KR20220015239A - 멀티플렉스 pcr 칩 및 이를 이용한 멀티플렉스 pcr 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다수의 목표 유전자를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR 칩 및 이를 이용한 멀티플렉스 PCR 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 하나 또는 다수의 반응챔버의 내부에 공간적으로 분리된 다수의 입자형성홈을 형성하고, 상기 입자형성홈에 용액 상태의 프로브를 주입한 후, 물리적 자극을 가해서 프로브 입자를 형성하되, 상기 입자형성홈의 평면 형상을 다양하게 하거나 상기 입자형성홈의 내측 면에 형성되는 입자고정체의 형태 및 패턴을 다양하게 하며, 상기 입자형성홈에 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 프라이머가 포함된 프로브를 주입함으로써 상기 프로브 입자의 위치와 형태뿐만 아니라 상기 프로브 립자의 내부에 형성되는 상기 입자고정체의 형태 및 패턴을 기초로 다수의 목표 유전자를 검출할 수 있도록 하여 동시다중 검출이 가능하도록 한 멀티플렉스 PCR 칩 및 이를 이용한 멀티플렉스 PCR 방법을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 다수의 목표 유전자를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR 칩 및 이를 이용한 멀티플렉스 PCR 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)은 핵산 분자를 포함하는 샘플 용액을 반복적으로 가열 및 냉각하여 특정 염기 서열을 갖는 부위(타깃 핵산)를 연쇄적으로 복제하여 기하급수적으로 증폭시키는 기술로서 미량의 핵산을 증폭, 복제하여 목표 유전자를 검출할 수 있게 하는 기술이다.
이러한 PCR 방법은 DNA 변성단계, 어닐링단계 및 DNA 합성단계를 반복적으로 수행하는데, DNA 변성단계(denaturing step)는 이중 가닥의 주형 DNA이 포함된 샘플 용액을 특정 온도, 예를 들어 약 95℃에서 5초간 가열하여 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 분리하는 단계이고, 어닐링단계(annealing step)는 DNA 변성단계 이후 샘플 용액에 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 주입하고, 단일 가닥의 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어 50℃에서 5초간 유지하여 단일 가닥의 DNA의 특정 염기 서열에 프라이머를 혼성화시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 단계이며, DNA 합성단계(extension step)는 어닐링 단계 이후 샘플 용액을 DNA 중합효소의 활성온도, 예를 들어 72℃에서 5초간 유지하여 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 부분적인 DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 기초로 이중 가닥의 DNA를 형성하는 단계이다. 그리고 타깃 핵산과 결합한 형광염료에서 발생하는 형광을 검출하여 타깃 핵산을 검출할 수 있다.
이러한 PCR 방법을 적절히 수행하기 위해서는, 시약(프라이머 및 형광염료)과 시료(샘플 용액)는 물론 하나 또는 다수의 반응챔버가 구비된 PCR 칩, 그리고 상기 PCR 칩을 가열 및 냉각하여 증폭 반응을 유도하고 그 결과를 측정하는 PCR 장치가 필요하다. 특히, 휴대용 실시간 PCR 장치에서는 작고 납작한 형태의 마이크로 PCR 칩을 사용하게 된다. 마이크로 PCR 칩은 투명 기판에 시약과 시료를 수용할 수 있는 하나 이상의 반응챔버가 구비된다. 그리고 상기 PCR 장치에는 타깃 핵산과 결합한 형광염료에서 발생하는 형광을 촬영하기 위한 카메라가 구비된다.
한편, 한 번의 실험으로 여러 개의 목표 유전자를 검출하는 것을 동시다중 검출 즉, 멀티플렉스(multiplex) PCR이라 한다. 이러한 멀티플렉스 PCR을 위해서는 다양한 종류의 형광염료를 사용하여야 하는데, 여러 개의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 여러 가지 형광염료를 구분하고 형광염료 간의 간섭을 방지할 수 있는 복잡한 프로브의 디자인이 요구된다. 이는 다양한 형광색에 따른 여기와 발광 파장대가 겹치기 때문이다.
이러한 화학적 멀티플렉스 방식의 문제점을 해결하기 위해서, 최근에는 공간적으로 고립화된 시스템을 개발하고 있다. 즉, 특허문헌에서 개시된 바와 같이, 종래의 멀티플렉스 PCR 칩은, 하나의 반응챔버 내에 다수 개의 프로브를 고착하고, 상기 반응챔버에 고정된 프로브 입자와 시료 간의 반응을 유도하여 한 번에 다수 개의 타깃 핵산을 증폭하고 검출할 수 있게 한다. 즉, 반응챔버 상의 서로 다른 위치에 서로 다른 종류의 프로브를 고착시켜 공간적으로 분리하고, 공간적으로 분리된 프로브에 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 프라이머를 주입함으로써 프로브의 위치에 기초하여 프로브에서 발광되는 형광색을 분석하여 동시다중 검출할 수 있도록 한 것이다. 이는 광학 장비의 크기를 줄이고 장비 가격을 낮출 수 있을 뿐만 아니라 검출에 걸리는 시간을 단축할 수 있는 등 효율을 향상시킬 수 있다.
그러나 종래의 멀티플렉스 PCR 칩은 반응챔버 상에 공간적으로 분리된 프로브를 고착시킬 때 즉, 프라이머가 포함된 액체 상태의 프로브를 몇 방울 떨어뜨린 후 이를 고착시킬 때, 프로브 방울이 퍼져서 제대로 된 프로브 입자를 형성하기 어렵다는 문제가 있었다. 또한, 프로브 입자를 형성하는 경우에는 프로브 입자가 쉽게 떨어지는 문제가 있었다. 또한, 프로브의 위치만으로는 다양한 조합을 얻는데 한계가 있어 검출 가능한 목표 유전자의 수가 제한되는 문제가 있고, PCR 칩의 좌우가 바뀌면 프로브의 위치가 변하게 되므로 동시다중 검출이 쉽지 않다는 문제가 있었다.
