KR20080045118A - 열 반응성 생중합체에 기초한 직접 약물 전달 시스템 - Google Patents

열 반응성 생중합체에 기초한 직접 약물 전달 시스템 Download PDF

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KR20080045118A
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Abstract

관심 화합물의 데포 약물을 숙주의 선택된 영역에 전달하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 숙주의 관심 영역에 직접 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 전달될 화합물(항염증제 또는 화학요법제) 및 역 온도 상전이를 겪는 중합체(엘라스틴 유사 펩티드 또는 ELP)를 포함하는 숙주의 관심 영역에 조성물을 직접 투여하는 단계, 및 선택된 영역에 상기 관심 화합물의 지속적인 방출을 제공하는 단계를 포함한다. 본 발명을 수행하는 데 유용한 조성물도 기재되어 있다.
지속 방출, 전달

Description

열 반응성 생중합체에 기초한 직접 약물 전달 시스템{DIRECT DRUG DELIVERY SYSTEM BASED ON THERMALLY RESPONSIVE BIOPOLYMERS}
Lori A. Setton, Ashutosh Chilkoti, Virginia B. Kraus, Helawe Betre and Matthew R. Dreher
본 발명은 미국립보건원(National Institutes of Health)의 허여 제 AR047442 및 EB002263 하에 정부 보조를 받아 완성되었다. 상기 정부는 본 발명에 대하여 특정 권리를 가진다.
본 출원은 개시 내용이 그 전체로서 본 명세서에 참조 인용되고, 2005년 6월 24일 출원된 미국 임시 특허 출원 제 60/693,966호의 이익을 주장한다.
본 발명은 약학 화합물의 조절된 방출 전달을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
골관절염(OA: Osteoarthritis)은 다른 임의의 근골격계 장애보다 많은 환자에게 영향을 주는 퇴행성 관절질환(degenerative joint disease)이다. 이것은 매년 4백만 이상의 입원으로 설명되고, 이것의 유행은 다음 20년 동안 50% 이상 증가할 것으로 추산된다. OA는 각각의 관절에 영향을 주고, 역사적으로 관절 하중에 기인한 "마모"로부터 유발되는 것으로 생각된다. 최근 OA는 관절 질환의 진행을 향상시 키고 상호 작용하는 생화학, 유전, 및 생체역학적 인자를 포함하는 복합 원인으로부터 기인하는 것을 이해된다. 관절 재배열(골절술), 인공 치환(관절성형술), 또는 융합(관절고정술)을 위한 외과적 선택이 관절 퇴행이 진행된 환자에게 유용하지만, 매우 일부의 환자만이 수술 치료를 필요로 한다. 따라서, 환자 증상을 완화시키고, 질환 진행 경과를 수정하는 것이 모두 가능한 비외과적 치료를 제공할 필요가 증가하고 있고, 이러한 요구가 매우 크다.
관절 질환을 조기에 조정하기 위한 치료로서 가장 널리 이용되는 것은 NSAID의 만성적인 이용이다. 이들 약물이 통증 완화에 효과를 제공하지만, 이들은 종종 위장 출혈 및 궤양을 포함하는 유해 증상(adverse condition)과 연관되어 있다. 또한, NSAID는 관절 퇴행에서 장기 본질 치료 공정을 포함하는 세포 생합성을 억제하는 것으로 보도되었다. OA의 질환 상태를 수정하는 능력을 가진 보다 최근의 단백질 약물이 규명되었다. 이들 단백질 약물은 TNF-α 억제제 및 IL-1 억제제를 포함하며, 이들 질환의 발병을 억제하고 진행을 지연시키는 잠복기 및 임상 연구 모두에서 중요한 징후를 나타내었다.
OA가 동시에 몇몇 관절에 편재화된 질환이므로, 상기 요법을 국소 전달하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 기법 중 하나는 영향 받은 관절 동공(cavity) 내에 약물을 투여하는 것, 즉 관절강내(intra-articular) 주입으로서, OA를 치료하는 데 코르티코스테로이드(corticosteroid) 및 히알루로난(hyaluronan) 용액에 대해 현재 매우 바람직하다. 또한, 약물 전달의 관절강내 메커니즘은 환자 및 임상학자 모두에게 매력적이지만, 윤활 동공으로부터 분자들을 신속히 제거하는 고효율의 림프 시스템의 존재에 의해 절충된다. 결과적으로 요법 약물은 자주 투여되거나 고농도로 투여되어야 효과적이다. 다시 말해, 이것은 고비용이고, 유해한 부작용을 유발할 수 있으며, 환자를 매우 불안하게 할 수 있다. 조절된 약물 전달 시스템은 이러한 도전들을 극복하기 위해 추적되었다.
Urry의 미국 특허 제 6,328,996호에는 생탄성체성(bioelastomeric) 약물 전달 시스템에 대하여 기재하고 있지만, 이들을 관심 영역 내로 직접 투여하는 것은 제안하지 않았다.
본 발명의 목적은 IL-1 수용체 길항제와 같은 약물의 지속 전달을 위한 열반응성 생분해성 중합체를 제공하는 것이다. 본 발명의 전달 시스템은 OA 감염 관절과 같은 병리학적 부위에 단백질 약물을 직접 전달하는 열 반응성 생중합체의 급속 응집(aggregation) 및 느린 분해(disaggregation) 특성을 이용한다.
본 발명은 숙주의 선택된 영역에 관심 화합물의 데포 약물을 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 숙주의 관심 영역에 직접 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 전달될 화합물 및 역 온도 상전이를 겪는 중합체를 포함하는 숙주의 관심 영역에 조성물을 직접 투여하는 단계, 및 선택된 영역에 상기 관심 화합물의 지속적인 방출을 제공하는 단계를 포함한다.
본 발명의 몇몇 실시예에에 있어서, 숙주의 선택된 영역(예, 관절 또는 윤활 관절)에 관심 화합물의 데포 약물을 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (예를 들어, 주입과 같은 것에 의해 직접 또는 관심 영역으로) 조성물을 관심 영역에 투여하는 것을 포함한다. 상기 조성물은 전달될 화합물 및 역 온도 상전이를 겪는 중합체를 포함한다. 상기 중합체는 상기 숙주의 신체 온도(예, 37℃ 이하) 이하의 전이 온도(Tt)를 가진다. 관심 영역 내의 콘쥬게이트 응집물 또는 조성물은 이어서 점진적으로 분해됨으로써, 상기 선택 영역에서 상기 관심 화합물의 상기 지속적 방출을 제공한다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 숙주의 선택된 영역에 관심 화합물의 데포 약물을 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 관심 영역에 직접 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 전달될 화합물 및 역 온도 상전이를 겪는 중합체를 포함하는 숙주의 관심 영역에 조성물을 직접 투여하는 단계로서 상기 중합체가 상기 숙주의 신체 온도 이하의 전이 온도(Tt)를 가지는 단계, 및 상기 조성물(또는 상기 콘쥬게이트)가 상기 관심 영역 내 용액으로부터 분리하여 벌크 응집물을 형성하고, 이어서, 벌크 응집물로부터 점진적으로 분리하여 용액으로 되돌아가며, 상기 선택된 영역에서 상기 관심 화합물의 지속적 방출을 제공하는 것을 포함한다(바꾸어 말해 상기 콘쥬게이트가 상기 관심 영역 내 용액으로부터 분리되고, 이어서 점진적으로 용액상으로 되돌아가며 상기 선택된 영역의 상기 화합물의 지속적인 방출을 제공한다).
