KR20070053650A - 어피니티 입자 및 어피니티 분리 방법 - Google Patents

어피니티 입자 및 어피니티 분리 방법 Download PDF

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가부시키가이샤 시세이도
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Abstract

본 발명은 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 가지며, 어떤 목적 물질에 특이적으로 친화성을 갖는 리간드를 무기 입자의 표면에 공유 결합 또는 흡착으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자이다.
본 발명은 저렴한 무기 입자를 이용한 어피니티 입자에 의해 간편하고 정밀하게 목적 물질을 분리하는 것이 가능한 어피니티 분리 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
Figure 112006056137945-PCT00023
(1)
Figure 112006056137945-PCT00024
무기, 입자, 어피니티, 목적, 공유 결합, 흡착, 포스포릴콜린기, 친화성

Description

어피니티 입자 및 어피니티 분리 방법{AFFINITY PARTICLE AND AFFINITY SEPARATION METHOD}
본 발명은 어피니티 입자 및 어피니티 분리 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 무기 입자를 이용한 어피니티 입자 및 목적 물질을 정밀하고 용이하게 분리하는 것이 가능한 어피니티 분리 방법에 관한 것이다. 또한, 목적 물질을 고감도로 용이하게 검출 가능한 면역 침강법, 라텍스 응집법 등을 비롯한 각종 분리, 정제, 검사 방법에 대하여 매우 유용하게 활용된다.
종래 생체 물질의 분리 정제에는 칼럼 크로마토그래피가 이용되어 왔다. 그러나, 칼럼 분리에는 하기 (1)∼(3)에 나타낸 치명적인 문제점이 있었다.
(1) 목적 물질을 얻을 때까지 많은 종류의 칼럼을 사용하여야 하며, 정제 효율이 나쁘다.
(2) 분획 성분 중에 목적 물질이 포함되어 있는지 여부의 확인 시험을 행할 필요가 있으므로 정제에 엄청난 시간을 필요로 한다.
(3) 정제시의 손실도 크기 때문에 다량의 샘플이 필요해진다.
반면, 목적 물질의 분리 정제에는 리간드가 담지된 어피니티 칼럼이나 어피니티 입자가 사용되고 있다(특허 문헌 1, 특허 문헌 2).
그러나, 어피니티 칼럼에 의한 분리 정제에는 아래의 문제점이 있었다.
(1) 원하는 목적 물질이 선택적으로 분리되지 않는다. 즉, 리간드에 포착되는 목적 물질 이외에 원하지 않는 목적 물질도 칼럼에 흡착되어 버린다.
(2) 포착 효율이 낮으며, 다량의 액체 시료가 필요해진다.
또한, 어피니티 입자를 액체 시료 중에 분산시켜 분리하는 어피니티 분리 방법에는 아가로스 등이 사용되고 있는데(비 특허 문헌 1), 하기의 문제점이 있었다.
(1) 원하는 목적 물질이 선택적으로 분리되지 않는다. 즉, 리간드에 포착되는 목적 물질 이외에, 원하지 않는 목적 물질도 어피니티 입자에 흡착되어 버린다.
(2) 비중이 가벼워 어피니티 입자를 분리하기가 어려웠다.
(3) 담체의 붕괴가 일어나기 쉬우며, 내구성이 낮다.
한편, 무기 입자는 유기 입자보다 많은 물질을 흡착해 버리기 때문에 무기 입자를 어피니티 입자에 이용한다는 발상은 당업자에게 생길 수 없었다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공고 평 8-26076호 공보
특허 문헌 2: 특표 2002-511141호 공보
비 특허 문헌 1: Bioconjugate Chem.; 2002; 13(2); 163-166
발명의 개시
본 발명은 저렴한 무기 입자를 이용한 어피니티 입자에 의해 간편하고 정밀하게 원하는 목적 물질을 분리하는 것이 가능한 획기적인 어피니티 분리 방법을 제공하는 것이다. 또한, 목적 물질을 고감도로 용이하게 검출 가능한 면역 침강법, 라텍스 응집법 등을 비롯한 각종 분리, 정제, 검사 방법에 대하여 매우 유용하게 활용된다.
즉, 본 발명은 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자를 제공하는 것이다.
Figure 112006056137945-PCT00001
(1)
또한, 본 발명은 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 가지며, 어떤 목적 물질에 특이적으로 친화성을 갖는 리간드와 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 무기 입자의 표면에 공유 결합 또는 흡착으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자를 제공하는 것이다.
Figure 112006056137945-PCT00002
(1)
나아가, 본 발명은 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 가지며, 어떤 목적 물질에 특이적으로 친화성을 갖는 리간드를 무기 입자의 표면에 공유 결합 또는 흡착으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자를 제공하는 것이다.
Figure 112006056137945-PCT00003
(1)
또한 본 발명은, 상기 무기 입자가 실리카, 산화티타늄, 아연화, 알루미나, 산화철, 탈크, 마이카, 세리사이트, 금 콜로이드로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 무기 입자로서, 그 평균 입경이 20 nm∼500 ㎛, 비중이 1.0 g/㎠이상인 것을 특징으로 하는 어피니티 입자를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명은 상기 리간드가 각종 항체, 항원, 효소, 기질, 리셉터, 렉틴, 펩타이드, DNA, RNA, 압타머, 단백질 A, 단백질 G, 아비딘, 비오틴, 킬레이트 화합물, 각종 금속 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 리간드인 것을 특징으로 하는 어피니티 입자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 (1) 청구항 1 또는 2에 기재된 어피니티 입자에 임의의 리간드를 결합시키는 제1 공정, (2) 제1 공정에서 제조한 어피니티 입자를 임의의 리간드에 의해 선택적으로 포착되는 목적 물질을 포함하는 액체 시료에 분산시키는 제2 공정, (3) 어피니티 입자로부터 포착한 목적 물질을 회수하는 제3 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 무기 입자에 의한 목적 물질의 어피니티 분리 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명은 (1) 청구항 3에 기재된 어피니티 입자를 임의의 리간드에 의해 선택적으로 포착되는 목적 물질을 포함하는 액체 시료에 분산시키는 제1 공정, (2) 어피니티 입자로부터 포착한 목적 물질을 회수하는 제2 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 무기 입자에 의한 목적 물질의 어피니티 분리 방법을 제공하는 것이다. 한편, 본 발명의 어피니티 입자를 면역 침강법이나 라텍스 응집법과 같은 항체나 단백의 검출에 이용하는 경우에는 (2)의 회수 공정은 불필요하며, 그 분산 상태의 변화에 의해 육안으로 용이하게 확인할 수 있다.
발명의 효과
본 발명의 어피니티 입자는 어떤 목적 물질(분리를 원하는 목적 물질)만 리간드에 의해 포착하고, 그 밖의 물질이 입자에 흡착되는 것을 억제하기 때문에 분리 선택성이 매우 높다. 그리고, 그 뛰어난 분산성과 액체 시료로부터의 분리가 매우 용이하기 때문에, 저렴한 무기 입자 입자를 이용한 어피니티 입자에 의해 간편하고 정밀하게 목적 물질을 분리하는 것이 가능해진다.
즉, 본 발명의 목적 물질의 분리 방법은, 분리를 목적으로 하는 목적 물질을 단시간에 효율적으로, 그리고 간편하게 분리할 수 있다. 통상적으로, 물질은 이물질에 대하여 흡착되는 성질을 가지고 있기 때문에 종래의 어피니티 입자에서는 목적 물질만 효율적으로 단리하기는 어려우나, 입자 표면을 포스포릴콜린기로 수식함으로써 다른 물질의 어피니티 입자에 대한 비특이적 흡착을 매우 효율적으로 방지할 수 있고, 정제 효율을 높이는 것이 가능하다.
또한, 포스포릴콜린기는 매우 높은 친수성을 가지고 있으며, 물을 포함하는 액체 시료 중에서 어피니티 입자의 분산성을 향상시키는 기능도 갖는다.
아울러, 통상적인 입자는 염에 의해 응집되는 경향이 있기 때문에, 예컨대 혈청으로부터 목적물을 단리하고자 하는 경우, 혈청 중의 각종 염에 의해 응집하여 정제 효율이 저하되는데, 본 발명의 어피니티 입자는 염의 존재 하에서도 응집이 적어 효율적으로 목적 물질을 회수할 수 있다.
본 발명에 사용하는 어피니티 입자는 무기 입자로 구성되기 때문에 비중이 높고, 정치 혹은 가벼운 원심 분리에 의해 용이하게 회수하는 것이 가능하다. 또한, 이 입자를 담체로서 칼럼에 채워넣고 어피니티 칼럼으로서 목적 물질의 회수에도 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 어피니티 입자와 종래의 어피니티 입자에 의한 단백질 포착의 선택성의 차이를 나타내는 모식도이다.
