KR20080020580A

KR20080020580A - 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해제조된 약물 함유 고분자 미립구

Info

Publication number: KR20080020580A
Application number: KR1020070088222A
Authority: KR
Inventors: 사홍기
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단; 에스케이케미칼주식회사
Priority date: 2006-08-31
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2008-03-05
Also published as: ES2420479T3; CN101511347B; EP2063874A4; US20090318569A1; CN101511347A; JP2010502594A; JP5302888B2; WO2008026894A1; US8202524B2; EP2063874B1; EP2063874A1; KR100918092B1

Abstract

본 발명은 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구에 관한 것으로, 구체적으로는 a) 고분자 화합물, 약물 및 수불용성 유기용매를 포함하는 분산상을 분산용매에 첨가하여 O/W(oil-in-water)형 또는 O/O(oil-in-oil)형 유제를 제조하거나, 또는 약물이 녹아있는 수용액을 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매에 유화시켜 W/O(water-in-oil)형 유제를 만든 후 이를 다시 분산용매에 첨가하여 W/O/W(water-in-oil-in-water)형 유제를 제조하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 제조된 유제에 암모니아 용액을 첨가하여 상기 수불용성 유기용매를 수용성 용매로 변환시키는 단계를 포함하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구에 관한 것이다. 상기 본 발명의 방법에 의하면, 적은 양의 물을 사용하여 빠른 시간 내에 간편하게 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있다.

고분자 미립구, 메틸 클로로아세테이트, 메틸다이클로로아세테이트

Description

약물 함유 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구{METHOD FOR PRODUCING MICROSPHERES LOADED WITH DRUGS AND MICROSPHERES LOADED WITH DRUGS PRODUCED THEREBY}

본 발명은 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구에 관한 것으로, 구체적으로는 고분자 화합물, 약물 및 수불용성 유기용매를 포함하는 분산상을 분산용매에 첨가하여 유제를 제조하는 단계 및 제조된 유제에 암모니아 용액을 첨가하여 상기 수불용성 유기용매를 수용성 용매로 변환시키는 단계를 포함하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구에 관한 것이다.

수액제, 현탁제 및 유제와 같은 종래 주사제형들은 근육이나 피하 투여 후 재빨리 체내에서 제거되기 때문에 만성질환 치료시에는 빈번한 주사투여가 필수적이었다. 이러한 문제점을 해결하고자 고안된 마이크로캅셀화(microencapsulation)는 고분자 화합물로 구성된 미립구(microsphere, 이하의 서술에서 미립구는 초미립구(nanosphere)를 포함함) 제형에 약물을 봉입시키는 제조공정을 지칭하는데, 미립구는 보통 ㎛ 단위의 크기를 지니므로 인체나 동물에 근육 또는 피하주사로 투여 가능하며, 다양한 약물 방출속도를 지니도록 제조할 수 있어 약물 전달기간을 제어할 수 있다. 그러므로, 단 한 번의 투여만으로도 장시간 동안 유효한 치료약물농도를 유지할 수 있어 치료에 필요한 약물 총 투여량을 극소화시킬 수 있으며, 환자의 약물치료 순응도를 향상시킬 수 있어, 현재 유수한 전 세계 제약회사에서 약물 함유 고분자 미립구 제조에 지대한 관심을 보이고 있다.

마이크로캅셀화를 통해 고분자 미립구를 제조하는 데에 폴리-d,l-락타이드-코-글리콜라이드(poly-d,l-lactide-co-glycolide, PLGA)가 고분자 화합물로서 가장 널리 사용된다. PLGA는 생체 내에서 가수분해되어 무독성의 락트산(lactic acid)과 글리콜산(glycolic acid)으로 변환되는 생체친화적인 고분자 화합물이다. 그러므로, 제약산업계는 PLGA를 사용한 의약품 제형의 개발에 많은 노력을 기울이고 있는데, 현재 시판되는 PLGA로 만든 미립구 제품의 예로서 리스퍼달 콘스타(Risperdal Consta), 산도스타틴(Sandostatin) LAR, 비비트롤(Vivitrol), 그리고 루프론 데포트(Lupron Depot) 등을 들 수 있다. 이들 각각은, 환자에게 1회 주사투여되어 리스페리돈(risperidone), 옥트레오타이드 아세테이트(octreotide acetate), 날트렉손(naltrexone), 그리고 루프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate)의 방출을 2주에서 4개월까지 조절한다.

이러한 약물 함유 고분자 미립구는 메틸렌 클로라이드 및 에틸 아세테이트와 같은 유기용매를 사용하는 용매증발법 또는 용매추출법에 의해 통상적으로 제조된다.

먼저, 용매증발법에 대하여 간략히 설명하자면(미국 특허 제6,471,996호, 제 5,985,309호 및 제5,271,945호 참조), 고분자 화합물을 녹인 유기용매 상에 약물을 분산 또는 녹인 후, 물과 같은 분산매에 유화시켜 수중유형(O/W, oil-in-water) 유제를 제조한 다음, 유제에 있는 유기용매를 분산매로 확산시켜 공기/물 계면을 통하여 유기용매를 증발시킴으로써 약물 함유 고분자 미립구를 형성한다. 이때, 유기용매의 분산매로의 확산을 촉진하기 위하여 감압, 온도 상승, 과량의 물을 사용한 유기용매 추출 등의 기법을 활용한다. PLGA 고분자 화합물을 녹이기 위해 일반적으로 사용되는 분산유기용매는 메틸렌 클로라이드로서, 이 메틸렌 클로라이드가 다양한 분자량과 락타이드:글리콜라이드 비를 지닌 PLGA 공중합체를 잘 녹일 수 있고, 물 용해도가 1.32 중량%로 낮아 물과 잘 섞이지 않으므로 수중유형 형태의 유제를 만들기에 적합하기 때문이다. 그리고, 39.8℃의 낮은 끓는점(비점)에 기인하여 유제 액체방울로부터 물로 확산한 소량의 메틸렌 클로라이드 분자들이 물과 공기 계면을 통하여 잘 증발된다. 이러한 과정이 지속적으로 반복되면 유제방울로부터 메틸렌 클로라이드가 제거됨에 따라 미립구가 만들어진다. 마지막으로, 낮은 비점 덕분에 미립구에 존재하는 잔류 메틸렌 클로라이드를 건조하여 제거하는 것이 매우 손쉽다는 장점을 갖는다. 용매증발법에 근거하여 유제방울이 미립구로 변화하는 모식도를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, (A)에서 PLGA/약물/메틸렌 클로라이드로 구성된 분산상이 물과 같은 외상에 수중유형 형태의 유제로 존재하다가(물에 녹아있는 메틸렌 클로라이드는 △으로 표현하였음), 메틸렌 클로라이드 일부가 수중으로 확산, 증발되는 과정이 되풀이되면 유제방울은 (B)에서 볼 수 있는 바와 같이 미립자로 변환하게 된다.