본 발명의 몇몇 실시예에에 따른 조성물은 상기 중합체에 콘쥬게이트된 전달될 화합물을 포함한다. 다른 실시예들에 있어서, 조성물은 상기 중합체와 혼합되지만, 화학적으로 결합되거나 달리 콘쥬게이트되지 않은 전달될 화합물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 역 온도 상전이를 겪는 중합체와 조합된(에, 혼합되거나 콘쥬게이트된) 요법 화합물을 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물이 제공된다. 상기 요법 화합물의 예는 TNF 항체, IL-1 항체, 용해성 TNF 수용체, 용해성 IL-1 수용체, TNF 수용체 길항제, 및 IL-1 수용체 길항제를 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시예에 있어서, 재조합 인간 IL- 1 수용체 길항제 및 이의 아형을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 주입 장치(주사기 및 다른 주입 장치 포함)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 본 명세서에 기재된 주입 장치의 용도를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 제안된 약물 전달 시스템의 예시적인 개략 실시예들을 나타낸 것이다. 도 1a를 참조하면, 열민감성 생탄성(생탄성) 중합체(ELP)에 부착된 화합물(약물)은 조직 영역(예, 관절 동공) 내로 주입될 수 있고, 화합물의 방출은 응집물로부터 수 시간동안 발생한다. 유리(free) 형태인 경우 상기 화합물은 도시한 바와 같이 수용체를 결합하는 데 유용하다. 화합물-생탄성 중합체의 상기 "유리" 분절은 수 시간 동안 조직 영역(예, 관절 동공)으로부터 제거된다. 도 1b를 참조하면, 대체 실시예는 조직 영역에 전달하는 동안 또는 전달 이전에 열민감성 생탄성 중합체와 초기에 혼합되는 화합물을 나타내고, 상기 화합물의 포획(entrapment)을 향상시킨다. 상기 화합물의 방출은 수시간동안 조직 영역으로부터 제거된 "유리" 화합물과 함께 수시간 동안 발생한다.
도 2는 37℃에서의 ELP 응집물의 평형화 이후 수시간 동안 상등액내에서 검출된 ELP 분절을 나타낸다. 결과는 ELP4-90([(VPGVG)10]9, 서열 번호 : 1) 및 ELP4-120([(VPGVG)10]12, 서열 번호 : 2) (평균 ± SD, n=4). 전이 온도 이상의 ELP는 37℃에서 평형화되어 역 온도 상전이를 향상시켰다. 37℃에서 상등액을 신선한 PBS로 교체하였고, 상등액의 분취액(aliquot) 중 ELP 농도를 280nm에서의 흡광도에 의해 수시간 동안 정량화하였다. 데이터는 [ELP]=[ELP]SS - A exp(-t/τ) 형태의 1차 지수 함수(실선)에 정확히 들어맞았고, 평형 상태에서 응집물 형태로 수용되지 않은 ELP의 분절([ELP]SS) 및 평형화 시간 상수(τ)를 수득하였다. ELP4-90의 경우, 상수는 다음과 같이 확인되었다: [ELP]SS = 0.21이고, τ = 31h. ELP4-120의 경우, 상수는 다음과 같이 확인되었다: [ELP]SS = 0.18이고, τ = 43h.
도 3a 내지 도 3c는 래트 모델의 오른쪽 무릎 관절 내로 관절내 주입을 한 이후의 응집하지 않는 [14C]ELP (Tt 〉5O℃)의 생분포를 나타낸 것이다. 주입 용량(ID/gm)은 10분 후속 주입에서 (회수된 조직 및 유체의 그람 당) 주입된 무릎 구획으로부터 회수된 14C의 양이다. 각각의 구획에 대하여, (회수된 조직 또는 유체의 그람 당) 14C를 이 값으로 표준화하여 각각의 조직 또는 유체에 대하여 %ID/gm을 측정하였다. 모든 데이터를 평균±SE (n=5)로 표현하였다. 도 3a를 참조하면, *p〈0.05으로서, 시간 0으로부터 통계적으로 상이하고, +p<0.05으로서, 주입되지 않은 (왼쪽) 무릎 구획과 통계적으로 상이하고, 도 3b를 참조하면, *p<0.05으로서, 시간 0으로부터 통계적으로 상이하고, +p<0.05으로서, 혈액과 통계적으로 상이하다. 도 3c를 참조하면, [14C]ELP는 모든 기관에 대해 1 %ID/gm이고, 이들 조직은 모든 시점에서 주입되지 않은 (왼쪽) 무릎과 통계적으로 상이하지 않은 것으로 확인되었다.
도 4a 내지 도 4c는 래트 모델의 오른쪽 무릎 관절 내로 관절내 주입을 한 이후의 응집하는 [14C]ELP (Tt〈35℃)의 생분포를 나타낸 것이다. 주입 용량(ID)은 시간 0(10분 후속 주입)에서 (회수된 조직 및 유체의 그람 당) 주입된 무릎 구획으로부터 회수된 14C의 양이다. 각각의 구획에 대하여, (회수된 조직 또는 유체의 그람 당) 14C를 이 값으로 표준화하여 각각의 조직 또는 유체에 대하여 %ID/gm을 측정하였다. 모든 데이터를 평균±SE (n=5)로 표현하였다. 도 4a를 참조하면, *p〈0.05으로서, 시간 0으로부터 통계적으로 상이하고, +p<0.05으로서, 주입되지 않은 (왼쪽) 무릎 구획과 통계적으로 상이하고, 도 4b를 참조하면, *p<0.05으로서, 시간 0으로부터 통계적으로 상이하고, +p<0.05으로서, 혈액과 통계적으로 상이하다. 도 4c를 참조하면, [14C]ELP는 모든 기관에 대해 1 %ID/gm이고, 이들 조직은 모든 시점에서 주입되지 않은 (왼쪽) 무릎과 통계적으로 상이하지 않은 것으로 확인되었다.
도 5a 및 도 5b는 수 시간 동안 주입된 관절 구획에서 [14C]ELP의 생분포를 나타낸 것이다. 주입 용량(ID/gm)은 시간 0(10분 후속 주입)에서 (회수된 조직 및 유체의 그람 당) 주입된 무릎 구획으로부터 회수된 14C의 양이다. 후속 시점에서의 ID/gm을 이 값으로 표준화하여 시간의 함수로서 무릎 관절 구획에 대하여 %ID/gm을 측정하였다. 도 5a는 응집하지 않는 ELP (Tt 〉5O℃)를 나타낸 것이고, 도 5b는 ELP (Tt〈35℃)를 나타낸 것이다. 평균±SE (n=5)로 표현된 데이터는 1차 지수 감쇄 함수(실선)에 정확히 들어맞았고, 세미-로그 축으로 플롯하였다. 신뢰 구간(95% 대시 선) 또한 나타내었다. 각각의 피트(fit)에 대한 시간 상수(τ)를 사용하여 2개의 ELP 타입의 관절 반감기[t1 /2 = τln(2)]를 측정하였다.
도 6은 시험관내에서 ELP와 혼합한 이후 용액에 방출된 방사선 표지된 화합물을 정량화하는 결과를 나타낸 것이다. 2.5 ㎍/ml에서 [3H]rhIL1Ra를 37℃에서 상이한 농도의 상이한 ELP 제제와 혼합하였다(ELP4-120 ([(VPGVG)10]12, 서열 번호:2) 및 ELP5 ([(VPGVG)6(VPGKG)]16, 서열 번호:3)). 총 반응 체적 200 미크로리터 중의 농도 0 mg/ml (대조군), 20 mg/ml, 및 50 mg/ml의 농도로 ELP 용액을 준비하였다. ELP-IL1Ra 혼합물이 응집물 내로 복합화하는 것을 관찰하였다. 상등액 중의 rhIL1Ra 농도의 측정으로서 섬광 계수(scintillation counting)를 통하여 [3H]에 대하여 수시간 동안 상등액의 분취액(5 미크로리터)을 분석하였다. 측정값을 대조군(0 mg/ml, 속이 빈 바(bar))으로 표준화하여 용액 중의 % 유리 rhIL1Ra = (샘플의 CPM/ 대조군의 CPM) x 100를 측정하였다. 데이터는 포획 24h 이내에 안정하였다. 평형 상태에서 96 시간에서의 데이터를 도시하였다. (n=5, 평균+SD). 결과는 혼합하는 경우 ELP는 이 화합물의 25 내지 55%를 포획할 수 있음을 나타낸다.
도 7a는 2라운드의 열적 정제 이후 2개의 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. 도 7b는 온도에 따른 융합 단백질의 입자 크기 및 응집이 유사하고, 대형 입자(> 100 nm)의 형성은 37℃에서 시작한다는 점을 나타낸다.