도 2는 합성예 1에서 제조한 화합물의 구조식 및 NMR 스펙트럼이다.
도 3은 합성예 2에서 제조한 화합물의 구조식 및 NMR 스펙트럼이다.
도 4는 합성예 5에서 제조한 PC 입자 (A), (B), (C)와 합성예 6에서 제조한 Af 입자 (A), (B), (C)를 이용한 P 정량의 결과이다.
도 5는 참고예 1에서 제조한 PC 입자 (A)의 31P-CPMAS 스펙트럼이다.
도 6은 참고예 1에서 제조한 PC 입자 (A)의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 7은 참고예 3에서 제조한 PC 입자 (C)의 13C-CPMAS 스펙트럼이다.
도 8은 참고예 1, 2, 3에서 제조한 PC 입자 (A), (B), (C)의 단백질 비특이흡착 억제 평가이다.
도 9는 실시예 1에서 행한 Af 입자 (A)를 이용한 항소 알부민 항체, 항사람 헤모글로빈에 대한 선택성 평가이다.
도 10은 실시예 2에서 행한 Af 입자 (B)를 이용한 항소 알부민 항체, 항사람 헤모글로빈에 대한 선택성 평가이다.
도 11은 실시예 3에서 행한 Af 입자 (C)를 이용한 항소 알부민 항체, 항사람 헤모글로빈에 대한 선택성 평가이다.
도 12는 실시예 1, 3에서 행한 Af 입자 (A), (C)를 이용한 염소 항혈청에 대한 선택성 평가이다.
도 13은 실시예 1, 3에서 행한 Af 입자 (A), (C)를 이용한 항사람 헤모글로빈 in 염소 혈청에 대한 선택성 평가이다.
도 14는 비교예 1에서 행한 아미노 입자를 이용한 항소 알부민 항체, 항사람 헤모글로빈에 대한 선택성 평가이다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
[무기 입자]
본 발명에 있어서, 어피니티 입자를 구성하는 무기 입자는 특별히 한정되지 않는다. 무기 입자란, 일반적으로 평균 입경 20 nm∼500 ㎛ 정도의 무기의 물체를 의미한다. 구체적인 입자로는, 예컨대 탈크, 카올린, 운모, 권운모(세리사이트), 백운모, 금운모, 합성 운모, 홍운모, 흑운모, 퍼미큘라이트, 탄산마그네슘, 탄산칼슘, 규산알루미늄, 규산바륨, 규산칼슘, 규산마그네슘, 규산스트론튬, 텅스텐산 금속염, 마그네슘, 실리카, 제올라이트, 황산바륨, 소성 황산칼슘(구운 석고), 인산칼슘, 불소 애퍼타이트, 히드록시 애퍼타이트, 세라믹 파우더, 금속 비누(예컨대, 미리스트산아연, 팔미트산칼슘, 스테아르산알루미늄), 질화붕소, 산화세륨, 금 콜로이드와 같은 무기 입자를 들 수 있다.
특히 바람직한 입자는 실리카, 산화티타늄, 아연화, 알루미나, 산화철, 탈크, 마이카, 세리사이트, 금 콜로이드 등이다. 또한, 다공질의 무기 입자보다 무공 질의 무기 입자가 바람직하다.
상기 (1) 식의 포스포릴콜린기와 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 입자 표면에 공유 결합에 의해 도입시키기 때문에, 그 표면에 아미노기를 갖는 입자가 바람직하다.
또한, 무기 입자의 평균 입경이 20 nm∼500 ㎛, 비중이 1.0 g/㎠ 이상인 어피니티 입자가 바람직하다.
예컨대, 실리카, 산화티타늄, 아연화, 알루미나, 산화철, 탈크, 마이카, 세리사이트, 금 콜로이드 등이다.
[리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기]
리간드가 결합 가능한 한 한정되지 않는다. 예컨대, 공유 결합 형태에서는 아미드, 에스테르, 우레탄, 에테르, 2차 아민, 요오드 결합, 디술피드 결합 등이 바람직하다. 따라서, 리간드가 이들의 공유 결합 형태가 될 수 있는 반응기가 바람직하며, 아미노기, 히드록실기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기 등이 바람직하다. 또한, 흡착 형태는 아비딘-비오틴, 금속-킬레이트 화합물 등이 바람직하다. 따라서, 리간드가 이들의 흡착 형태가 될 수 있는 흡착기가 바람직하며, 아비딘, 비오틴, 킬레이트 화합물 등이 바람직하다.
[리간드]
본 발명에 있어서 리간드란, 어떤 목적 물질과 특이적으로 결합하는 물질로서, 각종 항체, 항원, 효소, 기질, 리셉터, 펩타이드, DNA, RNA, 압타머, 단백질 A, 단백질 G, 아비딘, 비오틴, 킬레이트 화합물, 각종 금속 이온 등이다. 예컨대, 각종 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY, 항원은 단백질, 다당류, 효소는 글루타치온-S-트랜스퍼라아제, 기질은 글루타치온, 리셉터는 호르몬 리셉터, 사이토카인 리셉터, 킬레이트 화합물은 니트릴로트리 아세트산, 각종 금속 이온은 Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+이다.
[본 발명의 어피니티 입자의 제조 방법]
식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 가지며, 어떤 목적 물질에 특이적으로 친화성을 갖는 리간드와 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 무기 입자의 표면에 공유 결합 또는 흡착으로 무기 입자의 표면에 직접 존재해 있는 것이 본 발명의 본질이므로, 그 제조 방법은 한정되지 않으며, 어떠한 방법에 의해 결합시켜도 좋다.
단, 전술한 바와 같이, 포스포릴콜린기 및 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 미리 갖는 집합체를 이용하여, 화학 결합하지 않고 입자 표면을 단순히 피복하는 태양은 포함하지 않는다. 피복된 집합체가 벗겨져 버리거나 피복 집합체에 의한 영향이 발생하기 때문이다.
본 발명의 어피니티 입자는 하기 방법 등에 의해 제조할 수 있다.
단계 1: 입자에 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 도입한다. 반응기 또는 흡착기는 한정되지 않으나, 아미노기나 히드록실기, 카르복실기, 알데히드기 등이다.
단계 2: 입자에 도입한 반응기 또는 흡착기에 대하여 식 (1)로 표시되는 포 스포릴콜린기와 리간드를 결합시킨다. 한편, 포스포릴콜린기 또는 리간드와 반응기 또는 흡착기 사이에 존재하는 화학 구조(스페이서)는 임의이다. 예컨대, 임의의 스페이서로서, 메틸렌쇄, 옥시 에틸렌쇄 등 이외에 아미노기를 하나 또는 복수 포함하는 알킬렌쇄이어도 좋다.
[입자 표면에 존재해 있는 반응기 또는 흡착기가 아미노기인 경우]
단계 1: 임의의 입자에 공지의 방법 혹은 향후 개발될 방법으로 아미노기를 도입한다. 아미노기는 입자 표면에 직접 도입된다. 아미노기는 1차 아민 혹은 2차 아민이다.
단계 2: 아미노기를 갖는 입자에 대하여 글리세롤포스포릴콜린의 산화적 개열 반응에 의해 얻어진 알데히드체 또는 하이드레이트체를 환원적 아미노화 반응에 의해 포스포릴콜린기를 입자 표면에 직접 부가시킨다.
모든 아미노기에 대하여 포스포릴콜린기를 결합시키지 않고(반응량을 조절하는) 잔존하는 아미노기가 리간드가 결합 가능한 치환기가 된다.
또는, 아미노기를 갖는 입자에 대하여 글리세롤포스포릴콜린의 산화적 개열 반응에 의해 얻어진 카르복실체를 아미드화 반응에 의해 포스포릴콜린기를 입자 표면에 직접 부가시킨다.
모든 아미노기에 대하여 포스포릴콜린기를 결합시키지 않고(반응량을 조절하는) 잔존하는 아미노기가 리간드가 결합 가능한 치환기가 된다.
[입자 표면에 대한 아미노기의 도입 방법]
입자에 아미노기를 도입하는 공지의 방법(단계 1)으로는, 다음을 들 수 있 다.
