JP7209388B2 - マルチプレックスｐｃｒチップ及びこれを用いたマルチプレックスｐｃｒ方法 - Google Patents

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Description

本発明は、多数のターゲット遺伝子を同時に検出することができるマルチプレックスＰＣＲチップ、及びこれを用いたマルチプレックスＰＣＲ方法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）は、核酸分子を含むサンプル溶液を繰り返し加熱及び冷却して、特定の塩基配列を有する部位（ターゲット核酸）を連鎖的に複製して指数関数的に増幅させる技術であって、微量の核酸を増幅、複製してターゲット遺伝子を検出することができるようにする技術である。
このようなＰＣＲ方法は、ＤＮＡ変性ステップ、アニーリングステップ及びＤＮＡ合成ステップを繰り返し行うが、ＤＮＡ変性ステップ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｓｔｅｐ）は、二本鎖の鋳型ＤＮＡが含まれているサンプル溶液を特定の温度、例えば約９５℃で５秒間加熱して二本鎖のＤＮＡを一本鎖のＤＮＡに分離するステップであり、アニーリングステップ（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｓｔｅｐ）は、ＤＮＡ変性ステップの後、サンプル溶液に、増幅しようとする特定の塩基配列と相補的な配列を有するプライマーを注入し、一本鎖のＤＮＡと一緒に、特定の温度、例えば５０℃で５秒間維持して一本鎖のＤＮＡの特定の塩基配列にプライマーを混成化させて部分的なＤＮＡ－プライマー複合体を形成するステップであり、ＤＮＡ合成ステップ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｓｔｅｐ）は、アニーリングステップの後、サンプル溶液をＤＮＡポリメラーゼの活性温度、例えば７２℃で５秒間維持してＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によって部分的なＤＮＡ－プライマー複合体のプライマーを基に二本鎖のＤＮＡを形成するステップである。そして、ターゲット核酸と結合した蛍光色素から発生する蛍光を検出してターゲット核酸を検出することができる。
このようなＰＣＲ方法を適切に行うためには、試薬（プライマー及び蛍光色素）と試料（サンプル溶液）だけでなく、１つまたは複数の反応チャンバーが備えられたＰＣＲチップ、及び前記ＰＣＲチップを加熱及び冷却して増幅反応を誘導し、その結果を測定するＰＣＲ装置が必要である。特に、携帯用リアルタイムＰＣＲ装置では、小さくてフラットな形状のマイクロＰＣＲチップを使用する。マイクロＰＣＲチップは、透明基板に、試薬と試料を収容することができる一つ以上の反応チャンバーが備えられる。そして、前記ＰＣＲ装置には、ターゲット核酸と結合した蛍光色素から発生する蛍光を撮影するためのカメラとが備えられる。
一方、一回の実験で、多数のターゲット遺伝子を検出することを同時多重検出、すなわち、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲという。このようなマルチプレックスＰＣＲのためには、様々な種類の蛍光色素を使用しなければならないが、複数のプライマーからなるプライマーセットといろいろの蛍光色素を区分し、蛍光色素間の干渉を防止することができる複雑なプローブのデザインが要求される。これは、様々な蛍光色による励起と発光波長帯が重なるからである。
このような化学的マルチプレックス方式の問題点を解決するために、最近では、空間的に孤立したシステムを開発している。つまり、特許文献で開示されているように、従来のマルチプレックスＰＣＲチップは、一つの反応チャンバー内に多数のプローブを固着し、前記反応チャンバー内に固定されたプローブ粒子と試料間の反応を誘導して、一度に多数のターゲット核酸を増幅し検出することができるようにする。つまり、反応チャンバー上の互いに異なる位置に互いに異なる種類のプローブを固着させて空間的に分離し、空間的に分離されたプローブに、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化されるプライマーを注入することにより、プローブの位置に基づいて、プローブから発光する蛍光色を分析して同時多重検出することができるようにしたのである。これは、光学装備の大きさを減らし、装備価格を下げることができるだけでなく、検出にかかる時間を短縮することができるなど、効率を向上させることができる。
ところが、従来のマルチプレックスＰＣＲチップは、反応チャンバー上に空間的に分離されたプローブを固着させるとき、すなわち、プライマーが含まれている液体状態のプローブを数滴滴下した後にこれを固着させるとき、プローブ滴が広がってまともなプローブ粒子を形成することが難しいという問題点があった。また、プローブ粒子を形成する場合には、プローブ粒子が脱落しやすいという問題点があった。また、プローブの位置のみでは、様々な組み合わせを得るのに限界があり、検出可能なターゲット遺伝子の数が制限されるという問題点があり、ＰＣＲチップの左右が変わるとプローブの位置が変わるので、同時多重検出が容易ではないという問題点があった。
韓国登録特許第１０－１７２４２８１号公報（登録日：２０１７年４月３日）
本発明は、かかる問題点を解決するためになされたもので、その主な目的は、一度に多数のターゲット核酸を同時に増幅し、検出することができるマルチプレックスＰＣＲチップを提供することにある。
本発明の他の目的は、互いに異なる核酸分子と特異的に混成化する多数のプローブ粒子を空間的に孤立させ、これらのプローブ粒子の位置に基づいて同時多重検出を可能にするマルチプレックスＰＣＲチップを提供することにある。
