 연구는 생체모방제를 사용하여 에너지 산출을 최대화하기 위한 중요한 측면의 이해를 돕는다.
정의
본원에 사용된 "연료 전지"는 전기 단락을 피하기 위하여 분리되는 애노드 및 캐소드를 포함한다. 바람직하게는, 애노드 및 캐소드는 중합체 전해질 막에 의해 분리된다. 바이오연료 전지는 연료액 및 연료액의 산화를 촉매하는 효소를 사용한다. 한 실시태양에서, "바이오연료 전지"는 에너지 공급원으로서 유기 연료 및 유기 연료의 산화를 촉매하기 위한 산화환원 효소를 사용한다. "연료 전지" 및 "바이오연료 전지"라는 용어는 본 개시 전체에 걸쳐 상호교환하여 사용된다. 한 실시태양에서, 본 발명의 연료 전지는 전기 공급, 예를 들면 전기 장치 및 기구, 장난감, 내부 의료 장치, 및 전기 구동 운송기구에 한정되지 않는 전기 공급을 필요로 하는 적용분야에 사용될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 연료 전지는 생물체에 이식될 수 있고, 여기서 유기 연료는 그 유기체로부터 유래된 것이고 연료 전지는 생물체에 이식된 장치에 동력을 공급한다.
본원에 사용된 "유기 연료"라는 용어는 저장된 에너지를 갖는 탄소-기제 화합물을 의미한다. 유기 연료는 핵산, 탄수화물(예를 들면 글루코스), 알코올, 지방산 및 기타 탄화수소, 케톤, 알데히드, 아미노산 및 단백질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 유기 연료는 유기체 내의 생물학적 화합물일 수 있다. 바람직한 연료는 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 이소프로판올을 비롯한 알코올, 및 탄수화물, 특히 글루코스 또는 그의 중합체이다. 바람직한 알코올은 에탄올 및 메탄올이다.
본 발명은 바이오애노드로도 유도될 수 있다. 바이오애노드는 연료액의 산화를 촉매하는 효소를 포함하는 애노드이다. 한 실시태양에서, "바이오애노드"라는 용어는 유기 연료의 산화를 촉매하는 산화환원 효소를 포함하는 애노드를 의미한다. 애노드는 전기 회로 또는 전위에 대한 전자의 공급원을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 바람직한 바이오애노드는 이온 교환 중합체 막에 병치되는, 산화환원 중합체 막에 병치되는, 카본 섬유 클로쓰(cloth) 또는 카본 펠트의 시트와 같은 지지막 또는 구조체를 포함한다. 한 실시태양에서, "바이오캐소드"라는 용어는 산소의 환원을 촉매하는 락카아제(laccase)와 같은 산화환원 효소를 포함하는 캐소드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "산화환원 중합체", "산화환원 중합체 필름" 또는 "산화환원 중합체 막"은 화합물로부터 전자를 수용하거나 제공할 수 있어서, 각각 화합물의 산화 또는 환원을 일으키고, 전기 회로로 전달하는데 이용될 수 있는 자유 전자의 생성을 일으키는 중합체를 말한다. 바람직한 산화환원 중합체는 참고문헌 5(Zou et al., 1996)에 기재된 폴리메틸렌 그린이다. 산화환원 중합체에 의한 전기촉매화에 대한 기질인 바람직한 화합물은 환원된 아데닌 디뉴클레오티드, 예를 들면 NADH, FADH2 및 NADPH를 포함한다. 바이오캐소드로 유용한 산화환원 중합체 필름은 폴리(N-비닐-이미다졸) 및 그의 유도체를 포함한다.
본원에 사용된 "지지막"이라는 용어는 전류를 전도할 수 있고 바이오연료 전지 전극의 중합체 막을 지지하는데 사용되는 강성 또는 반-강성 불활성 물질을 말한다. 지지막은 예를 들면 스테인레스 스틸, 스테인레스 스틸 메쉬, 탄소, 탄소 나노튜브, 백금 또는 반도성 물질과 같은 전도성 물질을 포함할 수 있다. 바람직한 지지막은 카본 펠트의 시트이다. 용어 "카본 펠트", "카본 클로쓰" 및 "카본 클로쓰 지지막"은 상호교환하여 사용된다.
본원에 사용된 용어 "이온 교환 중합체" 또는 "이온 교환 중합체 막"은 이를 통해 이온이 전도되게 할 수 있는 중합체를 말한다. 바람직한 이온 교환 중합체는 나피온(Nafion)®(DuPont, Wilmington, DE)와 같은 퍼플루오르화 이온 교환 중합체이다. 본 발명은 또한 술폰산 교환 부위에 4차 암모늄 이온을 포함하는, 개질을 포함하는 퍼플루오르화 이온 교환 중합체로 유도된다. 개질은 이온 교환 중합체의 마이셀 내에 중성 pH를 초래한다. 본 발명에 따르면, 하나 이상의 산화환원 효소가 염-추출 4차 암모늄 처리 퍼플루오르화 이온 교환 중합체의 마이셀(또는 "마이셀 구획") 내에 혼입 또는 포획된다.