1. 플라즈마 처리의 표면 반응에 의한 아미노기의 도입
질소 가스 분위기 하에서 저온 플라즈마에 의해 입자 표면에 아미노기를 도입한다. 구체적으로는, 입자를 플라즈마 반응 용기 내에 수용하고, 반응 용기 내를 진공 펌프로 진공으로 만든 후, 질소 가스를 도입한다. 계속하여 글로우 방전에 의해 입자 표면에 아미노기를 도입할 수 있다. 플라즈마 처리한 무기 재료를 기계적으로 입자화하는 것도 가능하다. 플라즈마 처리에 관한 문헌을 아래에 나타내었다.
1. M. Muller, C. oehr
Plasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranes: comparison of the in plasma modifications with a grafting method using ESCA and an amino-selective fluorescent probe
Surface and Coatings Technology 116-119(1999) 802-807
2. Lidija Tusek, Mirko Nitschke, Carsten Werner, Karin Stana-Kleinschek , Volker Ribitsch
Surface characterization of NH3 plasma treated polyamide 6 foils
Colloids an Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 195(2001) 81-95
3. Fabienne Poncin-Epaillard, Jean-Claude Brosse, Thierry Falher
Reactivity of surface groups formed onto a plasma treated poly(propylene) film Macromol. Chem. Phys. 200.989-996(1999)
2. 표면개질제에 의한 아미노기의 도입
아미노기를 갖는 알콕시실란, 클로로실란, 실라잔과 같은 표면개질제를 이용하여 실란올 함유 입자와 같은 무기 입자 표면을 처리한다. 예컨대, 1차 아미노기를 갖는 3-아미노프로필트리메톡시실란에 의해 실리카 입자를 처리하여 아미노기를 도입한다. 구체적으로는, 실리카를 물-2-프로판올 혼합액 중에 담그고, 3-아미노프로필트리메톡시실란을 첨가한 후, 100℃로 가열하고 6 시간 반응시킨다. 실온으로 냉각 후, 실리카를 메탄올로 세정하고 건조하여 아미노기가 실리카 표면에 직접 도입된 입자가 얻어진다. 바람직하게 처리되는 입자로는, 실리카 이외에 유리, 알루미나, 탈크, 클레이, 마이카, 아스베스트, 산화티타늄, 아연화, 산화철과 같은 입자를 들 수 있다.
3. 실리콘 기상 처리에 의한 아미노기의 도입(일본 특허 공고 평1-54379호 공보, 일본 특허 공고 평1-54380호 공보, 일본 특허 공고 평1-54381호 공보 참조)
입자 표면을 먼저 1,3,5,7-테트라메틸시클로테트라실록산에 의해 처리하고, 표면에 도입된 Si-H기와 아미노기를 갖는 모노머를 반응시켜 아미노화된 표면을 얻는다. 예컨대, 마이카와 1,3.5.7-테트라메틸시클로테트라실록산을 데시케이터 중에 넣고, 아스피레이터로 탈기한다. 80℃에서 16 시간 반응시킨 후 마이카를 꺼내 120℃에서 건조시킨다. 얻어진 마이카를 에탄올 중에 분산하고, 아릴아민을 첨가, 계속하여 염화백금산의 에탄올 용액을 첨가하고, 60℃에서 2 시간 교반한다. 반응 종료 후, 여과, 에탄올 세정, 감압 건조하여 아미노화 마이카를 얻는다. 각종 무기 입자(마이카, 탈크, 카올린, 알루미나, 산화티타늄, 산화아연, 산화철, 각종 무기 안료)가 바람직하게 처리된다.
본 방법에 사용하는 모노머는 아민계 모노머를 이용할 수 있다. 아민계 모노머란 아릴아민에 한정되지 않으며, 아미노기 및 중합 가능한 비닐, 아크릴과 같은 반응성 부위를 가지고 있으면 된다. 아미노기는 부톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기 등에 의해 보호되어 있어도 좋다.
또한, 아민계 모노머가 아니어도, 에폭시기와 같이 예컨대 디아민과의 반응에 의해 간단하게 아미노기를 도입 가능한 작용기를 갖는 모노머이어도 좋다.
[아미노기를 갖는 입자에 포스포릴콜린기를 도입하는 방법]
다음, 아미노화된 입자 표면에 포스포릴콜린기를 도입하는 방법(단계 2)을 이하에 나타내었다.
입자를 메탄올 중에 담그고, 포스파티딜글리세르알데히드를 첨가하고, 실온에서 6 시간 방치한다. 그리고, 시아노붕소산나트륨을 0℃에서 첨가, 하룻밤 가열 교반하고, 아미노기에 포스포릴콜린기를 부가시킨다. 입자를 메탄올로 세정후 건조하여 포스포릴콜린기를 표면에 직접 갖는 입자가 얻어진다. 반응 용매는 메탄올 이외에도 물, 에탄올, 2-프로판올 등 프로톤성 용매이면 사용 가능한데, 메탄올을 사용한 경우의 도입율이 높은 경향이 있다.
표면개질제에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 이용하여 아미노기를 실리카에 도입하고, 다음 포스포릴콜린기(PC라고 약칭함)를 도입하는 방법의 반응식을 아래에 나타내었다.
Figure 112006056137945-PCT00004
Figure 112006056137945-PCT00005
상기에서 설명한 바와 같이 아미노기를 갖는 입자를 조제하고, 글리세로포스포릴콜린의 산화적 개열 반응에 의해 얻어진 알데히드체 또는 하이드레이트체의 환원적 아미노화 반응에 의해 포스포릴콜린기가 입자 표면에 직접 부가된 입자를 제조할 수 있다.
이 방법은 포스포릴콜린기의 도입율이 높고, 또한 다양한 무기 입자의 표면을 수식할 수 있다는 커다란 이점이 있다.
상기한 알데히드를 함유하는 화합물은 공지의 글리세로포스포릴콜린을 공지의 방법에 의해 산화적 개열을 행하도록 하는 것으로써, 매우 간단한 공정이다. 예컨대, 1,2-디올을 과요오드산, 과요오드산염 혹은 삼산화비스무트와 같은 산화제를 이용하여 산화함으로써 결합을 개열시켜 알데히드체가 얻어진다. 반응은 통상적으로 수중 또는 물을 포함하는 유기 용매 중에서 수행되며, 반응 온도는 0℃부터 실 온이다. 알데히드체는 수중에서 평형 반응을 거쳐 하이드레이트가 될 수도 있는데, 계속되는 아민과의 반응에는 영향을 주지 않는다. 아래에 포스포릴콜린기를 함유하는 일 관능의 알데히드체를 조제하는 반응식의 일례를 나타내었다.
Figure 112006056137945-PCT00006
글리세로포스포릴콜린의 산화적 개열 반응에 의해 얻어지는 알데히드체(혹은 하이드레이트체)를 입자의 아미노기에 결합시키는 환원적 아미노화 반응은 양자를 용매 중에서 교반함으로써 용이하게 수행할 수 있다. 이 반응은 양자를 물 혹은 알콜 중에 용해 또는 분산하고(제3 성분의 유기 용매를 혼합하여도 좋음), 이민을 형성시킨 후, 이를 환원제에 의해 환원하여 2차 아민을 얻는 것이다. 환원제로는 시아노붕소산나트륨 등 마일드한 환원제가 바람직하나, 포스포릴콜린이 안정적인 한, 다른 환원제를 이용하는 것도 가능하다. 반응은 통상적으로 0도부터 실온에서 이루어지는데, 경우에 따라 가열할 수도 있다.
또한, 상기 아미노기에는 식 (2)로 표시되는 화합물을 임의의 양만큼 상법에 의해 반응시켜 잔존하는 아미노기를 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로 하여도 좋다.
Figure 112006056137945-PCT00007
(2)
n=1∼12까지의 정수
구체적인 방법으로는, 예컨대 식 (2)의 화합물과 염화티오닐을 N, N'-디메틸포름아미드 중에서 반응시켜 산 염화물로 하고, N, N'-디메틸포름아미드 중에서 아미노기를 갖는 입자와 반응시켜 아미드 결합에 의해 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 도입할 수 있다.
식 (2)의 화합물은 하기의 반응식에 의해 합성할 수 있다.
[리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기에 대하여]
상기 반응에 있어서는, 모든 아미노기에 대하여 포스포릴콜린기를 결합시키지 않고(반응량을 조절하는) 잔존하는 아미노기가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기가 된다. 이 입자가 청구항 2에 기재된 어피니티 입자이며, 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기가 무기 입자의 표면에 직접 존재하는 입자가 된다. 그리고, 이 잔존하는 아미노기에 리간드를 결합시킨 것이 청구항 3에 기재된 어피니티 입자가 되며, 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 무기 입자의 표면에 직접 존재하는 입자가 된다.