본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 본 발명의 주된 목적은 한 번에 여러 개의 타깃 핵산을 동시에 증폭하고 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서로 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 다수의 프로브 입자를 공간적으로 고립시키고, 이들 프로브 입자의 위치에 기초하여 동시다중 검출을 가능하게 하는 멀티플렉스 PCR 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PCR 칩의 반응챔버의 내부에 공간적으로 분리된 프로브 입자를 형성하되, 일정량의 프로브를 수용하는 입자형성홈을 반응챔버의 내부에 형성하여 상기 프로브 입자의 크기와 형태를 쉽게 만들 수 있도록 하는 PCR 칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 프로브 입자를 형성하기 위한 입자형성홈의 바닥과 내측 면에 일정 길이 돌출되는 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체를 형성하여 상기 입자형성홈에 고정된 프로브 입자가 쉽게 분리되지 않도록 고정하는 PCR 칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 다수의 프로브 입자를 공간적으로 고립시키는 동시에 프로브 입자의 크기, 형태 또는 패턴을 다르게 하거나 입자고정체의 형태 또는 패턴을 서로 다르게 하여 프로브 입자의 위치뿐만 아니라 그 형태와 패턴을 기초로 다양한 종류의 목표 핵산을 동시다중 검출할 수 있도록 하는 멀티플렉스 PCR 칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, PCR 칩에 시료를 주입할 때 한 번의 시료 주입으로 모든 반응챔버에 시료를 채울 수 있도록 다수의 반응챔버를 하나의 연결챔버로 연결하고, 상기 다수의 반응챔버에 고정된 프로브 입자의 표면에 방수 코팅제를 도포하여 동시다중 검출이 쉽도록 한 멀티플렉스 PCR 칩을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명은 상기한 멀티플렉스 PCR 칩을 이용한 멀티플렉스 PCR 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩은,
투명한 소재로 이루어진 기판과;
상기 기판상에 일정한 크기와 깊이로 형성된 하나 또는 하나 이상의 반응챔버와;
상기 반응챔버의 내부에 일정량의 액체 상태의 프로브를 수용할 수 있는 크기와 깊이로 형성된 다수의 입자형성홈;을 포함하되, 공간적으로 분리된 서로 다른 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머와 상기 프라이머와 결합하는 형광염료 및 상기 프라이머가 고착되는 지지체가 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예로서, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩은,
투명한 소재로 이루어진 기판과;
상기 기판상에 일정한 크기와 깊이로 형성된 하나 또는 하나 이상의 반응챔버와;
상기 반응챔버의 내부에 일정량의 액체 상태의 프로브를 수용할 수 있는 크기와 깊이로 형성된 다수의 입자형성홈;을 포함하되, 상기 입자형성홈은 다양한 평면 형상을 하고, 서로 다른 평면 형상을 하는 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머와 상기 프라이머와 결합하는 형광염료 및 상기 프라이머가 고착되는 지지체가 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브에 포함된 지지체는 물리적 자극(광, 온도, 초음파)에 의해 3차원의 망구조체를 형성하여 상기 입자형성홈에 대응하는 형태의 프로브 입자를 형성한다.
상기 입자형성홈의 내부에는 상기 프로브 입자가 이탈되는 것을 방지하기 위한 입자고정체가 형성된다.
상기 입자고정체는 상기 입자형성홈의 바닥이나 내측 면에서 일정 길이 돌출되게 형성되는 다수 개의 돌기로 이루어져 상기 프로브 입자와 일체로 결합된다.
상기 입자고정체는 서로 다른 형태나 패턴으로 이루어지고. 공간적으로 분리된 상기 입자형성홈에 형성된 입자고정체는 서로 형태나 패턴을 가지며, 상기 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머가 포함된다.
상기 기판상에 형성된 반응챔버는 다수 개로 이루어지고, 상기 다수 개의 반응챔버는 하나의 연결채널을 통해 직렬로 연결되며, 상기 연결채널의 일단에는 시료를 주입하기 위한 주입구가 형성되고, 타단에는 시료를 배출하는 배출구가 형성되어, 상기 주입구를 통해 주입되는 시료가 모든 반응챔버로 공급되어 채워진다.
본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 방법은, 멀티플렉스 PCR 방법에 있어서, 다수의 반응챔버가 하나의 연결채널을 통해 직렬로 연결되고 각 반응챔버의 내부에는 공간적으로 분리된 다수의 입자형성홈이 형성되어 있는 PCR 칩을 준비하는 PCR칩준비단계(S110);
상기 다수의 입자형성홈에 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 프라이머와 상기 프라이머와 결합하는 형광염료 및 경화될 때 3차원 망상구조를 형성하는 지지체가 구비된 용액 상태의 프로브를 주입하는 프로브주입단계(S120);
상기 입자형성홈에 주입된 프로브에 물리적 자극을 주어 상기 지지체를 경화시키는 동시에 프라이머를 상기 지지체의 내부에 고착시켜서 상기 입자형성홈에 대응하는 형태의 프로브 입자를 형성하는 프로브입자고정단계(S130);
상기 프로브 입자가 고정된 다수의 반응챔버에 세정액을 주입하여 상기 지지체에 다공을 형성하는 프로브입자세정단계(S140)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 다수의 반응챔버와 연결챔버의 개방부를 밀봉하기 위해서 상기 PCR 칩의 일면에 밀봉 필름을 부착하고 상기 주입구와 배출구의 개구부를 밀봉하기 위해서 스티커를 부착하는 밀봉단계(S150);
상기 주입구를 통해 다수의 반응챔버에 시료를 주입하여 채우는 시료주입단계(S160)와;
상기 PCR 칩을 반복적으로 가열 및 냉각하여 시료에 포함된 특정 염기 서열과 프라이머가 혼성화되어 연쇄적으로 목표 핵산을 복제하고 증폭시킨 후, 상기 다수의 반응챔버를 관통하도록 여기 광을 조사하고 상기 프라이머와 결합한 형광염료에서 발광하는 형광색과 상기 프로브 입자의 위치와 형태를 기초로 한 번에 다수의 목표 유전자를 검출하는 PCR 단계(S170);를 더 포함한다.
상기 기판에 형성된 다수의 입자형성홈의 내측 면에는 상기 입자형성홈의 내부에 형성되는 상기 프로브 입자를 고정할 수 있도록 일정 길이 돌출되게 형성되는 다수 개의 돌기로 이루어진 입자고정체가 구비된다.