한 실시태양에서, 용어 "효소" 또는 "산화환원 효소"는 화학 반응에서 촉매로서 기능하는 단백질을 말한다. 바람직한 효소는 연료의 산화 및 "보조인자"의 부수적 환원을 촉매하는 "디히드로게나제"를 포함한다. 바람직한 보조인자는 아데닌 디뉴클레오티드, 예를 들면 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADH+) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)를 포함한다. 디히드로게나제는 알코올 디히드로게나제, 알데히드 디히드로게나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 포름알데히드 디히드로게나제, 포르메이트 디히드로게나제, 락테이트 디히드로게나제, 글루코스 디히드로게나제 및 피루베이트 디히드로게나제를 포함한다. 바이오캐소드에 유용한 산화환원 효소는 락카아제와 같은 O2 환원효소를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "탄화수소" 및 "히드로카르빌"은 원소 탄소 및 수소만으로 이루어진 유기 화합물 또는 라디칼을 기술한다. 이 잔기는 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 잔기를 포함한다. 이 잔기는 또한 다른 지방족 또는 시클릭 탄화수소 기, 예를 들면 알크아릴, 알켄아릴 및 알킨아릴로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 아릴 잔기를 포함한다. 달리 언급되지 않으면, 이 잔기들은 바람직하게는 1 내지 20 개의 탄소 원자를 포함한다.
본원에 기재된 "치환된 히드로카빌"잔기는 탄소 이외의 하나 이상의 원소로 치환된 히드로카빌 잔기이고, 탄소 사슬 원자가 질소, 산소, 규소, 인, 붕소, 황 또는 할로겐 원자와 같은 헤테로 원자로 치환된 잔기를 포함한다. 이 치환기는 할로겐, 헤테로시클로, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 히드록시, 보호된 히드록시, 케토, 아실, 아실옥시, 니트로, 아미노, 아미도, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르를 포함한다.
용어 "헤테로원자"는 탄소 및 수소 이외의 원자를 의미한다.
본원에 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 사용된 용어 "헤테로시클로" 또는 "헤테로시클릭"은 하나 이상의 고리에 하나 이상의 헤테로원자 및 바람직하게는 각 고리에 5 또는 6 개의 원자를 갖는 임의로 치환되거나, 완전히 포화되거나 또는 불포화된 모노시클릭 또는 바이시클릭, 방향족 또는 비방향족기를 의미한다. 헤테로시클로기는 바람직하게는 고리에 1 또는 2 개의 산소 원자, 1 또는 2 개의 황 원자, 및(또는) 1 내지 4 개의 질소 원자를 갖고, 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 결합될 수 있다. 예시적 헤테로시클로는 푸릴, 티에닐, 피리딜, 옥사졸릴, 피롤릴, 인돌릴, 퀴놀리닐, 또는 이소퀴놀리닐 등과 같은 헤테로방향족을 포함한다. 예시적 치환기는 하나 이상의 하기 기를 포함한다: 히드로카빌, 치환된 히드로카빌, 케토, 히드록시, 보호된 히드록시, 아실, 아실옥시, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 할로겐, 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
[실시예]
실시예 1
고정된 효소
나피온® 및 4차 암모늄 브로마이드의 혼합물-캐스트 막을 제조하기 위한 캐스팅 용액을 본원에 인용함으로써 삽입되는 참고문헌 2에서 논의된 바와 같이 제조하였다. 1 밀리리터의 혼합물-캐스팅 용액을 칭량 보트(weighing boat)에 놓고 건조시켰다. 이전의 연구에서는 막에 도입된 모든 브로마이드 이온이 그 막을 물에 담그었을 때 막으로부터 배출된 것으로 나타났다[2]. 그러므로, 18 MW 물 7.0 mL를 칭량 보트에 첨가하고 밤새 잠겨 있게 하였다. 물을 제거하고 필름을 18 MW 물로 완전히 헹구고 건조시켰다. 염-추출된 필름을 저급 지방족 알코올 1.0 mL에 재현탁시켰다.
효소 대 TBAB 비가 2:1인 효소/나피온® 캐스팅 용액(보통 1.0 μM 효소 1200 μL: 600 μL) 및 0.03 g NAD+을 함유하는 효소/나피온® 캐스팅 용액을 전극 상의 코팅을 제조하기 위해 보르텍스(vortex)하였다. 용액을 피펫으로 전극에 옮기고 카본-펠트 전극에 담그고 건조시켰다.