청구항 2에 기재된 어피니티 입자는 포착하고자 하는 물질(목적 물질)에 따라 사용자가 임의의 리간드를 결합시키는 것이 가능해지는 제품 양태이다. 청구항 3에 기재된 어피니티 입자는 미리 리간드를 결합시킨 제품 양태이다. 한편, 청구항 1에 기재된 어피니티 입자는 적어도 식 (1)의 포스포릴콜린기가 입자 표면에 존재해 있는 어피니티 입자이며, 리간드나 이를 결합할 수 있는 반응기 또는 흡착기의 유무에 한정되지 않고, 포착하고자 하는 물질(목적 물질)에 따라 사용자가 임의의 리간드를 결합시킬 수 있는 제품 양태이다. 또한 적어도 식 (1)의 포스포릴콜린기가 입자 표면에 존재해 있는 한, 어떠한 양태의 어피니티 입자도 포함하는 것이며, 예컨대 청구항 2 및 청구항 3의 양태도 포함하는 것이다.
상기한 반응에 있어서, 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로서 아미노기를 잔존시켜 두려면, 3-아미노프로필트리메톡시실란과 포스포릴콜린기를 도입한 3-아미노프로필트리메톡시실란을 경합 반응시키는 방법 또는 반응량을 조절하는 등에 의해 수행할 수 있다.
한편, 이 아미노기에 임의의 작용기를 갖는 화합물을 반응시켜, 그 작용기를 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로 하여도 좋다. 예컨대, 글루타르알데히드, 알킬디이미데이트, 아실아지드류, 이소시아네이트류 등을 생각할 수 있다.
한편, 상기한 표면개질제에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 사용한 경우의 반응식에 있어서, 표면개질제의 반응량을 조정하여 입자 표면에 존재하는 히드록실기(OH)를 남겨 두어, 잔존하는 OH기를 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로서 이용할 수도 있다.
[아미노기를 갖는 입자에 대한 리간드의 결합 방법에 대하여]
리간드가 단백질인 경우, 무기 입자 상의 아미노기에 글루타르알데히드의 한쪽의 알데히드기를 반응시키고, 다른 한쪽의 알데히드기에 단백질 중의 아미노기를 반응시켜 단백질을 결합시킨다.
[입자 표면에 존재해 있는 반응기 또는 흡착기가 히드록실기인 경우]
무기 입자의 대부분은 그 표면에 히드록실기가 존재하므로, 상기한 아미노기 와 같은 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 새로 도입하지 않고, 입자 표면에 존재하는 히드록실기(OH)를 그대로 이용하여 포스포릴콜린기 및 리간드 또는 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 도입한다. 본 발명의 어피니티 입자는 이 방법에 의해 제조하는 것이 바람직하다.
[히드록실기를 갖는 입자에 포스포릴콜린기를 도입하는 방법]
입자 표면의 히드록실기와 하기 식 (3) 또는 (4)의 화합물의 Si-OMe로부터 탈수에 의해 화학 결합을 형성시킨다. 이 화학 반응은 대부분의 유기 용매 중에서 가열 및 환류를 행함으로써 매우 용이하게 정량적으로 진행한다. 이 탈수 반응에 의해 화학적, 물리적으로 매우 안정적인 포스포릴콜린기를 도입할 수 있으므로 바람직하다. 한편, 하기 식 (3) 또는 (4)로 표시되는 포스포릴콜린기 함유 화합물은 신규 화합물이다.
Figure 112006056137945-PCT00008
(3)
Figure 112006056137945-PCT00009
(4)
상기 식에 있어서, m은 2∼6, n은 1∼4이다. OMe는 OEt, Cl이어도 좋다. 또한, Si와 결합하는 OMe 또는 OEt 또는 Cl 중 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기이어도 좋다.
[식 (3)의 포스포릴콜린기 함유 화합물의 제조 방법]
하기 식 (5)로 나타낸 포스포릴콜린 유도체를 증류수에 용해시킨다. 하기 식 (5)의 포스포릴콜린 유도체는 공지의 화합물로서 시판품을 입수할 수 있다.
Figure 112006056137945-PCT00010
(5)
식 (5)의 화합물의 수용액을 빙수욕 중에서 냉각하고, 과요오드산나트륨을 첨가하여 5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축, 감압 건조하고, 메탄올에 의해 하기 식 (6)으로 나타낸 알데히드기를 갖는 포스포릴콜린 유도체를 추출한다.
Figure 112006056137945-PCT00011
(6)
다음, 식 (6)의 메탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 0.5 당량 첨가한다. 이 혼합 용액을 실온에서 소정 시간 교반한 후, 빙냉하고, 시아노히드로붕소화나트륨을 적당량 첨가하고, 실온으로 되돌려서 16 시간 교반한다. 이 동안에도 반응 용기에는 건조 질소를 계속 흘린다. 침전을 여과한 후, 식 (3) 및 /또는 식 (4)의 메탄올 용액을 얻는다.
상기한 절차는 식 (3) 또는 (4)으로 나타낸 화합물 중의 m, n이 바뀌어도 완전히 동일하게 행할 수 있다. 여기서 나타낸 절차는 m=3, n=2의 경우이다. 반응 용매는 특별히 한정되지 않으며, 전술한 메탄올 이외에도 물이나, 에탄올, 프로판올, 부탄올과 같은 알콜, DMF나 DMSO와 같은 비프로톤성 용매를 이용할 수 있다. 단, 반응중의 중합을 막기 위해서는 탈수 용매가 바람직하며, 그 중에서도 탈수 메탄올이 적합하다.
또한, (3) 또는 (4) 중의 메톡시기(OMe)가 에톡시기(OEt)인 경우에는 메탄올을 에탄올로 바꾸어 반응을 수행하고, Cl인 경우에는 디메틸포름아미드나 디메틸술폭사이드로 변경하기만 하면 된다.
나아가서는, Si와 결합하는 OMe 또는 OEt 또는 Cl 중 2개 또는 1개가 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 하나로 치환되어 있는 경우에도 상기한 방법과 완전히 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
[식 (4)의 포스포릴콜린기 함유 화합물의 제조 방법]
하기 식 (5)로 나타낸 포스포릴콜린 유도체를 증류수와 아세트니트릴의 혼합액에 용해시킨다. 하기 식 (5)의 포스포릴콜린 유도체는 공지의 화합물로서, 시판품을 입수할 수 있다.
Figure 112006056137945-PCT00012
(5)
식 (5)의 화합물의 수용액을 빙수욕 중에서 냉각하고, 과요오드산나트륨 및 삼염화루테늄을 첨가하고, 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축, 감압 건조하고, 메탄올에 의해 하기 식 (7)로 나타낸 카르복실기를 갖는 포스포릴콜린 유도체를 추출한다.
Figure 112006056137945-PCT00013
(7)
다음, 식 (7)에 염화티오닐을 N, N'-디메틸포름아미드 중에서 첨가하여 산 염화물로 하고, 이어서 3-아미노프로필트리메톡시실란을 0.5 당량 및 트리에틸아민을 2당량 첨가한다. 이 혼합 용액을 실온에서 소정 시간 교반하고, 식 (4)의 N, N'-디메틸포름아미드 용액을 얻는다.
상기한 절차는 식 (4)로 나타낸 화합물 중의 m, n이 바뀌어도 완전히 동일한 방법으로 행할 수 있다. 여기서 나타낸 절차는 m=3, n=2의 경우이다. 반응 용매는 특별히 한정되지 않으며, 전술한 N, N'-디메틸포름아미드 이외에도 아세트니트릴이나 테트라히드로푸란, 디메틸술폭사이드와 같은 비프로톤성 용매를 사용할 수 있다. 단, 반응중의 중합을 막기 위해서는 탈수 용매가 바람직하다.
또한, Si와 결합하는 OMe 또는 OEt 또는 Cl 중 2개 또는 1개가 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 하나로 치환되어 있는 경우에도 상기한 방법과 완전히 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
[리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기에 대하여]
상기 반응에 있어서는, 모든 히드록실기에 대하여 포스포릴콜린기를 결합시키지 않고(반응량을 조절하는) 잔존하는 히드록실기가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기가 된다. 이 입자가 청구항 2에 기재된 어피니티 입자이며, 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기가 무기 입자의 표면에 직접 존재하는 입자가 된다. 그리고, 이 잔존하는 히드록실기에 리간드를 결합시킨 것이 청구항 3에 기재된 어피니티 입자가 되며, 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 무기 입자의 표면에 직접 존재하는 입자가 된다.
