KR20080063837A - Ｓｙｋ 억제제로서의 피롤로피리미딘 유도체 - Google Patents

Ｓｙｋ 억제제로서의 피롤로피리미딘 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비장 티로신 키나아제 (Spleen Tyrosine kinase, Syk)의 억제제로서, 부적절한 Syk 활성과 관련된 질병 및 질환, 특히 염증 및 알레르기 질병의 치료에서 잠재적 치료 이익을 지니는 하기 화학식(I)의 피롤로피리미딘 유도체에 관한 것이다:

Description

ＳＹＫ 억제제로서의 피롤로피리미딘 유도체 {PYRROLOPYRIMIDINE DERIVATIVES AS SYK INHIBITORS}
본 발명은 피롤로피리미딘 유도체, 이러한 화합물을 함유하는 조성물 및 약제 뿐만 아니라 이러한 화합물, 조성물 및 약제를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 피롤로피리미딘 유도체는 부적절한 Syk 활성과 관련된 질병 및 질환, 특히 염증 및 알레르기 질병의 치료에서 잠재적 치료 이익을 지닌다.
비장 티로신 키나아제 (Spleen Tyrosine Kinase, Syk)는 비만 세포, B-세포, 대식구 및 호중구를 포함하는 다수의 염증 세포에서 면역수용체 신호전달의 핵심 매개체로서 공지된 단백질 티로신 키나아제이다.
Fc 수용체 및 B-세포 수용체를 포함하는 이러한 면역수용체는 알레르기 질병 및 항체 매개성 자가면역 질병 둘 모두에 있어서 중요하며, 이에 따라 Syk를 약리학적으로 간섭하는 것은 이러한 장애를 치료할 수 있을 것이다.
알레르기성 비염 및 천식은 비만 세포, 호산구, T 세포 및 수지상 세포를 포함하는 다수의 세포 유형을 포함하는 과민성 반응 및 염증 사고와 관련된 질병이다. 알레르겐에 노출된 후, IgE (FcεRI) 및 IgG (FcεRI)에 대한 고친화성 면역글로불린 수용체는 교차결합하여 비만 세포 및 다른 세포 유형에서 다운스트림 프 로세스 (downstream process)를 활성화시킴으로써, 염증촉진(pro-inflammatory) 매개체 및 기도 스패스모겐(spasmogen)의 방출을 초래한다. 예를 들어 비만 세포에서, 알레르겐에 의한 IgE 수용체 교차결합은 사전형성된 과립으로부터 히스타민을 포함하는 매개체의 방출을 초래할 뿐만 아니라 프로스타글란딘 및 류코트리엔을 포함하는 새로 합성된 지질 매개체의 합성 및 방출을 초래한다.
Syk 키나아제는 FcεR1 및/또는 FcεR1 수용체를 교차결합시키는 것과 관련된 다운스트림 세포 신호를 전달하는데 있어서 중요한 수용체 비결합성 (non-receptor linked) 티로신 키나아제이며, 신호전달 케스케이드에서 초기에 위치한다. 예를 들어 비만 세포에서, 수용체-IgE 복합체의 알레르겐 교차결합 후의 FcεR1 신호전달의 초기 순서는 최초에는 Lyn (Src 패밀리 티로신 키나아제)이고 그 다음 Syk를 포함한다.
따라서, Syk 활성의 억제제는 모든 다운스트림 신호전달 케스케이드를 억제함으로써 염증촉진 매개체 및 스패스모겐의 방출에 의해 개시되는 즉시형 알레르기 반응 및 유해 사고를 완화시킬 것으로 예상된다 (Wong et al 2004, Expert Opin, Expert Opin. Investig. Drugs (2004) 13 (7) 743-762).
최근, 알레르기성 비염의 치료를 위한 I/II상 실험에서 비내 투여된 Syk 키나아제 억제제 R112 (Rigel)가 알레르기성 콧물의 개선과 매우 관련이 있는 핵심 면역 매개체인 PGD2의 통계적으로 유의할 만한 감소를 제공할 뿐만 아니라 일정 범위의 지표에 걸쳐 안전한 것으로 밝혀졌는데, 이는 국소용 Syk 키나아제 억제제의 임상적 안전성 및 효능에 대한 최초의 증거를 제공한다 (Melzer, Eli O.; Berkowitz, Robert B.; Grossbard, Elliott B, Journal of Allergy and Clinical Immunology (2005), 115(4), 791-796). 알레르기성 비염에 대한 보다 최근의 임상 II상 시험 (Clinical Trials.gov Identifier NCT0015089)에서, R112는 위약과 비교하여 효능이 없는 것으로 나타났다
류마티스 관절염 (RA)는 인구의 약 1%에 영향을 미치는 자가면역 질병이다. 이는 뼈 및 연골의 쇠약성 파괴를 초래하는 관절부의 염증을 특징으로 한다. 가역적 B 세포 고갈을 야기하는 리툭시맙(Rituximab)을 사용한 최근의 임상 실험 (J.C.W. Edwards et al 2004, New Eng. J. Med. 350: 2571-2581) 결과, B 세포 기능을 표적화하는 것이 RA와 같은 자가면역 질병에서 적절한 치료 전략인 것으로 밝혀졌다. 임상적 이익은 자가반응 항체 (또는 류마티스 인자)의 감소와 관련되고, 이러한 실험은 B 세포 기능 및 사실상 자가항체 생성이 질병의 진행중인 병상에 중추적임을 암시한다.
비장 티로신 키나아제 (Syk)가 부족한 마우스로부터의 세포를 사용한 실험은 B 세포 기능에서 이러한 키나아제의 비중복적 역할을 입증하였다. Syk의 부족은 B 세포 발달의 차단을 특징으로 한다 (M. Turner et al 1995 Nature 379: 298-302 및 Cheng et al 1995, Nature 378: 303-306). 이들 실험은 Syk가 부족한 성숙 B 세포에 대한 실험 (Kurasaki et al 2000, Immunol. Rev. 176:19-29)와 함께 Syk가 B 세포의 분화 및 활성화를 위해 필요함을 입증한다. 그러므로, RA 환자에서 Syk를 억제하는 것은 B 세포 기능을 차단함으로써 류마티스 인자 생산을 감소시키는 것으로 여겨진다. B 세포 기능에서의 Syk의 역할 이외에, RA의 치료와 추가로 관련되는 것은 Fc 수용체 (FcR) 신호전달에서 Syk 활성을 위한 요건이다. RA에서 면역 복합체에 의한 FcR 활성화는 다수의 염증촉진 매개체의 방출에 기여하는 것으로 암시되어 왔다.
본 발명은 Syk 키나아제 활성의 억제제인 신규한 피롤로피리미딘 화합물에 관한 것이다. 따라서, 이러한 피롤로피리미딘 유도체는 부적절한 Syk 활성과 관련된 장애의 치료, 특히 Syk에 의해 매개되는 질병 상태의 치료 및 예방에서 잠재적 치료 이익을 지닌다. 이러한 질병 상태로는 염증, 알레르기 및 자가면역 질병, 예를 들어 천식, 만성폐쇄폐질환 (COPD), 성인 호흡곤란 증후군 (ARDS), 궤양 결장염, 크론병, 기관지염, 피부염, 알레르기성 비염, 건선, 피부경화증, 두드러기, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 암, HIV 및 루푸스가 있을 수 있다.
발명의 개요
본 발명의 한 가지 일면에서, 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물이 제공된다:
Figure 112008033845667-PCT00001
상기 식에서,
R1은 H 또는 C1-3알킬이고;
R2는 C1-6알킬, C1-6할로알킬, C3-7시클로알킬, 또는 C1-3알킬렌C3-7시클로알킬이며, 여기서 각각의 시클로알킬은 C1-3알킬 또는 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있고;
R3는,
(a) 3-피리디닐, 4-피리디닐 또는 5-피리디닐 (이들 각각은 OH, =O, C1-3알킬, NHCOC1-3알킬, C1-6알콕시, COC1-6알킬, C0-3알킬렌 COOC1-3알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되거나 비치환될 수 있음)로부터 선택된 6원 헤테로아릴기;
(b) 기
Figure 112008033845667-PCT00002
(여기서, P 및 Q는 함께 5원 내지 7원 카르보시클릭, 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성하며, 이러한 고리는 다음과 같은 치환기로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되거나 비치환될 수 있는데, 각각의 탄소에서 2개 이하의 C1-3알킬기 또는 불소에 의해 또는 =O에 의해 또는 OH, C1-3알콕시, C1-3할로알킬, C0-3알킬렌NR5R6에 의해, 각각의 질소에서 C1-3알킬, COC1-3알킬, C1-3알킬렌C3-7시클로알킬, 페닐 (불소에 의해 치환되거나 비치환됨) 또는 C0-3알킬렌NR5R6에 의해 또는 황에서 =O 또는 (=O)2에 의해 치환되거나 비치환될 수 있고;
R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 C1-3알킬임);
(c) 기
Figure 112008033845667-PCT00003
(여기서, R, S 및 T 중 하나는 H이고, 나머지 변수는 H, C1-6알킬, C1-6할로알콕시, OH, C1-6히드록시알킬, CN, C3-7시클로알킬, O페닐, OCH2페닐, 할로겐, COOR7, C1-3알킬렌COOR7, XNR8R9, XCONR8R9, XSO2NR8R9, NR7COC1-6알킬, NR7SO2C1-6알킬, OCH2CONR8R9, SO2C1-3알킬, 모노시클릭 헤테로아릴기 (메틸에 의해 치환되거나 비치환됨)로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 H 또는 -C1-3알킬이고;
X는 결합 또는 C1-3알킬렌이고;
R8 및 R9는 독립적으로 H, C1-6알킬, C1-6할로알킬, C1-6히드록시알킬, C3-7시클로알킬, C1-3알킬렌C3-7시클로알킬, 페닐 (할로겐, -C1-3알킬, CN, 또는 SO2CF3로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되거나 비치환됨), C1-3알킬렌페닐, C1-3알킬렌OC1-3알킬이거나;
R8 및 R9는 이들이 결합되어 있는 N과 함께 4원, 5원 또는 6원 헤테로시클릭기를 형성하는데, 이러한 헤테로시클릭기는 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 함유하거나 비함유하며, 각각의 탄소에서 2개 이하의 C1-6알킬 또는 할로겐에 의해, 또는 =O 또는 C1-6알콕시에 의해, 임의의 질소에서 C1-6알킬, COC1-3알킬 또는 COOC1-6알킬에 의해 및 임의의 황에서 =O, (=O)2에 의해 치환되거나 비치환되고;
R4는 H 또는 -C1-3알킬임)이다.
본 발명의 추가 일면에서, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 일면에서, 치료에 사용되는 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물이 제공된다.
본 발명의 추가 일면에서, 부적절한 Syk 활성에 의해 매개되는 질병 또는 질환의 치료에 사용되는 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물이 제공된다.
본 발명의 추가 일면에서, 부적절한 Syk 활성에 의해 매개되는 질병 또는 질환의 치료에 사용되는 약제의 제조에 있어서 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물의 용도가 제공된다.
발명의 상세한 설명
본원에 사용된 "유효량"이란 용어는 연구원 또는 임상의가 얻고자 하는 조직, 계통, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도시키는 약물 또는 약제의 양을 의미한다. 또한, "치료적 유효량"이란 용어는 그러한 양이 투여되지 않은 상응하는 피검체와 비교하여 질병, 장애 또는 부작용의 치료, 치유, 예방 또는 개선을 향상시키거나 질병 또는 장애의 진행 속도의 감소를 일으키는 임의의 양을 의미한다. 또한, 이러한 용어는 이의 범위내에서 정상적 생리 기능을 향상시키는데 유효한 양을 포함한다.
본원에 사용된 "알킬"이란 용어는 지정된 수의 탄소 원자를 지닌 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 본원에 사용된 "C1-C3알킬" 및 "C1-C6알킬"이란 용어는 각각 탄소 원자를 1개 이상 3개 또는 6개 이하로 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 본원에 사용된 "알킬"의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸 등이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "알킬렌"이란 용어는 지정된 수의 탄소 원자를 지닌 직쇄 또는 분지쇄의 2가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 본원에 사용된 "C1-C3알킬렌" 및 "C1-C6알킬렌"이란 용어는 각각 탄소 원자를 1개 이상 3개 또는 6개 이하로 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬렌기를 의미한다. 본원에 사용된 "알킬렌"의 예로는 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, n-부틸렌 등이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "할로겐"이란 용어는 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I)를 의미하고, "할로"란 용어는 할로겐 라디칼, 즉, 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 및 요오도(-I)를 의미한다.
본원에 사용된 "할로알킬"이란 용어는 하나 이상의 할로기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미하며, 여기서 할로는 본원에 정의된 바와 같다. 본 발명에서 유용한 이러한 분지쇄 또는 직쇄 할로알킬기의 예로는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도와 같은 하나 이상의 할로로 독립적으로 치환된 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸 및 n-부틸이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "시클로알킬"이란 용어는 지정된 수의 탄소 원자를 함유하는 비방향족 시클릭 탄화수소 고리를 의미한다. 유사한 방식으로, "C3-C7시클로알킬"이란 용어는 3개 내지 7개의 탄소 원자를 지닌 비방향족 시클릭 탄화수소 고리를 의미한다. 본 발명에서 유용한 예시적인 "시클로알킬"기로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "카르보시클릭"이란 용어는 탄소 및 수소 원자를 함유하는 비방향족 고리를 의미하며, 이러한 고리는 포화되거나 하나 이상의 불포화결합을 지닌다.
본원에 사용된 "헤테로시클릭" 또는 "헤테로시클릴"이란 용어는 비바향족 헤테로시클릭 고리를 의미하는데, 이러한 고리는 포화되거나 하나 이상의 불포화결합을 지니고, S, S(O), S(O)2, O 또는 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자 치환기를 함유하며, 지정된 수의 고리 구성원을 지닌다.
본원에 사용된 "알콕시"란 용어는 RaO- 기를 의미하는데, 여기서 Ra는 상기 정의된 바와 같은 알킬이고, "C1-C3알콕시" 및 "C1-C6알콕시"란 용어는 본원에 정의된 바와 같은 알콕시기를 의미하는데, 여기서 알킬 부분은 탄소 원자를 1개 이상이고 3개 또는 6개 이하로 함유한다. 본 발명에서 유용한 예시적인 "C1-C3알콕시" 및 "C1-C6알콕시"기로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시 및 t-부톡시가 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "할로알콕시"란 용어는 RaO- 기를 의미하는데, 여기서 Ra는 상기 정의된 바와 같은 할로알킬이고, "C1-C6할로알콕시"란 용어는 본원에 정의된 바와 같은 할로알콕시기를 의미하는데, 여기서 할로알킬 부분은 탄소 원자를 1개 이상이고 6개 이하로 함유한다. 본 발명에서 유용한 예시적인 C1-C6할로알콕시기로는 트리플루오로메톡시가 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "히드록시"란 용어는 -OH 기를 의미한다.
"헤테로아릴"이란 용어는 달리 명시되지 않는 한 지정된 수의 고리 구성원 (예를 들어, 탄소 및 헤테로원자 N, O 및/또는 S)을 지니며 N, O 및 S로부터 선택된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 헤테로원자를 함유하는, 방향족 모노시클릭기 및 융합 바이시클릭 방향족 고리를 의미한다. 특정 헤테로아릴기의 예로는 푸란, 티오펜, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 옥사디아졸, 티아디아졸, 이소티아졸, 피리딘, 피리다진, 피라진, 피리미딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈아제핀, 벤즈이미다졸, 벤조이미다졸, 인돌, 옥신돌 및 인다졸이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "히드록시알킬"이란 용어는 하나 이상의 히드록시로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬을 의미하며, 여기서 히드록시는 본원에 정의된 바와 같다. 본 발명에 유용한 분지쇄 또는 직쇄 "C1-C6히드록시알킬"기의 예로는 하나 이상의 히드록시기로 독립적으로 치환된 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸 및 n-부틸이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "임의로"라는 용어는 후속 기술된 사건(들)이 일어나거나 일어나지 않을 수 있음을 의미하고, 일어나는 사건(들) 및 일어나지 않는 사건들 둘 모두를 포함한다.
본원에 사용된 "치환된"이라는 용어는 지시된 치환기(들)에 의한 치환을 의미하며, 여기서 달리 언급되지 않는 한 다수의 치환이 허용된다.
"Syk 억제제"라는 용어는 Syk 수용체를 억제하는 화합물을 의미하기 위해 사용된다.
"Syk 매개성 질병" 또는 "부적절한 Syk 활성에 의해 매개되는 장애 또는 질병 또는 질환"은 Syk 키나아제 메커니즘에 의해 매개되거나 조절되는 임의의 질병 상태를 의미하기 위해 사용된다. 이러한 질병 상태로는 염증, 알레르기 및 자가면역 질병, 예를 들어 천식, 만성폐쇄폐질환 (COPD), 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDs), 궤양 결장염, 크론병, 기관지염, 피부염, 알레르기성 비염, 건선, 피부경화증, 두드러기, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 암, HIV 및 루푸스, 특히 천식, 만성 페쇄성 폐 질병 (COPD), 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDs), 알레르기성 비염 및 류마티스 관절염이 있을 수 있다.
본원에 사용된 "본 발명의 화합물"이란 용어는 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 작용성 유도체를 의미한다.
본원에 사용된 "용매화물"이란 용어는 용질 (본 발명의 경우, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염) 및 용매에 의해 형성된 가변적 화학량론의 복합체를 의미한다. 본 발명을 위한 이러한 용매는 용질의 생물학적 활성을 간섭하지 않을 수 있다. 적합한 용매의 예로는 물, 아세톤, 메탄올, 에탄올 및 아세트산이 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 사용된 용매는 약제학적으로 허용되는 용매이다. 적합한 약제학적으로 허용되는 용매의 예로는 물, 에탄올 및 아세트산이 있다. 가장 바람직하게는, 용매는 물이다.
화학식 (I)의 화합물은 다형성(polymorphism)으로 공지된 특성인 한 가지 형태 이상으로 결정화하는 능력을 지닐 수 있고, 이러한 다형 형태 ("다형체")는 화학식 (I)의 범위에 속하는 것으로 이해된다. 다형성은 온도, 압력 또는 둘 모두의 변화에 대한 반응으로서 일어날 수 있고, 또한 결정화 작용의 변화에 기인할 수 있다. 다형체는 x-선 회절 패턴, 용해도 및 융점과 같은 당 분야에 공지된 다양한 물리적 특성에 의해 구별될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 중 일부는 하나 이상의 키랄 원자를 함유할 수 있거나, 그렇지 않은 경우 2개의 거울상이성질체로서 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 거울상이성질체의 혼합물 뿐만 아니라 정제된 거울상이성질체 또는 거울상이성질체로 농축된 혼합물을 포함한다. 또한, 본 발명의 범위에 속하는 것으로는 상기 화학식 (I)로 표현되는 화합물의 개별 이성질체 뿐만 아니라 이들이 전체적으로 또는 부분적으로 평형을 이룬 임의의 혼합물이 있다. 또한, 본 발명은 상기 화학식으로 표현되는 화합물의 개별 이성질체를 하나 이상의 키랄 중심이 뒤집어진 이의 이성질체와의 혼합물로서 포함한다.
화학식 (I)의 화합물이 토토머를 형성할 수 있다는 것이 또한 주목된다. 본 발명의 화합물의 모든 토토머 및 이들의 혼합물이 본 발명의 화합물의 범위에 포함되는 것으로 이해된다.
한 가지 구체예에서, R1은 H 또는 메틸을 나타낸다. 추가의 구체예에서, R1은 H를 나타낸다.
한 가지 구체예에서, R2는 C1-3알킬, 예를 들어 1-메틸에틸을 나타낸다. 추가의 구체예에서, R2는 C1-3할로알킬, 예를 들어 1-트리플루오로에틸을 나타낸다.
한 가지 구체예에서, R1은 H를 나타내고, R2는 C1-3알킬, 예를 들어 1-메틸에틸이다. 추가의 구체예에서, R1은 H를 나타내고, R2는 C1-3할로알킬, 예를 들어 1-트리플루오로에틸이다.
한 가지 구체예에서, R4는 H 또는 CH3이다. 추가의 구체예에서, R4는 H이다.
한 가지 구체예에서, R3는 하기 기이다:
Figure 112008033845667-PCT00004
여기서, R, S 및 T 중 하나는 H이고, 나머지 변수는 H, C1-6알킬, C1-6할로알킬, C1-6알콕시, OH, C1-6히드록시알킬, CN, C3-7시클로알킬, O페닐, OCH2페닐, 할로겐, COOR7, C1-3알킬렌COOR7, XNR8R9, XCONR8R9, XSO2NR8R9, NR7COC1-6알킬, NR7SO2C1-6알킬, OCH2CONR8R9, SO2C1-3알킬, 모노시클릭 헤테로아릴기 (메틸에 의해 치환되거나 비치환됨)으로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 H 또는 -C1-3알킬이고;
X는 결합 또는 C1-3알킬렌이고;
R8 및 R9는 상기 정의된 바와 같다.