캐스팅 용액 제조과정
하기 4차 암모늄 브로마이드를 사용하였다: 암모늄 브로마이드(Fisher), 테트라메틸암모늄 브로마이드(Aldrich), 테트라에틸암모늄 브로마이드(Fisher), 테트라프로필암모늄 브로마이드(Aldrich), 테트라부틸암모늄 브로마이드(Eastman), 및 테트라펜틸암모늄 브로마이드(Aldrich).
4차 암모늄 브로마이드를 혼입한 나피온® 막을 5 중량% 나피온® 현탁액(Solution Technologies, Inc.)과 함께 4차 암모늄 브로마이드를 공동 캐스팅함으로써 형성시켰다. 5 중량% 현탁액에 4차 암모늄 브로마이드를 첨가함으로써 혼합물-캐스팅 용액을 제조하였다. 4차 암모늄 브로마이드의 농도가 나피온® 현탁액 중의 술폰산 부위의 농도를 초과하도록 모든 혼합물-캐스팅 용액을 제조하였다. 최적화 후, 가장 안정하고 재현성 있는 막은 4차 암모늄 브로마이드 농도가 교환 부위의 농도의 세 배인 것으로 결정되었다.
1 밀리리터의 캐스팅 용액을 칭량 보트에 놓고 건조시켰다. 이전의 연구에서는 막에 도입된 모든 브로마이드 이온이 그 막을 물에 담그었을 때 막으로부터 배출된 것으로 나타났다. 그러므로, 18 MW 물 7.0 mL를 칭량 보트에 첨가하고 밤새 잠겨 있게 하였다. 물을 제거하고 필름을 18 MW 물로 완전히 헹구고 건조시켰다. 그 후, 필름을 메탄올 1.0 mL에 재현탁시켰다.
도 4 내지 6은 NAD+ 및 pH 7.15 포스페이트 완충액 중의 연료액 용액으로 처리된 다양한 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 막에 고정된 효소의 형광 현미경 사진을 나타낸다. 형광을 나타내는 형광 현미경 사진은 특정 개질 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 막에 고정된 효소가 고정화 후 여전히 촉매적으로 활성이 있는 효소인 것을 나타낸다. 이는 특정 고정화 물질이 효소의 촉매적 활성을 유지하면서 효소를 고정하고 안정화시키는지를 결정하는 하나의 방법이다. 하기 표는 제조된 효소 및 막에 대한 사항과 효소가 고정화 후 촉매 활성을 보유했는지에 대해 상술한다. 표에서 "○"로 기재된 경우는, 효소가 막에 고정된 후 촉매 활성을 보유한 것을 나타내고, "×"로 기재된 경우는, 효소가 막에 고정된 후 촉매 활성을 보유하지 않은 것이다.
막 알코올 DH 알데히드 DH 포르메이트 DH 글루코스 DH 락틱 DH 포름알데히드 DH
나피온® × × × × × ×
암모늄 Br × × × × × ×
TMABr × × × × × ×
TEABr × × × × × ×
TPropABr ○ × × × ○ ×
TBABr ○ ○ ○ ○ ○ ○
TPentABr × ○ ○ ○ ○ ×
실시예 2
물리적 전지 기구
본 발명의 바이오애노드를 도 1에서 보는 바와 같이 직경 2.6 cm, 높이 14.8 cm, 및 길이 7.6 cm의 주문 제작된 "U" 형 원주형 유리 튜빙으로 이루어진 물리적 시험 전지 상에서 시험하였다. 약 50 mL의 용액이 나피온® 막(Aldrich)의 양쪽 면에 함유되었다. 시험 전지의 캐소드 쪽은 외부 공급원(AirGas)을 통하여 버블링된 용존 산소로 포화된 pH 7.15의 포스페이트 완충 용액을 함유하였다. 캐소드 물질은 불캔(Vulcan) XC-72(E-Tek) 상에 20% 백금을 함유하는 ELAT 전극이다. 시험 전지의 애노드 쪽은 1.0 mM NAD+ 및 1.0 mM 연료(에탄올 또는 메탄올)를 함유하는 pH 7.15 완충액으로 충전되었다. 효소를 포함하는 본 발명의 바이오애노드는 애노드로서 작용하였다. 데이터 수집 전 2 내지 6 시간 동안 완전한 전지를 평형상태가 되도록 하였다. PC 컴퓨터에 인터페이스된 CH 인스트루먼츠 810 일정전위기(potentiostat)로 시험 전지에 대해 모든 데이터를 수집하고 분석하였다. 각 유형의 바이오연료 전지를 삼중으로 시험하였고, 모든 보고된 불확도는 하나의 표준 편차에 상응한다.