이처럼, 메틸렌 클로라이드는 강한 휘발성을 지니고 물과 잘 섞이지 않으며 물 보다 훨씬 낮은 비점을 갖는 등 유제를 만들기 위한 최적의 유기용매임에도 불구하고, 다음과 같은 심각한 문제점들을 갖는다: (a) 실험적으로 확인된 발암물질이다; (b) 대기의 오존층을 파괴시켜 환경독성을 야기하며, 이러한 결과로 인체 피부암 발생을 증가시킨다; (c) 미국 보건복지부 소속의 독성 물질 및 질병 담당 부서(Agency for Toxic Substances and Disease Registry)에서 규정하고 있는 가장 위험한 38가지 독성 유해물질 중의 하나에 속한다; (d) 물용해도가 약 1.32 중량%로 낮아 사용된 총량의 메틸렌 클로라이드 중 극히 일부만이 물에 용해되어 증발되므로 유제방울에 있는 메틸렌 클로라이드가 완전히 제거되려면 상당한 시간이 소요된다. 예로서, 미국 특허 제6,884,435호에서는 유제로부터 메틸렌 클로라이드를 제거하기 위하여 밤새 유제를 교반하고 있으며, 미립구 제조시간을 단축하기 위해 반응조(reactor)의 온도를 상승시키거나 또는 감압조건을 도입하기도 한다(미국 특허 제3,691,090호, 제3,891,570호, 제6,270,700호 및 제6,572,894호 참조).

한편, 약물 함유 고분자 미립구의 제조에 사용되는 용매추출법은 유제방울에 있는 유기용매를 대량의 가용화 용매를 사용하여 효과적으로 추출하는 방법이다. 유기용매가 유제방울로부터 추출되면, 녹아있던 고분자 화합물이 경화되어 유제방울이 미립구로 전환된다. 일반적으로 사용되는 가용화 용매는 물인데, 유기용매의 물 용해도 정도가 필요로 되는 물의 양에 큰 영향을 미친다. 예를 들면, 메틸렌 클로라이드의 경우 물용해도가 1.32 중량%이므로 매우 많은 양의 물을 사용해야만 유제에 있는 메틸렌 클로라이드를 추출할 수가 있다. 하지만, 이 경우 메틸렌 클로라 이드를 함유하는 폐수가 다량 생성되어 이러한 폐수의 처리가 또한 문제가 되므로, 용매추출법에는 메틸렌 클로라이드에 비하여 물용해도가 높은 에틸 아세테이트가 주로 사용된다. 에틸 아세테이트는 물용해도가 8.7 중량%에 달하여 메틸렌 클로라이드에 비하여 상대적으로 적은 양의 물로도 추출이 가능하며, 또한 비할로겐화 유기용매라는 장점을 갖는다. 하지만, 에틸 아세테이트의 비점은 77℃로서 메틸렌 클로라이드의 비점인 39.8℃보다 훨씬 높아 건조시 잔류용매를 제거하는 것이 상대적으로 힘들다는 단점을 갖는다. 또한, 특정 분자량과 락타이드:글리콜라이드 비를 지닌 PLGA 고분자화합물이 에틸 아세테이트에 잘 녹지 않는 물성을 나타낸다.

이에, 미국 특허 제4,389,840호, 제4,530,840호, 제6,544,559호, 제6,368,632호 및 제6,572,894호 등은 용매증발법과 용매추출법을 동시에 활용하는 기술을 개시한다. 즉, 유제를 만든 후 일부 유기용매는 증발과정을 통하여 제거하고 잔존하는 유기용매는 용매추출법을 사용하여 제거한다. 예를 들면, 미국 특허 제4,389,840호의 경우, 약물과 PLGA 고분자 화합물을 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 물에 유화시켜 수중유형 유제를 제조한 다음, 40 내지 60 중량%의 메틸렌 클로라이드를 증발과정을 통해 제거하고 잔존하는 메틸렌 클로라이드를 다량의 물로 추출함으로써 미립구를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 이들 기존의 방법은 모두 사용된 유기용매의 물 용해도가 충분히 높지 않기 때문에 아주 과량의 물(유기용매의 물용해도 × 10배 이상)을 사용해야 한다. 따라서, 이를 위해 매우 큰 용량의 반응조가 필요하고, 유기용매를 함유하는 폐수가 다량 생성되어 폐수 처리를 위한 부대비용이 증가하는 비효율성 문제에 직 면하게 된다. 또한, 미립구 내에 잔존하는 유기용매를 효과적으로 제거하기도 어렵다는 문제점을 갖는다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고 간편하게 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있는 방법을 연구하던 중, 수불용성 유기용매에 고분자 화합물과 약물을 녹여 유제를 만든 다음에 가암모니아 분해반응을 통해 수용성 용매로 변화시켜 유제방울을 미립구로 경화시킴으로써 간편하게 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 용매증발 또는 용매추출 공정을 필요로 하지 않는 약물 함유 고분자 미립구 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은,

a) 고분자 화합물, 약물 및 수불용성 유기용매를 포함하는 분산상을 분산용매에 첨가하여 O/W(oil-in-water)형 또는 O/O(oil-in-oil)형 유제를 제조하거나, 또는 약물이 녹아있는 수용액을 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매에 유화시켜 W/O(water-in-oil)형 유제를 만든 후 이를 다시 분산용매에 첨가하여 W/O/W(water-in-oil-in-water)형 유제를 제조하는 단계; 및

b) 상기 a) 단계에서 제조된 유제에 암모니아 용액을 첨가하여 상기 수불용성 유기용매를 수용성 용매로 변환시키는 단계를 포함하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구를 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 제법은, 유제에의 암모니아 용액 첨가에 따른 가암모니아분해반응(ammonolysis)을 통해 유제 중에 존재하는 수불용성 유기용매를 수용성 용매 로 변환시킴으로써 유제방울을 미립구로 즉시 경화시켜 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 얻는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 고분자 미립구 제법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

a) 단계 : 유제를 제조하는 단계

고분자 화합물, 약물 및 수불용성 유기용매를 포함하는 분산상을 분산용매에 첨가하여 O/W(oil-in-water)형 또는 O/O(oil-in-oil)형 유제를 제조하거나, 또는 약물이 녹아있는 수용액을 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매에 유화시켜 W/O(water-in-oil)형 유제를 만든 후 이를 다시 분산용매에 첨가하여 W/O/W(water-in-oil-in-water)형 유제를 제조한다.

본 발명에 사용되는 분산용매는 유화제를 함유하는 수성 분산용매 또는 비수성 분산용매를 포함하며, O/W형 및 W/O/W형 유제 제조시에는 수성 분산용매가, O/O형 유제 제조시에는 비수성 분산용매가 사용된다. 수성 분산용매로는 친수성 유화제, 예컨대 폴리비닐 알콜 또는 트윈(Tween) 계열과 같은 유화제를 함유하는 수용액 또는 이의 공용매를 사용할 수 있다. 비수성 분산용매로는 친유성 유화제, 예컨대 스팬(Span) 계열과 같은 유화제를 함유하는 실리콘 오일, 야채 기름, 톨루엔 또는 자일렌을 사용할 수 있다. 상기 분산용매에 함유되어 있는 유화제의 농도는 0.05 내지 15 %(w/v)일 수 있다.