本発明の別の目的は、ＰＣＲチップの反応チャンバーの内部に、空間的に分離されたプローブ粒子を形成するが、一定量のプローブを収容する粒子形成溝を反応チャンバーの内部に形成して前記プローブ粒子の大きさと形状を容易に作ることができるようにするＰＣＲチップを提供することにある。
本発明の別の目的は、プローブ粒子を形成するための粒子形成溝の底部及び内側面に、一定の長さ突出する多数の突起からなる粒子固定体を形成して、前記粒子形成溝に固定されたプローブ粒子が容易に分離されないように固定するＰＣＲチップを提供することにある。
本発明の別の目的は、核酸分子と特異的に混成化する多数のプローブ粒子を空間的に孤立させるとともに、プローブ粒子の大きさ、形状またはパターンを互いに異なるようにするか、或いは粒子固定体の形状又はパターンを互いに異なるようにして、プローブ粒子の位置だけでなく、その形状とパターンに基づいて、さまざまな種類のターゲット核酸を同時多重検出することができるようにするマルチプレックスＰＣＲチップを提供することにある。
また、本発明の別の目的は、ＰＣＲチップに試料を注入するときに一度の試料注入によりすべての反応チャンバーに試料を充填することができるように、多数の反応チャンバーを一つの連結チャンネルで連結し、前記多数の反応チャンバーに固定されたプローブ粒子の表面に防水コーティング剤を塗布して同時多重検出を行いやすくしたマルチプレックスＰＣＲチップを提供することにある。
また、本発明の別の目的は、前述したマルチプレックスＰＣＲチップを用いたマルチプレックスＰＣＲ方法を提供することにある。
上記の目的を達成するための手段として、本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップは、透明な素材からなる基板と、前記基板上に一定の大きさと深さに形成された一つまたはそれ以上の反応チャンバーと、前記反応チャンバーの内部に一定量の液体状態のプローブを収容することができる大きさと深さに形成された多数の粒子形成溝と、を含み、空間的に分離された互いに異なる粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマー、前記プライマーと結合する蛍光色素、及び前記プライマーが固着される支持体が含まれることを特徴とする。
本発明の他の実施形態として、本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップは、透明な素材からなる基板と、前記基板上に一定の大きさと深さに形成された１つ又はそれ以上の反応チャンバーと、前記反応チャンバーの内部に一定量の液体状態のプローブを収容することができる大きさと深さに形成された多数の粒子形成溝と、を含み、前記粒子形成溝は、様々な平面形状をし、互いに異なる平面形状をする粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマー、前記プライマーと結合する蛍光色素、及び前記プライマーが固着される支持体が含まれることを特徴とする。
本発明において、前記プローブに含まれている支持体は、物理的刺激（光、温度、超音波）によって３次元の網構造体を形成して、前記粒子形成溝に対応する形状のプローブ粒子を形成する。
前記粒子形成溝の内部には、前記プローブ粒子が離脱することを防止するための粒子固定体が形成される。
前記粒子固定体は、前記粒子形成溝の底部または内側面に一定の長さ突出するように設けられる多数の突起で構成され、前記プローブ粒子と一体に結合される。
前記粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンからなり、空間的に分離された前記粒子形成溝に形成された粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンを有し、前記粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマーが含まれる。
前記基板上に形成された反応チャンバーは、多数で構成され、前記多数の反応チャンバーは、一つの連結チャンネルを介して直列に連結され、前記連結チャンネルの一端には、試料を注入するための注入口が設けられ、前記連結チャンネルの他端には、試料を排出する排出口が設けられることにより、前記注入口を介して注入される試料がすべての反応チャンバーに供給されて充填される。
本発明によるマルチプレックスＰＣＲ方法は、マルチプレックスＰＣＲ方法において、多数の反応チャンバーが一つの連結チャンネルを介して直列に連結され、各反応チャンバーの内部には、空間的に分離された多数の粒子形成溝が形成されているＰＣＲチップを準備するＰＣＲチップ準備ステップ（Ｓ１１０）と、前記多数の粒子形成溝に互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化されるプライマー、前記プライマーと結合する蛍光色素、及び硬化されるときに３次元網状構造を形成する支持体が備えられた溶液状態のプローブを注入するプローブ注入ステップ（Ｓ１２０）と、前記粒子形成溝に注入されたプローブに物理的刺激を与えて前記支持体を硬化させるとともにプライマーを前記支持体の内部に固着させ、前記粒子形成溝に対応する形状のプローブ粒子を形成するプローブ粒子固定ステップ（Ｓ１３０）と、前記プローブ粒子が固定された多数の反応チャンバーに洗浄液を注入して前記支持体に多孔を形成するプローブ粒子洗浄ステップ（Ｓ１４０）と、を含むことを特徴とする。
前記多数の反応チャンバーと連結チャンネルの開放部を密封するために、前記ＰＣＲチップの一面に密封フィルムを付着させ、前記注入口と排出口の開口部を密封するためにステッカーを付着させる密封ステップ（Ｓ１５０）と、前記注入口を介して多数の反応チャンバーに試料を注入して充填する試料注入ステップ（Ｓ１６０）と、前記ＰＣＲチップを繰り返し加熱及び冷却して、試料に含まれている特定の塩基配列とプライマーが混成化されて連鎖的にターゲット核酸を複製し、増幅させた後、前記多数の反応チャンバーを貫通するように励起光を照射し、前記プライマーと結合した蛍光色素から発光する蛍光色と前記プローブ粒子の位置及び形状に基づいて一度に多数のターゲット遺伝子を検出するＰＣＲステップ（Ｓ１７０）と、をさらに含む。