청구항 2에 기재된 어피니티 입자는 포착하고자 하는 물질(목적 물질)에 따라 사용자가 임의의 리간드를 결합시키는 것이 가능해지는 제품 양태이다. 청구항 3에 기재된 어피니티 입자는 미리 리간드를 결합시킨 제품 양태이다. 한편, 청구항 1에 기재된 어피니티 입자는 적어도 식 (1)의 포스포릴콜린기가 입자 표면에 존재해 있는 어피니티 입자이며, 리간드나 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기의 유무에 한정되지 않고, 포착하고자 하는 단백질(어떤 목적 물질)에 따라 사용자가 임의의 리간드를 결합시킬 수 있는 제품 양태이다. 또한, 적어도 식 (1)의 포스포릴콜린기가 입자 표면에 존재해 있는 한, 어떠한 양태의 어피니티 입자도 포함하는 것이며, 예컨대 청구항 2 및 청구항 3의 양태도 포함하는 것이다.
[히드록실기를 갖는 입자에 대한 리간드의 결합 방법에 대하여]
리간드가 단백질인 경우, 입자 상의 히드록실기를 브롬화시안을 이용하여 활성화한다. 여기에 단백질 중의 아미노기를 반응시켜 단백질을 결합시킨다.
한편, 이 히드록실기에 임의의 작용기를 갖는 화합물을 반응시켜, 그 작용기를 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로 하여도 좋다.
[입자에 도입한 반응기 또는 흡착기가 카르복실기인 경우]
단계 1: 임의의 입자에 공지의 방법 혹은 향후 개발될 방법으로 카르복실기를 도입한다. 카르복실기는 입자 표면에 직접 도입된다.
단계 2: 카르복실기를 갖는 입자에 대하여 하기 식 (2)로 표시되는 포스포릴콜린 함유 화합물을 상법에 의해 반응시키고, 포스포릴콜린기를 산 아미드 결합시켜, 잔존하는 카르복실기를 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로 하여도 좋다.
모든 카르복실기에 대하여 포스포릴콜린기를 결합시키지 않고(반응량을 조절하는) 잔존하는 카르복실기가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기가 된다.
Figure 112006056137945-PCT00014
(8)
[입자 표면에 대한 카르복실기의 도입 방법]
입자에 카르복실기를 도입하는 공지의 방법(단계 1)으로는, 다음을 들 수 있다.
1. 표면개질제에 의한 카르복실기의 도입
카르복실기를 갖는 알콕시실란, 클로로실란, 실라잔과 같은 표면개질제를 이용하여 실란올 함유 입자와 같은 무기 입자 표면을 처리한다.
예컨대, 트리에톡시시릴프로필 무수 숙신산에 의해 실리카 입자를 처리하여 카르복실기를 도입한다. 구체적으로는, 트리에톡시시릴프로필 무수 숙신산을 N, N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 증류수와 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하고, 16 시간 실온에서 교반하여 하기 식 (3)으로 나타낸 카르복실산을 갖는 실란 커플링제를 얻는다. 본 반응은 무수 숙신산의 4-디메틸아미노피리딘에 의한 가수 분해 반응 이다.
카르복실산을 갖는 실란 커플링제에 의해 실리카 입자를 처리하여 카르복실기를 도입한다. 구체적으로는, 실리카를 물-2-프로판올 혼합액 중에 담그고, 카르복실산을 갖는 실란 커플링제를 첨가 후, 100℃로 가열하여 6 시간 반응시킨다. 실온으로 냉각 후, 실리카를 메탄올로 세정하고 건조하여 카르복실기가 실리카 표면에 직접 도입된 입자가 얻어진다. 바람직하게 처리되는 입자로는, 실리카 이외에 유리, 알루미나, 탈크, 클레이, 마이카, 아스베스트, 산화티타늄, 아연화, 산화철 등의 입자를 들 수 있다.
2. 실리콘 기상 처리에 의한 카르복실기의 도입(일본 특허 공고 평1-54379호 공보, 일본 특허 공고 평1-54380호 공보, 일본 특허 공고 평1-54381호 공보 참조)
입자 표면을 먼저 1,3,5,7-테트라메틸시클로테트라실록산에 의해 처리하고, 표면에 도입된 Si-H기와 카르복실기를 갖는 모노머를 반응시켜 카르복실화된 표면을 얻는다. 각종 무기 입자(마이카, 탈크, 카올린, 알루미나, 산화티타늄, 산화아연, 산화철, 각종 무기 안료)가 바람직하게 처리된다.
본 방법에 사용하는 모노머는 카르복실계 모노머를 이용할 수 있다. 카르복실계 모노머란, 카르복실기 및 중합 가능한 비닐, 아크릴과 같은 반응성 부위를 가지고 있으면 된다.
[카르복실기를 갖는 입자에 포스포릴콜린기를 도입하는 방법]
다음, 카르복실화된 입자 표면에 포스포릴콜린기를 도입하는 방법(단계 2)을 이하에 나타내었다.
카르복실기가 표면에 있는 입자를 N--히드록시숙신이미드(NHS), 1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드의 용액에 담그면, 입자의 표면이 활성 에스테르기로 덮인다. 여기에 식 (7)로 나타내는 아미노기를 갖는 포스포릴콜린 유도체 용액을 넣고, 포스포릴콜린기를 도입한다.
[리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기에 대하여]
상기 반응에 있어서는, 모든 카르복실기에 대하여 포스포릴콜린기를 결합시키지 않고(반응량을 조절하는) 잔존하는 카르복실기가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기가 된다. 이 입자가 청구항 2에 기재된 어피니티 입자이며, 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기가 무기 입자의 표면에 직접 존재하는 입자가 된다. 그리고, 이 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기에 리간드를 결합시킨 것이 청구항 3에 기재된 어피니티 입자가 되며, 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 무기 입자의 표면에 직접 존재하는 입자가 된다.
청구항 2에 기재된 어피니티 입자는 포착하고자 하는 물질(목적 물질)에 따라 사용자가 임의의 리간드를 결합시키는 것이 가능해지는 제품 양태이다. 청구항 3에 기재된 어피니티 입자는 미리 리간드를 결합시킨 제품 바꾸기이다. 한편, 청구항 1에 기재된 어피니티 입자는 적어도 식 (1)의 포스포릴콜린기가 입자 표면에 존재해 있는 어피니티 입자이며, 리간드나 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기의 유무에 한정되지 않고, 포착하고자 하는 물질(목적 물질)에 따라 사용자가 임의의 리간드를 결합시킬 수 있는 제품 바꾸기이다. 또한, 적어도 식 (1)의 포스포릴 콜린기가 입자 표면에 존재해 있는 한, 어떠한 바꾸기의 어피니티 입자도 포함하는 것이며, 예컨대 청구항 2 및 청구항 3의 바꾸기도 포함하는 것이다.
상기한 반응에 있어서, 카르복실기를 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로서 잔존시켜 두려면, 포스포릴콜린기를 도입한 카르복실산을 갖는 실란 커플링제의 반응량을 조절하는 등에 의해 수행할 수 있다.
한편, 이 카르복실기에 임의의 작용기를 갖는 화합물을 반응시켜, 그 작용기를 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로 하여도 좋다.
[카르복실기를 갖는 입자에 대한 리간드의 결합 방법에 대하여]
리간드가 단백질인 경우, 무기 입자 상의 카르복실기에 N-히드록시숙신이미드(NHS), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드의 용액에 담그고, 입자의 표면을 활성 에스테르화한다. 여기에 단백질 중의 아미노기를 반응시켜 단백질을 결합시킨다. 한편, 이 히드록실기에 임의의 작용기를 갖는 화합물을 반응시켜, 그 작용기를 단백질이 결합 가능한 반응기 또는 흡착기로 하여도 좋다.
[목적 물질의 어피니티 분리 방법]
상기에서 얻어지는 본 발명의 어피니티 입자를 이용하여, 본 발명의 목적 물질의 어피니티 분리 방법이 수행된다.
본 발명의 방법은 무기 입자를 이용하여 정밀한 분리가 간편하게 이루어진다는 점에서 획기적인 목적 물질의 분리 정제 방법이다.
본 발명의 방법은 다음의 3개의 공정을 포함하는 것이다. 한편, 미리 리간드가 결합되어 있는 어피니티 입자의 경우에는(청구항 2), 제1 공정은 이미 수행되었 으므로 생략된다.
1. 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 어피니티 입자 또는 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 가지며, 어떤 목적 물질에 특이적으로 친화성을 갖는 리간드를 무기 입자의 표면에 공유 결합 또는 흡착으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자에 임의의 리간드를 화학 결합시키는 제1 공정.