본 발명에 사용되는 수불용성 유기용매는 통상적으로 물과 섞이지 않으나 암모니아와 반응시 분해되어 수용성 용매로 변환되는 것이라면 모두 가능하며, 구체 적으로 카르복실 에스테르(carboxylic esters), 카르복실 아미드(carboxylic amides), 언하이드리드(anhydrides), 포스포릭 에스테르(phosphoric esters), 그리고 포스포릭 언하이드리드(phosphoric anhydrides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 백본(backbone)을 가지는 수불용성 유기용매가 바람직하다. 보다 구체적으로 메틸 다이클로로아세테이트(methyl dichloroacetate), 메틸 클로로아세테이트(methyl chloroacetate), 에틸 클로로아세테이트(ethyl chloroacetate), 에틸 다이클로로아세테이트(ethyl dichloroacetate), 메틸 플루로아세테이트(methyl fluoroacetate), 메틸 다이플루로아세테이트(methyl difluoroacetate), 에틸 플루로아세테이트(ethyl fluoroacetate), 에틸 다이플루로아세테이트(ethyl difluoroacetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 메틸 아세테이트(methyl acetate), 메틸 폴메이트(methyl formate), 에틸 폴메이트(ethyl formate), 아이소프로필 폴메이트(isopropyl formate),프로필 폴메이트(propyl formate)로 이루어진 군에서 선택된 수불용성 유기용매가 바람직하다.

상기 수불용성 유기용매는 일반적으로 비점이 높아 종래 미립구 제법에는 유기용매로서 사용될 수 없었으나, 본 발명의 고분자 미립구 제조방법에서는 암모니아와 반응하여 수용성 용매로 변환이 되므로 바람직하게 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 실시예에서 사용되는 메틸 다이클로로아세테이트 또는 메틸 클로로아세테이트는 기존의 용매증발법 또는 용매추출법에 흔히 사용되는 메틸렌 클로라이드 및 에틸 아세테이트 보다 훨씬 높은 비점(142.9℃, 129.5℃)을 가져 종래의 미립구 제법에는 유기용매로서 도저히 사용될 수 없으나, 본 발명에서는 암모니아와 반응시 아주 짧은 시간 내에 물에 완전히 용해되는 다이클로로아세트아마이드와 메탄올 또는 클로로아세트아마이드와 메탄올로 변환되므로 바람직하게 사용될 수 있다. 필요에 따라, 상기 메틸 다이클로로아세테이트 또는 메틸 클로로아세테이트와 1종 이상의 다른 유기용매가 혼합된 공용매를 사용함으로써 미립구에 봉입하고자 하는 약물의 용해도를 조절하거나 유제방울의 경화속도를 원하는 바에 따라 제어할 수 있다.

본 발명에 사용되는 고분자 화합물의 대표적인 예로는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체 및 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA)를 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 약물은 친수성 약물과 소수성 약물을 모두 포함한다. 약물의 대표적인 예로는 프로게스테론(progesterone) 할로페리돌(haloperidol), 티오틱센(thiothixene), 올란자핀(olanzapine), 클로자핀(clozapine), 브롬페리돌(bromperidol), 피모자이드(pimozide), 리스페리돈(risperidone), 지프라시돈(ziprasidone), 디아제프마(diazepma), 에틸 로플라제페이트(ethyl loflazepate), 알프라졸람(alprazolam), 네모나프라이드(nemonapride), 플루옥세틴(fluoxetine), 세르트랄린(sertraline), 베늘라팍신(venlafaxine), 도네페 질(donepezil), 타크린(tacrine), 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine), 셀레길린(selegiline), 로피니롤(ropinirole), 페르골리드(pergolide), 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl), 브로모크립틴(bromocriptine), 벤즈트로핀(benztropine), 콜치킨(colchicine), 노르다제팜(nordazepam), 에티졸람(etizolam), 브로마제팜(bromazepam), 클로티아제팜(clotiazepam), 멕사졸룸(mexazolum), 부스피론(buspirone), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 소마토트로핀(somatotropin), 루프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 옥트레오티드(octreotide), 세트로렐릭스(cetrorelix), 산도스타틴 아세테이트(sandostatin acetate), 고나도트로핀(gonadotropin), 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 미조리빈(mizoribine), 사이클로스포린(cyclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 날록손(naloxone), 날트렉손(naltrexone), 클라드리빈(cladribine), 클람부실(chlorambucil), 트레티노인(tretinoin), 카르무시틴(carmusitne), 아나그렐리드(anagrelide), 독소루비신(doxorubicin), 아나스트로졸(anastrozole), 이다루비신(idarubicin), 시스플라틴(cisplatin), 닥티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 랄티트렉세드(raltitrexed), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 메플로퀸(mefloquine), 프리마퀸(primaquine), 옥시부티닌(oxybutynin), 톨트레로딘(toltrerodine), 알릴에스트레놀(allylestrenol), 로보스타틴(lovostatin), 심바스타틴(simvastatin), 프로바스타틴(provastatin), 아트로바스타틴(atrovastatin), 알렌드로네이트(alendronate), 살카토닌(salcatonin), 랄록시펜(raloxifene), 옥사드롤론(oxadrolone), 콘쥬게이티드 에스트로겐(conjugated estrogen), 에스트라디올(estradiol), 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate), 에스트라디올 벤조에이트(estradiol benzoate), 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 에토노게스트렐(etonogestrel), 레보노르게스트렐(levonorgestrel), 티볼론(tibolone), 노르에티스테론(norethisterone) 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 리스페리돈 또는 프로게스테론을 사용할 수 있다.

소수성 약물의 경우에 고분자 화합물과 소수성 약물을 수불용성 유기용매에 녹인 후 수성 분산용매 또는 비수성 분산용매에 현탁시켜 O/W형 또는 O/O형 유제를 제조할 수 있다. 친수성 약물의 경우에 먼저 친수성 약물을 물에 녹여 약물이 녹아있는 수용액을 고분자 화합물이 녹아있는 유기용매에 유화시켜 1차적으로 W/O형 유제를 만든 후, 이 유제를 수성 분산용매에 현탁시켜 2차적으로 W/O/W형 유제를 제조할 수 있다.

상기 고분자 화합물은 약물 1 중량부를 기준으로 1 내지 500 중량부, 바람직하게는 1 내지 50 중량부의 양으로 사용할 수 있으며, 유제에 함유되어 있는 고분자 화합물의 농도는 3 내지 30 %(w/v)일 수 있다.

또한, 상기 분산상 또는 W/O(water-in-oil)형 유제와 분산용매의 부피비는 1:1-100, 바람직하게는 1:3-15 범위일 수 있다. 그리고 약물이 녹아있는 수용액과 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매의 부피비는 1:1-50, 바람직하게는 1:2-20 범위일 수 있다.

b) 단계 : 수불용성 유기용매를 수용성 용매로 변환시키는 단계

상기 a) 단계에서 제조된 O/W형, W/O/W형 또는 O/O형 유제에 암모니아 용액을 첨가하여 가암모니아분해반응을 통해 상기 수불용성 유기용매를 물에 완전히 용해되는 용매로 변환시켜 유제방울을 미립구로 경화시킴으로써 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 제조한다. 이때, 유제방울의 빠른 경화에 기인하여 유제방울 입자간의 상호작용이 억제되어 응집 없이 목적하는 미립구를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 하나의 실시양태로서 약물(리스페리돈) 함유 고분자 미립구가 생성되는 과정을 도 2에 모식도로서 나타내었다. 도 2에서, (A)에서 PLGA/리스페리돈/메틸렌 다이클로로아세테이트로 구성된 분산상이 액체방울 상태로 외상인 물(□)에 유화되어 있다가, 가암모니아분해반응에 의해 (B)에서 메틸렌 다이클로로아세테이트가 물과 완전히 섞이는 다이클로로아세트아마이드(▼)와 메탄올(▲)로 변화함으로써 목적하는 미립구가 생성된다. 본 발명에 사용되는 암모니아 용액은 수불용성 유기용매의 몰수 보다 많은 몰수의 암모니아를 함유하는 것이 적합하다.