실시예 3
에탄올용 바이오애노드
에탄올용 바이오애노드는 도 2에서 보는 바와 같이 디자인되었다. 이 바이오애노드는 NAD+과 염-추출된 테트라부틸암모늄(TBAB)/나피온® 막에 고정된 알코올 디히드로게나제 또는 알코올 디히드로게나제 및 알데히드 디히드로게나제의 혼합물을 가졌다. 막은 폴리(메틸렌 그린)-개질 카본 클로쓰 전극 상에 캐스팅된다. 이 바이오애노드는 30 일 초과의 기간 동안 기능할 수 있고, 기능은 연료 전지의 초기 전력 산출량의 20% 보다 큰 전력 산출량에 의해 결정된다.
TBAB/나피온® 막에 고정화된 알코올 디히드로게나제를 사용하는 바이오애노드는 20℃ 및 pH 7.15의 완충액에서 0.60 내지 0.62 V에 이르는 개방 회로 전위를 나타냈다. 에탄올-기제 바이오연료 전지에 대한 평균 최고 전력 밀도는 1.16 ± 0.05 mW/cm2이다. 에탄올/O2 연료 전지에 대한 대표적 전력 곡선은 도 3에 나타낸다. 도 3에서 시험된 바이오애노드는 TBAB/나피온® 막에 고정된 알코올 디히드로게나제 효소 1.2 x 10-9 몰을 갖는다. 효소에 대한 최적 pH는 8.6 내지 9.0이지만[7] 폴리(메틸렌 그린) 전기촉매가 중성 pH에서 NADH의 산화에 대한 가장 높은 촉매 효율을 가지므로 pH 7.15 포스페이트 완충액을 선택하였다. 이 전력 곡선은 2일 후 그린 것이다. 최고 전력은 처음 7 일에 걸쳐 6.1% 감소하였다.
TBAB/나피온® 막에 고정된 알코올 디히드로게나제 및 알데히드 디히드로게나제의 혼합물을 사용하는 바이오애노드를 제작하고 시험하였다. 이 바이오애노드는 TBAB/나피온® 막에 고정된 1.2 x 10-9 몰의 알코올 디히드로게나제 및 1.2 x 10-9 몰의 알데히드 디히드로게나제를 사용하였다. 알코올 디히드로게나제 및 알데히드 디히드로게나제를 사용하는 에탄올/O2 연료 전지의 개방 회로 전위는 0.82 V이다. 알코올 디히드로게나제 및 알데히드 디히드로게나제의 동일 몰 혼합물을 함유하는 에탄올-기제 바이오연료 전지에 대한 최고 전력 밀도는 2.04 mW/cm2이다.
이 알코올/O2 바이오연료 전지를 문헌 상의 바이오연료 전지와 비교하기 위하여 메탄올/O2 바이오연료 전지를 제작하고 시험하였다. 메탄올 바이오애노드는 TBAB/나피온® 막에 고정된 1.2 x 10-9 몰의 알코올 디히드로게나제, 1.2 x 10-9 몰의 포름알데히드 디히드로게나제, 및 1.2 x 10-9 몰의 포르메이트 디히드로게나제를 가졌다. 알코올 디히드로게나제는 메탄올을 포름알데히드로 산화시키고, 이는 추후 포름알데히드 디히드로게나제에 의해 포르메이트로 산화되었다. 마지막으로, 포르메이트는 포르메이트 디히드로게나제에 의해 이산화탄소로 산화됨으로써 반응된 연료의 각 몰에 대하여 3 몰의 NADH를 형성하였다.
현재 기술에서의 메탄올-기제 바이오연료 전지는 20℃ 및 pH 7.15의 완충액에서 0.64 내지 0.71 V 범위의 개방-회로 전위를 갖는다. 메탄올 기제 바이오연료 전지에 대한 평균 최고 전력 밀도는 1.55 ± 0.19 mW/cm2이다. 화이트사이즈(Whitesides) 및 공동연구자에 의해 개발된 기술 수준의 메탄올/O2 바이오연료 전지는 개방 회로 전위가 0.8 V이고 전지의 최고 전력 산출량이 0.67 mW/cm2[8]이었다. 참고문헌 1에 기재된 메탄올 바이오연료 전지는 고정된 효소를 가지지 않아서 연료 전지의 수명이 기껏해야 몇일로 제한된다. 본 발명의 TBAB/나피온® 막-기제 메탄올 바이오연료 전지는 성능의 저하 없이 5일보다 긴 시간 동안 시험되었다.