도 8은 rhIL1Ra 또는 ELP4-IL1Ra 융합 단백질에 의한 프라이머리 뮤린(primary murine) 흉선 세포 증식에 의존하는 콘에이(con A) 유도성 IL-1의 억제를 나타낸 것이다. 세포는 rhIL1Ra 또는 융합 단백질의 농도를 증가시키면서 1 ng/ml의 뮤린 IL-lβ로 48시간 동안 배양하였다. 존재하는 IL-1Β의 양에 대하여 몰 초과량으로 첨가된 IL-1 억제제의 양 대 대조군 증식의 백분율로 세미-로그 플롯으로 데이터를 나타내었다. 평균±SD (n=6), 데이터는 시그모이드 함수(sigmoid function)에 정확히 들어맞았으며 각각의 단백질에 대하여 IC50을 측정하였다.
도 9는 응집하는 ELP(속이 꽉찬 바) 및 응집하지 않는 ELP(해칭된 바)의 종양 내에 주입된 용량 백분율 (%ID)을 나타낸 것이다. 모든 타입의 ELP를 누드 마우스(Balb/c nu/nu)의 다리 위의 인간 편평세포암 (FaDu) 종양 내로 융합시켰다 (4㎕/분). 데이터는 평균±SEM이고, n = 1 내지 9였다.
바람직한 실시예의 상세한 설명
본 명세서에 사용된 "생탄성 중합체"는 탄성 반복 단위를 포함하는 화합물을 의미한다. 탄성 단위는 일반적으로 펜타펩티드, 테트라펩티드, 또는 나노펩티드일 수 있다. 그 예로서 엘라스틴형 폴리펩티드 또는 "ELP"가 있다.
본 명세서에 사용된 "숙주"는 동물 숙주, 특히 가축용 말, 고양이, 개, 영장류와 다른 포유 숙주뿐만 아니라, (남성 및 여성 숙주를 포함하고, 청소년, 청년, 성인, 및 노인 숙주를 포함하는) 인간 숙주를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "관절염"은 류마티즘성 관절염, 골관절염, 및 강직성 척추염을 포함하는 모든 형태의 관절염을 의미하며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "응집물"은 입자가 형성되는 복수의 분자의 수집 또는 덩어리를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "분해"는 응집물로부터 분자 또는 분자들의 분리, 응집물 크기의 점진적 감소 또는 입자 크기의 점진적 감소를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "관심 영역"은 관절 및 고형 종양("고형 종양"은 이것의 주된 질량을 외과적으로 제거한 이후 그 내부로 본 발명의 조성물이 직접 투여될 수 있는 고형 종양 내부의 절개 동공(resection cavity)을 포함한다)을 포함하는 모든 관심 영역을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다. 관절 투여의 몇몇 예에 있어서, 관심 영역은 추간강(intervertebral disk space) 또는 관련된 척추 관절(spinal joint) 구조이다.
본 명세서에 사용된 "신체 온도"는 중심 신체 온도 및 주변 신체 온도 (예, 관절과 같은 관심 영역이 말단에 위치한 경우 말단의 온도) 모두를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "관절"은 2개의 뼈가 만나는 이동 가능한 부위를 의미하며, 이들은 종종 윤활 관절 또는 인대 결합(syndesmosis)일 수 있고, 구상 관절(ball and socket joint) 타원 관절, 활주 관절(gliding joint), 경첩 관절(hinge joint), 중쇠 관절(pivot joint) 안장 관절(saddle joint)을 포함한다. 이러한 관절은 예를 들어 어깨, 목, 척추, 팔꿈치(elbow), 엉덩이(hip), 손목(wrist), 손, 무릎, 발목(ankle) 또는 발에 위치할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "고형 종양"은 임의의 고형 종양 또는 암일 수 있으며, 폐암, 간암, 전립선암, 난소암, 결장암, (흑색종(melanoma)을 포함하는) 피부암, 뇌암 등의 1차 및 2차 (또는 전이) 고형 종양을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "주입" 또는 "주입하는"은 바늘, 주사기, 션트(shunt), (예를 들어 7-33 게이지(gauge)의) 캐뉼라(cannula)를 통하여 임의의 적합한 수단 또는 관심 영역 내로 직접 전달될 조성물을 수시간 동안 단일 대형 환약(bolus) 또는 주입물로서 전달하는 다른 적합한 장치에 의해 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "항체" 또는 "항체들"은 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는 모든 형태의 면역글로불린을 의미한다. 용어 "면역글로불린"은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등과 같은 이들 면역글로불린의 서브 타입을 포함한다. 이들 면역 글로불린 중 IgM 및 IgG가 바람직하고, IgG가 특히 바람직하다. 항체들은 예를 들어 마우스, 래트, 래빗, 말, 또는 인간을 포함하는 모든 종의 기원일 수 있고, 잡종항체(chimeric antibody)일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 예를 들어 Fab, F(ab')2, 및 Fv 분절과 같이 목적 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체 분절, 및 IgG 이외의 항체로부터 수득된 상응하는 분절을 포함한다. 이러한 분절은 또한 공지된 수법에 의해 생산된다.
본 명세서에 사용된 "화학요법제"(또는 "항암제")는 메토트렉세이트, 다우노마이신, 미토마이신, 시스플라틴, 빈크리스틴, 에피루비신, 플루오로우라신, 베라파밀, 시클로포스파미드, 시토신, 아라비노시드, 아미노프테린, 블레오마이신, 미토마이신 C, 데모콜신, 에토포시드, 미트라마이신, 클로람부실, 멜파란, 다우노루비신, 독소루비신, 타모시펜, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 캄프토테신, 악티노마이신 D, 및 시타라빈을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 미국 특허의 공개 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조 인용된다.
관심 화합물. 단백질 및 펩티드를 포함하는 임의의 적합한 화합물(이에 한정되는 것은 아님)이 (예를 들어 화학 결합 또는 융합 단백질 생성을 통해) 중합체에 결합되거나 상기 언급한 중합체와 혼합될 수 있다. 일반적으로, 관심 화합물은 관찰가능한 그룹 또는 요법 그룹일 수 있다.
예를 들어, 관심 화합물은 골형성 단백질, 펩티드, 및 성장 인자, 특히, 인간 칼시토닌 유사체, 골원성 성장 펩티드, 및 골원성 성장 펩티드-인간 칼시토닌 유사체 하이브리드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 미국 특허 제 6,593,394호 참조.
관심 화합물은 항생제 및 항바이러스제와 같은 항감염제, 화학요법제 (즉 항암제), 항거부제(anti-rejection agent), 마취제 및 마취제 조합물; 항염증제, 스테로이드와 같은 호르몬, 골형성 단백질 (즉 BMP's 1-7), 골형성 유사 단백질 (즉 GDF-5, GDF-7 및 GDF-8), 상피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (즉 FGF 1-9), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF-I 및 IGF-II), 변형 성장인자 (즉 TGF-β I-III), 혈관내피 성장인자 (VEGF)를 포함하는 성장 인자, 및 기타 자연적으로 유도되거나 유전적으로 가공된 단백질, 폴리사카라이드, 글리코단백질, 또는 리포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 D. Overaker, 미국 특허 제 6,575,986호 참조.