본 발명에 따른 또 하나의 실시양태로서 약물(프로게스테론) 함유 고분자 미립구가 생성되는 과정을 도 7에 모식도로서 나타내었다. 도 7에서, PLGA/프로게스테론/메틸 클로로아세테이트로 구성된 분산상이 액체방울 상태로 외상인 물에 유화되어 있다가, 가암모니아분해반응에 의해 메틸 클로로아세테이트가 물과 완전히 섞이는 클로로아세트아마이드와 메탄올로 변화함으로써 목적하는 미립구가 생성된다.

이와 같은 본 발명 방법에 의해 제조된 고분자 미립구는 0.1 내지 3500 ㎛, 바람직하게는 10 내지 350 ㎛의 평균 입경을 가지며, 원하는 바에 따라 다양한 중량의 약물을 함유할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 기존의 용매증발 또는 용매추출 공정을 필요로 하지 않고, 적은 양의 물을 사용하여 폐수 발생을 최소화하면서 빠른 시간 내에 간편하게 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 기존의 용매증발 또는 용매추출 공정을 필요로 하지 않고, 적은 양의 물을 사용하여 폐수 발생을 최소화하면서 빠른 시간 내에 간편하게 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

메틸 다이클로로아세테이트를 이용한 가암모니아분해반응

<1-1> 메틸 다이클로로아세테이트에 대한 가암모니아 분해반응

본 발명자는 가암모니아 분해반응을 통해 수불용성 유기용매를 물과 완전히 섞이는 용매로 변화될 수 있는지를 확인하기 위하여, 수불용성 유기용매인 메틸 다이클로로아세테이트를 사용하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

폴리비닐알콜(88% 분해정도이며 분자량은 25,000) 1%를 포함하는 물 40 ml에 3 ml의 메틸 다이클로로아세테이트를 가한 후 550 rpm에서 교반하여 유제를 만들었다. 3분간 교반한 후 유제에 3 ml의 암모니아수(약 30% 농도)를 가하였다. 5분 이 상 경과 하였을 때 물에 분산된 메틸 다이클로로아세테이트 방울입자가 완전히 사라지고 유제가 단일상(one phase)의 용액으로 변하였다. 이러한 결과는 메틸 다이클로로아세테이트가 가암모니아분해반응을 거쳐 다이클로로아세트아마이드와 메탄올로 변환되어 물과 완전히 섞임을 보여준다(참고로 다이클로로아세트아마이드의 물용해도는 71 g/l 임).

<1-2> 메틸 다이클로로아세테이트의 분해산물인 다이클로로아세트아마이드의 분리

상기 <1-1>에서 얻은 투명한 용액에 과량의 NaCl을 가하여 녹아 있는 메틸 다이클로로아세테이트의 분해산물을 염석(salting-out)시켰다. 여기에 에틸 아세테이트를 가하여 염석된 분해산물을 에틸 아세테이트 상으로 전이시켜 수층으로부터 분리하였다. MgSO₄ 무수물을 가하여 에틸 아세테이트에 존재하는 물을 제거하고 여과한 후 회전 증발기(Eyela Model N-1000)를 사용하여 에틸 아세테이트를 증발 제거하였다. 잔존물에 남아있는 에틸 아세테이트를 없애기 위하여 CHCl₃로 한번 세척한 후 진공 건조하여 흰색의 분말을 얻었다.

<1-3> NMR 및 MS 실험을 통한 다이클로로아세트아마이드 동정

상기 <1-2>에서 얻은 흰색의 분말에 대하여 하기와 같이 NMR 및 MS 실험을 실시하였다; 흰색 분말을 아세톤-d6에 녹인 후 NMR 분광광도계를 사용해 ¹H-NMR 스펙트럼을 관찰하여 도 3에 나타내었다. 이때, 테트라메틸실란을 참고로 하여 ¹H 화 학적 이동을 측정하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, δH 7.46과 7.08에서 2개의 아마이드 프로톤 시그날이 관측되었다. 그리고, 두개의 염소기를 지닌 탄소에 붙어있는 프로톤 시그날은 δH 6.30에서 나타났다. 또한, Q-tof^TM 2 질량 분석계를 사용하여 전기분무 이온화 질량 스펙트럼(ESI-MS)을 관찰하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, m/z 149.93에서 [M+Na⁺] 피크가, m/z 151.93에서 [M+2+Na⁺] 피크가, 그리고 m/z 153.93에서 [M+4+Na⁺] 피크가 나타났다. 두개의 염소기를 지닌 화합물의 경우 [M+Na⁺], [M+2+Na⁺] 및 [M+4+Na⁺] 피크의 강도가 이론적으로 100, 65.3 및 10.6%이어야 함을 고려할 때, 본 실험의 측정치는 이러한 이론치와 완전히 일치하였다. 상기 ¹H-NMR 및 ESI-MS 실험결과 메틸 다이클로로아세테이트가 가암모니아 분해반응을 통하여 다이클로로아세트아마이드로 변환되었음을 확인할 수 있다.

상기와 같은 실험결과에 의해, 가암모니아분해반응을 통해 수불용성 유기용매인 메틸 다이클로로아세테이트가 수용성 유기용매인 다이클로로아세트아마이드와 메탄올로 변환되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

메틸 클로로아세테이트를 이용한 가암모니아 분해반응

<2-1> 메틸 클로로아세테이트에 대한 가암모니아 분해반응

본 발명자는 가암모니아 분해반응을 통해 수불용성 유기용매를 물과 완전히 섞이는 용매로 변화될 수 있는지를 확인하기 위하여, 수불용성 유기용매인 메틸 클로로아세테이트(물 용해도 25 ℃에서 46 g/l 임)를 사용하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

물 40 ml에 4 ml의 메틸 클로로아세테이트를 가한 후 가열교반기(400 HPS/VWR Scientific)를 사용하여 유제를 만들어 3분간 교반한 후 유제에 4 ml의 암모니아수(약 30% 농도)를 가하였다. 이 후 10분이 경과하였을 때 물에 분산된 메틸 클로로아세테이트 방울입자가 완전히 사라지고 유제가 단일상(one phase)의 용액으로 변하였다.

또한 물 40 ml에 암모니아수 4 ml가 첨가된 수용액에 메탄올릭 페놀프탈레인 용액 100 ul를 첨가하고 메틸 클로로아세테이트 4 ml를 혼합하였다. 이 후 상기 혼합액 1 ml를 취하여 U-3000 UV/Vis 스펙트로미터(Shimadzu사, 교토, 일본)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 시간에 따라 측정하여 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이 메틸 클로로아세테이트가 첨가되지 않은 경우 흡광도의 변화가 없었으나 메틸 클로로아세테이트가 첨가된 경우 흡광도가 급격히 감소하였다.

상기 결과를 통해 메틸 클로로아세테이트가 가암모니아분해반응을 거쳐 클로로아세트아마이드와 메탄올로 변환되어 물과 완전히 섞임을 알 수 있었다.