前記基板に形成された多数の粒子形成溝の内側面には、前記粒子形成溝の内部に形成される前記プローブ粒子を固定することができるように一定の長さ突出するように設けられる多数の突起からなる粒子固定体が備えられる。
前記粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンで構成され、空間的に分離されている粒子形成溝に形成された粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンを有し、前記粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマーが含まれる。
本発明によれば、一度に多数のターゲット核酸を同時に増幅し、検出することができるという効果がある。
本発明は、互いに異なる核酸分子と特異的に混成化する多数のプローブ粒子を空間的に孤立させ、これらのプローブ粒子の位置に基づいて同時多重検出することができるという効果がある。
本発明は、一定量のプローブを収容する粒子形成溝を反応チャンバーの内部に形成して前記プローブ粒子の大きさ及び形状を容易に作ることができ、空間的に分離されたプローブ粒子の位置及び形状に基づいて同時多重検出することができるという効果がある。
本発明は、プローブ粒子を形成するための粒子形成溝の底面と内側面に、一定の長さ突出する多数の突起からなる粒子固定体を形成して、前記粒子形成溝に固定されたプローブ粒子が容易に分離されないように固定することができるという効果がある。
本発明は、核酸分子と特異的に混成化する多数のプローブ粒子を空間的に孤立させるとともに、プローブ粒子の大きさ、形状またはパターンを互いに異なるようにするか、或いは粒子固定体の形状又はパターンを互いに異なるようにして、プローブ粒子の位置だけでなく、その形状とパターンに基づいてさまざまな種類のターゲット核酸を同時多重検出することができるという効果がある。
本発明は、多数の反応チャンバーを一つの連結チャンネルで連結し、前記多数の反応チャンバー内に固定されたプローブ粒子の表面に防水コーティング剤を塗布して、ＰＣＲチップに試料を注入する際に一度の試料注入ですべての反応チャンバーに試料を充填することができるようにすることにより、同時多重検出を容易にするという効果がある。
本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの一例を示す概略平面図である。 図１に示されたマルチプレックスＰＣＲチップの概略断面図である。 本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの様々な実施形態を示す平面図である。 本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの様々な実施形態を示す平面図である。 本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの様々な実施形態を示す平面図である。 本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの様々な実施形態を示す平面図である。 本発明によるマルチプレックスＰＣＲ装置の一例を示す概略断面図である。 本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの他の実施形態を示す概略平面図である。 本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの他の実施形態を示す概略平面図である。 図６に示されたマルチプレックスＰＣＲチップを用いたマルチプレックスＰＣＲ方法を示す断面フローチャートである。
本発明の利点、特徴、及びそれらを達成する方法は、添付図面と共に詳細に後述される実施形態によって説明される。しかし、本発明は、ここで説明される実施形態に限定されるものではなく、互いに異なる形態で具体化されることもできる。但し、本実施形態は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に本発明の技術思想を容易に実施し得る程度に詳細に説明するために提供されるものである。また、本発明の実施形態を説明するにあたり、関連する公知の構成又は機能に対する具体的な説明が本発明の実施形態についての理解を妨害すると判断された場合には、その詳細な説明は省略する。
まず、図１は本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの一例を示す平面図、図２は図１に示されたマルチプレックスＰＣＲチップの断面図である。図１及び図２に示すように、本発明のマルチプレックスＰＣＲチップ１（以下、「ＰＣＲチップ」という）は、試料内の核酸分子と特異的に混成化する多数のプローブ粒子２を空間的に分離させるとともに、プローブ粒子２の形状が互いに異なるように形成することにより、プローブ粒子２の位置及び形状に基づいて同時多重検出を容易にしたものである。
そのために、本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップ１は、透明なプラスチック素材からなる基板３と、前記基板３の一面に一定の大きさと深さに形成された１つ以上の反応チャンバー５と、前記反応チャンバー５の底面に一定の大きさと深さに形成された１つまたはそれ以上の粒子形成溝７と、を含む。
そして、前記粒子形成溝７には、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化されるプライマー、前記プライマーと結合する蛍光色素、及び前記プライマーが固着される支持体を含むプローブが注入される。従って、前記粒子形成溝７に注入された液体状態のプローブを硬化させると、前記粒子形成溝７に対応する形状にプローブ粒子２が形成される。