관심 화합물은 실제로 치료를 촉진하거나 증진시키는 제제 또는 화합물일 수 있고, 작동자(effector)는 감염을 방지하는 제제 또는 화합물(예를 들어, 항미생물제 및 항생제), 염증을 감소시키는 제제 또는 화합물 (예를 들어, 항염증제), 산화된 재생 셀룰로오스, 히알우론산과 같은 접착 형성을 최소화하거나 방지하는 화합물(예를 들어, INTERCEEDTM 및 SURGICELTM, Ethicon, Inc.로부터 구입가능), 면역 시스템을 억제하는 제제 또는 화합물 (예를 들어, 면역억제제)를 포함할 수 있다. 적합한 관심 화합물은 이종 또는 자가 성장 인자, 단백질(매트릭스 단백질 포함), 펩티드, 항체, 효소, 혈소판, 글리코단백질, 호르몬, 사이토킨, 글리코사미노그리칸, 핵산, 마취제, 바이러스, 바이러스 입자, 및 세포 타입을 포함한다. 동일하거나 상이한 기능을 가진 1 이상의 작동자가 골격내에 통합될 수 있다. 적합한 관심 화합물은 치료를 증진시키고/증진시키거나 상처받거나 손상된 조직을 재생시키는 것으로 공지된 복수의 이종 또는 자가 성장 인자를 포함한다. 주화소(chemotactic agent), 요법제(therapeutic agent)(예를 들어, 항생제, 스테로이드성 마취제, 비 스테로이드성 마취제 및 항염증약, 면역억제제 및 항암 약물과 같은 항거부제), 다양한 단백질 (예를 들어, 단기 펩티드, 골형성 단백질, 글리코단백질 및 리포단백질), 세포 부착 중재자, 생물학적 활성 리간드, 인테그린 결합 서열(integrin binding sequence), 리간드, 다양한 성장제 및/또는 분화제(differentiation agent) 및 이들의 분절(예를 들어, 상피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor)(HGF), IGF-I, IGF-II, TGF-.beta. I-III, 성장 및 분화 인자, 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린 유래 성장 인자 (IGF) 및 변형 성장인자, 및 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드, bFGF, TGFB 수퍼패밀리 인자(superfamily factor), BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-12, 소닉 헷지호그(sonic hedgehog), GDF5, GDF6, GDF8, MP52, CDMPl), 특정 성장 인자의 상방제어에 영향을 주는 소형 분자, 테나스신-C(tenascin-C), 히알우론산; 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 피브로넥틴(fibronectin), 데코린(decorin), 트롬보엘라스틴(thromboelastin), 트롬빈 유래 펩티드, 헤파린 결합 도메인, 헤파린, 헤파란 설페이트(heparan sulfate), DNA 분절 및 DNA 플라스미드를 포함한다. 마찬가지로 적합한 작동자는 상기 언급된 제제의 길항제 및 효능제를 포함한다. 성장 인자는 상기 열겨된 성장 인자의 조합을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 성장 인자는 혈액 내의 혈소판에 의해 공급되는 자가 성장 인자일 수 있다. 이 경우, 혈소판으로부터 공급되는 성장 인자는 다양한 성장인자의 제한되지 않은 칵테일일 수 있다. 예를 들어, J. Hwang 일행, 미국 특허 출원 공개 제 2004/0267362호 참조.
몇몇 실시예에 있어서, 특히 관절염의 치료를 위한 관심 화합물은 항염증제(antiinflammatory agent)이고, 이것의 예로 TNF 항체, IL-1 항체, 용해성 TNF 수용체, 용해성 IL-1 수용체, TNF 수용체 길항제, IL-1 수용체 길항제, COX-2 억제제, 및 비 스테로이드성 항염증제 (항체 및 수용체와 같은 단백질 또는 펩티드 화합물을 위한 이들의 활성 분절 포함)를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 화합물의 다양한 예는 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,846,834를 참조할 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,624,184; 6,596,746; 6,498,165; 및 6,420,373호도 참조할 수 있다. 하나의 특정 실시예는 미국 특허 제6,599,873 및 5,075,222호에 기재된 rhIL1Ra(아형(isoform) 포함)(Amgen으로부터 KINERET(TM) 으로서 상업적으로 입수 가능)이다.
생탄성 중합체. 생탄성 중합체는 예를 들어 Urry 등의 미국 특허 제 5,520,672호에 기재되고 공지되어 있다. 일반적으로, 생탄성 중합체는 생탄성 펜타펩티드, 테트라펩티드, 및/또는 나노펩티드의 탄성체 단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 따라서, 몇몇 실시예에 있어서, 탄성체 단위는 펜타펩티드이고, 다른 실시예에 있어서, 탄성체 단위는 테트라펩티드이고, 또 다른 실시예에 있어서, 탄성체 단위는 나노펩티드이다. 본 발명을 실시하기 위하여 사용될 수 있는 생탄성 중합체는 미국 특허 제 4,474,851호에 기재되어 있으며, 이는 생탄성 중합체의 형태로 사용될 수 있는 다수의 테트라펩티드 및 펜타펩티드 반복 단위에 대하여 기재하고 있다. 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있는 특정 생탄성 중합체는 미국 특허 제 4,132,746; 4,187,852; 4,500,700; 4,589,882; 및 4,870,055호에도 기재되어 있다. 생탄성 중합체의 또 다른 실시예는 Urry의 미국 특허 제 6,699,294호, Fertala 및 Ko의 미국 특허 제 6,753,311호, Wallace의 미국 특허 제 6,063,061호 및 Chilkoti의 미국 특허 제 6,852,834호에 기재되어 있다. 생탄성 중합체는 당업계에서 공지된 바와 같은 리더(leader) 및/또는 트레일러(trailer) 서열과 같은 추가의 잔기 또는 단위를 함유할 수 있다.
하나의 비제한 실시예에 있어서, 본 발명을 실시하는 데 사용되는 상기 생탄성 중합체는 적어도 하나의 일반 블록 구조[(VPGXjG)n i]m (서열 번호:4)를 함유하는 폴리펩티드이다. 이 경우 i=l 내지 J이고, Xj는 프롤린 이외의 아미노산(예를 들어, Ala, Leu, Phe)이고, ni는 블록 i에 인접하고, 블록 i+1에 앞서는 연속적인 반복 숫자이다. nj는 1, 2, 3, 또는 4 내지 20이하와 같은 임의의 수이고, nj는 i에 대하여 독립적이다. J는 1, 2, 또는 3 내지 5, 그 이상과 같은 임의의 수이다. m은 블록 구조의 반복 숫자이고, 이 경우 m은 2, 3 또는 4 내지 60 이하, 80 또는 300, 그 이상과 같은 임의의 적합한 수이다. 4번째 위치의 다양한 아미노산의 정체 및 빈도는 변화할 수 있다. 예를 들어 본 발명을 실시하기 위하여 사용되는 생탄성 중합체는 일반식이 [(VPGAG)5 1(VPGVG)2(VPGGG)2 3]m, (서열 번호:5)인 폴리펩티드일 수 있다. 여기서, X1 = A이고, X2는 = V이고, X3 = G이고, n1은 5, n2는 1, n3은 2이고, m은 적어도 1, 2, 또는 3 내지 100이하, 150 또는 300 이상이다.
또 하나의 비제한 실시예에 있어서, 본 발명을 실시하는 데 사용되는 생탄성 중합체는 생탄성 논펩티드(nonpeptide), 펜타펩티드 및 테트라펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탄성체 반복 단위를 포함할 수 있고, 이 경우 반복 단위는 아미노산 및 글리신 잔류물 모두로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔류물을 포함한다. 바람직한 아미노산 잔류물은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 많은 경우 상기 반복 단위의 제1 아미노산 잔류물은 발린, 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌의 잔류물이고, 제2 아미노산 잔류물은 프롤린의 잔류물이고, 제3 아미노산 잔류물은 글리신이고, 제4 아미노산 잔류물은 트립토판, 페닐알라닌 또는 티로신과 같은 매우 소수성인 잔류물 또는 글리신이다. 특정 실시예는 테트라펩티드 Val-Pro-Gly-Gly (서열 번호:6), 테트라펩티드 GGVP (서열 번호:7), 테트라펩티드 GGFP (서열 번호:8), 테트라펩티드 GGAP (서열 번호:9), 펜타펩티드 Val-Pro-Gly-Val-Gly (서열 번호: 10), 펜타펩티드 GVGVP (서열 번호:11), 펜타펩티드 GKGVP (서열 번호:12), 펜타펩티드 GVGFP (서열 번호:13), 펜타펩티드 GFGFP (서열 번호:14), 펜타펩티드 GEGVP (서열 번호:15), 펜타펩티드 GFGVP (서열 번호:16), and 펜타펩티드 GVGIP (서열 번호:17)를 포함한다. 예를 들어, Urry의 미국 특허 제 6,699,294호 참조.