추가의 구체예에서, R3는 하기 기이다:
Figure 112008033845667-PCT00005
여기서, R은 H이고, S 및 T는 H, C1-6알킬, C1-6할로알킬, C1-6알콕시, OH, C1-6히드록시알킬, CN, C3-7시클로알킬, O페닐, OCH2페닐, 할로겐, COOR7, C1-3알킬렌COOR7, XNR8R9, XCONR8R9, XSO2NR8R9, NR7COC1-6알킬, NR7SO2C1-6알킬, OCH2CONR8R9, SO2C1-3알킬, 모노시클릭 헤테로아릴기 (메틸에 의해 치환되거나 비치환됨)으로부터 독립적으로 선택되고;
X는 결합 또는 C1-3알킬렌이고;
R7, R8 및 R9는 상기 정의된 바와 같다.
추가의 구체예에서, R3는 하기 기이다:
Figure 112008033845667-PCT00006
여기서, R은 H이고, S는 XCONR8R9이고, X는 결합이고, T는 수소 또는 할로겐이고;
R8 및 R9는 상기 정의된 바와 같다.
추가의 구체예에서, R3는 하기 기이다:
Figure 112008033845667-PCT00007
여기서, R 및 T는 각각 수소이고, S는 CONR8R9이고;
R8 및 R9는 상기 정의된 바와 같다.
한 가지 구체에에서, R8 및 R9는 각각 수소이다.
한 가지 구체예에서, R8은 수소이고, R9는 C1-6알킬, C1-6할로알킬, C3-7시클로알킬, 또는 C1-3알킬렌C3-7시클로알킬, 바람직하게는 n-프로필이다.
한 가지 구체예에서, R8은 C1-6알킬, C1-6할로알킬, C3-7시클로알킬, C1-3알킬렌C3-7시클로알킬이고, R9는 C1-6알킬, C1-6할로알킬, C3-7시클로알킬, C1-3알킬렌C3-7시클로알킬이다.
한 가지 구체예에서, R8 및 R9는 이들이 결합되어 있는 N와 함께 4원, 5원 또는 6원 헤테로시클릭기를 형성하며, 이러한 헤테로시클릭기는 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 함유하거나 비함유하고, 임의의 질소에서 C1-6알킬에 의해 치환되거나 비치환되고, 임의의 황에서 =O 또는 (=O)2에 의해 치환되거나 비치환된다.
추가의 구체예에서, 하기 화학식 (IA)의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물이 제공된다:
Figure 112008033845667-PCT00008
상기 식에서,
R1은 H를 나타내고;
R2는 C1-3할로알킬이고;
R3는 하기 기이다:
Figure 112008033845667-PCT00009
여기서, R 및 T는 각각 수소이고, S는 CONR8R9이고;
R8은 수소이고, R9는 C1-6알킬, C1-6할로알킬, C3-7시클로알킬, C1-3알킬렌 C3-7시클로알킬, 바람직하게는 n-프로필이거나;
R8은 C1-6알킬, C1-6할로알킬, C3-7시클로알킬, C1-3알킬렌C3-7시클로알킬이고, R9는 C1-6알킬, C1-6할로알킬, C3-7시클로알킬, C1-3알킬렌C3-7시클로알킬이거나,
R8 및 R9는 이들이 결합되어 있는 N와 함께 4원, 5원 또는 6원 헤테로시클릭기를 형성하며, 이러한 헤테로시클릭기는 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 함유하거나 비함유하고, 임의의 질소에서 C1-6알킬에 의해 치환되거나 비치환되고, 임의의 황에서 =O, (=O)2에 의해 치환되거나 비치환되고,
R4는 H이다.
화학식 (IA)는 R1, R3 및 R4에 대한 값이 삽입된 경우 하기 화학식 (IB)로서 또한 표현될 수 있는 것으로 인식된다:
Figure 112008033845667-PCT00010
각각의 변수에 대한 구체예가 각각의 변수에 대해 개별적으로 상기 열거되었지만, 본 발명은 또한 화학식 (I)의 수 가지 또는 각각의 구체예가 상기 열거된 구체예 각각으로부터 선택되는 화합물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 각각의 변수에 대한 구체예의 모든 조합을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 화합물의 특정한 예는 하기 실시예 부분에 기재된 실시예 1 내지 52, 특히 N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다.
본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 존재하고/하거나 약제학적으로 허용되는 염으로서 투여될 수 있다. 적절한 염에 관한 개관에 대해서는 문헌 [Berge et al, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19]가 참조된다.
전형적으로, 본 발명의 염은 약제학적으로 허용되는 염이다. "약제학적으로 허용되는 염"이란 용어에 속하는 염은 본 발명의 화합물의 비독성 염을 의미한다.
적절한 약제학적으로 허용되는 염은 산 또는 염기 부가염을 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 산 부가염은 임의로 적절한 용매, 예를 들어 유기 용매에서 화학식 (I)의 화합물과 적절한 무기산 또는 유기산 (예를들어, 브롬화수소산, 염산, 황산, 질산, 인산, 숙신산, 말레산, 포름산, 아세트산, 피로피온산, 푸마르산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 벤조산, 살리실산, 글루탐산, 아스파르트산, p-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 메탄술폰산, 에탄설폰산, 2-나프탈렌설폰산과 같은 나프탈렌설폰산, 또는 헥사노산)을 반응시켜, 예를들어 결정화 및 여과에 의해, 통상적으로 단리되는 염을 생성시킴으로써 형성될 수 있다. 화학식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용되는 산 부가염은, 예를들어 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 말레에이트, 포르마레이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 푸마레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 글루타메이트, 아스파테이트, p-톨루엔설포네이트, 벤젠설포네이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 나프탈렌설포네이트 (예를 들어, 2-나프탈렌설포네이트) 또는 헥사노에이트 염이거나 이들 염을 포함할 수 있다.
또한, 그 밖의 약제학적으로 허용되지 않는 염, 예를들어 옥살레이트 또는 트리플루오로아세테이트가, 예를 들어 본 발명의 화합물의 단리에 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 이의 범위 내에 화학식 (I)의 화합물의 염의 모든 가능한 화학량론적 및 비화학량론적 형태를 포함한다.
화학식 (I)의 화합물, 및 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체는 Syk 활성의 억제제로서, 이에 따라 부적절한 Syk 활성과 관련된 질병 및 질환의 치료에서 잠재적으로 유용한 것으로 믿어진다.
따라서, 본 발명은 치료에 사용되는, 특히 부적절한 Syk 활성에 의해 매개되는 질병 및 질환의 치료에 사용되는, 화학식 (I)의 화합물, 및 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체를 제공한다.
본원에서 언급되는 부적절한 Syk 활성은 특정 포유동물 피검체에서 예상되는 정상적인 Syk 활성에서 벗어나는 임의의 Syk 활성이다. 부적절한 Syk 활성은 활성의 비정상적 증가, 또는 Syk 활성의 타이밍(timing) 및/또는 조절의 비정상과 같은 형태를 취할 수 있다. 이러한 부적절한 활성은 예를 들어 부적당하거나 제어되지 않는 활성화를 초래하는 단백질 키나아제의 과발현 또는 변이로부터 유래될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 통제되지 않는 Syk 활성과 관련된 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 Syk를 통제하거나, 조절하거나, 억제하는 방법에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 Syk 활성에 의해 매개되는 장애를 앓고 있는 포유동물 피검체에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학적 작용성 유도체를 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체를 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 Syk 활성에 의해 매개되는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학적 작용성 유도체의 용도를 제공한다.
추가의 구체예에서, 부적절한 Syk 활성에 의해 매개되는 질병 또는 질환은 류마티스 관절염이다.
추가의 구체예에서, 부적절한 Syk 활성에 의매 매개되는 질병 또는 질환은 알레르기성 비염이다.
추가의 구체예에서, 부적절한 Syk 활성에 의매 매개되는 질병 또는 질환은 만성폐쇄폐질환 (COPD)이다.
추가의 구체예에서, 부적절한 Syk 활성에 의매 매개되는 질병 또는 질환은 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDs)이다.
치료에 사용되는 경우, 화학식 (I)의 화합물 뿐만 아니라 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체는 미가공 화학물질로서 투여될 수 있지만, 활성 성분을 약제학적 조성물로서 제공하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 추가로 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 작용성 유도체, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 화학식 (I)의 화합물, 및 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체는 상기 기재된 바와 같다. 담체(들), 희석제(들) 또는 부형제(들)은 제형의 그 밖의 성분들과 양립가능하고 이의 수용자에게 유해하지 않다는 견지에서 허용될 수 있어야 한다. 본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 생리학적 작용성 유도체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 것을 포함하여 약제학적 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단위 투여량 당 소정량의 활성 성분을 함유하는 단위 투여량 형태로 제공될 수 있다. 이러한 단위는 예를 들어 치료하려는 질환, 투여 경로 및 연령, 체중 및 환자의 상태에 따라 화학식 (I)의 화합물을 5㎍ 내지 1g, 바람직하게는 1mg 내지 700mg, 더욱 바람직하게는 5mg 내지 100mg으로 함유할 수 있다. 따라서, 이러한 단위 투여량은 하루에 1회 이상 투여될 수 있다. 바람직한 단위 투여 조성물은 활성 성분의 상기 언급된 1일 투여량 또는 분할투여량(sub-dose) (하루에 1회 이상 투여하고자 하는 경우), 또는 활성 성분의 적절한 분획을 함유하는 것이다. 또한, 이러한 약제학적 조성물은 제약 분야에 널리 공지된 방법 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 경구 (협측 또는 설하를 포함함), 흡입 또는 비강 경로에 의해 투여되도록 적합될 수 있다. 이러한 조성물은 활성 성분이 담체(들) 또는 부형제(들)과 회합되도록 하는 것과 같은 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 예를 들어 류마티스 관절염을 치료하기 위해 경구 경로에 의해 투여되도록 적합된 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 알레르기성 비염을 치료하기 위해 비강 경로에 의해 투여되도록 적합된 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 예를 들어 COPD 또는 ARDS를 치료하기 위해 흡입 경로에 의해 투여되도록 적합된 약제학적 조성물을 제공한다.
경구 투여되도록 적합된 본 발명의 약제학적 조성물은 분리된 단위, 예를 들어 캡슐 또는 정제; 분말 또는 과립; 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 식용 포움(foam) 또는 윕(whip); 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐의 형태로 경구 투여되는 경우, 활성 약물 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구용이고 비독성인 약제학적으로 허용되는 비활성 담체와 배합될 수 있다. 분말은 화합물을 적절한 미세 크기로 분쇄하고, 유사하게 분쇄된 전분 또는 만니톨와 같은 식용 탄수화물과 같은 약제학적 담체와 혼합함으로써 제조된다. 착향제, 방부제, 분산제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
캡슐은 상기 기재된 분말 혼합물을 제조하고, 성형된 젤라틴 집(sheath)에 충전시킴으로써 제조된다. 글리던트(glidant) 및 윤활제, 예를 들어 콜로이드성 실리카, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 또는 고형 폴리에틸렌 글리콜이 충전 작업 전에 분말 혼합물에 첨가될 수 있다. 붕해제 또는 가용화제, 예를 들어 한천-한천, 탄산 칼슘 또는 탄산 나트륨이 또한 첨가되어 캡슐이 소화되는 경우 약제의 이용률을 개선시킬 수 있다.
더욱이, 요망되거나 필요한 경우, 적절한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제가 또한 혼합물에 혼입될 수 있다. 적절한 결합제로는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예를 들어 글루코오스 또는 베타-락토오스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예를 들어 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등이 있다. 이러한 투여 형태에 사용되는 윤활제로는 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드 등이 있다. 붕해제로는 비제한적으로 전분, 메틸 셀룰로오스, 한천, 벤토나이트, 잔탄 검 등이 있다. 정제는 예를 들어 분말 혼합물을 제조하고, 과립화 또는 슬러깅(slugging)시키고, 윤활제 및 붕해제를 첨가하고, 타정함으로써 제형화된다. 분말 혼합물은 적절하게 분쇄된 화합물을, 상기 기재된 희석제 또는 베이스(base) 및 임의로 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴 또는 폴리비닐 피롤리돈, 용액 지연제(solution retardant), 예를 들어 파라핀, 재흡수 촉진제, 예를 들어 4차염 및/또는 흡수제, 예를 들어 벤토나이트, 카올린 또는 인산 이칼슘과 혼합함으로써 제조된다. 분말 혼합물은, 시럽, 전분 페이스트, 아카디아 뮤실러지 (acadia mucilage) 또는 셀룰로오스 또는 중합체 물질의 용액과 같은 결합제로 습윤시키고, 스크린(screen)을 통과하게 함으로써 과립화될 수 있다. 과립화에 대한 대안으로서, 분말 혼합물을 정제기를 통해 처리할 수 있고, 결과물은 불완전하게 형성된 슬러그(slug)이며, 이는 과립으로 파쇄된다. 과립을 스테아르산, 스테아레이트 염, 탈크 또는 광유의 첨가에 의해 윤활처리하여 정제 형성 다이에 들러붙지 못하게 할 수 있다. 그 후, 윤활처리된 혼합물이 정제로 압축된다. 또한, 본 발명의 화합물은 자유 유동성 비활성 담체와 배합되어, 과립화 또는 슬러깅 단계를 거치지 않고 직접 정제로 압축될 수 있다. 쉘락(shellac)의 밀봉 코트로 이루어진 투명하거나 불투명한 코팅, 당 또는 중합체 물질의 코팅 및 왁스의 광택 코팅이 제공될 수 있다. 염료가 이러한 코팅에 첨가되어 다양한 단위 투여형을 식별할 수 있다.
경구용 유체, 예를 들어 용액, 시럽 및 엘릭서는 주어진 양이 소정량의 화합물을 함유하도록 투여 단위 형태로 제조될 수 있다. 시럽은 화합물을 적절하게 착향된 수용액에 용해시킴으로써 제조될 수 있으며, 엘릭서는 비독성 알코올성 비히클을 사용함으로써 제조된다. 현탁액은 화합물을 비독성 비히클에 분산시킴으로써 제형화될 수 있다. 가용화제 및 에멀젼화제, 예를 들어 에톡실화된 이소스테아릴 알코올 및 폴리옥시 에틸렌 소르비톨 에스테르, 방부제, 착향 첨가제, 예를 들어 페퍼민트 오일 또는 천연 감미제 또는 사카린 또는 그 밖의 인공 감미제 등이 또한 첨가될 수 있다.
적절한 경우, 경구 투여용 투여 단위 조성물은 미세캡슐화될 수 있다. 제형은 또한, 예를 들어 미립 물질을 중합체, 왁스 등으로 코팅하거나 이에 임베딩(embedding)시킴으로써, 방출을 연장 또는 지연시키도록 제조될 수 있다.
화학식 (I)의 화합물, 및 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체는 또한 리포솜 전달 시스템, 예를 들어 작은 단일층 소포 (unilamellar vesicle), 커다른 단일층 소포 및 다층(multilamellar) 소포의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 다양한 인지질, 예를 들어 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로부터 형성될 수 있다.
화학식 (I)의 화합물, 및 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체는 또한 화합물 분자가 커플링된 개개의 담체로서 모노클로날 항체를 사용하여 전달될 수 있다. 또한, 화합물은 표적화가능한 약물 담체로서 가용성 중합체와 커플링될 수 있다. 이러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파르트아미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신을 포함할 수 있다. 또한, 화합물은 약물의 제어된 방출을 달성하는데 유용한 생분해성 중합체의 부류, 예를 들어 폴리락트산, 폴입실론 카프로락톤 (polepsilon caprolactone), 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 히드로겔의 가교되거나 양쪽성(amphipathic)인 블록 공중합체에 커플링될 수 있다.
흡입 투여를 위한 투여 형태는 에어로졸 또는 건조 분말로서 편리하게 제형화될 수 있다.
흡입 투여에 적합하고/하거나 흡입 투여를 위해 적합된 조성물의 경우, 화학식 (I)의 화합물이 입자-크기-감소된 (particle-size-reduced) 형태로 존재하고, 더욱 바람직하게는 마이크론화(micronisation)에 의해 크기-감소된 형태가 수득되거나 수득될 수 있다. 크기-감소된 (예를 들어, 마이크론화된) 화합물, 염 또는 용매화물의 바람직한 입자 크기는 약 0.5 내지 약 10 마이크론의 D50 값 (예를 들어, 레이저 회절을 이용하여 측정되는 경우)으로 규정된다.
에어로졸 제형, 예를 들어 흡입 투여용 에어로졸 제형은 약제학적으로 허용되는 수성 또는 비수성 용매 중의 활성 물질의 용액 또는 미세 현탁액을 포함할 수 이다. 에어로졸 제형은 밀봉된 용기 중의 멸균 형태의 1회 또는 다회 투여량으로 제공될 수 있으며, 분무 장치 또는 흡입기와 함께 사용되도록 카트리지 또는 리필(refill)의 형태를 취할 수 있다. 대안적으로, 밀봉된 용기는 단위 분배 장치, 예를 들어 1회 투여용 비내 흡입기 또는 용기의 내용물이 고갈된 경우 폐기되도록 의도되는 계량 밸브가 장착된 에어로졸 디스펜서 (정량식 흡입기)일 수 있다.
투여 형태가 에어로졸 디스펜서를 포함하는 경우, 이는 바람직하게는 압력하에 적절한 추진제, 예를 들어 압축 공기, 이산화탄소 또는 유기 추진제, 예를 들어 히드로플루오로카본 (HFC)를 함유한다. 적절한 HFC 추진제로는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄이 있다. 에어로졸 투여 형태는 또한 펌프-오토마이저(pump-atomiser)의 형태를 취할 수 있다. 가압된 에어로졸은 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다. 이는 현탁액 제형의 분산 특성 및 균질성을 개선시키기 위해 추가의 부형제, 예를 들어 보조 용매 및/또는 계면활성제를 혼입하는 것을 필요로 할 수 있다. 용액 제형은 또한 에탄올과 같은 보조 용매의 첨가를 필요로 할 수 있다. 그 밖의 부형제 개질제가 또한 혼입되어 예를 들어 제형의 안정성 및/또는 풍미 및/또는 미세 입자 질량 특성 (양 및/또는 프로파일)을 개선시킬 수 있다.
흡입 투여에 적합하고/거나 흡입 투여를 위해 적합된 약제학적 조성물의 경우, 약제학적 조성물이 건조 분말 흡입성 조성물인 것이 바람직하다. 이러한 조성물은 분말 베이스, 예를 들어 락토오스, 글루코오스, 트레할로오스, 만니톨 또는 전분, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물 (바람직하게는 입자-크기-감소된 형태, 예를 들어 마이크론화된 형태), 및 임의로 성능 개질제, 예를 들어 L-류신 또는 또 다른 아미노산, 및/또는 스테아르산의 금속염, 예를 들어 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 건조 분말 흡입성 조성물은 락토오스와 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염의 건조 분말 블렌드를 포함한다. 락토오스는 바람직하게는 락토오스 히드레이트, 예를 들어 락토오스 모노히드레이트이고/이거나 바람직하게는 흡입 등급 (inhalation-grade) 및/또는 미세 등급 (fine-grade) 락토오스이다. 바람직하게는, 락토오스의 입자 크기는 락토오스 입자의 90% 또는 그 이상 (중량 또는 부피 기준)이 직경 1000 마이크론 (마이크로미터) 이하 (예를 들어, 10 내지 1000 마이크론, 예컨대 30 내지 1000 마이크론)이고/이거나 락토오스 입자의 50% 또는 그 이상이 직경 500 마이크론 이하 (예를 들어, 10 내지 500 마이크론)인 것으로 규정된다. 더욱 바람직하게는, 락토오스의 입자 크기는 락토오스 입자의 90% 또는 그 이상이 직경 300 마이크론 이하 (예를 들어, 10 내지 300 마이크론, 예컨대 50 내지 300 마이크론)이고/이거나 락토오스 입자의 50% 또는 그 이상이 직경 100 마이크론 이하인 것으로 규정된다. 임의로, 락토오스의 입자 크기는 락토오스 입자의 90% 또는 그 이상이 직경 100 내지 200 마이크론 이하이고/이거나 락토오스 입자의 50% 또는 그 이상이 직경 40 내지 70 마이크론 이하인 것으로 규정된다. 더욱 중요하게는, 입자의 약 3 내지 약 30% (예를 들어, 약 10%) (중량 또는 부피 기준)가 직경 50 마이크론 이하 또는 직경 20 마이크론 이하인 것이 바람직하다. 예를 들어, 비제한적으로 적절한 흡입 등급 락토오스는 E9334 락토오스 (10% fines)이다 (Borculo Domo Ingredients, Hanzeplein 25, 8017 JD Zwolle, Netherlands).
임의로, 특히 건조 분말 흡입성 조성물의 경우, 흡입 투여용 약제학적 조성물은 적절한 흡입 장치 내부의 스트립(strip) 또는 리본(ribon)에 길이방향으로 설치된 다수의 밀봉된 투여 용기 (예를 들어, 건조 분말 조성물을 함유함)내로 혼입될 수 있다. 용기는 필요에 따라 파열될 수 있거나 박리 개방될 수 있고, 예를 들어 건조 분말 조성물의 투여량은 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)에 의해 시판되는 DISKUSTM 장치와 같은 장치를 통한 흡입에 의해 투여될 수 있다. DISKUSTM 장치는 예를 들어 GB 2242134 A에 기재되어 있고, 이러한 장치에서 분말 형태의 약제학적 조성물에 대한 하나 이상의 용기 (용기(들)은 바람직하게는 스트립 또는 리본에 길이방향으로 설치된 다수의 밀봉된 투여 용기임)는 서로 박리가능하게 고정된 2개의 부재 사이에 형성되어 있으며, 이러한 장치는 상기 용기(들)에 대한 개방 스테이션을 형성하는 수단; 개방 스테이션에서 부재들을 박리시켜서 용기를 개방시키는 수단; 및 개방된 용기와 연통하며, 사용자가 개방된 용기로부터 분말 형태의 약제학적 조성물을 흡입할 수 있게 하는 출구를 포함한다.