<2-2> 메틸 클로로아세테이트의 분해산물인 클로로아세트아마이드의 분리

상기 <2-1>에서 얻은 투명한 용액에 과량의 NaCl을 가하여 염석(salting-out)해 클로로아세트아마이드를 침전시키고 여기에 에틸 아세테이트를 30 ml씩 3번 가하여 클로로아세트아마이드를 에틸 아세테이트 상으로 전이시켜 수층으로부터 분 리하였다. 상기 에틸 아세테이트 용액을 MgSO₄ 무수물을 가하여 에틸 아세테이트에 존재하는 물을 제거하고 셀라이트(celite)를 통하여 여과한 후 감압하에 에틸 아세테이트를 증발시켜 흰색의 분말을 얻었다.

<2-3> NMR 및 MS 실험을 통한 클로로아세트아마이드 동정

상기 <2-2>에서 얻은 흰색의 분말에 대하여 하기와 같이 NMR 및 MS 실험을 실시하였다; 흰색 분말을 중수소화된 트리클로로메탄 (CDCl₃)에 녹인 후 NMR 분광광도계를 사용해 ¹H-NMR 스펙트럼을 관찰하여 도 6a에 나타내었다. 이때, 테트라메틸실란을 참고로 하여 ¹H 화학적 이동을 측정하였다. 도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, δH 6.55과 6.04에서 2개의 아마이드 프로톤 시그날이 관측되었다. 그리고 한 개의 염소기를 지닌 탄소에 붙어있는 프로톤 시그날은 δH 4.05에서 나타났다.

또한, Q-tof^TM 2 질량 분석계를 사용하여 전기분무 이온화 질량 스펙트럼(ESI-MS)을 관찰하여 도 6b에 나타내었다. 도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이, m/z 116.01에서 [M+Na⁺] 피크가 그리고 m/z 118.01에서 [M+2+Na⁺] 피크가 나타났다. 상기 2개의 피크의 비가 3:1인 것은 ³⁷Cl의 자연 존재비와 일치한다.

상기 ¹H-NMR 및 ESI-MS 실험결과는 메틸 클로로아세테이트가 가암모니아 분해반응을 통하여 클로로아세트아마이드(C₂H₄ClNO)로 변환되었음을 확인할 수 있다. 구체적으로 가암모니아분해반응을 통해 수불용성 유기용매인 메틸 클로로아세테이 트가 수용성 유기용매인 클로로아세트아마이드와 메탄올로 변환되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

< 실시예 3>

메틸 다이클로로아세테이트를 이용한 PLGA 미립구

<3-1> 메틸 다이클로로아세테이트를 이용한 PLGA 미립구 제조

미립구 형성 고분자 화합물로서 락타이드:글리콜라이드 비가 75:25인 폴리-d,l-락타이드-코-글리콜라이드(CHCl₃에서의 고유 점도 0.67 dL/g; 이후부터는 PLGA 약어로 표시)를 사용하였다. 미립구에 봉입하는 소수성 약물로서 리스페리돈(중국 Changzhou United Chemical Co., Ltd로부터 구입)을 사용하였다. PLGA(250 mg)을 3 ml의 메틸 다이클로로아세테이트에 완전히 녹인 다음 리스페리돈(125, 175, 또는 225 mg)을 넣어 녹였다. PLGA, 리스페리돈 및 메틸 다이클로로아세테이트로 구성된 분산상을 40 ml의 1 % 폴리비닐알콜(분자량 = 25,000; 가수분해 정도 = 88 %) 수용액에 넣어 유화시켰다. 이때 유제를 만들기 위하여 마그네틱 교반기를 사용하였으며 마그네틱바의 교반속도는 550 rpm으로 유지하였다. 교반을 시작한 지 3분 경과 후, 유제에 3 ml의 암모니아수(암모니아 농도 약 30 %)를 가하고 15분 동안 계속 교반하였다. 이후 형성된 미립구 현탁액을 425 μm 크기를 지닌 체를 통과시켰다. 이 후 여과를 통해 미립구를 취하여 100 ml의 0.1 % 폴리비닐알콜 수용액에 분산시켰다. 45분 경과 후 미립구를 여과분리하여 100 ml의 0.1 % 폴리비닐알콜 수용액에 재분산시킨 후 2시간 동안 교반시켰다. 여과과정을 통해 취득한 미립구를 진공상태 에서 밤새 건조시켰다. 건조 후 미립구는 훌륭한 유동성을 갖추고 있음을 확인하였는데, 이는 곧 건조과정 중 미립구 간의 응집 현상이 심각하지 않았음을 증명한다. 또한, 미립구 수득률이 76.4에서 86.4 %로 관측되었는데, 이러한 결과는 본 발명에 의한 방법에 의해 미립구가 효과적으로 제조됨을 알 수 있었다.

<3-2> 열중량 ( thermogravimetric ) 분석

PLGA 250 mg과 리스페리돈 125 mg을 사용하여 제조한 미립구를 대상으로 열중량 분석기 TGA 2050(미국 TA 인스트루먼츠(Instruments)사제)을 사용하여 열중량을 분석한 결과를 도 8에 나타내었다. 이때, 질소가스를 사용하였으며, 온도를 분당 10 ℃씩 증가시켰을 때 미립구의 무게 변화를 측정하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 메틸 다이클로로아세테이트의 비점인 142.9 ℃에서 급격한 무게변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 미립구 제조시 메틸 다이클로로아세테이트가 물에 녹는 다이클로로아세트아마이드와 메탄올로 변화되어 유제방울로부터 효과적으로 제거되어 미립구가 형성되었음을 보여준다.

<3-3> HPLC 약물분석

시마쥬(Shimadzu) HPLC 시스템을 약물분석에 사용하였다. 분석칼럼으로서 길이 15 cm의 사이메트리(Symmetry) C18 5 μm 칼럼을 사용하였다. 이동상으로 10 mM 암모늄 아세테이트와 메탄올의 혼합용액(6:4 부피비)을 사용하였으며, 이동상 유출속도를 1 ml/분으로 유지하였다. HPLC 칼럼으로부터 유출되는 약물을 UV 파장 260 nm에서 측정하였다. 검체의 약물농도는 4가지 약물농도를 사용하여 작성한 표준검량곡선을 바탕으로 산출하였다.

<3-4> 리스페리돈 봉입률( encapsulation efficiency ) 측정

리스페리돈을 포함하고 있는 PLGA 미립구 일부를 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 여기에 16 ml의 메탄올을 가하고 0.45 μm 공극 크기를 지닌 나일론 필터로 여과하여 PLGA 침전물을 제거한 여과액을 마련하였다. 여과액 일부(20 μl)를 HPLC에 주입하여 약물의 농도를 측정하였다. 하기 수학식 1 내지 3에 따라, 약물의 이론부하량(%) 및 실제부하량(%)을 구하여 그 백분율을 약물의 봉입률(%)로 정의하였다.

PLGA 250 mg과 리스페리돈 125 mg을 사용하였을 때 봉입률은 97.0 ± 2.1 %이었다. PLGA의 양은 고정시키고 리스페리돈의 사용량을 175와 225 mg으로 증가하 였을 때 각각의 경우 봉입률은 94.5 ± 2.0 및 92.7 ± 3.2 %이었다. 이러한 결과는 본 발명의 방법에 따라 미립구를 제조하는 경우에 리스페리돈 대부분을 PLGA 미립구 내로 봉입시킬 수 있음을 보여준다.