투여. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 일반적으로 관심 영역에 (예를 들어, 관심 영역으로 또는 관심 영역 내에 주입과 같은 방식에 의해 직접) 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 조성물은 전달될 화합물 및 역 온도 상전이를 겪는 중합체를 포함한다. 상기 중합체는 숙주의 신체 온도 (예를 들어, 37℃ 이하) 이하의 전이 온도 (Tt)를 가진다. 콘쥬게이트(conjugate)는 관심 영역 내에서 응집하고, 이어서 선택된 영역에 관심 화합물을 지속적으로 방출시키면서 점진적으로 분해된다. 투여 단계는 주입, 특히 (예를 들어, 윤활 관절의 윤활 유체 내부로) 관절내 주입과 같은 모든 적합한 수단에 의해 수행할 수 있다.
데포형 약물(depot drug)이 바람직한 증상 및 질환에 걸린 환자는 관절염에 걸린 환자의 특정 실시예로 상기 방법으로 치료받을 수 있다.
관심 화합물은 주입 부위, 연령, 체중, 및 환자의 증상, 특정 활성제 등에 따라 적합한 양으로 투여될 수 있다. 일반적으로 상기 화합물은 투여 또는 주입 당 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5 또는 10 mg의 양, 투여 또는 주입 당 약 100, 200 또는 300 mg 이하의 양으로 투여될 수 있다. 일반적으로 상기 화합물은 관심 영역에 의존하는 주입 체적에 대해 1 pg/ml 내지 500 mg/ml의 농도로 투여될 수 있다. 일반적으로 ELP는 1 pg/ml 내지 500 mg/ml와 동일한 농도로 공투여될 수도 있고, 탄성체와 혼합 화합물의 예에서 보다 높은 농도로 투여도리 수도 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 관심 화합물은 상기 영역내에서 1 또는 2시간 이상의 생체 내 반감기를 가지는 것이 바람직하다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 투여 방법으로 ELP와 조합하여 관심 화합물을 투여하는 것은 상기 영역 내에서 상기 화합물에 대하여 2 또는 3일 이상, 1주, 또는 4주 이상, 2개월 이하 또는 3개월 이상의 생체내 반감기와 연관된다. 바꾸어 말하면, 투여 단계는 규칙적이고 반복된 기초(예, 관절염과 같은 만성 증상의 치료)를 근간으로 수행한다는 점을 심사숙고 하지만, 바람직한 치료 유효량을 아직 보유하고 있는 동안 투여 빈도는 개월당 1, 2, 3 또는 4회를 초과하지 않는다.
본 발명은 후술하는 비제한 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
실험예
엘라스틴 유사 폴리펩티드 (ELP)는 유전적으로 가공된 생중합체로서, 온도 증가에 반응하여 응집을 수행하는 상기 정의된 펜타펩티드 반복 단위로 이루어진다. ELP는 이것의 전이 온도 (Tt) 이하의 온도에서 용해성이고, 이것의 Tt 이상의 온도에서 불용성이 되어 미크론 크기 응집물을 형성한다. 본 발명자들은 본 명세서에 약물 담체에 부착된 단백질 약물이 주입 시점에 응집하고 주윕 부위에서 '데포' 약물을 형성하며, 이어서 지속된 방식으로 관절강 내부로 천천히 분해되는 것을 개시하였다(예를 들어 도 1a 및 도 1b 참조). 이들 실시예에 있어서, 관절내 주사 이후에 응집하는 ELP(Tt < 3O℃) 및 응집하지 않는 ELP(Tt > 5O℃)의 관절 반감기 및 생체내 생분해 뿐만 아니라, Tt 이상의 온도에서 ELP의 생체외 분해를 평가할 것이다. 또한, 본 발명자들은 ELP 및 IL1Ra 융합 단백질을 디자인하고, IL-1 수용체에 대한 이들의 결합 친화도 및 IL-1을 억제하는 생물학적 활성을 평가하여, ELP 융합 단백질 약물 담체 시스템에 대한 개념 증명(proof-of-concept)을 예증할 것이다.
실험예 1
생체외 ELP 분해 및 펩티드 방출
골관절염과 같은 국소적 질환의 치료를 위한 제안된 전달 시스템의 개념 증명으로서, 엘라스틴형 폴리펩티드 (ELP) 또는 생탄성 중합체응집물 형태로부터 "유리" 중합체의 지속적인 방출을 제공하는 능력을 평가하였다. 약물 전달 시스템은 대형 입자를 형성하는 급속 열 유도성 응집 이후에 벌크 응집된 대형 입자로부터 "유리" 형태로 명명된 ELP를 지속적으로 방출하는 ELP 고유 특성을 이용한다. 이를 평가하기 위해 유전적 가공 기법 및 열 정제를 이용하여 2가지 ELP 분자를 합성하였다. (1) ELP4-90 = [(VPGVG)1O]9 (서열 번호:1), Tt = 30.6℃, MW = 37 kDa; 및 (2) ELP4-120 = [(VPGVG)1O]12 (서열 번호:2), Tt = 28.6℃, MW = 49 kDa가 그것이며, 공지된 수법을 따라 합성하였다. (Urry의 미국 특허 제 6,699, 294호 및 Chilkoti의 미국 특허 제 6,852,834호 참조). 생체외 연구의 경우, 농도 30 mg/ml인 어느 하나의 ELP 1.5 ml를 원뿔형 튜브에 위치시키고, 37℃에서 24h 동안 배양시켰다. 최종적으로 37℃에서 상등액을 PBS로 완전히 교환하고, 상등액 중의 ELP를 280nm에서의 흡광도에 의해 초기 ELP의 함수로서 정량화하였다.(도 2, t = 0 h) 샘플을 37℃로 복귀시키고, 유리 ELP의 양을 수시간 동안 상등액의 분취액 7㎕로 정량화하였다. 평형상태에 대한 시간 상수를 ELP 농도에 대한 1차 지수 함수로 수치적으로 정확히 맞는 데이터에 의해 측정하였다.
ELP 타입 모두에 있어서, 폴리펩티드는 37℃에 위치시킨 직후 역 온도 상전이를 겪었고, 15-20%의 출발 ELP가 유리 형태로 되는 평형상태에 천천히 도달하였다(도 2). 상등액이 완전히 교환된 이후 평형 상태에 대한 시간 상수는 1-2일의 차수(order)를 가졌다. 유리 내지 응집물 ELP 농도에 대한 안정 상태를 기술하는 평형 상수는 0.15-0.20이었다. 이들 결과는 응집된 ELP 형태는 수시간동안 유리 ELP를 천천히 방출한다는 점을 예시한다. 유리 형태가 윤활 조직을 통하여 일정하게 제거되는 가동 관절(diarthrodial joint)의 경우 ELP 응집물의 연속 "분해"를 증진시킨다.
실험예 2
관절내 주사 이후 ELP 의 생분해
응집하는 ELP4-120 ([(VPGVG)10]12, 서열 번호:2, Tt < 32℃, MW 47 kDa) 및 응집하지 않는 ELP2 ([(VPGVG)1(VPGAG)8(VPGGG)7]10, 서열 번호: 18, MW 61 kDa, Tt > 5O℃)의 관절 반감기 및 생분해를 확인하였다. 관절내 주사 이후의 ELP를 래트 동물 모델에서 평가하였다. ELP를 [14C]로 라벨링하여 32-37 mCi/mmole의 특정 활성을 산출하였다. 라벨링된 ELP를 투석하고 멸균 여과하였으며 (0.22 ㎛ 여과기), ~650μM에서 체적이 30㎕인 펩티드 중 어느 하나를 위스타르 래트(Wistar rat)의 오른쪽 무릎의 관절강내로 주입하였다. 주입 이후, 동물을 4주 이하 동안 케이지(cage) 내에서 주거시켰다. 각 시점에 5마리의 래트가 희생되었고, 이들의 오른쪽 및 왼쪽 무릎(윤활 유체, 반월상연골(meniscus), 연골(cartilage), 활막조직(synovium)), 혈액, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 방광을 수집하고 소화(digest)시켰다. 액상 베타-섬광 계수를 이용하여 각 조직의 방사능을 측정하였다. 조직 중량당 총 개수를 각 동물 및 각 조직 또는 신체 유체에 대하여 측정하였고 (그룹 및 시간 당 n=5 동물) 시간의 함수로서 각 조직에 대해 플롯하였다. 관절 조직 및 관절 유체에 대한 값을 총"관절"값(윤활 유체, 반월상연골, 관절 연골, 활막조직)으로 합산하였다.