상기 입자고정체는 서로 다른 형태나 패턴으로 이루어지며, 공간적으로 분리되어 있는 입자형성홈에 형성된 입자고정체는 서로 형태나 패턴을 가지고, 상기 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머가 포함된다.
본 발명에 따르면 한 번에 여러 개의 타깃 핵산을 동시에 증폭하고 검출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 서로 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 다수의 프로브 입자를 공간적으로 고립시키고, 이들 프로브 입자의 위치에 기초하여 동시다중 검출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 일정량의 프로브를 수용하는 입자형성홈을 반응챔버의 내부에 형성하여 상기 프로브 입자의 크기와 형태를 쉽게 만들 수 있고 공간적으로 분리된 프로브 입자의 위치와 형태를 기초로 동시다중 검출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 프로브 입자를 형성하기 위한 입자형성홈의 바닥과 내측 면에 일정 길이 돌출되는 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체를 형성하여 상기 입자형성홈에 고정된 프로브 입자가 쉽게 분리되지 않도록 고정시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 다수의 프로브 입자를 공간적으로 고립되는 동시에 프로브 입자의 크기, 형태 또는 패턴을 다르게 하거나 입자고정체의 형태 또는 패턴을 서로 다르게 하여 프로브 입자의 위치뿐만 아니라 그 형태와 패턴을 기초로 다양한 종류의 목표 핵산을 동시다중 검출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 다수의 반응챔버를 하나의 연결챔버로 연결하고, 상기 다수의 반응챔버에 고정된 프로브 입자의 표면에 방수 코팅제를 도포하여 PCR 칩에 시료를 주입할 때 한 번의 시료 주입으로 모든 반응챔버에 시료를 채울 수 있도록 함으로써 동시다중 검출을 용이하게 하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 일 예를 보여주는 개략적인 평면도,
도 2는 도 1에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩의 개략적인 단면도,
도 3은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다양한 실시예를 보여주는 평면도,
도 4는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 장치의 일 예를 보여주는 개략적인 단면도,
도 5는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예를 보여주는 개략적인 평면도,
도 6은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예를 보여주는 개략적인 평면도,
도 7은 도 6에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩을 이용한 멀티플렉스 PCR 방법을 보여주는 단면 흐름도이다.
도 2는 도 1에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩의 개략적인 단면도,
도 3은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다양한 실시예를 보여주는 평면도,
도 4는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 장치의 일 예를 보여주는 개략적인 단면도,
도 5는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예를 보여주는 개략적인 평면도,
도 6은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예를 보여주는 개략적인 평면도,
도 7은 도 6에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩을 이용한 멀티플렉스 PCR 방법을 보여주는 단면 흐름도이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술 되는 실시 예를 통해 설명될 것이다. 그러나 본 발명은 여기에서 설명되는 실시 예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 본 실시 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여 제공되는 것이다. 또한, 본 발명의 실시 예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시 예에 대해 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
먼저, 도 1은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 일 예를 보여주는 평면도이고, 도 2는 도 1에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩의 단면도이다. 도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 칩(1)(이하, 'PCR 칩'이라 함)은, 시료 내의 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 다수의 프로브 입자(2)를 공간적으로 분리시키는 동시에 프로브 입자(2)의 형태를 서로 다르게 형성함으로써 프로브 입자(2)의 위치 및 형태에 기초하여 동시다중 검출이 용이하도록 한 것이다.
이를 위해서, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩(1)은, 투명한 플라스틱 소재로 이루어진 기판(3)과, 상기 기판(3)의 일면에 일정한 크기와 깊이로 형성된 하나 또는 하나 이상의 반응챔버(5)와, 상기 반응챔버(5)의 바닥면에 일정한 크기와 깊이로 형성된 하나 또는 하나 이상의 입자형성홈(7)을 포함한다.
그리고 상기 입자형성홈(7)에는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 프라이머와 상기 프라이머와 결합하는 형광염료 및 상기 프라이머가 고착되는 지지체가 포함된 프로브가 주입된다. 따라서 상기 입자형성홈(7)에 주입된 액체 상태의 프로브를 경화시키면 상기 입자형성홈(7)에 대응되는 형태로 프로브 입자(2)가 형성된다.
이때, 상기 입자형성홈(7)은 공간적으로 분리되는 동시에 서로 다른 평면 형태로 이루어질 수 있다. 그러면 상기 입자형성홈(7)에 의해 형성되는 프로브 입자(2)도 공간적으로 고립되는 동시에 서로 다른 형태를 가게 된다.
또한, 상기 입자형성홈(7)의 바닥 또는 내측 면에는 상기 프로브 입자(2)를 고정할 수 있도록 일정 길이로 돌출되는 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)가 형성된다. 상기 입자고정체(9)의 돌기는 다양한 형태로 이루어지고 상기 돌기는 다양한 패턴으로 배치될 수 있다. 따라서 상기 입자형성홈(7)에 의해 형성되는 프로브 입자(2)는 상기 입자고정체(9)가 일체로 결합하여 이탈을 방지하는 동시에 서로 다른 입자형성홈(7)에 형성되는 입자고정체(9)의 형태와 패턴을 서로 다르게 구성함으로써 다양한 종류의 목표 유전자를 서로 구분하여 검출할 수 있다.
