KR20090100380A - 실시간으로 ｐｃｒ의 다중 분석을 위한 시스템과 방법 - Google Patents

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KR20090100380A
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Abstract

본 발명에서는 다중화 가능성(multiplexing capability)을 갖는, PCR의 실시간 측정(real-time measurement)을 위한 방법과 시스템을 제시한다. 특정 구체예는 이러한 PCR 공정 동안 증폭 산물의 고정(immobilization)을 위한 형광 인코딩된 초상자성 마이크로스피어(superparamagnetic microsphere), 그리고 이러한 PCR 공정을 보조하기 위한 통제가능 서열 증폭(thermal cycling)을 수행할 수 있는 측정 장치(measurement device)의 영상 챔버(imaging chamber)를 이용하는 방법과 시스템에 관계한다.
PCR

Description

실시간으로 ＰＣＲ의 다중 분석을 위한 시스템과 방법{SYSTEMS AND METHODS FOR MULTIPLEX ANALYSIS OF PCR IN REAL TIME}
본 출원은 2006년 12월 13일 제출된 U.S. 가출원 60/869,742에 우선권을 주장하는데, 이의 전체 내용은 참조로서 편입된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 전반적으로, PCR과 같은 DNA 증폭의 측정을 수행하기 위한 시스템과 방법에 관계한다. 특히, 본 발명은 다중화 가능성(multiplexing capability)을 갖는, PCR의 실시간 측정(real-time measurement)을 위한 방법과 시스템을 제시한다. 특정 구체예는 입자, 예를 들면, 상자성 마이크로스피어(paramagnetic microsphere), 그리고 이러한 PCR 공정을 보조하기 위한 통제가능 서열 증폭(thermal cycling)을 수행할 수 있는 측정 장치(measurement device)의 영상 챔버(imaging chamber)를 이용하는 시스템에 관계한다.
중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 살아있는 생물체를 이용하지 않으면서 DNA를 효소적으로 복제하기 위한 분자 생물학 기술이다. PCR은 의학과 생물학 연구소에서, 다양한 과제, 예를 들면, 유전 질환(hereditary disease)의 검출, 유전자 지문(genetic fingerprint)의 확인, 감염 질 환(infectious disease)의 진단, 유전자의 클로닝(cloning), 친자확인검사(paternity testing), 그리고 DNA 컴퓨팅(computing)에 일상적으로 이용되고 있다. PCR은 비할 데 없는 증폭(amplification)과 정밀 능력(precision capability)으로 인하여, 핵산 검출(nucleic acid detection)을 위한 선택 방법으로서 분자 생물학자들에 의해 인정받고 있다. DNA 검출은 전형적으로, PCR 반응의 종점(end-point), 또는 고원기(plateau phase)에서 수행되기 때문에, 출발 주형(starting template)을 정량하기 어렵다. 실시간 PCR 또는 동적 PCR은 반응이 진행됨에 따라 앰플리콘 농도(amplicon concentration)를 기록함으로써 종점 PCR 분석의 능력을 진전시킨다. 앰플리콘 농도는 증폭된 표적과 연관된 형광 신호 변호(fluorescent signal change)를 통하여 빈번하게 기록된다. 실시간 PCR은 또한, 폐쇄된 시스템(closed system) 내에서 수행될 수 있기 때문에 오염이 제한된다는 점에서 종점 검출(end-point detection)보다 유리하다. 다른 이점에는 더욱 높은 민감도(sensitivity), 동적 범위(dynamic range), 속도(speed), 더욱 적은 필요 공정이 포함된다.
여러 분석 화학물질(assay chemistry)이 실시간 PCR 검출 방법에 이용되고 있다. 이들 분석 화학물질에는 이중-가닥(double-stranded) DNA 결합 염료(binding dye), 이중-표지된 올리고뉴클레오티드(dual-labeled oligonucleotide), 예를 들면, 헤어핀 프라이머(hairpin primer), 그리고 헤어핀 프로브(hairpin probe)를 이용하는 것이 포함된다. 다른 화학물질에는 가수분해 프로브(hydrolysis probe)와 같은 엑소뉴클레아제 기초된 프로브(exonuclease based probe)가 포함된다. 다양한 PCR과 실시간 PCR 방법은 U.S. Patent No. 5,656,493; 5,994,056; 6,174,670; 5,716,784; 6,030,787; 6,174,670에 개시되는데, 이들은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
현재 이용되는 실시간 PCR의 단점은 제한된 다중화 가능성(multiplexing capability)이다. 현재의 실시간 PCR 기술은 용해 상태의 자유로운 리포터 형광색소(reporter fluorochrome)를 이용한다. 이러한 설계는 복합 반응물(multiplex reaction) 내에서 각 분석을 위한 스펙트럼에서 상이한 형광색소의 이용을 필요로 한다. 가령, 4개의 표적 서열을 검출하도록 설계된 복합 반응물은 제어장치(control)를 보유하지 않으면서, 스펙트럼 구분(spectral differentiation)으로 4개의 상이한 자유 부동 형광색소를 구별할 수 있는 장치를 필요로 할 것이다. 이들 장치는 실질적인 다중화 기능성을 제한할 뿐만 아니라 비용을 증가시키는데, 그 이유는 이런 장치가 전형적으로, 복수의 레이저(laser)와 필터(filter)를 필요로 하기 때문이다. 현재의 실시간 PCR 기술은 대략 1-6중(plex)의 다중화 가능성을 갖는다.
본 발명의 요약
본 발명은 DNA의 증폭과 검출을 위한 시스템과 방법에 관계한다. 특히, 본 발명에서는 실시간 PCR의 다중화 가능성을 현저하게 증가시키는 시스템과 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 표지 물(labeling agent), 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 입자 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 입자로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 증폭 산물을 인코딩된 입자 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 입자와 이러한 인코딩된 입자 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 유인하는 단계; (e) 인코딩된 입자로부터 신호를 검출하고, 증폭 산물로부터 신호를 직접적으로(가령, 증폭 산물 내로 통합된 라벨(label)) 또는 간접적으로(가령, 증폭 산물에 혼성화된 표지된 상보성 핵산 sequence) 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 인코딩된 입자와 이러한 인코딩된 입자 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로부터 분산시키는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다.
이들 입자는 자성(magnetic property)을 갖는 입자 및/또는 용해 상태에서 2차원 표면 상에 정지할 수 있도록 하는 밀도(density)를 갖는 입자이다. 이들 입자는 자력(magnetic force), 중력(gravitational force), 또는 이온력(ionic force)에 의해, 또는 화학적 결합(chemical bonding)에 의해, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 수단에 의해 2차원 표면 상에 한 가지 방식으로 또는 다른 방식으로 정 지한다. 입자는 유리(glass), 폴리스티렌(polystyrene), 라텍스(latex), 금속(metal), 양자점(quantum dot), 고분자(polymer), 실리카(silica), 금속 산화물(metal oxide), 세라믹(ceramic), 또는 핵산에 결합하기 적합한 임의의 다른 물질, 또는 핵산에 부착할 수 있는 화학물질 또는 단백질로 구성된다. 입자는 막대상(rod shaped) 또는 구상(spherical) 또는 원반상(disc shaped)이거나, 또는 임의의 다른 형상을 포함한다. 입자는 또한, 그들의 형상 또는 크기 또는 물리적 위치에 의해 구별될 수도 있다. 입자는 하나 이상의 염료 또는 형광색소의 염료 또는 비율 또는 농도를 갖는 조성을 보유함으로써 스펙트럼에서 상이하거나, 또는 바코드(barcode) 또는 입체 영상(holographic image) 또는 입자 코딩(particle coding)의 다른 인쇄된 형태(imprinted form)에 의해 구별될 수 있다. 입자가 자성 입자(magnetic particle)이면, 이들은 자기장(magnetic field)의 적용에 의해 챔버의 표면에 유인된다. 유사하게, 자성 입자는 자기장의 제거에 의해 챔버의 표면으로부터 분산된다. 적절하게는, 자성 입자는 상자성(paramagnetic) 또는 초상자성(superparamagnetic)이다. 상자성과 초상자성 입자는 자기장의 부재에서 미미한 자력(magnetism)을 갖지만, 자기장의 적용은 입자 내에서 자성 도메인(magnetic domain)의 정렬을 유도하여 자기장 근원(field source)으로 입자의 유인을 결과한다. 자기장이 제거되면, 자성 도메인은 무작위 배향(random orientation)으로 환원되고, 입자간 자성 인력(attraction) 또는 척력(repulsion)이 존재하지 않는다. 초상자성(superparamagnetism)의 경우에, 이들 도메인이 거의 즉각적으로 무작위 배향으로 환원되는 반면, 상자성 물질은 자기장의 제거 이후에 일정한 기간 동안 도 메인 정렬(domain alignment)을 유지할 것이다. 입자가 충분한 밀도를 갖는 경우에, 이들은 중력(gravity)에 의해 챔버의 바닥 표면(bottom surface)으로 유인되고, 챔버의 진동(agitation), 예를 들면, 와동(vortexing), 초음파처리(sonication), 또는 유체 움직임(fluidic movement)에 의해 챔버의 바닥 표면으로부터 분산된다. 챔버의 진동은 또한, 입자가 다른 힘, 예를 들면, 자력 또는 이온력, 또는 흡입력(suction force), 또는 진공 여과(vacuum filtration), 또는 친화성(affinity), 또는 친수성(hydrophilicity) 또는 소수성(hydrophobicity), 또는 이들의 임의의 조합에 의해 챔버의 표면에 유인되는 방법과 시스템에서 이들 입자의 분산을 더욱 보조하는데 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 표지물(labeling agent), 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 표지된 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 표지된 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 표지된 증폭 산물을 챔버 의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 증폭 산물로부터 신호를 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다.
리포터(reporter)로 지칭될 수도 있는 표지물은 부착되는 분자(가령, 핵산 sequence)의 검출을 용이하게 하는 분자이다. 핵산을 표지하는데 이용될 수 있는 다수의 리포터 분자가 공지되어 있다. 직접적인 리포터 분자에는 형광단, 발색단(chromophore)과 방사단(radiophore)이 포함된다. 형광단의 무-제한적 실례에는 적 형광 스쿠아린 염료(red fluorescent squarine dye), 예를 들면, 2,4-비스[1,3,3-트리메틸-2-인돌리닐리덴메틸] 사이클로부텐디일륨-1,3-디옥솔레이트, 적외선 염료(infrared dye), 예를 들면, 2,4-비스[3,3-디메틸-2-(1H-벤즈[e]인돌리닐리덴메틸)] 사이클로부텐디일륨-1,3-디옥솔레이트, 또는 오렌지 형광 스쿠아린 염료(orange fluorescent squarine dye), 예를 들면, 2,4-비스[3,5-디메틸-2-피롤릴] 사이클로부텐디일륨-1,3-디올롤레이트가 포함된다. 형광단의 다른 무-제한적 실례에는 양자점(quantum dot), Alexa Fluor염료, AMCA, BODIPY630/650, BODIPY650/665, BODIPY, BODIPY, BODIPY, BODIPY, Cascade Blue, CyDye™(가령, Cy2™, Cy3™, Cy5™), DNA 삽입 염료, 6-FAM™, 플루오레세인(Fluorescein), HEX™, 6-JOE, Oregon Green488, Oregon Green500, Oregon Green514, Pacific Blue™, REG, 피코빌리단백질(phycobilliprotein)(가령, 피코에리트린(phycoerythrin)과 알로피코시아닌(allophycocyanin), Rhodamine Green™, Rhodamine Red™, ROX™, TAMRA™, TET™, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 또는 Texas Red이다. 형광 신호를 강화하기 위하여 신호 증폭 시약(signal amplification reagent), 예를 들면, 티라마이드(tyramide)(PerkinElmer)가 이용될 수 있다. 간접적인 리포터 분자에는 비오틴(biotin)이 포함되는데, 이는 검출을 위하여 스트렙타비딘(streptavidin)-피코에리트린(phycoerythrin)과 같은 다른 분자에 결합되어야 한다. 형광 공명 에너지 이동 쌍(fluorescence resonance energy transfer pair) 또는 염료-소광물질 쌍(dye-quencher pair)과 같은 라벨의 쌍 역시 이용될 수 있다.
표지된 증폭 산물은 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 직접적인 표지화(direct labeling)는 예로써, 표지된 프라이머, 표지된 dNTP, 표지된 핵산 삽입 인자 또는 이들의 조합을 이용함으로써 달성된다. 간접적인 표지화는 예로써, 표지된 프로브를 증폭 산물에 혼성화시킴으로써 달성된다.
인코딩된 입자, 예를 들면, 인코딩된 자성 구슬은 형광 염료로 인코딩될 수 있다. 형광 염료로 인코딩(encoding)은 상이한 형광 방출 파장 및/또는 상이한 형광 강도를 갖는 형광 염료를 이용한다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적; 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 여기서 각 프라이머 쌍의 한쪽 프라이머가 표지되고; 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 표지된 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 표지된 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 표지된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 증폭 산물로부터 신호를 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 분자 비콘(molecular beacon)을 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 분자 비콘은 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 분자 비콘의 실체는 이러한 분자 비콘이 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수 의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 분자 비콘에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 분자 비콘에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 분자 비콘으로부터 신호를 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브 세트를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 각 프로브 세트는 형광 에너지 이동 쌍의 첫 번째 구성원으로 표지되고, 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 프로브와 형광 에너지 이동 쌍의 두 번째 구성원을 보유하는 두 번째 프로브를 포함하고, 상기 첫 번째 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 증폭 산물을 프로브 세트에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩 된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장(magnetic field)을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 증폭 산물에 혼성화된 형광 에너지 이동 쌍으로부터 신호를 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다. 특정 측면에서, 형광 에너지 이동 쌍으로부터 신호는 형광에서 증가이다. 다른 측면에서, 형광 에너지 이동 쌍으로부터 신호는 형광에서 감소이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 핵산 표적, 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 프라이머 쌍, 그리고 핵산 표적에 상보적인 프로브 세트(probe set)를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브 세트는 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 프로브와 라벨(label)을 포함하는 두 번째 프로브를 포함하고; (b) 프라이머 쌍으로 증폭된 핵산 표적에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 증폭 산물을 프로브 세트에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장(magnetic field)을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 증폭 산물에 혼성화된 두 번째 프로브로부터 신호를 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 이러한 방법은 단일 또는 다중 수행될 수 있다. 다중화는 두 번째 프로브 상에서 상이한 라벨을 이용하고 및/또는 첫 번째 프로브가 고정되는 입자를 표지하거나 인코딩함으로써 달성될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 핵산 표적, 이러한 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 프라이머 쌍, 소광물질 분자에 결합된 dNTP, 그리고 상기 핵산 표적에 상보적인 형광 표지된 프로브를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 자성 구슬 상에 고정되고; (b) 핵산 표적의 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기를 수행하는 단계, 상기 증폭 산물은 소광물질 분자를 포함하고; (c) 증폭 산물을 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 표지된 프로브로부터 신호를 검출하는 단계, 여기서 표지된 프로브로부터 신호의 감소는 소광물질 분자를 포함하는 증폭 산물에 이러한 표지된 프로브의 혼성화(hybridization)를 지시하고; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 이러한 방법은 단일 또는 다중 수행될 수 있다. 다중화는 프로브 상에서 상 이한 라벨을 이용하고 및/또는 이들 프로브가 고정되는 입자를 표지하거나 인코딩함으로써 달성될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브 세트를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 각 프로브 세트는 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 프로브와 라벨(label)을 포함하는 두 번째 프로브를 포함하고, 상기 첫 번째 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 증폭 산물을 프로브 세트에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장(magnetic field)을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 증폭 산물에 혼성화된 두 번째 프로브로부터 신호를 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 소광물질 분자에 결합된 dNTP, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 형광 표지된 프로브를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 소광물질 분자를 포함하는 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기를 수행하는 단계; (c) 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 프로브로부터 신호를 검출하는 단계, 여기서 표지된 프로브로부터 신호의 감소는 소광물질 분자를 포함하는 증폭 산물에 이러한 표지된 프로브의 혼성화(hybridization)를 지시하고; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적; 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 여기서 각 프라이머 쌍은 표적 특이적인 서열, 이러한 표적 특이적인 서열의 5' 태그 서열(tag sequence), 그리고 선택적으로, 표적 특이적인 서열과 태그 서열 사이에 차단제(blocker)를 포함하는 첫 번째 프라이머와 표적 특이적인 서열을 포함하는 두 번째 프라이머를 포함하고; 표지물(labeling agent); 그리고 복수의 프라이머 쌍의 태그 서열에 상보적인 복수의 프로브를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 표식(tagged)되고 표지된(labeled) 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기를 수행하는 단계; (c) 표식되고 표지된 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 표식되고 표지된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬과 표식되고 표지된 증폭 산물을 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다. 특정 측면에서, 표지물은 프라이머 쌍의 두 번째 프라이머에 부착된 리포터 분자이다. 다른 측면에서, 표지물은 핵산 삽입 염료(nucleic acid intercalating dye)이다. 이러한 핵산 삽입 인자는 증폭의 부재에서도, 혼성화된 상보성 태그(complementary tag)를 표지 할 것이다. 이는 종점 검출만 수행되는 PCR에서 문제가 될 수 있는데, 그 이유는 증폭이 성공적이었는지 또는 검출된 신호가 상보성 태그를 표지하는 삽입 인자에만 기인하는지가 불분명하기 때문이다. 본 명세서에 기술된 방법에 따라 PCR이 실시간으로 수행되면, 성공적인 증폭에서, 증폭 주기의 횟수가 증가함에 따라 삽입 인자로부터 신호가 증가하는 것으로 관찰된다. 따라서 성공적인 증폭과 상보성 태그 단독의 표지를 구별할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 샘플 내에서 핵산 표적의 최초량(initial amount)을 정량하는 단계가 더욱 포함할 수 있다. 이러한 정량은 예로써, 로그자(logarithmic scale)에서 주기 횟수(cycle number)에 대하여 형광을 도면에 기입함으로써 실시간 PCR의 대수기(exponential phase) 동안 존재하는 DNA의 상대적 농도를 결정하는 과정을 포함한다. 이후, DNA의 양은 연속 희석(serial dilution)된 공지된 양의 DNA의 실시간 PCR에 의해 산출된 표준 곡선(standard curve)에 이들 결과를 비교함으로써 결정된다. 부가적으로, 실시간 PCR은 샘플 내에서 낮은 존재비(abundance) RNA를 비롯한 RNA를 정량하기 위하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription polymerase chain reaction)과 합동될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 복수의 프라이머 쌍이 단일 PCR 반응에서 복수의 표적 핵산을 증폭하도록 다중화 가능성을 제공한다. 특정 구체예에서, 단일 PCR 반응에 최소한 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개의 상이한 프라이머 쌍이 존재한다. 일부 구체예에서, 단일 PCR 반응에 8개 내지 100개, 8개 내지 80개, 8개 내지 60개, 8개 내지 40개, 8개 내지 20개, 8개 내지 18개, 8개 내지 16개, 8개 내 지 12개, 10개 내지 100개, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 40개, 10개 내지 20개, 10개 내지 18개, 10개 내지 16개, 10개 내지 12개, 12개 내지 100개, 12개 내지 80개, 12개 내지 60개, 12개 내지 40개, 12개 내지 20개, 12개 내지 18개, 또는 12개 내지 16개의 상이한 프라이머 쌍이 존재한다. 특정 구체예에서, PCR 반응에 최소한 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개의 상이한 표적 핵산이 존재한다. 일부 구체예에서, PCR 반응에 8개 내지 100개, 8개 내지 80개, 8개 내지 60개, 8개 내지 40개, 8개 내지 20개, 8개 내지 18개, 8개 내지 16개, 8개 내지 12개, 10개 내지 100개, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 40개, 10개 내지 20개, 10개 내지 18개, 10개 내지 16개, 10개 내지 12개, 12개 내지 100개, 12개 내지 80개, 12개 내지 60개, 12개 내지 40개, 12개 내지 20개, 12개 내지 18개, 또는 12개 내지 16개의 상이한 표적 핵산이 존재한다. PCR 반응에 존재하는 프로브는 중합효소에 의한 프로브의 확장을 예방하기 위하여 차단된 3' 하이드록실 기를 포함할 수 있다. 이러한 3' 하이드록실 기는 예로써, 인산염 기 또는 a 3' 반전된 dT로 차단된다.
표적 핵산 서열은 임의의 목적 서열일 수 있다. 표적 핵산 서열을 보유하는 샘플은 핵산을 보유하는 임의의 샘플일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 샘플은 예로써, 하나 이상의 유전자 돌연변이(genetic mutation) 또는 다형성( polymorphism)의 존재 또는 부재에 대하여 조사되는 개체이다. 본 발명의 다른 측면에서, 샘플은 병원균(pathogen)의 존재 또는 부재에 대하여 조사되는 개체로부터 유래된다. 샘플이 개체로부터 획득되는 경우에, 이는 당업자에게 공지된 방법, 예 를 들면, 흡기(aspiration), 생검(biopsy), 면봉채집(swabbing), 정맥천자(venipuncture), 요추 천자(spinal tap), 대변 샘플(fecal sample), 또는 소변 샘플(urine sample)에 의해 획득될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 샘플은 환경 샘플, 예를 들면, 물(water), 토양(soil), 또는 공기(air) 샘플이다. 본 발명의 다른 측면에서, 샘플은 식물(plant), 세균(bacteria), 바이러스(virus), 진균(fungi), 원생동물(protozoan), 또는 후생동물(metazoan)로부터 유래된다.
각 증폭 주기는 3가지 단계(phase)를 갖는다: 변성 단계(denaturing phase), 프라이머 어닐링 단계(primer annealing phase)와 프라이머 신장 단계(primer extension phase). 증폭 주기는 원하는 양의 증폭 산물이 생산될 때까지 반복될 수 있다. 전형적으로, 증폭 주기는 대략 10회 내지 40회 반복된다. 실시간 PCR에서, 증폭 산물의 검출은 전형적으로, 각 증폭 주기 이후에 수행된다. 하지만, 본 발명의 특정 측면에서, 증폭 산물의 검출은 두 번째, 세 번째, 네 번째, 또는 다섯 번째 증폭 주기 이후마다 수행된다. 검출은 또한, 적게는 2회 또는 그 이상의 증폭 주기가 분석되거나 검출되도록 수행될 수도 있다. 증폭 주기는 증폭의 검출이 진행되는 동일한 챔버 내에서 수행되는데, 이런 경우에 상기 챔버는 증폭 주기의 변성 단계, 프라이머 어닐링 단계와 프라이머 신장 단계를 위하여 챔버 내에서 온도가 조절될 수 있도록 가열 요소(heating element)를 포함하는 것이 필요하다. 이러한 가열 요소는 전형적으로, 프로세서(processor)의 통제를 받는다. 하지만, 증폭 주기는 증폭의 검출이 진행되는 챔버로부터 상이한 챔버에서 수행될 수 있는데, 이런 경우에 “증폭” 챔버는 가열 요소를 포함해야 하지만 “검출” 또는 “영상” 챔 버는 가열 요소를 보유할 필요가 없다. 증폭과 검출이 별개의 챔버에서 진행되는 경우에, 증폭 반응이 진행되는 유체는 예로써, 펌프(pump) 또는 피스톤(piston)에 의해 챔버 사이에 이전된다. 이러한 펌프 또는 피스톤은 프로세서의 통제를 받는다. 대안으로, 이러한 유체는 예로써, 피펫(pipette)을 이용하여 수동으로 챔버 사이에 이전될 수 있다.
챔버는 예로써, 석영 챔버(quartz chamber)이다. 챔버의 표면에 인접하게 영구 자석을 위치시킴으로써 또는 챔버의 표면에 인접한 전자석을 켬으로서, 자기장은 상기 챔버에 적용되고 챔버 내에 자성 입자를 챔버의 표면으로 유인한다. 자석은 자기장이 챔버 내에서 자성 입자를 챔버 표면으로 유인할 만큼 충분히 가까우면, 챔버와 반드시 물리적으로 접촉할 필요가 없다. 자기장은 챔버로부터 영구 자석을 멀게 이동시킴으로서 또는 전자석을 끔으로써 챔버로부터 제거된다. 물론, 켜진 전자석은 영구 자석에 대하여 앞서 기술된 바와 같이, 챔버로부터 더욱 가깝게 또는 더욱 멀게 이동시킴으로써 상기 챔버에 적용되거나 상기 챔버로부터 제거될 수도 있다. 증폭과 검출이 동일한 챔버 내에서 진행되는 구체예에서, 자기장은 증폭 주기의 프라이머 어닐링 단계 동안, 증폭 주기의 프라이머 신장 단계 동안, 또는 증폭 주기 이후에 적용된다. 증폭과 검출이 상이한 챔버에서 진행되는 구체예에서, 자기장은 전형적으로, 증폭 주기 이후에 증폭 반응 유체가 검출 챔버 내로 이송될 때 적용된다.