비내 투여용 투여 형태는 에어로졸, 용액, 점적액, 겔 또는 건조 분말로서 제형화될 수 있다.
흡입에 의해 투여되도록 적합된 약제학적 조성물은 미세 입자 더스트(dust) 또는 미스트(mist)를 포함하는데, 이는 다양한 유형의 정량식 가압 에어로졸, 분무기 또는 취입기에 의해 생성될 수 있다.
비내 투여에 적합한 약제학적 조성물 및/또는 비내 투여를 위해 적합된 약제학적 조성물의 경우, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 유체 디스펜서로부터의 전달을 위해 유체 제형으로서 제형화될 수 있다. 이러한 유체 디스펜서는 예를 들어 사용자에 의해 가해진 힘이 유체 디스펜서의 펌프 메커니즘에 적용시에 유체 제형의 계량된 투여량이 분배되게 하는 분배 노즐 또는 분배 오리피스를 지닐 수 있다. 이러한 유체 디스펜서에는 일반적으로 유체 제형의 다수의 계량된 투여량의 저장소가 제공되며, 이러한 투여량은 순차적 펌프 작동시 분배될 수 있다. 분배 노즐 또는 오리피스는 비강내로의 유체 제형의 분무 분배를 위해 사용자의 콧구멍내로 삽입되도록 형성될 수 있다. 상기 언급된 유형의 유체 디스펜서는 WO-A-2005/044354에 기재되어 있고 예시되어 있는데, 이러한 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 디스펜서는 유체 제형을 함유하기 위한 용기상에 설치된 압축 펌프를 지닌 유체 배출 장치를 수용하는 하우징을 지닌다. 하우징은 하우징에 대하여 내측으로 이동하여 하우징에서 용기를 상향으로 캠 운동시킴으로써 펌프를 압축시키고 펌프 스템(stem)으로부터 계량된 투여량의 제형을 하우징의 비강 노즐을 통해 펌핑시킬 수 있는 하나 이상의 손가락 작동가능한 사이드 레버 (side lever)를 지닌다. 특히 바람직한 유체 디스펜서는 WO-A-2005/044354의 도 30 내지 40에 도시된 일반적 유형을 지닌다.
본 발명의 화합물이 흡입, 정맥내, 경구 또는 비내 경로에 의해 통상적으로 투여되는 다른 치료제와 함께 투여되는 경우, 생성된 약제학적 조성물이 동일한 경로에 의해 투여될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
상기 특별히 언급된 성분들 이외에, 본 발명의 조성물은 해당 제형의 유형에 대해 당 분야에서 통상적인 다른 작용제를 포함할 수 있는데, 예를 들어 경구 투여에 적합한 작용제로는 착향제가 있을 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료적 유효량은 예를 들어 동물의 연령 및 체중, 치료를 필요로 하는 정확한 질환 및 이의 중증도, 제형의 특성, 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 좌우되며, 궁극적으로 담당 의사 또는 수의사의 재량의 범위에 속한다. 그러나, 부적절한 Syk 활성과 관련된 질병 또는 질환의 치료를 위한 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 일반적으로 일(day) 당 수용자 (포유동물)의 체중 kg 당 5㎍ 내지 100mg이고, 더욱 일반적으로는 일 당 체중 kg 당 5㎍ 내지 10mg이다. 이러한 양은 일 당 1회 투여로 제공될 수 있거나, 더욱 일반적으로는 전체 1일 투여량이 동일해지도록 일 당 다회 (예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회)의 분할 투여량으로 제공될 수 있다. 화학식 (I)의 화합물의 염 또는 용매화물의 유효량은 화학식 (I)의 화합물 자체의 유효량의 비율로서 결정될 수 있다.
본 발명의 화합물, 및 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체는 단독으로 사용되거나 부적절한 티로신 및 세린/트레오닌 키나아제 활성과 관련된 질병 및 질환의 치료를 위한 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조합 요법은 하나 이상의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학적 작용성 유도체를 투여하고, 하나 이상의 그 밖의 약제학적 활성제를 사용하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조합 요법은 하나 이상의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학적 작용성 유도체, 및 하나 이상의 다른 약제학적 활성제를 투여하는 것을 포함한다. 화학식 (I)의 화합물(들) 및 다른 약제학적 활성제(들)은 함께 투여되거나 개별적으로 투여될 수 있고, 개별적으로 투여되는 경우 이는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 일어날 수 있다. 화학식 (I)의 화합물(들) 및 다른 약제학적 활성제(들)의 양 및 상대적 투여 시기는 요망되는 조합 요법적 효과를 달성하도록 선택된다.
본 발명의 화합물, 및 이의 염, 용매화물 및 생리학적 작용성 유도체는 또한 당 분야에 공지된 다른 부류의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 조합법에 사용되는 대표적 부류의 약물로는 천식 치료의 경우 항염증성 스테로이드 (특히, 코르티코스테로이드), 국소용 글루코코르티코이드 효능제, PDE4 억제제, IKK2 억제제, A2a 효능제, β2-아드레날린수용체 효능제 (완속 작용성 (slow acting) 및 장기 작용성 (long acting) β2-아드레날린수용체 효능제 둘 모두를 포함함), 알파 4 인테그린 억제제, 및 항무스카린제가 있고, 알레르기 치료의 경우 상기 언급된 약물 뿐만 아니라 H1 및 H1/H3 길항제가 있다. 중증 천식을 치료하기 위한 조합 요법에 사용되는 대표적인 약물로는 국소 작용성 p38 억제제 및 IKK2 억제제가 있다.
항염증성 코르티코스테로이드는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 대표적인 예로는 플루티카손 프로피오네이트 (예를 들어, 미국 특허 4,335,121), 베클로메타손 17-프로피오네이트 에스테르, 베클로메타손 17,21-디프로피오네이트 에스테르, 덱사메타손 또는 이의 에스테르, 모메타손 또는 이의 에스테르 (예를 들어, 모메타손 푸로에이트), 시클레소니드, 부데소니드 및 플루니솔리드가 있다. 항염증성 코르티코스테로이드의 추가의 예는 WO 02/12266 A1 (Glaxo Group Ltd)에 기재되어 있는데, 특히 실시예 1 (6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르) 및 실시예 41 (6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-17α-[(4-메틸-1,3-티아졸-5-카르보닐)옥시]-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 들 수 있다.
β2-아드레날린수용체 효능제의 예로는 살메테롤 (예를 들어, 라세미체 또는 R-거울상이성질체와 같은 단일 거울상이성질체로서), 살부타몰, 포르모테롤, 살메파몰, 페노테롤 또는 테르부탈린 및 이들의 염, 예를 들어 살메테롤의 지나포에이트 염, 살부타몰의 설페이트 염 또는 유리 염기 또는 포르모테롤의 푸마레이트 염이 있다. 장기 작용성 β2-아드레날린수용체 효능제, 특히 살메테롤 또는 포르모테롤과 같은 24시간에 걸쳐 치료 효과를 지닌 것들이 바람직하다.
항히스타민제의 예로는 아젤라스틴, 레보카바스틴, 올로파티딘, 메타피릴렌, 로라타딘, 세티리진, 데스로라타딘 또는 펙소페나딘이 있다.
항콜린작용성 화합물의 예로는 무스카린 (M) 수용체 길항제, 특히 M1, M2, M1/M2 또는 M3 수용체 길항제, 특히 (선택적) M3 수용체 길항제가 있다. 항콜린작용성 화합물의 예는 WO 03/011274 A2 및 WO 02/069945 A2 / US 2002/0193393 A1 및 US 2002/052312 A1에 기재되어 있다. 무스카린 M3 길항제의 예로는 이프라트로퓸 브로마이드, 옥시트로퓸 브로마이드 또는 티오트로퓸 브로마이드가 있다.
본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있는 대표적 PDE4 또는 혼합 PDE3/4 억제제로는 AWD-12-281 (Elbion), PD-168787 (Pfizer), 로플루밀라스트(roflumilast), 및 실로밀라스트(cilomilast) (GlaxoSmithKline)가 있다. PDE4 억제제의 추가의 예는 WO 2004/103998 (Glaxo Group Ltd)에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 β2-아드레날린수용체 효능제 및 항염증성 코르티코스테로이드와 함께 포함하는 소위 "3중 조합 (triple combination)" 치료제를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 조합은 천식, COPD 또는 알레르기성 비염의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다. β2-아드레날린수용체 효능제 및/또는 항염증성 코르티코스테로이드는 상기 기재된 바와 같고/같거나 WO 03/030939 A1에 기재된 바와 같을 수 있다. 이러한 "3중" 조합의 대표적인 예는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 살메테롤 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 (예를 들어, 살메테롤 지나포에이트) 및 플루티카손 프로피오네이트를 포함한다.
적절한 경우, 치료 성분의 활성 및/또는 안정성 및/또는 물리적 특성, 예를 들어 용해도를 최적화시키기 위해 다른 치료 성분(들)이 염, 예를 들어 알칼리 금속 또는 아민 염 또는 산 부가염으로서의 염, 또는 프로드러그, 또는 저급 알킬 에스테르와 같은 에스테르, 또는 수화물과 같은 용매화물의 형태로 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 적절한 경우 치료 성분이 광학적으로 순수한 형태로 사용될 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.
상기 언급된 조합물은 약제학적 조성물의 형태로 사용되도록 편리하게 제공될 수 있는데, 따라서 상기 규정된 조합물을 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 추가의 일면을 구성한다. 이러한 조합물은 특히 호흡기 질병에서 관심을 끌며, 흡입 또는 비내 전달을 위해 편리하게 적합된다.
류마티스 관절염 (RA)은 조합 요법이 고려될 수 있는 또 다른 염증 질병이다. 따라서, 추가의 일면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물을 류마티스 관절염의 치료에 유용한 추가의 치료제와 함께 제공하는데, 상기 조합물은 류마티스 관절염의 치료를 위해 유용하다.
본 발명에 따른 화합물 및 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어 NSAIDS, 코르티코스테로이드, COX-2 억제제, 시토카인 억제제, 항-TNF 약물, 온코스타틴 M의 억제제, 항말라리아제, 면역억제제 및 세포증식억제제(cytostatic)로부터 선택된 치료제와 함께 사용될 수 있거나, 이러한 치료제를 포함할 수 있다.
두 가지 부류의 약물이 RA의 치료를 위해 고려되는데, 이들은 "신속 작용성 (fast acting) 및 "완속 작용성 (slow acting)" 또는 "2차 (second line)" 약물 (또한 질병 조절 항류마티스 약물 또는 DMARDS라 일컬어짐)로서 분류될 수 있다. 1차 (first line) 약물로는 예를 들어 전형적인 NSAID (예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 에토돌락), 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손)이 있다. 2차 약물로는 COX-2 억제제 및 항-TNF 약물이 있다. COX-2 억제제의 예로는 셀레콕시브 (Celebrex), 에토리콕시브 및 로페콕시브 (Vioxx)가 있다.
항-TNF 약물로는 인플릭시맙 (Remicade), 에타네르셉트 (Enbrel) 및 아달리무맙 (Humira)이 있다. 그 밖의 "생물학적" 치료제로는 아나킨라 (Kineret), 리툭시맙, 림포스타트-B, BAFF/APRIL 억제제 및 CTLA-4-Ig 또는 이들의 유사물질(mimetic)이 있다. 그 밖의 시토카인 억제제로는 레플루노미드 (Arava)가 있다. 추가의 2차 약물로는 금 조제물 (오라노핀(Auranofin) (Ridaura tablets) 또는 오로티오말레이트(Aurothiomalate) (Myocrisin injection)), 말라리아용 약제: (히드록시클로로퀸 (Plaquenil)), 면역계를 억제제하는 약제 (아자티오프린(Azathioprine) (Imuran, Thioprine), 메토트렉세이트 (Methobalstin, Ledertrexate, Emthexate), 시클로스포린 (Sandimmun, Neoral)), 시클로포스파미드 (Cycloblastin), 시톡산(Cytoxan), 엔독산(Endoxan)), D-페니실라민 (D-Penamine), 설파살라진 (Salazopyrin), 비스테로이드성 항염증약 (아스피린 및 이부프로펜을 포함함)이 있다.
이러한 조합물의 개별 화합물은 분리된 약제 조성물 또는 결합된 약제 조성물 형태로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 개별 화합물은 결합된 약제 조성물 형태로 동시에 투여된다. 공지된 치료제의 적절한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 인식될 것이다.
본 발명의 화합물은 표준 화학을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 임의의 앞서 규정된 변수는 달리 언급되지 않는 한 계속해서 앞서 규정된 의미를 지닌다. 예시적인 일반 합성 방법이 하기 제시된 후, 본 발명의 특정 화합물이 실시예에서 제조된다.
화학식 (I)의 화합물은 부분적으로 하기 합성 반응식에 의해 제시된 유기 합성 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기 기재된 모든 반응식에서, 민감성 또는 반응성 기에 대한 보호기가 일반 화학 원리에 따라 필요한 경우 사용된다는 것이 잘 이해된다. 보호기는 표준 유기 합성 방법에 따라 조작된다 (T. W. Green and P. G. M. Wuts (1991) Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons). 이들 기는 당업자에게 매우 명백한 방법을 이용하여 화합물 합성의 편리한 단계에서 제거된다. 방법의 선택 뿐만 아니라 이를 수행하기 위한 반응 조건 및 순서는 화학식 (I)의 화합물의 제법과 일치해야 한다. 당업자는 입체중심이 화학식 (I)의 화합물에 존재하는 지의 여부를 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 가능한 입체이성질체 둘 모두를 포함하며, 라세미 화합물 뿐만 아니라 개별 거울상이성질체도 포함한다. 화합물이 단일 거울상이성질체로서 요망되는 경우, 이는 입체특이적 합성법에 의해 수득될 수 있거나, 최종 생성물 또는 임의의 편리한 중간체의 분해에 의해 수득될 수 있다. 최종 생성물, 중간체 또는 출발 물질의 분해는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다 [참조: Stereochemistry of Organic Compounds by E. L. Eliel, S. H. Wilen, and L. N. Mander (Wiley-Interscience, 1994).
경로 1
Figure 112008033845667-PCT00011
(i) HNR1R2, IPA, 마이크로파 100℃; (ii) R3NH2, Pd(dba)2, 2-디시클로헥실포스피노-2'-(N,N'-디메틸아미노)비페닐, Cs2CO3, DMF, 마이크로파 150℃
경로 2
Figure 112008033845667-PCT00012
(i) NaH, TsCl, DMF; (ii) HNR1R2, IPA, 80℃; (iii) R3NH2, Pd2(dba)3, 2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필비페닐, K2CO3, t-BuOH, 80℃; (iv) NaOMe, MeOH
경로 3 (R4 = H인 경우)
Figure 112008033845667-PCT00013
(i) R3NH2, 190℃; (ii) ClCH2CHO, NaOAc, IPA/H2O, 80; (iii) (CF3SO2)2NPh, K2CO3, DMF, RT; (iv) HNR1R2, K2CO3, 디옥산, 마이크로파 80℃; (v) 2N NaOH.
경로 4
Figure 112008033845667-PCT00014
(i) ClCHR4CHO, NaHCO3, H2O, 50℃; (ii) (tBuCO)2O, DMAP, 120℃; (iii) POCl3, 110℃; (iv) 2N NaOH, 100℃; (v) TsCl, NaH, DMF, RT; (vi) tBuONO, CH2I2, CuI, I2, THF, 80℃; (vii) HNR1R2, IPA, 80℃; (viii) R3NH2, Pd2(dba)3, 2-디시클로헥실포스피노-2'-(N,N'-디메틸아미노)비페닐, Cs2CO3, DMF, 90℃; (ix) NaOMe, MeOH
경로 5
Figure 112008033845667-PCT00015
(i) ClCHR4CHO, NaHCO3, H2O, 50℃; (ii) (tBuCO)2O, DMAP, 120℃; (iii) POCl3, 110℃; (iv) 2N NaOH, 100℃; (v) TsCl, NaH, DMF, RT; (vi) t-BuONO, Me3SiCl, BnN(Et)3Cl, DCM; (vii) HNR1R2, IPA, 80℃; (viii) R3NH2, Pd2(dba)3, 2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필비페닐, K2CO3, t-BuOH, 마이크로파, 120℃; (ix) NaOMe, MeOH
따라서, 추가의 일면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은,
(i) 하기 화학식 (II)의 화합물을 아민 R3NH2와 반응시킨 후, 존재하는 경우 보호기를 제거하거나;
(ii) R4-H인 경우, 하기 화학식 (III)의 화합물을 아민 HNR1R2와 반응시킨 후, 보호기를 제거하거나;
(iii) 하기 화학식 (IV)의 화합물을 아민 R3NH2와 결합시킨 후, 보호기를 제거하는 것을 포함한다:
Figure 112008033845667-PCT00016
상기 식에서, X는 H 또는 보호기, 예를 들어 p-톨루엔설포닐이고, Y는 보호기, 예를 들어 트리플레이트이고, Hal은 Cl 또는 I 이다.
본 발명의 특정 구체예가 이제 단지 예로서 설명될 것이다. 예시된 화합물에 대해 제공된 물리적 데이터는 이들 화합물의 할당된 구조와 일치한다.
실시예
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 공정, 반응식 및 실시예에서 사용되는 기호 및 규약은 예를들어 [Journal of the American Chemical Society] 또는 [Journal of Biological Chemistry]와 같은 현대 과학 문헌에서 사용되는 것과 일치한다. 아미노산 잔기를 나타내기 위해 표준적인 단문자 약어 또는 3문자 약어가 일반적으로 사용되며, 이는 달리 지시되지 않는 경우 L-형태이다. 달리 지시되지 않는 경우, 모든 출발 물질은 상업 제품 제조업체로부터 구입하였고, 추가 정제 없이 사용하였다. 특히, 하기 약어가 실시예 및 본 명세서를 통해 사용되었다:
g (그램);
l (리터);
μl (마이크로리터);
M (몰);
MHz (메가헤르츠);
mmol (밀리몰);
min (분);
Rt (정체 시간);
TFA (트리플루오로아세트산);
THF (테트라히드로푸란);
DMSO (디메틸술폭시드);
DCM (디클로로메탄);
DMF (N,N-디메틸포름아미드);
DMAP (4-디메틸아미노피리딘);
ATP (아데노신 트리포스페이트);
DMEM (둘베코 변형 이글 배지);
HPLC (고압 액체 크로마토그래피);
TBAF (테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드);
TsCl (토실 클로라이드);
HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄 술폰산);
EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산);
TBTU (O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트);
DIPEA (디이소프로필에틸아민);
Pd2(dba)3 (비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐);
LC/MS (액체 크로마토그래피 - 질량 분석법);
mg (밀리그램);
ml (밀리리터);
mM (밀리몰);
h (시간);
IPA (이소프로판올);
atm (기압);
BSA (우혈청 알부민);
HRP (호스라디쉬 퍼옥시다아제);
MDAP (질량 특이적 오토프렙(Mass directed autoprep) / 제조용 질량 특이적 HPLC);
에테르에 대한 모든 참조는 디에틸 에테르이고; 염수는 NaCl의 포화 수용액을 의미한다. 달리 지시되지 않는 경우, 모든 온도는 ℃(섭씨°)이다. 달리 지시되지 않는 경우, 모든 반응은 실온에서 비활성 대기하에서 수행하였다.
1H NMR 스펙트럼은 테트라메틸실란을 참조로 하여 브루커(Bruker) DPX 400MHz를 이용하여 기록하였다.
LC/MS를 3ml/분의 유속의 용리 구배 0.0-7분 0%B, 0.7-4.2분 100%B, 4.2-5.3분 0%B, 5.3-5.5분 0%B을 이용하는, 물중 0.1% HCO2H 및 0.01M 암모늄 아세테이트 (용매 A) 및 아세토니트릴중 0.05% HCO2H, 5% 물 (용매 B)로 용리되는 수펠코실(Supelcosil) LCABZ+PLUS 컬럼 (3.3 cm x 4.6 mm ID)에서 수행하였다. 질량 스펙트럼을 전기분무 양성 및 음성 모드(ES+ve 및 ES-ve)를 이용하는 피손스(Fisons) VG 플랫폼 분광계로 기록하였다.