문헌[9-11]에는 다수의 다른 메탄올 바이오연료 전지가 있지만, 보고된 것 중 가장 높은 개방 회로 전위는 0.3 V이다. 이는 불량한 산화전위 매개체 및 불량한 촉매 활성의 조합 때문이다. 폴리(메틸렌 그린) 산화환원 매개체는 수성 산화환원 매게체 또는 흡착된 산화환원 매개체보다 더 높은 안정성을 나타내고 NADH의 산화 과전위를 400 mV 감소시키고[5] TBAB/나피온® 막은 효소 고정화를 위한 이상적 환경을 제공한다.
실시예 4
시약 및 전극 제조
메틸렌 그린(Sigma), 질산나트륨(Fisher), 붕산나트륨(Fisher), 나피온®1100 현탁액(Aldrich) 및 나피온® 117(Aldrich)을 구입하고 입수된 대로 사용하였다. 사용된 효소는 알코올 디히드로게나제(E.C. 1.1.1.1, 초기 활성 300-500 단위/mg), 알데히드 디히드로게나제(E.C. 1.2.1.5, 초기 활성 2-10 단위/mg), 포름알데히드 디히드로게나제(E.C. 1.2.1.2, 초기 활성 1-6 단위/mg), 및 포르메이트 디히드로게나제(E.C. 1.2.1.46, 초기 활성 5-15 단위/mg)을 포함한다. 효소는 시그마(Sigma; St. Louis, MO) 및 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science; Indianapolis, IN)에서 구입하고, 0℃에서 저장하고, 입수된 대로 사용하였다. 또한, NAD+ 및 NADH는 시그마에서 구입하고 입수된 대로 사용하였다.
바이오애노드는 메틸렌 그린과 전기중합된 1 cm x 1 cm 정사각형 카본 펠트(Alfa Aesar)로 이루어진다. 폴리(메틸렌 그린)의 얇은 필름은 0.4 mM 메틸렌 그린 및 10 mM 소듐 테트라보레이트 중의 0.1 M 질산나트륨을 함유하는 용액 중에서 0.05 V/s의 스캔 속도로 12 개의 스위프 세그멘트(sweep segment)에 대해 -0.3 볼트 내지 1.3 볼트에서 CH 인스트루먼츠 810 또는 620 일정전위기(Austin, TX)를 사용하여 순환 전압전류법을 수행함으로써 형성하였다. 전극을 헹군 후 추가의 개질 전에 밤새 건조시켰다.
실시예 5 내지 7
다양한 연료액용 바이오애노드
실시예 3에서 사용된 것과 동일한 방법을 사용하되 하기 명시된 효소 및 연료액을 사용하였다.
실시예 번호 연료액 효소 막 보조인자 최대 전력
5 프로판올 알코올 디히드로게나제 TBAB/나피온® NAD+ 0.808 mW/cm2
6 글루코스 글루코스 디히드로게나제 TBAB/나피온® NAD+ 0.39 mW/cm2
7 미스테르산(mysteric acid) 조효소 A(Co-Enzyme A) TBAB/나피온® FAD 0.63 mW/cm2
실시예 8
폴리메틸렌 그린으로 처리된 그래파이트 웜(graphite worm)
메틸렌 그린(Sigma), 질산나트륨(Fisher), 붕산나트륨(Fisher)을 구입해서 입수된 대로 사용하였다. GAT 확장된 그래파이트 웜, 랩 코드: 3-96-16(Sigma Graphite Co.), 방수되지 않은 카본 클로쓰(E-Tek), 및 카본 테이프(Spi Supplies)를 입수된 대로 사용하였다.
메틸렌 그린을 함유하는 완충액을 1 mM 농도의 메틸렌 그린, 질산 나트륨, 및 붕산 나트륨을 첨가함으로써 18 MΩ 물에서 제조하였다. 용질은 사용 전에 충분히 용해시켰다. 원하는 양의 GAT 확장된 그래파이트 웜을 적절한 양의 메틸렌 그린 완충 용액이 채워진 큰 용기에 넣었다. 그래파이트 및 메틸렌 그린 완충 용액을 30 분 이하 동안 완전히 혼합하여 메틸렌 그린이 그래파이트의 표면에 완전히 흡착되도록 하였다.
그래파이트 및 완충 용액의 혼합물을 용액 중의 낮은 밀도의 그래파이트에 기초하여 분리되게 하였다. 그 후 과잉의 완충액을 그래파이트로부터 따라버리고 그래파이트를 18 MΩ 물로 세척하였다. 각 세척 후, 용액이 분리되게 하고, 과잉량을 따라버리고, 추가의 세척을 수행하였다. 이 과정은 세척 용액이 투명해지고 더이상 과량의 메틸렌 그린을 함유하지 않는 것으로 보일 때까지 반복하였다. 마지막 세척액을 따라버리고 예비 처리된 그래파이트 물질을 추후 사용 전에 완전히 건조되도록 하였다.