챔버의 표면 상에서 인코딩된 입자와 증폭 산물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 영상 시스템(imaging system)을 이용하여 검출될 수 있다. 가령, 인코딩된 자 성 구슬과 표지된 증폭 산물을 검출하는 단계는 이러한 인코딩된 자성 구슬과 표지된 증폭 산물로부터 방출된 형광 파장 및/또는 형광 강도를 영상화하는 과정을 포함한다. 영상화(imaging)는 챔버의 표면 상에서 구슬을 확인하기 위한 디코딩 영상(decoding image)을 포착하고, 챔버의 표면 상에서 증폭 산물을 검출하기 위한 분석 영상(assay imaging)을 포착하는 것을 포함한다. 디코딩 영상과 분석 영상의 비교에서, 어떤 구슬에 증폭 산물이 결합하는 지를 확인할 수 있다. 구슬에 부착된 프로브의 실체가 이들 구슬의 인코딩에 의해 확인되기 때문에, 프로브에 혼성화된 증폭 산물의 실체 역시 결정될 수 있다. 본 발명의 방법은 표지된 증폭 산물로부터 신호를 샘플 내에서 DNA 또는 RNA의 농도와 직접적으로 또는 간접적으로 상관시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 이러한 상관은 로그자(logarithmic scale)에서 주기 횟수(cycle number)에 대하여 형광을 도면에 기입함으로써 실시간 PCR의 대수기(exponential phase) 동안 존재하는 DNA의 상대적 농도를 결정하고, 연속 희석(serial dilution)된 공지된 양의 DNA 또는 RNA의 실시간 PCR에 의해 산출된 표준 곡선(standard curve)에 이들 결과를 비교하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 다중화된 실시간 PCR을 수행하기 위한 시스템을 제시하는데, 상기 시스템은 서열 증폭기(thermal cycler); 서열 증폭기에 결합된 영상 시스템; 서열 증폭기 내로 도입되도록 개조되는 인코딩된 자성 입자; 인코딩된 자성 입자를 고정하기 위하여 자기장을 서열 증폭기로 선택적으로 도입하기 위한 자석을 포함한다.
본 명세서에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대하여 수행될 수 있다.
특허청구범위에서 “또는”은 단독 대안을 지칭하도록 달리 명시되거나, 또는 이들 대안이 상호 배타적이지 않으면, 단독 대안과 “및/또는”을 지칭하는 정의가 기재되어 있음에도 불구하고, “및/또는”을 의미하는데 이용된다.
본 명세서 전반에서, “대략”은 수치가 이러한 수치를 측정하는데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 표준 오차(standard deviation of error)를 포함함을 지시하는데 이용된다.
확립된 특허법에 따라, 특허청구범위 또는 명세서에서 “포함하는”과 함께 이용되는 단수 표현은 달리 명시되지 않는 경우에, 하나 이상을 의미한다.
본 발명의 다른 목적, 특징과 이점은 아래의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 이러한 상세한 설명과 특정 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 지시하긴 하지만 예시의 목적으로만 제공되는데, 그 이유는 본 발명의 기술적 사상과 범위 내에 다양한 개변이 아래의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문이다.
아래의 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 특정 측면을 더욱 상술하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 구체예에 관한 상세한 설명과 함께, 이들 도면 중에서 하나 이상을 참조함으로써 더욱 명확하게 이해될 수 있다.
도 1은 영상 시스템의 개요도이다.
도 2는 도 1에 도시된 시스템의 기능적 상세를 보여주는 블록 다이어그램(block diagram)이다.
도 3은 검출 챔버 내에서 마이크로스피어의 상관관계를 실증하는 개요도이다.
도 4는 검출 챔버 내에서 마이크로스피어의 상관관계를 실증하는 다른 개요도이다.
도 5는 상보성 핵산 서열에 혼성화될 때, 헤어핀 형태(hairpin conformation)와 열린 형태(open conformation)에서 분자 비콘 프로브의 도해이다.
도 6은 상보성 핵산 서열에 혼성화될 때, 열린 형태에서 분자 비콘 프로브의 도해이다. 영상 챔버의 인근에 자석의 배치는 영상 챔버의 표면 상에 고정되는 분자 비콘 프로브를 결과하는데, 그 이유는 이들이 자성 반응성 마이크로스피어(magnetically responsive microsphere)에 부착되기 때문이다.
도 7은 FRET 검출 화학을 도시한다.
도 8은 소광 분자(quenching molecule)가 새로 합성된 DNA 가닥에 통합되고 상보성 프로브가 구슬의 표면에 부착된 형광색소로 표지되는 검출 화학을 도시한다.
도 9는 영상 시스템의 블록 다이어그램(block diagram)이다.
도 10은 영상 시스템으로 이용되는 유세포분석기(flow cytometer)의 블록 다이어그램이다.
도 11은 프라이머 쌍의 한쪽 프라이머가 5' 말단에서 리포터 분자로 표지되 는 직접적인 혼성화 검출 화학을 도시한다.
도 12는 2개의 프로브 검출 화학을 도시한다.
도 13은 인자 V Leiden 게놈 유전자 서열(SEQ ID NO: 6과 7)을 도시한다.
도 14는 PCR 동안 중앙 형광 강도(Median Fluorescent Intensity, MFI)(y-축)와 주기 횟수(cycle number)(x-축)의 그래프이다.
도 15는 다양한 낭포성 섬유증 유전자 서열(SEQ ID NO: 8-15)을 도시한다.
A. 영상 시스템
도면으로 돌아가서, 이들 도면은 스케일(scale)에 구애받지 않는다. 특히, 도면의 일부 요소의 스케일은 이들 요소의 특징을 강조하기 위하여 상당히 과장된다. 또한, 이들 도면은 동일한 스케일에 구애받지 않는다. 유사하게 구성된 하나 이상의 도면에 도시된 요소는 동일한 참조 숫자(reference numeral)를 이용하여 표시된다.
도 1, 2와 9의 영상 시스템의 구체예는 2가지 넓은 기반(broad based) 영상 방법을 이용한 여러 구성(configuration)을 보유한다. 형광 검출을 위하여, 검출되는 파장에 대해 단일 센서(single sensor), 예를 들면, 광증배관(photomultiplier tube, PMT) 또는 전자사태 광다이오드(avalanche photodiode, APD)가 이용된다. 대안으로, 1차원 또는 2차원 전하 결합 소자(CCD) 또는 다른 적절한 어레이 검출기(array detector)가 형광 검출에 이용될 수 있다. 여기 광원(excitation source)은 발광 다이오드(light emitting diode, LED)와 같은 광원(light source)에 의해 방출되고 직접적으로 또는 광섬유(fiber optic)를 통하여 측정 장치(measurement device)의 영상 볼륨(imaging volume) 내에 하나 이상의 물질에 전달되는 광을 이용한 광범위 조명(즉, 측정 장치의 영상 볼륨의 상대적으로 넓은 부위(가령, 측정 장치의 전체 영상 볼륨)에 동시에 제공된 조명)을 제공하도록 구성된다. 대안으로, 여기 광원은 측정 장치의 영상 볼륨에서 상대적으로 작은 반점의 조명을 제공하도록 구성되고, 이러한 시스템은 영상 볼륨을 교차하여, 상대적으로 작은 반점을 주사하도록 구성될 수 있다. 이러한 방식으로, 조명은 하나 이상의 LED, 하나 이상의 레이저, 하나 이상의 다른 적합한 광원, 또는 이들의 일부 조합으로부터 산출된 집중 광(focused light)의 상대적으로 “작은 비점(tiny flying spot)”으로서 구성된다.
도 1과 2에서는 측정 장치의 영상 볼륨 내에서 하나 이상의 물질을 영상하도록 구성된 시스템의 한 가지 구체예를 도시한다. 이러한 시스템 구체예는 검출기(34, 36, 38)를 보유한다. 검출기(34, 36, 38)는 CCD 카메라 또는 임의의 다른 적합한 영상 장치이다. 각 검출기는 동일한 구성 또는 상이한 구성을 갖는다. 각 검출기는 상이한 파장 또는 파장 대역(wavelength band)에서 광(가령, 영상 또는 검출 챔버(42)에 의해 한정되는 영상 볼륨에서 입자(40)로부터 형광 발광된 광)을 검출하도록 구성된다. 이에 더하여, 각 검출기는 영상 챔버(42) 내에서 입자(40)(가령, 영상 챔버(42)의 바닥에서 입자)의 영상 또는 “포획 형광 사진(capture fluorescent picture)”을 산출하도록 구성된다.
도 1과 2에서, 마이크로스피어(40)는 서열 증폭 요소(thermal cycling element)(제시되지 않음)에 결합되는 영상 챔버 내로 공급되고, 따라서 이들 마이크로스피어는 PCR 반응 동안 PCR 반응과 동일한 용액 내에 포함된다. 마이크로스피어(40)는 자석(264)으로 자기장을 적용함으로써 PCR 주기의 임의의 단계에서 영상 챔버(42)의 표면으로 끌어당겨진다. 마이크로스피어(40)는 자기장을 제거함으로서 표면으로부터 방출된다. 차기 검출 단계 동안, 마이크로스피어는 영상화를 위하여 표면으로 다시 끌어당겨진다. 도 1과 2에서, 마이크로스피어(40)는 또한, 서열 증폭기(제시되지 않음)로부터 영상 챔버(42)로 직접 공급될 수도 있다. 마이크로스피어(40)는 영상 챔버(42)로 도입되고 PCR 주기의 임의의 단계에서 표면으로 끌어당겨진다.
도 1과 2에서는 자성 마이크로스피어(40)를 표면으로 선택적으로 끌어당기기 위한 자석(264)을 도시한다. 도 1과 2의 시스템은 또한, 상이한 파장 또는 상이한 파장 대역을 갖는 광을 방출하도록 구성된 광원(44, 46)을 보유한다(가령, 이들 광원 중에서 하나는 적색광(red light)을 방출하도록 구성되고, 다른 광원은 녹색광(green light)을 방출하도록 구성된다. 광원(44, 46)에 의해 방출되는 광에는 예로써, 가시적 파장 양식(visible wavelength regime)의 임의의 부분에서 광이 포함된다. 광원(44, 46)에는 LED 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 광원이 포함된다. 광원(44, 46)은 영상 챔버(42)의 외면(periphery) 위에 정렬된다. 이에 더하여, 이들 광원은 각 광원이 광을 상이한 방향에서 영상 챔버(42) 내에 입자(40)에 지향시키도록 하기 위하여 영상 챔버 위에 정렬된다. 이러한 시스템은 또한, 광원(44, 46)에 각각 결합된 필터(48, 50)를 보유한다. 필터(48, 50)는 대역통과 필터(bandpass filter) 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 스펙트럼 필터(spectral filter)이다. 이러한 방식으로, 상기 시스템은 광의 상이한 파장 또는 상이한 파장 대역을 갖는 입자를 순차적으로 조명하기 위하여 광원(44, 46)과 필터(48, 50)를 이용한다. 가령, 적색광은 입자에 내재하는 분류 염료(classification dye)(제시되지 않음)를 여기하는데 이용되고, 녹색광은 입자의 표면에 결합된 리포터 분자(repoter molecule)(제시되지 않음)를 여기하는데 이용된다. 분류 조명(classification lumination)이 리포터 측정 동안 어둡기 때문에(즉, 상기 실례에서, 적색광은 입자로 지향되지 않는 반면, 녹색광은 입자로 지향된다), 상기 시스템의 분석물 측정 감도(analyte measurement sensitivity)는 대역 광(band light)에서로부터 혼선(crosstalk)으로 인하여 감소되지 않을 것이다.
이러한 시스템은 또한, 조명 “고리(ring)”의 중심(또는 거의 중심)에 배치된 단일 렌즈(52)를 보유한다. 렌즈(52)는 당분야에 공지된 임의의 적합한 굴절성 광학 요소(refractive optical element)를 보유한다. 렌즈(52)는 입자로부터 분산된 및/또는 형광 발광된 광을 하나 이상의 광학 요소를 통하여 하나 이상의 단색(monochrome) CCD 검출기(가령, 검출기(34, 36, 38))로 영상하도록 구성되는데, 이들 요소는 하나 이상의 이색(dichroic)과 하나 이상의 광학 대역통과 필터를 보유할 수 있다. 가령, 광 출구 렌즈(light exiting lens)(52)는 이색 필터(54)로 지향되는데, 이는 당분야에 공지된 임의의 적합한 이색 광학 요소를 보유할 수 있다. 이색 필터(54)는 하나의 파장 또는 파장 대역의 광을 반사시키고 다른 파장 또는 파장 대역의 광을 전송하도록 구성된다. 이색 필터(54)에 의해 반사된 광은 필터(56)로 지향되는데, 이는 대역통과 필터 또는 다른 적합한 스펙트럼 필터이다. 광 출구 필터(56)는 검출기(34)로 지향된다. 이색 필터(54)에 의해 전송되는 광은 이색 필터(58)로 지향되는데, 이는 당분야에 공지된 임의의 적합한 이색 광학 요소를 보유할 수 있다. 이색 필터(58)는 하나의 파장 또는 파장 대역의 광을 반사하고 다른 파장 또는 파장 대역의 광을 전송하도록 구성된다. 이색 필터(58)에 의해 전송되는 광은 필터(60)로 지향되는데, 이는 대역통과 필터 또는 다른 적합한 스펙트럼 필터이다. 광 출구 필터(60)는 검출기(36)로 지향된다. 이색 필터(58)에 의해 반사되는 광은 필터(62)로 지향되는데, 이는 대역통과 필터 또는 다른 적합한 스펙트럼 필터이다. 광 출구 필터(62)는 검출기(38)로 지향된다.
더 나아가, 도 1과 2에 도시된 시스템이 2개의 광원을 보유하긴 하지만, 이러한 시스템은 임의의 적합한 숫자의 광원을 보유할 수 있다. 가령, 상기 시스템은 렌즈(52)의 외면 주위에 정렬된 복수 광원을 보유한다. 이러한 방식으로, 광원은 렌즈(52)를 둘러싸는 조명 “고리”를 제공하도록 구성된다. 비록 도 1과 2에 도시된 시스템이 입자로부터 분산된 및/또는 형광 발광된 광을 상이한 파장 또는 파장 대역에서 영상하도록 구성된 3개의 검출기를 보유하긴 하지만, 이러한 시스템은 2개 이상의 검출기를 보유할 수 있다. 가령, 상기 시스템은 분류 채널(classification channel)과 리포터 채널(reporter channel)을 동시에 측정하여 추가의 하드웨어 비용(hardware cost)과 함께 측정을 위한 더욱 높은 처리량을 제공하는데 이용될 수 있는 2개 이상의 CCD 검출기(및 선택적으로, 고정된 필터)를 보유한다.
이러한 영상 시스템은 또한, 검출 챔버가 서열 증폭을 할 수 없는 경우에, 유체(가령, PCR 반응물, 세척 완충액(wash buffer))를 보관 용기(storage vessel)로부터 또는 서열 증폭기 또는 다른 가열된 챔버로부터 검출 챔버 내로 이송하기 위한 유체 처리 하위시스템(fluid handling subsystem)을 포함할 수 있다. 보관 용기는 원심분리 튜브(centrifuge tube), 주입 주사기(injection syringe), 마이크로역가 평판(microtiter plate) 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 샘플 용기로서 구성된다.
이러한 유체 처리 하위시스템은 또한, 보관 용기, 서열 증폭기, 또는 다른 가열된 챔버로부터 유체를 검출 챔버로 이전하도록 구성된 펌프(pump)를 보유할 수 있다. 펌프는 당분야에 공지된 임의의 적합한 구성을 갖는다. 상기 유체 처리 시스템은 또한, 시스템을 통과하는 유체의 흐름을 제어하도록 구성된 하나 이상의 밸브를 보유할 수 있다. 상기 유체 처리 하위시스템은 또한, 펌프에 의해 검출 챔버로 이송되는 담수(fresh water)(또는 다른 적합한 반응물)를 보관하기 위한 세정액 저장소(wash reservoir)를 보유할 수 있다. 펌프는 또한, 검출 챔버 내에서 재료와 임의의 다른 유체를 폐기물 용기(waste vessel)로 이송하도록 구성될 수도 있다. 폐기물 용기는 당분야에 공지된 임의의 적합한 구조를 갖는다. 상기 유체 처리 하위시스템의 펌프와 밸브는 프로세서에 의해 제어되거나, 또는 수동으로 작동된다.
이런 이유로, 도 1과 2에 도시된 시스템은 여러 목적 파장에서 입자(40)의 형광 방출(fluorescent emission)을 표시하는 복수의 또는 일련의 영상을 산출하도록 구성된다. 이에 더하여, 상기 시스템은 입자의 형광 방출을 표시하는 복수의 또는 일련의 디지털 영상을 프로세서(즉, 처리 엔진(processing engine))에 공급하도록 구성된다. 상기 시스템은 프로세서를 보유하거나, 또는 보유하지 않는다(도 9 참조). 프로세서는 검출기(34, 36, 38)로부터 영상 데이터(image data)를 획득(가령, 수신)하도록 구성된다. 가령, 상기 프로세서는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방식으로 검출기(34, 36, 38)에 결합된다(가령, 전송 매체(transmission media)(제시되지 않음)를 통하여, 이들 검출기 중에서 하나가 프로세서에 각각 결합된다; 하나 이상의 전자 소자(electronic component)(제시되지 않음), 예를 들면, 아날로그-디지털 변환기(analog-to-digital converter)를 통하여, 이들 검출기 중에서 하나가 프로세서에 각각 결합된다; 등). 적절하게는, 이러한 프로세서는 입자(40)의 한 가지 이상의 특징, 예를 들면, 입자의 분류와 입자의 표면 상에서 분석물에 관한 정보를 결정하기 위하여 이들 영상을 처리하고 분석하도록 구성된다. 한 가지 이상의 특징은 임의의 적합한 방식, 예를 들면, 각 파장에서 각 입자에 대한 형광 광도(fluorescent magnitude)를 위한 입구(entry)를 보유하는 데이터 어레이(data array)에서 프로세서에 의해 산출된다. 구체적으로, 이러한 프로세서는 영상을 처리하고 분석하기 위한 방법의 하나 이상의 단계를 수행하도록 구성된다. 시스템, 예를 들면, 도 1과 2에 도시된 시스템에 의해 산출된 영상을 처리하고 분석하기 위한 전형적인 방법은 Roth에 의해 2006년 9월 21일 제출된 U.S. Patent Application Serial No. 11/534,166(발명의 명칭: “Methods and Systems for Image Data Processing”)에 예시되는데, 이는 본 명세서에 참조로서 편입된다.
상기 프로세서는 전형적인 퍼스널 컴퓨터(personal computer), 메인프레임 컴퓨터 시스템(mainframe computer system), 워크스테이션(workstation) 등에 통상적으로 포함되는 프로세서이다. 일반적으로, “컴퓨터 시스템”은 기억 매체(memory medium)로부터 명령을 수행하는 하나 이상의 프로세서를 보유하는 임의의 장치를 포괄하도록 넓게 정의된다. 이러한 프로세서는 임의의 다른 적절한 기능적 하드웨어(functional hardware)를 이용하여 수행될 수 있다. 가령, 상기 프로세서에는 펌웨어(firmware)에 고정 프로그램(fixed program)을 보유하는 디지털 신호 프로세서(digital signal processor, DSP), 필드 프로그램가능 게이트 어레이(field programmable gate array, FPGA), 또는 고급 프로그래밍 언어(high level programming language), 예를 들면, 초고속 집적 회로(very high speed integrated circuit, VHSIC) 하드웨어 기술 언어(hardware description language, VHDL)로 “작성된” 순차 논리(sequential logic)를 이용하는 다른 프로그램가능 논리 소자(programmable logic device, PLD)가 포함된다. 다른 실례에서, 앞서 참조된 특허 출원에서 기술된 컴퓨터-구현 방법(computer-implemented method)의 하나 이상의 단계를 수행하기 위하여 프로세서 상에서 수행될 수 있는 프로그램 명령(program instruction)(제시되지 않음)은 고급 언어, 예를 들면, C#(적절하게는, C++로 작성된 부분 포함), ActiveX controls, JavaBeans, Microsoft Foundation Classes(“MFC”), 또는 원하는 다른 기술이나 방법으로 코드화된다. 프로그램 명령은 특히, 절차-기초된 기술(procedure-based technique), 성분-기초된 기술(component-based technique) 및/또는 객체-지향된 기술(object-oriented technique)을 비롯한 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 프로그램 명령은 운반 매체(carrier medium)(제시되지 않음)에 전송되거나, 또는 운반 매체에 보관된다. 이러한 운반 매체는 전송 매체(transmission medium), 예를 들면, 와이어(wire), 케이블(cable), 또는 무선 전송 링크(wireless transmission link)일 수 있다. 운반 매체는 보관 매체(storage medium), 예를 들면, 읽기-전용 메모리(read-only memory), 랜덤 액세스 메모리(random access memory), 자성 또는 광학 디스크, 또는 자성 테이프일 수도 있다.
도 1-4의 영상 시스템의 구체예는 측정 장치의 영상 챔버(42) 내에서 하나 이상의 입자(40)를 실질적으로 고정시키도록 구성된다. 적절하게는, 이러한 시스템은 시스템의 광학 요소를 마주보는 영상 챔버(42)의 측면에 배치된 자성 요소(264)를 보유한다. 자성 요소(264)는 적당한 자기장을 산출하는데 이용될 수 있는 당분야에 공지된 임의의 적합한 자성 요소, 예를 들면, 영구 자석 또는 전자석이다. 이러한 방식으로, 자석이 내포된 염색된 입자가 본 명세서에 기술된 구체예에 이용되는데, 이들 입자는 챔버(42)의 후면(back side)에서 자성 요소(264)에 의해 산출된 자기장을 이용하여 영상 챔버(42)(가령, 챔버의 바닥)에 실질적으로 고정될 수 있다. 자성 요소(264)는 여러 도면에서 영상 챔버(42)로부터 이격된 것으로 도시되지만, 시스템의 광학 요소를 마주보는 영상 챔버(42)의 측면 상에서 영상 챔버(42)와 접촉(또는 여기에 결합)될 수도 있다. 자성 요소(264)는 앞서 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수 있다. 도 3에서는 구슬(40)이 챔버의 표면 상에 실질적으로 고정되도록 하기 위하여, 자석(264)이 챔버의 표면에 인접하게 배치된 영상 챔버의 측면도(side view)를 도시한다. 도 3에서는 형광단이 구슬의 표면에 부착되는 구체예를 실증한다. 도 4 역시 구슬(40)이 챔버의 표면 상에 실질적으로 고정되도록 하기 위하여, 자석(264)이 챔버의 표면에 인접하게 배치된 영상 챔버의 측면도(side view)를 도시한다. 하지만, 도 4에서, 형광단은 구슬(40)에 직접적으로 결합되지 않지만 이들 구슬에 직접적으로 결합된 서열에 혼성화(hybridization)를 통하여 구슬(40)과 결합하는 핵산 서열(가령, PCR 프라이머)에 부착된다. 이는 구슬 상에서 상보성 프로브 서열이 형광단이 부착되는 핵산 서열과의 혼성화에 가용하지 않을 때, “자유 부동(free floating)” 형광단을 결과한다. 이들 자유 부동 형광단으로부터 신호는 챔버의 표면 상에 고정된 구슬을 영상할 때, 배경 잡음(background noise)을 증가시킬 수 있다; 하지만, 자유 부동 형광단이 일반적으로, 영상 시스템의 포컬 플레인(focal plane)에 존재하지 않기 때문에, 구슬의 성공적인 영상이 달성될 수 있다. 이에 더하여, 다양한 도면이 영상 챔버에 인접하게 배치된 하나의 자성 요소를 도시하지만, 이러한 시스템은 하나 이상의 자성 요소를 보유할 수 있는데, 이들 각각은 시스템의 광학 요소를 마주보는 영상 챔버의 측면에 인접하게 배치된다.
이러한 시스템은 첨부된 자석을 보유하는데, 상기 자석은 영상 챔버(42)에 대하여 다양한 거리로 이동할 수 있다. 영상 시스템에 의한 신호 획득(signal acquisition) 이후에, 자기장은 제거되고(가령, 솔레노이드(solenoid)를 이용하여 영구 자석을 이동시키거나 스위치로 전자석을 켜고 끔으로써), 입자(40)는 영상 챔버를 빠져 나가며, 다음 샘플로부터 새로운 입자(40)가 챔버 내로 유입된다. 영상 챔버(42) 내에서 이들 입자는 제거되고, 본 명세서에 기술된 임의의 구체예를 이용하여 영상 챔버로 입자가 도입된다. 다른 구체예에서, 영상 챔버(42) 내에서 입자는 표면으로부터 방출되고 챔버 내에서 존속하여, 용해 상태로 다른 요소와 상호작용하고, 이후 영상화를 위하여 표면으로 다시 끌어당겨진다.