한편, 상기 기판(3)의 일 측면에는 상기 반응챔버(5) 내로 시료를 주입할 수 있도록 주입구(6)가 형성되고, 반대편에는 상기 반응챔버(5) 내의 시료를 배출시킬 수 있도록 배출구(8)가 형성된다. 또한, 상기 주입구(6) 및 배출구(8) 사이에는 연결채널이 형성된다. 그리고 상기 기판(3)의 하면에는 밀봉 필름(4)이 부착된다. 상기 밀봉 필름(4)은 박막 필름으로 이루어져 상기 반응챔버(5)의 개방부를 밀봉하는 동시에 반응챔버(5) 내부의 시료에 열이 신속하게 전달되도록 한다. 또한, 상기 필봉 필름(4)의 표면은 친수성으로 처리되어 시료가 원활하게 이동할 수 있게 한다. 그리고 상기 주입구(6)와 배출구(8)의 개구부를 밀봉하기 위한 밀봉스티커(12)가 더 구비될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 칩(1)은, 상기 반응챔버(5)의 내부에 공간적으로 분리된 다수의 입자형성홈(7)을 형성하고 상기 입자형성홈(7)에 대응되는 형태를 갖는 프로브 입자(2)를 공간적으로 분리하여 형성함과 아울러 상기 입자형성홈(7)의 평면 형상을 다양하게 함으로써 서로 다른 형태를 갖는 프로브 입자(2)를 쉽게 구별할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 입자형성홈(7)의 바닥이나 내측면에는 일정 길이 돌출되는 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)를 형성하여 상기 프로브 입자(2)가 쉽게 이탈되는 것을 방지하는 동시에 상기 입자형성체(9)를 구성하는 돌기의 형태와 패턴을 다양하게 구성함으로써 상기 프로브 입자(2)의 위치 및/또는 형태뿐만 아니라 상기 입자고정체(9)의 형태 및 패턴을 기초하여 다양한 종류의 목표 유전자를 동시다중 검출할 수 있게 한다.
더욱 구체적으로, 다시 도 1 및 도 2를 참조하면, 상기 기판(3)은 일정한 두께를 갖고 한 부분 면에는 일정한 크기와 깊이로 하나 또는 하나 이상의 반응챔버(5)가 형성된다. 그리고 상기 반응챔버(5)의 바닥에는 일정 거리 이격되게 다수의 입자형성홈(7)이 형성된다. 따라서 상기 입자형성 홈들은 공간적으로 분리된다.
이때, 상기 입자형성홈(7)은 일정량의 프로브를 수용할 수 있는 크기와 깊이로 이루어진다. 상기 프로브는 시료 내의 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 프라이머와 상기 프라이머와 결합하여 소정 파장의 형광을 발광하는 형광염료 및 액체상태를 유지하다가 경화될 때 3차원 망상구조를 형성될 때 상기 프라이머가 고착되는 지지체를 포함한다.
상기 입자형성홈(7)은 다양한 형상으로 이루어진다. 예를 들어, 상기 입자형성홈(7)의 평면 형상은 사각형, 원형, 오각형 등 다양한 형태로 이루어진다. 따라서 다수의 입자형성홈(7)에 일정량의 프로브를 주입하고 경화시키면, 상기 입자형성홈(7)에 대응하는 형태로 프로브 입자(2)가 형성된다.
또한, 상기 입자형성홈(7)의 내측면에는 상기 프로브 입자(2)를 고정하기 위해 일정 길이 돌출된 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)가 일체로 형성된다. 예를 들어, 상기 입자고정체(9)는 상기 기판(3)을 사출성형할 때 함께 성형 될 수 있다. 바람직하게 상기 입자고정체(9)는 상기 입자형성홈(7)의 표면을 거칠게 하거나 표면적을 확대하여 상기 프로브 입자(2)를 형성할 때 일체로 결합하여 상기 프로브 입자(2)가 분리되지 않도록 한다.
그리고 상기 입자고정체(9)를 구성하는 돌기는 사각형, 원형, 피라미드형 등 다양한 형태로 이루어질 수 있다. 그리고 상기 입자형성홈(7)의 바닥 및/또는 내측 면에 형성되는 돌기들은 다앙한 패턴으로 형성될 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 입자형성홈(7)을 형성하여 프로브 입자(2)를 용이하게 형성할 수 있게 하는 동시에 입자형성홈(7)의 평면 형상을 다양하게 하여 다양한 형태의 프로브 입자(2)를 형성함으로써 프로브 입자(2)를 공간적으로 분리시키는 동시에 형태적으로 구별할 수 있게 하고, 서로 다른 입자형성홈(7)에 서로 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 서로 다른 종류의 프라이머를 주입함으로써 상기 프로브 입자(2)의 위치뿐만 아니라 형태에 기초하여 다수의 목표 유전자를 동시다중 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 반응챔버(5)의 내부에, 공간적으로 분리된 다수의 입자형성홈(7)을 형성하는 동시에 상기 입자형성홈(7)의 내측 면에 상기 프로브 입자(2)를 고정할 수 있도록 돌출되게 형성된 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)의 형태를 형성하여 상기 프로브 입자(2)를 단단히 고정하는 동시에 상기 입자고정체(9)의 형태와 패턴에 따라 서로 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머를 주입함으로써 상기 프로브 입자(2)의 위치와 형태뿐만 아니라 프로브 입자(2)의 내부에 형성된 입자고정체(9)의 형상과 패턴을 기초로 다양한 종류의 목표 유전자를 동시다중 검출할 수 있게 한다.
다시 도 1 및 도 2를 참조하면, 상기 PCR 칩(1)의 기판(3)에는 일정량의 시료를 수용할 수 있도록 일정한 깊이와 크기로 반응챔버(5)가 형성되어 있다. 그리고 상기 반응챔버(5)의 바닥에는 2개의 입자형성홈(7)이 형성되어 있다. 이때, 2개의 입자형성홈(7)은 일정 거리 이격되게 설치되어 공간적으로 분리되어 있다. 예를 들어, 우측에 있는 입자형성홈(7)과 좌측에 있는 입자형성홈(7)에는 서로 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머가 포함된 프로브를 주입하여 프로브 입자(2)를 형성한다.
또한, 상기 입자형성홈(7)은 서로 다른 평면 형상으로 이루어진다. 예를 들어, 좌측에 있는 입자형성홈(7)은 원형의 평면 형상으로 이루어지고, 우측에 있는 입자형성홈(7)은 사가형의 평면 형상으로 이루어진다. 그리고 서로 다른 평면 형상을 하는 입자형성홈(7)에는 서로 다른 종류의 프라이머가 포함된 프로브를 주입하여 프로브 입자(2)를 형성한다.
한편, 상기 프로브 입자(2)에 포함된 지지체는 프라이머를 고정하는 동시에 프로브 입자(2)를 지지하는 역할을 수행한다. 바람직하게, 상기 지지체는 프라이머와 혼합될 수 있도록 액체상태를 유지하되 상기 입자형성홈(7)에 주입된 후에는 프로브 입자(2)를 형성할 수 있도록 겔 또는 고체 상태로 변환될 수 있는 물질로 이루어진다.