この時、前記粒子形成溝７は、空間的に分離されるとともに、互いに異なる平面形状からなることができる。すると、前記粒子形成溝７によって形成されるプローブ粒子２も、空間的に孤立されるとともに、互いに異なる形状を有する。
また、前記粒子形成溝７の底面又は内側面には、前記プローブ粒子２を固定することができるように一定の長さに突出する多数の突起からなる粒子固定体９が形成される。前記粒子固定体９の突起は、様々な形状からなり、前記突起は、様々なパターンで配置できる。よって、前記粒子形成溝７によって形成されるプローブ粒子２は、前記粒子固定体９が一体に結合して離脱を防止するとともに、互いに異なる粒子形成溝７に形成される粒子固定体９の形状とパターンを互いに異なるように構成することにより、様々な種類のターゲット遺伝子を互いに区分して検出することができる。
一方、前記基板３の一側面には、前記反応チャンバー５内に試料を注入することができるように注入口６が形成され、前記基板３の反対側には、前記反応チャンバー５内の試料を排出させることができるように排出口８が形成される。また、前記注入口６と排出口８との間には連結チャンネルが形成される。前記基板３の下面には密封フィルム４が付着する。前記密封フィルム４は、薄膜フィルムからなり、前記反応チャンバー５の開放部を密封するとともに、反応チャンバー５内の試料に熱が速やかに伝達されるようにする。また、前記密封フィルム４の表面は、親水性に処理されて試料がスムーズに移動できるようにする。そして、前記注入口６と排出口８の開口部を密封するための密封ステッカー１２がさらに備えられることができる。
このように、本発明のマルチプレックスＰＣＲチップ１は、前記反応チャンバー５の内部に、空間的に分離された多数の粒子形成溝７を形成し、前記粒子形成溝７に対応する形状を有するプローブ粒子２を空間的に分離して形成するとともに、前記粒子形成溝７の平面形状を多様にすることにより、互いに異なる形状を有するプローブ粒子２を容易に区別することができる。
また、本発明は、前記粒子形成溝７の底面又は内側面には、一定の長さ突出する多数の突起からなる粒子固定体９を形成して、前記プローブ粒子２が容易に離脱することを防止するとともに、前記粒子固定体９を構成する突起の形状とパターンを多様に構成することにより、前記プローブ粒子２の位置及び／又は形状だけでなく、粒子固定体９の形状及びパターンに基づいて、さまざまな種類のターゲット遺伝子を同時多重検出することができるようにする。
より具体的には、再び図１及び図２を参照すると、前記基板３は、一定の厚さを有し、一つの部分面には一定の大きさと深さに一つ又はそれ以上の反応チャンバー５が形成される。そして、前記反応チャンバー５の底部には、一定の距離離隔するように多数の粒子形成溝７が形成される。よって、前記粒子形成溝同士は空間的に分離される。
この時、前記粒子形成溝７は、一定量のプローブを収容することができる大きさと深さに形成される。前記プローブは、試料内の互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化されるプライマー、前記プライマーと結合して所定の波長の蛍光を発光する蛍光色素、及び液体状態を維持してから硬化するときに３次元網状構造を形成すると前記プライマーが固着される支持体を含む。
前記粒子形成溝７は、様々な形状を有する。例えば、前記粒子形成溝７の平面形状は、四角形、円形、五角形などの多様な形状を有する。よって、多数の粒子形成溝７に一定量のプローブを注入して硬化させると、前記粒子形成溝７に対応する形状にプローブ粒子２が形成される。
また、前記粒子形成溝７の内側面には、前記プローブ粒子２を固定するために一定の長さ突出した多数の突起からなる粒子固定体９が一体に形成される。例えば、前記粒子固定体９は、前記基板３を射出成形するときに一緒に成形できる。好ましくは、前記粒子固定体９は、前記粒子形成溝７の表面を粗くするか或いは表面積を拡大して、前記プローブ粒子２を形成するときに一体に結合して前記プローブ粒子２が分離されないようにする。
そして、前記粒子固定体９を構成する突起は、四角形、円形、ピラミッド形などの様々な形状を有することができる。そして、前記粒子形成溝７の底部及び／又は内側面に形成される突起は、多様なパターンで形成できる。
このように、本発明は、粒子形成溝７を形成してプローブ粒子２を容易に形成することができるようにするとともに、粒子形成溝７の平面形状を多様にして多様な形状のプローブ粒子２を形成することにより、プローブ粒子２を空間的に分離させるとともに形態的に区別することができるようにし、互いに異なる粒子形成溝７に、互いに異なる核酸分子と特異的に混成化する互いに異なる種類のプライマーを注入することにより、前記プローブ粒子２の位置だけでなく、形状に基づいて、多数のターゲット遺伝子を同時多重検出することができる。
また、本発明は、反応チャンバー５の内部に、空間的に分離された多数の粒子形成溝７を形成するとともに、前記粒子形成溝７の内側面に前記プローブ粒子２を固定することができるように突設された多数の突起からなる粒子固定体９の形状を形成して、前記プローブ粒子２をしっかりと固定するとともに、粒子固定体９の形状とパターンに応じて、互いに異なる核酸分子と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマーを注入することにより、前記プローブ粒子２の位置及び形状だけでなく、プローブ粒子２の内部に形成された粒子固定体９の形状とパターンに基づいて、さまざまな種類のターゲット遺伝子を同時多重検出することができるようにする。