"질량 특이적 오토프렙" / "제조용 질량 특이적 HPLC"를 연장된 펌프 헤드를 지닌 워터스(Waters) 600 펌프를 포함하는 워터스 프랙션링크스 시스템(Waters FractionLynx system), 워터스 2700 오토샘플러, 워터스 996 다이오드 어레이 및 적절한 용리 구배를 이용하는 수중 0.1% 포름산 또는 트리플루오로아세트산 (용매 A) 및 아세토니트릴중 0.1% 포름산 또는 트리플루오로아세트산 (용매 B)으로 용리되는 10 cm 2.54 cm ID ABZ+ 컬럼 상의 길슨(Gilson) 202 분획 수집기와 같은 시스템 상에서 수행하였다. 질량 스펙트럼을 전기분무 양성 및 음성 모드, 또는 대안적 스캔을 이용하는 마이크로매스 ZMD 질량 분광기에서 기록하였다. 오픈링크스(OpenLynx) 및 프랙션링크스(FractionLynx) 옵티오(optio)를 지닌 매스링크스(MassLynx) 3.5를 소프트웨어로 사용하거나; 동등한 대안적 시스템을 사용하였다.
"소수성 프릿(frit)"은 와트만(Whatman)사에서 시판되는 여과 튜브를 의미한다. SPE (고상 추출)은 인터내셔널 솔벤트 테크놀로지 엘티디.(International Sorbent Technology Ltd.)사에서 시판되는 카트리지의 사용을 의미한다.
플래시마스터 Ⅱ는 일회용의 정상(normal phase) SPE 카트리지(2g 내지 10Og)를 이용하는 아고넛 테크놀로지스 엘티디(Argonaut Technologies Ltd)사에서 시판되는 자동화 멀티-유저 플래시 크로마토그래피 시스템이다. 이는 구배 방법이 수행될 수 있도록 혼합된 4부분의 온-라인 용매를 제공한다. 샘플은 용매, 유속, 구배 프로파일 및 수집 조건을 다루는 다기능 공개 이용 소프트웨어를 이용하여 대기열에 넣어진다. 상기 시스템은 자동화된 피크 커팅, 수집 및 트래킹이 가능한 크나우어(Knauer) 가변 파장 UV-검출기 및 두개의 길슨 FC204 분획-수집기가 장비되어 있다.
실리카 크로마토그래피 기술은 자동화(플래시마스터(Flashmaster)) 기술, 또는 미리 패킹된 카트리지(SPE) 또는 수동으로 패킹된 플래시 컬럼에서의 수동 크로마토그래피를 포함한다.
마이크로파 화학작용은 통상적으로 적절한 마이크로파 반응기 시스템, 예를들어 바이오티지 이니시에이터(Biotage Initiator™) 마이크로파 합성기로 방사선 조사되는 밀봉된 용기에서 수행하였다.
화학제품 공급업체의 명칭은 예를들어 "화합물 X (Aldrich)" 또는 "화합물 X / Aldrich"와 같이 화합물 또는 시약의 명칭 뒤에 제공되며, 이는 화합물 X가 화학제품 공급업체, 예를들어 명명된 화학제품 공급업체로부터 입수가능한 것을 의미한다.
유사하게, 화합물 Y (EP 0 123 456)와 같이 문헌 또는 특허 참고문헌이 화합물의 명칭 뒤에 제공되는 경우, 이는 화합물의 제법이 명명된 참고문헌에 기술되어 있는 것을 의미한다.
실시예의 명칭은 화합물 작명 프로그램 "ACD Name Pro 6.02"을 이용하여 수득되었다.
실시예 1
4-({4-[(1-메틸에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 포르메이트
Figure 112008033845667-PCT00017
디옥산(1.5ml) 중의 2-{[4-(아미노카르보닐)페닐]아미노}-7-[(트리플루오로메틸)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일 트리플루오로메탄술포네이트(0.024g)의 용액에 탄산칼륨(15mg) 및 이소프로필아민(0.005g)을 첨가하였다. 현탁액을 10분 동안 마이크로파 방사선 조사에 의해 80℃에서 밀봉된 바이얼에서 가열하였다. 혼합물에 수성 수산화나트륨(2M, 0.75ml)을 처리하고, 4시간 동안 강하게 교반하였다. 혼합물에 수성 염산(2M, 0.75ml)을 처리하고, SCX-2 카트리지 (10g, 메탄올로 전처리됨)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 메탄올중 10% 암모니아로 용리시켰다. 염기성 분획을 진공에서 농축시키고, MDAP에 의해 잔여물을 정제하여 백색 고형물로서 4-({4-[(1-메틸에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 포르메이트(0.010g)를 생성시켰다. LC/MS: Rt 2.37분, MH+ 311.
중간체 1
2-{[4-(아미노카르보닐)페닐]아미노}-7-[(트리플루오로메틸)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일 트리플루오로메탄술포네이트
Figure 112008033845667-PCT00018
DMF (3ml) 중의 4-[(4-옥소-4,7-디히드로-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노]벤즈아미드(0.077g)의 현탁액에 탄산칼륨(0.097g) 및 N-페닐트리플루오로메탄술폰아미드(0.25g)를 첨가하였다. 현탁액을 1.5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 추가량의 N-페닐트리플루오로메탄술폰아미드(0.064g) 및 탄산칼륨(0.024g)을 혼합물에 첨가하고, 3.5시간 동안 20℃에서 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(30ml)와 물(20ml) 사이에 분배시켰다. 상을 분리시키고, 유기상을 물로 세척(2x 15ml)하였다. 조합된 수성 세척물을 에틸 아세테이트(20ml)로 추출하고, 제 2의 에틸 아세테이트 추출물을 물(10ml)로 세척하였다. 조합된 유기 추출물을 건조(황산 마그네슘)시키고, 여과시키고, 진공하에서 용매를 제거하였다. 잔여물을 실리카 상에 흡착시키고, 30분에 걸쳐 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(0-100%)로 용리되는 실리카 카트리지(20g) 상에서 크로마토그래피하여 정제시키고, 적절한 분획으로부터 용매를 증발시킨 후, 2-{[4-(아미노카르보닐)페닐]아미노}-7-[(트리플루오로메틸)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일 트리플루오로메탄술포네이트(0.050g)를 생성시켰다. LC/MS: Rt 3.50분, MH+ 534.
중간체 2
4-[(4-옥소-4,7-디히드로-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노]벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00019
IPA(3ml) 및 물(1ml) 중의 4-[(4-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-2-피리미디닐)아미노]벤즈아미드(0.325g)의 현탁액에 나트륨 아세테이트(0.240g)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 클로로아세트알데히드(0.22ml, 수중 50%)를 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 80℃로 가열하였다. 실온에서 혼합물을 물(30ml)로 희석시키고, 생성된 현탁액을 15분 동안 교반하였다. 현탁액을 여과시키고, 잔여물을 물(10ml)로 세척하였다. 미정제 물질을 메탄올/DCM 구배(0-30%) + 1% 트리에틸아민으로 용리되는 실리카 카트리지(50g) 상에서 크로마토그래피하여 추가로 정제시키고, 적절한 분획으로부터 용매를 증발시킨 후에 백색 고형물로서 4-[(4-옥소-4,7-디히드로-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노]벤즈아미드(0.132g)를 생성시켰다. LC/MS: Rt 2.1분, MH+ 270.
중간체 3
4-[(4-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-2-피리미디닐)아미노]벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00020
6-아미노-2-(메틸티오)-4(1H)-피리미디논(1.023g, Salor) 및 4-아미노벤즈아미드(1.0g, Acros)의 혼합물을 실온에서 진탕시키고, 26시간 동안 190℃에서 교반하였다. 잔여물을 DCM/메탄올(1:1, 100ml)을 이용하는 실리카 상에 흡착시켰다. 미정제 생성물을 메탄올/DCM 구배(0-25%), 이후 50% 메탄올/1% 트리에틸아민을 지니는 DCM으로 용리되는 실리카 카트리지(100g) 상에서 크로마토그래피하여 정제시켰다. 적절한 분획으로부터 용매를 증발시켜, 황색 고형물로서 4-[(4-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-2-피리미디닐)아미노]벤즈아미드(0.340g)를 생성시켰다. LC/MS: Rt 1.8분, MH+ 246.
중간체 4
2-요오도-N-(1-메틸에틸)-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
Figure 112008033845667-PCT00021
4-클로로-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(1.3g) 을 에탄올(20ml) 중에 현탁시키고, 이소프로필아민(360mg, Aldrich) 및 DIPEA(10mmol)를 처리하고, 혼합물을 3시간 동안 80℃에서 가열하였다. 반응물을 건조시키고, 잔여물을 에틸 아세테이트/DCM 구배(0-100%)로 용리되는 실리카 카트리지 상에서 크로마토그래피하여 정제시켰다. 적절한 분획을 조합하고, 용매를 증발시켜, 표제 화합물을 생성시켰다(950mg). LC/MS; Rt 3.88분, MH+ 456.9.
중간체 5
2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
Figure 112008033845667-PCT00022
4-클로로-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(1.3g)을 에탄올(20ml)에 현탁시키고, 2,2,2-트리플루오로에틸아민(600mg, Aldrich) 및 DIPEA(10mmol)를 처리하고, 혼합물을 6시간 동안 80℃에서 가열하였다. 2,2,2-트리플루오로에틸아민(2ml) 및 DIPEA(2ml)를 첨가하고, 18시간 동안 90℃에서 가열을 지속시켰다. 반응물을 건조시키고, 잔여물을 에틸 아세테이트/DCM 구배(0-100%)로 용리되는 실리카 카트리지 상에서 크로마토그래피하여 정제시켰다. 적절한 분획물을 조합시키고, 용매를 증발시켜, 표제 화합물을 생성시켰다(1.21 g). LC/MS; Rt 3.80분, MH+ 496.9
방법 1:
4-클로로-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(310mg)을 에탄올에 현탁시키고, 아민(2mmol) 및 DIPEA(3mmol)를 처리하고, 혼합물을 3시간 동안 80℃에서 가열하였다. 반응물을 건조시키고, 잔여물을 에틸 아세테이트/DCM 구배(0-100%)로 용리되는 실리카 카트리지 상에서 크로마토그래피하여 정제시켰다. 적절한 분획을 조합시키고, 용매를 증발시켜, 요망되는 생성물을 생성시켰다.
하기 화합물이 방법 1을 이용하여 제조되었다:
중간체 구조식 화합물명 아민/공급원 LC/MS Rt(분) LC/MS MH+
6
Figure 112008033845667-PCT00023
 2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2-메틸프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 이소부틸아민/Aldrich 4.09 470.83
7
Figure 112008033845667-PCT00024
 2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-[(1R)-1-메틸프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (R)-이차 부틸아민/Aldrich 4.04 470.82
중간체 8
N-에틸-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
Figure 112008033845667-PCT00025
4-클로로-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(300mg)을 에탄올(5ml)에 현탁시키고, 에틸아민(1ml, Aldrich) 및 DIPEA(1ml)를 처리하고, 혼합물을 2시간 동안 80℃에서 가열하였다. 반응물을 건조시키고, 잔여물을 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(0-100%)로 용리되는 실리카 카트리지(20g) 상에서 크로마토그래피하여 정제시켰다. 적절한 분획을 조합시키고, 용매를 증발시켜, 표제 화합물을 생성시켰다. LC/MS; Rt 3.82분, MH+ 442.78.
방법 2:
피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 시약, 예를들어 피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(0.1mmol, 43mg), 4-아미노-N-메틸벤즈아미드(29.8mg, Asinex), 탄산세슘(96mg), 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐(6mg, Acros) 및 2-디시클로헥실포스피노-2'-(N,N-디메틸아미노)비페닐(6mg, Acros)을 DMF(2.0ml) 중에서 조합시켰다. 반응 혼합물을 3시간 동안 80℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각되도록 두고, 셀라이트를 통해 여과시키고, 셀라이트를 DMF로 세척하고, 조합된 여과액 및 세척액을 증발 건조시켰다. 잔여물을 2시간 동안 80℃에서 나트륨 메톡시드 용액(2N, 0.5ml)과 함께 가열하고, 실온으로 냉각되도록 두었다. 용액을 증발 건조시키고, 잔여물을 DMSO에 용해시키고, MDAP으로 정제시켰다. 생성물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜, 요망되는 화합물을 생성시켰다.
하기 화합물이 방법 2를 이용하여 제조되었다:
예 구조식 화합물명 피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 시약 LC/MS Rt(분) LC/MS MH+
2
Figure 112008033845667-PCT00026
 N-메틸-4-[(4-{[(1R)-1-메틸프로필]아미노}-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노]벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-[(1R)-1-메틸프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 2.40 339
3
Figure 112008033845667-PCT00027
 4-{[4-(에틸아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}-N-메틸벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 N-에틸-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 2.17 311
4
Figure 112008033845667-PCT00028
 N-메틸-4-({4-[(2-메틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2-메틸프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 2.45 339
방법 3:
2-{[4-(아미노카르보닐)페닐]아미노}-7-[(트리플루오로메틸)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일 트리플루오로메탄술포네이트(853mg)를 IPA(16ml)에 현탁시키고, 이러한 혼합물의 분취량(1ml)에 IPA(1ml) 및 DIPEA(17μl) 중의 아민(0.15mmol) 용액을 처리하였다. 반응물을 밤새 환류 상태로 80℃에서 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 잔여물을 디옥산(1ml) 및 수산화나트륨(2M, 1 ml)에 용해시키고, 생성된 이상성 혼합물을 ~72시간 동안 실온에서 강하게 교반하였다. 반응물을 염산(2N)으로 중화시키고, 에틸 아세테이트(2ml)로 추출하였다. 유기상을 농축시키고, 잔여물을 MDAP로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜, 요망되는 화합물을 생성시켰다.
하기 화합물이 방법 3을 이용하여 제조되었다:
예 구조식 화합물명 아민 시약/공급원 LC/MS Rt(분) LC/MS MH+
5
Figure 112008033845667-PCT00029
 4-{[4-(메틸아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 메틸아민/Acros 2.03 283
6
Figure 112008033845667-PCT00030
 4-({4-[(2-메틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (2-메틸프로필)아민/Aldrich 2.39 325
7
Figure 112008033845667-PCT00031
 4-[(4-{[(1R)-1-메틸프로필]아미노}-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노]벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 [(1S)-1-메틸프로필]아민/Acros 2.34 325
8
Figure 112008033845667-PCT00032
 4-({4-[(2,2-디메틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (2,2-디메틸프로필)아민/Fluorochem 2.51 339
방법 4:
2-{[4-(아미노카르보닐)페닐]아미노}-7-[(트리플루오로메틸)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일 트리플루오로메탄술포네이트(1190mg, 60% 순도)를 IPA(17ml)에 현탁시켰다. 이러한 혼합물의 분취량(1ml)에 IPA(1ml) 및 DIPEA(17μl) 중의 아민(0.15mmol) 용액을 처리하였다. 반응물을 밤새 환류 상태로 80℃에서 교반하였다. 반응물을 질소 스트림 하에서 농축시키고, 잔여물을 디옥산(1ml) 및 수산화나트륨(2M, 1ml) 중에 용해시키고, 생성된 이상성 혼합물을 ~72시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 디옥산 상을 분리시키고 농축시켰다. 잔여물을 MDAP로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발 건조시켜 요망되는 생성물을 생성시켰다.
하기 화합물이 방법 4를 이용하여 제조되었다:
예 구조식 화합물명 아민 시약/공급원 LC/MS Rt(분) LC/MS MH+
9
Figure 112008033845667-PCT00033
 4-{[4-(프로필아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 1-프로필아민/Aldrich 2.24 311
10
Figure 112008033845667-PCT00034
 4-{[4-(에틸아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 에틸아민/Aldrich 2.12 297
11
Figure 112008033845667-PCT00035
 4-{[4-(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (2,2,2-트리플루오로에틸)아민/Aldrich 2.51 351
예 구조식 화합물명 아민 시약/공급원 LC/MS Rt(분) LC/MS MH+
9
Figure 112008033845667-PCT00036
 4-{[4-(프로필아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 1-프로필아민/Aldrich 2.24 311
10
Figure 112008033845667-PCT00037
 4-{[4-(에틸아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 에틸아민/Aldrich 2.12 297
11
Figure 112008033845667-PCT00038
 4-{[4-(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (2,2,2-트리플루오로에틸)아민/Aldrich 2.51 351
실시예 12
4-({4-[(2,2-디플루오로프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트
Figure 112008033845667-PCT00039
2-{[4-(아미노카르보닐)페닐]아미노}-7-[(트리플루오로메틸)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일 트리플루오로메탄술포네이트(312mg)를 IPA(17ml)에 현탁시켰다. 이러한 혼합물의 분취량(1ml)에 IPA(1ml) 및 DIPEA(17μl) 중의 (2,2-디플루오로프로필)아민(14.3mg, Oakwood Products) 용액을 처리하였다. 반응물을 18시간 동안 환류 상태로 80℃에서 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 잔여물을 디옥산(1 ml) 및 수산화나트륨(2M, 1ml)에 용해시키고, 생성된 이상성 혼합물을 ~90시간 동안 25℃에서 강하게 교반하였다. 디옥산 상을 분리시키고, 농축시켰다. 잔여물을 MDAP로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발 건조시켜 표제 화합물을 생성시켰다. LC/MS; Rt 2.43분, MH+ 347.
실시예 13
4-({4-[(3-메틸부틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트
Figure 112008033845667-PCT00040
2-{[4-(아미노카르보닐)페닐]아미노}-7-[(트리플루오로메틸)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일 트리플루오로메탄술포네이트(2.7g, 불순물 ~4.2mmol)를 IPA(42ml)에 현탁시켰다. 이러한 혼합물의 분취량(1 ml)에 IPA(1 ml) 및 DIPEA(17μl) 중의 (3-메틸부틸)아민(13.1mg, Aldrich)을 처리하였다. 반응물을 ~72시간 동안 환류 상태로 80℃에서 교반하였다. 반응물을 농축시키고(진공 원심분리), 잔여물을 메탄올(1.5ml)에 용해시키고, 메탄올중 나트륨 메톡시드(0.5M, 0.5ml)를 처리하고, 생성된 용액을 밤새 80℃에서 교반하였다. 반응물을 농축시키고(진공 원심분리), 잔여물을 MDAP로 정제시켰다. 생성물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 표제 화합물을 생성시켰다(13.8mg) (정제 방법 1). LC/MS; Rt 2.63분, MH+ 339.
하기 화합물을 유사한 방법으로 제조하고, 상기 정제 방법(정제 방법 1) 또는 정제 방법 2(하기)를 이용하여 정제시켰다.
정제 방법 2
나트륨 메톡시드를 이용하여 탈보호시킨 후, 탈보호된 종으로의 전환이 불충분하였다. 반응물을 농축시키고, 잔여물을 디옥산(1 ml) 및 수산화나트륨(2M, 1 ml)에 용해시켰다. 반응물을 16시간 동안 강하게 교반하였다. 디옥산 상을 분리시키고, 농축시키고, 잔여물을 MDAP로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발 건조시켜 요망되는 생성물을 생성시켰다.
예 구조식 화합물명 아민 시약/공급원 정제 방법 LC/MS Rt(분) LC/MS MH+
14
Figure 112008033845667-PCT00041
 4-({4-[(1-에틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (1-에틸프로필)아민/Aldrich 1 2.52 339
15
Figure 112008033845667-PCT00042
 4-({4-[(2-플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (2-플루오로에틸)아민 히드로클로라이드/Aldrich 2 2.21 315
16
Figure 112008033845667-PCT00043
 4-({4-[(1,1-디메틸에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (1,1-디메틸에틸)아민/Aldrich 1 2.48 325
17
Figure 112008033845667-PCT00044
 4-({4-[(3,3,3-트리플루오로프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (3,3,3-트리플루오로프로필)아민 히드로클로라이드/Apollo 2 2.53 365
18
Figure 112008033845667-PCT00045
 4-({4-[(2,2-디플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 (2,2-디플루오로에틸)아민/Apollo 1 2.39 333
실시예 19
4-({4-[(1-메틸에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트
Figure 112008033845667-PCT00046
2-요오도-N-(1-메틸에틸)-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(45.8mg), 4-아미노벤즈아미드(20.4mg, Aldrich), 탄산세슘(97.5mg), 2-디시클로헥실포스피노-2'-(N,N-디메틸아미노)비페닐(5.8mg) 및 비스(디벤질리덴아세톤) 팔라듐(5.8mg)의 혼합물을 DMF(2ml)에 현탁시키고, 반응물을 4시간 동안 질소하에서 80℃에서 교반하였다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 여과물을 농축시켰다. 생성된 검(gum)에 DMF(2ml) 중의 4-아미노벤즈아미드(20.4mg), 탄산세슘(130mg), 2-디시클로헥실포스피노-2'-(N,N-디메틸아미노)비페닐(5.8mg) 및 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐(5.8mg)을 처리하고, 반응물을 2시간 동안 질소하에서 80℃에서 교반하였다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 메탄올(1ml)에 용해시키고, 메탄올 중의 나트륨 메톡시드(0.5M, 1ml)를 처리하고, 밤새 60℃에서 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 잔여물을 MDAP로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 표제 화합물을 생성시켰다(6.0mg). LC/MS; Rt 2.22분, MH+ 311.
방법 5:
2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(992mg)을 DMF(20ml)에 현탁시켰다. 이러한 혼합물의 분취량(1ml)에 DMF(1ml) 중의 아닐린(0.2mmol), 탄산세슘(97.5mg), 2-디시클로헥실포스피노-2'-(N,N-디메틸아미노)비페닐(5.8mg) 및 비스(디벤질리덴아세톤) 팔라듐(5.8mg) 용액을 처리하였다. 반응물을 3시간 동안 질소하에서 80℃에서 교반하였다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 농축시키고(진공 원심분리), 잔여물을 메탄올(1ml)에 용해시키고, 메탄올 중의 나트륨 메톡시드(0.5M, 500μl)를 처리하고, 밤새 60℃에서 교반하였다. 반응물을 농축시키고, MDAP를 이용하여 정제시켰다. 적절한 분획을 건조시켜 표제 화합물을 생성시켰다.