주입 이후 10분에 관절 동공 내 모든 조직 및 유체로부터 회수한 총 방사능을 비특이적으로 분포된 주입된 [14C]-ELP에 대하여 조절하였으며, 투여 용량의 70-75%인 것으로 확인되는 출발 용량을 이용하였다. 이어서, 모든 회수된 조직 및 유체에 대한 전달된 양에 대한 조직의 그람 당 주입 용량의 백분율(%ID/gm)을 수득하기 위해, 조직 중량당 방사능을 초기 주입된 무릎 관절 동공 값에 의해 표준화하였다(10분 후속 주입).
모든 시점에 있어서, 주변 기관 내에서 어느 하나의 펩티드도 바람직하게 축적되는 것이 관찰되지 않았다(도 3C 또는 도 4C). 주입된 무릎 및 혈액 내를 제외하고, 다른 기관 내에서 각 펩티드의 총량은 1% ID/gm 이었다(도 3B 또는 도 4B). 주입된 무릎 내의 응집하지 않는 ELP의 프로파일(profile)을 도 3(시(hour) 단위의 시간에 대해 플롯함)에 나타내었고, 주입된 무릎 내의 응집하는 ELP의 프로파일을 도 4(일 단위의 시간에 대해 플롯함)에 나타내었다. 응집하지 않는 ELP는 최초 24 시간 내에 관절강 내에서 10 %ID/gm 이었지만, 응집하는 ELP는 동일한 레벨에 도달하는 데 거의 2주일이 소요되었다.
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이 관절에 대한 총 방사능 개수를 합산함으로써 주입된 무릎 관절 구획에 대하여 방사능 반감기 (t1 /2)를 측정하였다. 도 5a는 응집하지 않는 ELP(Tt > 5O℃)에 대한 주입된 무릎 관절 구획 값을 나타내고, 도 5b는 응집하는 ELP (Tt < 35℃) 값을 나타낸다. 평균±SE (n=5)으로 표현된 데이터는 1차 지수 감쇄 함수(실선)에 정확히 들어맞았고, 세미-로그 축으로 플롯하였다. 신뢰 구간(95% 대시 선) 또한 나타내었다. 각각의 피트(fit)에 대한 시간 상수(τ)를 사용하여 2개의 ELP 타입의 관절 반감기[t1 /2 = τln(2)]를 측정하였다. 관절 내 응집하지 않는 ELP 및 응집하는 ELP는 각각 3.4 ± 0.2 hour 및 3.7 ± 0.2 일 것으로 확인되었다. 이것은 인공 관절내 ELP의 응집 특성이 펩티드의 반감기를 24배 이상(p<0.05, ANOVA) 현저히 연장한다는 것을 암시하고, 제안된 지속 방출 메커니즘을 확인해준다. 이들이 ELP의 열반응성 특성을 이용할 수 있고, 단백질 약물을 관절염 감염된 관절로 전달할 수 있다는 점을 예증하기 때문에 이들 발견은 중요하다.
실험예 3
포획의 예증
도 6은 본 발명의 조성물 및 방법에 의한 포획을 예증한 것이다. 도 6은 생체외에서 ELP와 혼합한 이후 용액으로 방출된 방사선 표지된 화합물을 정량화하기 위한 결과를 나타낸 것이다. 2.5 ㎍/ml의 [3H]rhIL1Ra를 37℃에서 상이한 농도의 상이한 ELP 제제 (ELP4-120 [(VPGVG)10]12, 서열 번호:2 및 ELP5 [(VPGVG)6(VPGKG)]16, 서열 번호:19)와 혼합하였다. 총 반응 체적 200 미크로리터 중의 농도 0 mg/ml (대조군), 20 mg/ml, 및 50 mg/ml의 농도로 ELP 용액을 준비하였다. ELP-IL1Ra 혼합물이 응집물 내로 복합화하는 것을 관찰하였다. 상등액 중의 rhIL1Ra 농도의 측정으로서 섬광 계수를 통하여 [3H]에 대하여 수시간 동안 상등액의 분취액(5 미크로리터)을 분석하였다. 측정값을 대조군(0 mg/ml)으로 표준화하여 용액 중의 %유리 rhIL1Ra = (샘플의 CPM/ 대조군의 CPM) x 100를 측정하였다. 데이터는 포획 24h 이내에 안정하였다. 평형 상태에서 96 시간에서의 데이터를 도시하였다. 결과는 혼합하는 경우 ELP는 이 화합물의 25 내지 55%를 포획할 수 있음을 나타낸다.
실험예 4
ELP - IL1Ra 융합 단백질 디자인, 합성 및 특성화
이 약물 전달 시스템의 개념 증명 테스트에 있어서, ELP 및 IL1Ra 2개의 응집하는 융합 단백질을 후술하는 바와 같이 유전적으로 합성하였다. Carter 등 (1990) Nature 344: 633-8에 의해 이미 기재된 바와 같이 LPS 활성화된 U937 세포로부터 인간 IL1Ra에 대한 유전자를 PCR 클로닝하였다. Chilkoti의 미국 특허 제 6,852,834호에 의해 기재된 바와 같이 2개의 ELP 제제를 합성하였다: ELPl [(VPGVG)5(VPGGG)3(VPGAG)2]9, (서열 번호:20), MW 36 kDa, 및 ELP4 [(VPGVG)10]3, (서열 번호:21), MW 14.5 kDa. 이어서 종래의 분자 생물학 기법을 이용하여 각각의 ELP 유전자를 벡터(pET-25b+)를 함유하는 IL1Ra 내부로 서브 클로닝하여, 분자량이 30.2 및 53 kDa인 2개의 ELP-IL1Ra 융합 단백질(표 1, 2 참조)을 생성하였다. 이어서, 융합 단백질을 E. coli로 표현하고, Urry의 미국 특허 제 6,699, 294호 및 Chilkoti의 미국 특허 제 6,852,834호의 공지된 기법을 따라 열적으로 정제하였다. 융합 단백질의 크기 및 순도를 SDS-PAGE로 조사하고 도 7a에 도시하였다. 본 명세서에 사용한 열적 정제 방법은 ＞융합 단백질 50 mg/95% 순도를 초과하는 박테리아 성장 리터를 생성하였다.
온도에 의해 구동되는 각 융합 단백질의 응집을 동적 광산란에 의하여 평가하였다. 융합 단백질의 희석 용액(25 μM)을 20 내지 60 ℃의 범위에서 1℃ 간격으로 가열하면서 융합 단백질에 의한 레이저광 산란을 모니터링하였다. 구형 입자에 대한 Stokes-Einstein 관계에 의해 스캐터 데이터로부터 수력학적 반지름 (Rh: hydrodynamic radius)을 측정하였다. 응집 온도는 그 이상의 온도에서 대형 입자(>100 nm)가 융합 단백질 응집물을 형성하기 시작하는 온도로 정의하였다. 도 7b는 온도 구동 상전이를 겪고 대형 응집물을 형성하는 디자인된 융합 단백질을 나타내었다. 응집은 37℃ 이하의 온도에서 형성되기 시작하였다. 이 열반응성 행동은 약물 전달 시스템의 중요한 부분이다. 이것은 ELP 및 IL1Ra의 디자인된 융합 단백질이 주입 시 및 주입 부위에서 응집한다는 점을 암시하며, 이는 IL1Ra 단백질 약물의 증가된 반감기에 귀착된다.
표 1: (A)ELP4-IL1Ra의 유전자(서열 번호:22) 및 단백질 서열(서열 번호:23)
Figure 112008005822201-PCT00001
(ELP4 유전자는 최초 462 뉴클레오티드로 확장하고 이어서 33 염기의 긴 스페이서가 뒤따른다. IL1Ra 유전자는 492 내지 942 염기로 확장한다)
표 2: ELP1-IL1Ra의 유전자(서열 번호:24) 및 단백질 서열(서열 번호:25).
ELP1 유전자는 최초 1362 뉴클레오티드로 확장하고 이어서 33 염기의 긴 스페이서가 뒤따른다. IL1Ra 유전자는 1395 내지 1845 염기로 확장한다.