생성된 물질은 사용가능한 전극 형태로의 제작이 필요한 느슨한 그래파이트 분말과 유사하였다. 어떠한 원하는 치수 또는 형상으로 최종 전극을 제작하는데에는 극도의 유연성이 있었다. 선택된 파라미터는 2.5 cm x 2.5 cm 전극을 제조하기 위한 것이었다. 이는 주문 제작된 원하는 치수의 플렉시 글래스 주형을 예비 처리된 그래파이트 물질로 충전함으로써 달성되었다. 이 물질을 수압식 잭으로 다양한 압력으로 압축하였다. 전형적으로 3000 psi가 사용되었다.
웜을 3000 psi 미만의 어떠한 압력으로 압축한 경우에도 기계적으로 불안정한 전자 도체가 생성되었다. 전형적으로, 전자 도체는 3000 내지 4000 psi로 압축되었다. 그 결과 카본 섬유에 부착시키는 것과 같은 추가의 지지 없이 사용되기에 충분한 기계적으로 안정한 전자 도체가 생성되었다. 또한, 이 압축 조건에서는 액체에 반투과성인 전자 도체가 생성되었다. 더 높은 압력에서는 매우 압축되어 액체가 전자 도체에 쉽게 흡수되지 않는 전자 도체가 생성되었다.
생성된 전극은 견고했고, 추가의 안정성을 위해 지지체 물질에 부착시킬 수 있었다. 사용된 지지체 물질은 카본 클로쓰였다. 양면 카본 테이프의 층을 카본 클로쓰의 한쪽 면에 부착하고, 그 위에 예비-처리된 압축된 그래파이트 웜을 놓았다.
이 시점에서 산화환원 종의 안정성 및 수명을 향상시키기 위하여 산화환원 종의 중합을 수행하였다. 중합은 화학적 또는 전기화학적 방법으로 수행될 수 있다. 이 예에서는, 산화환원 종을 1 mM 메틸렌 그린, 1 mM 질산나트륨 및 1 mM 붕산나트륨을 함유하는 용액에 제작된 전극을 넣음으로써 전기화학적으로 중합하였다. 시스템은 작업 전극으로서 작용하는 제작된 전극, 백금 상대 전극 및 Ag/AgCl 기준 전극과 함께 CH 인스트루먼츠 810 일정전위기에 인터페이스되었다. 전위는 14 개의 스위프 세그먼트에 대하여 -0.3 에서 1.3 V로 다시 -0.3 V로 스캔하였다. 그 결과 전극 상에 안정한 메틸렌 그린 중합체가 얻어졌다.
실시예 9
바이오캐소드
산화효소, 특히 락카아제, 효소를 4차 암모늄 도핑된 나피온® 필름에 고정하는 것은 디히드로게나제 효소를 고정하는 것과 유사하다. 일련의 4차 암모늄 염을 사용하여 어떤 염이 효소가 고정될 때 최적의 효소 활성을 제공하는지를 결정하였다. 효소는 전형적으로 산화제로서 산소를 사용한다. 효소 활성은 pH 범위를 변화시키면서 다양한 완충액 중의 포화 산소 환경에서 전기화학적으로(순환 전압전류법) 결정하지만, 대부분의 전극 물질에서 퍼옥시드의 불량한 전기화학으로 인해 산화환원 매개체가 필요하다. 시험될 산화환원 매개체는 [Fe(비피리딘)3]2+, [Os(비피리딘)3]2+, [Ru(비피리딘)3]2+ 및 물리적으로 안정하고 가역적 전기화학을 갖고 0.8 내지 2.0 V 사이의 표준 환원 전위를 갖는 기타 산화환원 커플을 포함한다. 이 산화환원 매개체는 막과 함께 혼합-캐스트되거나, 최종 캐스팅 전에 막으로 염-추출되거나, 캐스팅 후에 막으로 추출될 수 있다.
실시예 10
막 전극 어셈블리(MEA)
막 전극 어셈블리(MEA) 공정은 바이오애노드의 제작으로 시작했다. 바이오애노드는 상기 언급한 탄소, 그래파이트, 또는 금속 전극 물질로 제작할 수 있다. 전체 MEA 공정은 변화되지 않는다.
메틸렌 그린 예비-처리 비압축 그래파이트 웜을 사용할 때, 상기한 바와 같이 전극을 제조하였다. 전극을 수압 하에서 원하는 규격으로 압축한 후, 메틸렌 그린과 전기중합하고, 개질된 나피온®/효소/조효소 중합체로 코팅하고, 건조하여 MEA에 사용할 수 있는 상태가 되게 하였다. 전극은 전형적으로 나피온®/효소/조효소 중합체로 양면 상에 코팅하였다.