바람직하게, 상기 지지체는 3차원의 망상체를 형성하는 다공성 스펀지나 하이드로젤로 이루어질 수 있다. 하이드로젤은 다량의 수분을 함유할 수 있는 3차원의 친수성 고분자 망상구조를 가진 물질을 의미한다. 하이드로젤의 성분은 폴리 비닐 알코올, 폴리 아크릴산 나트륨, 아크릴 레이트 중합체 및 풍부한 친수성기를 갖는 공중 합체를 포함한다. 하이드로젤의 구성요소 중 90% 이상이 수분으로 이루어져 유동성이 있기 때문에 프라이머 등을 혼합할 수 있다. 이러한 하이드로젤은 어떠한 고분자를 주사슬로 정하느냐 또는 가교방식을 무엇으로 정하느냐에 따라 다양한 성질을 나타낼 수 있으며 고분자 사슬 자체의 특성을 이용하거나 고분자 사슬에 특정 작용기를 도입시켜 하이드로젤에 접착성을 도입시킬 수도 있다.
그리고 하이드로젤은 광, 열, 초음파 등의 물리적인 자극을 받으면 쉽게 경화되어 젤 형태로 변한다. 즉, 하이드로젤은 물리적 자극을 받으면 3차원의 망상체를 형성한다. 예를 들어, PEGDA pre-plolymer 용액에 자외선을 2초의 간격을 두고 여러 번 쪼이면 플라스틱 기판에도 하이드로젤 고정체를 고정할 수 있다. 따라서 하이드로젤에 물리적 자극을 가하는 동안에 프라이머는 지지체의 내부에 분산되어 고착된다.
따라서 상기 입자형성홈(7)의 내부에 프로브를 주입한 후 소정의 물리적 자극을 주면, 상기 지지체가 그물모양의 다공체를 형성하면서 굳어져서 프로브 입자(2)를 형성한다. 그리고 상기 프로브 입자(2)를 세정수로 세정하면, 다공체 사이의 통로에 있던 불순물이 씻겨나가면서 다공성의 프로브 입자(2)가 형성된다. 따라서 상기 프로브 입자(2)에는 시료가 통과할 수 있는 수많은 통로가 형성된다. 그리고 프로브 입자(2)의 통로로 삽입된 시료는 상기 프로브 입자(2)에 있는 특정 프라이머와 반응하게 된다. 그리고 상기 프로브 입자(2)에 포함된 형광염료는 외부에서 조사되는 여기광에 반응하여 특정한 파장의 형광을 발광한다.
또한, 프로브 입자(2)는 입자형성홈(7)과 대응되는 형태로 이루어지기 때문에 일반적으로 상기 입자형성홈(7)에서 쉽게 이탈될 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 상기 입자형성홈(7)의 내측 면, 즉, 바닥과 내측 면에 일정한 길이로 돌출되는 다수 개의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)를 형성한다. 그러면, 상기 프로브 입자(2)의 내부에 다수의 돌기가 일체로 결합하여 프로브 입자(2)가 분리되는 것을 방지할 수 있다.
그리고 상기 입자형성홈(7)에 형성되는 입자고정체(9)의 돌기는 원주, 사각기둥, 다이아몬드 등 다양한 형태로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 입자형성홈(7)의 바닥과 내측면에 형성되는 다수의 돌기는 다양한 패턴을 배열될 수 있다.
이와 같이, 입자고정체(9)는 프로브 입자(2)와의 결합을 향상시킬 뿐만 아니라 프로브 입자(2)를 시각적으로 구분할 수 있게 한다. 예를 들어, 프로브 입자(2)를 촬영하면, 프로브 입자(2)의 내부에 결합되어 있는 입자고정체(9)의 형태와 패턴을 시각적으로 구분할 수 있다. 따라서 프로브 입자(2)에 형성된 입자고정체(9)의 형태와 패턴을 기초로 다양한 종류의 핵산 분자를 동시다중 검출할 수 있다.
이어, 도 3은 본 발명에 따른 다양한 종류의 PCR 칩을 보여주는 평면도이다.
도시된 바와 같이, 좌측 상단에 있는 PCR 칩(1)은 하나의 반응챔버(5)에 6개의 원형 입자형성홈(7)이 일정한 간격으로 이격되게 2줄로 배열되어 있다. 그리고 상단에 배열된 입자형성홈(7)의 바닥에는 사각형의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)가 형성되고, 하단에 배열된 입자형성홈(7)의 내부에는 원형의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)가 형성되어 있다. 따라서 상기 입자형성홈(7)의 위치와 입자고정체(9)의 형태에 따라 서로 다른 프라이머를 포함하는 프로브 입자(2)를 형성함으로써 동시다중 검출이 가능하게 된다.
이어, 우측 상단에 있는 PCR 칩(1)도 하나의 반응챔버(5)에 6개의 사각형 입자형성홈(7)이 일정한 간격으로 이격되게 상하 2줄로 배열하고, 상단에 배열된 입자형성홈(7)의 바닥에는 사각형의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)가 형성되고, 하단에 배열된 입자형성홈(7)의 내부에는 원형의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)가 형성된다. 따라서 상기 입자형성홈(7)의 위치와 입자고정체(9)의 형태에 따라 서로 다른 프라이머를 포함하는 프로브 입자(2)를 형성함으로써 동시다중 검출할 수 있게 된다.
이어서, 좌측 하단에 있는 PCR 칩(1)은 하나의 반응챔버(5) 내에 6개의 원형 입자형성홈(7)이 일정한 간격으로 이격되게 상하 2줄로 배열되고, 상단에 배열된 입자형성홈(7)의 내측면에는 일정 길이 수평으로 돌출되는 원형의 돌기가 형성되고, 하단에 배열된 입자형성홈(7)의 바닥에는 일정 길이 수직으로 돌출되는 원형의 돌기가 형성되는 입자고정체(9)가 형성된다. 따라서 상기 입자형성홈(7)의 위치와 입자고정체(9)의 형태 및 패턴에 따라 서로 다른 프라이머를 포함하는 프로브 입자(2)를 형성함으로써 동시다중 검출이 가능하게 된다.