Figure 112008005822201-PCT00002
(서열 번호:2)ELP1 유전자는 최초 1362 뉴클레오티드로 확장하고 이어서 33 염기의 긴 스페이서가 뒤따른다. IL1Ra 유전자는 1395 내지 1845 염기로 확장한다.
실험예 5
ELP - IL1Ra 융합 단백질의 생물학적 활성
앞서 기재한 바와 같이 콘에이 유도성 뮤린 C57 프라이머리 휸성 세포의 IL-1β 강화된 증식을 억제하는 대표적 융합 단백질(ELP4-IL1Ra)의 생활성을 조사하였다. 요약하면, 프라이머리 흉선 세포를 신선하게 희생된 5 내지 7주된 C57 마우스로부터 기계적으로 분리하였고, 밀도가 ∼2×106 세포/ 200㎕인 1 ng/ml의 rmIL-1Β (Pierce), 1 ㎍/ml의 콘에이(Sigma) 및 5 %의 FCS가 보충된 RPMI 1640내에 현탁시켰다. 이어서 (상기 기재한 바와 같은) ELP4-IL1Ra 융합 단백질 또는 상업적 rhIL1Ra (R&D 시스템) 중 어느 하나의 연속 희석액의 존재하에 48h 동안 세포를 배양시켰다. [3H]-티미딘(0.5 μCi/웰)을 흡입하여 흉선 세포의 증식을 평가하였다. 6개의 복제 배양균의 [3H]-티미딘의 평균 CPM±SD로 데이터를 표현하였다. 50% 억제(IC50)를 생성하는 최고 농도는 데이터를 시그모이드 함수에 맞춤으로써 측정하였다. ELP4-IL1Ra 융합 단백질은 61.4±19.8 nM의 IC50의 현저한 생활성을 나타내었고, 52 pM rmIL-1Β억제하였다. 도 8 참조.
실험예 6
종양 투여
본 발명의 조성물의 투여예를 도 9에 나타내었다. 응집하는 ELP(속이 꽉찬 바) 및 응집하지 않는 ELP(해칭된 바)의 종양 내에 주입된 용량 백분율 (%ID)을 나타내었다. 모든 타입의 ELP를 누드 마우스(Balb/c nu/nu)의 다리 위의 인간 편평세포암 (FaDu) 종양 내로 융합시켰다 (4㎕/분). 데이터는 평균±SEM이고, n = 1 내지 9였다. 응집하지 않는 ELP에 비해 응집하는 ELP의 용량이 훨씬 큼을 확인할 수 있다.
상술한 내용은 본 발명의 예시적인 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 후술하는 청구항에 의하여 정의되고, 청구항의 균등물은 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Duke University Setton, Lori A. Chilkoti, Ashutosh Kraus, Virginia B. Betre, Helawe Dreher, Matthew R. <120> A DIRECT DRUG DELIVERY SYSTEM BASED ON THERMALLY RESPONSIVE BIOPOLYMERS <130> 5405-367KR <150> PCT/US2006/024427 <151> 2006-06-21 <150> US 60/693,966 <151> 2005-06-24 <160> 25 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Thermosensitive bioelastic polymer sequence <400> 1 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 20 25 30 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 35 40 45 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 50 55 60 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 65 70 75 80 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 85 90 95 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 100 105 110 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 115 120 125 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 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Gly Val Pro Gly Val Gly Val 245 250 255 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 260 265 270 Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly 275 280 285 Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val 290 295 300 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 305 310 315 320 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 325 330 335 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro 340 345 350 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 355 360 365 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly 370 375 380 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly 385 390 395 400 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 405 410 415 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 420 425 430 Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly 435 440 445 Ala Gly 450 <210> 21 <211> 150 <212> PRT 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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 1 5 10 15 ggc gta ccg ggc gtt ggt gtt cct ggt gtc ggc gtg ccg ggc gtg ggt 96 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 20 25 30 gtt ccg ggc gta ggt gtc cca ggt gtg ggc gta ccg ggc gtt ggt gtt 144 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 35 40 45 cct ggt gtc ggc gtg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gta ggt gtc cca 192 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 50 55 60 ggt gtg ggc gta ccg ggc gtt ggt gtt cct ggt gtc ggc gtg ccg ggc 240 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 65 70 75 80 gtg ggt gtt ccg ggc gta ggt gtc cca ggt gtg ggc gta ccg ggc gtt 288 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 85 90 95 ggt gtt cct ggt gtc ggc gtg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gta ggt 336 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 100 105 110 gtc cca ggt gtg ggc gta ccg ggc gtt ggt gtt cct ggt gtc ggc gtg 384 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 115 120 125 ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gta ggt gtc cca ggt gtg ggc gta ccg 432 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 130 135 140 ggc gtt ggt gtt cct ggt gtc ggc gtg ccg ggc ggg ccg ggc ggc agc 480 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ser 145 150 155 160 ggc ggc agc gga tcc ggg aga aaa tcc agc aag atg caa gcc ttc aga 528 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg 165 170 175 atc tgg gat gtt aac cag aag acc ttc tat ctg agg aac aac caa cta 576 Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu 180 185 190 gtt gct gga tac ttg caa gga cca aat gtc aat tta gaa gaa aag ata 624 Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile 195 200 205 gat gtg gta ccc att gag cct cat gct ctg ttc ttg gga atc cat gga 672 Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly 210 215 220 ggg aag atg tgc ctg tcc tgt gtc aag tct ggt gat gag acc aga ctc 720 Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu 225 230 235 240 cag ctg gag gca gtt aac atc act gac ctg agc gag aac aga aag cag 768 Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln 245 250 255 gac aag cgc ttc gcc ttc atc cgc tca gac agc ggc ccc acc acc agt 816 Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser 260 265 270 ttt gag tct gcc gcc tgc ccc ggt tgg ttc ctc tgc aca gcg atg gaa 864 Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu 275 280 285 gct gac cag ccc gtc agc ctc acc aat atg cct gac gaa ggc gtc atg 912 Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met 290 295 300 gtc acc aaa ttc tac ttc cag gag gac gag tag 945 Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu 305 310 <210> 23 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Met Ser Gly Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 1 5 10 15 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 20 25 30 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 35 40 45 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 50 55 60 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 65 70 75 80 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 85 90 95 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 100 105 110 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 115 120 125 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 130 135 140 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg 165 170 175 Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu 180 185 190 Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile 195 200 205 Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly 210 215 220 Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu 225 230 235 240 Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln 245 250 255 Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser 260 265 270 Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu 275 280 285 Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met 290 295 300 Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu 305 310 <210> 24 <211> 1845 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Elastin-like polypeptide coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1842) <400> 24 atg agc ggg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggt ggc 48 Met Ser Gly Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly 1 5 10 15 ggt gtg ccg ggc gca ggt gtt cct ggt gta ggt gtg ccg ggt gtt ggt 96 Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 20 25 30 gtg ccg ggt gtt ggt gta cca ggt ggc ggt gtt ccg ggt gca ggc gtt 144 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val 35 40 45 ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gtg ggt gtt ccg 192 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 50 55 60 ggt ggc ggt gtg ccg ggc gca ggt gtt cct ggt gta ggt gtg ccg ggt 240 Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 65 70 75 80 gtt ggt gtg ccg ggt gtt ggt gta cca ggt ggc ggt gtt ccg ggt gca 288 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala 85 90 95 ggc gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gtg ggt 336 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 100 105 110 gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gca ggt gtt cct ggt gta ggt gtg 384 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val 115 120 125 ccg ggt gtt ggt gtg ccg ggt gtt ggt gta cca ggt ggc ggt gtt ccg 432 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 130 135 140 ggt gca ggc gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc 480 Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 145 150 155 160 gtg ggt gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gca ggt gtt cct ggt gta 528 Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val 165 170 175 ggt gtg ccg ggt gtt ggt gtg ccg ggt gtt ggt gta cca ggt ggc ggt 576 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly 180 185 190 gtt ccg ggt gca ggc gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gtg ggt gtt 624 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val 195 200 205 ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gca ggt gtt cct 672 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro 210 215 220 ggt gta ggt gtg ccg ggt gtt ggt gtg ccg ggt gtt ggt gta cca ggt 720 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 225 230 235 240 ggc ggt gtt ccg ggt gca ggc gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gtg 768 Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val 245 250 255 ggt gtt ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc gca ggt 816 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly 260 265 270 gtt cct ggt gta ggt gtg ccg ggt gtt ggt gtg ccg ggt gtt ggt gta 864 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 275 280 285 cca ggt ggc ggt gtt ccg ggt gca ggc gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg 912 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 290 295 300 ggc gtg ggt gtt ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc 960 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly 305 310 315 320 gca ggt gtt cct ggt gta ggt gtg ccg ggt gtt ggt gtg ccg ggt gtt 1008 Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 325 330 335 ggt gta cca ggt ggc ggt gtt ccg ggt gca ggc gtt ccg ggt ggc ggt 1056 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly 340 345 350 gtg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggt ggc ggt gtg 1104 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 355 360 365 ccg ggc gca ggt gtt cct ggt gta ggt gtg ccg ggt gtt ggt gtg ccg 1152 Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 370 375 380 ggt gtt ggt gta cca ggt ggc ggt gtt ccg ggt gca ggc gtt ccg ggt 1200 Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly 385 390 395 400 ggc ggt gtg ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggc gtg ggt gtt ccg ggt ggc 1248 Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly 405 410 415 ggt gtg ccg ggc gca ggt gtt cct ggt gta ggt gtg ccg ggt gtt ggt 1296 Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 420 425 430 gtg ccg ggt gtt ggt gta cca ggt ggc ggt gtt ccg ggt gca ggc gtt 1344 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val 435 440 445 ccg ggt ggc ggt gtg ccg ggc ggg ccg ggc ggc agc ggc ggc agc gga 1392 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 450 455 460 tcc ggg aga aaa tcc agc aag atg caa gcc ttc aga atc tgg gat gtt 1440 Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val 465 470 475 480 aac cag aag acc ttc tat ctg agg aac aac caa cta gtt gct gga tac 1488 Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr 485 490 495 ttg caa gga cca aat gtc aat tta gaa gaa aag ata gat gtg gta ccc 1536 Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro 500 505 510 att gag cct cat gct ctg ttc ttg gga atc cat gga ggg aag atg tgc 1584 Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys 515 520 525 ctg tcc tgt gtc aag tct ggt gat gag acc aga ctc cag ctg gag gca 1632 Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala 530 535 540 gtt aac atc act gac ctg agc gag aac aga aag cag gac aag cgc ttc 1680 Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe 545 550 555 560 gcc ttc atc cgc tca gac agc ggc ccc acc acc agt ttt gag tct gcc 1728 Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala 565 570 575 gcc tgc ccc ggt tgg ttc ctc tgc aca gcg atg gaa gct gac cag ccc 1776 Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro 580 585 590 gtc agc ctc acc aat atg cct gac gaa ggc gtc atg gtc acc aaa ttc 1824 Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe 595 600 605 tac ttc cag gag gac gag tag 1845 Tyr Phe Gln Glu Asp Glu 610 <210> 25 <211> 614 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Met Ser Gly Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 20 25 30 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val 35 40 45 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 50 55 60 Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 65 70 75 80 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala 85 90 95 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 100 105 110 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val 115 120 125 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 130 135 140 Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 145 150 155 160 Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val 165 170 175 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly 180 185 190 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val 195 200 205 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro 210 215 220 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 225 230 235 240 Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val 245 250 255 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly 260 265 270 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 275 280 285 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 290 295 300 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly 305 310 315 320 Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 325 330 335 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly 340 345 350 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 355 360 365 Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 370 375 380 Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly 385 390 395 400 Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly 405 410 415 Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 420 425 430 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val 435 440 445 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val 465 470 475 480 Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr 485 490 495 Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro 500 505 510 Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys 515 520 525 Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala 530 535 540 Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe 545 550 555 560 Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala 565 570 575 Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro 580 585 590 Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe 595 600 605 Tyr Phe Gln Glu Asp Glu 610

Claims (29)

  1. 관심 영역에 직접 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 전달될 화합물 및 역 온도 상전이를 겪는 중합체를 포함하는 숙주의 관심 영역에 조성물을 직접 투여하는 단계; 및
    선택된 영역에 상기 관심 화합물의 지속적인 방출을 제공하는 단계를 포함하되,
    상기 중합체는 상기 숙주의 신체 온도 이하의 전이 온도(Tt)를 가지는 상기 숙주의 상기 선택된 영역에 상기 관심 화합물의 데포 약물을 전달하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 관심 영역내에서 응집하고, 점진적으로 분해됨으로써, 상기 선택 영역에서 상기 관심 화합물의 상기 지속적 방출을 제공하는 데포 약물을 전달하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 투여 단계는 주입에 의해 수행하는 데포 약물의 전달 방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 투여 단계는 바늘 또는 캐뉼라를 통한 주입에 의해 수행하고, 상기 바 늘 또는 캐뉼라는 7-33 게이지인 데포 약물의 전달 방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 관절인 데포 약물의 전달 방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 관절이고, 상기 관심 화합물은 항염증 화합물이고, 상기 환자는 골관절염에 걸려있고, 상기 조성물은 상기 골관절염을 치료하는 데 유효량으로 투여되는 데포 약물의 전달 방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 투여 단계는 관절내 주사에 의해 수행하는 데포 약물의 전달 방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 환자는 가동 관절 장애 및/또는 추간판 질환에 걸린 데포 약물의 전달 방법.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 추간강인 데포 약물의 전달 방법.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 고형 종양인 데포 약물의 전달 방법.
  11. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 숙주가 걸린 고형 종양이고, 상기 조성물은 상기 고형 종양을 치료하는 데 유효량으로 투여되는 데포 약물의 전달 방법.
  12. 제1 항에 있어서,
    상기 투여 단계는 1개월에 3회 이하의 빈도로 복수 번 반복되는 데포 약물의 전달 방법.
  13. 제1 항에 있어서,
    상기 조성물은, 역 온도 상전이를 겪는 상기 중합체에 콘쥬게이트된 전달될 상기 약물을 포함하는 데포 약물의 전달 방법.
  14. 제1 항에 있어서,
    상기 중합체는 생탄성 중합체이고, 상기 생탄성 중합체는 생탄성 펜타펩티드, 테트라펩티드, 및 나노펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 탄성체 단위를 포함하는 데포 약물의 전달 방법.
  15. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 화합물은 단백질 또는 펩티드인 데포 약물의 전달 방법.
  16. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 화합물은 TNF 블로킹 항체, IL-1 항체, 용해성 TNF 수용체, 용해성 IL-1 수용체, TNF 수용체 길항제, 및 IL-1 수용체 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된 항염증 화합물인 데포 약물의 전달 방법.
  17. 제1 항에 있어서,
    상기 관심 화합물은 재조합 인간 IL- 1 수용체 길항제인 데포 약물의 전달 방법.
  18. 제1 항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 상기 중합체에 콘쥬게이트된 데포 약물의 전달 방법.
  19. 제1 항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 상기 중합체와 혼합되는 데포 약물의 전달 방법.
  20. 역 온도 상전이를 겪는 중합체와 조합된 요법 화합물을 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 항염증제 및 화학요법제로 이루어진 군으로부터 선택된 약학적으로 허용가능한 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 항염증제인 약학적으로 허용가능한 조성물.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 TNF 항체, IL-1 항체, 용해성 TNF 수용체, 용해성 IL-1 수용체, TNF 수용체 길항제, 및 IL-1 수용체 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된 항염증제인 약학적으로 허용가능한 조성물.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 재조합 인간 IL-1 수용체 길항제인 약학적으로 허용가능한 조성물.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 화학요법제인 약학적으로 허용가능한 조성물.
  26. 제20항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 상기 중합체에 콘쥬게이트된 약학적으로 허용가능한 조성물.
  27. 제20항에 있어서,
    상기 요법 화합물은 상기 중합체와 혼합되는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  28. 제20항에 있어서,
    멸균 주입가능한 형태의 제20 항의 조성물을 함유하는 주입 장치.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 주입 장치는 주사기인 주입 장치.
KR1020087001872A 2005-06-24 2006-06-21 열 반응성 생중합체에 기초한 직접 약물 전달 시스템 KR101446503B1 (ko)

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