하기 화합물이 방법 5를 이용하여 제조되었다:
예 구조식 화합물명 아닐린 시약/공급원 정제 LC/MS Rt(분) LC/MS MH+
20
Figure 112008033845667-PCT00047
 N-메틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 4-아미노-N-메틸 벤즈아미드/Park research 3 2.59 365
21
Figure 112008033845667-PCT00048
 N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 4-아미노-N-프로필 벤즈아미드/Park Research 4 2.87 393
정제:
(3) MDAP
(4) 2회의 연속적 MDAP에 의한 정제
실시예 22
N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00049
메탄올/물(4:1, 12.5ml) 중의 4-({7-[(4-메틸페닐)술포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노}-N-프로필벤즈아미드(550mg) 및 탄산칼륨(414mg)을 5시간 동안 환류 상태로 가열하였다. 냉각된 반응물을 물로 희석시키고, 여과에 의해 침전물을 분리시켰다. 고형물을 에테르로 세척하여, 백색 고형물로서 표제 화합물을 생성시켰다(315mg). LC/MS; Rt 3.10분, MH+ 393.
중간체 9
4-({7-[(4-메틸페닐)술포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)-N-프로필벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00050
t-부탄올(10ml) 중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(500mg), 4-아미노-N-프로필벤즈아미드(267mg, Buttpark Screening Library), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(68mg), 2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필비페닐(30mg) 및 탄산칼륨(222mg)의 혼합물을 밤새 질소하에서 환류 상태로 가열하였다. 냉각된 반응물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시키고, 유기상을 물 및 염수로 세척하였다. 유기상을 건조시키고(소수성 프릿), 진공에서 건조시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(1:15 내지 7:1)로 용리되는 실리카 카트리지(50g) 상에서 크로마토그래피하여 정제시켰다. 용매를 생성 분획으로부터 증발시켜 표제 화합물을 생성시켰다(556mg). LC/MS; Rt 3.5분, MH+ 547.
중간체 10
2-클로로-N-(1-메틸에틸)-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
Figure 112008033845667-PCT00051
IPA(900ml) 중의 2,4-디클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(70g)의 현탁액에 이소프로필아민(70ml)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 100℃에서 가열한 후, 진공에서 농축시켰다. 잔여물을 물(1.5L)과 에틸 아세테이트(300ml) 사이에 분배시켰다. 층을 분리시키고, 수성상을 에틸 아세테이트(2x 300ml)로 추가로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 에테르로부터 증발시켜, 금색 포움(foam)으로서 표제 화합물을 생성시켰다(72.2g). NMR [CDCl3]; δH 8.10,(2H, d), 7.43,(1H, d), 7.33,(2H, d), 6.39,(1H, d), 4.97,(1H, br s), 4.37,(1H, br m), 2.41 ,(3H, s), 1.27,(6H, d). LC/MS; Rt 3.59분, MH+ 365, 367.
중간체 11
2,4-디클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
Figure 112008033845667-PCT00052
질소 분위기 하에서 DCM (1.1L) 중의 4-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-아민(86.8g), 디클로로트리메틸실란(570ml) 및 벤질 트리에틸암모늄 클로라이드(127.2g) 용액에 3차-부틸 니트라이트(52ml)를 20분에 걸쳐 적가하였다. 15분 동안 교반한 후, 혼합물을 ~20℃로 냉각시키고, 혼합물을 얼음 수조에서 냉각시키면서 조심스럽게 물(1.5L)을 처리하였다. 층을 분리시키고, 수성상을 DCM(2x 500ml)으로 추가로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 건조시키고(황산나트륨), 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 에테르로 분쇄시켜 담황색 고형물로서 표제 화합물을 생성시켰다(70.6g). NMR; [CDCl3] δH 8.12,(2H, d), 7.76,(1H, d), 7.37,(2H, d), 6.68,(1H, d), 2.44,(3H, s). LC/MS; Rt 3.54분, MH+ 342, 344, 346.
실시예 23
N-메틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00053
메탄올(0.5M, 5ml) 중의 N-메틸-4-({7-[(4-메틸페닐)술포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드(385mg) 및 나트륨 메톡시드를 1.5시간 동안 80℃에서 가열하였다. 반응물을 밤새 실온으로 냉각되도록 두고, 메탄올을 진공에서 증발시키고, 잔여물을 물로 분쇄시키고, 여과시켰다. 잔여 고형물을 실리카 상에 흡착시키고, 실리카 카트리지(20g)에 적용시키고, 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(30-100%)로 카트리지를 용리시켰다. 생성물 분획을 진공하에서 건조시키고, 잔여물을 에테르/에틸 아세테이트로 분쇄시켜, 백색 고형물로서 표제 화합물을 생성시켰다 (115mg). LC/MS; Rt 2.65분, MH+ 365.
중간체 12
N-메틸-4-({7-[(4-메틸페닐)술포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00054
t-부탄올(18ml) 중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(404mg), 4-아미노-N-메틸벤즈아미드(180mg), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(91.6mg), 2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필비페닐(47.3mg) 및 탄산칼륨(193mg)의 혼합물을 탈기시킨 후, 밤새 질소하에서 80℃에서 가열하였다. 냉각된 반응물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, SCX-2 SPE(50g)에 적용시키고, 컬럼을 에틸 아세테이트 및 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올/0.880 암모니아로 용리시켰다. 용매를 증발시켜 베이지색 포움으로 표제 화합물을 생성시켰다(385mg). LC/MS; Rt 3.52분, MH+ 519.
중간체 13
4-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-아민
Figure 112008033845667-PCT00055
질소하에서 나트륨 하이드라이드(오일중 60% 분산액, 2.2g)를 교반된 DMF(120ml) 중의 4-클로로-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-아민(8.0g, WO2004024082)의 냉각(얼음-수조) 용액에 첨가하였다. 15분 후, DMF(50ml) 중의 4-톨루엔술포닐 클로라이드(11g) 용액을 10분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 25분 동안 교반하고, 10% 암모늄 클로라이드 용액(800ml)에 붓고, 에틸 아세테이트(3x 200ml)로 추출하였다. 조합된 추출물을 물로 세척(3x 200ml)하고, 건조시키고(황산나트륨), 진공에서 증발시켜, 황색 고형물로서 표제 화합물을 생성시켰다(15g). LC/MS; Rt 3.34분, MH+ 325.
중간체 14
4-클로로-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
Figure 112008033845667-PCT00056
실온에서 3차-부틸 니트라이트(23ml)를 THF(250ml) 중의 4-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-아민(15g), 요오드화구리(10.6g), 요오드(13.7g) 및 디요오도메탄(44ml)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 이후, 혼합물을 20분에 걸쳐 80℃로 가열하고, 45분 동안 이러한 온도를 유지시켰다. 냉각된 반응 혼합물을 나트륨 술파이트(1000ml) 수용액에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출(3x 300ml)하였다. 조합된 추출물을 물로 세척(2x 300ml)하고, 건조시키고(황산나트륨), 용매를 증발시켰다. 잔여물을 시클로헥산/에테르(3:1)로 용리되는 실리카(800g) 상에서 플래시 크로마토그래피하여 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜, 오프-화이트(off-white) 고형물로서 표제 화합물을 생성시켰다(8.5g). LC/MS; Rt 3.74분, MH+ 435.
중간체 15
2-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
Figure 112008033845667-PCT00057
2,4-디클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(4.0g), 2,2,2-트리플루오로에틸아민(1.49g, Aldrich), DIPEA(3.23ml) 및 에탄올(100ml)의 혼합물을 밤새 질소하에서 95℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔여물을 에틸 아세테이트(500ml)에 용해시키고, 물로 세척(5x 300ml)하고, 유기상을 농축시켰다. 잔여물을 에탄올(100ml)에 용해시키고, 2,2,2-트리플루오로에틸아민(1.49g, Aldrich) 및 DIPEA(3.23ml)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 질소하에서 95℃에서 가열하였다. 혼합물을 농축시키고, 잔여물을 에틸 아세테이트(450ml)에 용해시키고, 물로 세척(5x 200ml)하였다. 유기상을 건조시키고(소수성 프릿), 농축시켜 표제 화합물을 생성시켰다(4.43g). LC/MS; Rt 3.64분, MH+ 405.
실시예 24
N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00058
4-({7-[(4-메틸페닐)술포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)-N-프로필벤즈아미드(101g)에 메탄올(1500ml)을 첨가하고, 물(500ml)을 첨가하고, 고체 탄산칼륨(76.5g)을 첨가하였다. 이러한 용액을 가열함에 따라 급속하게 흐려졌다. 5시간의 환류 후, 반응물을 냉각시키고, 여과시켰다. 분리된 백색 고형물을 물로 세척(~1.5L)하고, 필터 상에서 흡수 건조시켰다. 이러한 고형물을 5% 메탄올을 함유하는 물에 500ml의 부피로 현탁시키고, 또 다른 500ml의 메탄올/물을 첨가하고, 1시간 동안 혼합물을 잘 교반하고, 진공하에서 여과시키고, 메탄올/물(250ml)로 세척하였다. 고형물을 흡수 건조시키고, 40℃에서 고진공하에서 추가로 건조시켜, 백색 고형물로서 요망되는 생성물을 생성시켰다(60.3g). LC/MS; Rt 2.90분, MH+ 393. NMR; [D6-DMSO] δH 11.22,(1H, s), 9.10,(1H, s), 8.19,(1H, t), 7.93-7.86,(3H, m), 7.73,(2H, d), 6.89,(1H, m), 6.51,(1H, m), 4.38,(2H, m), 3.20,(2H, q), 1.53,(2H, m), 0.89,(3H, t).
중간체 16
4-({7-[(4-메틸페닐)술포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)-N-프로필벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00059
4-아미노-N-프로필벤즈아미드(36.7g)에 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(69.4g), 고체 탄산칼륨(34.4g) 및 질소 퍼징된 3차-부탄올(1700ml)을 첨가하였다. 이러한 혼합물을 10분 동안 질소로 퍼징시키고, 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(3.14g) 및 2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필비페닐(3.28g)을 첨가하였다. 혼합물을 빛이 없는 곳에서 질소하에서 밤새 85℃에서 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시키고, 유기상을 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 진공에서 증발시켜 암적색 오일/포움을 생성시켰다. 이러한 미정제 생성물을 따뜻한 에틸 아세테이트(500ml)에 용해시키고, 시클로헥산(500ml)을 점진적으로 첨가하였다. 생성된 고형물을 진공하에서의 여과에 의해 분리하고, 분리된 베이지색 고형물을 시클로헥산으로 세척하였다. 점착성의 고형물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 증발시켜 고형물을 생성시키고, 이를 에틸 아세테이트/DCM 구배(0-50%)로 용리되는 실리카(1.5kg) 상에서 크로마토그래피하여 정제시켰다. 적절한 분획으로부터 용매를 증발시켜, 백색 포움으로서 요망되는 생성물을 생성시켰다(70.76g). LC/MS; Rt 3.54분, MH+ 547. NMR; [D6-DMSO] δH 9.51, (1H, s), 8.34-8.29,(2H, m), 7.99-7.96,(4H, m), 7.84,(2H, d), 7.37-7.36,(3H, m), 6.85,(1H, d), 4.36,(2H, m), 3.23,(2H, q), 2.31,(3H, s), 1.55,(2H, m), 0.90,(3H, t) + 에틸 아세테이트.
중간체 17
2-클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
Figure 112008033845667-PCT00060
에탄올(1900ml) 중에 현탁된 2,4-디클로로-7-[(4-메틸페닐)술포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(140g)에 DIPEA(105.9g)를 첨가하고, 트리플루오로에틸아민(81.2g)을 첨가하였다. 혼합물을 응축복수기(water condenser)의 상부의 드라이-아이스 응축기를 이용하여 가열 환류시켰다. 4.5시간 후, 트리플루오로에틸아민(33ml)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 75℃에서 교반하였다. 약간의 냉각후 트리플루오로에틸아민(33ml)을 첨가하고, 지속적으로 가열하였다. 23.5시간 후, 반응물을 냉각시키고, 휘발성 물질을 증발시켰다. 생성된 오일을 에틸 아세테이트(1100ml)에 용해시키고, 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 증발시켜 갈색 오일을 생성시키고, 밤새 응고시켰다. 이러한 약간 밀랍성의 고형물을 분쇄시키고, 15분 동안 에테르(350ml)에서 잘 교반하였다. 헥산(300ml)을 첨가하고, 슬러리를 진공하에서 여과하였다. 고형물을 물/헥산(1:1, 300ml)으로 세척하고, 흡수 건조시킨 후, 고진공하에서 건조시켜, 담황색-베이지색 고형물로서 요망하는 생성물을 생성시켰다(111.4g). LC/MS; Rt 3.56분, MH+ 405. NMR; [D6-DMSO] δH 8.90,(1H, m), 7.96,(2H, d), 7.65,(1H, d), 7.46,(2H, d), 6.96,(1H, d), 4.30,(2H, m), 2.37,(3H, s).
첫번째 수확물로부터 여과액을 증발시키고, 상기와 같이 다시 작업(x2)하여 두번째 수확 생성물을 생성시켰다(27.59g).
중간체 18
4-아미노-N- 프로필벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00061
탄소상 팔라듐 (10%, 50% wet, 4g)에 에틸 아세테이트 (100ml)를 첨가한 다음, 에틸 아세테이트 (1600ml)중의 니트로아미드 (10Og, Butt Park)를 첨가하고, 혼합물을 실온 및 대기압에서 밤새 수소화시켰다. 반응물을 여과하고, 촉매를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여액과 세척액을 건조(황산마그네슘)시키고, 여과하고, 증발시켜 목적 생성물을 엷은 황금색 오일로서 수득하고, 진공하에 1 시간 동안 추가로 건조시켰다(89.Og). LC/MS; Rt 1.85min, MH+ 179. NMR; [D6-DMSO] δH 7.96,(1H, t), 7.56,(2H, d), 6.52,(2H, d), 5.56,(2H, br s), 3.15,(2H, q), 1.49,(2H, m), 0.86,(3H, t).
실시예 25
N-프로필-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드 4- 메틸벤젠설포네이트
Figure 112008033845667-PCT00062
N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 (61.5g)를 무수 THF(1050ml)에 현탁시키고, 혼합물을 질소하에 40℃에서 교반하였다. 무수 THF(185ml)중의 p-톨루엔 설폰산 일수화물 (29.8g, 알드리치: Aldrich)용액을 적가하였다. 첫 번째 50ml 첨가 후에, 혼합물에 소량의 N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 4-메틸벤젠설포네이트로 씨딩하였다. 나머지 p-톨루엔 설폰산을 반응 온도를 약 40℃로 유지하면서 약 45분에 걸쳐서 적가하였다. 첨가가 완료된 후에, 반응 혼합물을 40℃에서 추가로 1 시간 동안 교반하고, 2 시간에 걸쳐서 0℃로 냉각시키고, 0℃에서 5 시간 동안 유지시킨 다음, 0.5 시간에 걸쳐서 주위 온도로 가온하였다. 결정을 여과하고, THF(500ml)로 세척하고, 진공하에 40℃에서 밤새 건조시켰다. 결정을 분쇄하고 40℃에서 추가로 밤새 재건조시켜 목적 생성물(87.5g)을 수득하였다. NMR; [D6-DMSO] δH 11.71,(1H, s), 9.78,(1H, br s), 8.94,(1H, br s), 8.35,(1H, t), 7.83,(2H, d), 7.74,(2H, d), 7.51,(2H, d), 7.13,(2H, d), 7.02,(1H, s), 6.68,(1H, s), 4.41,(2H, m), 3.31, (2H, q), 2.29,(3H, s), 1.53,(2H, m), 0.89,(3H, t).
실시예 26
4-({4-[(1- 메틸에틸 )아미노]-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00063
메탄올 (1250ml)중의 4-({4-[(1-메틸에틸)아미노]-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 (50.52g)에 무수 탄산칼륨 (45g)과 물(250ml)을 첨가하였다. 현탁액을 환류 가열하였다. 4.75시간 후에, 반응물을 냉각시키고, 메탄올을 진공하에 증발시키고, 수성 잔류물을 에틸 아세테이트 (1L, 이어서 3x 100ml)로 추출하였다. 합한 유기물을 염수로 세척하고, 건조 (황산마그네슘)시기고, 여과하고, 용매를 증발시켜 갈색 포말을 얻었다. 이를 에틸 아세테이트로 용리시키고 이어서 점점 증가하는 백분율의 메탄올(0-5%)로 용리시키는 실리카(1kg)상의 크로마토그래피로 정제한 후에, 적절한 분획으로부터 용매를 증발시켜 목적 생성물을 엷은 녹색 포말(32.3g)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.21min, MH+ 311.
이러한 물질을 아세톤(400ml)중에서 가온하면서 용해시키고, 혼합물이 탁하게 유지될 때까지(전체 용적 약 1.3L) 물을 서서히 첨가하였다. 초기 결정을 스크레칭하여, 혼합물을 스토퍼(stopper)가 없이 3일 동안 유지시키고, 빙욕에서 약 2 시간 동안 냉각시키고, 결정을 여과에 의해서 분리하였다. 고형물을 소량의 물로 세척하고, 이어서 높은 진공하에 40℃에서 밤새 건조시켜 담황색 고형물 (27.8g)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.25min, MH+ 311. NMR; [D6-DMSO] δH 11.03,(1H, s), 8.93,(1H, s), 7.91,(2H, d), 7.74,(2H, d), 7.72,(1H, br s), 7.04,(2H, br s), 6.80,(1H, s), 6.47,(1H, s), 4.44,(1H, m), 1.25,(6H, d) 및 아세톤.
중간체 19
4-({4-[(1- 메틸에틸 )아미노]-7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00064
2-클로로-N-(1-메틸에틸)-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (45g)에 4-아미노벤즈아미드 (20.1g), 질소-퍼징된 3차-부탄올 (1125ml), 무수 탄산칼륨 (24.7g), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필바이페닐 (2.35g) 및 트리스(디벤질이덴 아세톤)디팔라듐 (2.26g)을 첨가하였다. 광을 차단하면서 혼합물을 질소하에 환류 가열하였다. 5.5 시간 후에, 혼합물을 서서히 냉각시키고, 용매를 증발시켜 적갈색 오일/포말을 얻었다. 이러한 잔류물을 물(1000ml)로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기물을 염수로 세척하고, 건조(황산마그네슘)시키고, 셀라이트를 통해서 여과하고, 용매를 증발시켜 적갈색 오일/포말을 얻었다. 이러한 물질을 DCM / 에틸 아세테이트 (2:1 내지 1 :1 및 최종적으로 2:3)로 용리시키는 실리카(1600g)상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획으로부터 용매를 증발시켜 목적 화합물을 엷은 핑크-베이지색 고형물(42.1g)으로서 수득하였다. LC/MS; Rt 3.32min, MH+ 465. NMR; [D6-DMSO] δH 9.31,(1H, s), 7.97,(4H, d), 7.83,(2H, d), 7.80,(1H, br s), 7.47, (1H, d), 7.38,(2H, d), 7.28,(1H, d), 7.11,(1H, br s), 6.80,(1H, d), 4.37,(1H, m), 2.31,(3H, s), 1.21(6H, d) 및 에틸 아세테이트.
실시예 27
4-({4-[(1,1-디메틸에틸)아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노)-N-메틸벤즈아미드 트리플루오로아세테이트
Figure 112008033845667-PCT00065
N-(1,1-디메틸에틸)-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘- 4-아민 (O.8mmol)을 DMF (16ml)에 용해시켰다. 비스(디벤질이덴아세톤) 팔라듐 (10mol%, 알드리치), 2-디시클로헥실포스포노-2'-(N,N-디메틸아미노) 바이페닐 (15mol%), 탄산세슘 (0.3mmol) 및 4-아미노-N-메틸벤즈아미드 (0.15mmol)를 분취량의 상기 용액(2ml)과 혼합하였다. 반응물을 80℃에서 2 시간 동안 가열하고, 냉각시키고, 셀라이트를 통해서 여과하고 농축시켰다. 반응물을 메탄올(1.5ml)중에 용해시키고, 메탄올중의 나트륨 메톡시드(0.5M, 500㎕)로 처리하고, 70℃에서 2 시간 동안 교반하고, 실온에서 밤새 정치시켰다. 반응물을 추가의 5 시간 동안 가열하고, 농축시키고, MDAP를 사용하여 정제시켰다. 생성물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 표제 화합물(3mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.58min, MH+ 339.
중간체 20
N-(1,1-디메틸에틸)-2- 요오도 -7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-아민
Figure 112008033845667-PCT00066
에탄올(10ml)중의 4-클로로-2-요오도-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (500mg)을 3차-부틸아민 (610μl) 및 DIPEA (410μl)로 처리하였다. 반응물을 80℃에서 6.5 시간 동안 교반하고, 실온에서 주말 동안 정치시켰다. 3차-부틸아민 (100μl)을 첨가하고 반응물을 80℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 반응물을 농축시키고, 30분에 걸쳐서 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(0-100%)로 용리시키는 실리카 카트리지(50g)상의 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 건조시켜 표제 화합물(0.4g)을 수득하였다. LC/MS; Rt 4.01 min, MH+ 471.