한 구체예에서, 영상 챔버 설계는 자석(264)이 구슬(40)을 표면으로 끌어당김에 따라 이들 구슬이 내부 표면을 교차하여 무작위로 분포되도록 하기 위하여, 자성 요소(264)의 인근에 영상 챔버의 측면 상에서 상대적으로 부드러운 내부 표면을 보유하는 영상 챔버이다. 하지만, 이러한 영상 챔버(42)는 자기장이 적용될 때, 구슬, 특히, 반점(spot)을 “유지”하도록 설계될 수도 있다. 가령, 도 1에 도시된 영상 챔버의 내부 표면은 앞서 기술된 바와 같이 자기장의 적용 이후에 구슬(40)이 식각된 리세스(etched recess) 중의 한 곳에 배치되도록 하기 위하여, 정사각형 패턴의 식각된 리세스가 거기에 형성된다. 이런 식각된 리세스는 자기장이 적용될 때, 구슬을 분리하는데 도움이 된다. “식각된” 리세스는 식각 공정(etching process) 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 공정에 의해 형성된다. 더 나아가, 식각된 리세스의 구성과 정렬은 예로써, 구슬(40)의 크기와 구슬 사이에 선택된 공간(spacing)에 따라 달라진다.
다른 실례에서, 영상 챔버(42)의 내부 표면은 앞서 기술된 바와 같이 자기장의 적용 이후에 구슬(40)이 식각된 리세스(etched recess) 중의 한 곳에 배치되도록 하기 위하여, 삼각형 패턴의 식각된 리세스를 보유한다. 이런 이유로, 식각된 리세스는 자기장이 적용될 때, 구슬을 분리하는데 도움이 된다. 이에 더하여, “식각된” 리세스는 식각 공정(etching process) 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 공정에 의해 형성된다. 더 나아가, 식각된 리세스의 구성과 정렬은 예로써, 구슬의 크기와 구슬 사이에 선택된 공간(spacing)에 따라 달라진다. 식각된 리세스는 구슬(40)이 2차원에서 리세스에 의해 제한된다는 점에서 가급적 2차원이지만, 이들 리세스는 한쪽 방향으로만 구슬을 제한하도록 구성되는 트렌치(trench) 또는 임의의 다른 적합한 리세스에 의해 대체될 수 있다.
측정 장치의 영상 볼륨 내에서 하나 이상의 입자(40)를 실질적으로 고정시키기 위한 방법과 관련하여 다른 구체예가 존재한다. 하나 이상의 입자를 실질적으로 고정시키는 것은 자력(magnetic attraction), 진공 필터 플레이트(vacuum filter plate) 또는 당분야에 공지된 다른 방법을 이용하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 가령, 측정 장치의 영상 볼륨 내에서 하나 이상의 입자를 실질적으로 고정시키는 것은 측정 장치의 영상 볼륨을 한정하는 영상 챔버의 한쪽 면에 자기장을 적용하는 단계를 포함한다. 이에 더하여, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 임의의 다른 단계를 포함할 수 있다.
더 나아가, 이러한 방법은 본 명세서에 기술된 임의의 시스템에 의해 수행될 수 있다. 영상화를 위하여 마이크로스피어를 배치하는 방법과 시스템의 실례는 Pempsell에 의해 2005년 11월 9일 제출된 U.S. Patent Application Serial No. 11/270,786에 예시되는데, 이는 본 명세서에서 참조로서 편입된다. 입자 고정 방법에 상관없이, 입자는 이들 입자가 수초 동안의 검출기 통합 기간(detector integration period) 동안 인지될 정도로 이동하지 않도록 하기 위하여, 가급적 실질적으로 고정된다.
다른 구체예는 하나 이상의 입자를 하나 이상의 보관 용기(가령, 도 10의 시스템에 도입된 분액(aliquot))로부터 측정 장치의 영상 볼륨으로 이송하거나, 영상 볼륨 내에서 하나 이상의 입자를 영상하거나, 영상 볼륨 내에서 하나 이상의 물질을 실질적으로 고정시키거나, 또는 이들의 일부 조합을 달성하도록 구성된 시스템에 관계한다. 이러한 시스템은 본 명세서에 기술된 바와 같이 하나 이상의 입자를 이송하거나, 본 명세서에 기술된 바와 같이 하나 이상의 입자를 영상하거나, 본 명세서에 기술된 바와 같이 하나 이상의 입자를 실질적으로 고정시키거나, 또는 이들의 일부 조합을 달성하도록 구성될 수 있다.
본 명세서에 기술된 측정에는 일반적으로, 입자의 한 가지 이상의 특징, 예를 들면, 복수의 검출 파장에서 입자의 형광 방출의 크기를 표시하는 수치(numerical value)를 결정하기 위하여 입자의 하나 이상의 영상을 분석하는 영상 처리(image processing)가 포함된다. 입자의 한 가지 이상의 특징의 후속 처리(subsequent processing), 예를 들면, 하나 이상의 수치를 이용하여, 이들 입자가 속하는 다중 부분집합(multiplex subset)을 표시하는 토큰(token) ID 및/또는 이들 입자의 표면에 결합되는 분석물의 존재 및/또는 양을 표시하는 리포터 수치(reporter value)를 결정하는 것은 U.S. Patent No. 5,736,330(Fulton), 5,981,180(Chandler et al.), 6,449,562(Chandler et al.), 6,524,793(Chandler et al.), 6,592,822(Chandler), 그리고 6,939,720(Chandler et al.)에 기술된 방법에 따라 방법에 따라 수행될 수 있다.
한 가지 실례에서, U.S. Patent No. 5,981,180(Chandler et al)에 기술된 기술은 입자가 단일 샘플 내에서 복수 분석물의 분석을 위한 부분집합(subset)으로 분류되는 다중화 전략(multiplexing scheme)에서 본 명세서에 기술된 형광 측정과 함께 이용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 구성되는(가령, 본 명세서에 기술된 조명 하위시스템의 구체예의 포함에 의해) 시스템의 추가적인 실례는 U.S. Patent No. 5,981,180(Chandler et al.), 6,046,807(Chandler), 6,139,800(Chandler), 6,366,354(Chandler), 6,411,904(Chandler), 6,449,562(Chandler et al.), 그리고 6,524,793(Chandler et al.)에서 예시된다. 도 10에 도시된 시스템은 이들 특허에서 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수 있다. 도 10에 도시된 시스템은 다른 시스템과 구체예에 대하여, 본 명세서에 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수도 있다.
입자의 측정을 수행하도록 구성된 도 1과 2의 영상 시스템의 다른 구체예는 도 9에 도시된다. 도 9에 도시된 시스템은 샘플의 다중-분석물 측정(multi-analyte measurement)과 같은 적용에 이용될 수 있다. 시스템의 이러한 구체예는 형광 영상 시스템으로서 구성된다. 상기 시스템은 측정 동안 입자(62)의 조명을 제공하도록 구성된 조명 하위시스템을 보유할 수 있다. 도 9에서, 조명 하위시스템은 LED 또는 LED 다이(die)(108)를 보유한다. LED 또는 LED 다이(108)는 당분야에 공지된 임의의 적합한 LED 또는 LED 다이이다. 이에 더하여, 조명 하위시스템은 하나 이상의 광원(제시되지 않음)을 보유할 수 있는데, 이들 각각은 최소한 하나의 파장 또는 최소한 하나의 파장 대역의 광을 산출하도록 구성된다. 도 9에 도시된 시스템에 이용하기 적합한 광원 조합의 실례에는 2개 이상의 LED 또는 LED 다이가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 단일 LED 다이는 단일 방출 구역(임의 형상의), 또는 단일 다이 상에서 복수 방출 구역을 보유할 수 있다. 전형적으로, 이들 복수 방출 구역이 직사각형으로 형상되면, 이들은 “막대(bar)”로 지칭된다. 하지만, 이들 광원은 하나 이상의 다른 비-LED 광원, 예를 들면, 앞서 기술된 것들과 함께, 최소한 하나의 LED 다이를 보유할 수도 있다. 하나 이상의 광원에 의해 산출되는 광은 이들 광원으로부터 광이 입자에 동시에 지향되도록 위하여, 광속분할기(beamsplitter)(제시되지 않음) 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 광학 요소에 의해 공통 조명 경로(common illumination path)로 통합된다.
대안으로, 조명 하위시스템은 입자를 조명하기 위하여 어떤 광원이 이용되는 지에 따라, 광학 요소(제시되지 않음), 예를 들면, 반사 거울(reflecting mirror)과 조명 경로 내외로 광학 요소를 이동시키도록 구성된 장치(제시되지 않음)를 보유할 수 있다. 이러한 방식으로, 광원은 광의 상이한 파장 또는 파장 대역을 갖는 입자를 순차적으로 조명하는데 이용될 수 있다. 이들 광원은 또한, 기질(substrate) 아래로부터가 아닌 위로부터 기질을 조명할 수 있다(제시되지 않음).
광원은 광원에 결합되거나 통합된 입자 또는 물질이 형광을 방출하도록 유도하는 파장 또는 파장 대역에서 광을 제공하도록 선택된다. 가령, 파장 또는 파장 대역은 입자 내에 통합되고 및/또는 입자의 표면에 결합된 형광단, 형광 염료, 또는 다른 형광 물질을 여기하도록 선택된다. 이러한 방식으로, 파장 또는 파장 대역은 입자가 이러한 입자의 분류에 이용되는 형광을 방출하도록 선택된다. 이에 더하여, 파장 또는 파장 대역은 입자의 표면 상에서 또는 입자 내부에서 반응물을 통하여 입자에 결합된 형광단, 형광 염료, 양자점, 형광 나노결정(fluorescent nanocrystal), 또는 다른 형광 물질을 여기하도록 선택된다. 따라서 파장 또는 파장 대역은 입자의 표면 상에서 또는 입자 내부에서 발생하는 반응을 감지 및/또는 정량하는데 이용되는 형광을 입자가 방출하도록 선택된다. 대안으로, 파장 또는 파장 대역은 후속 검사를 선택하기 위하여 입자의 물리적 크기 특징 및/또는 입자 유형의 존재를 결정하는데 이용될 수 있는 형광을 입자가 방출하도록 입자 자체를 여기하도록 선택될 수도 있다. 이런 시스템의 적용의 한 가지 실례는 입자의 형광 및/또는 분산(scattering)에 대응하는 출력이 최소한도로, 생물학적 또는 화학적 병원균의 잠재적 존재를 검출하는데 이용될 수 있는 생체방어 적용(biodefense application)이다.
검출 이외에, 상기 출력을 이용하여 일단의 물리적 및/또는 광학 특징이 분석될 수 있다. 이러한 조명 하위시스템은 또한, 실질적으로 타원(elliptical)이고 LED 또는 LED 다이(108)에 의해 산출되는 광의 광학 경로에 배치되는 반사경(110)을 보유한다. 반사경(110)은 조명 볼륨(illumination volume) 전체에서 광의 강도가 실질적으로 균일하도록 하기 위하여, LED 또는 LED 다이로부터 광을 조명 볼륨으로 지향시키도록 구성된다. LED 또는 LED 다이(108)와 반사경(110)은 본 명세서에 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수 있다. 입자(40)는 측정 동안 조명 볼륨 내에 배치된다. 특히, 반사경(110)은 LED 또는 LED 다이(108)로부터 광을 입자(40)가 고정되는 기질(114)로 지향시키도록 구성된다. 입자(40)는 앞서 기술된 임의의 입자이다. 기질(114)은 당분야에 공지된 임의의 적합한 기질이다. 기질(114)에 고정되는 입자는 조명 하위시스템에 대하여, 기질(114)과 여기에 고정되는 입자(40)의 위치를 유지하기 위하여 영상 챔버(제시되지 않음) 또는 임의의 다른 장치에 배치될 수 있다. 기질(114)의 위치를 유지하기 위한 장치는 또한, 영상에 앞서 기질의 위치를 변형하도록(가령, 조명을 기질에 집중시키도록) 구성될 수 있다.
도 9의 기질(114) 상에 입자(40)의 고정은 앞서 기술된 바와 같은 자력(magnetic attraction), 진공 필터 플레이트(vacuum filter plate), 또는 앞서 기술된 바와 같은 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 입자(40)는 이들 입자가 수초 동안의 검출기 통합 기간(detector integration period) 동안 인지될 정도로 이동하지 않도록 하기 위하여, 가급적 고정된다.
도 9에 도시된 시스템은 또한, 영상 볼륨 내에서 입자로부터(가령, 입자로부터 분산된 및/또는 입자에 의해 방출된) 광에 대응하는 출력을 산출하도록 구성되는 검출 하위시스템을 보유할 수 있다. 가령, 도 9에 도시된 바와 같이, 이러한 검출 하위시스템은 광학 요소(116)와 이색 광선분할기(118)를 보유한다. 광학 요소(116)는 기질(114)과 여기에 고정되는 입자(40)로부터 광을 수집하고 조준하며, 상기 광을 광선분할기(118)로 지향시키도록 구성된다. 광학 요소(116)는 당분야에 공지된 임의의 적합한 광학 요소이다. 이에 더하여, 광학 요소(116)가 도 9에서 단일 광학 요소로서 도시되지만, 광학 요소(116)는 하나 이상의 광학 요소를 보유할 수도 있다. 더 나아가, 광학 요소(116)가 도 9에서 굴절성(refractive) 광학 요소로서 도시되지만, 광학 요소(116)는 하나 이상의 반사성 광학 요소, 하나 이상의 굴절성 광학 요소, 하나 이상의 회절성(diffractive) 광학 요소, 또는 이들의 일부 조합을 보유할 수도 있다.
광선분할기(118)는 당분야에 공지된 임의의 적합한 광선분할기이다. 광선분할기(118)는 광의 파장에 기초하여, 광학 요소(116)로부터 광을 상이한 검출기로 지향시키도록 구성된다. 가령, 첫 번째 파장 또는 파장 대역을 갖는 광은 광선분할기(118)에 의해 전송되고, 첫 번째와 상이한 두 번째 파장 또는 파장 대역을 갖는 광은 광선분할기(118)에 의해 반사된다. 이러한 검출 하위시스템은 또한, 광학 요소(120)와 검출기(122)를 보유할 수 있다. 광선분할기(118)에 의해 전송되는 광은 광학 요소(120)로 지향된다. 광학 요소(120)는 광선분할기에 의해 전송되는 광을 검출기(122)에 집중시키도록 구성된다. 이러한 검출 하위시스템은 광학 요소(124)와 검출기(126)를 더욱 보유할 수 있다. 광선분할기(118)에 의해 반산된 광은 광학 요소(124)로 지향된다. 광학 요소(124)는 광선분할기에 의해 반사된 광을 검출기(126)로 집중시키도록 구성된다. 광학 요소(120, 124)는 광학 요소(116)에 대하여, 앞서 기술된 바와 같이 구성된다.
검출기(122, 126)에는 예로써, 전하 결합 소자(CCD) 검출기 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 영상 검출기, 예를 들면, CMOS 검출기, 광감성(photosensitive) 요소의 2차원 어레이, 시간 지연 적분(time delay integration, TDI) 검출기 등이 포함된다. 일부 구체예에서, 실질적으로 전체 기질 또는 기질 상에 고정되는 모든 입자의 영상을 동시에 획득하는데 2차원 CCD 영상 어레이와 같은 검출기가 이용될 수 있다. 시스템 내에 포함되는 검출기의 총수는 각 검출기가 파장 또는 파장 대역 중의 하나에서 영상을 산출하는데 이용되도록 하기 위하여, 목적하는 파장 또는 파장 대역의 총수에 동등하다. 이들 검출기에 의해 산출되는 각 영상은 광선분할기에서부터 검출기에 이르는 광 경로에 배치되는 광학 대역통과 요소(제시되지 않음) 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 광학 요소를 이용하여 스펙트럼 여과된다. 상이한 필터 “대역(band)”이 각 포착된 영상에 대하여 이용될 수 있다. 영상이 획득되는 각 파장 또는 파장 대역에 대한 검출 파장 중심과 너비는 입자 분류(particle classification) 또는 리포터(reporter signal)에 이용되는 지에 상관없이, 목적하는 형광 방출에 조화된다. 이러한 방식으로, 도 9에 도시된 시스템의 검출 하위시스템은 상이한 파장 또는 파장 대역에서 복수 영상을 동시에 산출하도록 구성된다.
도 9에 도시된 시스템이 2개의 검출기를 보유하긴 하지만, 이러한 시스템은 2개 이상의 검출기(가령, 3개의 검출기, 4개의 검출기 등)를 보유할 수 있다. 앞서 기술된 바와 같이, 이들 검출기는 상이한 파장 또는 파장 대역에서 광을 상이한 검출기에 동시에 지향시키기 위한 하나 이상의 광학 요소를 이용함으로써 상이한 파장 또는 파장 대역에서 영상을 동시에 산출하도록 구성된다. 이에 더하여, 이러한 시스템이 도 9에서 복수 검출기를 보유하는 것으로 도시되지만, 이러한 시스템은 단일 검출기를 보유할 수도 있다. 단일 검출기는 복수 파장 또는 파장 대역에서 복수 영상을 순차적으로 산출하는데 이용될 수 있다. 가령, 상이한 파장 또는 파장 대역의 광은 기질에 순차적으로 지향되고, 각각의 상이한 파장 또는 파장 대역을 갖는 기질의 조명 동안 상이한 영상이 산출된다.
다른 실례에서, 단일 검출기로 지향되는 광의 파장 또는 파장 대역을 선별하기 위한 상이한 필터가 상이한 파장 또는 파장 대역에서 영상을 순차적으로 산출하기 위하여 변형될 수 있다(가령, 영상 경로 내외로 상이한 필터를 이동시킴으로써). 이런 이유로, 도 9에 도시된 검출 하위시스템은 여러 목적 파장에서 입자(112)의 형광 방출을 표시하는 복수의 또는 일련의 영상을 산출하도록 구성된다. 이에 더하여, 상기 시스템은 입자의 형광 방출을 표시하는 복수의 또는 일련의 디지털 영상을 프로세서(즉, 처리 엔진(processing engine))에 공급하도록 구성된다. 이와 같은 실례에서, 상기 시스템은 프로세서(128)를 보유한다. 프로세서(128)는 검출기(122, 126)로부터 영상 데이터를 획득(가령, 수신)하도록 구성된다. 가령, 프로세서(128)는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방식으로 검출기(122, 126)에 결합된다(가령, 전송 매체(제시되지 않음)를 통하여, 이들 검출기 중에서 하나가 프로세서에 각각 결합된다; 하나 이상의 전자 소자(제시되지 않음), 예를 들면, 아날로그-디지털 변환기(analog-to-digital converter)를 통하여, 이들 검출기 중에서 하나가 프로세서에 각각 결합된다; 등). 적절하게는, 프로세서(128)는 입자(40)의 한 가지 이상의 특징, 예를 들면, 입자의 분류와 입자의 표면 상에서 분석물에 관한 정보를 결정하기 위하여 이들 영상을 처리하고 분석하도록 구성된다. 한 가지 이상의 특징은 임의의 적합한 방식, 예를 들면, 각 파장 또는 파장 대역에서 각 입자에 대한 형광 광도(fluorescent magnitude)를 위한 입구(entry)를 보유하는 데이터 어레이(data array)에서 프로세서에 의해 산출된다. 프로세서(128)는 전형적인 퍼스널 컴퓨터(personal computer), 메인프레임 컴퓨터 시스템(mainframe computer system), 워크스테이션(workstation) 등에 통상적으로 포함되는 프로세서이다. 일반적으로, “컴퓨터 시스템”은 기억 매체(memory medium)로부터 명령을 수행하는 하나 이상의 프로세서를 보유하는 임의의 장치를 포괄하도록 넓게 정의된다. 이러한 프로세서는 임의의 다른 적절한 기능적 하드웨어(functional hardware)를 이용하여 수행될 수 있다. 가령, 상기 프로세서에는 펌웨어(firmware)에 고정 프로그램(fixed program)을 보유하는 디지털 신호 프로세서(digital signal processor, DSP), 필드 프로그램가능 게이트 어레이(field programmable gate array, FPGA), 또는 고급 프로그래밍 언어(high level programming language), 예를 들면, 초고속 집적 회로(very high speed integrated circuit, VHSIC) 하드웨어 기술 언어(hardware description language, VHDL)로 “작성된” 순차 논리(sequential logic)를 이용하는 다른 프로그램가능 논리 소자(programmable logic device, PLD)가 포함된다.
다른 실례에서, 프로세서(128) 상에서 수행될 수 있는 프로그램 명령(program instruction)(제시되지 않음)은 고급 언어, 예를 들면, C#(적절하게는, C++로 작성된 부분 포함), ActiveX controls, JavaBeans, Microsoft Foundation Classes(“MFC”), 또는 원하는 다른 기술이나 방법으로 코드화된다. 프로그램 명령은 특히, 절차-기초된 기술(procedure-based technique), 성분-기초된 기술(component-based technique) 및/또는 객체-지향된 기술(object-oriented technique)을 비롯한 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
도 9에 도시된 시스템은 다른 시스템과 구체예에 대하여, 본 명세서에 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수 있다.
도 10에서는 본 발명의 특정 구체예에 따라 입자의 측정을 수행하도록 구성된 영상 시스템의 유세포분석기 구체예를 도시한다. 도 10에 도시된 시스템은 본 명세서에 기술된 구체예에 따라 구성된 조명 하위시스템을 보유한다. 도 10에서, 이러한 시스템은 입자(74)가 흘러가는 큐벳(72)의 횡단면(cross section)을 통하는 평면(plane)을 따라서 도시된다. 한 가지 실례에서, 큐벳은 표준 유세포분석기에 이용되는 것과 같은 표준 융합된 실리카 큐벳이다. 하지만, 분석용 샘플을 전달하기 위하여, 임의의 다른 적합한 유형의 보기(viewing) 또는 전달(delivery) 구성, 예를 들면, 적절하게 제한된 샘플 기류 흐름(air-flow stream) 역시 이용될 수 있다. 도 10의 시스템에 실시간 PCR의 방법을 적용하는 것은 PCR 용액의 분액을 서열 증폭기로부터 도 10의 검출 시스템으로 이전하는 단계를 수반한다. PCR 공정의 상이한 간격에서 분액을 채취함으로써, 최초 주형 또는 DNA의 정량이 조장된다. 이러한 방법은 또한, 추가의 완충액 또는 반응물을 첨가함으로써 분액을 조작하거나, 또는 검출을 향상시키는 증폭 방법일 수 있다. 다른 방법에는 서열 증폭기에 로딩(loading)에 앞서 PCR 반응물을 전-등분(pre-aliquoting)하거나, PCR 공정에서 독립된 간격에서 이들 샘플을 제거하거나, 또는 임의의 다른 분석 공정이 포함될 수 있다.
이러한 조명 하위시스템은 광으로 입자(74)를 조명하도록 구성된다. 상기 조명 하위시스템은 LED 또는 LED 다이(76)를 보유한다. LED 또는 LED 다이는 당분야에 공지된 임의의 적합한 LED 또는 LED 다이이다. 이에 더하여, 상기 조명 하위시스템은 하나 이상의 LED 또는 LED 다이(제시되지 않음)를 보유할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 조명 하위시스템은 LED 또는 LED 다이(76)와 하나 이상의 다른 광원(제시되지 않음), 예를 들면, LED, LED 다이, 레이저, 아크 등(arc lamp), 섬유 조명기(fiber illuminator), 전구(light bulb), 또는 이들의 일부 조합을 보유한다. 다른 광원은 당분야에 공지된 임의의 적합한 광원이다. 이러한 방식으로, 상기 조명 하위시스템은 하나 이상의 광원을 보유한다. 한 구체예에서, 이들 광원은 상이한 파장 또는 파장 대역을 갖는 광(가령, 청색광과 녹색광)으로 입자를 조명하도록 구성된다. 일부 구체예에서, 이들 광원은 상이한 방향에서 입자를 조명하도록 구성된다.
이러한 조명 하위시스템은 또한, 실질적으로 타원(elliptical)이고, 조명 볼륨(illumination volume) 전체에서 광의 강도가 실질적으로 균일하거나, 또는 조명 볼륨에서 선택된 조명 기능을 갖도록 하기 위하여 LED 또는 LED 다이(76)로부터 광을 조명 볼륨으로 지향시키도록 구성되는 반사경(78)을 보유한다. LED 또는 LED 다이(76)와 반사경(78)은 본 명세서에 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수 있다. 입자(74)는 측정 동안 조명 볼륨을 통하여 흘러간다. 이러한 방식으로, 광 출구 반사경(78)은 입자가 큐벳을 통하여 흘러가는 동안 이들 입자를 조명한다. 이러한 조명은 입자 자체, 또는 여기에 부착되거나 통합된 형광단이 하나 이상의 파장 또는 파장 대역을 갖는 형광을 방출하도록 유도한다. 형광단은 당분야에 공지된 임의의 적합한 형광단이다. 일부 구체예에서, 입자(74) 자체가 적절한 강도와 파장의 광으로 조명될 때, 형광을 방출하거나, 또는 형광을 자연 방출하도록 구성된다. 이와 같은 구체예에서, 광 출구 반사경(78)이 입자가 형광을 방출하도록 유도한다.