예컨대, 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기와 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 무기 입자의 표면에 전자는 공유 결합으로 후자는 공유 결합 또는 흡착으로 갖는 어피니티 입자와 임의의 리간드 PBS 용액 1 ㎖를 2 ㎕ 에펜도르프 튜브에 넣고, 30 분 동안 4℃에서 천천히 흔든다. 5000 rpm, 5 분간 원심하여 상청액을 버린다. 세정을 위하여 PBS 용액 1 ㎖를 부가하여 천천히 흔들고, 5000 rpm, 5 분간 원심하여 상청액을 버린다. 이 세정 조작을 3회 반복한다.
2. 제1 공정에서 제조한 어피니티 입자를 임의의 리간드에 의해 선택적으로 포착되는 목적 물질을 포함하는 액체 시료에 분산시키는 제2 공정.
예컨대, 제1 공정에서 제조한 어피니티 입자를 임의의 리간드에 의해 선택적으로 포착되는 목적 물질을 포함하는 액체 시료에 분산시키고, 30 분간 4℃에서 천천히 흔든다. 5000 rpm, 5 분간 원심하고, 상청액을 버린다. 세정을 위하여 PBS 용액 1 ㎖를 부가하고 천천히 흔들고, 5000 rpm, 5 분간 원심하여 상청액을 버린다. 이 세정 조작을 3회 반복한다.
3. 분리한 어피니티 입자로부터 포착한 목적 물질을 회수하는 제3 공정.
예컨대 어피니티 입자로부터 포착한 목적 물질을 회수하기 위하여, 용출 버퍼 1 ㎖를 부가하고, 30 분간 4℃에서 천천히 흔들고, 입자로부터 목적 물질을 용출시키고, 상청액을 회수한다. 용출 버퍼 1 ㎖를 부가하여 천천히 흔들고, 5000 rpm, 5 분간 원심하여 상청액을 회수한다. 이 조작을 2회 반복한다.
도 1은 본 발명의 어피니티 입자와 종래의 어피니티 입자에 의한 목적 물질포착의 선택성의 차이를 나타낸 모식도이다.
다음, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명한다. 한편, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다. 입자 표면에 도입된 포스포릴콜린기는 FT-IR 및 원소 분석에 의해 확인되어 정량할 수 있다.
[합성예 1]
[포스포릴콜린기를 함유하는 알데히드 화합물]
1-α-글리세로포스포릴콜린(6.29 g)을 증류수 210 ㎖에 용해하고, 빙수욕 중에서 냉각하였다. 과요오드산나트륨(10.23 g)을 첨가하고, 5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축, 감압 건조하고, 메탄올에 의해 목적물을 추출하였다. 하기 화합물 (6)에 구조를 나타내었다.
식 (6)의 화합물의 중수 중에서의 1H NMR 스펙트럼을 도 2에 나타내었다. 식 (6)의 화합물은 수중에서 식 (9)와 평형 상태이므로, 실제 스펙트럼은 식 (6)과 식 (9)의 쌍방을 반영한 것이 된다.
Figure 112006056137945-PCT00015
(6)
Figure 112006056137945-PCT00016
(9)
[합성예 2]
[포스포릴콜린기를 함유하는 카르복실산 화합물]
200 ㎖ 플라스크 내에 글리세로포스포릴콜린 5 g, 과요오드산나트륨 17 g, 삼염화루테늄·n 수화물 81 mg 및 이온 교환수 70%, 아세트니트릴 30 g을 부가한다. 실온에서 2 시간 교반한 후, 여과하고, 여과액으로부터 용매를 제거하였다. 얻어진 고형물로부터 메탄올로 목적 화합물을 추출, 계속하여 메탄올을 제거함으로써 목적 화합물 (7)을 얻었다.
식 (7)의 화합물의 중수 중에서의 1H NMR 스펙트럼을 도 3에 나타내었다.
Figure 112006056137945-PCT00017
(7)
[합성예 3]
[식 (10)의 화합물]
합성예 1의 화합물 5.0 g을 탈수한 메탄올 55 ㎖에 용해시키고, 용기 내를 건조 질소로 치환한다. 다음, 화합물 1의 메탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시 실란을 2.84 g 첨가하였다. 이 혼합 용액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 빙냉하고, 시아노히드로붕소화나트륨 1.39 g을 첨가하고, 실온으로 되돌려서 5 시간 교반하였다. 이 동안에도 반응 용기에는 건조 질소를 계속 흘렸다. 침전을 여과한 후, 목적 물질인 하기 식 (10)을 포함하는 메탄올 용액을 얻었다.
Figure 112006056137945-PCT00018
[합성예 4]
[식 (11)의 화합물]
합성예 4의 화합물 9.0 g을 N, N'-디메틸포름아미드 300 ㎖에 분산시키고, 용기 내를 건조 질소로 치환한다. 다음, 염화티오닐 4.5 g을 첨가하고, 15 분간 교반한 후, 3-아미노프로필트리메톡시실란을 2.84 g, 트리에틸아민을 9.5 g 첨가하였다. 이 혼합 용액을 실온에서 하룻밤 교반하고, 침전을 여과한 후, 목적 물질인 하기 식 (11)의 화합물을 포함하는 N, N'-디메틸포름아미드 용액을 얻었다.
Figure 112006056137945-PCT00019
(11)
[참고예 1]
[포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 포스포릴콜린 입자(PC 입자(A))]
합성예 3에서 제조한 식 (10)의 화합물 50 μmol을 포함하는 메탄올 용액 97.7 ㎕를 취하고, 메탄올 47.5 ㎖, 증류수 2.5 ㎖를 부가하고, 평균 입경 1.5 ㎛, 비표면적이 6 ㎡/g인 실리카겔을 5 g 더 첨가하였다. 이 입자 분산 용액을 80℃에서 하룻밤 환류시키고 커플링시켰다. 환류 후 메탄올로 원심 세정하여 청구항 1의 PC 입자를 얻었다(이후, PC 입자 (A)라고 함). 이상의 절차에서, 합성예 3의 표면개질제로 PC 처리한 입자 (A)의 P 정량 측정을 도 4에 나타내었다. 이로부터 구한 PC 도입량은 3.1 μmol/g 입자가 되며 PC기가 입자 표면에 도입되어 있음을 확인하였다.
[참고예 2]
[포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 포스포릴콜린 입자(PC 입자 (B))]
합성예 4에서 제조한 식 (11)의 화합물 50 μmol을 포함하는 디메틸포름아미드 용액 278 ㎕를 취하고, 디메틸포름아미드 50 ㎖를 부가하고, 평균 입경 1.5 ㎛, 비표면적이 6 ㎡/g인 실리카겔을 5 g 더 첨가하였다. 이 입자 분산 용액을 160℃에서 하룻밤 환류시키고 커플링시켰다. 환류 후 메탄올로 원심 세정하여 청구항 1의 PC 입자를 얻었다(이후, PC 입자 (B)라고 함). 이상의 절차에서, 합성예 4의 표면개질제로 처리한 PC 입자 (B)의 P 정량 측정을 도 4에 나타내었다. 이로부터 구한 PC 도입량은 3.4 μmol/g 입자가 되며, PC기가 입자 표면에 도입되어 있음을 확인하였다.
[참고예 3]
[포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 포스포릴콜린 입자(PC 입자(C))]
합성예 4에서 제조한 식 (11)의 화합물 50 μmol을 포함하는 디메틸포름아미드 용액 278 ㎕를 취하고, 디메틸포름아미드 47.5 ㎖, 증류수 2.5 ㎖를 부가하고, 평균 입경 1.5 ㎛, 비표면적이 6 ㎡/g인 실리카겔을 5 g 더 첨가하였다. 이 입자 분산 용액을 160℃에서 하룻밤 환류시키고 커플링시켰다. 환류 후 메탄올로 원심 세정하여 청구항 1의 PC 입자를 얻었다(이후, PC 입자(C)라고 함). 이상의 절차에서, 합성예 4의 표면개질제로 처리한 PC 입자 (C)의 P 정량 측정을 도 4에 나타내었다. 이로부터 구한 PC 도입량은 73 μmol/g 입자가 되며, PC기가 입자 표면에 도입되어 있음을 확인하였다.
참고예 1의 PC 입자 (A)의 13C-CPMAS 스펙트럼 및 13C-PSTMAS 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. PSTMAS 스펙트럼이란 자유 운동을 하고 있는 분자쇄의 스펙트럼을 선택적으로 얻는 방법으로, 입자 표면의 수식쇄의 해석에 널리 이용되고 있는 방법이다. 도 5에서는, 54.2 ppm으로 포스포릴콜린기의 탄소에 기인하는 스펙트럼이 관측된다.