再び図１及び図２を参照すると、前記ＰＣＲチップ１の基板３には、一定量の試料を収容することができるように一定の深さと大きさに反応チャンバー５が形成されている。そして、前記反応チャンバー５の底部には、２つの粒子形成溝７が形成されている。この時、２つの粒子形成溝７は、一定の距離離隔するように設置されて空間的に分離されている。例えば、右側にある粒子形成溝７と左側にある粒子形成溝７には、互いに異なる核酸分子と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマーが含まれているプローブを注入することにより、プローブ粒子２を形成する。
また、前記粒子形成溝７は、互いに異なる平面形状からなる。例えば、左側にある粒子形成溝７は、円形の平面形状からなり、右側にある粒子形成溝７は、四角形の平面形状からなる。そして、互いに異なる平面形状をする粒子形成溝７には、互いに異なる種類のプライマーが含まれているプローブを注入することにより、プローブ粒子２を形成する。
一方、前記プローブ粒子２に含まれている支持体は、プライマーを固定するとともにプローブ粒子２を支持する役割を果たす。好ましくは、前記支持体は、プライマーと混合できるように液体状態を維持するが、前記粒子形成溝７に注入された後にはプローブ粒子２を形成することができるようにゲル又は固体状態に変換できる物質からなる。
好ましくは、前記支持体は、３次元の網状体を形成する多孔質スポンジ又はハイドロゲルからなることができる。ハイドロゲルは、多量の水分を含有することができる３次元の親水性高分子網状構造を持つ物質を意味する。ハイドロゲルの成分は、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、及び豊富な親水性基を有する共重合体を含む。ハイドロゲルの構成要素のうちの９０％以上が水分からなって流動性があるため、プライマーなどを混合することができる。このようなハイドロゲルは、どの高分子を注鎖として定めるか或いは架橋方式をどれにするかによって様々な性質を示すことができ、高分子鎖自体の特性を用いるか或いは高分子鎖に特定の官能基を導入させてハイドロゲルに接着性を導入することもできる。
そして、ハイドロゲルは、光、熱、超音波などの物理的な刺激を受けると、容易に硬化してゲル状に変わる。すなわち、ハイドロゲルは、物理的刺激を受けると、３次元の網状体を形成する。例えば、ＰＥＧＤＡ ｐｒｅ－ｐｏｌｙｍｅｒ溶液に紫外線を２秒の間隔を置いて複数回照らすと、プラスチック基板にもハイドロゲル固定体を固定することができる。したがって、ハイドロゲルに物理的刺激を加える間に、プライマーは、支持体の内部に分散されて固着される。
従って、前記粒子形成溝７の内部にプローブを注入した後、所定の物理的刺激を与えると、前記支持体が網状の多孔体を形成しながら固まってプローブ粒子２を形成する。前記プローブ粒子２を洗浄水で洗浄すると、多孔体の間の通路にあった不純物が洗い流されながら多孔性のプローブ粒子２が形成される。よって、前記プローブ粒子２には、試料が通過することができる多くの通路が形成される。そして、プローブ粒子２の通路に挿入された試料は、前記プローブ粒子２にある特定のプライマーと反応する。そして、前記プローブ粒子２に含まれている蛍光色素は、外部から照射される励起光に反応して特定の波長の蛍光を発光する。
また、プローブ粒子２は、粒子形成溝７と対応する形状からなるため、一般的に、前記粒子形成溝７から容易に離脱することができる。かかる問題を解決するために、前記粒子形成溝７の内側面、すなわち、底面と内側面に一定の長さに突出する多数の突起からなる粒子固定体９を形成する。すると、前記プローブ粒子２の内部に多数の突起が一体に結合することで、プローブ粒子２が分離されることを防止することができる。
そして、前記粒子形成溝７に形成される粒子固定体９の突起は、円柱、四角柱、ダイヤモンドなどの様々な形状からなることができる。また、前記粒子形成溝７の底部と内側面に形成される多数の突起は、様々なパターンに配列できる。
このように、粒子固定体９は、プローブ粒子２との結合を向上させるだけでなく、プローブ粒子２を視覚的に区分することができるようにする。例えば、プローブ粒子２を撮影すると、プローブ粒子２の内部に結合されている粒子固定体９の形状とパターンを視覚的に区分することができる。したがって、プローブ粒子２に形成された粒子固定体９の形状とパターンに基づいて多様な種類の核酸分子を同時多重検出することができる。
次に、図３Ａ乃至図３Ｄは本発明による様々な種類のＰＣＲチップを示す平面図である。
図示の如く、図３ＡのＰＣＲチップ１は、一つの反応チャンバー５に、６つの円形の粒子形成溝７が一定の間隔で離隔するように２列に配列されている。そして、上段に配列された粒子形成溝７の底部には、四角形の突起からなる粒子固定体９が形成され、下段に配列された粒子形成溝７の内部には、円形の突起からなる粒子固定体９が形成されている。従って、前記粒子形成溝７の位置と粒子固定体９の形状に応じて、互いに異なるプライマーを含むプローブ粒子２を形成することにより、同時多重検出が可能になる。
次に、図３ＢのＰＣＲチップ１も、一つの反応チャンバー５に、６つの四角形の粒子形成溝７が一定の間隔で離隔するように上下２列に配列し、上段に配列された粒子形成溝７の底部には、四角形の突起からなる粒子固定体９が形成され、下段に配列された粒子形成溝７の内部には、円形の突起からなる粒子固定体９が形成される。従って、前記粒子形成溝７の位置と粒子固定体９の形状に応じて、互いに異なるプライマーを含むプローブ粒子２を形成することにより、同時多重検出することができる。
次に、図３ＣのＰＣＲチップ１は、一つの反応チャンバー５に、６つの円形の粒子形成溝７が一定の間隔で離隔するように上下２列に配列され、上段に配列された粒子形成溝７の内側面には、一定の長さに水平に突出する円形の突起が形成され、下段に配列された粒子形成溝７の底部には、一定の長さ垂直に突出する円形の突起が形成される粒子固定体９が形成される。従って、前記粒子形成溝７の位置と粒子固定体９の形状及びパターンに応じて、互いに異なるプライマーを含むプローブ粒子２を形成することにより、同時多重検出が可能になる。