도 10에 도시된 시스템은 또한, 조명 볼륨에서 입자로부터(가령, 입자로부터 분산된 및/또는 입자에 의해 방출된) 광에 대응하는 출력을 산출하도록 구성된 검출 하위시스템을 보유한다. 가령, 입자로부터 전방으로 분산된 광은 광학 요소(82)에 의해 검출 시스템(80)으로 지향되는데, 상기 광학 요소는 접반사경(folding mirror), 적절한 광 지향 소자(light directing component), 또는 이색 반사 소자(dichronic reflecting component)이다. 대안으로, 검출 시스템(80)은 전방 분산된 광의 경로에 직접적으로 배치될 수 있다. 이러한 방식으로, 광학 요소(82)는 시스템에 포함되지 않는다. 한 구체예에서, 전방 분산된 광은 도 10에 도시된 바와 같이, 조명 하위시스템에 의해 조명의 방향으로부터 대략 180° 각도에서 입자에 의해 분산된 광이다. 전방 분산된 광의 각도는 입사광(incident light)이 검출 시스템의 광감성 표면에 충돌하지 않도록 하기 위하여, 조명의 방향으로부터 정확하게 180°가 아닐 수도 있다. 가령, 전방 분산된 광은 조명의 방향으로부터 180°보다 크거나 작은 각도에서 입자에 의해 분산된 광(가령, 대략 170°, 대략 175°, 대략 185°, 또는 대략 190°의 각도에서 분산된 광)이다. 조명의 방향으로부터 대략 90° 각도에서 입자에 의해 분산된 광 역시 검출 하위시스템에 의해 수집될 수 있다. 입자에 의해 분산된 광은 부가적으로, 또는 대안적으로, 검출 하위시스템에 의해 임의의 각도 또는 배향에서 수집될 수 있다.
한 구체예에서, 이러한 분산된 광은 하나 이상의 광선분할기 또는 이색 거울에 의해 광의 하나 이상의 광선으로 분리된다. 가령, 조명 방향으로 대략 90°각도에서 분산된 광은 광선분할기(84)에 의한 광의 2가지 상이한 광선으로 분리된다. 광의 이들 2가지 상이한 광선은 광의 4가지 상이한 광선을 발생시키기 위하여 광선분할기(86, 88)에 의해 다시 분리될 수 있다. 광의 각 광선은 하나 이상의 검출기를 보유하는 상이한 검출 시스템으로 지향될 수 있다. 가령, 광의 4가지 광선 중에서 하나는 검출 시스템(90)으로 지향된다. 검출 시스템(90)은 입자에 의해 분산된 광을 검출하도록 구성된다. 검출 시스템(80) 및/또는 검출 시스템(90)에 의해 검출된 분산된 광은 일반적으로, 광원에 의해 조명되는 입자의 볼륨에 비례한다. 이런 이유로, 검출 시스템(80)의 출력 및/또는 검출 시스템(90)의 출력은 조명 볼륨 내에 위치하는 입자의 직경(diameter)을 결정하는데 이용될 수 있다.
이에 더하여, 검출 시스템(80) 및/또는 검출 시스템(90)의 출력은 함께 뭉치거나, 또는 대략 동시에 조명 볼륨을 통과하는 하나 이상의 입자를 확인하는데 이용될 수 있다. 이런 이유로, 이들 입자는 다른 샘플 입자와 보정 입자(calibration particle)로부터 구별된다. 광의 다른 3가지 광선은 검출 시스템(92, 94, 96)으로 지향된다. 검출 시스템(92, 94, 96)은 형광단 또는 입자 자체에 의해 방출된 형광을 검출하도록 구성된다. 각 검출 시스템은 상이한 파장 또는 상이한 파장 범위의 형광을 검출하도록 구성된다. 가령, 검출 시스템 중에서 하나는 녹색 형광을 검출하도록 구성된다. 다른 검출 시스템은 옐로-오렌지(yellow-orange) 형광을 검출하도록 구성되고, 또 다른 검출 시스템은 적색 형광을 검출하도록 구성된다.
일부 구체예에서, 스펙트럼 필터(98, 100, 102)가 각각, 검출 시스템(92, 94, 96)에 결합된다. 이들 스펙트럼 필터는 검출 시스템이 검출하도록 구성되는 것(들)과 상이한 파장의 형광을 차단하도록 구성된다. 이에 더하여, 하나 이상의 렌즈(제시되지 않음)가 각 검출 시스템에 광학적으로 결합될 수 있다. 이들 렌즈는 검출기의 광감성 표면에 분산된 광 또는 방출된 형광을 집중시키도록 구성된다. 검출기의 출력은 검출기에 충돌하는 형광 광에 비례하고, 전류 펄스(current pulse)를 발생시킨다. 이러한 전류 펄스는 전압 펄스(voltage pulse) 전환되고, 저대역(low pass) 여과되고, 이후 A/D 변환기(converter)(제시되지 않음)에 의해 디지털화될 수 있다. 프로세서(104), 예를 들면, 디지털 신호 프로세서(DSP)는 펄스 아래 구역을 적분하여 형광 광도를 나타내는 숫자를 제공한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 프로세서(104)는 전송 매체(106)를 통하여 검출기(90)에 결합된다. 프로세서(104)는 또한, 전송 매체(106)와 하나 이상의 다른 소자(제시되지 않음), 예를 들면, A/D 변환기를 통하여 간접적으로 검출기(90)에 결합될 수도 있다. 상기 프로세서는 유사한 방식으로 시스템의 다른 검출기에 결합될 수 있다. 프로세서(104)는 본 명세서에 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수 있다.
일부 구체예에서, 형광단 또는 입자에 의해 방출되는 형광에 대응하는 출력은 입자의 실체와 이들 입자의 표면에서 일어났거나 일어나고 있는 반응에 관한 정보를 결정하는데 이용된다. 가령, 2개의 검출 시스템서 출력이 입자의 실체를 결정하는데 이용되고, 다른 검출 시스템의 출력이 입자의 표면에서 일어났거나 일어나고 있는 반응에 관한 정보를 결정하는데 이용된다. 이런 이유로, 검출기과 스펙트럼 필터의 선택은 입자에 통합되거나 결합되는 염료 또는 형광단의 유형 및/또는 측정되는 반응(즉, 이러한 반응에 관여하는 반응물에 통합되거나 결합된 염료)에 따라 달라지거나, 또는 입자 자체의 형광 특징에 좌우된다. 샘플 입자의 실체를 결정하는데 이용되는 검출 시스템(가령, 검출 시스템(92, 94))은 전자사태 광다이오드(APD), 광증배관(PMT), 또는 다른 유형의 광검출기(photodetector)이다. 입자의 표면에서 일어났거나 일어나고 있는 반응을 확인하는데 이용되는 검출 시스템(가령, 검출 시스템(96))은 PMT, APD, 또는 다른 유형의 광검출기이다. 이러한 측정 시스템은 본 명세서에 기술된 바와 같이 더욱 구성될 수 있다.
도 10의 시스템이 상이한 염료 특징을 갖는 입자를 구별하기 위한 2개의 검출 시스템을 보유하지만, 이러한 시스템은 상이한 염료 특징을 갖는 입자를 구별하기 위한 2개 이상의 검출 시스템(즉, 3개의 검출 시스템, 4개의 검출 시스템 등)을 보유할 수 있다. 이런 구체예에서, 상기 시스템은 추가 광선분할기와 추가 검출 시스템을 보유할 수 있다. 이에 더하여, 스펙트럼 필터 및/또는 렌즈가 각각의 추가 검출 시스템에 결합될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 시스템은 영상 챔버(42)에 결합된 열 통제 요소(thermal control element)를 보유한다. 이러한 열 통제 요소가 영상 챔버(42)에 결합되면, 영상 챔버 내에서 온도는 다양한 생물학적 반응을 수행하기 위하여 필요에 따라 조정될 수 있다. 따라서 영상 챔버 PCR에 열 통제 요소의 결합은 영상 챔버(42) 내에서 수행될 수 있다. 특정 측면에서, 영상 챔버는 초음파처리(sonication) 또는 와동(vortexing) 장치를 비롯한, 챔버의 표면으로부터 마이크로스피어의 방출을 위한 장치에 결합된다. 다른 구체예에는 복수 검출 챔버 및/또는 일회용 검출 챔버를 보유하는 시스템이 포함된다.
B. PCR
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 시험관내 효소 복제(in vitro enzymatic replication)로 DNA 조각을 증폭하는 분자 생물학에서 널리 이용되는 기술이다. 전형적으로, PCR 적용에는 열-안정성 DNA 중합효소, 예를 들면, Taq 중합효소가 이용된다. 이러한 DNA 중합효소는 주형(template)으로서 단일 가닥(single-stranded) DNA와 DNA 합성을 촉발하기 위한 DNA 프라이머(primer)를 이용하여, 뉴클레오티드(dNTP)로부터 새로운 DNA 가닥을 효소적으로 조립한다. 기초 PCR 반응은 아래와 같은 여러 성분과 반응물을 필요로 한다: 증폭되는 표적 서열을 보유하는 DNA 주형; 표적 서열의 5'와 3' 말단에서 DNA 영역에 상보적인 하나 이상의 프라이머; 가급적, 대략 70℃에서 최적 온도를 갖는 DNA 중합효소(가령, Taq 중합효소); 데옥시뉴클레오티드 삼인산염(deoxynucleotide triphosphate, dNTP); DNA 중합효소의 최적 활성과 안정성을 위한 적합한 화학적 환경을 제공하는 완충액; 이가 양이온(divalent cation), 전형적으로, 마그네슘 이온(magnesium ion, Mg2+); 그리고 일가 양이온(monovalent cation), 전형적으로, 칼슘 이온(potassium ion).
대부분의 PCR 방법에는 규정된 일련의 온도 단계(temperature step)에 PCR 샘플을 종속시키는 서열 증폭(thermal cycling)이 이용된다. 각 주기는 전형적으로, 2가지 또는 3가지 독립된 온도 단계를 갖는다. 이러한 사이클링(cycling)은 종종, 높은 온도(>90℃)에서 단일 온도 단계(“개시”)가 선행하고, 이후 최종 산물 신장(“최종 신장”) 또는 짧은 보관(“최종 보유”)을 위하여 종결 시점에서 1가지 또는 2가지 온도 단계가 뒤따른다. 이용된 온도와 이들의 각 주기에서 적용되는 시간 길이는 다양한 파라미터(parameter)에 좌우된다. 이들에는 DNA 합성에 이용되는 효소, 반응물에서 이가 이온과 dNTP의 농도, 그리고 프라이머의 용융 온도(melting temperature)(Tm)가 포함된다. PCR 방법의 다양한 단계에서 통상적으로 이용되는 온도는 아래와 같다: 개시 단계(initialization step) - 94-96℃; 변성 단계(denaturation step) - 94-98℃; 어닐링 단계(annealing step) - 50-65℃; 확장(extension)/신장(elongation) 단계 - 70-74℃; 최종 신장(final elongation) - 70-74℃; 최종 보유(final hold) - 4-10℃.
정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(QRT-PCR) 또는 동적 중합효소 연쇄 반응으로 불리는 실시간 중합효소 연쇄 반응은 표적된 DNA 분자를 증폭하고 동시에 정량하는데 이용된다. 이는 DNA 샘플 내에서 특정 서열의 검출과 정량(DNA 입력 또는 부가적인 표준화 유전자(normalizing gene)에 표준화될 때, 절대 사본수(absolute number of copy) 또는 상대적 양(relative amount)으로) 둘 모두를 가능하게 한다. 실시간 PCR은 낮은 존재비(abundance) RNA를 정량하기 위한 역전사 중합효소 연쇄 반응과 합동될 수 있다. 실시간 PCR의 대수기(exponential phase) 동안 존재하는 DNA의 상대적 농도는 로그자(logarithmic scale)에서 주기 횟수(cycle number)에 대하여 형광을 도면에 기입함으로써 결정된다. 이후, DNA의 양은 연속 희석(serial dilution)된 공지된 양의 DNA의 실시간 PCR에 의해 산출된 표준 곡선(standard curve)에 이들 결과를 비교함으로써 결정된다.
다중-PCR과 다중 실시간 PCR에는 상이한 DNA 서열의 앰플리콘(amplicon)을 산출하기 위하여 단일 PCR 반응 내에 복수의 독특한 프라이머 세트가 이용된다. 한 번에 복수 유전자를 표적함으로써, 더욱 많은 반응물과 더욱 많은 수행 시간이 요구됐을 수도 있는 단일 검사 작업(single test run)으로부터 부가적인 정보가 획득될 수 있다. 각 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도(annealing temperature)는 단일 반응 내에서 작용하도록 최적화되어야 한다.
본 명세서에 기술된 방법에는 PCR 공정 동안 비대칭적 촉발 기술(asymmetric priming technique) 역시 이용될 수 있는데, 이는 상보성 표적 서열에 리포터 프로브의 결합을 강화시킬 수 있다. 비대칭적 PCR은 DNA 주형에서 한쪽 가닥을 다른 가닥보다 더욱 우선적으로 증폭하기 위하여, 선택된 가닥에 대한 과량의 프라이머로 수행된다.
C. 실시간 PCR 검출 화학물질
실시간 PCR에 현재 이용되고 있는 여러 상업적으로 가용한 핵산 검출 화학물질이 존재한다. 이들 화학물질에는 DNA 결합제(binding agent), FRET 기초된 핵산 검출, 혼성화 프로브, 분자 비콘, 가수분해 프로브, 그리고 염료-프라이머 기초된 시스템이 포함된다. 이들 화학물질은 각각 하기에 더욱 상술된다.
1. DNA 결합제
동적 PCR의 첫 번째 분석은 Higuchi 등에 의해 수행되었는데, 이들은 이중 가닥(double-stranded) DNA 산물을 결합시키는데 에티듐 브롬화물(ethidium bromide)을 이용하였다(Higuchi et al., 1992; Higuchi et al., 1993; U.S. Patent 5,994,056; U.S. Published Application No. 2001/6171785). 에티듐 브롬화물은 동적 PCR에 이용되는 다른 DNA 결합제와 유사하게, 결합 이후에 형광 강도를 증가시킬 수 있다. 결과로써, 신호 증가가 반응 과정 동안 기록되고, 주기 횟수와 대비하여 도면에 기입될 수 있다. 이러한 방식으로 데이터를 기록하는 것은 종점 분석(end-point analysis)에 비하여, 목적하는 샘플의 최초 농도를 더욱 지시한다.
결합 염료는 다른 검출 화학물질에 비하여 상대적으로 저렴하다. 이들 결합 염료를 이용하는 이점은 낮은 비용과 뛰어난 신호 대 잡음 비율(signal to noise ratio)이다. 단점은 프라이머-이합체 형성에 의해 만들어진 앰플리콘을 비롯하여, PCR 반응에서 임의의 이중-가닥 DNA에 비-특이적인 결합 특성 등이다(Wittwer et al., 1997). 특이적인 앰플리콘의 생산을 확증하기 위하여, 용해 곡선 분석(melting curve analysis)이 수행되어야 한다(Ishiguro et al., 1995). 다른 단점은 더욱 긴 산물의 증폭이 더욱 짧은 산물에서보다 더욱 많은 신호를 발생시킨다는 점이다. 증폭 효율이 상이하면, 정량이 훨씬 부정확해질 수 있다(Bustin and Nolan, 2004).
SYBRGreen I(Invitrogen™, Carlsbad, CA)는 대중적인 삽입 염료이다(Bengtsson et al., 2003). SYBRGreen I은 환형 치환된(cyclically substituted) 비대칭 시아닌 염료(asymmetric cyanine dye)(Zipper et al., 2004; U.S. Patent 5,436,134; U.S. Patent 5,658,751)이다. BEBO로 알려져 있는 소홈(minor groove) 결합 비대칭 시아닌 염료가 실시간 PCR에 이용되고 있다. BEBO는 아마도 느린 집합 과정(aggregation process)으로 인하여 시간의 추이에서 형광의 비-특이적인 증가를 유발하고, SYBRGreen I에 비하여 덜 민감하다. BOXTO로 불리는 유사한 염료 역시 qPCR에 이용되는 것으로 보고되었다(Bengtsson et al., 2003; U.S. Published Application No. 2006/0211028). BEBO와 유사하게, BOXTO는 SYBRGreen I보다 덜 민감하다(U.S. Published Application No. 2006/0211028).
다른 공통 리포터에는 YO-PRO-1과 티아졸 오렌지(thiazole orange, TO)가 포함되는데, 이들은 삽입 비대칭 시아닌 염료이다(Nygren et al., 1998). 이들 염료가 결합 이후에 형광 강도에서 상당한 증가를 나타내긴 하지만, TO와 Oxazole Yellow(YO)는 실시간 PCR에서 성과가 불량한 것으로 보고되었다(Bengtsson et al., 2003). 이용될 수 있는 다른 염료에는 피코 그린(pico green), 아크리디늄 오렌지(acridinium orange), 그리고 크로모마이신(chromomycin A3이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(U.S. Published Application No. 2003/6569627).
실시간 PCR에 적합한 염료는 다양한 공급업체, 예를 들면, Invitrogen, Cambrex Bio Science(Walkersville, MD), Rockland Inc.(Rockland, ME), Aldrich Chemical Co.(Milwaukee, WI), Biotium(Hayward, CA), TATAA Biocenter AB(Goteborg, Sweden), 그리고 Idaho Technology(Salt Lake City, UT)로부터 구입할 수 있다(U.S. Published Application No. 2007/0020672).
EvaGreen™(Biotium)으로 알려져 있는 염료는 PCR을 저해하지 않도록 설계되고 SYBRGreen I에 비하여 알칼리 조건에서 더욱 안정하다는 점에서 유망하다(Dorak, 2006; U.S. Published Application No. 2006/0211028). 다른 새로운 염료에는 LCGreen염료 집단(Idaho Technology)이 포함된다. LCGreenI과 LCGreenPlus는 이들 염료 중에서 상업적으로 가장 경쟁력이 있다. LCGreenPlus는 LCGreen보다 훨씬 선명하다(U.S. Published Application No. 2007/0020672; Dorak, 2006; U.S. Published Application No. 2005/0233335; U.S. Published Application No. 2066/0019253).
2. FRET 기초된 핵산 검출
많은 실시간 핵산 검출 방법에는 포레스트 공명 에너지 이동(Forster Resonance Energy Transfer, FRET)에 의해 상호작용하는 라벨이 이용된다. 이러한 기전은 공여자(donor)와 수용자(acceptor) 쌍을 수반하는데, 여기서 공여자 분자는 특정 파장에서 여기되고, 이후 이의 에너지가 수용자 분자로 비-방사성으로 이동한다. 이는 전형적으로, 공여자와 수용자 분자의 상호 근접을 지시하는 신호 변화를 결과한다.
이러한 기술의 기초가 되는 FRET 기초된 핵산 검출의 초기 방법에는 Heller 등(U.S. Patent No. 4,996,143; 5,532,129; 5,565,322)에 의한 연구가 포함된다. 이들 특허에서는 서로 근접하게 표적 서열에 혼성화되는 2개의 표지된 프로브를 포함함으로써 FRET 기초된 핵산 검출을 도입한다. 이러한 혼성화 현상은 에너지의 이동을 유발하여 스펙트럼 반응(spectral response)에서 측정가능 변화를 발생시키는데, 이러한 변화는 표적의 존재를 간접적으로 신호한다.
Cardullo 등(참조로서 편입됨)은 형광 변화(fluorescence modulation)와 비-방사성 형광 공명 에너지 이동이 용해 상태에서 핵산 혼성화를 검출할 수 있음을 확립하였다(Cardullo et al., 1988). 상기 연구에서는 3가지 FRET 기초된 핵산 검출 전략을 이용하였다. 첫 번째 전략은 서로 상보성인 2개의 5' 표지된 프로브를 포함하고, 혼성화된 복합체의 범위에서 공여자와 수용자 형광단 사이에 이동이 진행되도록 한다. 두 번째 방법에서, 형광 분자는 2개의 핵산, 3' 말단에서 한 핵산과 5' 말단에서 다른 핵산에 공유 부착되었다. 이들 형광단-표지된 핵산은 더욱 길고 표지되지 않은 핵산의 별개지만 가까운 거리의 서열에 혼성화되었다. 최종적으로, 삽입 염료는 프로브의 5' 말단에서 공유 부착된 수용자 형광단에 대한 공여자로서 이용되었다.
참조로서 편입된 Morrison 등(1989)에서는 경쟁적 혼성화(competitive hybridization)로 표지되지 않은 표적 DNA를 검출하기 위하여 상보성 표지된 프로브를 이용하여 형광 신호를 발생시켰는데, 이들 신호는 표적 DNA 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 이러한 경우에, 서로 상보성이고 5'와 3' 말단에서 각각, 플루오레세인과 플루오레세인 소광물질에서 표지된 2개의 프로브가 이용되었다. 더욱 최근의 연구 역시 형광 용해 곡선이 혼성화를 모니터하는데 이용될 수 있음을 증명하였다(Morrison and Stols, 1993).
3. 혼성화 프로브
실시간 PCR에 이용되는 혼성화 프로브는 주로, Roche LightCycler기구와 함께 이용을 위하여 개발되었다(U.S. Published Application No. 2001/6174670; U.S. Published Application No. 2000/6140054). 이들은 때때로, FRET 프로브, LightCycler프로브, 또는 이중 FRET 프로브로 지칭된다(Espy et al., 2006).
혼성화 프로브는 FRET가 직접적으로 측정되는 방식으로 이용된다(Wilhelm and Pingoud, 2003). 2개의 프로브는 각각, 형광 에너지 이동 쌍의 개별 구성원으로 표지되고, 따라서 표적 DNA 서열의 인접 영역에 혼성화 이후에, 여기 에너지(excitation energy)가 공여자에서 수용자로 이동하고 수용자에 의한 추후 방출이 리포터 신호로서 기록될 수 있다(Wittwer et al., 1997). 이들 2개의 프로브는 상류 프로브가 3' 말단에서 형광 표지되고 하류 프로브가 5' 말단에서 표지되도록 표적 서열에 어닐링된다. 하류 프로브의 3' 말단은 전형적으로, 인산화(phosphorylation)에 의해, 또는 PCR 동안 프로브의 확장을 예방하는 일부 다른 수단에 의해 차단된다. 상류 프로브의 3' 말단에 결합된 염료는 상기 프로브의 확장을 예방하는데 충분하다. 이러한 리포터 시스템은 형광 신호를 소멸시키기 보다는 발생시키기 위하여 FRET를 이용한다는 점에서, 다른 FRET 기초된 검출 방법(분자 비콘, TaqMan등)과 상이하다(Dorak, 2006).
전형적인 수용자 형광단에는 시아닌 염료(Cy3과 Cy5), 6-카르복시-4,7,2',7'-테트라클로로플루오레세인(TET), 6-카르복시-N,N,N',N'-테트라메틸로다민(TAMRA), 그리고 6-카르복시로다민 X(ROX)가 포함된다. 공여자 형광단은 일반적으로, 6-카르복시플루오레세인(FAM)이다(Wilhelm and Pingoud, 2003). 혼성화 프로브는 유전자형확인(genotyping)과 미스매치(mismatch) 검출에 특히 유리하다. 용해 곡선 분석은 PCR 반응 동안 형광의 주기전 모니터링(per-cycle monitoring)에 추가하여, 수행될 수 있다. 프로브 혼성화 이후에 샘플의 느린 가열은 목적 서열에 관한 추가의 정량적인 정보를 제공할 수 있다(Lay and Wittwer, 1997; Bernard et al., 1998a; Bernard et al., 1998b). 염기쌍 미스매치(base-pair mismatch)는 미스매치 유형과 서열 내에서 위치에 따라, 이중나선의 안정성(stability)을 다양한 양으로 이동시킬 것이다(Guo et al., 1997).
4. 분자 비콘
헤어핀 프로브(hairpin probe)로 알려져 있는 분자 비콘(molecular beacon)은 상보성 표적 서열의 존재에서 개방되고 혼성화되는 스템-루프 구조(stem-loop structure)이고 전형적으로, 형광에서 증가를 유도한다(U.S. Patent 5,925,517); U.S. Published Application No. 2006/103476). 분자 비콘은 전형적으로, 분석 조건 하에 표적의 부재에서 서로 상호작용하여 스템 이중나선(stem duplex)을 형성하는 친화성 쌍(affinity pair)의 구성원이 측면에서 접하는 핵산 표적 보체(complement) 서열을 보유한다. 미리 선택된 표적 서열에 프로브의 혼성화는 프로브에서 형태 변화를 유도하고, “팔(arm)”을 강제로 이격시키고, 스템 이중나선을 제거하여 형광단과 소광물질을 분리한다.