그리고 우측 하단에 있는 PCR 칩(1)은 하나의 반응챔버(5)에 6개의 사각형 입자형성홈(7)이 일정한 간격으로 이격되게 상하 2줄로 배열되고, 상단에 배열된 입자형성홈(7)의 내측면에는 일정 길이 수평으로 돌출되는 삼각형상의 돌기가 형성되고 하단에 배열된 입자형성홈(7)의 바닥에는 수직으로 일정 길이 돌출되는 원형의 돌기가 형성되는 입자고정체(9)가 형성된다. 따라서 상기 입자형성홈(7)의 위치와 입자고정체(9)의 형태 및 패턴에 따라 서로 다른 프라이머가 포함된 프로브 입자(2)를 형성함으로써 동시다중 검출이 가능하게 된다.
이와 같이, 본 발명은 공간적으로 분리되도록 다수의 프로브 입자(2)를 형성하되, 상기 프로브 입자(2)의 형태를 서로 다르게 하고, 상기 프로브 입자(2)의 내부에 형성되는 입자고정체(9)의 형태 및 패턴을 서로 다르게 함으로써 다양한 종류의 핵산 서열을 구분하여 동시다중 검출할 수 있게 한다.
이어, 도 4는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 장치(10)의 바람직한 구조를 보여주는 개략적인 단면도이다. 도시된 바와 같이, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 장치(10)는 크게 히팅 블록(11)과 광원부(13) 그리고 카메라(15)를 포함한다. 히팅블록(11)은 PCR 칩(1)을 일정한 시간 간격으로 가열 및 냉각한다. 이를 위해 PCR 칩(1)은 상기 히팅블록(11)의 상면에 밀착하도록 안착된다. 그리고 PCR 칩(1)의 한쪽 또는 양쪽 측면에는 광원부(13)가 설치된다. 상기 광원부(13)는 소정 파장의 여기 광을 상기 PCR 칩(1)에 형성된 반응챔버(5)를 관통하도록 조사한다. 바람직하게 광원부(13)는 다수 개의 LED로 이루어질 수 있다. 그리고 상기 카메라(15)는 다수의 프로브 입자(2)에서 발광하는 형광을 촬영할 수 있게 배치된다. 즉, 상기 프로브 입자(2)에 특정한 파장의 여기 광이 조사되면, 프라이머와 결합되어 있는 형광염료가 반응하여 특정 파장의 형광이 발광 되게 된다. 따라서 카메라(15)를 이용하여, 프로브 입자(2)에서 발광하는 형광을 촬영하면, 형광색을 이용하여 표적 유전자를 구분할 수 있게 된다.
한편, 도 5는 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예를 보여주는 평면도이다. 도시된 바와 같이, 상기 멀티플렉스 PCR 칩(1)은 광 투과성 플라스틱으로 이루어진 기판(3)과, 상기 기판(3)에 형성된 하나의 반응챔버(5)와, 반응챔버(5)의 내부에 일정한 간격으로 형성된 프로브 입자(2)와, 상기 반응챔버(5) 와 연결되는 주입구(6) 및 배출구(8)를 포함한다. 이때, 상기 프로브 입자(2)는 상기 반응챔버(5)의 내부에 일정 간격 이격되게 형성된 다수의 입자형성홈(7)에 의해서 형성될 수 있다. 이와 같이, 다수의 프로브 입자(2)는 공간적으로 분리되어 있고 서로 다른 프라이머가 포함되어 있기 때문에 각 프로브 입자(2)에서 발광하는 형광색을 검출하여 한 번에 여러 개의 표적 유전자를 동시다중 검출할 수 있다.
이어, 도 6은 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 칩의 다른 실시 예를 보여주는 평면도이다. 도시된 바와 같이, 상기 멀티플렉스 PCR 칩(1)은 광 투과성 플라스틱으로 이루어진 기판(3)과, 상기 기판(3)에 형성된 다수의 반응챔버(5)와, 상기 반응챔버(5)의 내부에 일정한 간격으로 형성된 다수의 프로브 입자(2)와, 상기 다수의 반응챔버(5)를 직렬로 연결하는 하나의 연결채널(21)과, 상기 연결채널(21)의 양단에 각각 형성되는 주입구(6)와 배출구(8)를 포함한다. 이때, 상기 프로브 입자(2)는 상기 반응챔버(5)의 내부에 일정 간격 이격되게 형성된 다수의 입자형성홈(7)에 의해서 형성될 수 있다. 또한, 상기 입자형성홈(7)의 내측면에는 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체(9)가 일체로 형성될 수 있다.
이와 같이, 본 실시 예의 멀티플렉스 PCR 칩은, 하나의 연결채널(21)을 이용하여 다수 개의 반응챔버(5)를 직렬로 연결함으로써 상기 주입구(6)를 통해 주입되는 시료가 모든 반응챔버(5)로 공급되어 채울 수 있게 함으로써 반복적인 피펫팅을 생략할 수 있게 하여 동시다중 검출을 용이하게 한다. 바람직하게 상기 연결채널(21)에는 이웃하는 반응챔버(5) 사이에 시료의 이동을 어느 정도 억제할 수 있도록 다수 개의 굴곡부(21a)를 형성할 수 있다.
도 7은 도 6에 도시된 멀티플렉스 PCR 칩을 이용한 PCR 방법의 바람직한 실시 예를 보여주는 단면 흐름도이다.
도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 방법은, PCR칩준비단계(S110), 프로브주입단계(S120), 프로브입자고정단계(S130) 및 프로브입자세정단계(S140)를 포함한다. 또한, 상기 PCR 방법은 밀봉단계(S150), 시료주입단계(S160), 및 PCR단계(S180)를 더 포함한다. 또한, 상기 프로브입자세정단계(140)의 후단에는 세정된 프로브입자를 건조하는 프로브입자건조단계가 더 포함될 수 있다. 이와 같이, 프로브입자를 건조하면, PC 칩의 보관과 이송이 쉽고 또 보관이나 이송 중에 프로브입자가 오염되는 것을 방지할 수 있다.