실시예 28
N-(1- 메틸에틸 )-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00067
DMF (0.75ml)중의 4-({7-[(4-메틸페닐)설포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조산 (60mg), TBTU (42mg) 및 DIPEA (0.062ml)를 스토퍼(stopper)가 있는 플라스크에서 실온하에 교반하였다. 30분 후에, 이소프로필아민 (0.101ml)을 첨가하고, 반응물을 1 시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공하에 건조시키고, 잔류물을 메탄올로 공비제거하였다. 메탄올중에 용해된 잔류물을 미리-조정된 SCX-2 카트리지(5g)에 적용시키고, 메탄올로 세척하고 생성물을 메탄올중의 2 N 암모니아와 함께 용리시켰다. 염기성 분획을 건조시키고, 잔류물을 물(0.5ml) 및 메탄올(1.5ml)에 시키고, 탄산칼륨(41mg)을 첨가하였다. 혼합물을 85℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 탄산칼륨 (30mg)을 첨가하고, 반응물을 85℃에서 추가의 15 시간 동안 교반하였다. 반응물을 여과하고, 고형물을 물과 에테르로 세척하고, 진공하에 건조시켜 표제 화합물을 오프-화이트 고형물(17mg)으로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 393, Rt 3.03min.
중간체 21
4-({7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노)벤조산
Figure 112008033845667-PCT00068
DCM (6ml)중의 1,1-디메틸에틸 4-({7-[(4-메틸페닐)설포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조에이트(150mg)를 TFA (1 ml)로 처리하고 실온에서 1.75 시간 동안 교반하였다. 휘발물을 진공하에 증발시키고 잔류 고형물을 에틸 아세테이트 (25ml)에 용해시켰다. 용맥을 물(2x 25ml)로 세척하고, 건조(소수성 프릿(frit))시켰다. 용매를 증발시켜 표제 화합물을 녹색 고형물(130mg)로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 506, Rt 3.72min.
중간체 22
1,1-디메틸에틸-4-({7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤조에이트
Figure 112008033845667-PCT00069
3차-부탄올 (5ml)중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (200mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (11.8mg), 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (45.2mg), 탄산칼륨 (95.6mg) 및 3차-부틸 4-아미노벤조에이트 (114.5mg, Fluka)의 혼합물을 탈기시켰다. 용기를 밀봉하고 120℃에서 3 시간 동안 마이크로파로 조사(irradiation)하였다. 반응 혼합물을 건조시키고 잔류물을 에틸 아세테이트에 현탁시켰다. 현탁액을 SCX-2 카트리지(10g, 메탄올에 이어진 에틸 아세테이트로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시키고, 에틸 아세테이트, 메탄올 및 메탄올중의 2N 암모니아로 용리시켰다. 암모니아 분획을 농축시키고, 메탄올에 재용해시키고, 플로리실(Florisil)상으로 흡착시켰다. 이를 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(0-50%)로 용리시키는 실리카 카트리지(100g)상의 크로마트그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 건조시키고, 에테르와 함께 공비시켜 표제 화합물을 황색 고형물(150mg)로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 562, Rt 4.00min.
실시예 29
N-(2- 메틸프로필 )-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00070
DMF (0.75ml)중의 4-({7-[(4-메틸페닐)설포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조산 (60mg), TBTU (42mg) 및 DIPEA (0.062ml)를 스토퍼가 있는 플라스크 중의 실온에서 교반하였다. 30분 후에, 이소부틸아민 (0.117ml)을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하게 증발시키고, 잔류물을 메탄올과 함께 공비시켰다. 메탄올중의 잔류물을 미리-컨디셔닝된 SCX-2 카트리지(5g)에 적용시키고, 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2N 암모니아로 용리시켰다. 염기성 분획을 건조시키고, 잔류물을 물(0.5ml) 및 메탄올 (1.5ml)에 용해시켰다. 탄산칼륨 (69mg)을 첨가하고, 혼합물을 85℃에서 7 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 고형물을 물과 에테르로 세척하였다. 세척을 반복하고, 에테르 분획을 고형물과 합하고, 건조시켰다. 잔류 고형물을 가온된 메탄올에 용해시키고, SCX-2 카트리지(5g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2N 암모니아 용액으로 용리시켰다. 암모니아 분획을 건조시켜 표제 화합물을 백색 고형물(23.2mg)로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 407, Rt 3.09min.
실시예 30
N-에틸-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00071
메탄올 (10ml) 및 물 (5ml)중의 N-에틸-4-({7-[(4-메틸페닐)설포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 (306mg) 및 탄산칼륨 (794mg)을 85℃에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 반응물을 주위 온도로 냉각시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 고형물을 메탄올에 현탁시키고, 여과하고, 여액을 SCX-2 카트리지(20g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2N 암모니아로 용리시켰다. 암모니아 분획을 합하고 건조시켰다. 잔류 고형물을 메탄올에 용해시키고 플로리실상으로 흡착시켰다. 이러한 물질을 30분에 걸쳐서 DCM/메탄올 구배(0-25%)로 용리시키는 실리카 카트리지(50g)상의 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 용리된 분획중 하나를 침전되게 하고, 이를 여과하여 분리하고, DCM으로 세척하였다. 진공중에서 건조시킨 후에, 이는 표제 화합물을 백색/핑크 고형물(12mg)을 생성시켰다. LC/MS; MH+ 379, Rt 2.81 min.
중간체 23
N-에틸-4-({7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-7H-피 롤로[2,3-d]피리미 딘-2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00072
3차-부탄올 (12ml)중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (350mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (21 mg), 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (48mg), 탄산칼륨 (167mg) 및 4-(에틸카르바밀)아닐린 (170mg, Butt Park)을 질소하에 80℃에서 밤새 가열하였다. 반응물을 열원으로부터 제거하고, 내용물을 마이크로파 용기에 옮겼다. 혼합물을 탈기시키고, 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (48mg)을 첨가하였다. 혼합물을 밀봉된 용기중에서 105℃에서 2 시간 동안 마이크로파를 조사시켰다. 반응 혼합물을 질소하에 탈기시키고, 105℃에서 1.5 시간 동안 마이크로파 중에서 다시 가열하였다. 반응 혼합물을 진공중에서 농축시키고, 잔류 고형물을 에틸 아세테이트에 현탁시켰다. 셀라이트를 통해서 여과시킨 후에, 여액을 플로리실상으로 예비-흡수시키고, 60분에 걸쳐서 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(0-100%)로 용리시키는 실리카 카트리지(100g)상의 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 증발시켜 표제 화합물을 황색 오일(306mg)로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 533, Rt 3.61min.
실시예 31
N,N-디메틸-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00073
IPA (3ml)중의 N,N-디메틸-4-({7-[(4-메틸페닐)설포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 (114mg)를 수성 수산화나트륨 (2N, 0.64ml)으로 처리하고, 80℃에서 6 시간 동안 가열하였다. 온도를 70℃로 저하시키고, 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 22시간의 가열 후에 실온으로 냉각시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 현탁시키고, SCX-2 카트리지(5g, 메탄올과 에틸 아세테이트로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 에틸 아세테이트, 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2N 암모니아로 용리시켰다. 용매를 암모니아 분획으로부터 증발시키고, 잔류 오일을 메탄올에 용해시키고, 플로리실상으로 흡착시켰다. 이러한 물질을 시클로헥산중의 에틸 아세테이트/메탄올(1:1)의 구배(10-100%)로 용리시키는 실리카 카트리지(20g)상의 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 용매를 증발시켜 갈색 고형물을 수득하였다. 에테르로 분쇄하고 질소하에 건조시켜 표제 화합물을 황색/갈색 고형물(37.2mg)을 수득하였다. LC/MS; MH+ 379, Rt 2.64min.
중간체 24
N,N-디메틸-4-({7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00074
3차-부탄올 (2ml)중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (117mg), 4-(N,N-디메틸카르바모일)아닐린 (57mg, Apollo Scientific Ltd), 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (O) (16mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (6.9mg) 및 탄산칼륨 (55.9mg)을 1 시간 동안의 마이크로파 조사에 의해서 밀봉된 용기에서 120℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 셀라이트 패드를 통해서 여과하였다. 여액을 SCX-2 카트리지(5g, 메탄올과 에틸 아세테이트로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 에틸 아세테이트, 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올 중의 2N 암모니아 용액으로 용리시켰다. 암모니아 분획을 진공하에 건조시키고, 메탄올로부터 플로리실상으로 흡착시켰다. 이를 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(25-100%)로 용리시키는 실리카 카트리지(20g)상의 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 용매를 증발시키고, 에테르와 공비시켜 표제 화합물을 유리 같은 고형물(114mg)로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 533, Rt 3.41 min.
실시예 32
N-( 시클로프로필메틸 )-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00075
3차-부탄올 (1.5ml)중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (100mg), 4-아미노-N-(시클로프로필메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 (62.8mg) 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (13.6mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (5.9mg) 및 탄산칼륨 (91.8mg)을 교반하고, 1 시간 동안 마이크로파 중의 밀봉된 용기중에서 120℃에서 조사하였다. 혼합물을 150℃에서 추가로 1 시간 동안 가열하였다. 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (7mg) 및 탄산칼륨 (17mg)을 반응물에 첨가하였다. 용기를 밀봉하고, 혼합물을 마이크로파중에서 45분 동안 150℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2ml)로 희석시키고, 셀라이트를 통해서 여과하였다. 여액을 SCX-2 카트리지(5g, 메탄올과 에틸 아세테이트로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 에틸 아세테이트, 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2N 암모니아 용액으로 용리시켰다. 암모니아 분획을 감압하에 건조시키고, 잔류물을 IPA(1.5ml)에 용해시켰다. 용액을 수성 수산화나트륨 (2N, 1ml)으로 처리하고, 혼합물을 80℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 질소 스트림하에 증발시키고, 잔류물을 메탄올중에 현탁시켰다. 현탁액을 SCX-2 카트리지(2g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지의 상부에 보유된 고형물을 질소하에 건조시켜 표제 화합물을 오프-화이트 고형물(33mg)로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 405, Rt 2.89min.
중간체 25
4-아미노-N-( 시클로프로필메틸 ) 벤즈아미드 히드로클로라이드
Figure 112008033845667-PCT00076
N-(시클로프로필메틸)-4-니트로벤즈아미드 (23.8g)를 에탄올에 용해시키고, 탄소상 팔라듐 (10%, 1.8g)상에서 수소화시켰다. 반응물을 여과하고, 에탄올을 진공하에 증발시키고, 잔류 검을 에틸 아세테이트와 중탄산나트륨 용액 사이에 분배시켰다. 유기상을 진공중에서 건조시키고, 디옥산중의 염산(4N)을 첨가하였다. 백색 고형물을 여과에 의해서 분리하고, 에테르로 세척하고, 진고하에 건조시켜 표제 화합물(15.5g)을 수득하였다. NMR; [D6-DMSO] δH 9-8,(3H, bm), 7.81,(2H, d), 7.11,(2H, d), 3.12,(2H, m), 1.01,(1H, m), 0.42,(2H, m), 0.22 (2H, m).
중간체 26
N-( 시클로프로필메틸 )-4- 니트로벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00077
4-니트로벤조일 클로라이드 (2Og, Aldrich)를 DCM (500ml)에 용해시키고, 트리에틸아민 (16.5ml)을 첨가하였다. 시클로프로판메틸아민 (21ml, Aldrich)를 첨가(발열)하고, 반응물을 질소하에 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 증발시키고, 잔류물을 진공중에서 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. LC/MS; MH+ 221 , Rt 2.7min.
실시예 33
N 2 -{4-[(4- 메틸 -1- 피페라지닐 )카르보닐] 페닐 }- N 4 -(2,2,2- 트리플루오로에틸 )-1H-피 롤로[2,3-d]피리미 딘-2,4- 디아민
Figure 112008033845667-PCT00078
3차-부탄올 (1.5ml)중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (100mg), 1-(4-아미노벤조일)-4-메틸피레라진 (65.1 mg, Butt Park Ltd), 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (13.6mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (5.9mg) 및 탄산칼륨 (47.8mg)을 교반하고 1 시간 동안 마이크로파에 의해서 밀봉된 용기중에서 120℃에서 조사하였다. 혼합물을 추가로 30분 동안 150℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2ml)로 희석시키고, 셀라이트를 통해서 여과하였다. 여액을 SCX-2 카트리지(5g, 메탄올과 에틸 아세테이트로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 에틸 아세테이트, 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2N 암모니아 용액으로 용리시켰다. 암모니아 분획을 진공중에서 건조시키고, 잔류물을 IPA(1.5ml)에 용해시켰다. 용액을 수성 수산화나트륨 (2N, 1 ml)로 처리하고, 80℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 질소 스트림하에 증발시키고, 잔류물을 메탄올에 현탁시켰다. 현탁액을 SCX-2 카트리지(2g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 생성물을 메탄올 세척액으로 용리시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 MDAP상에서 정제하고, 적절한 분획을 합하고, 증발시켰다. 샘플을 메탄올로부터 플로리실상으로 흡착시키고 실리카 카트리지(20g)에 적용시켰다. 이를 시클로헥산 (10-100%)중의 에틸 아세테이트 / 메탄올 (1:1 )의 구배로 용리시켰다. 적절한 분획을 합하고, 용매를 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다. LC/MS; MH+ 434, Rt 2.03min.
방법 6:
무수 DMF (3.75ml)중의 4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조산 (527mg)을 DIPEA (0.78ml) 및 TBTU (530mg)로 처리하고, 실온에서 30분 동안 방치하였다. 이러한 용액의 일부(0.302ml)를 DMF (0.25ml)중의 아민 (0.2OmM) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소하의 실온에서 밤새 방치시켰다. 혼합물을 진공 원심분리중에 건조시키고, 잔류물을 MDAP에 의해서 정제하였다. 적절한 분획을 진공 원심분리를 이용하여 증발시켜 목적 생성물을 수득하였다.
하기 화합물이 방법 6에 의해서 제조되었다:
예 구조식 화합물명 아민시약/공급원 LC/MH+ LC/MS Rt(분)
34
Figure 112008033845667-PCT00079
 N-시클로헥실-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 시클로헥실아민/알드리치 433 3.2
35
Figure 112008033845667-PCT00080
 N-시클로펜틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 시클로헥실아민/알드리치 419 3.07
36
Figure 112008033845667-PCT00081
 N-메틸-N-(1-메틸에틸)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 메틸이소프로필아민/알드리치 4.7 2.84
37
Figure 112008033845667-PCT00082
 N-(1,1-디메틸에틸)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 t-부틸아민/알드리치 407 3.06
38
Figure 112008033845667-PCT00083
 N-시클로부틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 시클로부틸아민/알드리치 405 2.96
중간체 27
4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노)벤조산
Figure 112008033845667-PCT00084
에틸 4-({7-[(4-메틸페닐)설포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조에이트 (2.5g)을 에탄올(60ml)에 현탁시키고, 수성 수산화나트륨 (2N, 14.1ml)로 처리하였다. 혼합물을 80℃에서 3 시간 동안 교반하고, 주위 온도로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 빙욕에서 교반하면서 빙초산으로 산성화시켰다. 침전물을 여과에 의해서 분리하고, 아세톤에 용해시키고, 여과하고, 아세톤을 증발시켰다. 잔류물을 수 방울의 아세톤 및 물이 첨가된 에틸 아세테이트로부터 재결정하였다. 침전된 고형물을 여과에 의해서 분리하여 표제 화합물(1.0g)을 수득하였다. LC/MS; MH+ 351.98, Rt 2.87min.
중간체 28
에틸 4-({7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-7H-피롤로[ 2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤조에이트
Figure 112008033845667-PCT00085
3차-부탄올 (40ml)중의 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (7.5g), 에틸-4-아미노벤조에이트 (3.37g, Aldrich), 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (510mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (142mg) 및 탄산칼륨 (3.59g)을 질소하에 110℃에서 밤새 가열하였다. 용매를 진공중에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 용액을 셀라이트를 통해서 여과하고, 여액을 건조시켰다. 잔류물을 에탄올로부터 결정화시키고, 결정을 여과에 의해서 분리하였다. 이들을 비등하는 에탄올에 용해시키고, 용액을 먼저 실온으로 냉각시키고, 이어서 약 4℃에서 5 시간 동안 유지시켰다. 에탄올을 생성된 결정으로부터 배출시키고, 이어서 신터(sinter)상에서 건조시켜 표제 화합물(4.7g)을 수득하였다. LC/MS: MH+ 533.98, Rt 3.84min.
방법 7:
무수 DMF (6ml)중의 4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조산 (842mg)을 TBTU (847.2mg) DIPEA (1.7ml)로 처리하고, 실온에서 30분 동안 방치시켰다. 이러한 용액의 일부(0.32ml)를 DMF (6ml)중의 아민 (0.2OmM) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3.5일 동안 방치시켰다. 추가의 TBTU (32mg) 및 DIPEA (0.017ml)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 방치시켰다. 반응물을 MDAP에 의해서 정제하고, 적절한 분획을 합하고, 증발시켜 목적 화합물을 수득하였다.
하기 화합물을 방법 7에 의해서 제조하였다:
예 구조식 화합물명 아민시약/공급원 LC/MH+ LC/MS Rt(분)
39
Figure 112008033845667-PCT00086
 N-(2,2-디메틸프로필)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 네오펜틸아민/플루오로켐 엘티디 420.89 3.16
40
Figure 112008033845667-PCT00087
 N-(1-에틸-1-메틸프로필)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 3-메틸-3-펜탄아민/매트릭스 사이언스 435 3.30
41
Figure 112008033845667-PCT00088
 N-[(1S)-1-시클로헥실에틸]-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 S(+)-1-시클로헥실에틸아민/알드리치 461 3.41
42
Figure 112008033845667-PCT00089
 N,N-디에틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 트리플루오로아세테이트 디에틸아민/알드리치 406.9 2.89
실시예 43
4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00090
4-({7-[(4-메틸페닐)설포닐]-4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 (229mg)를 메탄올 (0.5M, 3ml)중의 나트륨 메톡시드에 용해시키고, 용액을 질소하에 80℃에서 약 1 시간 동안 가열하고, 이어서 실온에서 밤새 방치하였다. 반응물을 물(약 5ml)로 희석시키고, 침전물을 여과에 의해서 분리하였다. 고형물을 물로 세척하고, 신터(sinter)상에서 감압 건조시키고, 추가로 진공하에 45℃에서 건조시켜 표제 화합물을 크림 고형물(133mg)로서 수득하였다. LC/MS; MH+ 350.93, Rt 2.51 min.
중간체 29
4-({7-[(4- 메틸페닐 ) 설포닐 ]-4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00091
2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (200mg), 4-아미노벤즈아미드 (81 mg), 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (12mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (6mg) 및 탄산칼륨 (100mg)를 3차-부탄올 (7.5ml)중에서 혼합하고, 혼합물을 탈기시키고, 질소하에 85℃에서 약 20시간 동안 가열하였다. 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (12mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (6mg)을 반응물에 첨가하고, 85℃에서 3 시간 동안, 이어서 95℃에서 약 20 시간 동안 계속 가열하였다. 냉각된 반응물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 실리카상에 흡수시키고, 실리카 카트리지(20g)에 적용하였다. 카트리지를 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(0-100%)로 용리시키고, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공중에서 증발시켜 목적 생성물을 담황색 고형물(230mg)로서 수득하였다. NMR; [D6-DMSO] δH 9.51,(1H, s), 8.32,(1H, t), 7.98-7.93,(4H, m), 7.86-7.84,(3H, m), 7.40-7.37,(3H, m), 7.15,(1H, bs), 6.85,(1H, d), 4.35,(2H, m), 2.32,(3H, s).
실시예 44
4-{[4-( 메틸아미노 )-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일]아미노}-N- 프로필벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00092
2-클로로-N-메틸-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(1OOmg), 4-아미노-N-프로필벤즈아미드 (98mg), 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (50.4mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (39.1mg), 탄산칼륨 (152mg) 및 3차-부탄올 (10ml)을 혼합하고, 밀봉된 용기중의 마이크로파에 의해서 140℃에서 40분 동안 가열하였다. 반응물을 에탄올로 희석시키고, 셀라이트를 통해서 여과하고, 여액을 질소 스트림하에 건조시켰다. 잔류물을 DCM/메탄올에 용해시키고, SCX-2 카트리지 (1Og, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 부하시켰다. 카트리지를 메탄올 및 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 용매를 질소 스트림하에 메탄올성 암모니아 분획으로부터 증발시켰다. 잔류물을 30분 동안 메탄올/DCM (0-15%) + 1% 트리에틸아민의 구배로 용리시키는 실리카 카트리지(20g)상의 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물(41mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.32min, MH+ 325.
중간체 30
2- 클로로 -N- 메틸 -1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -4-아민
Figure 112008033845667-PCT00093
2,4-디클로로-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (400mg, Pharma Lab Product List) 및 에탄올 (33%, 10ml)중의 메틸아민의 용액을 밀봉된 용기중의 마이크로파에 의해서 80℃에서 10분 동안 가열하였다. 휘발물을 진공중에서 증발시키고, 잔류 고형물을 물에 현탁시키고, 5분 동안 교반하였다. 고형물을 여과에 의해서 분리하고, 진공하에 40℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물(311mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.22min, MH+ 183, 185.