도 6에 도시한 참고예 1의 PC 입자 (A)의 31P-CPMAS 스펙트럼에서는, 대상으로서 측정한 NaH2PO4와 거의 동일한 화학 시프트 값에 피크가 검출된 것에서 인산기의 존재를 확인할 수 있다. 이상의 결과로부터, 포스포릴콜린기를 담체 실리카겔 표면에 도입할 수 있었으리라 사료된다.
도 5로부터는, 스페이서인 프로필기의 탄소에 기인하는 스펙트럼이 9 ppm, 23 ppm 부근으로 관측되며, 포스포릴콜린 내의 에틸에 유래하는 스펙트럼은 60 ppm, 69 ppm 부근으로 관측된다. 이상으로부터, 식 (10) 및 (11)의 구조가 파괴되지 않고 실리카겔에 도입되어 있음을 알 수 있다.
도 7에 참고예 3의 PC 입자 (C)의 FT-IR 스펙트럼을 나타내었다. 1650 cm-1 부근에 아미드 결합 특유의 흡수를 관측할 수 있었다.
[포스포릴콜린 입자의 단백질 비특이 흡착 평가]
참고예 1에서 사용한 포스포릴콜린기를 도입하지 않은 미처리 실리카겔 입자(미처리 입자라고 약칭함)와 참고예 1, 2, 3에서 제조한 PC 입자 (A), (B), (C)를 각각 25 mg씩 취하고, 증류수 1 ㎖ 부가하여 초음파 처리를 1 분간 수행하였다. 원심으로 증류수를 제거하고, 알부민(100 5㎍/㎖) 혹은 리소자임(100 ㎍/㎖)을 1 ㎖ 부가하여 실온에서 1 시간 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 5회 수행하고 세정하였다. 다음, SDS(1%)를 1 ㎖ 부가하여 실온에서 1 시간 반응시키고, 원심(5000 g)하여 상청액을 MICRO BCA법으로 정량하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 미처리 입자에 비해 포스포릴콜린기로 처리되어 있는 PC 입자 (A)는 알부민, 리소자임 모두 흡착이 상당히 억제되어 있음을 알 수 있었다. PC 입자 (B), (C)에서는 미처리 입자 또는 PC 입자 (A)에 비해 알부민, 리소자임 모두 흡착이 더욱 더 억제되어 있었다.
[실시예 1]
[포스포릴콜린기와 아미노기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 어피니티 입자(Af 입자(A))]
합성예 3에서 제조한 식 (10)의 화합물 45 μmol을 포함하는 메탄올 용액 87.9 ㎕와 3-아미노프로필트리메톡시실란 5 μmol을 포함하는 메탄올 용액 50 ㎕를 취하고, 메탄올 47.5 ㎖, 증류수 2.5 ㎖를 부가하고, 다시 평균 입경 1.5 ㎛, 비표면적이 6 ㎡/g인 실리카겔을 5 g 첨가하였다. 이 입자 분산 용액을 80℃에서 하룻밤 환류시키고 커플링시켰다. 환류 후 메탄올로 원심 세정하여 청구항 1의 어피니티 입자를 얻었다(이후, Af 입자 (A)라고 함). 이상의 절차에서, 합성예 3의 표면개질제로 처리한 Af 입자 (A)의 P 정량 측정을 도 4에 나타내었다. 이로부터 구한 PC 도입량은 2.7 μmol/g 입자가 되며, PC기가 입자 표면에 도입되어 있음을 확인하였다.
[실시예 2]
[포스포릴콜린기와 아미노기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 어피니티 입자(Af 입자 (B))]
합성예 4에서 제조한 식 (11)의 화합물 45 μmol을 포함하는 디메틸포름아미드 용액 250 ㎕와 3-아미노프로필트리메톡시실란 5 μmol을 포함하는 디메틸포름아미드 용액 50 ㎕를 취하고, 평균 입경 1.5 ㎛, 비표면적이 6 ㎡/g인 실리카겔을 5 g 더 첨가하였다. 이 입자 분산 용액을 160℃에서 하룻밤 환류시키고 커플링시켰다. 환류 후 메탄올로 원심 세정하여 청구항 1의 어피니티 입자를 얻었다(이후, Af 입자 (B)라고 함). 이상의 절차에서, 합성예 4의 표면개질제로 처리한 Af 입자 (B) 의 P 정량 측정을 도 4에 나타내었다. 이로부터 구한 PC 도입량은 3.3 μmol/g 입자가 되며 PC기가 입자 표면에 도입되어 있음을 확인하였다.
[실시예 3]
[포스포릴콜린기와 아미노기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 어피니티 입자(Af 입자 (C))]
합성예 4에서 제조한 식 (11)의 화합물 45 μmol을 포함하는 디메틸포름아미드 용액 250 ㎕와 3-아미노프로필트리메톡시실란 5 μmol을 포함하는 디메틸포름아미드 용액 50 ㎕를 취하고, 디메틸포름아미드 47.5 ㎖, 증류수 2.5 ㎖를 부가하고, 평균 입경 15 ㎛, 비표면적이 6 ㎡/g인 실리카겔을 5 g 더 첨가하였다. 이 입자 분산 용액을 160℃에서 하룻밤 환류시키고 커플링시켰다. 환류 후 메탄올로 원심 세정하여 청구항 1의 어피니티 입자를 얻었다(이후, Af 입자 (C)라고 함). 이상의 절차에서, 합성예 4의 표면개질제로 처리한 Af 입자 (C)의 P 정량 측정을 도 4에 나타내었다. 그로부터 구한 PC 도입량은 6.3 μmol/g 입자가 되며, PC기가 입자 표면에 도입되어 있음을 확인하였다.
[어피니티 입자의 선택성 평가 1]
다음, 청구항 6에서 나타낸 어피니티 분리법을 나타내었다. 실시예 1, 2, 3에서 제조한 Af 입자 (A), (B), (C) 25 mg에 증류수 1 ml를 부가하고 초음파 처리를 1 분간 수행하였다. 원심으로 증류수를 제거하고, 글루타르알데히드 용액(8%) 1 ㎖와 쉬프 염기(Schiff('s) base)의 안정화를 위하여 시아노트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 5 시간 반응시키고, MQ수로 원심 및 정제(5000 g) 5회 로 세정하였다. 글루타르알데히드가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기인 청구항 2의 어피니티 입자를 얻었다. 다음, 소 알부민(1 mg/㎖) 혹은 사람 헤모글로빈(1 mg/㎖) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 일 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 수행하였다. 이 소 알부민 혹은 사람 헤모글로빈이 리간드이다. 여기부터 청구항 7에서 나타낸 어피니티 분리법이다. 남아 있는 글루타르알데히드기를 비활성화하기 위하여 에탄올아민 염산염(0.5 M, pH 7.1) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 시간 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 수행하여 청구항 3의 어피니티 입자를 얻었다. 다음, HRP 표식 항소 알부민 항체(10 ㎍/㎖) 혹은 HRP 표식 항사람 헤모글로빈 항체(10 ㎍/㎖)를 1 ㎖ 부가하고, 실온에서 1 시간 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 5회 수행하였다. PBS를 1 ㎖ 더 부가하여 교반하고, 10 ㎕를 96 웰 플레이트로 옮겨 기질 TMBZ를 이용하여 발색 시험을 수행하고, 450 nm에서 측정을 행하였다. 그 결과를 도 9, 도 10, 도 11에 나타내었다. Af 입자 (A)는 사람 헤모글로빈-HRP 표식 항사람 헤모글로빈 항체에서 선택성이 있었다. 또한, Af 입자 (B), Af 입자 (C)에서는 소 알부민 HRP 표식 항소 알부민 항체, 사람 헤모글로빈-HRP 표식 항사람 헤모글로빈 항체 모두 선택성이 있었다.