구체적으로, 상기 PCR칩준비단계(S110)는, 다수의 반응챔버(5)가 형성되고, 각 반응챔버(5)의 내부에는 다수의 입자형성홈(7)이 일정한 간격으로 형성되며, 하나의 연결채널(21)을 통해 다수의 반응챔버(5)를 직렬로 연결하고 상기 연결채널(21)의 일단에는 주입구(6)가 형성되고 타단에는 배출구(8)가 형성된 PCR 칩(1)을 준비하는 단계이다. 이때, 상기 입자형성홈(7)은 공간적으로 분리되는 동시에 서로 다른 형태로 이루어져 시각적으로 구분할 수 있고, 각 입자형성홈(7)의 내부에는 입자고정체(9)가 일체로 형성될 수 있다. 또한, 상기 입자고정체(9)는 서로 다른 형태나 패턴으로 이루어질 수 있다.
이어 프로브주입단계(S120)는, 상기 PCR 칩(1)의 반응챔버(5) 내부에 형성된 다수의 입자형성홈(7)에 프라이머와 형광염료 및 지지체를 프로브를 주입하는 단계이다. 이때, 공간적으로 분리된 입자형성홈(7)에는 서로 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 프라이머를 주입할 수 있다. 그리고 상기 형광염료는 외부에서 조사되는 여기 광에 반응하여 소정 파장의 형광을 발광한다. 또한, 상기 지지체는 3차원의 친수성 고분자 망상구조를 가진 하이드로젤로 이루어질 수 있다. 상기 하이드로젤은 액체 상태로 이루어져 프라이머와 혼합될 수 있고 물리적 자극을 받을 경우 경화되어 다공성 구조체를 형성한다.
상기 프로브고정단계(S130)는, 상기 입자형성홈(7)에 주입된 프로브에 소정의 물리적 자극을 가해서 지지체가 3차원의 망상구조체로 변형되도록 하는 동시에 이 망상구조체의 내부에 프라이머가 고정되도록 한다. 예를 들어, 프로브에 일정한 온도로 열을 가하거나 자외선을 조사하면, 하이드로젤은 3차원 망상체를 형성하고, 프라이머는 하이드로젤 망상체의 내부에 고착된다. 이때 프로브는 입자형성홈(7)에 대응되는 형태로 고정되어 프로브 입자(2)를 형성한다. 또한, 프로브 입자(2)를 형성하는 과정에는 입자고정체(9)의 돌기들이 상기 프로브 입자(2)의 내부에 일체로 결합되게 된다.
이어서, 상기 프로브세정단계(S140)는 다수의 반응챔버(5)에 세정수를 주입하여 프로브 입자(2)의 다공에 끼여져 있는 불순물을 제거하여 다공성이 확보되도록 한다. 따라서 상기 다공성 프로브 입자(2)는 다수의 통로를 따라 시료가 유입되어 프라이머와 반응할 수 있게 된다.
이어, 상기 밀봉단계(S150)는 PCR 칩(1)의 일면에 밀봉 필름을 부착하여 다수의 반응챔버(5)와 연결채널(21)의 개구부를 밀봉하고 상기 주입구(6)나 배출구(8)의 개방부에 스티커를 부착하여 전체적으로 밀봉한다. 이상의 단계는 실험실과 같은 실내에서 전문가에 의해 수행될 수 있고 이후의 단계들은 혈액 샘플을 채취할 수 있는 현장에서 이루어질 수 있다.
상기 시료주입단계(S160)는 다수의 반응챔버(5)에 시료를 주입하는 단계이다. 이때, 다수의 반응챔버(5)는 연결채널(21)을 통해 직렬로 연결되고, 상기 연결채널(21)의 일단에는 주입구(6)가 형성되고 타단에는 배출구(8)가 형성된 경우에는, 상기 주입구(6)에 시료를 주입하면, 상기 연결채널(21)을 통해 다수의 반응챔버(5)로 시료가 주입되어 한 번의 페이핏팅으로 모든 반응챔버(5)에 시료를 채울 수 있다. 이때, 상기 반응챔버(5)에 형성된 프로브 입자(2)는 방수 코팅제로 코팅되어 있기 때문에 프로브 입자(2)가 녹거나 서로 다른 프라이머가 이동하여 혼합되는 것을 방지한다.
끝으로, 상기 PCR 단계(S170)는 PCR 칩(1)을 반복적으로 가열 및 냉각하여 타깃 핵산 분자를 연쇄적으로 복제, 증폭한 후 증폭 산물을 검출하기 위해서 PCR 칩(1)의 반응챔버(5)를 관통하도록 여기 광을 조사하고, 상기 다수의 프로브 입자(2)에 포함된 형광염료가 여기 광에 반응하여 발광하는 특정 파장의 형광을 카메라(15)로 촬영하고 형광색을 분석함으로써 한 번에 다양한 목표 유전자를 동시다중 검출하는 단계이다.
이와 같이, 본 실시 예의 멀티플렉스 PCR 칩(1)은, 서로 다른 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 다수의 프로브 입자를 공간적으로 고립시키고, 이들 프로브 입자의 위치에 기초하여 동시다중 검출할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 일정량의 프로브를 수용하는 입자형성홈을 반응챔버의 내부에 형성하여 상기 프로브 입자의 크기와 형태를 쉽게 만들 수 있고 공간적으로 분리된 프로브 입자의 위치와 형태를 기초로 동시다중 검출할 수 있는 효과가 있다.
그리고 본 발명은 프로브 입자를 형성하기 위한 입자형성홈의 바닥과 내측 면에 일정 길이 돌출되는 다수의 돌기로 이루어진 입자고정체를 형성하여 상기 입자형성홈에 고정된 프로브 입자가 쉽게 분리되지 않도록 고정할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 다수의 프로브 입자를 공간적으로 고립되는 동시에 프로브 입자의 크기, 형태 또는 패턴을 다르게 하거나 입자고정체의 형태 또는 패턴을 서로 다르게 하여 프로브 입자의 위치뿐만 아니라 그 형태와 패턴을 기초로 다양한 종류의 목표 핵산을 동시다중 검출할 수 있는 효과가 있다.