そして、図３ＤのＰＣＲチップ１は、一つの反応チャンバー５に、６つの四角形の粒子形成溝７が一定の間隔で離隔するように上下２列に配列され、上段に配列された粒子形成溝７の内側面には、一定の長さ水平に突出する三角形状の突起が形成され、下段に配列された粒子形成溝７の底部には、垂直に一定の長さ突出する円形の突起が形成される粒子固定体９が形成される。従って、前記粒子形成溝７の位置と粒子固定体９の形状及びパターンに応じて、互いに異なるプライマーが含まれているプローブ粒子２を形成することにより、同時多重検出が可能になる。
このように、本発明は、空間的に分離されるように多数のプローブ粒子２を形成するが、前記プローブ粒子２の形状を互いに異なるようにし、前記プローブ粒子２の内部に形成される粒子固定体９の形状及びパターンを互いに異なるようにすることにより、様々な種類の核酸配列を区分して同時多重検出することができるようにする。
次に、図４は本発明によるマルチプレックスＰＣＲ装置１０の好適な構造を示す概略断面図である。図示の如く、本発明のマルチプレックスＰＣＲ装置１０は、大きくヒーティングブロック１１、光源部１３及びカメラ１５を含む。ヒーティングブロック１１は、ＰＣＲチップ１を一定の時間間隔で加熱及び冷却する。このために、ＰＣＲチップ１は、前記ヒーティングブロック１１の上面に密着するように装着される。そして、ＰＣＲチップ１の一方又は両方の側面には光源部１３が設置される。前記光源部１３は、所定の波長の励起光を、前記ＰＣＲチップ１に形成された反応チャンバー５を貫通するように照射する。好ましくは、光源部１３は、多数のＬＥＤからなることができる。そして、前記カメラ１５は、多数のプローブ粒子２から発光する蛍光を撮影することができるように配置される。すなわち、前記プローブ粒子２に特定の波長の励起光が照射されると、プライマーと結合されている蛍光色素が反応して、特定の波長の蛍光が発光する。したがって、カメラ１５を用いて、プローブ粒子２から発光する蛍光を撮影すると、蛍光色を用いてターゲット遺伝子を区分することができる。
一方、図５は本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの他の実施形態を示す平面図である。図示の如く、前記マルチプレックスＰＣＲチップ１は、光透過性プラスチックからなる基板３と、前記基板３に形成された一つの反応チャンバー５と、反応チャンバー５の内部に一定の間隔で形成されたプローブ粒子２と、前記反応チャンバー５に連結される注入口６及び排出口８を含む。この時、前記プローブ粒子２は、前記反応チャンバー５の内部に一定の間隔離隔するように形成された多数の粒子形成溝７によって形成できる。このように、多数のプローブ粒子２は、空間的に分離されており、互いに異なるプライマーが含まれているので、各プローブ粒子２から発光する蛍光色を検出して一度に多数のターゲット遺伝子を同時多重検出することができる。
次に、図６は本発明によるマルチプレックスＰＣＲチップの他の実施形態を示す平面図である。図示の如く、前記マルチプレックスＰＣＲチップ１は、光透過性プラスチックからなる基板３と、前記基板３に形成された多数の反応チャンバー５と、前記反応チャンバー５の内部に一定の間隔で形成された多数のプローブ粒子２と、前記多数の反応チャンバー５を直列に連結する一つの連結チャンネル２１と、前記連結チャンネル２１の両端にそれぞれ形成される注入口６と排出口８を含む。この時、前記プローブ粒子２は、前記反応チャンバー５の内部に一定の間隔離隔するように形成された多数の粒子形成溝７によって形成できる。また、前記粒子形成溝７の内側面には、多数の突起からなる粒子固定体９が一体に形成できる。
このように、本実施形態のマルチプレックスＰＣＲチップは、一つの連結チャンネル２１を用いて多数の反応チャンバー５を直列に連結することにより、前記注入口６を介して注入される試料がすべての反応チャンバー５に供給されて充填できるようにすることにより、反復的なピペッティングを省略することができるようにして、同時多重検出を容易にする。好ましくは、前記連結チャンネル２１には、隣接する反応チャンバー５の間で試料の移動をある程度抑制することができるように多数の屈曲部２１ａを形成することができる。
図７は図６に示されたマルチプレックスＰＣＲチップを用いたＰＣＲ方法の好適な実施形態を示す断面フローチャートである。
図示の如く、本発明によるマルチプレックスＰＣＲ方法は、ＰＣＲチップ準備ステップ（Ｓ１１０）、プローブ注入ステップ（Ｓ１２０）、プローブ粒子固定ステップ（Ｓ１３０）及びプローブ粒子洗浄ステップ（Ｓ１４０）を含む。また、前記マルチプレックスＰＣＲ方法は、密封ステップ（Ｓ１５０）、試料注入ステップ（Ｓ１６０）、及びＰＣＲステップ（Ｓ１７０）をさらに含む。また、前記プローブ粒子洗浄ステップ（Ｓ１４０）の後段には、洗浄されたプローブ粒子を乾燥させるプローブ粒子乾燥ステップがさらに含まれることができる。このように、プローブ粒子を乾燥させると、ＰＣＲチップの保管と移送が容易であり、保管又は搬送中のプローブ粒子の汚染を防止することができる。
具体的には、前記ＰＣＲチップ準備ステップ（Ｓ１１０）は、多数の反応チャンバー５が形成され、各反応チャンバー５の内部には、多数の粒子形成溝７が一定の間隔で形成され、一つの連結チャンネル２１を介して多数の反応チャンバー５を直列に連結し、前記連結チャンネル２１の一端には注入口６が形成され、前記連結チャンネルの他端には排出口８が形成されたＰＣＲチップ１を準備するステップである。この時、前記粒子形成溝７は、空間的に分離されると同時に、互いに異なる形状からなって視覚的に区分することができ、各粒子形成溝７の内部には、粒子固定体９が一体に形成できる。また、前記粒子固定体９は、互いに異なる形状又はパターンからなることができる。