<3-5> 미립구 형상 관찰

본 발명에 따라 제조된 미립구의 내부 및 외부 형상을 JSM-5200 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 관찰하여 도 9a 내지 9d에 나타내었다. 도 9a는 미립구의 외부 형상을 보여주고 있는데, 구상의 형태로 잘 분산되어 있음을 알 수 있다. 도 9b 내지 9d의 절단된 미립구 내부 사진은 리스페리돈 부하량에 관계없이 유사한 형상을 나타내었는데, 매트릭스 내에 작은 크기의 공동(cavity)이 관찰되었다. 종합하여 말하자면, 본 발명에 따르면, 미립구가 응집현상 없이 잘 분산된 상태로 제조됨을 알 수 있었다.

< 비교예 >

용매 증발법( solvent evaporation method )을 이용한 DCM 미립구 제조

본 발명자들은 종래 용매 증발법을 이용한 PLGA 미립구와 본 발명의 방법으로 제조된 PLGA 미립구를 비교하기 위하여 하기와 같은 방법으로 미립구를 제조하였다. PLGA(250 mg)을 4 ml의 다이클로로메탄에 완전히 녹인 다음 프로게스테론(60, 100, 160, 200 또는 250 mg)을 넣어 녹였다. PLGA, 프로게스테론 및 다이클로로메탄으로 구성된 분산상을 40 ml의 0.5 % 폴리비닐알콜 수용액에 넣어 유화시켰다. 이때 유제를 만들기 위하여 마그네틱 교반기를 사용하였으며 마그네틱바의 교반속도는 550 rpm으로 유지하였다. 5시간의 교반후 형성된 미립구 현탁액을 425 μm 크기를 지닌 체를 통과시켰다. 이 후 여과를 통해 미립구를 취하여 진공상태에서 밤새 건조시켜 PLGA 미립구를 PLGA 미립구를 제조하였는 바 이하 상기 과정을 통해 제조된 PLGA 미립구를 ‘DCM 미립구’ 라 한다.

< 실시예 4>

메틸 클로로아세테이트를 이용한 PLGA 미립구 (이하 ‘ MCA 미립구 ’)

<4-1> 메틸 클로로아세테이트를 이용한 MCA 미립구 제조

미립구 형성 고분자 화합물로서 실시예 <3-1>에서 이용한 PLGA를 사용하였다. 미립구에 봉입하는 소수성 약물로서 프로게스테론을 사용하였다. PLGA(250, 300, 또는 350 mg)을 4 ml의 메틸 클로로아세테이트에 완전히 녹인 다음 프로게스테론(60, 100, 160, 200 또는 250 mg)을 넣어 녹였다. PLGA, 프로게스테론 및 메틸 클로로아세테이트로 구성된 분산상을 40 ml의 0.5 % 폴리비닐알콜 수용액에 넣어 유화시켰다. 이때 유제를 만들기 위하여 마그네틱 교반기를 사용하였으며 마그네틱바의 교반속도는 550 rpm으로 유지하였다. 교반을 시작한 지 3분 경과 후, 유제에 4 ml의 암모니아수(암모니아 농도 28 %)를 가하고 10 분 동안 계속 교반한 후 40 ml의 물을 가하여 5 분 동안 추가 교반하였다. 이 후 형성된 미립구 현탁액을 425 μm 크기를 지닌 체를 통과시켰다. 이 후 여과를 통해 미립구를 취하여 80 ml의 0.1 % 폴리비닐알콜 수용액에 분산시켰다. 2 시간 후 미립구를 다시 여과 분리하여 취득한 미립구를 진공상태에서 밤새 건조시켜 PLGA 미립구를 제조하였는 바 이하 상기 과정을 통해 제조된 PLGA 미립구를 ‘MCA 미립구’ 라 한다.

<4-2> 프로게스테론 봉입률( encapsulation efficiency ) 측정

프로게스테론을 포함하고 있는 상기 실시예 <4-1>의 미립구(‘MCA’ 미립구)의 지름 크기(median size)를 마스터사이저 2000(Malvern Instruments사, Worcestershire, 영국)을 이용하여 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 여기에 24 ml의 메탄올을 가하고 0.45 μm 공극 크기를 지닌 나일론 필터로 여과하여 PLGA 침전물을 제거한 여과액을 마련하였다. 여과액 일부(20 μl)를 HPLC에 주입해 약물의 농도를 측정하여, 실시예 <3-4>에 기재된 수학식을 이용해 약물의 봉입률(%)로 계산하고 하기 수학식 4를 이용하여 미립구의 생산률을 계산하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.

MCA 미립구의 프로게스테론의 봉입률, 미립구의 생산률 및 지름

미립구의 조성비(mg)		프로게스테론의 봉입률(%)	미립구의 생산률(%)	미립구의 지름 (μm)
PLGA	프로게스테론	프로게스테론의 봉입률(%)	미립구의 생산률(%)	미립구의 지름 (μm)
250	160	68.9 ±1.4	76.8 ±6.4	167.2 ±10.3
300	160	67.1 ±1.3	81.3 ±4.4	178.9 ±19.6
350	160	65.9 ±1.44	83.6 ±5.0	181.1 ±10.6

한편 상기 실시예 <4-1> 제조된 미립구인 ‘MCA 미립구’(PLGA 투여량이 250 mg인 경우에 한함)와 상기 비교예에서 제조된 미립구인 ‘DCM 미립구’의 투여된 프로게스테론의 양에 따른 봉입률을 측정하여 도 10에 기재하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이 MCA 미립구의 경우 프로게스테론의 양을 많이 투여할수록 점차적인 봉입률의 증가를 보여 프로게스테론 투여량이 250 mg인 경우 봉입률이 72.8 ± 0.3 %에 달했으며 DCM 미립구의 경우 75.2 ± 3.8 % 내지 78.6 ± 3.1 %의 봉입률을 보였다. 따라서 MCA 미립구의 봉입률은 프로게스테론의 양을 많이 투여할수록 DCM 미립구의 봉입률과 거의 일치하는 모습을 보였다.

따라서 메틸 클로로아세테이트를 이용한 가암모니아 분해 반응에 의해 제조된 MCA 미립구는 프로게스테론 투여량이 많을수록 봉입률이 뛰어나 유용한 약물 함유 고분자 미립구로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<4-3> 열중량 ( thermogravimetric ) 분석

실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 제조된 프로게스테론 12.4, 27.4, 및 36.4 %의 MCA 미립구와 비교예와 동일한 방법으로 제조된 프로게스테론 15.2, 29.4, 및 38.6 %의 DCM 미립구를 대상으로 열중량 분석기 TGA 2050(미국 TA Instruments사제)을 사용하여 열중량을 분석한 결과를 도 11에 나타내었다. 이때, 질소가스를 사용하였으며, 온도를 분당 10 ℃씩 증가시켰을 때 미립구들의 무게 변화를 측정하였다.