이상의 본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 이상에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하게 하고 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 오로지 특허청구범위에 기재된 청구항의 범주에 의하여 정의될 뿐이다.
1: 멀티플렉스 PCR 칩 2: 프로브 입자
3: 기판 4: 밀봉 필름
5: 반응챔버 6: 주입구
7: 입자형성홈 9: 입자고정체
10: PCR 장치 11: 히팅 블록
13: 광원부 15: 카메라
21: 연결채널 21a: 굴곡부
3: 기판 4: 밀봉 필름
5: 반응챔버 6: 주입구
7: 입자형성홈 9: 입자고정체
10: PCR 장치 11: 히팅 블록
13: 광원부 15: 카메라
21: 연결채널 21a: 굴곡부
Claims (12)
- 투명한 소재로 이루어진 기판과;
상기 기판상에 일정한 크기와 깊이로 형성된 하나 또는 하나 이상의 반응챔버와;
상기 반응챔버의 내부에 일정량의 액체 상태의 프로브를 수용할 수 있는 크기와 깊이로 형성된 다수의 입자형성홈;을 포함하되, 공간적으로 분리된 서로 다른 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머와 상기 프라이머와 결합하는 형광염료 및 상기 프라이머가 고착되는 지지체가 포함되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩. - 투명한 소재로 이루어진 기판과;
상기 기판상에 일정한 크기와 깊이로 형성된 하나 또는 하나 이상의 반응챔버와;
상기 반응챔버의 내부에 일정량의 액체 상태의 프로브를 수용할 수 있는 크기와 깊이로 형성된 다수의 입자형성홈;을 포함하되, 상기 입자형성홈은 다양한 평면 형상을 하고, 서로 다른 평면 형상을 하는 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머와 상기 프라이머와 결합하는 형광염료 및 상기 프라이머가 고착되는 지지체가 포함되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩. - 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 프로브에 포함된 지지체는 물리적 자극(광, 온도, 초음파)에 의해 3차원의 망구조체를 형성하여 상기 입자형성홈에 대응하는 형태의 프로브 입자를 형성하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩. - 제3 항에 있어서,
상기 입자형성홈의 내부에는 상기 프로브 입자가 이탈되는 것을 방지하기 위한 입자고정체가 형성되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩. - 제4 항에 있어서,
상기 입자고정체는 상기 입자형성홈의 바닥이나 내측 면에서 일정 길이 돌출되게 형성되는 다수의 돌기로 이루어져 상기 프로브 입자와 일체로 결합하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩. - 제4 항에 있어서,
상기 입자고정체는 서로 다른 형태나 패턴으로 이루어지고. 공간적으로 분리된 상기 입자형성홈에 형성된 입자고정체는 서로 형태나 패턴을 가지며, 상기 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머가 포함되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩. - 제2 항에 있어서,
상기 기판상에 형성된 반응챔버는 다수 개로 이루어지고, 상기 다수 개의 반응챔버는 하나의 연결채널을 통해 직렬로 연결되며, 상기 연결채널의 일단에는 시료를 주입하기 위한 주입구가 형성되고, 타단에는 시료를 배출하는 배출구가 형성되어, 상기 주입구를 통해 주입되는 시료가 모든 반응챔버로 공급되어 채워지는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 칩. - 멀티플렉스 PCR 방법에 있어서,
다수의 반응챔버가 하나의 연결채널을 통해 직렬로 연결되고 각 반응챔버의 내부에는 공간적으로 분리된 다수의 입자형성홈이 형성되어 있는 PCR 칩을 준비하는 PCR칩 준비단계(S110);
상기 다수의 입자형성홈에 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 프라이머와 상기 프라이머와 결합하는 형광염료 및 경화될 때 3차원 망상구조를 형성하는 지지체가 구비된 용액 상태의 프로브를 주입하는 프로브주입단계(S120);
상기 입자형성홈에 주입된 프로브에 물리적 자극을 주어 상기 지지체를 경화시키는 동시에 프라이머를 상기 지지체의 내부에 고착시켜서 상기 입자형성홈에 대응하는 형태의 프로브 입자를 형성하는 프로브입자고정단계(S130);
상기 프로브 입자가 고정된 다수의 반응챔버에 세정액을 주입하여 상기 지지체에 다공을 형성하는 프로브입자세정단계(S140);를 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 다수의 반응챔버와 연결챔버의 개방부를 밀봉하기 위해서 상기 PCR 칩의 일면에 밀봉 필름을 부착하고 상기 주입구와 배출구의 개구부를 밀봉하기 위해서 스티커를 부착하는 밀봉단계(S150);
상기 주입구를 통해 다수의 반응챔버에 시료를 주입하여 채우는 시료주입단계(S160)와;
상기 PCR 칩을 반복적으로 가열 및 냉각하여 시료에 포함된 특정 염기 서열과 프라이머가 혼성화되어 연쇄적으로 목표 핵산을 복제하고 증폭시킨 후, 상기 다수의 반응챔버를 관통하도록 여기광을 조사하고 상기 프라이머와 결합한 형광염료에서 발광하는 형광색과 상기 프로브 입자의 위치와 형태를 기초로 한 번에 다수의 목표 유전자를 검출하는 PCR 단계(S170);를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 프로브입자세정단계(S140)에서 세정된 프로브 입자를 건조시키는 프로브입자건조단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 기판에 형성된 다수의 입자형성홈의 내측면에는 상기 입자형성홈의 내부에 형성되는 상기 프로브 입자를 고정할 수 있도록 일정 길이 돌출되게 형성되는 다수 개의 돌기로 이루어진 입자고정체가 구비되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 방법. - 제11 항에 있어서,
상기 입자고정체는 서로 다른 형태나 패턴으로 이루어지며, 공간적으로 분리된 상기 입자형성홈에 형성된 입자고정체는 서로 형태나 패턴을 가지고, 상기 입자형성홈에 주입되는 상기 프로브는 서로 다른 핵산 분자의 서열과 특이적으로 혼성화되는 서로 다른 종류의 프라이머가 포함되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 PCR 방법.
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