5. 가수분해 프로브
TaqMan분석물(U.S. Patent 5,210,015)로 알려져 있는 가수분해 프로브가 널리 이용되고 있는데, 그 이유는 이들이 2개의 프로브(혼성화 프로브에서처럼)가 아닌 표적 서열에 대해 단일 프로브만을 필요로 하기 때문이다. 이는 샘플당 비용을 절감한다. 또한, 이들 프로브의 설계가 분자 비콘의 설계보다 덜 복잡하다. 이들은 전형적으로, 5' 말단에서 리포터와 3' 말단에서 소광물질로 표지된다. 리포터와 소광물질이 동일한 프로브 상에 고정될 때, 이들은 매우 근접하게 존재하도록 강제된다. 이러한 근접은 프로브가 표적 서열에 혼성화될 때에도 리포터 신호를 효과적으로 소멸시킨다. PCR 반응의 확장 또는 신장 단계 동안, Taq 중합효소로 알려져 있는 중합효소가 5' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)으로 인하여 이용된다. 이러한 중합효소는 상류 프라이머를 결합 부위로서 이용하고, 이후 확장된다. 가수분해 프로브는 중합효소 확장 동안 Taq의 5'-엑소뉴클레아제 활성에 의해 5' 말단에서 절단된다. 이러한 현상이 발생하면, 리포터 형광단은 프로브로부터 방출되고, 차후에, 소광물질에 더 이상 근접하여 존재하지 않는다. 이는 PCR 반응이 사이클링(cycling)을 지속함에 따라, 각 신장 단계에서 리포터 신호의 영구적인 증가를 유도한다. 각 주기에서 최대 신호를 담보하기 위하여, 반응에서 프라이머의 Tm보다 거의 10℃ 높은 Tm을 갖는 가수분해 프로브가 설계된다.
하지만, 프로브의 5' 말단을 절단하는 과정은 표적 서열의 증폭 또는 확장을 요하지 않는다(U.S. Patent 5,487,972). 이는 프로브를 표적 서열 상에서 상류 프라이머에 인접하게 배치함으로써 달성된다. 이러한 방식으로, 어닐링과 차후의 프로브 가수분해의 순차적 라운드가 진행되고, 중합화의 부재에서 상당한 양의 신호 발생을 결과할 수 있다. 실시간 가수분해 프로브 반응의 효용은 U.S. Patent No. 5,538,848과 7,205,105에서 기술된다.
6. 염료-프라이머 기초된 시스템
실시간 PCR에 이용가능한 다수의 염료-표지된 프라이머 기초된 시스템이 존재한다. 이들은 단순한 헤어핀 프라이머 시스템에서부터, 헤어핀 프로브의 스템-루프 부분이 비-증폭가능 링커를 통하여 특이적인 PCR 프라이머에 부착된 더욱 복잡한 프라이머 구조까지 복잡성(complexity)에서 변동한다. 이들 방법은 프로브-기초된 분석 시스템에 필수적인 추가의 개재성 표지된 프로브를 요구하지 않고, 또한 DNA 결합 염료에서 가능하지 않는 다중화를 가능하게 하는 이점을 갖는다. 하지만, 이들 각 방법의 성공은 프라이머 서열의 신중한 설계에 좌우된다.
헤어핀 프라이머는 표적 DNA에 상보성인 서열에 의해 분리되는 반전된 반복 서열(inverted repeat sequence)을 보유한다(Nazarenko et al., 1997; Nazarenko et al., 2002; U.S. Patent 5,866,336). 이들 반복 서열은 어닐링되어 헤어핀 구조를 형성하고, 따라서 5'-말단에서 형광단이 3'-말단에서 소광물질에 매우 근접하고, 형광 신호를 소멸시킨다. 이러한 헤어핀 프라이머는 헤어핀 구조를 유지하기 보다는 표적 DNA에 우선적으로 결합하도록 설계된다. PCR 반응이 진행됨에 따라, 프라이머는 축적되는 PCR 산물에 어닐링되고, 형광단과 소광물질은 물리적으로 분리되며, 형광 수준이 증가한다.
Invitrogen의 LUX™(Light Upon eXtension) 프라이머는 3' 말단 인근에서 내부 서열에 상보적이고 3' 말단 인근에 부착된 형광단의 위치와 부분적으로 겹치는 프라이머의 5' 말단에서 짧은 4-6 뉴클레오티드 확장을 보유하는 형광원성(fluorogenic) 헤어핀 프라이머이다(Chen et al., 2004; Bustin, 2002). 이들 상보성 서열 사이에 염기쌍은 프라이머의 3' 말단에서 매우 근접하게 위치하는 리포터 염료를 소멸시키는 이중-가닥 스템을 형성한다. PCR 동안, LUX™ 프라이머는 새로운 DNA 가닥 내로 통합되고, 이후 새로운 상보성 두 번째 가닥이 산출될 때 선형화된다. 이러한 구조 변화는 형광 신호에서 최대 10배 증가를 결과한다. 이들 프라이머는 설계하기 어렵고, 프로브가 PCR 산물에 우선적으로 어닐링하도록 담보하기 위하여 2차 구조가 신중하게 분석되어야 한다. 맞춤 LUX™ 프라이머를 위한 설계와 검증 서비스는 Invitrogen으로부터 제공될 수 있다.
더욱 최근에, 헤어핀 프로브는 PCR 프라이머의 일부가 되고 있다(Bustin, 2002). 이러한 접근법에서, 프라이머가 확장되면, 헤어핀 내에서 서열이 새로 합성된 PCR 산물에 어닐링되고, 헤어핀을 파괴하고, 형광단과 소광물질을 분리시킨다.
Scorpion프라이머는 이중기능성(bifunctional) 분자인데, 여기서 상류 헤어핀 프로브 서열이 하류 프라이머 서열에 공유 결합된다(U.S. Published Application No. 2001/6270967; U.S. Published Application No. 2005/0164219; Whitcombe et al., 1999). 이러한 프로브는 5' 말단에 형광단과 3' 말단에 소광물질을 보유한다. 표적의 부재에서, 프로브는 6-7개 염기 스템을 형성하고, 형광단과 소광물질을 근접시키고, 소광물질이 형광단에 의해 방출된 형광을 흡수할 수 있도록 한다. scorpion 프로브 섹션의 루프 부분은 상기 프라이머 서열의 3' 말단으로부터 하류에 11개 염기 내에서 표적 서열의 일부분에 상보적인 서열로 구성된다. 표적의 존재에서, 프로브는 첫 번째 PCR 주기에서 합성된 표적 영역에 부착된다. 변성과 어닐링의 두 번째 주기 이후에, 프로브와 표적은 혼성화된다. 헤어핀 루프의 변성은 생산된 새로운 DNA 이중나선보다 더욱 적은 에너지를 필요로 한다. 따라서, scorpion 프로브 루프 서열은 새로 합성된 PCR 산물의 일부분에 혼성화되고, 소광물질로부터 형광단의 분리와 방출된 형광의 증가를 유도한다.
모든 염료-프라이머 기초된 방법에서처럼, Scorpion 프라이머의 설계는 이차 반응이 정확한 탐침 현상(probing event)과 경쟁하지 않도록 담보하기 위하여 이차 구조와 프라이머 서열에 대한 엄밀한 설계 고려사항을 따른다. 이러한 프라이머 쌍은 대략 100-200개 bp의 앰플리콘을 제공하도록 설계된다. 이상적으로, 프라이머는 가능한 작은 이차 구조를 가지고, 헤어핀 형성과 이차 구조에 대하여 조사된다. 프라이머는 프로브 요소와 혼성화되지 않도록 설계되어야 하는데, 그 이유는 이러한 혼성화가 선형화(linearization)와 비-특이적인 형광 방출의 증가를 유발하기 때문이다. 이들 두 프라이머의 Tm은 유사하고, 스템 Tm은 프로브 Tm보다 5-10℃ 높다. 프로브 서열은 17-27개 염기 길이이고, 프로브 표적은 scorpion의 3' 말단으로부터 11개 염기 또는 그 이하이다. 스템 서열은 6-7개 염기 길이이고, 일차적으로, 시토신(cytosine)과 구아닌(guanine)을 보유한다. 5' 스템 서열은 구아닌이 형광단을 소멸시키기 때문에, 시토신으로 시작된다. 여러 올리고뉴클레오티드 설계 소프트웨어 패키지는 Scorpion 프라이머 설계를 위한 알고리즘(algorithm)을 보유하고, 맞춤 설계 서비스는 일부 올리고뉴클레오티드 공급업체로부터 제공될 수 있다.
Plexor™ 시스템(Promega)은 프로브를 설계할 필요가 없고 하나의 PCR 프라이머만 표지되는 이점을 갖는 실시간 PCR 기술이다(U.S. Patent 5,432,272; U.S. Published Application No. 2000/6140496; U.S. Published Application No. 2003/6617106). 이러한 기술은 2개의 변형된 뉴클레오티드, 이소구아닌(isoguanine)(iso-dG)과 5'-메틸이소시토신(methylisocytosine)(iso-dC) 사이에 특이적인 상호작용을 이용한다(Sherrill et al., 2004; Johnson et al., 2004; Moser and Prudent, 2003). 이러한 기술의 주요한 특징은 이들 이소-염기(iso-base)가 상보성 이소-염기와만 염기쌍을 이루고, DNA 중합효소가 상응하는 상보성 이소-염기가 기존 서열 내에 존재할 때에만 이소-염기를 통합한다는 점이다. 5'-말단 뉴클레오티드로서 형광-표지된 iso-dC 잔기로 하나의 PCR 프라이머가 합성된다. 증폭이 진행됨에 따라, 표지된 프라이머는 어닐링되고 확장되며, PCR 산물에 통합되기 시작한다. PCR 마스트 혼합물(master mix) 내에서 유리 뉴클레오티드로서 가용한 소광물질-표지된 iso-dGTP(dabsyl-iso-dGTP)는 iso-dC와 특이적으로 염기쌍을 이루고, 상보성 PCR 가닥에 통합되기 시작하고, 형광 신호를 소멸시킨다. Plexor 시스템에 대한 프라이머 설계는 일부 다른 dye-프라이머 시스템에 비하여 상대적으로 단순하고 통상적으로, 전형적인 표적-특이적 프라이머 설계 고려사항을 따른다. Promega로부터 입수가능한 웹-기초된(web-based) Plexor 프라이머 설계 소프트웨어는 적절한 염료와 소광물질 조합을 선택하는데 도움을 주고, 이소-염기 보유 프라이머를 제공하도록 인가를 받은 올리고뉴클레오티드 공급업체에 연결고리를 제공한다.
D. 전형적인 화학물질
앞서 언급된 바와 같이, 실시간 PCR에 현재 이용되는 여러 상업적으로 가용한 핵산 검출 화학물질이 존재한다. 하지만, 현재의 실시간 PCR 기술은 다중화 가능성이 대략 1-6중(plex) 반응으로 제한된다. 본 발명의 방법과 시스템은 실시간 PCR에는 이용되지 않았던 검출 화학물질을 비롯한 상업적으로 가용한 핵산 검출 화학을 이용한 훨씬 높은 실시간 PCR 다중화를 달성할 수 있다. 본 발명의 배경에서 이들 검출 화학물질 중에서 일부의 이용을 기술하는 구체예가 하기에 제시된다.
1. 분자 비콘
헤어핀 프로브로 알려져 있는 분자 비콘은 상보성 표적 서열의 존재에서 개방되고 혼성화되는 스템-루프 구조(stem-loop structure)로서 기술될 수 있고 전형적으로, 형광에서 증가를 유도하지만 이의 부재에서 스템-루프 구조를 형성하고 감소된 형광을 유도한다(U.S. Patent 5,925,517; U.S. Published Application No. 2006/103476). 본 발명의 한 구체예에 따른 프로브는 분석 조건 하에 표적의 부재에서 서로 상호작용하여 스템 이중나선을 형성하는, 친화성 쌍 또는 팔의 구성원이 측면에서 접하는 핵산 표적 상보 서열을 보유하는 표지된 프로브이다. 미리 선택된 표적 서열에 프로브의 혼성화는 프로브에서 형태 변화를 유도하고, “팔(arm)”을 강제로 이격시키고, 스템 이중나선을 제거한다. 본 발명에 따른 프로브의 구체예는 상호작용 라벨을 이용하는데, 여기서 상기 형태 변화가 검출될 수 있고, 또는 특수하게 제한된 대립유전자-판별(allele-discriminating) 구조를 이용하거나, 또는 둘 모두를 이용한다. 신호 수준에서 특징적인 변화는 라벨 모이어티(label moiety)가 닫힌 위치(closed position)에 존재하는 프로브로 인하여 근접하거나, 또는 열린 위치(open position)에 존재하는 프로브로 인하여 분리되는 지의 여부에 좌우된다. 이러한 구체예에 따라, 분자 비콘은 또한, 스펙트럼에 의해 또는 달리 구별가능한 입자에 결합되고, 상기 입자는 통상적인 방법을 이용하여 기존에 가능했던 것보다 더욱 높은 수준의 다중화를 제공하는데, 여기서 염료는 포획 프로브에 부착된 입자의 특성을 구별하기 보다는 염료의 색깔을 구별함으로써 헤어핀 프로브에 부착된다.
도 5와 6에서는 본 발명의 한 구체예가 소광 분자로부터 형광색소를 분리하여 입자의 표면 상에서 검출가능 형광을 가능하게 하는 방법을 실증한다. 도 5에서, 소광 분자와 형광색소에 결합된 헤어핀 프로브는 용해 상태에서 상동하다. 소광 분자(200)는 프로브가 헤어핀 형성 동안 존재할 때, 형광색소 분자(202)에 의해 방출되는 형광의 양을 제한한다. 헤어핀 형성에서 올리고뉴클레오티드 프로브는 도 5에서 205로서 표시된다. 헤어핀 분자의 내부 루프가 표적 앰플리콘에 혼성화될 때, 형광색소와 소광 분자는 도 5와 6에서 도시된 바와 같이 분리되고, 구슬(40)의 표면 상에서 검출가능 형광을 가능하게 한다. 이러한 형광을 영상하기 위하여, 구슬(40)은 자성 요소(264)를 어레이에 근접하게 이동시키고 영상 시스템, 예를 들면, 도 1-2와 9에 도시된 영상 시스템으로 형광을 검출함으로써 평면 어레이(planar array)로 끌어당겨진다.
2. 혼성화 프로브
실시간 PCR에 이용되는 혼성화 프로브는 때때로, FRET 프로브, LightCycler프로브, 또는 이중 FRET 프로브로 지칭된다(Espy et al., 2006). 혼성화 프로브는 FRET가 직접적으로 측정되는 방식으로 이용된다(Wilhelm and Pingoud, 2003). 2개의 프로브는 각각, 형광 에너지 이동 쌍의 개별 구성원으로 표지되고, 따라서 표적 DNA 서열의 인접 영역에 혼성화 이후에, 여기 에너지(excitation energy)가 공여자에서 수용자로 이동하고 수용자에 의한 추후 방출이 리포터 신호로서 기록될 수 있다(Wittwer et al., 1997). 이들 2개의 프로브는 상류 프로브가 3' 말단에서 형광 표지되고 하류 프로브가 5' 말단에서 표지되도록 표적 서열에 어닐링된다. 하류 프로브의 3' 말단은 전형적으로, 인산화(phosphorylation)에 의해, 또는 PCR 동안 프로브의 확장을 예방하는 일부 다른 수단에 의해 차단된다. 상류 프로브의 3' 말단에 결합된 염료는 상기 프로브의 확장을 예방하는데 충분하다.
이러한 구체예에서, 2개의 혼성화 프로브 중에서 하나는 구별가능한 입자(가령, 인코딩된 구슬)에 결합될 수 있다. 이러한 경우에, 입자에 결합된 포획 프로브는 목적하는 표적 핵산 서열에 상보적이고, 결합되지 않은 프로브는 상기 표적 서열을 따라서 인접 영역에 혼성화될 것이다. 실시간 PCR 반응의 배경에서, 표적 서열은 앰플리콘이다. 공여자 또는 수용자 형광단은 입자에 부착되는 올리고뉴클레오티드 서열에 부착될 수 있다.
전형적인 수용자 형광단에는 시아닌 염료(Cy3과 Cy5), 6-카르복시-4,7,2',7'-테트라클로로플루오레세인(TET), 6-카르복시-N,N,N',N'-테트라메틸로다민(TAMRA), 그리고 6-카르복시로다민 X(ROX)가 포함된다. 공여자 형광단은 일반적으로, 6-카르복시플루오레세인(FAM)이다(Wilhelm and Pingoud, 2003). 표적 서열의 유전자형확인(genotyping)은 리포터 프로브를 그들의 상응하는 서열에 매치함으로써 달성된다.
도 7에서는 본 발명의 배경에서 변형된 FRET(형광 공명 에너지 이동, Fluorescence Resonance Energy Transfer) 혼성화 프로브를 도시한다. 공여자 형광단(210)은 상자성 마이크로스피어(40)의 표면 상에 고정되는 프로브에 부착된다. 각 PCR 주기의 검출 단계에 도달한 이후에, 용액의 온도는 공여자-표지된 프로브와 수용자-표지된 프로브 둘 모두의 표적 서열에 대한 혼성화에 기여할 것이다. 공여자(210)와 수용자(212) 쌍의 매우 근접함은 형광 공명 에너지 이동을 가능하게 할 것이다. 이는 수용자 분자(212)가 공여자(210)와 상이한 파장에서 광을 방출하도록 함으로서 구슬(40)의 표면 인근에서만 형광을 발생시킬 것이다.
따라서, FRET 혼성화 프로브를 이용하여 샘플 내에서 복수의 핵산 표적의 다중화된 실시간 증폭과 검출을 위한 방법을 수행하는 한 구체예에서, 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브 세트를 포함하는 샘플이 챔버 내에서 합쳐지는데, 각 프로브 세트는 형광 에너지 이동 쌍의 첫 번째 구성원으로 표지되고 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 프로브, 여기서 첫 번째 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; 그리고 형광 에너지 이동 쌍의 두 번째 구성원을 보유하는 두 번째 프로브를 포함한다. 이후, 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위한 증폭 주기가 수행된다. 증폭 산물은 프로브 세트에 혼성화된다. 자기장을 챔버의 표면에 적용함으로써, 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물은 챔버의 표면으로 끌어당겨지는데, 여기서 영상 시스템, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 영상 시스템이 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 증폭 산물에 혼성화된 형광 에너지 이동 쌍으로부터 신호를 검출한다. 이후, 자기장은 추가의 증폭 주기를 수행하기 위하여 챔버의 표면으로부터 제거된다. 이러한 증폭과 검출은 반응에 관한 실시간 정량적 데이터를 획득하기 위하여 원하는 횟수로 반복될 수 있다. 형광 에너지 이동 쌍으로부터 신호는 이용되는 리포터 분자에 따라, 형광의 증가 또는 형광의 감소이다.
이러한 2 프로브 시스템은 또한, FRET 쌍 없이 이용될 수도 있다. 이러한 구체예에서, 입자에 결합되지 않는 프로브만 표지되고, 따라서 표적 서열에 대한 양쪽 프로브의 혼성화는 2개의 프로브 중에서 하나의 프로브에서 라벨에 의해 검출될 수 있다. 가령, 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브 세트를 포함하는 샘플이 챔버 내에서 합쳐지는데, 각 프로브 세트는 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 프로브, 여기서 첫 번째 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; 그리고 라벨을 보유하는 두 번째 프로브를 포함한다. 이후, 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위한 증폭 주기가 수행된다. 증폭 산물은 프로브 세트에 혼성화되고, 자기장이 챔버의 표면에 적용됨으로써 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물이 챔버의 표면으로 끌어당겨진다. 비-고정화된 표지된 프로브 역시 챔버의 표면으로 끌어당겨지는데, 그 이유는 상기 프로브가 증폭 산물 상에서 상보성 서열에 혼성화되기 때문이다. 이후, 영상 시스템, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 영상 시스템이 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 증폭 산물에 혼성화된 두 번째 프로브로부터 신호를 검출하는데 이용된다. 그 다음, 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장이 제거된다. 이러한 증폭과 검출은 반응에 관한 실시간 정량적 데이터를 획득하기 위하여 원하는 횟수로 반복될 수 있다.
프로브(가령, 프로브 세트의 세 번째 프로브, 네 번째 프로브 등)에 부착되는 추가의 자유 부동 FRET 염료 또는 다른 리포터 분자가 특정 구체예에서 포함될 수 있는데, 여기서 프로브의 하나 이상의 쌍은 프로브 세트에서 하나의 프로브가 입자 또는 자성 인코딩된 입자에 결합될 만큼 긴 임의의 시점에서 표적 핵산 서열에 혼성화될 수 있다. 이들 추가의 프로브는 추가의 구별가능 특징, 또는 표적에 부착되는 추가의 리포터 분자를 부가함으로써 상기 방법의 민감성(sensitivity), 특이성(specificity), 그리고 다중화 능력(multiplexing ability)을 더욱 증가시킬 수 있다. 가령, 자성 인코딩된 입자에 결합된 프로브를 보유함으로써, 상기 프로브가 자신보다 긴 표적에 혼성화되고, 따라서 다른 리포터 분자로 변형된 다른 프로브가 자성 인코딩된 입자에 결합된 프로브의 5' 또는 3'인 표적 서열의 영역에 혼성화된다.
추가적인 반응물을 이용하여 본 명세서에 기술된 임의의 구체예의 효율을 향상시킬 수 있다. 이들 반응물은 당업자에게 공지된 PCR 첨가제(additive)를 이용함으로써 본 명세서에 기술된 방법을 향상시킬 수 있다. 차단제(blocking agent) 또는 세정제(detergent) 또는 계면활성제(surfactant)로서 기능하는 BSA 또는 다른 분자 역시 본 명세서에 기술된 방법을 향상시킬 수 있다. BSA, 또는 당업자에게 공지된 다른 유사한 반응물은 반응 챔버의 표면에 대한 DNA와 다른 반응물의 인력(attraction)을 감소시킴으로써 유리 또는 석영 챔버에서 수행되는 PCR 반응을 향상시킬 수 있다. 혼성화 시간을 향상시키는 분자 군집 효과(molecular crowding effect)를 나타내는 다른 첨가제가 이용될 수 있다. 혼성화 시간을 향상시키는 당업자에게 공지된 다른 분자, 반응물, 화학물질, 용액 역시 이용될 수 있다. 이의 실례는 핵산 결합 단백질 또는 소홈 접합제(minor groove binder)이다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 리포터 염료에 변형, 예를 들면, 황산염(sulfate) 기를 추가하는 공지된 방법은 염료 분자의 친수성(hydrophilicity)을 변화시킬 것이고, 이는 인코딩된 자성 입자에 더욱 적은 비-특이적 결합을 이끌어 낼 것이다.
3. 2개의 프로브 경쟁
다른 구체예에서는 표적 핵산 서열 마다 2개의 프로브를 이용한다. 하나의 프로브는 구슬에 부착되고 형광단으로 표지될 수 있다. FRET가 발생하도록 하기 위하여 소광물질 또는 형광단 쌍을 보유하는 상보성 “자유 부동” 프로브 역시 추가된다. 이러한 경우에, 구슬 상에서 프로브는 3' 말단에서 형광단을 보유하는 반면, 5' 말단에서 구슬에 부착된다. 이러한 자유 부동 프로브는 형광단의 역보체(reverse compliment)로서 설계되고 5' 말단에 소광 모이어티(quenching moiety)를 보유함으로 구슬 상에서 형광단과 연관된 신호를 소멸시킬 수 있고, 따라서 형광단에 매우 근접하고, 프로브에 혼성화 이후에 신호에서 감소를 달성한다. 이들 프로브는 또한, PCR 증폭 또는 일부 다른 증폭 현상 동안 존재할 것이다. PCR 주기의 표적 검출 단계에서, 자유 부동 프로브는 구슬에 부착된 프로브를 이탈하고 표적 서열에 혼성화될 것이다. 구슬에 부착된 프로브는 자유 부동 프로브의 표적 서열과의 결합과 용융 온도에 비하여, 자유 부동 프로브와 덜 우호적인 결합과 더욱 낮은 용융 온도를 보이도록 설계될 것이다. 표적 서열이 농도에서 증가하고, PCR 반응이 지속됨에 따라, 구슬과 연관된 신호에서 현저한 증가가 관찰된다. 신호에서 측정가능 증가의 동일한 효과는 표적 서열의 자유 부동 프로브와의 결합 동역학에 비하여, 표적 서열의 우호적인 결합을 보이는 구슬에 부착되는 프로브를 설계하는 유사한 방법에 의해 달성될 수 있다. 결합 동역학에서 차이는 서로 길이가 상이한 자유 부동 프로브와 고정된 프로브를 설계하거나, 또는 다른 프로브 상의 서열에 대하여 미스매치(mismatch)이지만 표적 서열에 대하여 미스매치가 아닌, 프로브 중의 하나에서 염기 또는 하나 이상의 염기를 삽입함으로써 획득될 수 있다.