실시예 45
N 2 -{4-[(1,1- 디옥시도 - 티오모르폴리닐 )카르보닐] 페닐 }- N 4 -(2,2,2- 트리플루오로에틸 )-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2,4- 디아민
Figure 112008033845667-PCT00094
4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조산 (0.42g)을 DMF (3ml)에 현탁시켰다. 현탁액을 DIPEA (0.84ml)로 처리한 다음, TBTU (0.48g)로 처리하고, 20분 동안 방치시켰다. 티오모르폴린 1,1-디옥시드 (27.0mg, Syntech)을 DMF (0.25ml)에 현탁시키고, 1/12의 활성화된 에스테르 혼합물(약 0.25ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소하에 실온에서 방치시켰다. 반응 혼합물을 MDAP에 의해서 정제하고, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공 원심분리에 의해서 증발시켰다. 잔류물을 소량의 메탄올에 용해시키고, 아미노프로필 카트리지 (1g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)를 통해서 여과하였다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 용매를 합한 여액으로부터 증발시키고 진공하에 세척하여 목적 생성물을 수득하였다. LC/MS; MH+ 468.84, Rt 2.60min.
실시예 46
N-에틸-N- 메틸 -4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00095
DMF (0.5ml)중의 4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤조산 (35.1 mg) 및 TBTU (35.3mg)의 혼합물을 DIPEA (0.053ml)로 처리하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 격렬하게 교반시켰다. N-에틸메틸아민 (0.086ml)를 첨가하고, 1.25 시간 동안 교반하였다. DIPEA (0.026ml) 및 TBTU (15.0mg)를 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 이어서, N-에틸메틸아민 (0.042ml)를 첨가하고, 혼합물을 추가의 1.25 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 소량의 메탄올에 용해시키고, SCX-2 카트리지 (1g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올에 이어서 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 적절한 분획을 수거하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 MDAP에 의해서 추가로 정제한 후에, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(12mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.76min, MH+ 393.
실시예 47
N-(2,2,2- 트리플루오로에틸 )-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00096
3차-부탄올 (2.5ml)중의 4-아미노-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)벤즈아미드 (64.7mg), 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (100mg), 탄산칼륨 (47.8mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (5.9mg) 및 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (13.6mg)의 교반 혼합물을 1 시간 동안 120℃에서 마이크로파 조사에 의해서 밀봉된 용기내에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, SCX-2 SPE 카트리지 (2Og)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 암모니아성 분획을 수거하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 IPA (3ml) 및 수성 수산화나트륨 용액 (2M, 3ml)으로 처리하고, 혼합물을 60℃에서 밤새 가열하였다. 용매를 감압하에 증발시키고, 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 용액을 SCX-2 카트리지 (2Og)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2M 암모니아 용액으로 용리시켰다. 염기성 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 MDAP에 의해서 정제한 후에, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(60mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.99min, MH+ 432.86.
중간체 31
4-아미노-N-(2,2,2- 트리플루오로에틸 ) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00097
에탄올(30ml)중의 4-니트로-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)벤즈아미드 (550mg)의 용액을 탄소상 팔라듐 (10%, 55mg)상에서 밤새 수소화(1 Atm)시켰다. 혼합물을 셀라이트를 통해서 여과하고, 잔류물을 에탄올로 세척하였다. 여액을 셀라이트를 통해서 재여과하고, 셀라이트를 에탄올로 세척하였다. 용매를 합한 여액으로부터 증발시키고, 진공하에 세척하여 표제 화합물을 백색 고형물(290mg)로서 수득하였다. LC/MS; Rt 1.91 min, MH+ 219.
중간체 32
4-니트로-N-(2,2,2- 트리플루오로에틸 ) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00098
DCM (40ml)중의 4-니트로벤조일 클로라이드 (750mg) 및 탄산칼륨 (606.6mg)의 혼합물을 2,2,2-트리플루오로에틸아민 (0.482ml)로 처리하고, 혼합물을 질소하에 실온에서 2 시간 40분 동안 교반하였다. 탄산칼륨 (606mg) 및 2,2,2-트리플루오로에틸아민 (0.482ml)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1.5 시간 동안 교반하였다. 물(40ml)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 격렬하게 교반하였다. 층을 분리되게 하고, 유기상을 분리(소수성 프릿)하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물을 백색 고형물(550mg)로서 수득하였다. LC/MS: Rt 2.63min, [M-H]- 247.
실시예 48
N 2 -[4-(1- 피페리디닐카르보닐 ) 페닐 ]- N 4 -(2,2,2- 트리플루오로에틸 )-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2,4- 디아민
Figure 112008033845667-PCT00099
3차-부탄올 (2.5ml)중의 4-(1-피페리디닐카르보닐)아닐린 (lOOmg, Fluorochem), 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (165mg), 탄산칼륨 (79mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (9.8mg) 및 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (O) (22.5mg)의 혼합물을 1 시간 동안 120℃에서 마이크로파 조사에 의해서 밀봉된 튜브에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 소량의 메탄올에 용해시키고, SCX-2 카트리지 (5g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 적절한 분획을 수거하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 소량의 메탄올에 용해시키고, 플로리실상으로 흡착시키고, 60분에 걸쳐서 에틸 아세테이트/시클로헥산 구배(0-100%)로 용리시키는 실리카 카트리지(70g)상의 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 진공하에 증발시킨 후에, 잔류물을 소량의 에테르에 용해시키고, 용매를 진공하에 증발시켜 백색 고형물(194mg)을 얻었다. 이러한 고형물을 탄산칼륨 (340mg), 메탄올 (2ml) 및 물(1 ml)로 처리하고, 혼합물을 80℃에서 밤새 가열하였다. 수산화나트륨 수용액 (2M, 1ml)을 첨가하고, 추가로 4.5 시간 동안 80℃로 계속 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 수성상을 에틸 아세테이트 (3x 20ml)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 진공하에 증발시켰다. 메탄올중의 나트륨 메톡시드(0.5M, 3ml)를 잔류물에 첨가하고, 교반 혼합물을 80℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 최소량의 메탄올에 용해시키고, 용액을 SCX-2 카트리지 (10g, 메탄올로 미리-컨디셔닝됨)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 MDAP에 의해서 정제한 후에, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(14mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.96min, MH+ 419.
실시예 49
N 2 -[4-(1- 피롤리디닐카르보닐 ) 페닐 ]- N 4 -(2,2,2- 트리플루오로에틸 )-1H- 피롤로 [2,3-d] 피리미딘-2,4- 디아민
Figure 112008033845667-PCT00100
3차-부탄올 (2.5ml)중의 4-(1-피롤리디닐카르보닐)아닐린 (56.4mg), 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (100mg), 탄산칼륨 (48mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (6mg) 및 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (14mg)의 교반 혼합물을 120℃에서 1 시간 동안 마이크로파 조사에 의해서 밀봉된 바이알(vial)에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 탄산칼륨 (24mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (3mg) 및 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (7mg)을 첨가하였다. 이어서, 교반 혼합물을 120℃에서 1 시간 동안 마이크로파 조사에 의해서 밀봉된 바이알에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, SCX-2 카트리지 (2Og)에 적용시켰다. 카트리지를 에틸 아세테이트로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 적절한 분획을 수거하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 IPA (3ml)로 현탁시키고, 수산화나트륨 수용액(2M, 3ml)으로 처리하고, 혼합물을 60℃에서 밤새 가열하였다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 염산으로 2회 세척하였다. 유기상을 진공중에서 건조시키고, 잔류물을 MDAP에 의해서 정제하고, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(17mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.83min, MH+ 405.
중간체 33
4-(1- 피롤리디닐카르보닐 )아닐린
Figure 112008033845667-PCT00101
에탄올(30ml)중의 1-[(4-니트로페닐)카르보닐]피롤리딘 (500mg)의 용액을 탄소상 팔라듐 (5%, 50mg)상에서 밤새 수소화(1Atm)시켰다. 혼합물을 셀라이트를 통해서 여과하고, 촉매를 에탄올로 2회 세척하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물을 백색 고형물(402mg)로서 수득하였다. LC/MS; Rt 1.86min, MH+ 191.
중간체 34
1-[(4- 니트로페닐 )카르보닐] 피롤리딘
Figure 112008033845667-PCT00102
DCM (50ml)중의 4-니트로벤조일 클로라이드 (750mg)의 혼합물을 피롤리딘 (1.66ml)으로 처리하고, 혼합물을 질소하에 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 염산(1M, 50ml)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 격렬하게 교반하였다. 층을 분리하고, 유기상을 탄산수소나트륨 용액(50ml)로 세척하고, 이어서 물로 세척하고, 진공하에 건조시켜 표제 화합물(500mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.54min, MH+ 221.
실시예 50
N 2 -[4-(1- 아제티디닐카르보닐 ) 페닐 ]- N 4 -(2,2,2- 트리플루오로에틸 )-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2,4- 디아민
Figure 112008033845667-PCT00103
3차-부탄올 (2.5ml)중의 4-(1-아제티디닐카르보닐)아닐린 (52.2mg), 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[213-d]피리미딘-4-아민 (100mg), 탄산칼륨 (47.8mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (6mg) 및 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (13.6mg)의 교반 혼합물을 120℃에서 1 시간 동안 마이크로파 조사에 의해서 밀봉된 바이알에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, SCX-2 SPE 카트리지 (2Og)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올, 에틸 아세테이트로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 염기성 분획을 수거하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 IPA (3ml)에 현탁시키고, 수산화나트륨 수용액 (2M, 3ml)으로 처리하고, 혼합물을 60℃에서 밤새 가열하였다. 용매를 감압하에 증발시켰다. DCM을 잔류물에 첨가하고, 불용성 물질을 여과에 의해서 분리하였다. 고형물을 메탄올(30ml)에 용해시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 클로로포름에 용해시키고, 용액을 아미노프로필 SPE (10g)에 적용시키고, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 메탄올로 용리시켰다. 클로로포름 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 MDAP에 의해서 정제한 후에, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(6mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.73min, MH+ 391.
중간체 35
4-(1- 아제티디닐카르보닐 )아닐린
Figure 112008033845667-PCT00104
에탄올(30ml)중의 1-[(4-니트로페닐)카르보닐]아제티딘 (463mg)의 용액을 탄소상 팔라듐 (46.3mg)상에서 밤새 수소화시켰다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해서 여과하고, 에탄올로 2회 세척하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물을 황색 고형물(340mg)로서 수득하였다. LC/MS; Rt 1.72min, MH+ 177.
중간체 36
1-[(4- 니트로페닐 )카르보닐] 아제티딘
Figure 112008033845667-PCT00105
DCM (50ml)중의 4-니트로벤조일 클로라이드 (750mg) 및 탄산칼륨 (607mg)의 혼합물을 아제티딘 (0.408ml)으로 처리하고, 혼합물을 질소하에 실온에서 4 시간 20분 동안 교반하였다. 탄산칼륨 (606mg) 및 아제티딘 (0.408ml)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 40분 동안 교반하였다. 물 (50ml)을 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 격렬하게 교반시켰다. 층을 분리하고, 유기상을 분리(소수성 프릿)하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물을 황색 고형물(463mg)로서 수득하였다. LC/MS; Rt 2.41 min, MH+ 207.
실시예 51
N- 메틸 -N-프로필-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00106
3차-부탄올 (2.5ml)중의 4-아미노-N-메틸-N-프로필벤즈아미드 (57mg), 2-클로로-7-[(4-메틸페닐)설포닐]-N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (100mg), 탄산칼륨 (48mg), 2-디시클로헥실포스포노-2',4',6'-트리이소프로필 바이페닐 (6mg) 및 트리스(디벤질이덴아세톤)디팔라듐 (0) (14mg)의 교반 혼합물을 120℃에서 1 시간 동안 마이크로파 조사에 의해서 밀봉된 바이알내에서 가열하였다. 냉각된 반응물을 미리-컨디셔닝된 SCX-2 카트리지 (2Og)에 적용시켰다. 카트리지를 메탄올로 세척하고, 생성물을 메탄올중의 2M 암모니아로 용리시켰다. 암모니아성 분획을 수거하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 탄산칼륨 (423.5mg), 메탄올 (2ml) 및 물(1ml)로 처리하고, 교반된 혼합물을 80℃에서 밤새 가열하였다. 물(5ml)을 첨가하고, 침전물을 여과에 의해서 분리하였다. 여액을 에틸 아세테이트(30ml)로 추출하고, 유기상을 건조(소수성 프릿)시키고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물과 침전물을 메탄올에 용해시키고, 합하고, 진공중에서 건조시켰다. 생성된 잔류물을 MDAP에 의해서 정제한 후에, 적절한 분획을 합하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(19mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.91 min, MH+ 406.9.
중간체 37
4-아미노-N- 메틸 -N- 프로필벤즈아미드
Figure 112008033845667-PCT00107
에탄올(15ml)중의 N-메틸-4-니트로-N-프로필벤즈아미드 (330mg)의 용액을 탄소상 팔라듐 (10%, 15.3mg)상에서 밤새 수소화(1Atm)시켰다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해서 여과하고, 이어서 에탄올로 세척하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(260mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.02min, MH+ 193.
중간체 38
Figure 112008033845667-PCT00108
N- 메틸 -4-니트로-N- 프로필벤즈아미드
DCM (50ml)중의 4-니트로벤조일 클로라이드 (750mg), N-메틸프로필아민 (0.622ml) 및 탄산칼륨 (836mg)의 혼합물을 질소하에 실온에서 밤새 교반하였다. 염산(1 M, 50ml)을 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하고, 상을 분리하고, 유기상을 물(100ml)로 세척하고, 건조(소수성 프릿)시켰다. 진공하에 용매를 증발시켜 잔류물을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트(25ml)에 용해시키고, 탄산수소나트륨 용액(50ml)로 세척하였다. 유기상을 수소성 프릿을 통해서 수거하고, 용매를 진공하에 증발시켜 표제 화합물(330mg)을 수득하였다. LC/MS; Rt 2.58min, MH+ 223.
실시예 52
N-프로필-4-({4-[(2,2,2- 트리플루오로에틸 )아미노]-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -2-일}아미노) 벤즈아미드 4- 메틸벤젠설포네이트
Figure 112008033845667-PCT00109
N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 (350mg)를 가열 및 음파 파쇄하면서 THF(7ml)에 용해시켰다. p-톨루엔설폰산 하이드레이트(162mg)를 가열하면서 THF(1ml)에 용해시키고, 생성된 용액을 N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드에 첨가하였다. 혼합물을 약하게 가온시켜 용액을 얻고, 이어서 실온으로 냉각하였다. 혼합물을 40℃로 재가온시키고, 내각되게 하고, 이러한 가열 냉각 사이클을 반복하였다(2회). 혼합물을 실온에서 주말동안 방치시키고, 백색 고형물을 여과에 의해서 분리하고, THF(1ml)로 세척하고, 신터상에서 감압 건조시켰다. 고형물을 추가호 진공하에 약 40℃에서 2 시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 백색 고형물(425mg)로서 수득하였다. NMR; [D6-DMSO] δH 11.46,(1H, b), 9.44,(1H, b), 8.47,(1H, b), 8.28,(1H, t), 7.79,(4H, s), 7.48,(2H, d), 7.11 ,(2H, d), 6.96,(1H, m), 6.60,(1H, m), 4.40,(2H, m), 3.21 , (2H, q), 2.29,(3H, s), 1.53,(2H, m), 0.89,(3H, t).
생물학적 시험 방법
본 발명의 화합물을 하기 검정에 따른 시험관내 활성에 대해서 시험할 수 있다.
1. 효소 검정 - 시간- 분해형광공명에너지 전달 카나아제 검정(Time-resolved fluorescence energy transfer kinase assay)
재조합 사람 Syk를 His-태깅된(tagged) 단백질*로서 발현시켰다. Syk의 활성을 시간-분해형광공명에너지 전달(TR-FRET) 검정을 이용하여 검정하였다.
버젼 A - HEPES pH 7.4, (4OmM 최종)중의 3㎕의 비오티닐화된 펩티드 함유 기질 시약, 비오틴-AAAEEIYGEI (0.5μM 최종), ATP (30μM 최종) 및 MgCl2 (1OmM 최종)을 그레이너 저용적 384 웰 블랙 플레이트(Greiner low volume 384 well black plate)중의 0.2㎕의 다양한 농도의 화합물 또는 DMSO 비히클(3.3% 최종)을 함유한 웰에 첨가하였다. 반응을 HEPES pH 7.4 (4OmM 최종)중의 3 ㎕의 Syk (2OnM 최종)의 첨가에 의해서 개시시켰다. 반응물을 실온에서 40분 동안 인큐베이션(incubation)시키고, 이어서, 4OmM HEPES pH 7.4, 0.03% BSA중의 60 mM EDTA, 15OmM NaCl, 5OnM 스트렙타비딘 APC (Prozyme, San Leandro, California, USA), W-1024 유로피움 킬레이트(europium chelate) (Wallac OY, Turku, Finland)로 표지된 0.5nM 안티포스포티로신 항체를 함유하는 3㎕의 판독 시약의 첨가에 의해서 종료시켰다. 반응물을 실온에서 60분 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 비오틴-AAAEEIYGEI의 포스포릴화 정도를 참조 유로피움 620nm 신호에 대한 특정 665nm 에너지 전달 신호의 비로서 BMG 루비스타 플레이트 판독기(BMG Rubystar plate reader) (BMG LabTechnologies Ltd, Aylesbury, UK)를 사용하여 측정하였다.
버젼 B - Syk를 16.6mM MgCI2, 8.3mM ATP의 존재하에 실온에서 30분 동안 예비-활성화시키고, 4OmM Hepes pH 7.4, 0.01% BSA중에 4nM로 희석시켰다. 4OmM HEPES pH 7.4, 0.01% BSA중의 비오티일화된 펩티드, 비오틴-AAAEEIYGEI (0.5μM 최종), ATP (30μM 최종) 및 MgCl2 (1OmM 최종)을 함유한 3㎕의 기질 시약을 그레이너 저용적 384 웰 블랙 플레이트중의 0.1㎕의 다양한 농도의 화합물 또는 DMSO 비히클(1.7% 최종)을 함유한 웰에 첨가하였다. 반응을 묽은 3㎕의 Syk(2nM 최종)의 첨가에 의해서 개시시켯다. 반응물을 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, 이어서 4OmM HEPES pH 7.4, 0.03% BSA중의 60 mM EDTA, 15OmM NaCl, 5OnM 스트렙타비딘 APC (Prozyme, San Leandro, California, USA), W-1024 유로피움 킬레이트(europium chelate) (Wallac OY, Turku, Finland)로 표지된 0.5nM 안티포스포티로신 항체를 함유하는 3㎕의 판독 시약의 첨가에 의해서 종료시켰다. 반응물을 실온에서 60분 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 비오틴-AAAEEIYGEI의 포스포릴화 정도를 참조 유로피움 620nm 신호에 대한 특정 665nm 에너지 전달 신호의 비로서 BMG 루비스타 플레이트 판독기(BMG Rubystar plate reader) (BMG LabTechnologies Ltd, Aylesbury, UK)를 사용하여 측정하였다.
본 발명에 따른 화합물을 본 검정법으로 검정하거나 유사한 시간-분해형광공명에너지 전달 키나아제 검정법으로 검정하고, 10μM이만의 IC50 값을 얻었다.
* 재조합 사람 전장 비장 티로신 키나아제 ( Syk )Syk의 제조
전장 사람 Syk를 바쿨로바이러스 시스템(baculovirus system) (Invitrogen, Paisley, Scotland)을 이용하여 N-말단 상에 6His tag를 지니도록 발현시켰다. 세포를 다운스 균질화(dounce homogenisation)에 의해서 분쇄시키고, 단편을 원심분리에 의해서 제거하고, 용해물을 NiNTA 슈퍼플로우(NiNTA Superflow) (Qiagen, Crawley, UK)와 접촉시켰다. NiNTA를 컬럼에 패킹하고, 10 컬럼 용적의 각각의 완충액 (2OmM 트리스 pHδ.O, 30OmM NaCl, 1OmM βMcEtOH, 10% 글리세롤), 완충액 + 1 M NaCl, 완충액 + 2OmM 이미다졸 및 완충액 + 30OmM 이미다졸을 이용하여 용리시켰다. 300mM 이미다졸 분획을 수거하고, 완충액을 G25M (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 2OmM MES pH 6.0, 2OmM NaCl, 1OmM βMcEtOH, 10% 글리세롤로 교환하였다. 완충액 교환된 6His-Syk를 소스15S 컬럼(Source15S column) (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)상으로 부하시키고, 컬럼을 50 컬럼 용적으로 NaCl 구배 0-500mM을 사용하여 용리시켰다. 6His-Syk 함유 분획을 수거하고, 초 여과(ultra-filtration)에 의해서 농축시켰다. 6His-Syk를 펩티드 질량 핑거 프린팅 및 온전한 LC-MS에 의해서 확인하였다.