次に、プローブ注入ステップ（Ｓ１２０）は、前記ＰＣＲチップ１の反応チャンバー５の内部に形成された多数の粒子形成溝７にプライマー、蛍光色素及び支持体を含むプローブを注入するステップである。この時、空間的に分離された粒子形成溝７には、互いに異なる核酸分子と特異的に混成化するプライマーを注入することができる。そして、前記蛍光色素は、外部から照射される励起光に反応して、所定の波長の蛍光を発光する。また、前記支持体は、３次元の親水性高分子網状構造を持つハイドロゲルからなることができる。前記ハイドロゲルは、液体状態からなってプライマーと混合でき、物理的刺激を受ける場合に硬化されて多孔性構造体を形成する。
前記プローブ粒子固定ステップ（Ｓ１３０）は、前記粒子形成溝７に注入されたプローブに所定の物理的刺激を加えて支持体が３次元の網状構造体に変形するようにするとともに、この網状構造体の内部にプライマーが固定されるようにする。例えば、プローブに一定の温度で熱を加えるか或いは紫外線を照射すると、ハイドロゲルは３次元網状体を形成し、プライマーはハイドロゲル網状体の内部に固着される。この時、プローブは、粒子形成溝７に対応する形状に固定されてプローブ粒子２を形成する。また、プローブ粒子２を形成する過程には、粒子固定体９の突起が前記プローブ粒子２の内部に一体に結合される。
次に、前記プローブ粒子洗浄ステップ（Ｓ１４０）は、多数の反応チャンバー５に洗浄水を注入して、プローブ粒子２の多孔に挟まれている不純物を除去して多孔性が確保されるようにする。よって、前記多孔性プローブ粒子２は、多数の通路に沿って試料が流入してプライマーと反応することができる。
その後、前記密封ステップ（Ｓ１５０）は、ＰＣＲチップ１の一面に密封フィルムを付着させて多数の反応チャンバー５と連結チャンネル２１の開放部を密封し、前記注入口６又は排出口８の開口部にステッカーを付着させて全体的に密封する。以上のステップは、実験室などの室内で専門家によって行われることができ、以後のステップは、血液サンプルを採取することができる現場で行われることができる。
前記試料注入ステップ（Ｓ１６０）は、多数の反応チャンバー５に試料を注入するステップである。この時、多数の反応チャンバー５は、連結チャンネル２１を介して直列に連結され、前記連結チャンネル２１の一端には注入口６が形成され、前記連結チャンネルの他端には排出口８が形成された場合には、前記注入口６に試料を注入すると、前記連結チャンネル２１を介して多数の反応チャンバー５に試料が注入されて一回のピペッティングですべての反応チャンバー５に試料を充填することができる。この際、前記反応チャンバー５に形成されたプローブ粒子２は、防水コーティング剤でコーティングされているので、プローブ粒子２が溶けるか或いは互いに異なるプライマーが移動して混合されることを防止する。
最後に、前記ＰＣＲステップ（Ｓ１７０）は、ＰＣＲチップ１を繰り返し加熱及び冷却してターゲット核酸分子を連鎖的に複製、増幅した後、増幅産物を検出するためにＰＣＲチップ１の反応チャンバー５を貫通するように励起光を照射し、前記多数のプローブ粒子２に含まれている蛍光色素が励起光に反応して発光する特定の波長の蛍光をカメラ１５で撮影し、蛍光色を分析することにより、一度に様々なターゲット遺伝子を同時多重検出するステップである。
このように、本実施形態のマルチプレックスＰＣＲチップ１は、互いに異なる核酸分子と特異的に混成化する多数のプローブ粒子を空間的に孤立させ、これらのプローブ粒子の位置に基づいて同時多重検出することができるという効果がある。また、本発明は、一定量のプローブを収容する粒子形成溝を反応チャンバーの内部に形成して、前記プローブ粒子の大きさと形状を容易に作ることができ、空間的に分離されたプローブ粒子の位置と形状に基づいて同時多重検出することができるという効果がある。
そして、本発明は、プローブ粒子を形成するための粒子形成溝の底部と内側面に、一定の長さ突出する多数の突起からなる粒子固定体を形成して、前記粒子形成溝に固定されたプローブ粒子が容易に分離されないように固定することができるという効果がある。また、本発明は、核酸分子と特異的に混成化する多数のプローブ粒子を空間的に孤立させるとともに、プローブ粒子の大きさ、形状又はパターンを互いに異なるようにするか、或いは粒子固定体の形状又はパターンを互いに異なるようにして、プローブ粒子の位置だけではなく、その形状とパターンに基づいてさまざまな種類のターゲット核酸を同時多重検出することができるという効果がある。
以上の本明細書と図面には、本発明の好適な実施形態について開示した。特定の用語が使用されたが、これは単に本発明の技術内容を容易に説明し、発明の理解を助けるための一般的な意味で使用されたものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。また、本発明は、以上で開示される実施形態に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で実現できる。ただし、本実施形態は、本発明の開示を完全たるものにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、特許請求の範囲に記載された請求項の範疇よって定義されるだけである。
１ マルチプレックスＰＣＲチップ
２ プローブ粒子
３ 基板
４ 密封フィルム
５ 反応チャンバー
６ 注入口
７ 粒子形成溝
９ 粒子固定体
１０ ＰＣＲ装置
１１ ヒーティングブロック
１３ 光源部
１５ カメラ
２１ 連結チャンネル
２１ａ 屈曲部

Claims (9)

  1. 透明な素材からなる基板と、
    前記基板上に一定の大きさと深さに形成された一つまたはそれ以上の反応チャンバーと、
    前記反応チャンバーの内部に一定量の液体状態のプローブを収容することができる大きさと深さに形成された多数の粒子形成溝と、を含み、
    空間的に分離された互いに異なる粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマー、前記プライマーと結合する蛍光色素、及び前記プライマーが固着される支持体が含まれ、
    前記プローブに含まれている支持体は、物理的刺激（光、温度、超音波）によって３次元の網構造体を形成して、前記粒子形成溝に対応する形状のプローブ粒子を形成し、