4. 통합된 소광 분자
도 8에서는 뉴클레오티드를 소광 분자에 미리 결합시킴으로써 소광 분자가 새로 합성된 DNA 가닥 내로 통합되는 실례를 실증한다. 이러한 미리 결합된 뉴클레오티드/소광물질은 PCR 반응 혼합물에 가용하고, 증폭 산물 내로 통합될 것이다. 구슬(40)의 표면에 부착된 형광색소로 표지된 상보성 프로브는 더욱 많은 표적 올리고뉴클레오티드 서열이 생산됨에 따라 형광 신호가 감소하는 시스템을 결과할 것이다. 가령, 복수의 핵산 표적; 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍; dNTP의 혼합물, 여기서 dNTP의 일부가 소광물질 분자에 결합되고; 그리고, 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 형광 표지된 프로브를 포함하는 샘플이 챔버 내에서 합쳐질 수 있는데, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인된다. 증폭 주기는 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 수행된다. 증폭 반응 동안 dNTP의 일부가 소광물질 분자에 결합하기 때문에, 증폭 산물은 이들 소광물질 분자를 통합할 것이다. 증폭 산물은 이후, 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화되고, 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장이 챔버의 표면에 적용된다. 이후, 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 프로브로부터 신호가 검출된다. 증폭 산물이 소광물질 분자를 통합하기 때문에, 프로브로부터 형광 신호는 더욱 많은 증폭 산물이 생산됨에 따라 감소한다. 자기장은 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 제거된다. 이러한 증폭과 검출은 반응에 관한 실시간 정량적 데이터를 획득하기 위하여 원하는 횟수로 반복될 수 있다.
5. 직접적인 혼성화
증폭된 서열 또는 앰플리콘을 형성하는데 이용되는 프라이머가 형광색소(가령, Cy3) 또는 검출을 가능하게 하는 다른 물질로 표지되는 PCR이 수행된다. 표지화(labeling)는 예로써, 프라이머의 5-프라임 말단(prime end)에서 수행된다. 표지된 프라이머를 이용하면, 표지된 앰플리콘의 형성이 가능하다. 표지된 증폭된 핵산 서열은 구별가능 입자에 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화되고 상기 프로브에 의해 포획될 수 있다. 현재의 상업적 실시간 PCR 방법에는 직접적인 혼성화 방법이 이용되지 않고 있다.
직접적인 혼성화 접근법을 이용하는 구체예는 도 11에 도시된다. 도 11에 도시된 바와 같이, 프라이머 쌍 중에서 한쪽 프라이머는 5' 말단에서 리포터 분자, 예를 들면, 형광단 Cy3으로 표지된다. 이러한 프라이머 쌍은 PCR에 존재하는 샘플 DNA로부터 표적 서열을 증폭하여 표지된 앰플리콘을 형성한다. PCR에는 앰플리콘의 표지된 가닥에 상보적인 프로브에 결합된 자성 인코딩된 구슬이 또한 존재한다. 고정된 프로브의 3' 말단은 상기 프로브의 중합효소 확장을 예방하기 위하여 차단된다(가령, 인산염 기 또는 3' 반전된 dT로). 원하는 횟수의 PCR 주기후, 자성 인코딩된 구슬을 검출을 위한 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 챔버에 자기장이 적용된다. 이러한 단계는 표지된 앰플리콘이 그들의 상보성 프로브에 혼성화되고, 따라서 챔버의 표면으로 끌어당겨지도록 하기 위하여 혼성화 조건 하에 수행된다. 표지된 앰플리콘의 존재는 챔버의 표면에서 라벨의 검출(가령, Cy3 라벨로부터 형광 신호)에 의해 검출된다. 도 11에서 단일 반응을 예시하긴 하지만, 상기 방법은 다중 PCR 반응에도 적용될 수 있다. 인코딩된 구슬, 앰플리콘 상에서 라벨, 그리고 이들의 조합은 동일한 반응에서 많은 수의 상이한 앰플리콘을 구별할 수 있다.
6. 표식된 프라이머
다른 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: 복수의 핵산 표적; 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 여기서 각 프라이머 쌍은 표적 특이적인 서열, 표적 특이적인 서열의 5' 태그 서열(tag sequence), 그리고 표적 특이적인 서열과 태그 서열 사이에 차단제(blocker)를 포함하는 첫 번째 프라이머와 표적 특이적인 서열을 포함하는 두 번째 프라이머를 포함하고; 표지물; 그리고, 복수의 프라이머 쌍의 태그 서열에 상보적인 복수의 프로브(anti-tag)를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치고, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인된다. 증폭 주기는 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 표식되고 표지된 증폭 산물을 형성하기 위하여 수행된다. 이들 표식되고 표지된 증폭 산물은 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화되고, 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 표식되고 표지된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 챔버의 표면에 자기장이 적용된다. 이후, 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표식되고 표지된 증폭 산물로부터 신호는 예로써, 영상 시스템, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 영상 시스템을 이용하여 검출된다. 자기장은 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 제거된다. 이러한 증폭과 검출은 반응에 관한 실시간 정량적 데이터를 획득하기 위하여 원하는 횟수로 반복될 수 있다. 특정 측면에서, 표지물은 프라이머 쌍 중에서 두 번째 프라이머에 부착된 리포터 분자이다. 다른 측면에서, 표지물은 삽입 염료(intercalating dye)이다.
앞서 언급된 바와 같이, 상보성 태그 서열(즉, 태그(tag)와 안티-태그(anti-tag))이 프라이머와 프로브에 이용될 수 있다. 프라이머, 프로브 서열, 표적 서열 등에 결합되는 태그 보체(tag complement)에 대한 특이적인 혼성화에 이용될 수 있는 고형 서포트(solid support)에 부착되는 올리고뉴클레오티드 태그의 이용을 필요로 하는 다수의 접근법이 개발되었다. 비-혼성화 태그(non-hybridizing tag)와 안티-태그 서열의 적절한 선택은 엄밀한 비-교차 혼성화 행태(non-cross hybridizing behavior)를 요하는 분석, 특히, 고도 병렬 혼성화 환경에서 분석에 유용하다.
핵산 하이브리드(nucleic acid hybrid)를 형성하는 특정의 열역학 특성(thermodynamic property)이 태그와 안티-태그 서열의 설계에서 고려된다. Tm(핵산 이중나선 중에서 50%가 분리되는 온도)으로 알려져 있는, 올리고뉴클레오티드가 그들의 상보성 서열과 이중나선을 형성하는 온도는 표준 쌍(canonical pair) A-T와 G-C의 수소 결합 에너지(hydrogen bonding energy)(GC 또는 염기 조성에서 반영됨), 누적되는 유리 에너지(free energy), 그리고 정도가 덜하긴 하지만, 주위 분자와의 상호작용(nearest neighbor interaction)을 비롯한 다수의 서열 의존성 특성에 따라 달라진다. 이들 에너지는 혼성화 분석에 전형적으로 이용되는 올리고뉴클레오티드 간에 폭넓게 변한다. 가령, 표준 조건 하에, 24개의 뉴클레오티드로 구성되는 2개의 프로브 서열(한 서열은 40% GC 함량을 보유하고, 다른 서열은 60% GC 함량을 보유한다)의 상보성 표적과의 혼성화는 이론적으로, 용융 온도에서 10℃ 차이를 갖는다(Mueller et al., 1993). 이들 하이브리드가 한 세트의 모든 올리고뉴클레오티드 서열의 정확한 혼성화에 최적합되지 않은 단일 혼성화 온도를 보유하는 혼성화 조건 하에 형성될 때, 혼성화에서 문제가 발생한다. 측정가능한 미스매치 불안정성(mismatch stability)을 갖는 이중나선을 형성하는 비-상보성 프로브의 미스매치 혼성화가 발생할 수 있다(Santalucia et al., 1999). 특정 세트의 올리고뉴클레오티드에서 이중나선의 미스매칭(mismatching)은 미스매치가 특정 세트의 최소의 안정한 정확한 이중나선보다 더욱 높은 Tm을 유발하는 이중나선 안정성(duplex stability)에서 감소를 결과하는 혼성화 조건 하에 발생할 수 있다. 가령, 혼성화가 AT-풍부 완전 매치 이중나선 서열에 유리한 조건 하에 수행되면, 정확하게 형성된 AT-풍부 이중나선에서보다 여전히 높은 용융 온도를 갖는 미스매치 염기를 보유하는 GC-풍부 이중나선 서열을 혼성화하는 가능성이 존재한다. 이런 이유로, 다중화된 혼성화 반응에 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열 집단의 설계에는 설계된 올리고뉴클레오티드 세트 내에서 교차 혼성화 행태를 감소 또는 배제하는 올리고뉴클레오티드와 이중나선 형성의 열역학 특성에 관한 고려가 포함되어야 한다.
다중화된 혼성화 검사에서 이용을 위한 태그와 안티-태그 서열을 선택하기 위한 다수의 상이한 접근법이 존재한다. 주소매김 어레이(addressable array)에서 집 코드(zip code) 또는 태그로서 이용될 수 있는 서열의 선택은 특허 문헌에서 Brenner 등에 의한 접근법에서 기술되었다(U.S. Patent 5,654,413). Chetverin 등(WO 93/17126; U.S. Patent No. 6,103,463과 6,322,971)은 핵산을 분류하고 조사하기 위한 분할된 이원 올리고뉴클레오티드 어레이를 개시한다. 이들 어레이는 인접한 가변 뉴클레오티드 서열(variable nucleotide sequence)에 부착된 불변 뉴클레오티드 서열(constant nucleotide sequence)을 보유하는데, 이들 둘 모두 공유 연결 모이어티(covalent linking moiety)에 의해 고형 서포트에 결합된다. 아단위(subuni)에 기초된 태그의 설계에 이용되는 파라미터(parameter)는 Barany et al. (WO 9731256)에서 언급된다. 다중 염기서열분석 방법(multiplex sequencing method)은 U.S. Patent 4,942,124에서 기술되었다. 상기 방법은 태그 서열에서 서로 상이한 최소한 2개의 벡터(vector)를 이용한다.
U.S. Patent 7,226,737에서는 210개의 비-교차 혼성화 태그와 안티-태그를 기술한다. U.S. Published Application No. 2005/0191625에서는 최소의 교차 혼성화로 상보성 서열에 정확하게 혼성화되는 입증된 능력을 갖는 1168개 태그 서열 집단을 개시한다. U.S. Application No. 60/984,982에서는 핵산 서열의 증폭에서 태그, 안티-태그, 그리고 포획 복합체(capture complex)의 이용을 기술한다.
올리고뉴클레오티드 태그 또는 안티-태그 서열의 집단은 직접적인 화학적 합성(direct chemical synthesis), 화학적 결합(chemical coupling), 결찰(ligation), 증폭(amplification) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 여러 상이한 방식으로 프라이머 또는 다른 폴리뉴클레오티드 서열의 집단에 공동(conjugation)될 수 있다. 표적 특이적인 프라이머 서열로 합성되는 서열 태그는 예로써, PCR 증폭에서 표적 상에서 프라이머의 효소 확장에 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 태그 또는 안티-태그 서열의 집단은 예로써, 고형 서포트의 표면 상에서 표면 화학에 의해 고형 서포트에 공동될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 증폭 반응에 이용되는 프라이머 쌍 중에서 한쪽 프라이머는 태그 서열을 포함한다. 태그 서열을 포함하는 프라이머의 최초 확장 이후에, 표식된 확장 산물은 프라이머 쌍 중에서 다른 프라이머에 대한 주형으로서 기능할 수 있다. 하지만, 이런 주형 상에서 확장이 태그 영역을 통하여 진행되는 것은 바람직하지 않은데, 그 이유는 이것이 태그 서열과 프로브의 안티-태그 서열 간의 혼성화를 간섭할 수 있기 때문이다. 따라서 차단제가 표적 특이적인 서열과 프라이머의 태그 서열 사이에 배치될 수 있다. 차단제 모이어티는 중합효소가 태그 서열 영역 내로 확장하는 것을 예방하는데, 이는 태그 서열이 증폭 동안 단일-가닥 상태로 유지되고, 따라서 포획 복합체 내에서 상보성 안티-태그 서열에 자유롭게 혼성화될 수 있도록 한다.
차단제 모이어티는 첫 번째 뉴클레오티드 서열과 두 번째 뉴클레오티드 서열 사이에 연결(가령, 공유 연결)될 때, 첫 번째 또는 두 번째 뉴클레오티드 서열의 확장을 저해(바람직하게는, 예방)하는데 효과적이지만, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열 둘 모두를 저해하지는 않는 임의의 모이어티를 지칭한다. 차단제 모이어티로서 이용될 수 있는 다수의 분자가 존재한다. 차단제 모이어티의 무-제한적 실례에는 C6-20 직쇄 알킬렌(straight chain alkylene)과 iSp18(18-원자 헥사-에틸렌글리콜)이 포함된다. 차단제 모이어티는 예로써, 최소한 하나의 데옥시 리보푸라노실 나프탈렌(deoxy ribofuranosyl naphthalene) 또는 리보푸라노실 나프탈렌(ribofuranosyl naphthalene) 모이어티를 보유하는데, 이는 3'-푸라노실 연쇄(furanosyl linkage) 또는 바람직하게는, 2'-푸라노실 연쇄를 통하여 인접 뉴클레오티드에 연결된다. 차단제 모이어티는 표적 특이적인 서열과 반대 방향으로 존재하는 올리고뉴클레오티드 서열일 수 있다. 따라서 본 발명의 특정 측면에서, 프라이머의 태그 서열은 태그와 차단제 둘 모두인데, 여기서 표적 특이적인 서열은 5'에서 3' 방향으로 존재하는 반면, 태그 서열은 3'에서 5' 방향으로 존재한다. 이러한 방향에서, 태그 서열은 중합효소에 의해 확장되지 않는다. 다양한 차단제 모이어티와 이들의 용도는 U.S. Patent 5,525,494에서 기술된다.
차단제 모이어티가 이용되지 않으면, 태그 서열과 안티-태그 서열 간의 혼성화를 가능하게 하는 단계가 수행될 수 있다. 가령, 안티-표식된 프라이머는 증폭 동안 표식되고 차단된 프라이머에 대하여 치환될 수 있다. 이런 경우에, 중합효소는 안티-태그 서열 영역 내로 확장되고, 상보성 태그 서열을 산출한다. 이후, 안티-태그/태그 영역을 보유하는 이중-가닥 증폭 산물은 고형 기질(solid substrate)에 결합된 안티-태그에 대한 혼성화에 앞서, 변성된다.
7. 입자에 부착된 프라이머
본 발명의 특정 구체예에서, 자성 반응성 입자의 표면에 자체적으로 부착되는 프라이머가 이용될 수 있다. 이런 구체예에서, 구슬에 부착된 혼성화 프로브는 앰플리콘을 포획할 필요가 없는데, 그 이유는 앰플리콘이 구슬 상에서 합성되기 때문이다. 전형적으로, 각 프라이머 쌍 중에서 한쪽 프라이머만 입자에 부착된다. 프라이머 쌍 중에서 다른 프라이머는 “자유 부동”된다. 또한, 이들 프라이머는 예로써, 분자 비콘으로서 기능하는 프라이머로 확장 이후에, 이들이 스펙트럼에 의해 구별될 수 있도록 하는 특성을 나타내는데, 여기서 신호에서 변화는 형광단과 소광물질의 근접을 변화시키는 프라이머의 확장 이후에 관찰된다. 다른 검출 화학, 예를 들면, 자유 부동 프라이머의 표지화, 표지된 dNTP의 앰플리콘 내로 통합, 또는 DNA 삽입 인자의 이용 역시 이들 구체예에서 활용될 수 있다.
8. 가수분해 프로브
표적 핵산 검출의 다른 방법은 일부 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다. 이러한 구체예에서, 형광단과 소광물질 쌍, 또는 FRET 쌍은 입자(가령, 구슬)에 부착되는 단일 프로브의 변형이다. 이들 형광색소 중에서 하나가 자성 구슬의 표면에 부착되고, 다른 형광색소가 입자의 표면에 고정되는 프로브에 부착될 수도 있는데, 이들 양쪽 형광색소는 밀접한 공간적 근접(spatial proximity)으로 인하여 서로 상호작용한다. 프로브에 대한 표적 서열의 혼성화 이후에, 상기 프로브의 하류에 다른 프라이머가 배치되고, 따라서 프라이머의 확장 이후에, 소광 모이어티(또는 형광 모이어티)가 제거되고, 신호에서 측정가능한 변화가 산출된다.
9. SimpleProbes
다른 구체예는 SimpleProbes또는 SimpleProbes에 동등한 프로브의 이용을 통합하는데, 이들 프로브는 실시간으로 데이터를 관찰하기 위한 목적으로 구슬에 부착된다. 이들 프로브는 U.S. Patent No. 6,635,427에서 기술된다. SimpleProbes는 아미노 변형된 C12 링커 또는 일부 다른 링커를 이용하여, 또는 다른 공유 결합 상호작용에 의해 초상자성 마이크로스피어에 부착될 수 있다. 이들 프로브를 구슬로 유인함으로써, 구슬이 PCR 반응 동안 존재하고, 따라서 의도된 표적 서열에 결합함으로써 이중-가닥 산물이 형성되고, 고도 다중화된 실시간 PCR 방식으로 핵산 서열의 검출과 분석이 가능해진다.
10. 면역-PCR
면역-PCR은 항체의 항체(antibody)에 의해 검출될 수 있는 목적하는 항원(antigen), 세포(cell), 내포자(endospore), 또는 임의의 다른 분자 또는 단백질을 검출하는데 이용될 수 있는데, 여기서 상기 항체는 핵산 서열에 연결된다. 기존의 면역-PCR 방법은 U.S. Patent No. 5,665,539; Sano, T. et al., Science, 258:120122 (1992); Sims, PW et al., Anal Biochem. 281:230232 (2000)에서 기술되는데, 이들 각각은 참조로서 편입된다. 하지만, 기존의 방법은 실시간으로 면역-PCR을 검출하는 다중화 능력에서 제한된다. 한 구체예에서, 본 발명에서는 먼저, 본질적으로 자성(가령, 초상자성)인 입자에 포획 항체(capture antibody) 또는 압타머(aptamer)를 연결함으로써 실시간으로 면역-PCR을 검출하는 다중화 능력을 현저하게 증가시킬 수 있는 방법을 제시하는데, 여기서 상기 입자는 목적하는 표적 분자와 반응하고 여기에 결합할 수 있다. 이러한 입자는 스펙트럼에 의해 확인가능하도록 인코딩될 필요는 없다. 반응이 발생한 이후, 또는 반응 동안, 또는 반응 이전에, 나노입자(nanoparticle) 또는 마이크로입자(microparticle)일 수 있는 자성 입자는 검출과 증폭 챔버로 이전된다. 포획 항체 또는 압타머에 연결되는 입자는 자기장을 적용함으로써 챔버의 표면으로 끌어당겨진다. 이들 입자와 여기에 결합되거나 달리 부착된 분자는 세척 절차(washing procedure)를 거치는데, 이는 자력에 의해 유지되는 입자 위에 1 부피(volume)의 수용액을 흘려보내고, 필요에 따라 과량의 표적 분자를 씻어내는 단계를 포함한다.
검출 항체 또는 검출 압타머는 반응 챔버 내로 도입되고, 표적 분자와 결합하고 여기에 결합하는데, 상기 표적 분자는 또한, 포획 항체 또는 압타머에 의해 결합되고, 상기 포획 항체 또는 압타머는 교대로, 자성 입자에 연결된다. 검출 항체 또는 검출 압타머는 증폭가능 핵산 산물을 형성할 수 있는 핵산 서열에 연결된다. 검출 항체는 자기장이 적용될 수 있는 검출 챔버에 도입될 필요가 없지만, 별개의 반응 용기에 도입되고, 이후 자기장이 적용될 수 있는 반응 용기 내로 차후에 도입될 수 있다. 검출 항체는 세적 절차에 앞서, 표적 분자 또는 표적/포획/입자 복합체와 함께 도입될 필요는 없다. 표적/포획/입자 복합체 또는 표적/포획/입자/검출 복합체(포획 샌드위치 복합체(capture sandwich complex))가 자기장이 적용될 수 있는 검출 챔버 내로 일단 도입되면, 이들 입자가 완전하게 복합되지 않은 표적/포획/입자 복합체 또는 이들의 일부분을 형성하거나 세척하는 방법의 다양한 파생에서 챔버의 표면으로 미리 끌어당겨지지 않았다면, 상기 복합체는 챔버의 표면으로 끌어당겨질 수 있다. 챔버의 표면으로 끌어당겨지면, 이러한 복합체는 다수의 반응물, 또는 완충제, 또는 이를 달성하기 위한 당분야에 공지된 수용액에 의해 세척될 수 있다. 통상적으로 이용되는 완충제에는 PBS, BSA, PBS/BSA, 물, PCR 완충액 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 경우에 세척은 과량의 검출 항체 또는 압타머를 제거하여 특이성을 증가시킴으로써 분석을 향상시킨다. 포획 항체 또는 포획 압타머는 세척이 바람직하지 않는 경우에, 표면으로 끌어당겨질 수 있는 입자에 부착될 필요는 없다.
포획 샌드위치 복합체는 인코딩된 자성 구슬이 공존하는 PCR 반응 또는 실시간 PCR 반응 동안 이용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 포획 샌드위치 복합체 또는 복수의 포획 샌드위치 복합체는 서열 증폭을 수행할 수 있는 검출 챔버 내로 도입되고, 세척 절차를 수행하기 위하여 자기장에 의해 챔버의 표면으로 끌어당겨지고 유지된다. 세척후, 핵산 표적 검출에 적합한 핵산 프로브와 결합된 인코딩된 구슬은 중합효소 연쇄 반응 또는 다른 핵산 증폭 방법을 수행하기 위하여 필요한 모든 반응물과 성분을 포함하는 매체 내로 도입된다. 상기 용액은 또한, 본 명세서의 다른 구체예에서 기술된 바와 같이, 실시간 PCR의 다중화된 검출에 필요한 다수의 반응물을 포함한다. 가령, 복수의 검출 항체 또는 검출 압타머는 핵산 서열의 다중화된 검출을 가능하게 하기 위하여 상이한 서열 조합으로 구성되는 핵산 서열에 연결되고, 따라서 이러한 복수 서열의 검출은 검출 항체 또는 검출 압타머와의 관련으로 인하여, 표적 분자의 검출 또는 정량에 역으로 관련될 수 있다.
가령, 포획 샌드위치 복합체와 PCR 반응물, 그리고 인코딩된 자성 구슬이 합쳐지면, 차후의 방법은 본 명세서에 기술된 다중화된 증폭과 검출에 대한 다수의 구체예를 포함할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 표지물(labeling agent), 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고; (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 표지된 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계; (c) 표지된 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 표지된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계; (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 증폭 산물로부터 신호를 검출하는 단계; (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계; (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계; 여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다. 본 발명의 특정 측면에서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복된다.
11. 핵산 유사체
본 명세서에 기술된 방법에 이용되는 핵산에는 뉴클레오티드 이성질체(isomer) 또는 염기 유사체(base analog), 예를 들면, “잠금된 핵산(locked nucleic acid)” 등이 포함된다. 핵산 서열은 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체(analog)를 포함하거나, 또는 이러한 유사체로 완전히 구성될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 당분야에 널리 공지되어 있다. 무-제한적 실례에는 U.S. Patent No. 5,786,461, 5,891,625, 5,773,571, 5,766,855, 5,736,336, 5,719,262, 5,714,331, 5,539,082와 WO 92/20702에 기술된, “PNA”로 알려져 있는 “펩티드 핵산”, “펩티드-기초된 핵산 유사체”, 또는 “PENAM”이 포함된다. 펩티드 핵산은 일반적으로, 분자, 예를 들면, DNA와 RNA에 비하여 강화된 서열 특이성, 결합 특성, 그리고 효소 분해(enzymatic degradation)에 대한 내성을 갖는다(Egholm et al., 1993; PCT/EP/01219). 펩티드 핵산은 일반적으로, 핵염기 모이어티(nucleobase moiety), 5-탄소 당이 아닌 핵염기 링커 모이어티(nucleobase linker moiety), 및/또는 인산염 골격 모이어티(phosphate backbone moiety)가 아닌 골격 모이어티를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함한다. PNA에서 기술된 핵염기 링커 모이어티의 실례에는 아자 질소 원자(aza nitrogen atom), 아미도(amido) 및/또는 우레이도 테터(ureido tether)가 포함된다(참조: U.S. Patent 5,539,082). PNA에서 기술된 골격 모이어티의 실례에는 아미노에틸글리신(aminoethylglycine), 폴리아마이드(polyamide), 폴리에틸(polyethyl), 폴리티오아마이드(polythioamide), 폴리설핀아마이드(polysulfinamide) 또는 폴리설폰아마이드(polysulfonamide) 골격 모이어티가 포함된다.