MEA의 제조 공정은 먼저 한 장의 카프톤(Kapton)(DuPont)을 세정하고 놓는 것을 포함했다. 카프톤은 MEA가 열 프레스에 달라붙는 것을 방지하는 작용을 하고, MEA가 깨끗이 유지되도록 했다. 백금 로딩한(단면 또는 양면 로딩) 기체 확산 전극(Etek)을 카프톤 위에 놓고 그 위에 기체 확산 전극보다 약 2.5 배 크게 자른 한 장의 나피온® 117, 112 또는 111을 놓았다. 그 후, 전에 제조한 바이오애노드를 나피온®막의 위에 놓았다. 조립체를 약간 습윤시키고 다른 한 장의 카프톤을 바이오애노드의 맨 위에 놓아서 조립체가 서로 고정되도록 하였다.
그 후 MEA 조립체를 수압 프레스의 가열 소자 사이에 위치시켰다. 프레스의 위쪽 및 아래쪽 압반이 막 접촉하기 시작하기에 충분한 만큼의 압력만을 가했다. 가열을 시작하고 압반을 120-135℃로 가열하였다. 온도에 도달한 후, 원하는 규격, 전형적으로 3000 내지 4000 psi로 압력을 가하였다. MEA 조립체를 프레스에 놓기 전 압반을 예열할 수 있다. 이 과정은 정확히 이 단계들을 따라야 할 필요는 없다; 개질되더라도 여전히 성공적일 수 있다.
압력 하에 3 내지 5 분 둔 후, MEA를 제거하고 냉각한 후 카프톤으로부터 분리하였다.
열 프레싱 없이도 MEA를 만들 수 있다. 몇 방울의 액체 나피온® 또는 염 개질 나피온®을 애노드와 나피온® 117, 112 또는 111 및 캐소드와 나피온® 117, 112 또는 111 사이에 둔 것을 제외하고 MEA를 동일하게 조립하였다. 액체 나피온®이 건조될 때까지 조립체를 열 없이 압축하였다.
또한, 애노드를 다음의 방식으로 예비 제조할 수 있다. 원하는 전극 물질을 산화환원 중합체가 필요하다면 산화환원 중합체와 전기중합 또는 화학적으로 중합하였다. 이 때 전극을 효소 없이 MEA 조립체에 넣고, 상기한 바와 같이 열 압축하였다. 압축 및 냉각 후, 완성된 MEA의 애노드 쪽에 효소를 캐스팅하였다.
9 개의 바이오연료 전지 MEA를 제작하였고, 이 중 7 개가 작동하였다. 바이오연료 전지 MEA에 의해 생산된 개방 회로 전위는 0.36 내지 0.599 V의 범위였고, 전력 밀도는 0.15 내지 1.49 mW/cm2 범위였다.
실시예 11
PQQ 의존성 효소
비개질 전극에서 산화될 수 있는 조효소의 예는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)이다. PQQ는 세균의 알코올 디히드로게나제에서 산화환원 보조인자로서 발견되었다. PQQ는 비개질 탄소-기제 전극에서 산화형과 환원형 사이에서 효율적이고 pH-의존적이며 가역적인 전자 전달을 나타내는 o-퀴논 잔기를 함유한다. PQQ 의존성 디히드로게나제 효소를 사용함으로써 바이오연료 전지 및 센서에 사용하기 위한 전기촉매의 제거가 가능해진다. 이는 전극 장치를 단순화하고, 가격을 하락시키며, 분자의 작은 크기 때문에 막을 통한 PQQ의 유량이 더 높아져서 느린 물질 전달로부터의 전력 손실을 적게 한다.
실시예 12
효소 센서
유리 탄소 전극을 화학적 또는 전기화학적 수단으로 중합한 메틸렌 그린으로 개질시켰다. 상기 실시예 1에 기재된 과정을 사용하여 알코올 디히드로게나제를 테트라부틸암모늄 브로마이드-개질 나피온® 막에 고정시키고 고정된 효소를 개질된 유리 탄소 전극에 쌓고 건조시켰다. 개질된 유리 탄소 전극이 건조된 후, pH 7.15의 포스페이트 완충액에 넣고 평형화시켰다. 평형된 후, -0.4 V의 전위에서 전류 검출을 수행하였다. 기준선 수치가 확립된 후, 포스페이트 완충액 중의 8 mM 에탄올 용액 1 mL를 용액에 주입하였다. 도 10은 전류 센서에 대한 전류 대 시간의 그래프를 나타낸다.