도 11a에서 볼 수 있는 바와 같이, DCM 미립구들의 경우 150 ℃에서 다이클로로메탄의 증발로 인해 원래 무게의 0.5 ~ 2.3 %의 손실이 있었으며 이는 전형적인 용매 증발 과정에서 일어나는 현상과 일치한다(Benoit, T. S.; Courteille, F.; Thies, C. Int. J. Pharm. 1986, 29, 95-102). 다만 도 11b에서 볼 수 있는 바와 같이 MCA 미립구들의 경우 원래 무게의 1.6 ~ 3.5 %의 손실이 있었으며 메틸 클로로아세테이트의 비점인 129.5 ℃에서는 급격한 무게 손실은 없었다. 이러한 결과는 가암모니아 분해 반응이 효과적으로 유제방울로부터 분산용매를 제거시킴을 의미한다.

<4-5> 미립구 형상 관찰

실시예 <4-1> 및 비교예와 동일한 방법으로 제조된 미립구들의 표면 및 내부 형상을 JSM-5200 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 관찰하였다.

실시예 <3-4>에 기재된 수학식 2에 따라 프로게스테론 실제 부하량이 15.2, 21.7, 29.4, 및 38.6 % 인 DCM 미립구의 표면 형상을 각각 도 12A의 a, b, c 및 d에 도시하였다. 도 12A에 나타낸 바와 같이 DCM미립구에서 프로게스테론 함량이 증가할수록 프로게스테론 결정체가 형성되고 미립구의 표면이 손상되는 것을 확인하였다.

또한 프로게스테론 실제 부하량이 12.4, 18.7, 27.4, 및 36.4 % 인 MCA 미립구의 표면 형상을 각각 도 12B의 a, b, c 및 d에 도시하였다. 도 12B에 나타낸 바와 같이 프로게스테론 함량이 증가할수록 오히려 결점이 없어지고 구형의 미립구가 형성되며 DCM 미립구에서 나타난 결정체(drug crystal) 형성이 억제됨을 확인하였다.

또한 프로게스테론 실제 부하량이 15.2, 21.7, 29.4, 및 38.6 % 인 DCM 미립구의 내부 형상을 각각 도 13A의 a, b, c 및 d에 도시하였다. 도 13A에 나타낸 바와 같이 DCM 미립구에서 프로게스테론 함량이 증가할수록 프로게스테론의 결정화가 일어나 프로게스테론과 PLGA 폴리머간에 상 분리 현상을 가속화시켜 결국 미립구의 내부 매트릭스가 비틀어짐을 확인하였다.

또한 프로게스테론 실제 부하량이 12.4, 18.7, 27.4, 및 36.4 % 인 MCA 미립구의 표면 형상을 각각 도 13B의 a, b, c 및 d에 도시하였다. 도 13B에 나타낸 바와 같이 매트릭스 내에 작은 크기의 공동(cavity)이 관찰되었지만 DCM 미립구와 비교할 때 프로게스테론 함량의 증가에 따른 큰 변화는 관찰되지 않았다.

따라서 프로게스테론 투여량이 많다 하더라도 MCA 미립구는 그 표면 및 내부 형태를 유지하여 유용한 약물 함유 고분자 미립구로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

에틸 클로로아세테이트를 이용한 PLGA 미립구

<5-1> 에틸 클로로아세테이트를 이용한 PLGA 미립구 제조

미립자 형성 고분자 화합물로서 실시예 <3-1>에서 이용한 PLGA를 사용하였다. 미립구에 봉입하는 소수성 약물로서 프로게스테론을 사용하였다. 250 mg의 PLGA을 4 ml의 에틸 클로로아세테이트에 완전히 녹인 다음 프로게스테론(60, 100, 160, 200, 또는 250 mg)을 넣어 다시 녹였다. 이후 상기 용액을 40 ml의 0.5 % 폴리비닐알콜 수용액에 넣고 550 rpm에서 3분 간 교반하고, 유체에 암모니아수(28 %) 9 ml을 넣고 60분간 추가 교반한 후 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 PLGA 미립구를 제조하였다.

<5-2> 프로게스테론 봉입률( encapsulation efficiency ) 측정

프로게스테론을 포함하고 있는 상기 실시예 <5-1>의 미립구의 지름 크기(median size)를 마스터사이저 2000(Malvern Instruments사, Worcestershire, 영국)을 이용하여 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 여기에 24 ml의 메탄올을 가하고 0.45 μm 공극 크기를 지닌 나일론 필터로 여과하여 PLGA 침전물을 제거한 여과액을 마련하였다. 여과액 일부(20 μl)를 HPLC에 주입해 약물의 농도를 측정하여, 실시예 <3-4>에 기재된 수학식을 이용해 약물의 봉입률(%)로 계산하여 그 결과를 표 2에 기재하였다.

PLGA 미립구의 프로게스테론의 봉입률

미립구의 조성비(mg)		프로게스테론의 봉입률(%)
PLGA	프로게스테론	프로게스테론의 봉입률(%)
250	60	87.96 ± 1.22
250	100	87.06 ± 1.24
250	160	84.77 ± 0.75
250	200	85.01 ± 1.27
250	250	86.22 ± 1.60

상기 표 2에 기재된 바와 같이 에틸 클로로아세테이트를 이용한 가암모니아 분해 반응에 의해 제조된 PLGA 미립구의 프로게스테론 봉입률은 84.77 ± 0.75 내지 87.96 ± 1.22에 달해 상기 PLGA 미립구는 유용한 약물 함유 고분자 미립구로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<5-3> 미립구 형상 관찰

실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 제조된 프로게스테론의 실제 부하량이 43.1 %인 PLGA 미립구의 표면 형상(도 14B)을 JSM-5200 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 프로게스테론을 함유하지 않은 PLGA 미립구(도 14A)와 비교 관찰하였다.

도 14에 나타낸 것과 같이 프로게스테론을 투여 하더라도 PLGA 미립구는 그 표면 형태를 유지하여 유용한 약물 함유 고분자 미립구로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

에틸 플루로아세테이트를 이용한 PLGA 미립구

<6-1> 에틸 플루로아세테이트를 이용한 PLGA 미립구 제조

미립자 형성 고분자 화합물로서 실시예 <3-1>에서 이용한 PLGA를 사용하였다. 미립구에 봉입하는 소수성 약물로서 프로게스테론을 사용하였다. 250 mg의 PLGA을 4 ml의 에틸 플루로아세테이트(Ethyl fluoroacetate)에 완전히 녹인 다음 프로게스테론(60, 100, 160, 200, 또는 250 mg)을 넣어 다시 녹여 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 PLGA 미립구를 제조하였다.

<6-2> 프로게스테론 봉입률( encapsulation efficiency ) 측정

프로게스테론을 포함하고 있는 상기 실시예 <6-1>의 미립구의 지름 크기(median size)를 마스터사이저 2000(Malvern Instruments사, Worcestershire, 영국)을 이용하여 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 여기에 24 ml의 메탄올을 가하고 0.45 μm 공극 크기를 지닌 나일론 필터로 여과하여 PLGA 침전물을 제거한 여과액을 마련하였다. 여과액 일부(20 μl)를 HPLC에 주입해 약물의 농도를 측정하여, 실시예 <3-4>에 기재된 수학식을 이용해 약물의 봉입률(%)로 계산하여 그 결과를 표 3에 기재하였다.