[어피니티 입자의 선택성 평가 2]
사람 헤모글로빈에 대한 염소 항혈청을 이용하여 선택성 시험을 수행하였다. 실시예 1, 3에서 제조한 Af 입자 (A), (C) 25 mg에 증류수 1 ㎖ 부가하여 초음파 처리를 1 분간 행하였다. 원심으로 증류수를 제거하고, 글루타르알데히드 용액(8%) 1 ㎖와 쉬프 염기의 안정화를 위하여 시아노트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 5 시간 반응시키고, MQ수로 원심 및 정제(5000 g) 5회로 세정하였다. 글루타르알데히드가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기인 청구항 2의 어피니티 입자를 얻었다. 다음, 사람 헤모글로빈(1 mg/㎖) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 일 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 행하였다. 이 사람 헤모글로빈이 리간드이다. 여기부터, 청구항 7에서 나타낸 어피니티 분리법이다. 남아 있는 글루타르알데히드기를 비활성화하기 위하여 에탄올 아민 염산염(0.5 M, pH 7.1) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 시간 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 수행하여 청구항 3의 어피니티 입자를 얻었다. 다음, 100 배 희석한 염소 항혈청을 1 ㎖ 부가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. 다음, 원심(5000 g)하여 상청액을 얻었다(상청액 분획). PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 5회 수행하였다. 다음, Gly-HCl 버퍼(0.2 M, pH 2.5) 1 ㎖를 부가하여 실온에서 1 시간 반응시켜 항사람 헤모글로빈 항체를 용출하고, 원심(5000 g)하여 상청액을 얻었다(용출 분획). 이 상청액 분획과 용출 분획을 SDS-PAGE로 흘려 은 염색을 수행한 결과를 도 12에 나타내었다. Af 입자 (A), (C) 모두 용출 분획에서는 항체의 중쇄의 밴드가 짙게 보이고 그 이외에는 밴드는 보이지 않는 것에서, 고선택적으로 항체를 포착하고 있는 입자임을 알 수 있었다.
[어피니티 입자의 선택성 평가 3]
항사람 헤모글로빈을 혼합한 염소 항혈청을 이용하여 선택성 시험을 행하였다. 실시예 1, 3에서 제조한 Af 입자 (A), (C) 25 mg에 증류수 1 ㎖ 부가하여 초음 파 처리를 1 분간 수행하였다. 원심으로 증류수를 제거하고, 글루타르알데히드 용액(8%) 1 ㎖와 쉬프 염기의 안정화를 위하여 시아노트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 5 시간 반응시키고, MQ수로 원심 및 정제(5000 g) 5회로 세정하였다. 글루타르알데히드가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기인 청구항 2의 어피니티 입자를 얻었다. 다음, 사람 헤모글로빈(1 mg/㎖) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 일 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 수행하였다. 이 사람 헤모글로빈이 리간드이다. 여기부터 청구항 7에서 나타낸 어피니티 분리법이다. 남아 있는 글루타르알데히드기를 비활성화하기 위하여 에탄올아민 염산염(0.5 M, pH 7.1) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 시간 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 수행하여 청구항 3의 어피니티 입자를 얻었다. 다음, 항사람 헤모글로빈 50 ㎍을 혼합한 100 배 희석 염소 혈청을 1 ㎖ 부가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. 다음, 원심(5000 g)하여 상청액을 얻었다(상청액 분획). PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 5회 수행하였다. 다음, Gly-HCl 버퍼(0.2 M, pH 2.5) 1 ㎖를 부가하여 실온에서 1 시간 반응시켜 항사람 헤모글로빈 항체를 용출하고, 원심(5000 g)하여 상청액을 얻었다(용출 분획). 이 상청액 분획과 용출 분획을 SDS-PAGE로 흘리고, 은 염색을 수행한 결과를 도 13에 나타내었다. Af 입자 (A), (C) 모두 용출 분획에서는 항체의 중쇄의 밴드가 짙게 보이고 그 이외에는 엷은 밴드밖에 보이지 않는 것에서, 고선택적으로 항체를 포착하고 있는 입자임을 알 수 있었다. 또한, 밴드의 짙음으로부터, 항체 포착량은 10∼20 ㎍ 정도이었다. 또한, 용출 분획의 항체 활성을 샌드위치 ELISA로 확인하였 더니, Af 입자 (A) 13.0 ㎍, Af 입자 (C)에서는 10.1 ㎍ 정도 활성이 있었다.
[비교예 1]
[아미노기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 어피니티 입자(아미노 입자)]
3-아미노프로필트리메톡시실란 50μmol을 포함하는 메탄올 용액 500 ㎕를 취하고, 메탄올 47.5 ㎖, 증류수 2.5 ㎖를 부가하고, 평균 입경 1.5 ㎛, 비표면적이 6 ㎡/g인 실리카겔을 5 g 더 첨가하였다. 이 입자 분산 용액을 80℃에서 하룻밤 환류시키고 커플링시켰다. 환류 후 메탄올로 원심 세정하여 아미노 입자를 얻었다. 이 아미노 입자 25 mg에 증류수 1 ㎖ 부가하여, 초음파 처리를 1 분간 수행하였다. 원심으로 증류수를 제거하고, 글루타르알데히드 용액(8%) 1 ㎖와 쉬프 염기의 안정화를 위하여 시아노트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 5 시간 반응시키고, MQ수로 원심 및 정제(5000 g) 5회로 세정하였다. 글루타르알데히드가 리간드가 결합 가능한 반응기 또는 흡착기이다. 다음, 소 알부민(1 mg/㎖) 혹은 사람 헤모글로빈(1 mg/㎖) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 일 반응시키고 PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 행하였다. 이 소 알부민 혹은 사람 헤모글로빈이 리간드이다. 남아 있는 글루타르알데히기를 비활성화하기 위하여 에탄올 아민 염산염(0.5 M, pH 7.1) 1 ㎖와 트리히드로붕산나트륨 10 mg을 부가하여 실온에서 1 시간 반응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 4회 행하여 청구항 3의 어피니티 입자를 얻었다. 다음, HRP 표식 항소 알부민 항체(10 ㎍/㎖) 혹은 HRP 표식 항사람 헤모글로빈 항체(10 ㎍/㎖)를 1 ㎖ 부가하여 실온에서 1 시간 반 응시키고, PBS로 원심 및 정제(5000 g)를 5회 수행하였다. PBS를 1 ㎖ 더 부가하여 교반하고, 10 ㎕를 96 웰 플레이트로 옮겨 기질 TMBZ를 이용하여 발색 시험을 수행하고, 450 nm에서 측정을 행하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 단백질의 비특이 흡착이 많고, 선택성이 낮다.
본 발명의 어피니티 입자는 분리를 원하는 목적 단백질만 포착하기 때문에 선택성이 매우 높다. 그리고, 분산성이 뛰어나고, 액체 시료로부터의 분리가 매우 용이하다. 저렴한 무기 입자를 이용한 어피니티 입자에 의해 간편하고 정밀하게 목적 물질을 분리하는 것이 가능해지기 때문에 목적 물질의 정밀한 분리가 요구되는 생체 관련 산업에 유용하다.

Claims (7)

  1. 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자:
    Figure 112006056137945-PCT00020
    (1)
  2. 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 가지며, 어떤 목적 물질에 특이적으로 친화성을 갖는 리간드와 결합 가능한 반응기 또는 흡착기를 무기 입자의 표면에 공유 결합 또는 흡착으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자:
    Figure 112006056137945-PCT00021
    (1)
  3. 하기 식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기를 무기 입자의 표면에 공유 결합으로 가지며, 어떤 목적 물질에 특이적으로 친화성을 갖는 리간드를 무기 입자의 표면에 공유 결합 또는 흡착으로 갖는 것을 특징으로 하는 어피니티 입자:
    Figure 112006056137945-PCT00022
    (1)
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무기 입자가 실리카, 산화티타늄, 아연화, 알루미나, 산화철, 탈크, 마이카, 세리사이트, 금 콜로이드로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 무기 입자로서, 그 평균 입경이 20 nm∼500 ㎛, 비중이 1.0 g/㎠ 이상인 것을 특징으로 하는 어피니티 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 각종 항체, 항원, 효소, 기질, 리셉터, 렉틴, 펩타이드, DNA, RNA, 압타머, 단백질 A, 단백질 G, 아비딘, 비오틴, 킬레이트 화합물, 각종 금속 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 리간드인 것을 특징으로 하는 어피니티 입자.
  6. (1) 제1항 또는 제2항에 기재된 어피니티 입자에 임의의 리간드를 결합시키는 제1 공정,
    (2) 제1 공정에서 제조한 어피니티 입자를 임의의 리간드에 의해 선택적으로 포착되는 목적 물질을 포함하는 액체 시료에 분산시키는 제2 공정,
    (3) 어피니티 입자로부터 포착한 목적 물질을 회수하는 제3 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 무기 입자에 의한 목적 물질의 어피니티 분리 방법.
  7. (1) 제3항에 기재된 어피니티 입자를 임의의 리간드에 의해 선택적으로 포착되는 목적 물질을 포함하는 액체 시료에 분산시키는 제1 공정,
    (2) 어피니티 입자로부터 포착한 목적 물질을 회수하는 제2 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 무기 입자에 의한 목적 물질의 어피니티 분리 방법.
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