다른 무-제한적 실례는 잠금된 핵산 또는 “LNA”이다. LNA 단량체(monomer)는 RNA 뉴클레오시드와 구조적으로 유사한 이중환 화합물(bi-cyclic compound)이다. LNA는 Koshkin et al., 1998a와 1998b, 그리고 Wahlestedt et al., 2000에서 기술된 바와 같이, 2'-O 위치를 4'-C 위치로 연결하는 메틸렌 링커에 의해 제한되는 푸라노스(furanose) 형태를 갖는다.
또 다른 무-제한적 실례는 U.S. Patent 5,908,845에서 기술된 “폴리에테르 핵산”이다. 폴리에테르 핵산에서, 하나 이상의 핵염기가 폴리에테르 골격 내에 키랄 탄소 원자(chiral carbon atom)에 연결된다.
12. 혼성화
본 명세서에서, “혼성화,” “혼성화되는” 또는 “혼성화될 수 있는”은 이중 또는 삼중 가닥 분자, 또는 부분적인 이중 또는 삼중 가닥 특징을 갖는 분자의 형성을 의미한다. 본 명세서에서 “어닐링(annealing)”은 “혼성화”와 동의어다. “혼성화,” “혼성화되는” 또는 “혼성화될 수 있는”은 용어 “엄밀한 조건” 또는 “높은 엄밀도(stringency)”, 그리고 “낮은 엄밀도” 또는 “낮은 엄밀도 조건”을 포함한다.
본 명세서에서, “엄밀한 조건” 또는 “높은 엄밀도”는 상보성 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 가닥 사이에 또는 이들 핵산 가닥 내에서 혼성화를 가능하게 하지만 비-상보성 서열의 혼성화를 배제하는 조건이다. 이런 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 높은 선택성(selectivity)을 요하는 적용에 적합하다. 엄밀도 조건은 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예를 들면, 대략 50℃ 내지 대략 70℃의 온도에서 대략 0.02 M 내지 대략 0.15 M NaCl에 의해 제공되는 조건을 포함한다. 원하는 엄밀도의 온도와 이온 강도(ionic strength)는 특정 핵산의 길이, 표적 서열의 길이와 핵염기 함량, 핵산의 전하 조성(charge composition), 그리고 혼성화 혼합물 내에서 포름아마이드(formamide), 테트라메틸암모늄 염화물(tetramethylammonium chloride) 또는 다른 용매의 존재 또는 농도에 의해 부분적으로 결정된다.
혼성화를 위한 이들 범위, 조성과 조건은 무-제한적 실례로서 언급될 뿐이며, 특정 혼성화 반응에 바람직한 엄밀도는 종종, 하나 이상의 양성 또는 음성 대조와의 비교에 의해 경험적으로 결정된다. 낮은 엄밀도 조건의 무-제한적 실례에는 대략 20℃ 내지 대략 50℃의 온도 범위에서 대략 0.15 M 내지 대략 0.9 M NaCl에서 수행된 혼성화가 포함된다. 당연하게, 특정 적용에 적합하게 낮은 또는 높은 엄밀도 조건을 더욱 변형시키는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
E. 인코딩된 입자
특정 구체예가 인코딩된 마이크로스피어(즉, 구슬)와 관련하여 본 명세서에서 기술되긴 하지만, 이들 조명 하위시스템, 시스템과 방법은 다른 입자, 예를 들면, 마이크로입자, 금이나 다른 금속 나노입자, 양자점, 또는 나노점(nanodot)과 함께 이용될 수도 있다. 이들 입자는 바람직하게는, 초상자성(superparamagnetic)이다. 마이크로스피어, 구슬과 입자의 실례는 U.S. Patent No. 5,736,330(Fulton), 5,981,180(Chandler et al.), 6,057,107(Fulton), 6,268,222(Chandler et al.), 6,449,562(Chandler et al.), 6,514,295(Chandler et al.), 6,524,793(Chandler et al.), 그리고 6,528,165(Chandler)에서 예시된다.
인코딩된 입자의 표면 내에서 또는 표면 상에서 염료 또는 형광색소의 여기는 레이저 광(laser light), 다이오드 광(diode light), 아크 등(arc lamp), 열(heat), 방사성 방사(radioactive emission), 화학발광(chemiluminescence), 전자발광(electroluminescence), 화학전자발광(chemielectroluminescence), 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 LuminexxMAP와 MagPlex™ 기술과 병용된다. Luminex xMAP 기술은 형광 인코딩된 마이크로스피어 상에 고정되는 핵산 산물의 검출을 가능하게 한다. 마이크로스피어를 10가지의 상이한 강도의 각 2가지의 스펙트럼에서 상이한 형광색소로 염색함으로써, 마이크로스피어의 100가지의 형광 상이한 집단이 생산된다. 이들 개별 집단(세트)은 개별 검출 서열을 대표할 수 있고, 각 세트에서 혼성화의 등급은 개별적으로 검출될 수 있다. 혼성화 반응의 크기는 세 번째 리포터를 이용하여 측정되는데, 상기 리포터는 전형적으로, 세 번째 스펙트럼에서 상이한 형광단이다. 리포터 분자는 마이크로스피어 상에서 분자에 부착함으로써 반응의 정도를 신호한다. 마이크로스피어와 리포터 분자 둘 모두 표지되기 때문에, 디지털 신호 처리(digital signal processing)는 각 반응에 대한 실시간 정량적 데이터로 신호의 번역을 가능하게 한다. 이러한 Luminex 기술은 예로써, U.S. Patent 5,736,330, 5,981,180과 6,057,107에서 기술된다. LuminexMagPlex™ 마이크로스피어는 앞서 기술된 xMAP기술을 이용하여 형광 인코딩된 초상자성 마이크로스피어이다. 마이크로스피어는 리간드(또는 생물분자)의 공유 부착(covalent attachment)을 위한 표면 카르복실 기를 보유한다.
F. 키트
본 발명에서는 또한, 본 명세서에 개시된 증폭과 검출 방법에 이용을 위한 성분을 포함하는 키트를 제시한다. 본 명세서에 개시된 임의의 성분이 키트 내에서 합쳐질 수 있다. 특정 구체예에서, 이들 키트는 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍과 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브를 포함하는데, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인된다. 특정 구체예에서, 키트는 또한, 표지물을 포함한다. 특정 구체예에서, 이들 키트는 인코딩된 자성 구슬에 부착되지 않는 프로브를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 키트는 영상 챔버를 포함하는데, 이는 영상 시스템에 이용을 위한 일회용 영상 챔버이다.
키트의 이들 성분은 수성 매체(aqueous media) 또는 동결 건조된 형태(lyophilized form)로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단에는 일반적으로, 최소한 하나의 바이알(vial), 검사 튜브(test tube), 플라스크(flask), 병(bottle), 주사기(syringe) 또는 다른 용기 수단(container means)이 포함되는데, 성분은 이러한 용기 수단 내로 배치되고, 바람직하게는, 적절하게 분액된다. 키트 내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우에, 상기 키트는 일반적으로, 부가적인 성분이 별도로 배치될 수 있는 두 번째, 세 번째 또는 다른 부가적인 용기를 보유할 수도 있다. 하지만, 성분의 다양한 조합이 바이알 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한, 상업적 판매를 위하여 밀실(close confinement) 내에 다양한 용기를 포함하기 위한 포장(packaging)을 전형적으로 보유한다. 이런 포장에는 원하는 바이알, 병 등이 보유되는 판지(cardboard), 또는 주입식 중공 성형(blow molded) 플라스틱 포장이 포함된다.
키트의 성분이 하나 이상의 액상 용액에 담겨 제공되는 경우에, 이러한 액상 용액은 수용액인데, 무균 수용액이 특히 바람직하다. 하지만, 키트의 특정 성분은 건조 분말(dried powder)로서 제공될 수도 있다. 반응물 및/또는 성분이 건조 분말로서 제공될 때, 상기 분말은 적절한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 용매는 다른 용기 수단에 의해 제공될 수도 있다.
키트는 또한, 키트 성분을 이용하기 위한 사용설명서(instruction)를 보유할 수 있다. 사용설명서에는 실행될 수 있는 변동이 포함될 수 있다.
아래의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하기 위하여 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 아래의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 충분히 기능하는 것으로 본 발명자에 의해 확인된 기술을 대표하고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 양식을 성립하는 것으로 간주될 수 있다. 하지만, 당업자는 본 발명의 개시에 비추어, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 유사한 결과를 달성하는 다수의 변화가 본 명세서에 개시된 특정 구체예에서 가능함을 인지할 것이다.
실시예 1: PCR 사이클링 조건 하에 자성 마이크로스피어의 안정성
본 연구에서는 PCR 사이클링 조건(cycling condition)에서 Luminex 초상자성 마이크로스피어의 강한 안정성을 증명한다. 또한, 앰플리콘은 농도가 더욱 증가함에 따라, PCR 반응의 다양한 단계에서 포획되고 검출될 수 있는 것으로 증명된다. 본 연구에서는 또한, 2-프로브 시스템이 자성 마이크로스피어를 이용한 실시간 PCR 검출을 위한 실용적인 설계임을 증명한다. 혼성화 프로브(US 2001/6174670) 역시 2-프로브 시스템을 이용한다.
실험 설계: 표적 특이적인 뉴클레오티드 프로브와 결합된 자성 마이크로스피어의 존재에서 인자 V 유전자 앰플리콘의 발생을 검출하기 위하여 2 프로브 시스템이 이용되었다. 표적 특이적 프로브(FV 프로브 Ano)를 구슬 세트(22)에 부착하였다. 상기 프로브는 형광 표지되지 않았다. 다른 프로브를 혼합물에 포함시켰는데, 상기 프로브는 구슬 세트에 부착되지 않았지만 표적 특이적이고, 3' 말단 상에서 Cy3 형광단으로 표지되었다. 표적에 특이적이지 않은 올리고뉴클레오티드 서열에 결합된 두 번째 구슬(구슬 세트(27))은 음성 대조(negative control)로서 추가되었다.
PCR 칵테일은 아래의 반응물과 농도를 이용하여 제조하였다:
Figure 112009040105564-PCT00001
프라이머는 최적화된 비대칭 농도로 이용되었는데, 여기서 표적 서열(FV Rev)을 증폭하는 프라이머는 PCR 칵테일에서 50 nM의 최종 농도를 갖는 진행 프라이머(FV Fwd52)와 비교하여, 400 nM의 최종 농도로 존재하였다. 상기 반응물 내에서 염화마그네슘(magnesium chloride)의 농도는 당업자로부터 정상적으로 예상되는 것보다 높은 농도에서 최적화되었다. 가열가능 검출 챔버가 가용하지 않았기 때문에, 게놈 주형을 제외한 PCR 칵테일이 만들어지도록 개념 증명 실험(proof-of-concept experiment)을 설정하였다. 상기 칵테일은 각각 48 ㎕의 16개 동등 부피로 분액하였다. 게놈 주형은 이들 각 분액에 첨가하고, PCR 반응의 상이한 주기 횟수에서 Perkin Elmer 9700 서열 증폭기로부터 제거하였다. 서열 증폭기로부터 분액을 제거한 직후에, 그리고 개별 반응물에 추가적인 반응물 첨가 없이, 이들 분액은 95 ℃에서 30초 동안, 이후 52℃에서 3분 동안 별개의 히터에 위치시켰다. 이후, 이들 분액은 추가적인 변형 없이 Luminex 100 기구에서 즉시 분석하였다. 첨가된 양쪽 Luminex Magplex 마이크로스피어 세트는 반응당 대략 5000개 마이크로스피어의 농도로 존재하였다.
이러한 반응을 위한 사이클링 조건은 아래와 같았다:
열 변성 단계; 5분 동안 95℃.
사이클링 단계(43회 주기 동안): 30s 동안 95℃, 45s 동안 45℃, 45s 동안 72℃.
본 연구에 이용된 올리고뉴클레오티드 서열은 IDT로부터 구입하였고 아래와 같았다:
프라이머:
FV Rev: TGTTATCACACTGGTGCTAAAAAGG (SEQ ID NO: 1)
FV Fwd 52: ACTACAGTGACGTGG (SEQ ID NO: 2)
프로브:
프로브 B short: /3Cy3sp/ATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACAGTA (SEQ ID NO: 3)
FV 프로브 Ano: /5AmMC12/TCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCT/3InvdT/ (SEQ ID NO: 4)
AT-29: /5AmMC12/AAAGAAAGGATTTGTAGTAAGATT (SEQ ID NO: 5)
인자 V 라이덴(Leiden) 게놈 유전자 서열(gi:2769646과 gi:488109)은 도 13에 도시된다.
표 1에서 데이터는 PCR 반응에서 주기 횟수가 증가함에 따라 신호가 증가함을 증명한다. 상기 데이터는 특이적인 구슬 세트(22)에 대한 신호에서 증가, 그리고 비-특이적인 구슬 세트(27)에 대한 신호에서 현저한 증가 없음을 증명한다. 여기서 신호는 Luminex 분석기로부터 평균 형광 강도(Median Fluorescent Intensity, MFI)로서 표시된다. 이러한 MFI는 대략 100개의 개별 결합된 자성 구슬로부터 리포터 신호를 측정하고 평균을 산정함으로써 획득하였다.
주기 # 구슬(22)에 대한 MFI 구슬(27)에 대한 MFI
0 5 5.5
3 7 4
6 13 8
9 10 10.5
12 11 8
15 7 3
18 11 11.5
21 19 8
24 27 15.5
27 35.5 12
30 45 11
33 48.5 8
36 47 13.5
39 47 16.5
43 47 14
43 49 11.5
표 1에서 데이터는 도 14에서 그래프로 도시된다. 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 구슬 세트(22)로부터 곡선의 외형은 전형적인 실시간 PCR 반응으로부터 예상되는 형상이다. 상기 곡선은 기준 단계(baseline phase), 대수기(exponential phase), 그리고 PCR 반응을 지시하는 고원기(plateau phase)를 보여준다.
구슬은 아래의 프로토콜을 이용하여 포획 프로브에 결합시켰다:
1. -20℃, 건조된 Pierce EDC 분말의 새로운 분액을 실온으로 데운다.
2. 아민-치환된 올리고뉴클레오티드(“프로브” 또는 “포획” 올리고)를 dH2O에 녹인 1 mM(1 나노몰/㎕)에 재현탁시킨다.
3. 마이크로스피어와 함께 제공된 산물 정보 인쇄물에 기술된 사용설명서에 따라, 결합되지 않은 스톡(stock) Luminex 마이크로스피어를 재현탁시킨다.
4. 5.0 x 106의 스톡 마이크로스피어를 USA Scientific 마이크로원심분리 튜브(microcentrifuge tube)로 이전한다.
5. 스톡 마이크로스피어를 ≥ 8000 x g에서 1-2분 동안 마이크로원심분리(microcentrifugation)로 펠릿(pellet)으로 만든다.
6. 상층액(supernatant)을 제거하고, 펠릿으로 만들어진 마이크로스피어를 대략 20초 동안 와동(vortex)과 초음파처리(sonication)로 50 ㎕의 0.1 M MES, pH 4.5에 재현탁시킨다.
7. dH2O에서 1 mM 포획 올리고의 1:10 희석액(0.1 나노몰/㎕)을 제조한다.
8. 2 ㎕(0.2 나노몰)의 1:10 희석된 포획 올리고를 재현탁된 마이크로스피어에 첨가하고 와동으로 혼합한다.
9. dH2O에서 10 ㎎/㎖ EDC의 새로운 용액을 제조한다(주의: 두 번째 EDC 첨가에 재사용을 위하여 EDC 분말을 건조제(desiccant)에 환원시킨다).
10. 각 결합 반응에 대하여 차례로, 2.5 ㎕의 새로운 10 ㎎/㎖ EDC를 마이크로스피어(25 ㎍ 또는 ≒ [0.5 ㎍/㎕]final)에 첨가하고, 와동으로 혼합한다.
11. 실온에서 30분 동안 어둠에서 항온 처리한다.
12. dH2O에서 10 ㎎/㎖ EDC의 두 번째 새로운 용액을 제조한다(주의: EDC 분말의 분액은 폐기한다).
13. 각 결합 반응에 대하여 차례로, 2.5 ㎕의 새로운 10 ㎎/㎖ EDC를 마이크로스피어에 첨가하고, 와동으로 혼합한다.
14. 실온에서 30분 동안 어둠에서 항온 처리한다.
15. 결합된 마이크로스피어에 1.0 ㎖의 0.02% Tween-20을 첨가한다.
16. 결합된 마이크로스피어를 ≥ 8000 x g에서 1-2분 동안 마이크로원심분리로 펠릿으로 만든다.
17. 상층액을 제거하고, 결합된 마이크로스피어를 와동으로 1.0 ㎖의 0.1% SDS에 재현탁시킨다.
18. 결합된 마이크로스피어를 ≥ 8000 x g에서 1-2분 동안 마이크로원심분리로 펠릿으로 만든다.
19. 상층액을 제거하고, 결합된 마이크로스피어를 대략 20초 동안 와동과 초음파처리로 100 ㎕의 TE, pH 8.0에 재현탁시킨다.
20. 결합된 마이크로스피어를 혈구계수기(hemacytometer)로 계수한다:
a. 재현탁되고 결합된 마이크로스피어를 dH20에서 1:100 희석한다.
b. 와동으로 완전하게 혼합한다.
c. 10 ㎕를 혈구계수기로 이전한다.
d. 혈구계수기 격자의 4개의 넓은 코너(large corner) 내에서 마이크로스피어를 계산한다.
e. 마이크로스피어/㎕ = (4개의 넓은 코너 내에서 마이크로스피어의 총계) x 2.5 x 100(희석비(dilution factor)).
f. 주의: 최대는 50,000 마이크로스피어/㎕이다.
21. 2-8℃에 냉동된 결합된 마이크로스피어를 어둠에서 보관한다.
실시예 2: 표식된 프라이머를 이용한 증폭 검출
아래의 실시예에서는 핵산 증폭 신호가 표식된 프라이머 방법을 이용하여 실시간으로 측정될 수 있음을 증명한다. 또한, 본 실시예에서는 측정이 석영 영상 챔버, 그리고 변형되지 않은 중합효소 연쇄 반응 용액의 존재에서, 전하 결합 소자 (CCD) 검출기를 마주보는 챔버의 2차원 표면으로 초상자성 입자를 자성으로 끌어당기기 위하여 석영 영상 챔버에 인접하게 이동될 수 있는 자석을 포함하는 영상 시스템(도 1과 2 참조)을 이용하여 수행될 수 있고, 이의 측정 결과가 Luminex 200 시스템에 필적한다는 것을 증명한다. 석영 챔버와 자석을 포함하는 이러한 영상 시스템은 “정적(static)” 영상 시스템으로 간주되는데, 그 이유는 상기 검출기가 입자와 이들에 결합된 임의의 분자가 자기장에 의해 챔버의 표면에 고정되는 동안 이들 입자와 분자의 영상을 포착하기 때문이다. 대조적으로, Luminex 200 시스템은 “유동(flow)” 시스템으로 간주되는데, 그 이유는 입자가 검출 동안 고정되지 않기 때문이다.
실험 설계:
이러한 설계에서, 2개의 프라이머가 이용되는데, 이들 프라이머 중에서 하나는 5' 말단에서 Cy3 형광단으로 변형된다. 다른 프라이머는 표적 특이적 영역과 초상자성 마이크로스피어에 부착된 특이적인 프로브(anti-tag) 서열에 상보적인 태그 서열 사이에 배치된 Carbon18 스페이서(spacer)로 변형되었다. 이러한 경우에, 프라이머 LUA-MEU는 구슬 세트(43)에 결합된 Bead ME tf 프로브 서열에 상보적인 C18 스페이서(iSp18 - IDT)의 5' 측면 상에 태그 서열을 보유하였다. 본 연구에서, 이들 프라이머 세트는 MTHFR Exon 7 유전자 서열의 영역을 증폭하도록 설계되었다. 2개의 Luminex MagPlex 마이크로스피어 세트(구슬 세트)가 PCR 반응 동안 PCR 칵테일에 포함되었다. 구슬 세트(43)에 부착된 프로브는 프라이머 LUA-MEU-TF 상에서 5' 태그 서열에 상보적인 반면, 구슬 세트(12)에 결합된 프로브는 이러한 반응 동안 상기 프라이머의 태그 서열에 상보적이지 않고, 따라서 음성 대조(negative control)로서 기능하였다. 추가된 양쪽 Luminex Magplex 마이크로스피어 세트는 반응당 대략 5000개 마이크로스피어의 농도로 존재하였다.
PCR 칵테일은 아래의 농도와 반응물을 이용하여 제조하였다:
Figure 112009040105564-PCT00002
이러한 반응을 위한 사이클링 조건은 아래와 같았다:
열 변성 단계; 5분 동안 95℃.
사이클링 단계(36회 주기 동안): 30s 동안 94℃, 30s 동안 55℃, 30s 동안 72℃.
본 실험에 이용된 올리고뉴클레오티드 서열은 IDT로부터 구입하였고 아래와 같았다:
프라이머:
LUA-MEU-TF:
CAAACAAACATTCAAATATCAATC/iSp18/CAAGGAGGAGCTGCTGAAGATG (SEQ ID NO: 16)
LUA-MED-TF:
/5Cy3/CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG (SEQ ID NO: 17)
프로브:
구슬 세트(43): 구슬 ME tf:
/5AmMC12/GATTGATATTTGAATGTTTGTTTG (SEQ ID NO: 18)
구슬 세트(12): W12822:
/5AmMC12/ CAA CAG TGG AGG AAA GCC/3InvdT/ (SEQ ID NO: 19)
표적 서열:
Figure 112009040105564-PCT00003
본 실험에서, 프라이머 농도와 염화마그네슘 농도는 최적화될 필요가 없었다. 이는 이들 증폭 프라이머의 설계의 특징에 기인하였는데, 여기서 증폭된 산물은 태그 서열에 상응하는 단일 가닥 오버행(overhang)을 보유한다. C18 스페이서는 중합효소에 의한 확장을 차단하고, 따라서 구슬 세트(43) 상에서 프로브에 상보적인 태그 서열은 두 번째 가닥 합성을 위한 주형으로서 기능할 수 없다. 따라서 증폭 산물의 5' 말단 상에서 단일 가닥 태그 서열은 직접적인 혼성화 모형에서 발생하는 바와 같은, 역 상보성 가닥으로부터 경쟁 없이 프로브에 혼성화될 수 있었다.
본 연구에서, PCR 칵테일은 주형 없이, 각 50 ㎕의 부피에서 32개의 독립된 PCR 튜브 내로 분액될 만큼 충분한 부피로 만들었다. 상기 PCR 칵테일은 2가지 세트의 Luminex MagPlex 마이크로스피어를 포함하였다. 일단 혼합되고 분액되면, 16개의 PCR 반응은 게놈 DNA와 혼합하고, 16개의 튜브를 음성 PCR 대조로서 기능하는 주형 없음(nt) 반응물로서 유지시켰다. 8개의 양성 샘플과 8개의 음성 샘플은 Luminex LX200 기구를 이용하여 분석하였다. 부가적으로, 8개의 양성 샘플과 8개의 음성 샘플은 앞서 기술된 “정적” 영상 기구를 이용하여 분석하였다. 8개 샘플 세트의 각 사례에서, 각 샘플은 PCR 반응의 다양한 단계에서 서열 증폭기로부터 이전되었다. 이들 샘플은 아래의 주기: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35에서 서열 증폭기로부터 이전하였다. 반응물은 서열 증폭이 완결될 때까지, 실온에서 어둠에서 일시적으로 보관하였다.
이후, 이들 샘플은 1분 동안 95℃ 히터에 위치시키고, 차후에 37℃에서 10분 동안 위치시켰다.
이들 샘플은 또한, 증폭 특이성을 조사하기 위하여 Reliant Gel System Gel Cat. No. 54929에서 이동시켰다.