PLGA 미립구의 프로게스테론의 봉입률

미립구의 조성비(mg)		프로게스테론의 봉입률(%)
PLGA	프로게스테론	프로게스테론의 봉입률(%)
250	60	81.16 ± 2.40
250	100	81.42 ± 1.90
250	160	82.82 ± 1.36
250	200	84.01 ± 2.31
250	250	84.56 ± 2.02

상기 표 3에 기재된 바와 같이 에틸 플루로아세테이트를 이용한 가암모니아 분해 반응에 의해 제조된 PLGA 미립구의 프로게스테론 봉입률은 81.16 ± 2.40 내지 84.56 ± 2.02에 달해 상기 PLGA 미립구는 유용한 약물 함유 고분자 미립구로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<6-3> 미립구 형상 관찰

실시예 <6-1>과 동일한 방법으로 제조된 프로게스테론의 실제 부하량이 42.3 %인 PLGA 미립구의 표면 형상(도 15B)을 JSM-5200 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 프로게스테론을 함유하지 않은 상기 PLGA 미립구(도 15A)와 비교 관찰하였다.

도 15에 나타낸 것과 같이 프로게스테론을 투여 하더라도 상기 PLGA 미립구는 그 표면 형태를 유지하여 유용한 약물 함유 고분자 미립구로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

도 1은 종래의 용매증발법에 근거하여 유제방울이 미립구로 변화하는 과정을 모식도로서 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따른 하나의 실시양태로서 약물(리스페리돈) 함유 고분자 미립구가 생성되는 과정을 모식도로서 나타낸 것이고,

도 3 및 4는 각각 본 발명에 따른 하나의 실시양태를 수행하는 과정에서 생성된 다이클로로아세트아마이드의 ¹H-NMR 및 전기분무 이온화 질량 스펙트럼(ESI-MS)이고,

도 5 는 본 발명에 따른 하나의 실시양태를 수행하는 과정에서 페놀프탈레인 존재시 생성된 메틸 클로로아세테이트가 함유된 암모니아 용액의 흡광도를 시간에 따라 측정한 곡선이고,

● : 메틸 클로로아세테이트가 존재하지 않는 경우

○ : 메틸 클로로아세테이트가 존재하는 경우

도 6 은 각각 본 발명에 따른 하나의 실시양태를 수행하는 과정에서 생성된 클로로아세트아마이드의 ¹H-NMR(도 6A) 및 전기분무 이온화 질량 스펙트럼(ESI-MS) (도 6B) 이고,

도 7은 가암모니아 분해과정을 통한 미립자의 생성 과정을 설명하는 모식도를 나타낸 것이고,

도 8은 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 약물(리스페리돈) 함유 고분자 미립구의 열중량 분석 곡선이고,

도 9는 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 약물(리스페리돈) 함유 고분자 미립구의 외부(도 9a) 및 내부(도 9b 내지 9d) 형상에 대한 주사 전자 현미경(scanning electron microscope) 사진이고,

도 10은 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 MCA 미립구의 약물(프로게스테론) 봉입률을 DCM 미립구의 봉입률과 비교한 그래프이고,

도 11은 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 약물(프로게스테론) 함유 MCA 미립구의 열중량(도 11B)을 DCM 미립구의 열중량(도 11A)과 비교한 곡선이고,

도12는 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 약물(프로게스테론) 함유 MCA 미립구의 표면 형상(도 12B)을 DCM 미립구의 표면 형상(도 12A)을 비교한 주사 전자 현미경(scanning electron microscope) 사진이고

도13은 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 약물(프로게스테론) 함유 MCA 미립구의 내부 형상(도 13B)을 약물(프로게스테론) 함유 DCM 미립구(도 13A)의 내부 형상을 비교한 주사 전자 현미경(scanning electron microscope) 사진이고,

도14는 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 약물(프로게스테론) 함유 PLGA 미립구의 표면 형상(도 14B)을 약물(프로게스테론) 함유하지 않은 PLGA 미립구의 표면 형상(도 14A)을 비교한 주사 전자 현미경(scanning electron microscope) 사진이고

도15는 본 발명에 따른 하나의 실시양태에서 제조된 약물(프로게스테론) 함유 PLGA 미립구의 표면 형상(도 15B)을 약물(프로게스테론) 함유하지 않은 PLGA 미립구의 표면 형상(도 15A)을 비교한 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)사진이다.

Claims

a) 고분자 화합물, 약물 및 수불용성 유기용매를 포함하는 분산상을 분산용매에 첨가하여 O/W(oil-in-water)형 또는 O/O(oil-in-oil)형 유제를 제조하거나, 또는 약물이 녹아있는 수용액을 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매에 유화시켜 W/O(water-in-oil)형 유제를 만든 후 이를 다시 분산용매에 첨가하여 W/O/W(water-in-oil-in-water)형 유제를 제조하는 단계; 및

b) 상기 a) 단계에서 제조된 유제에 암모니아 용액을 첨가하여 상기 수불용성 유기용매를 수용성 용매로 변환시키는 단계를 포함하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계의 분산용매가 폴리비닐 알콜 수용액 또는 이의 공용매인 수성 분산용매이거나, 또는 스팬-함유 실리콘 오일, 야채 기름, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 비수성 분산용매임을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계의 수불용성 유기용매가 수불용성 유기용매와 1종 이상의 다른 유기용매가 혼합된 공용매임을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 수불용성 유기용매는 카르복실 에스테르(carboxylic esters), 카르복실 아미드(carboxylic amides), 안하이드리드(anhydrides), 포스포릭 에스테르(phosphoric esters), 그리고 포스포릭 안하이드리드(phosphoric anhydrides)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 백본(backbone)을 가지는 것을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항 에 있어서, 상기 수불용성 유기용매는 메틸 다이클로로아세테이트(methyl dichloroacetate), 메틸 클로로아세테이트(methyl chloroacetate), 에틸 클로로아세테이트(ethyl chloroacetate), 에틸 다이클로로아세테이트(ethyl dichloroacetate), 메틸 플루로아세테이트(methyl fluoroacetate), 메틸 다이플루로아세테이트(methyl difluoroacetate), 에틸 플루로아세테이트(ethyl fluoroacetate), 에틸 다이플루로아세테이트(ethyl difluoroacetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 메틸 아세테이트(methyl acetate), 메틸 폴메이트(methyl formate), 에틸 폴메이트(ethyl formate), 아이소프로필 폴메이트(isopropyl formate), 프로필 폴메이트(propyl formate)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 수불용성 유기용매는 메틸 다이클로로아세테이트(methyl dichloroacetate), 메틸 클로로아세테이트(methyl chloroacetate), 에틸 클로로아세테이트(ethyl chloroacetate) 및 에틸 플루로아세테이트(ethyl fluoroacetate)로 이루어진 군에서 선택된 수불용성 유기용매인 것을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계의 고분자 화합물이 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계의 고분자 화합물을 약물 1 중량부를 기준으로 1 내지 500 중량부로 혼합하는 것을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계의 유제에 함유되어 있는 고분자 화합물의 농도가 3 내지 30 %(w/v)임을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계의 분산상 또는 W/O(water-in-oil)형 유제와 분산용매의 부피비가 1:1-100임을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계에서 약물이 녹아있는 수용액과 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매의 부피비는 1:1-50임을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 b) 단계의 암모니아 용액을 수불용성 유기용매의 몰수 보다 많은 몰수로 첨가하는 것을 특징으로 하는 약물 함유 고분자 미립구의 제조방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 약물 함유 고분자 미립구.