관련 기술의 기재
본 명세서 전체에서 인용된 문헌을 여기에 숫자로 나열하였고 이 문헌들은 본원에 인용함으로써 삽입된다. 본원에서 참고문헌의 논의는 그 저자의 주장을 단지 요약하려는 것이고 참고문헌이 선행기술을 구성하는 것을 인정하는 것이 아니다. 출원인은 인용된 참고문헌의 정확성 및 타당성에 대해 이의를 제기할 권리를 유보한다:
Figure pat00002
Figure pat00003
이상의 사실로부터 볼 때, 본 발명의 몇몇 목적이 달성되었고 다른 유리한 결과가 얻어진 것을 알 수 있다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않고 상기 방법에 다양한 변화가 가해질 수 있으므로, 상기 기재에 포함되거나 첨부하는 도면에 나타난 모든 사항은 제한적 의미가 아닌 예시적인 것으로 해석될 것이다.

Claims (15)

  1. 효소를 고정하고 안정화시킬 수 있으며 효소보다 작은 화합물에 투과성이고, 비천연 콜로이드 물질, 비세포성 콜로이드 물질, 마이셀 또는 역 마이셀 물질, 양이온-개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 고정화 물질에 고정되고, 안정화된 효소는 적어도 30일 내지 365일 동안 그의 초기 촉매 활성의 75% 이상을 유지하고, 효소 고정화 물질에 포획된 효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고정화 물질이 비세포성 콜로이드 고정화 물질인 고정된 효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 고정화 물질이 마이셀 또는 역 마이셀 고정화 물질인 고정된 효소.
  4. 제3항에 있어서, 상기 고정화 물질이 양이온-개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체인 고정된 효소.
  5. 제3항에 있어서, 상기 효소가 알코올 디히드로게나제, 알데히드 디히드로게나제, 포르메이트 디히드로게나제, 포름알데히드 디히드로게나제, 글루코스 디히드로게나제, 글루코스 옥시다제, 락테이틱 디히드로게나제, 락토스 디히드로게나제 또는 피루베이트 디히드로게나제를 포함하는 것인 고정된 효소.
  6. 제3항에 있어서, 상기 효소가 적어도 90일 동안 활성인 고정된 효소.
  7. 제4항에 있어서, 상기 양이온-개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체가 NH4 +보다 더 큰 소수성 양이온으로 개질된 것인 고정된 효소.
  8. 제7항에 있어서, 상기 소수성 양이온이 암모늄계 양이온, 4차 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥스데실피리디늄, 에티디움, 비올로겐, 메틸 비올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀)이미늄, 금속 착물, 비피리딜 금속 착물, 페난트롤린계 금속 착물, [Ru(비피리딘)3]2+ 또는 [Fe(페난트롤린)3]3+를 포함하는 것인 고정된 효소.
  9. 제7항에 있어서, 상기 소수성 양이온이 하기 화학식 1로 나타내어지는 4차 암모늄 양이온을 포함하는 것인 고정된 효소.
    <화학식 1>
    Figure pat00004

    상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소 이외의 것이다.
  10. 제9항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실이고, 여기서, R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소 이외의 것인 고정된 효소.
  11. 제9항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 동일하고 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실인 고정된 효소.
  12. 제9항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 부틸인 고정된 효소.
  13. 제3항에 있어서, 상기 효소보다 작은 화합물이 암모니아, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소부탄올, 부탄올 및 이소프로판올, 알릴 알코올, 아릴 알코올, 글리세롤, 프로판디올, 만니톨, 글루큐로네이트, 알데히드, 탄수화물, 글루코스, 글루코스-1, D-글루코스, L-글루코스, 글루코스-6-포스페이트, 락테이트, 락테이트-6-포스페이트, D-락테이트, L-락테이트, 프룩토스, 갈락토스-1, 갈락토스, 알도스, 소르보스, 만노스, 글리세레이트, 조효소 A, 아세틸 Co-A, 말레이트, 이소시트레이트, 포름알데히드, 아세트알데히드, 아세테이트, 시트레이트, L-글루코네이트, 베타-히드록시스테로이드, 알파-히드록시스테로이드, 락트알데히드, 테스토스테론, 글루코네이트, 지방산, 지질, 포스포글리세레이트, 레티날, 에스트라디올, 시클로펜탄올, 헥사데칸올, 장쇄 알코올, 코니페릴-알코올, 신나밀-알코올, 포르메이트, 장쇄 알데히드, 피루베이트, 부탄알, 아실-CoA, 스테로이드, 아미노산, 플라빈, NADH, NADH2, NADPH, NADPH2 또는 수소를 포함하는 것인 고정된 효소.
  14. 제3항에 있어서, 상기 고정화 효소가 염-추출된 테트라알킬-암모늄 개질된 퍼플루오로술폰산-PTFE 공중합체인 것인 고정된 효소.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오연료 전지, 바이오센서, 바이오프로세서, 바이오어세이, 효소 센서, 바이오리액터, 효소 치료, 면역어세이 또는 생체모방제(biomimic)에서 사용하기 위한 것인 고정된 효소.
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