상기 “정적” 영상 기구로부터 획득된 데이터는 표 2에 제시된다:
Figure 112009040105564-PCT00004
상기 “정적” 영상 기구에서, 각 샘플은 석영 영상 챔버 내로 분배하고, 인코딩된 자성 구슬은 챔버의 뒷면으로 끌어당기고 분석 동안 유지시켰다. 이 데이터는 리포터 파장으로부터 대표적인 평균치(median value)를 나타낸다. 양쪽 구슬 세트는 문제없이, 분류 파장(classification wavelength)을 이용하여 분류할 수 있었다. 구슬 세트(43)로부터 주기 30과 35에서 신호에서 증가를 주목한다. 신호에서 이러한 증가는 증폭 크기와 강도에 관하여 겔 데이터(gel data)와 상관한다.
Luminex 200 기구로부터 데이터(표 3)는 “정적” 영상 기구에서 분석된 샘플(표 2)과 동일한 샘플 설정을 이용하여 획득하였다.
Figure 112009040105564-PCT00005
상기 데이터는 증폭 크기와 강도에 관하여 겔로부터 데이터와 상관하였다. “정적” 영상 시스템 방식을 이용하여, 유사한 패턴의 신호 증가가 관찰되었다.
실시예 3: 8의 다중
본 실시예에서, 8개의 프라이머 세트와 14개의 구슬 세트로 직접적인 혼성화 방법이 이용되었다. 증폭 산물이 무관한 프로브를 보유하는 구슬 세트에 비-특이적으로 혼성화되지 않는다는 것을 증명하기 위하여, 과량의 구슬 세트를 이용하였다.
아래의 반응물을 포함하는 PCR 칵테일을 제조하였다:
Figure 112009040105564-PCT00006
프로브 서열이 부착된 Luminex MagPlex 마이크로스피어를 포함하는 상기 칵테일은 각각 50 ㎕에서 40개의 PCR 튜브 내로 분액하였다. 이후, 20개의 반응물은 대략 100 ng의 게놈 DNA를 첨가하였다. 이들 반응물은 BioRad iCycler 서열 증폭기에서 순환시켰다. 프라이머는 낭포성 섬유증 CFTR 유전자의 특정 영역을 증폭하도록 설계하였다. 이러한 반응에 이용되는 8개 프라이머 세트 각각에 대한 프라이머 서열은 각 50 ㎕ 반응물 내에서 최종 농도와 함께, 표 5에 제시된다.
프라이머 조성
세트 명칭 변형 서열 스케일 bp 정제 최종 농도 (nM)
1 E20U 없음 TTG AGA CTA CTG AAC ACT GAA GG (SEQ ID NO: 21) 100 nmol 23 탈염 75
1 CE20D /5Cy3/ TTC TGG CTA AGT CCT TTT GC (SEQ ID NO: 22) 100 nmol 20 HPLC 125
2 E11U 없음 TCA GAT TGA GCA TAC TAA AAG TGA C (SEQ ID NO: 23) 100 nmol 25 탈염 75
2 CE11D /5Cy3/ GAA CTA TAT TGT CTT TCT CTG CAA AC (SEQ ID NO: 24) 100 nmol 26 HPLC 125
3 E11U2 없음 AAG TTT GCA GAG AAA GAC AAT ATA G (SEQ ID NO: 25) 100 nmol 25 탈염 100
3 CE11D2 /5Cy3/ GAA TGA CAT TTA CAG CAA ATG C (SEQ ID NO: 26) 100 nmol 22 HPLC 200
4 E4U 없음 TTT GTA GGA AGT CAC CAA AGC (SEQ ID NO: 27) 100 nmol 21 탈염 75
4 CE4D /5Cy3/ GAG CAG TGT CCT CAC AAT AAA GAG (SEQ ID NO: 28) 100 nmol 24 HPLC 125
5 CE21U /5Cy3/ TGC TAT AGA AAG TAT TTA TTT TTT CTG G (SEQ ID NO: 29) 100 nmol 28 HPLC 125
5 E21D 없음 AGC CTT ACC TCA TCT GCA AC (SEQ ID NO: 30) 100 nmol 20 탈염 75
6 CE7U /5Cy3/ GAA CAG AAC TGA AAC TGA CTC G (SEQ ID NO: 31) 100 nmol 22 HPLC 200
6 E7D3 없음 CAG GGA AAT TGC CGA GTG (SEQ ID NO: 32) 100 nmol 18 탈염 100
7 CC7U /5Cy3/ GAC TTG TCA TCT TGA TTT CTG G (SEQ ID NO: 33) 100 nmol 22 HPLC 125
7 C7D 없음 TTT GGT GCT AGC TGT AAT TGC (SEQ ID NO: 34) 100 nmol 21 탈염 75
8 BE9U /5Cy3/ TCA CTT CTT GGT ACT CCT GTC C (SEQ ID NO: 35) 100 nmol 22 HPLC 125
8 E9D 없음 CAA AAG AAC TAC CTT GCC TGC (SEQ ID NO: 36) 100 nmol 21 탈염 75
이러한 반응을 위한 사이클링 조건은 아래와 같았다:
열 변성 단계; 10분 동안 95℃.
사이클링 단계(36회 주기 동안): 30s 동안 94℃, 90s 동안 56℃, 90s 동안 72℃.
개별 PCR 샘플은 PCR 반응 동안 다양한 주기에서 이전하였다. 이들은 56℃ 단계 동안, 개별 주기 횟수에서 이전하였다. “주형 없음”과 “주형 양성” 샘플 둘 모두 아래의 주기 횟수: 5, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 30, 36, 36에서 다시 한 번 동시에 이전하였다. 서열 증폭기로부터 벗겨져 나온 샘플은 36회 주기의 완결 때까지 실온에서 어둠에서 보관하였다. 반응물의 첨가와 관련하여 추가적인 변형 없이, 이들 샘플은 1분 동안 95℃로 가열하고, 이후 44℃에서 15분 동안 항온 처리하고, 앞서 기술된 바와 같이 Luminex 200 기구와 “정적” 영상 시스템에서 분석하였다. 가열가능 검출 챔버가 이 시점에 가용하지 않았지만, 이러한 실험의 설계는 본 명세서에 기술된 전반적인 절차가 서열 증폭이 가능한 검출 챔버에서 분석에 맞게 개조되면, 상기 반응을 실시간으로 수행하는 것이 가능함을 증명한다.
이들 반응에 이용된 구슬 세트와 상기 구슬 세트에 결합된 프로브는 표 6에 제시된다.
구슬 세트 명칭 변형 서열 스케일 bp 정제 표적 프라이머 세트
12 W12822 /5AmMC12/ /3InvdT/ CAA CAG TGG AGG AAA GCC (SEQ ID NO: 37) 100 nmol 18 탈염 1
19 G1717 /5AmMC12/ /3InvdT/ TTG GTA ATA GGA CAT CTC CA (SEQ ID NO: 38) 100 nmol 20 탈염 2
18 R560 /5AmMC12/ /3InvdT/ CTT TAG CAA GGT GAA TAA CT (SEQ ID NO: 39) 100 nmol 20 탈염 3
20 R117 /5AmMC12/ /3InvdT/ AGG AGG AAC GCT CTA TCG CG (SEQ ID NO: 40) 100 nmol 20 탈염 4
22 N1303 /5AmMC12/ /3InvdT/ GGG ATC CAA GTT TTT TCT AA (SEQ ID NO: 41) 100 nmol 20 탈염 5
25 1078T2 /5AmMC12/ /3InvdT/ CAC CAC AAA GAA CCC TGA (SEQ ID NO: 42) 100 nmol 18 탈염 6
36 A455 /5AmMC12/ /3InvdT/ CCA GCA ACC GCC AAC AAC TG (SEQ ID NO: 43) 100 nmol 20 탈염 8
38 3659C2 /5AmMC12/ /3InvdT/ TTG ACT TGG TAG GTT TAC (SEQ ID NO: 44) 100 nmol 18 탈염 없음
35 G278952 /5AmMC12/ /3InvdT/ TGG AAA GTG AGT ATT CCA TGT C (SEQ ID NO: 45 ) 100 nmol 22 탈염 없음
37 2184A7 /5AmMC12/ /3InvdT/ GAA ACA AAA AAA CAA TC (SEQ ID NO: 46) 100 nmol 17 탈염 없음
39 G18982 /5AmMC12/ /3InvdT/ TAT TTG AAA GGT ATG TTC TTT G (SEQ ID NO: 47) 100 nmol 22 탈염 없음
42 G31202 /5AmMC12/ /3InvdT/ CTT CAT CCA GGT ATG TAA AAA T (SEQ ID NO: 48) 100 nmol 22 탈염 없음
44 G85 /5AmMC12/ /3InvdT/ ATT TGA TGA AGT ATG TAC CTA T (SEQ ID NO: 49) 100 nmol 22 탈염 없음
43 C3849 /5AmMC12/ /3InvdT/ GTC TTA CTC GCC ATT TTA AT (SEQ ID NO: 50) 100 nmol 20 탈염 7
본 실험에 이용된 낭포성 섬유증 유전자 서열(SEQ ID NO: 8-15)은 도 15에 제시된다. 이러한 반응으로부터 결과는 겔에서 분석으로 확증하였다.
데이터는 44℃에서 Luminex 200 기구를 이용하여 수집하였다. 수집된 데이터는 표 7에 제시된다. 수치가 잡음으로부터 구별될 수 있는 모든 주형 양성 샘플은 표 7에서 음영으로 표시된다. 반응 조건을 개선하고 신호-대-잡음 비율(signal-to-noise ratio)을 더욱 향상시키기 위하여, 당업자에게 공지된 다른 최적화 기술이 이용될 수 있다. MFI 수치가 앰플리콘에 표적 특이적일 것으로 예상되는 구슬 세트는 이러한 반응의 후반 종결(latter end) 무렵에 잡음을 초과하여 상승하였다. 프로브가 비-특이적이거나 음성일 것으로 예상되는 구슬 세트는 그렇지 않았다.
Figure 112009040105564-PCT00007
데이터는 44℃에서 “정적” 영상 시스템을 이용하여 수집하였다. “정적” 영상 시스템을 이용하여 수집된 순 데이터(net data)는 표 8에 제시된다. 수치가 잡음으로부터 구별될 수 있는 모든 양성 샘플은 표 8에 강조된다. 표 8을 산출하는데 이용된 “정적” 영상 시스템으로부터 원 데이터(raw data)는 표 9에 제시된다. 표 8은 모든 주기 동안 주형 음성 샘플을 보유하는 모든 구슬 세트의 데이터 지점(data point)으로부터 평균 MFI를 채택하고, 모든 데이터 지점으로부터 평균을 뺌으로써 계산되었다. 계산의 총합이 음(negative)인 경우에, 모든 음수(negative number)는 0으로 전환시켰다. 일부 낮은 주기 횟수는 가성 결과(spurious result)를 포함하였는데, 이들은 역외자(outlier)로 간주될 수 있다.
Figure 112009040105564-PCT00008
표 8을 산출하는데 이용된 “정적” 영상 시스템으로부터 원 데이터(raw data)는 표 9에 제시된다.
Figure 112009040105564-PCT00009
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물과 방법은 본 발명의 개시에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법이 특정 구체예로서 기술되긴 했지만, 본 발명의 개념, 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기술된 조성물과 방법에, 그리고 이들 방법의 단계 또는 단계 순서에서 변화가 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 작용제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본 명세서에 기술된 작용제를 대체할 수 있음은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이와 같은 모든 유사한 치환과 변형은 하기에 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 기술적 사상, 범위와 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
아래의 참고문헌은 본 명세서에 열거된 내용을 보충하는 정도에서 실험적 절차 또는 다른 상세를 제공하고, 본 명세서에 참조로서 편입된다.
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gaaattctga gaatttcttc 180 tggctagaac atgttaggtc tcctggctaa ataatggggc atttccttca agagaacagt 240 aattgtcaag tagtcctttt tagcaccagt gtgataacat ttattctttt tttttttttg 300 <210> 7 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gtgtctttta ctacgggtca cgaattgttc tggtatgatg tcactgcacc tgtagtactc 60 tctgtagcgg agacccgatt atcctgatga agattagaca ttctcgtcta gggacctgtc 120 cgctccttat gtccataaaa caggaacttc attggaaagt ctttaagact cttaaagaag 180 accgatcttg tacaatccag aggaccgatt tattaccccg taaaggaagt tctcttgtca 240 ttaacagttc atcaggaaaa atcgtggtca cactattgta aataagaaaa aaaaaaaaac 300 <210> 8 <211> 145 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cagctttttt gagactactg aacactgaag gagaaatcca gatcgatggt gtgtcttggg 60 attcaataac tttgcaacag tggaggaaag cctttggagt gataccacag gtgagcaaaa 120 ggacttagcc agaaaaaagg caact 145 <210> 9 <211> 114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcaaattcag attgagcata ctaaaagtga ctctctaatt ttctattttt ggtaatagga 60 catctccaag tttgcagaga aagacaatat agttcttgga gaaggtggaa tcac 114 <210> 10 <211> 149 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 atctccaagt ttgcagagaa agacaatata gttcttggag aaggtggaat cacactgagt 60 ggaggtcaac gagcaagaat ttctttagca aggtgaataa ctaattattg gtctagcaag 120 catttgctgt aaatgtcatt catgtaaaa 149 <210> 11 <211> 160 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tccccttttg taggaagtca ccaaagcagt acagcctctc ttactgggaa gaatcatagc 60 ttcctatgac ccggataaca aggaggaacg ctctatcgcg atttatctag gcataggctt 120 atgccttctc tttattgtga ggacactgct cctacaccca 160 <210> 12 <211> 118 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ttttttgcta tagaaagtat ttattttttc tggaacattt agaaaaaact tggatcccta 60 tgaacagtgg agtgatcaag aaatatggaa agttgcagat gaggtaaggc tgctaact 118 <210> 13 <211> 165 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ttttatagaa cagaactgaa actgactcgg aaggcagcct atgtgagata cttcaatagc 60 tcagccttct tcttctcagg gttctttgtg gtgtttttat ctgtgcttcc ctatgcacta 120 atcaaaggaa tcatcctccg gaaaatattc accaccatct cattc 165 <210> 14 <211> 169 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 aatttcagtt gacttgtcat cttgatttct ggagaccaca aggtaatgaa aaataattac 60 aagagtcttc catctgttgc agtattaaaa tggcgagtaa gacaccctga aaggaaatgt 120 tctattcatg gtacaatgca attacagcta gcaccaaatt caacactgt 169 <210> 15 <211> 123 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 taatttctca cttcttggta ctcctgtcct gaaagatatt aatttcaaga tagaaagagg 60 acagttgttg gcggttgctg gatccactgg agcaggcaag gtagttcttt tgttcttcac 120 tat 123 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 16 caaacaaaca ttcaaatatc aatccaagga ggagctgctg aagatg 46 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 17 cactttgtga ccattccggt ttg 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 18 gattgatatt tgaatgtttg tttg 24 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 19 caacagtgga ggaaagcc 18 <210> 20 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ggaggagctg ctgaagatgt ggggggagga gctcaccagt gaagaaagtg tctttgaagt 60 ctttgttctt cctcctcgac gacttctaca cccccctcct cgagtggtca cttctttcac 120 agaaacttca gaaacaagaa tacctctcgg gagaaccaaa ccggaatggt cacaaagtga 180 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 21 ttgagactac tgaacactga agg 23 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 22 ttctggctaa gtccttttgc 20 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 23 tcagattgag catactaaaa gtgac 25 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 24 gaactatatt gtctttctct gcaaac 26 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 25 aagtttgcag agaaagacaa tatag 25 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 26 gaatgacatt tacagcaaat gc 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 27 tttgtaggaa gtcaccaaag c 21 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 28 gagcagtgtc ctcacaataa agag 24 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 29 tgctatagaa agtatttatt ttttctgg 28 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 30 agccttacct catctgcaac 20 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 31 gaacagaact gaaactgact cg 22 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 32 cagggaaatt gccgagtg 18 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 33 gacttgtcat cttgatttct gg 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 34 tttggtgcta gctgtaattg c 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 35 tcacttcttg gtactcctgt cc 22 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 36 caaaagaact accttgcctg c 21 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 37 caacagtgga ggaaagcc 18 <210> 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Claims (37)

  1. 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 표지물(labeling agent), 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 첫 번째 복수의 프로브를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고;
    (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 표지된 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계;
    (c) 표지된 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계;
    (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 표지된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장(magnetic field)을 챔버의 표면에 적용하는 단계;
    (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 증폭 산물로부터 신호를 검출하는 단계;
    (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계;
    (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계;
    여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 표지된 증폭 산물로부터 신호를 샘플 내에서 핵산 표적의 농도와 상관시키는 단계가 더욱 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 복수의 프라이머 쌍은 8개 내지 500개의 상이한 프라이머 쌍으로 더욱 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 표지물은 각 프라이머 쌍의 한쪽 프라이머에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 챔버는 석영 챔버(quartz chamber)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 표지물은 형광 염료(fluorescent dye)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 표지물은 형광 공명 에너지 이동 쌍(fluorescence resonance energy transfer pair)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 복수의 핵산 표적에 상보적인 두 번째 복수의 프로브를 챔버 내에서 합치는 단계가 더욱 포함되고, 여기서 두 번째 복수의 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되지 않고, 또한 두 번째 복수의 프로브는 첫 번째 복수의 프로브와 달리 복수의 핵산 표적 상에서 상이한 영역에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 형광 공명 에너지 이동 쌍의 한쪽 구성원은 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 복수의 프로브에 부착되고, 형광 공명 에너지 이동 쌍의 다른 구성원은 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되지 않은 두 번째 복수의 프로브에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 표지물은 형광단(fluorophore)과 소광물질(quencher) 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 표지물은 DNA 삽입 인자(intercalating agent)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 인코딩된 자성 구슬은 형광 염료로 인코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 인코딩된 자성 구슬은 상이한 형광 강도(fluorescent intensity)로 인코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 인코딩된 자성 구슬은 상이한 형광 방출 파장(fluorescent emission wavelength)으로 인코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 인코딩된 자성 구슬은 초상자성(superparamagnetic)인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 자기장을 적용하는 단계는 챔버의 표면에 인접하게 영구 자석(permanent magnet)을 위치시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 자기장을 적용하는 단계는 챔버의 표면에 인접한 전자석(electromagnet)을 켜는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 자기장은 증폭 주기의 프라이머 어닐링 단계(primer annealing phase) 동안 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 1에 있어서, 자기장은 증폭 주기의 프라이머 신장 단계(primer extension phase) 동안 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 자기장은 증폭 주기 이후에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 인코딩된 자성 구슬과 표지된 증폭 산물을 검출하는 단계는 인코딩된 자성 구슬과 표지된 증폭 산물로부터 방출된 형광 파장(fluorescent wavelength)을 영상화하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 1에 있어서, 자기장을 제거하는 단계는 챔버의 표면에 인접한 위치로부터 영구 자석을 제거하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 자기장을 제거하는 단계는 챔버의 표면에 인접한 전자석을 끄는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 1에 있어서, 단계 (b) 내지 (f)는 10회 내지 40회 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 1에 있어서, 복수의 프로브는 차단된 3' 하이드록실 기(hydroxyl group)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 3' 하이드록실 기는 인산염 기(phosphate group)로 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 3' 하이드록실 기는 3' 반전된 dT로 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 분자 비콘(molecular beacon)을 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 분자 비콘은 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 분자 비콘의 실체는 이러한 분자 비콘이 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고;
    (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계;
    (c) 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 분자 비콘에 혼성화시키는 단계;
    (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 분자 비콘에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장(magnetic field)을 챔버의 표면에 적용하는 단계;
    (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 분자 비콘으로부터 신호를 검출하는 단계;
    (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계;
    (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계;
    여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다.
  29. 샘플 내에서 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 핵산 표적, 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 프라이머 쌍, 그리고 핵산 표적에 상보적인 프로브 세트(probe set)를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브 세트는 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 프로브와 라벨(label)을 포함하는 두 번째 프로브를 포함하고;
    (b) 프라이머 쌍으로 증폭된 핵산 표적에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계;
    (c) 증폭 산물을 프로브 세트에 혼성화시키는 단계;
    (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장(magnetic field)을 챔버의 표면에 적용하는 단계;
    (e) 증폭 산물에 혼성화된 두 번째 프로브로부터 신호를 검출하는 단계;
    (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계;
    (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계;
    여기서 샘플 내에서 핵산 표적이 증폭되고 검출된다.
  30. 청구항 29에 있어서, 자성 구슬은 인코딩된 자성 구슬인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 아래의 단계를 포함하는, 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법으로 더욱 정의되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 프로브 세트를 포함하는 샘플을 챔버(chamber) 내에서 합치는 단계, 여기서 각 프로브 세트는 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 첫 번째 프로브와 라벨(label)을 포함하는 두 번째 프로브를 포함하고, 상기 첫 번째 프로브의 실체는 이러한 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고;
    (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기(amplication cycle)를 수행하는 단계;
    (c) 증폭 산물을 프로브 세트에 혼성화시키는 단계;
    (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장(magnetic field)을 챔버의 표면에 적용하는 단계;
    (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 증폭 산물에 혼성화된 두 번째 프로브로부터 신호를 검출하는 단계;
    (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계;
    (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계;
    여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다.
  32. 샘플 내에서 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 핵산 표적, 이러한 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 프라이머 쌍, 소광물질 분자에 결합된 dNTP, 그리고 상기 핵산 표적에 상보적인 형광 표지된 프로브를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 자성 구슬 상에 고정되고;
    (b) 핵산 표적의 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기를 수행하는 단계, 상기 증폭 산물은 소광물질 분자를 포함하고;
    (c) 증폭 산물을 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계;
    (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브 에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계;
    (e) 표지된 프로브로부터 신호를 검출하는 단계, 여기서 표지된 프로브로부터 신호의 감소는 소광물질 분자를 포함하는 증폭 산물에 이러한 표지된 프로브의 혼성화(hybridization)를 지시하고;
    (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계;
    (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계;
    여기서 샘플 내에서 핵산 표적이 증폭되고 검출된다.
  33. 청구항 32에 있어서, 자성 구슬은 인코딩된 자성 구슬인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 아래의 단계를 포함하는, 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법으로 더욱 정의되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 복수의 핵산 표적, 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 소광물질 분자에 결합된 dNTP, 그리고 복수의 핵산 표적에 상보적인 복수의 형광 표지된 프로브를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고;
    (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 소광물질 분자를 포함하는 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기를 수행하는 단계;
    (c) 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계;
    (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계;
    (e) 인코딩된 자성 구슬로부터 신호와 표지된 프로브로부터 신호를 검출하는 단계, 여기서 표지된 프로브로부터 신호의 감소는 소광물질 분자를 포함하는 증폭 산물에 이러한 표지된 프로브의 혼성화(hybridization)를 지시하고;
    (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계;
    (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계;
    여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다.
  35. 샘플 내에서 복수의 핵산 표적을 증폭하고 검출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 복수의 핵산 표적; 복수의 핵산 표적의 증폭을 촉발하기 위한 복수의 프라이머 쌍, 여기서 각 프라이머 쌍은 표적 특이적인 서열, 이러한 표적 특이적인 서열의 5' 태그 서열(tag sequence), 그리고 표적 특이적인 서열과 태그 서열 사이 에 차단제(blocker)를 포함하는 첫 번째 프라이머와 표적 특이적인 서열을 포함하는 두 번째 프라이머를 포함하고; 표지물(labeling agent); 그리고 복수의 프라이머 쌍의 태그 서열에 상보적인 복수의 프로브를 포함하는 샘플을 챔버 내에서 합치는 단계, 여기서 프로브는 복수의 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되고, 따라서 각 프로브의 실체는 프로브가 고정되는 인코딩된 자성 구슬로부터 확인되고;
    (b) 복수의 프라이머 쌍으로 증폭된 복수의 핵산 표적 각각에 대한 표식(tagged)되고 표지된(labeled) 증폭 산물을 형성하기 위하여 증폭 주기를 수행하는 단계;
    (c) 표식되고 표지된 증폭 산물을 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화시키는 단계;
    (d) 인코딩된 자성 구슬과 이러한 인코딩된 자성 구슬 상에 고정되는 프로브에 혼성화된 표식되고 표지된 증폭 산물을 챔버의 표면으로 끌어당기기 위하여 자기장을 챔버의 표면에 적용하는 단계;
    (e) 인코딩된 자성 구슬과 표식되고 표지된 증폭 산물을 검출하는 단계;
    (f) 추가의 증폭 주기를 수행하기에 앞서, 챔버의 표면으로부터 자기장을 제거하는 단계;
    (g) 단계 (b) 내지 (f)를 최소한 1회 반복하는 단계;
    여기서 샘플 내에서 복수의 핵산 표적이 증폭되고 검출된다.
  36. 청구항 35에 있어서, 표지물은 프라이머 쌍의 두 번째 프라이머에 부착된 리 포터 분자(reporter molecule)인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, 표지물은 삽입 염료(intercalating dye)인 것을 특징으로 하는 방법.
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