2. 전체 세포 검점 - cFms 검정
검정의 원리
마우스 섬유아세포주 NIH-3T3 세포를 cFms-SYK 키메라로 안정적으로 형질감염시킨다. 리간드(MCSF)를 첨가하면 키메라가 이량체화되어 SYK 키나아제 도메인의 자동포스포릴화가 유도된다. 세포 용해 후에 포스포릴화된 SYK가 ELISA에 의해서 검출된다.
MCSF 에 의한 cFms - SYK 세포의 자극 버젼 A
세포를 96웰 콜라겐 1 코팅된 조직 배양 플레이트(96 well Collagen 1 coated tissue culture plate)중에 200 μl 성장 배지(10% 열 불활성화된 소 태아 혈청, 1% L-글루타아민, 400μg/ml 지네티신(geneticin) 및 400μg/ml 제오신을 함유하는 DMEM)의 용적으로 1 x 105/웰의 밀도로 평판시킨다. 37℃, 10% CO2에서 20 시간 동안 인큐베이션한 후에, 세포 상등액을 제거하고, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 200μl DMEM(무혈청 DMEM)으로 대체한다. 세포를 상기 조건하에 1 시간 동안 인큐베이션한다. 배지를 제거하고, 50μl의 적절히 희석된 화합물 용액을 첨가하고, 플레이트를 추가로 1 시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 37℃에서 20분 동안 25μl MCSF (0.66μg/ml 최종)로 자극시킨다. 상등액을 제거한 후에, 세포를 냉 PBS로 세척하고, 4℃에서 4 시간 동안 100μl 용해 완충액으로 용해시킨다.
MCSF 에 의한 cFms - SYK 세포의 자극 버젼 B
세포를 96웰 콜라겐 1 코팅된 조직 배양 플레이트(96 well Collagen 1 coated tissue culture plate)중에 200 μl 성장 배지(10% 열 불활성화된 소 태아 혈청, 1% L-글루타아민, 400μg/ml 지네티신(geneticin) 및 400μg/ml 제오신을 함유하는 DMEM)의 용적으로 1 x 105/웰의 밀도로 평판시킨다. 37℃, 10% CO2에서 20 시간 동안 인큐베이션한 후에, 세포 상등액을 제거하고, 50μl의 적절히 희석된 화합물 용액을 첨가하고, 플레이트를 추가로 1 시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 37℃에서 20분 동안 25μl MCSF (0.66μg/ml 최종)로 자극시킨다. 상등액을 제거한 후에, 세포를 냉 PBS로 세척하고, 4℃에서 4 시간 동안 100μl 용해 완충액으로 용해시킨다.
cFms ELISA
85μl 세포 용해물을 염소 항-사람 M-CSF R 포획(capture) 항체로 코팅된 96 웰 ELISA 플레이트에 옮기고 4℃에서 16 시간 동안 인큐베이션시킨다. 플레이트를 세척하고, 비오티닐화된 항-포스포티로신 검출 항체를 실온에서 2 시간 동안 첨가(100μl/웰)한다. 이를 제거하고, 30분 동안 100μl 스트렙타비딘-HRP로 대체한다. 포획된 포스포릴화된 SYK를 100μl TMB 기질을 사용하여 가시화시킨다. 반응을 50μl 1 M 황산으로 종료시키고, 흡광도를 45nm에서 측정한다.
화합물 준비
화합물을 DMSO중의 10mM 원액으로 제조하고, 9개의 연속적인 5 배 희석액을 사용하여 DMSO중에 희석액 시리즈를 제조한다. 이러한 희석액 시리즈를 무혈청 DMEM으로 추가로 1:333으로 희석시켜 시험되는 농도범위가 1 x 10-5 내지 1.54 x 10-11M이 되게 한다. 화합물을 희석액을 바이오멕 2000 또는 바이오멕 Nx 자동화 로봇 피페팅 시스템(Biomek 2000 or Biomek Nx automated robotic pipetting system)을 사용하여 준비한다.
3. B 세포 증식 검정
배경
이러한 검정으로 관찰된 B 세포 집단은 나이브(naive) 성숙 IgM/lgD 발현 집단이다. 이들은 70% 이상의 정제된 B 세포 집단(나머지는 이소타입(isotype) 스위칭된 기억 B 세포이다)이며 세포가 항-IgM으로 자극됨에 따라서 증식하는 유일한 세포이다.
항-IgM은 SyK 종속적인 B 세포 수용체를 통해서 신호전달을 유도한다. 증식은 세포내로의 삼중수소화된(tritiated) 메틸 티미딘의 혼입을 관찰함으로써 측정될 수 있는 B 세포 신호전달의 기능적 척도이다.
원안
정제된 사람 편도선 B 세포를 버클레이* 배지(Buckleys* medium)에 1.25 x 106 ml의 농도로 재현탁시킨다.
버클레이 배지에 재현탁된 160μl의 세포를 96웰 플레이트의 화합물 및 대조군 웰에 첨가한다. 대조군 웰을 96 웰 플레이트의 컬럼 11 및 12에 위치시킨다. 바탕 웰은 컬럼 12에 위치시키고, 20μl의 10μM 대조군을 첨가하여 적절한 바탕 대조를 제공한다. 20μl의 1% DMSO를 자극된 대조군을 위하여 컬럼 11중의 웰에 첨가한다.
화합물 적정물을 컬럼 1 내지 10에서 위치시킨다. 3가지의 화합물을 각각의 플레이트 상에서 이중으로 수행시키고, 열(row) A 및 B를 대조 화합물 적정에 이용한다.
DMSO의 최종 농도는 검정에서 0.1%이다. 세포는 45분 동안 방치되며, 45분 후에, 증식성 자극을 96 웰 플레이트의 첫 번째 11 웰에 첨가하고, 20μl 의 배지를 컬럼 12에 첨가한다. 사람 IgM에 대해서 유발된 폴리클로날 염소 항-혈청의 F(ab')2 단편을 15μg/ ml의 최종 농도로 사용하여 세포를 자극시킨다. (Biosource. Cat no: AMI 4601 ).
적정된 메틸 티미딘을 웰당 1μCi의 농도로 세포에 첨가한다. (Amersham, TRK 758). 방사성 활성을 최초 자극 65 시간 후에 가하고, 세포상에서 6 내지 8 시간 동안 방치한다. 메틸 티미딘으로 플러싱시킨 후에, 세포를 스카트론 웰 세포 수거기(Skatron 96 well cell harvester)상에서 유리 섬유 매트상으로 수거한다. 이들이 건조되면 이들을 왈락 1450 마이크로베타 신틸레이션 계수기(Wallac 1450 Microbeta scintillation counter)상에서 계수한다.
데이터를 XL 파일로서 다운로드하고, IC50을 활성 기준을 이용하여 측정한다.
* 버클레이 배지: 450 ml 이스코브스(Iscoves) (Sigma I 3390), 50ml FCS, 2.5 g BSA, 5ml 페니실린/스트렙토마이신, 5ml 클루타민 (20OmM), 500μl Apo 트랜스페린 (50mg/ml) Sigma (T 1147), 100μl 소 인슐린 (10mg/ml) Sigma (I 1882).
화합물 준비
화합물을 DMSO중의 10mM 원액으로 제조하고, 9개의 연속적인 3 배 희석액을 사용하여 DMSO중에 희석액 시리즈를 제조한다. 이러한 희석액 시리즈를 버클레이 배지로 추가로 1:100으로 희석시켜 시험되는 농도범위가 100μM to 5nM가 되게 한다. 이를 20μl로서 96 웰 플레이트에 이중으로 가하여 시험되는 각각의 화합물에 대해서 두 개의 IC50을 생성시킨다. 각각의 플레이트를 내부 표준으로 작용하는 대조군의 존재하여 시험한다.
4. LAD2 검정
검정의 원리
LAD2는 비만 세포 육종/백혈병을 앓고 있는 환자의 골수 흡출물로부터 NIH에 의해서 확립된 줄기세포 인자 (SCF)-의존성 사람 비만 세포주이다. LAD 2 세포는 CD34+-유도된 사람 비만 세포와 유사하며 작용성 FcεRI를 발현한다. FcεRI는 IL-4, SCF 및 IgE의 존재하에 상향 조절되고, 후속된 세포-결합된 IgE의 가교는 헥소스아미니데이즈(hexosaminidase) 방출로서 측정될 수 있는 탈과립화를 초래한다.
LAD2 세포의 프라이밍에 의한 Fc εRI의 상향조절
LAD2 세포를 1x105/ml으로 사람 재조합 SCF (100ng/ml; R&D systems), 사람 재조합 인터루킨-4 (6ng/ml; R&D Systems) 및 IgE (100μg/ml; Calbiochem)로 추가로 보충된 완전 스템 프로-34SFM (스템 프로-34 영양 보충제 (1:40), 글루타민 (2mM), 페니실린 (100μg/ml), 스트렙토마이신(100μg/ml)을 함유한 킵코 카탈로그 10640-019 배지(Gibco Cat 10640-019 media))에 재현탁시킨다. 세포를 이어서 가습된 대기중의 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 유지시킨다.
화합물 준비
화합물을 100% DMSO중의 2mM 원액으로부터 적정하여 9개의 연속적인 1:3 희석액을 제조한다(V 96-well Nunc; Biomek 2000). 이러한 마스터 플레이트로부터 3μl를 딸(daughter) 플레이트(평면 96 웰 넝바이오멕 Fx: flat 96-well NuncBiomek Fx)에 분배시키고, 이어거 2mM 글루타민을 함유한 RPMI에 1:40으로 희석시키고, 20μl 의 희석된 화합물을 그레이너 세포 플레이트 상으로 옮긴다. 그러므로, 최종 화합물 농도 범위는 일정한 0.5% DMSO에서 1x10-5M 내지 5x10-10M이다. 대조 웰을 0.5%DMSO로 처리한다.
항- IgE 에 의한 LAD2 세포의 활성화 버젼 A
프라이밍된 LAD2 세포를 원심분리하고(30Og, 5min), 상등액을 따라내고, 세페 펠릿을 글루타민 (2mM)로 보충된 RPMI중에 1x104 세포/ml로 재현탁시킨다. 추가의 원심분리 후에(30Og, 5min), 세포를 글루타민(2mM)로 보충된 새로운 RPMI에 재현탁시키고, 밀도를 2.85x105/ml으로 조정하고, 20μl 희석된 화합물을 함유하는 무균의 V-웰 플레이트(70μl/웰; Greiner)(상기된 바와 같이 준비됨)내로 피펫팅한다. 세포를 이어서 항-IgE의 최대 미만 농도(10μl 용적으로 1:2700의 최종 검정 희석액을 얻음; Sigma)로 활성화시키기 전에 1시간 동안 인큐베이션한다(가습된 대기중의 37℃, 5% CO2). 40분 동안 인큐베이션 한 후에(가습된 대기중의 37℃, 5% CO2), 플레이트를 원심분리하고(120Og, 10min, 4°C), 상등액을 헥소스아미니데이즈 검정을 위해서 제거한다. 세포 펠릿을 37℃에서 30분 동안 100μl/웰 트리톤-X (RPMI 2mM 글루타민중의 0.5%)에 용해시킨다.
항- IgE 에 의한 LAD2 세포의 활성화 버젼 B
프라이밍된 LAD2 세포를 원심분리하고(40Og, 5min), 상등액을 따라내고, 세페 펠릿을 글루타민 (2mM)로 보충된 RPMI중에 1x104 세포/ml로 재현탁시킨다. 추가의 원심분리 후에(40Og, 5min), 세포를 글루타민(2mM)로 보충된 새로운 RPMI에 재현탁시키고, 밀도를 5.7 x 105/ml으로 조정하고, 20μl 희석된 화합물을 함유하는 무균의 V-웰 플레이트(70μl/웰; Greiner)(상기된 바와 같이 준비됨)내로 피펫팅한다. 세포를 이어서 항-IgE의 최대 미만 농도(10μl 용적으로 1:2700의 최종 검정 희석액을 얻음; Sigma)로 활성화시키기 전에 1시간 동안 인큐베이션한다(가습된 대기중의 37℃, 5% CO2). 40분 동안 인큐베이션 한 후에(가습된 대기중의 37℃, 5% CO2), 플레이트를 원심분리하고(120Og, 10min, 4°C), 상등액을 헥소스아미니데이즈 검정을 위해서 제거한다. 세포 펠릿을 37℃에서 30분 동안 100μl/웰 트리톤-X (RPMI 2mM 글루타민중의 0.5%)에 용해시킨다.
베타- 헥소스아미니데이즈 검정
베타-헥소스아미니데이즈 검정을 형광 생성물로의 4-메틸엄벨리페릴 N-아세틸-ε-D 글루코사미니드(methylumbelliferyl N-acetyl-ε-D glucosaminide: Sigma)의 전환에 의해서 측정한다. 상등액 또는 용해물(25μl)를 블랙 96-웰 플레이트(Nunc)중의 동일한 양의 4-메틸엄벨리페릴 N-아세틸-ε-D 글루코사미니드(0.2M 나트륨 시트레이트 완충액중의 500μM, pH 4.5)와 함께 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 반응을 이어서 트리즈마 pH9(Trizma pH9) (90μl)의 첨가에 의해서 종결시키고, 형광 생성물을 여기 (excitation) 356nm 및 방출 450nm(Tecan Safire)를 사용하여 측정한다.
유용한 스크리닝 기술은 검정 1(효소 검정 (pKi), 검정 2 및 이어진 검정 3(B 세포 증식) 또는 검정 4(LAD2)를 포함한다.
상세한 설명 및 청구범위를 구성하는 본원은 어떠한 후속 출원에 대하여 우선권의 기초로서 이용될 수 있다. 그러한 후속 출원의 청구범위는 본원에 기재된 어떠한 특징 또는 그러한 특징의 조합에 관한 것일 수 있다. 이들은 제품, 조성물, 방법, 또는 용도 청구항의 형태를 취할 수 있으며, 예로서 어떠한 제한 없이 하기 청구범위를 포함할 수 있다:

Claims (23)

  1. 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물:
    Figure 112008033845667-PCT00110
    상기 식에서,
    R1은 H 또는 C1 - 3알킬이고;
    R2는 C1 - 6알킬, C1 - 6할로알킬이며, 여기서 각각의 시클로알킬은 C1 - 3알킬 또는 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있고;
    R3는 기
    Figure 112008033845667-PCT00111
    이고,
    R 및 T는 각각 수소이고, S는 CONR8R9이고,
    R8 및 R9는 독립적으로 H, C1 - 6알킬, C1 - 6할로알킬, C1 - 6히드록시알킬, C3 - 7시클 로알킬, C1 - 3알킬렌C3 - 7시클로알킬, 페닐 (할로겐, -C1 - 3알킬, CN, 또는 SO2CF3로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되거나 비치환됨), C1 - 3알킬렌페닐, C1 - 3알킬렌OC1 - 3알킬이거나;
    R8 및 R9는 이들이 결합되어 있는 N과 함께 4원, 5원 또는 6원 헤테로시클릭기를 형성하는데, 이러한 헤테로시클릭기는 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 함유하거나 비함유하며, 각각의 탄소에서 2개 이하의 C1 - 6알킬 또는 할로겐에 의해, 또는 =O 또는 C1 - 6알콕시에 의해, 임의의 질소에서 C1 - 6알킬, COC1 - 3알킬 또는 COOC1 - 6알킬에 의해 및 임의의 황에서 =O, (=O)2에 의해 치환되거나 비치환되고;
    R4는 H 또는 -C1 - 3알킬이다.
  2. 제 1항에 있어서, R1이 H 또는 메틸인 화합물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, R1이 H인 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C1 -3 알킬 또는 C1 -3 할로 알킬인 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C1 -3 알킬인 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C1 -3 할로알킬인 화합물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 트리플루오로에틸인 화합물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 H 또는 CH3인 화합물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 H인 화합물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H이고; R2이 트리플루오로에틸; R3이 기
    Figure 112008033845667-PCT00112
    이고; R 및 T가 각각 수소이고, S가 CONR8R9이고, R4 가 H인 화합물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, R8이 수소이고, R9는 C1 - 6알킬, C1-6할로알킬, C3 - 7시클로알킬, C1 - 3알킬렌C3 - 7시클로알킬, 바람직하게는 n-프로필이거나;
    R8이 C1 - 6알킬, C1 - 6할로알킬, C3 - 7시클로알킬, C1 - 3알킬렌C3 - 7시클로알킬이고, R9는 C1 - 6알킬, C1 - 6할로알킬, C3 - 7시클로알킬, C1 - 3알킬렌C3 - 7시클로알킬이거나;
    R8 및 R9는 이들이 결합되어 있는 N과 함께 4원, 5원 또는 6원 헤테로시클릭기를 형성하는데, 이러한 헤테로시클릭기는 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 함유하거나 비함유하며, 임의의 질소에서 C1 - 6알킬에 의해 및 임의의 황에서 =O, (=O)2에 의해 치환되거나 비치환되는 화합물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (IA)의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물인 화합물:
    Figure 112008033845667-PCT00113
    상기 식에서,
    R1은 H를 나타내고;
    R2는 C1 - 3알킬 또는 C1 - 3할로알킬이고;
    R3는 기
    Figure 112008033845667-PCT00114
    이고;
    R 및 T는 각각 수소이고, S는 CONR8R9이고;
    R8은 수소이고, R9는 C1 - 6알킬, C1 - 6할로알킬, C3 - 7시클로알킬, C1 - 3알킬렌 C3 - 7시클로알킬, 바람직하게는 n-프로필이거나;
    R8은 C1 - 6알킬, C1 - 6할로알킬, C3 - 7시클로알킬, C1 - 3알킬렌C3 - 7시클로알킬이고, R9는 C1 - 6알킬, C1 - 6할로알킬, C3 - 7시클로알킬, C1 - 3알킬렌C3 - 7시클로알킬이거나,
    R8 및 R9는 이들이 결합되어 있는 N와 함께 4원, 5원 또는 6원 헤테로시클릭기를 형성하며, 이러한 헤테로시클릭기는 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가의 헤테 로원자를 함유하거나 비함유하고, 임의의 질소에서 C1 - 6알킬에 의해 치환되거나 비치환되고, 임의의 황에서 =O, (=O)2에 의해 치환되거나 비치환되고,
    R4는 H이다.
  13. 제 1항에 있어서, 하기 화합물로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    4-{[4-(에틸아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}-N-메틸벤즈아미드;
    N-메틸-4-[(4-{[(1R)-1-메틸프로필]아미노}-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노]벤즈아미드;
    N-메틸-4-({4-[(2-메틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-메틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-메틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(2,2-디플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(3,3,3-트리플루오로프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일} 아미노)벤즈아미드
    4-({4-[(1,1-디메틸에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(2-플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(1-에틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(3-메틸에틸부틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-{[4-(에틸아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드;
    4-{[4-(프로필아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드;
    4-({4-[(2,2-디메틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-[(4-{[(1R)-1-메틸프로필]아미노}-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)아미노]벤즈아미드
    4-({4-[(2-메틸프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈 아미드;
    4-{[4-(메틸아미노)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일]아미노}벤즈아미드;
    N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드 4-메틸벤젠설포네이트;
    4-({4-[(1-메틸에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N2-{4-[(1,1-디옥시도-4-티오모르폴리닐)카르보닐]페닐}-N4-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2,4-디아민;
    N,N-디에틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-[(1S)-1-시클로헥실에틸]-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-(1-에틸-1-메틸프로필)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-(2,2-디메틸프로필)-4-({4-[(2,2)2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-메틸-N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-시클로부틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피 리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-(1,1-디메틸에틸)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-메틸-N-(1-메틸에틸)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-시클로펜틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d|피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-시클로헥실-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N2-{4-[(4-메틸-1-피페라지닐)카르보닐]페닐}-N4-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2,4-디아민;
    N-(시클로프로필메틸)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N,N-디메틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N2-[4-(1-피페리디닐카르보닐)페닐]-N4-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2,4-디아민;
    N2-[4-(1-피롤리디닐카르보닐)페닐]-N4-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2,4-디아민;
    N2-[4-(1-아제티디닐카르보닐)페닐]-N4-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2,4-디아민;
    N-에틸-N-메틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-에틸-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-(2-메틸프로필)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    N-(1-메틸에틸)-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드;
    4-({4-[(1,1-디메틸에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)-N-메틸벤즈아미드; 및
    4-({4-[(2,2-디플루오로프로필)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드.
  14. 제 1항에 있어서, 하기 화합물로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    N-프로필-4-({4-[(2,2,2-트리플루오로에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일}아미노)벤즈아미드.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  17. 부적절한 Syk 활성에 의해서 매개된 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  18. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물을 포유동물에게 투여함을 포함하여 포유동물에서의 부적절한 Syk 활성에 의해서 매개된 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 부적절한 Syk 활성에 의해서 매개된 질환 또는 질병이 류마티스 관절염인 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 부적절한 Syk 활성에 의해서 매개된 질환 또는 질병이 알레르기성 비염인 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 부적절한 Syk 활성에 의해서 매개된 질환 또는 질병이 만성폐쇄폐질환(COPD)인 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 부적절한 Syk 활성에 의해서 매개된 질환 또는 질병이 성인 호흡곤란 증후군(ARDs)인 방법.
  23. 부적절한 Syk 활성에 의해서 매개된 질환 또는 질병의 치료에 사용되는 약물의 제조에서의 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 용도.
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