    前記粒子形成溝の内部には、前記プローブ粒子が離脱することを防止するための粒子固定体が形成されることを特徴とする、マルチプレックスＰＣＲチップ。
  2. 透明な素材からなる基板と、
    前記基板上に一定の大きさと深さに形成された１つ又はそれ以上の反応チャンバーと、
    前記反応チャンバーの内部に一定量の液体状態のプローブを収容することができる大きさと深さに形成された多数の粒子形成溝と、を含み、
    前記粒子形成溝は、様々な平面形状をし、互いに異なる平面形状をする粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマー、前記プライマーと結合する蛍光色素、及び前記プライマーが固着される支持体が含まれ、
    前記プローブに含まれている支持体は、物理的刺激（光、温度、超音波）によって３次元の網構造体を形成して、前記粒子形成溝に対応する形状のプローブ粒子を形成し、
    前記粒子形成溝の内部には、前記プローブ粒子が離脱することを防止するための粒子固定体が形成されることを特徴とする、マルチプレックスＰＣＲチップ。
  3. 前記粒子固定体は、前記粒子形成溝の底部または内側面に一定の長さ突出するように設けられる多数の突起で構成され、前記プローブ粒子と一体に結合することを特徴とする、請求項１又は２に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
  4. 前記粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンからなり、空間的に分離された前記粒子形成溝に形成された粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンを有し、前記粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマーが含まれることを特徴とする、請求項１又は２に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
  5. 前記基板上に形成された反応チャンバーは、多数で構成され、前記多数の反応チャンバーは、一つの連結チャンネルを介して直列に連結され、前記連結チャンネルの一端には、試料を注入するための注入口が設けられ、前記連結チャンネルの他端には、試料を排出する排出口が設けられることにより、前記注入口を介して注入される試料がすべての反応チャンバーに供給されて充填されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のマルチプレックスＰＣＲチップ。
  6. マルチプレックスＰＣＲ方法であって、
    多数の反応チャンバーが一つの連結チャンネルを介して直列に連結され、各反応チャンバーの内部には、空間的に分離された多数の粒子形成溝が形成されているＰＣＲチップを準備するＰＣＲチップ準備ステップ（Ｓ１１０）と、
    前記多数の粒子形成溝に互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化されるプライマー、前記プライマーと結合する蛍光色素、及び硬化されるときに３次元網状構造を形成する支持体が備えられた溶液状態のプローブを注入するプローブ注入ステップ（Ｓ１２０）と、
    前記粒子形成溝に注入されたプローブに物理的刺激を与えて前記支持体を硬化させるとともにプライマーを前記支持体の内部に固着させ、前記粒子形成溝に対応する形状のプローブ粒子を形成するプローブ粒子固定ステップ（Ｓ１３０）と、
    前記プローブ粒子が固定された多数の反応チャンバーに洗浄液を注入して前記支持体に多孔を形成するプローブ粒子洗浄ステップ（Ｓ１４０）と、を含み、
    前記多数の粒子形成溝の内側面には、前記粒子形成溝の内部に形成される前記プローブ粒子を固定することができるように一定の長さ突出するように設けられる多数の突起からなる粒子固定体が備えられることを特徴とする、マルチプレックスＰＣＲ方法。
  7. 前記多数の反応チャンバーと連結チャンネルの開放部を密封するために前記ＰＣＲチップの一面に密封フィルムを付着させ、前記連結チャンネルの一端に設けられる注入口の開口部と前記連結チャンネルの他端に設けられる排出口の開口部を密封するためにステッカーを付着させる密封ステップ（Ｓ１５０）と、
    前記注入口を介して多数の反応チャンバーに試料を注入して充填する試料注入ステップ（Ｓ１６０）と、
    前記ＰＣＲチップを繰り返し加熱及び冷却して、試料に含まれている特定の塩基配列とプライマーが混成化されて連鎖的にターゲット核酸を複製し、増幅させた後、前記多数の反応チャンバーを貫通するように励起光を照射し、前記プライマーと結合した蛍光色素から発光する蛍光色と前記プローブ粒子の位置及び形状に基づいて一度に多数のターゲット遺伝子を検出するＰＣＲステップ（Ｓ１７０）と、をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載のマルチプレックスＰＣＲ方法。
  8. 前記プローブ粒子洗浄ステップ（Ｓ１４０）で洗浄されたプローブ粒子を乾燥させるプローブ粒子乾燥ステップをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載のマルチプレックスＰＣＲ方法。
  9. 前記粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンで構成され、空間的に分離されている粒子形成溝に形成された粒子固定体は、互いに異なる形状又はパターンを有し、前記粒子形成溝に注入される前記プローブは、互いに異なる核酸分子の配列と特異的に混成化される互いに異なる種類のプライマーが含まれることを特徴とする、請求項６に記載のマルチプレックスＰＣＲ方法。
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